CN110295126A - 一种混合益生菌制剂及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体是一种混合益生菌制剂及其制备工艺。该工艺将植物乳杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌三种益生菌依据菌种类型制定出两级混合培养方案，并使用兼顾三种益生菌营养需求的混合发酵培养基，使得两类益生菌在混合培养过程中能够表现出明显的互惠共生关系，从而有效提高三种益生菌的生物量以及丁酸梭菌的芽孢率，并且生产成本相对较低。该制剂对应的益生菌组合对于常见的肠道致病菌具有明显的抑菌活性，应用于饲料后能够明显改善动物的平均日增重量和料重比。

Description

一种混合益生菌制剂及其制备工艺

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，具体是一种混合益生菌制剂及其制备工艺。

背景技术

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是能够定植在动物消化系统内并改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。目前益生菌中最常被开发研究的菌属主要有芽孢杆菌属和乳酸杆菌属。其中，芽孢杆菌属益生菌中的代表性菌种为丁酸梭菌，乳酸菌属益生菌中的代表性菌种有植物乳杆菌和屎肠球菌。

丁酸梭菌属于厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌。丁酸梭菌耐热、耐酸、耐胆汁，且对多种饲用抗生素有较强的耐受性，可配伍使用。此菌能够产生淀粉酶以水解淀粉和糖类，还能产生丁酸、醋酸和乳酸等代谢产物，目前作为饲料添加剂应用于畜禽养殖中已取得很好的效果，对于减少当前饲料中抗生素的用量、减少肉品中的药物残留、降低致病菌的耐药性和保障动物健康方面都有重要的意义，因此是一种理想的、具有广阔开发前景的微生态制剂。

植物乳杆菌属于同型发酵乳酸菌，厌氧或兼性厌氧，活菌数在乳酸菌属中相对较高，可起到维持肠道内菌群平衡和提高肠道免疫力的作用，具体表现在对于腐败菌繁殖的抑制、防止蛋白质发酵、减少肠内产气等方面。另外此菌还能促进消化液分泌从而促进消化吸收。

屎肠球菌是动物肠道正常菌群中的菌类，需氧或兼性厌氧，对维持动物肠道菌群生态平衡起到重要作用，特别是在幼龄动物的肠道保健和疾病的防疫和治疗上有突出的表现。屎肠球菌制剂在提高幼年畜禽体增重、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高营养吸收、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果。

现有用作饲料添加剂的益生菌制剂往往不仅含有一种或同属的几种益生菌，而是包含来自不同属的多种益生菌的混合益生菌制剂。这种混合益生菌制剂通常由单独发酵得到的单一菌种活菌制剂经混合复配后得到，制备过程涉及多套发酵及干燥制粉工艺的同步执行，设备及物料成本都很高。另外单独培养的多种益生菌进入动物肠道后还可能产生明显的拮抗作用，使得益生效果大打折扣。因此有必要找出适用于饲料领域的高效益生菌组合并针对该益生菌组合研发对应的混合发酵工艺以简化混合益生菌制剂的生产，降低生产成本，同时保证应用效果。

发明内容

本发明的第一目的为基于混合发酵技术提供一种适用于饲料领域的高效益生菌组合的混合益生菌制剂的制备工艺。

本发明的第二目的在于提供一种通过上述工艺制成的混合益生菌制剂。

为实现上述第一目的，本发明提供一种混合益生菌制剂的制备工艺，其特殊之处在于，包括下列步骤：

S1、对植物乳杆菌菌种、屎肠球菌菌种和丁酸梭菌菌种分别进行活化处理；

S2、对经过活化处理的植物乳杆菌菌种、屎肠球菌菌种和丁酸梭菌菌种分别进行扩大培养并得到活菌数均处于1×10⁷cfu/ml至2×10⁷cfu/ml范围的植物乳杆菌种子液、屎肠球菌种子液和丁酸梭菌种子液；

S3、将1体积份植物乳杆菌种子液和2体积份屎肠球菌种子液接入装有94体积份混合发酵培养基的发酵罐中得到一级培养液，将一级培养液在37℃下培养4h，随后向一级培养液中接入3体积份丁酸梭菌种子液得到二级培养液，将二级培养液在37℃下培养22h至26h，整个培养过程都在搅拌条件下进行并通过添加pH调节剂将一级培养液和二级培养液的pH值控制在6.5至6.6；

