CN114888054B - 一种多功能过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用 - Google Patents
一种多功能过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多功能过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用，属于酶工程技术领域。本发明提供了刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)来源的多功能过氧化物酶在聚乙烯降解中的新用途，并通过优化酶解反应体系，以苹果酸缓冲液提供反应环境，通过H2O2启动酶解反应，在30℃，200rpm条件下反应72h后的聚乙烯薄膜部分降解为醛、酮、醇、酸类等小分子化合物，使降解后的薄膜表面存在明显刻蚀，亲水性得到明显增强。本发明提供的降解紫外处理聚乙烯薄膜的方法，反应条件温和、环境友好在塑料产品生物降解领域具备较为理想的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种多功能过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
塑料是以单体为原料，通过加聚或缩聚反应聚合而成的高分子化合物。大部分塑料化学性能稳定，抗腐蚀能力强，制造成本低，是重要的有机合成高分子材料，应用非常广泛。
根据合成塑料单体连接方式及碳链类型，可将塑料分为聚烯烃类和聚酯类。聚酯类塑料由多元醇和多元酸缩聚而成，主要指聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，由于存在可水解的酯键，在很多报道中已实现了高效降解。聚烯烃类塑料通常是乙烯、丙烯或高级烯烃的聚合物，具有极强的物理化学稳定性，聚烯烃类塑料的生物降解效果甚微，目前还处在微生物筛选和酶类鉴定阶段，关于微生物和酶类的降解途径及机理还未做深入研究。一些众所周知的微生物已被报道为聚烯烃降解菌，如白腐真菌、红球菌、绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、褐单孢菌、粪产碱杆菌、梭菌等。
聚乙烯(PE)是塑料垃圾的主要来源，加之难以降解。这使得PE塑料垃圾在环境中持续积累，对生态构成了严重的威胁。目前已报道的PE降解酶比酶活不高，降解效果比较微弱，且降解过程及机理不明，亟待开发新的降解效率更高的PE降解酶。
发明内容
本发明提供了刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)来源的多功能过氧化物酶在降解聚乙烯或含聚乙烯的塑料中的应用。
在一种实施方式中，所述多功能过氧化物酶的氨基酸序列如O94753.1所示。
在一种实施方式中，所述含聚乙烯的塑料包括但不限于聚乙烯薄膜。
在一种实施方式中，所述聚乙烯薄膜经紫外预处理。
在一种实施方式中，所述紫外预处理是将聚乙烯薄膜在60～80℃、UV辐射强度为150～250V的条件下处理至少4天，或至少8天，获得经紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)。
本发明还提供了一种降解含聚乙烯的塑料产品的方法，包括步骤(a)、(b)：
(a)将含聚乙烯的塑料产品进行紫外辐照处理；
(b)将步骤(a)处理后的含聚乙烯的塑料产品与多功能过氧化物酶在溶液环境中接触，并发生酶解反应。
在一种实施方式中，步骤(b)的反应体系为10mL反应体系中包含面积1-9cm2厚度10～20μm、质量25～200mg的聚乙烯塑料薄膜。
在一种实施方式中，步骤(b)的反应体系中多功能过氧化物酶的作用剂量≥0.1U/mg塑料产品。
在一种实施方式中，所述多功能过氧化物酶的初始添加量为1U/mL，每隔24h补加1U/mL的酶液。
在一种实施方式中，所述反应的温度≥30℃，pH为4.5～5.5。
在一种实施方式中，所述酶解反应的温度为30℃，降解时间为72h。
在一种实施方式中，所述酶解反应在苹果酸-苹果酸钠缓冲液中进行。
在一种实施方式中，所述苹果酸-苹果酸钠缓冲液的浓度≥25mM，或≥50mM，或浓度为50～75mM。
在一种实施方式中，所述苹果酸-苹果酸钠缓冲液的pH为4.5～5.5。
在一种实施方式中，所述多功能过氧化物酶由微生物发酵制得。
在一种实施方式中，所述多功能过氧化物酶的制备方法包括：
(1)将SEQ ID NO.1所示的PEvp基因与pET载体连接，并转化至大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌；
(2)将重组大肠杆菌在适宜的温度下培养，收集培养物中的多功能过氧化物酶。
在一种实施方式中，所述多功能过氧化物酶还经过变性、复性处理。
本发明还提供了编码氨基酸序列如O94753.1所示的多功能过氧化物酶的基因、含有多功能过氧化物酶的基因的重组质粒、携带多功能过氧化物酶的基因的宿主细胞。
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET系列质粒。
在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-24a(+)质粒。
在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21。
本发明还提供所述多功能过氧化物酶、携带多功能过氧化物酶的重组微生物细胞，或所述方法在塑料产品降解方面的应用。
在一种实施方式中，所述塑料产品包括但不限于刚性或柔性包装(薄膜、瓶、托盘)、农用薄膜、袋、一次性物品、纺织品、织物、无纺布、地板覆盖物、塑料废物或纤维废物等。
有益效果：
(1)本发明提供了一种可降解紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)的多功能过氧化物酶，将多功能过氧化物酶加入含有紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)、4mM MnSO4的75mM的苹果酸缓冲液中(pH 4.5)，添加0.2mM H2O2启动酶解反应，其在30℃，200rpm条件下反应72h，在中间反应过程中每隔24h补加1U/mL的酶量，每隔12h补加0.1mM H2O2水溶液。可使紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)部分降解为醛、酮、醇、酸类等小分子化合物，其薄膜表面存在明显刻蚀，亲水性得到明显增强。
相比于公开号为CN113897378A的锰过氧化物酶，按照终浓度1U/mL的加酶量所需酶蛋白为0.06mg/mL，本发明中的多功能过氧化物酶1U/mL加酶量所需酶蛋白为0.03mg/mL，酶的用量减少一倍即可达到相同或更优的降解效果。
(2)本发明提供了一种降解紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)的方法，该方法反应条件温和、环境友好，因此本发明提供的多功能过氧化物酶在降解紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)中具备极高的应用前景。
(3)本发明对酶解紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)的反应体系进行了优化，以苹果酸缓冲液提供反应环境，通过H2O2启动酶解反应，提高了UVPE的降解效率。
附图说明
图1：多功能过氧化物酶的SDS-PAGE分析；其中，M为蛋白质分子量标准；泳道1、3、5分别对应IPTG终浓度为0、0.2和0.4mM的细胞裂解上清液蛋白；2、4、6分别对应IPTG终浓度为0，0.2和0.4mM的包涵体蛋白，箭头代表目的条带。
图2：多功能过氧化物酶的酶学性质；其中(A)为最适温度，(B)为最适pH，(C)为温度稳定性。
图3：多功能过氧化物酶对紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)扫描电子显微镜(SEM)检测结果。
图4：多功能过氧化物酶对紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)傅立叶变换红外光谱(FTIR)检测结果；线条以左侧起始处从上往下，分别代表UVPE组、UVPE对照组、UVPE实验组。
图5：多功能过氧化物酶Pevp对UVPE8薄膜降解产物GC-MS分析及产物类型比例。
图6：多功能过氧化物酶对紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)亲水角(Contact Angle)检测结果；其中，A是UVPE-对照组，B是UVPE-实验组。
图7：有机酸类型对多功能过氧化物酶Pevp活性的影响。
图8：苹果酸缓冲液浓度对多功能过氧化物酶Pevp活性的影响。
图9：H2O2浓度对多功能过氧化物酶Pevp活性的影响。
图10：Mn2+浓度对多功能过氧化物酶Pevp活性的影响。
图11：多功能过氧化物酶Pevp对UVPE4薄膜降解产物的GC-MS分析及产物类型比例。
具体实施方式
技术术语：
降解：塑料或含PE的塑料的“降解”是指将塑料材料的聚合物分解成更小的分子，例如单体和/或低聚物。在本发明的情况下，用于降解PE或含PE的塑料材料是指将塑料中的PE降解成单体(如苯乙烯)和/或醛、酮、羧酸、烷烃类物质等。
塑料：术语“塑料”或“塑料材料”是指塑料产品(例如片材、托盘、薄膜、管、块、纤维、织物等)以及用于制造塑料产品的塑料组合物。除了聚合物之外，塑料材料还可以包含其他物质或添加剂，例如增塑剂、矿物或有机填料、染料等。因此，在本发明的上下文中，塑料材料是指包含至少一种半结晶和/或无定形形式的聚合物，特别是至少一种聚乙烯的任何塑料产品和/或塑料组合物。