S4、向二级培养液中添加冻干保护剂并搅拌混合得到菌悬液，使用pH调节剂将菌悬液的pH值调至6.8，随后对菌悬液进行冻干处理得到混合益生菌制剂。

混合发酵培养基包括22g/L至27.5g/L的葡萄糖、38g/L至43g/L的玉米淀粉、10g/L至15g/L的硫酸铵、13g/L至18g/L的酵母浸膏、30g/L至40g/L的蛋白胨、3g/L至5g/L的轻质碳酸钙、4g/L至6g/L的氯化钠、3g/L至5g/L的磷酸氢二钾、2g/L至4g/L的磷酸二氢钾、0.15g/L至0.25g/L的碳酸氢钠、0.08g/L至0.1g/L的硫酸锰、0.3g/L至0.4g/L的硫酸镁以及0.1g/L至0.2g/L的消泡剂，初始pH值为6.8至7.0。

由上可见，植物乳杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌分属两类益生菌，即乳酸杆菌属益生菌和芽孢杆菌属益生菌，生物特性上存在一定差别，具体的益生作用上也不尽相同，在混合益生菌制剂中可表现出很好的互补性。实验确定这三种菌接近于1：2：3的活菌数比例的益生菌组合在动物肠道内可起到显著的益生作用。通过科学配比出兼顾三种益生菌营养需求的混合发酵培养基并将混合培养过程划分为两个阶段可使两类益生菌表现出明显的互惠共生关系，从而实现三种益生菌的混合培养。依据两类益生菌的生物特性制定的两级混合培养方案相较于单独培养可显著提高三种益生菌的生物量，还可同时提高丁酸梭菌的芽孢率。另外，三种益生菌种群在混合发酵阶段已经相互适应，种群间的相互影响趋于平衡并达成稳定的共生关系，由于混合益生菌制剂中的全部活菌都来自于共生的菌群，进入动物肠道后不易发生拮抗。

上述两级混合培养方案的优越性体现在：一方面，丁酸梭菌的代谢产物对于植物乳杆菌和屎肠球菌具备营养功能，可使两种乳酸菌在对数生长后期得到营养物质方面的补充，进而解除营养限制、延长生长期并提高活菌数，另外两种乳酸菌的代谢产物对丁酸梭菌的生长也有促进作用；另一方面，两种乳酸菌更易利用小分子碳源，而大分子碳源有助于提高丁酸梭菌的芽孢率，丁酸梭菌在利用大分子碳源(比如玉米淀粉)时会分解出少量可供两种乳酸菌利用的小分子碳源，因此在发酵培养基中使用两种碳源，先培养两种乳酸菌消耗掉大部分小分子碳源(比如葡萄糖)后再加入丁酸梭菌有助于提高三种益生菌的生物量；再一方面，两种乳酸菌较为耐氧，一级培养阶段两种乳酸菌可充分消耗发酵罐中的氧气形成有利于丁酸梭菌的严格厌氧环境。

进一步的方案是，混合益生菌制剂含有34wt％至45wt％的冻干保护剂。

进一步的方案是，冻干保护剂按重量份计含有10至15份的脱脂乳粉、12至15份的蛋白胨以及12至15份的海藻糖。

由上可见，适度添加对三种益生菌都具备较好保护效果的复配冻干保护剂能够延长三种益生菌的保存期，同时还能提高三种益生菌的存活率。

进一步的方案是，步骤S4中的冻干处理过程是将菌悬液先置于-20℃下预冻12h至14h，随后在-30℃下真空冷冻干燥36h至48h。

由上可见，上述冻干工艺参数兼顾了三种益生菌的生物特性，能够保证冻干粉制剂中三种益生菌的生物活性。

进一步的方案是，混合益生菌制剂的含水量为6wt％至7wt％。

由上可见，将成品的含水量控制在上述范围有助于延长产品的保存期。

进一步的方案是，步骤S3及步骤S4中的搅拌转速均为75rpm至100rpm。

由上可见，虽然三种菌都可归为属于兼性厌氧菌种，但在培养过程中存在一系列复杂的营养物质转化过程，发酵环节引入适度的搅拌有利于营养物质的转化、分散和传递。

进一步的方案是，步骤S4中搅拌混合的时间为20min。

由上可见，较长的混合时间可保证菌悬液的稳定性，另外复配的冻干保护剂中某些活性成分需要与活菌充分作用才能发挥保护性功能，比如海藻糖需穿过细胞壁并作用于细胞膜后才能在冻干过程中替代细胞膜内原有的水分子与磷脂和蛋白质形成氢键才能起到维持细胞膜完整性的功能。

进一步的方案是，步骤S3中所述二级培养液的装填量占发酵罐总体积的70％。

进一步的方案是，pH调节剂为20wt％的氨水。

为实现上述第二目的，本发明提供一种混合益生菌制剂，其特殊之处在于，该混合益生菌制剂通过前述制备工艺制成。

具体实施方式

实施例一

本实施例提供一种混合益生菌制剂的制备工艺以及通过该制备工艺制成的混合益生菌制剂，该制备工艺包括以下步骤：

S1、从-80℃冷冻保存的对应于三种益生菌的甘油管中各取液体菌种100μL接种至装有200ml对应的种子培养基的三角瓶中，置于恒温培养箱中在37℃下静置培养12h至24h以实现对植物乳杆菌菌种、屎肠球菌菌种和丁酸梭菌菌种各自的活化处理。

其中，植物乳杆菌和屎肠球菌的种子培养基均采用不含琼脂的MRS培养基，该培养基的制备方法为：以1L蒸馏水溶解10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g醋酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁以及0.05g硫酸锰后在116℃高压灭菌20min。

丁酸梭菌种子培养基的配制方法为：以1L蒸馏水溶解10g的胰蛋白胨、22g的酵母浸粉、26g葡萄糖、1g无水硫酸铵、0.2g硫酸镁、1g碳酸氢钠、0.2g硫酸锰、0.2g氯化钙以及0.5g半胱氨酸后用氨水溶液调节pH值至6.8至7.0并在115℃下灭菌20min。

S2、按照5％的接种量将经过活化处理的植物乳杆菌菌种、屎肠球菌菌种和丁酸梭菌菌种分别接种至对应的种子培养基中并在37℃下静置培养，具体的培养时间上植物乳杆菌和屎肠球菌均为3h至5h，丁酸梭菌为8h至12h，从而得到活菌数均处于1×10⁷cfu/ml至2×10⁷cfu/ml范围的植物乳杆菌种子液、屎肠球菌种子液和丁酸梭菌种子液；

S3、选用100L规格的发酵罐按照70％的装填系数进行混合发酵，即将0.7L植物乳杆菌种子液和1.4L屎肠球菌种子液接入装有65.8L混合发酵培养基的100L规格发酵罐得到一级培养液，将一级培养液在37℃下培养4h，培养过程中辅以75rpm至100rpm转速的搅拌，同时使用20wt％的氨水作为pH调节剂在线调节一级培养液的pH值至6.5至6.6。

向一级培养液中接入2.1L丁酸梭菌种子液得到二级培养液，将二级培养液在37℃下继续培养22h至26h，培养时间超过12h以后每4h对二级培养液镜检并通过镜检结果来判定发酵终点。培养过程中同样辅以75rpm至100rpm转速的搅拌，同时使用20wt％的氨水作为pH调节剂在线调节二级培养液的pH值至6.5至6.6。

混合发酵培养基包括25g/L的葡萄糖、40g/L的玉米淀粉、10g/L的硫酸铵、15g/L的酵母浸膏、30g/L的蛋白胨、5g/L的轻质碳酸钙、5g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢二钾、2g/L的磷酸二氢钾、0.2g/L的碳酸氢钠、0.08g/L的硫酸锰、0.35g/L的硫酸镁以及0.1g/L的GPE型消泡剂，该培养基需用氨水溶液调节初始pH值至为6.8至7.0，并在121℃下灭菌20min。

S4、向二级培养液中添加冻干保护剂并在75rpm至100rpm的转速下搅拌混合20min得到菌悬液，使用20wt％的氨水将菌悬液的pH值调至6.8后转入无菌的冻干搁置板中，装液厚度控制在3cm至4cm，随后将冻干搁置板放入低温冷冻冰箱进行预冻，预冻温度为-20℃，预冻时间为12h。将预冻好的菌悬液转入冷冻干燥机中并在-30℃下真空冷冻干燥40h得到混合益生菌制剂成品。

经检测混合益生菌制剂成品含有11wt％的脱脂乳粉、14wt％的蛋白胨和12wt％海藻糖，即总计37wt％的冻干保护剂，混合益生菌制剂成品的含水量在6wt％至7wt％。