塑料产品：术语“塑料产品”包括经制造的含塑料的产品，例如刚性或柔性包装(薄膜、瓶、托盘)、农用薄膜、袋、一次性物品、纺织品、织物、无纺布、地板覆盖物、塑料废物或纤维废物等。
聚合物：术语“聚合物”是指其结构由通过化学共价键连接的多个重复单元(即“单体”)组成的化合物。在本发明的上下文中，在不做特别说明的情况下，“聚合物”更具体地是指在塑料材料的组合物中使用的此类化合物。
紫外预处理：本发明所指的“紫外预处理”是指在酶反应前对聚乙烯材料或含聚乙烯的材料所作的处理，包括但不限于通过紫外辐照等方式使待处理的材料发生氧化。
紫外预处理聚乙烯薄膜：本发明所指的“紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)”是指经UV辐照后表面发生了一定程度刻蚀现象的聚乙烯薄膜；所述UV辐照的强度范围为100-250V；可选地，为了保证紫外照射的均一性，可以每隔一段时间(例如12～24h)对聚乙烯薄膜进行翻面处理。
下述实施例中涉及的材料及试剂：
下述实施例中涉及的LDPE薄膜购自淘宝网店诚信塑料五金包装，颜色透明，拉伸比例为400％，厚度为20μm；羟高铁血红素(HEMATIN)、二硫苏糖醇(DTT)购自国药试剂；氧化型谷胱甘肽(GSSG)购自西安雅图生物科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10、琼脂13，pH 7.0。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10，pH 7.0。
TB液体培养基(g/L)：蛋白胨12、酵母粉24、甘油4mL、磷酸二氢钾2.31、磷酸氢二钾12.54。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
多功能过氧化物酶酶活测定方法：
总反应体系为1mL：pH 4.5的50mM的苹果酸缓冲液，1.0mM的MnSO2溶液，酶液50μL，在25℃条件下，加入0.1mM的H2O2溶液启动反应，连续观察反应最初3min内240nm处吸光度的变化(EM240＝6500L·mol-1cm-1)，酶活力定义为：每min使1μmo1的Mn2+转化为Mn3+所需的酶量为一个酶活力单位(U)。计算公式如下所示：
N：酶液稀释倍数；
V总：测活反应的总体积(mL)；
V酶：反应添加的酶液体积(mL)；
T：反应时间(min)；
ΔOD240：T时间内反应液在240nm处波长的增加；
L：比色皿的直径(cm)；
6500：240nm处Mn2+转化为Mn3+的摩尔吸光系数(L·mol-1cm-1)。
聚乙烯(PE)塑料薄膜表面微观结构的检测方法：
将经多功能过氧化物酶处理后紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)，用去离子水反复清洗3～4次；将清洗完的薄膜依次用2％SDS(v/v)、去离子水、50％乙醇分别超声清洗两遍以除去薄膜表面的蛋白等杂质，每次30min。结束漂洗后将膜片包入称量纸内放置在60℃的烘箱进行烘干。以未经处理的紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)为对照，使用扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)以及亲水角(Contact Angle)检测未经处理的紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)表面以及经多功能过氧化物酶处理后紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)表面微观结构。
实施例1携带多功能过氧化物酶基因的重组质粒的构建
利用化学方法将编码如O94753.1所示多功能过氧化物酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)合成到载体pET-24a(+)上NdeI和EcoRI酶切位点之间，获得重组质粒pET-24a(+)-PEvp，将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有40μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pET-24a(+)-PEvp。
实施例2表达多功能过氧化物酶的重组大肠杆菌的构建
将实施例1构建的重组质粒pET-24a(+)-PEvp转化大肠杆菌Escherichia coliBL21感受态细胞中，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-24a(+)-PEvp。