实施例二

本实施例提供一种混合益生菌制剂的制备工艺及通过该工艺制成的混合益生菌制剂，该制备工艺与实施例一基本相同的，区别仅表现在以下几个方面：

本实施例使用的混合发酵培养基包括22g/L的葡萄糖、43g/L的玉米淀粉、12g/L的硫酸铵、13g/L的酵母浸膏、35g/L的蛋白胨、4g/L的轻质碳酸钙、4g/L的氯化钠、3g/L的磷酸氢二钾、3g/L的磷酸二氢钾、0.25g/L的碳酸氢钠、0.09g/L的硫酸锰、0.3g/L的硫酸镁以及0.12g/L的GPE型消泡剂；步骤S4中-20℃下的预冻时间为12.5h，-30℃下的冷冻干燥时间为38h。

经检测混合益生菌制剂成品含有14wt％的脱脂乳粉、12wt％的蛋白胨和14wt％海藻糖，即总计40wt％的冻干保护剂，混合益生菌制剂成品的含水量在6wt％至7wt％。

实施例三

本实施例提供一种混合益生菌制剂的制备工艺及通过该工艺制成的混合益生菌制剂，该制备工艺与实施例一基本相同的，区别仅表现在以下几个方面：

本实施例使用的混合发酵培养基包括26g/L的葡萄糖、38g/L的玉米淀粉、15g/L的硫酸铵、16g/L的酵母浸膏、38g/L的蛋白胨、3g/L的轻质碳酸钙、6g/L的氯化钠、4g/L的磷酸氢二钾、4g/L的磷酸二氢钾、0.15g/L的碳酸氢钠、0.1g/L的硫酸锰、0.4g/L的硫酸镁以及0.15g/L的GPE型消泡剂；步骤S4中-20℃下的预冻时间为13h，-30℃下的冷冻干燥时间为36h。

经检测混合益生菌制剂成品含有10wt％的脱脂乳粉、12wt％的蛋白胨和12wt％海藻糖，即总计34wt％的冻干保护剂，混合益生菌制剂成品的含水量在6wt％至7wt％。

实施例四

本实施例提供一种混合益生菌制剂的制备工艺及通过该工艺制成的混合益生菌制剂，该制备工艺与实施例一基本相同的，区别仅表现在以下几个方面：

本实施例使用的混合发酵培养基包括27.5g/L的葡萄糖、42g/L的玉米淀粉、11g/L的硫酸铵、18g/L的酵母浸膏、40g/L的蛋白胨、3.5g/L的轻质碳酸钙、4.5g/L的氯化钠、3.5g/L的磷酸氢二钾、3.5g/L的磷酸二氢钾、0.18g/L的碳酸氢钠、0.09g/L的硫酸锰、0.33g/L的硫酸镁以及0.2g/L的GPE型消泡剂；步骤S4中-20℃下的预冻时间为14h，-30℃下的冷冻干燥时间为48h。

经检测混合益生菌制剂成品含有15wt％的脱脂乳粉、13wt％的蛋白胨和13wt％海藻糖，即总计41wt％的冻干保护剂，混合益生菌制剂成品的含水量在6wt％至7wt％。

实施例五

本实施例提供一种混合益生菌制剂的制备工艺及通过该工艺制成的混合益生菌制剂，该制备工艺与实施例一基本相同的，区别仅表现在以下几个方面：

本实施例使用的混合发酵培养基包括23g/L的葡萄糖、41g/L的玉米淀粉、14g/L的硫酸铵、17g/L的酵母浸膏、32g/L的蛋白胨、3g/L的轻质碳酸钙、6g/L的氯化钠、3g/L的磷酸氢二钾、4g/L的磷酸二氢钾、0.22g/L的碳酸氢钠、0.08g/L的硫酸锰、0.38g/L的硫酸镁以及0.18g/L的GPE型消泡剂；步骤S4中-20℃下的预冻时间为13.5h，-30℃下的冷冻干燥时间为44h。

经检测混合益生菌制剂成品含有15wt％的脱脂乳粉、15wt％的蛋白胨和15wt％海藻糖，即总计45wt％的冻干保护剂，混合益生菌制剂成品的含水量在6wt％至7wt％。

活菌计数对比实验

参照实施例一中的方法对植物乳杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌进行混合培养，步骤S3中三种益生菌的接种顺序及间隔时间按照下列条件执行：

(1)A组：将0.7L植物乳杆菌种子液、1.4L屎肠球菌种子液和2.1L丁酸梭菌种子液同时接入65.8L混合发酵培养基中在37℃下进行混合培养；

(2)B组：将0.7L植物乳杆菌种子液和1.4L屎肠球菌种子液同时接入65.8L混合发酵培养基中，37℃下培养4h后接入2.1L丁酸梭菌种子液继续在37℃下进行混合培养(接种顺序和接种时间与步骤S3完全相同)；