实施例3重组大肠杆菌摇瓶发酵产多功能过氧化物酶
将实施例2在37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后获得的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-24a(+)-PEvp菌液以5％(v/v)的接种量转接至100mL的TB液体培养基中，于37℃、200rpm摇床培养3h至OD600＝0.8后添加IPTG至终浓度为0.4mM，于25℃、200rpm继续摇床培养20h，获得发酵液。
将发酵液于8000rpm的条件下离心15min取沉淀；用pH 7.0 10mM Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀，获得重悬液；将重悬液用高压匀浆机于压力为800Bar的条件下破壁，得到破壁液；将破壁液于8000rpm的条件下离心15min，将破壁上清、破壁沉淀分离。
分别对发酵上清液、破壁上清液、破壁沉淀三部分进行酶活测定，发现均没有酶活，证明该重组多功能过氧化物酶未有可溶性表达。破壁沉淀经SDS-PAGE分析显示在37kDa条带出存在粗的蛋白带，即为多功能过氧化物酶。
实施例4多功能过氧化物酶的体外变复性
变性：将实施例3制备获得的破壁沉淀(包涵体沉淀)溶于pH＝9.5的50mM的Tris-HCl缓冲液，加入8M的尿素，1mM的EDTA，5mM的DTT，和10％的甘油。4℃静置4-5h。
复性：将蛋白变性液加入到复性体系中(pH 9.5Tis-HCl缓冲液、0.5M尿素、0.5mMGSSG、0.1mM DTT、0.1mM EDTA、5mM CaCl2、10％甘油、5μM血红素)，4℃静置透析24h，5μM血红素孵育12h。多功能过氧化物酶蛋白复性胶图(如图1所示)，酶活达10.14U/mL，蛋白浓度为0.29mg/mL，比酶活力为34.97U/mg。
实施例5多功能过氧化物酶的酶学性质
1、最适反应温度
如酶活测定体系，取0.93mL 50mmol·L-1的苹果酸缓冲液(pH 4.5)至0.5cm石英比色皿中，加入50uL待测稀释样品和1.0mmol·L-1的MnSO2溶液，将混合液分别置于25、30、40、50、60℃水浴中预热5min后，加入0.1mmol·L-1的H2O2溶液启动反应，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长240nm处测A值，每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。将酶活最高的组别记为100％酶活，计算各个温度下多功能过氧化物酶的相对酶活(检测结果见图2A)，结果显示，多功能过氧化物酶在70℃的酶活力可达18.44U/mL，在60～70℃的相对酶活保持在90％以上。
2、最适反应pH
取0.93mL 50mmol·L-1的苹果酸缓冲液缓冲液(pH分别为3.0、3.5、4.5、5.5、6.5)至0.5cm石英比色皿中，加入50uL待测稀释样品和1.0mmol·L-1的MnSO2溶液，将混合液置于30℃水浴中预热5min后，然后加入0.1mmol·L-1的H2O2启动反应，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长240nm处测A值，每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。以酶活最高的为100％，计算各个pH下多功能过氧化物酶的相对酶活(检测结果见图2B)。结果显示，多功能过氧化物酶在pH 4.5时显示出最高酶活力，在pH 4.5～6.5的范围内相对酶活保持在80％以上。
3、温度稳定性
取0.93mL 50mmol·L-1的苹果酸缓冲液(pH 4.5)至0.5cm石英比色皿中，加入50uL待测稀释样品和1.0mmol·L-1的MnSO2溶液，将混合液分别置于30、40、50、60、70℃水浴中，分别测定不同温度条件下多功能过氧化物酶在12、24、36、48、60h的酶活。加入10uL H2O2启动反应，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长240nm处测A值，每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。以酶活最高的为100％，计算各个温度下多功能过氧化物酶的酶活稳定性(检测结果见图2C)，结果显示，多功能过氧化物酶在30℃条件下，24h PEvp的残留Mn2+活性为71.47％，半衰期在48-60h之间，60h的相对酶活为44％左右；在40℃半衰期在24h左右，低于40℃后的半衰期接近甚至低于12h。