(3)C组：将0.7L植物乳杆菌种子液和1.4L屎肠球菌种子液同时接入65.8L混合发酵培养基中，37℃下培养8h后接入2.1L丁酸梭菌种子液继续在37℃下进行混合培养；

三组混合培养实验中混合培养液的发酵终点都通过镜检确定，混合培养结束后对混合培养液中的两类益生菌以及丁酸梭菌芽孢分别进行计数，在进行丁酸梭菌芽孢时计数前需将混合培养液的一级稀释液置于80℃下水浴处理10min。

乳酸菌的选择性计数培养基为添加过万古霉素的MRS培养基，该培养基的制备方法为：以1L蒸馏水溶解10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g醋酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉以及10mg万古霉素后在116℃下高压灭菌20min。

丁酸梭菌及其芽孢的选择性计数培养基为添加过多粘菌素B的TPY培养基，该培养基的制备方法为：以1L蒸馏水溶解10g胰蛋白胨，5g大豆蛋白胨，3g酵母粉，10g蛋白胨，10g葡萄糖，0.3g的L-半胱氨酸盐酸盐，2.5g磷酸二氢钾，3g氯化钠，0.3g硫代乙醇酸钠、20g琼脂粉和20mg多粘菌素B后在116℃下高压灭菌20min。

三个实验组的两类益生菌的总菌数计数结果以及丁酸梭菌的芽孢率如表1所示，由表1可见，将两类益生菌分开接种，并将接种间隔时间控制在4h所获得的混合培养液在两类益生菌的总菌数以及丁酸梭菌芽孢率上都优于另外两组的混合培养实验结果，因此间隔4h接种能够充分利用两类益生菌的互惠共生作用获得最佳的混合培养效果。

表1：不同接种顺序和时间间隔下的计数及芽孢率结果

	A组	B组	C组
				乳酸菌总菌数(cfu/ml)	3.6×10<sup>8</sup>	6.2×10<sup>8</sup>	4.8×10<sup>8</sup>
丁酸梭菌总菌数(cfu/ml)	1.1×10<sup>7</sup>	5.7×10<sup>8</sup>	3.9×10<sup>8</sup>
				丁酸梭菌芽孢率(％)	47.1	95.8	84.1

注：表中的乳酸菌总菌数代表植物乳杆菌和屎肠球菌的总菌数之和，丁酸梭菌芽孢率(％)＝(丁酸梭菌芽孢数/丁酸梭菌总菌数)×100％。

体外抑菌对比实验

取前述活菌计数对比实验中A组、B组和C组培养至发酵终点的混合培养液在10000rpm转速下离心20min后取上清液，并用NaOH溶液调节pH值至6.8后做以大肠杆菌、金换色葡萄球菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌作为病原指示菌的体外抑菌实验。

制备pH6.8的LB液体培养基(胰蛋白酶10g/L,酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)和LB固体培养基(在LB液体培养基的基础上添加15g/L的琼脂粉)，将牛津杯、200μL移液枪头、西林瓶、10mL离心管在121℃下高压灭菌后烘干备用。在无菌操作台内制作LB固体培养基平板，每个平板倒入15mL的LB固体培养基，通风放冷后加盖备用。

从-4℃的冰箱内取出4种病原指示菌的菌种液并恢复至室温后均按1％的接种量接种至含LB液体培养基的西林瓶中，并在200r/min和37℃的条件下摇床培养过夜后适度稀释得到OD600值在0.145至0.150范围内的病原指示菌培养液。

取0.1ml病原指示菌培养液涂布于LB固体培养基平板上，之后在每个LB固体培养基平板上放置3个牛津杯，通过移液枪向每个牛津杯中垂直加入200μL的pH6.8混合培养液上清液，并以pH6.8的无菌水做空白对照，随后将LB固体培养基平板置于37℃培养箱中培养24h。

三个实验组的体外抑菌实验结果如表2所示，由表2可见，将两类益生菌分开接种，并将接种间隔时间控制在4h所获得的混合培养液上清液对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌这4种病原菌的抑菌圈直径明显大于另外两个实验组对应的抑菌圈直径，表明其对于常见的肠道致病菌具有更强的抑菌活性。