实施例6建立用于紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)降解的反应体系
取购买的PE薄膜，裁剪成30cm×30cm的规格，固定在紫外老化箱(艾斯瑞仪器科技有限公司，中国)的辐照隔层中，在T＝70℃，于UV辐射强度为100-250V的条件下进行预处理。为了保证紫外照射的均一性，每隔24h对聚乙烯薄膜进行翻面处理；取外辐照8d的聚乙烯薄膜进行留样，作为经紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)。
将刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)来源的多功能过氧化物酶加入含有尺寸为2cm×2cm，质量约100mg的紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)、2-6mM MnSO4、pH 4.5、浓度为50-100mM的苹果酸缓冲液中，添加0.2-0.6mM H2O2启动酶解反应72h。
实施例7紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)的降解
取购买的PE薄膜，裁剪成30cm×30cm的规格，固定在紫外老化箱(艾斯瑞仪器科技有限公司，中国)的辐照隔层中，在T＝70℃，于UV辐射强度为200V的条件下进行预处理。为了保证紫外照射的均一性，每隔24h对聚乙烯薄膜进行翻面处理；取紫外辐照8d的聚乙烯薄膜进行留样，作为经紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)。
将刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)来源的多功能过氧化物酶加入含紫外辐照8d的尺寸为2cm×2cm，厚度20μm、质量约100mg的紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE8)、4mM MnSO4、pH4.5、75mM的苹果酸缓冲液中，添加0.2mM H2O2启动酶解反应，初始加酶量为1U/mL(相当于0.1U/mg聚乙烯薄膜，酶蛋白终浓度为0.06mg/mL反应体系)，反应体系共10mL，在30℃，200rpm条件下反应72h，反应过程中每隔24h补加终浓度1U/mL的酶量，每隔12h补加H2O2水溶液使其终浓度为0.1mM。
UVPE-对照组：实验步骤与上述操作一致，区别在于，用相同体积的苹果酸缓冲液代替酶液。
UVPE组：仅对聚乙烯薄膜按照上述方法进行紫外预处理，不进行任何酶解孵育操作。
酶解反应结束后，使用尼龙滤布过滤出反应后的膜片，回收滤液。依次用2％SDS(v/v)、去离子水、50％乙醇分别超声清洗两遍以除去薄膜表面的蛋白等杂质，每次30min。结束漂洗后将膜片包入称量纸内放置在60℃的烘箱进行烘干。烘干后的PE材料进行扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、亲水角(Contact Angle)的检测。
检测经多功能过氧化物酶处理后的紫外预处理聚乙烯薄膜(UVPE)的表面微观结构可知，UVPE表面变得粗糙不平，出现斑点和坑洼，UVPE-对照组除了表面出现一些物理的划痕外，无裂痕和空洞现象。SEM检测结果见图3示。
FTIR检测结果见图4所示，线条从上往下，分别代表原始UVPE、UVPE-对照、UVPE-实验。在多功能过氧化物酶的酶解作用下，多功能过氧化物酶处理的UVPE薄膜的羧基、醛基等官能团明显增加，该官能团的变化在一定程度上证明了多功能过氧化物酶对UVPE的生物降解效果。
GC-MS分析有助于确定特定的产物类型，并为阐明络合体系作用UVPE的具体过程和途径提供重要信息。GC/MS检测结果见图5所示，UVPE-实验组的酶解反应液中生成了C4-C14的酮类、醛类和醇类物质，辛醛、壬醛、庚醛、十三醛含量最为丰富。由于实验所用的PE薄膜中存在少量的短枝甲基，GC-MS检测到的醛类和酮类可能是UVPE分子中的C＝C氧化断裂的产物，分别产生醛类[CH3(CH2)nCOH]和酮类[CH3(CH2)nCOCH3]化合物。PEvp介导的Mn(III)-有机酸络合体系可能会引发UVPE分子的自由基反应，通过电子的转移及键能的降低，导致C-C键的断裂，引发一系列醛、酮类物质产生，实现UVPE的氧化降解。UVPE-实验组的酶解产物中，醛类物质含量最多，约占总产物的80％，酮类和醇类所占比例较小。
亲水角检测结果见图6所示，在多功能过氧化物酶的酶解作用下，UVPE薄膜亲水角降低26.8゜。UVPE酶解的亲水角分析表明：多功能过氧化物酶改变了UVPE表面的亲水性，UVPE的亲水性能得到加强。
对比例1：
具体实施方式同实施例7，区别在于，将pH 4.5 75mM的苹果酸缓冲液分别替换为浓度为75mM的柠檬酸、丁二酸、草酸、酒石酸、乙酸，结果显示(图7)，替换缓冲液后的多功能过氧化物酶相对酶活均低于苹果酸缓冲液体系相对酶活的50％。
对比例2：
具体实施方式同实施例7，区别在于，将苹果酸缓冲液浓度调整为10-100mM，结果显示(图8)，Pevp活性在苹果酸缓冲液浓度为25～100mM时相对酶活达90％以上。
对比例3：
具体实施方式同实施例7，区别在于，将H2O2浓度调整为0-0.6mM，结果显示(图9)，Pevp活性在H2O2浓度为0.1～0.6mM时相对酶活达82％以上。
对比例4：
具体实施方式同实施例7，区别在于，将Mn2+浓度调整为0-6mM，结果显示Pevp活性在Mn2+浓度为2-6mM时相对酶活达90％以上。
对比例5：
具体实施方式同实施例7，区别在于，将UV辐照时间调整为4d，结果显示，处理4d的PE薄膜(UVPE4)表面呈现不同程度的雾化及表面产生破碎现象，物理强度大幅度下降。经PEvp酶解后的UV处理4d的薄膜表面凹凸不平出现一定的刻蚀现象；而实施例6紫外预处理8d的薄膜，产生了更多的氧化官能团。
按照相同的方法利用PEvp对UVPE4进行酶降解，其降解产物GC-MS分析结果如图11所示，PEvp-UVPE4实验组的酶解反应液中同样生成了C4-C14的酮类、醛类和醇类物质，其中辛醛、壬醛、庚醛含量最为丰富。出现了明显的羰基吸收带(1600-1700cm-1)，包括酮羰基(C＝O)、醛羰基(-CHO)和羧基(-COOH)。但其产物丰度和产物类型中醛类和酮类产物比例均低于PEvp-UVPE8实验组，表明Pevp对UVPE8氧化降解效果更为显著。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种多功能过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用
<130> GBAA220718B
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1010
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaattcgcga cctgcgatga tggccgcacc accgcgaacg cggcgtgctg cattctgttt 60
ccgattctgg atgatattca agaaaacctg tttgatggcg cgcagtgcgg cgaagaagtg 120
catgaaagcc tgcgcctgac ctttcatgat gcgattggct tcagcccgac cctgggcggc 180
ggcggcgcgg atggcagcat tattgcgttt gataccattg aaaccaactt tccggcgaac 240
gcgggcattg atgaaattgt gagcgcgcag aaaccgtttg tggcgaaaca taacattagc 300
gcgggcgatt ttattcagtt tgcgggcgcg gtgggcgtga gcaactgccc gggcggcgtg 360
cgcattccgt tttttctggg ccgcccggat gcggtggcgg cgagcccgga tcatctggtg 420
ccggaacctt ttgacagcgt agacagcatt ctggcgcgca tgggcgatgc tggctttagc 480
ccggtggaag tggtgtggct gctggcgagc catagcattg cggcggcgga taaagtggat 540
ccgagcattc cgggcacccc gtttgatagc acgcccggcg tgtttgatag tcagtttttt 600
attgaaacgc agctgaaagg ccgcctgttt ccgggcaccg cggataacaa aggcgaagcg 660
cagagcccgc tgcaaggcga aattcgcctg cagagcgatc atctgctggc gcgcgatccg 720
cagaccgcgt gcgaatggca gagcatggtg aacaatcagc cgaaaattca gaaccgcttt 780
gcggcgacca tgagcaaaat ggcgctgctg ggccaagata aaaccaaact gattgattgc 840
agcgatgtca ttcccactcc gccggcgctg gtgggcgcgg cacatctgcc ggccggcttt 900
agcctgtcgg atgtagagca agcctgcgcc gccaccccct ttccggcgct gacggcagac 960