表2：混合发酵液上清液对于4种病原指示菌的抑菌效果

注：表格中各抑菌圈直径竖直均已排除空白对照的影响。

动物养殖实验

选取体重20kg左右的杜×长×大仔猪288头，分为3个实验组和1个对照组，按照每个组6个重复，每个重复12头进行养殖对比实验，试验期21天。

取前述活菌计数对比实验中A组、B组和C组培养至发酵终点的混合培养液按照实施例一中的步骤S4制备得到对应的混合益生菌制剂成品，将上述各混合益生菌制剂成品按照100g/t的比例分别添加至基础日粮中作为实验组1至3中的仔猪日粮，对照组中的仔猪则仅饲喂基础日粮(未添加任何益生菌制剂)。实验期间观察各组猪群的采食和饮水情况，记录采食量以及实验开始和结束时仔猪的体重，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。

3个实验组和对照组中仔猪的增重情况如表3所示，由表3可知，将两类益生菌分开接种，并将接种间隔时间控制在4h所对应的混合益生菌制剂相较于对照组能明显改善仔猪的平均日增重量和料重比，并且改善效果也优于其他两个实验组，这说明按照一定的菌种接种顺序和接种间隔时间得到的混合益生菌制剂产品的性能优于普通的混合发酵产品。

表3：混合益生菌制剂对仔猪体重的影响

	对照组	实验组1	实验组2	实验组3
					日增重(g)	580.7<sup>a</sup>	608.2<sup>ab</sup>	645.7<sup>b</sup>	643.3<sup>b</sup>
料重比	2.13<sup>a</sup>	2.05<sup>b</sup>	1.93<sup>c</sup>	1.96<sup>c</sup>
					采食量(kg/日)	1.24	1.25	1.25	1.26

注：表中数据标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Claims (10)

1.一种混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于，包括下列步骤：

S1、对植物乳杆菌菌种、屎肠球菌菌种和丁酸梭菌菌种分别进行活化处理；

S2、对经过活化处理的植物乳杆菌菌种、屎肠球菌菌种和丁酸梭菌菌种分别进行扩大培养并得到活菌数均处于1×10⁷cfu/ml至2×10⁷cfu/ml范围的植物乳杆菌种子液、屎肠球菌种子液和丁酸梭菌种子液；

S3、将1体积份所述植物乳杆菌种子液和2体积份所述屎肠球菌种子液接入装有94体积份混合发酵培养基的发酵罐中得到一级培养液，将所述一级培养液在37℃下培养4h，随后向一级培养液中接入3体积份所述丁酸梭菌种子液得到二级培养液，将所述二级培养液在37℃下培养22h至26h，整个培养过程都在搅拌条件下进行并通过添加pH调节剂将所述一级培养液和所述二级培养液的pH值控制在6.5至6.6；

S4、向所述二级培养液中添加冻干保护剂并搅拌混合得到菌悬液，使用pH调节剂将所述菌悬液的pH值调至6.8，随后对所述菌悬液进行冻干处理得到混合益生菌制剂；

所述混合发酵培养基包括22g/L至27.5g/L的葡萄糖、38g/L至43g/L的玉米淀粉、10g/L至15g/L的硫酸铵、13g/L至18g/L的酵母浸膏、30g/L至40g/L的蛋白胨、3g/L至5g/L的轻质碳酸钙、4g/L至6g/L的氯化钠、3g/L至5g/L的磷酸氢二钾、2g/L至4g/L的磷酸二氢钾、0.15g/L至0.25g/L的碳酸氢钠、0.08g/L至0.1g/L的硫酸锰、0.3g/L至0.4g/L的硫酸镁以及0.1g/L至0.2g/L的消泡剂，初始pH值为6.8至7.0。

2.如权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

所述混合益生菌制剂含有34wt％至45wt％的所述冻干保护剂。

3.如权利要求2所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

所述冻干保护剂按重量份计含有10至15份的脱脂乳粉、12至15份的蛋白胨以及12至15份的海藻糖。

4.权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

步骤S4中的冻干处理过程是将所述菌悬液先置于-20℃下预冻12h至14h，随后在-30℃下真空冷冻干燥36h至48h。

5.如权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

所述混合益生菌制剂的含水量为6wt％至7wt％。

6.如权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

步骤S3及步骤S4中的搅拌转速均为75rpm至100rpm。

7.如权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

步骤S4中搅拌混合的时间为20min。

8.如权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

步骤S3中所述二级培养液的装填量占所述发酵罐总体积的70％。

9.如权利要求1所述的混合益生菌制剂的制备工艺，其特征在于：

所述pH调节剂为20wt％的氨水。

10.一种混合益生菌制剂，其特征在于：

该混合益生菌制剂通过权利要求1至9中任意一项所述的制备工艺制成。