cccggtccgg tgacgagcgt gccgccggtg ccgggcagct aagcggccgc 1010
<210> 2
<211> 361
<212> PRT
<213> Pleurotus eryngii
<400> 2
Met Ser Phe Lys Thr Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ala
1 5 10 15
Val Gln Phe Ala Ser Ala Ala Val Pro Leu Val Gln Lys Arg Ala Thr
20 25 30
Cys Asp Asp Gly Arg Thr Thr Ala Asn Ala Ala Cys Cys Ile Leu Phe
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Asp Ile Gln Glu Asn Leu Phe Asp Gly Ala Gln Cys
50 55 60
Gly Glu Glu Val His Glu Ser Leu Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile
65 70 75 80
Gly Phe Ser Pro Thr Leu Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile
85 90 95
Ala Phe Asp Thr Ile Glu Thr Asn Phe Pro Ala Asn Ala Gly Ile Asp
100 105 110
Glu Ile Val Ser Ala Gln Lys Pro Phe Val Ala Lys His Asn Ile Ser
115 120 125
Ala Gly Asp Phe Ile Gln Phe Ala Gly Ala Val Gly Val Ser Asn Cys
130 135 140
Pro Gly Gly Val Arg Ile Pro Phe Phe Leu Gly Arg Pro Asp Ala Val
145 150 155 160
Ala Ala Ser Pro Asp His Leu Val Pro Glu Pro Phe Asp Ser Val Asp
165 170 175
Ser Ile Leu Ala Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Val Glu Val
180 185 190
Val Trp Leu Leu Ala Ser His Ser Ile Ala Ala Ala Asp Lys Val Asp
195 200 205
Pro Ser Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Gly Val Phe Asp
210 215 220
Ser Gln Phe Phe Ile Glu Thr Gln Leu Lys Gly Arg Leu Phe Pro Gly
225 230 235 240
Thr Ala Asp Asn Lys Gly Glu Ala Gln Ser Pro Leu Gln Gly Glu Ile
245 250 255
Arg Leu Gln Ser Asp His Leu Leu Ala Arg Asp Pro Gln Thr Ala Cys
260 265 270
Glu Trp Gln Ser Met Val Asn Asn Gln Pro Lys Ile Gln Asn Arg Phe
275 280 285
Ala Ala Thr Met Ser Lys Met Ala Leu Leu Gly Gln Asp Lys Thr Lys
290 295 300
Leu Ile Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Thr Pro Pro Ala Leu Val Gly
305 310 315 320
Ala Ala His Leu Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ser Asp Val Glu Gln Ala
325 330 335
Cys Ala Ala Thr Pro Phe Pro Ala Leu Thr Ala Asp Pro Gly Pro Val
340 345 350
Thr Ser Val Pro Pro Val Pro Gly Ser
355 360
Claims (8)
1.一种降解含聚乙烯的塑料产品的方法，其特征在于，包括步骤（a）、（b）：
（a）将含聚乙烯的塑料产品进行紫外辐照处理；
（b）将步骤（a）处理后的含聚乙烯的塑料产品与多功能过氧化物酶在溶液环境中接触，并发生酶解反应；所述多功能过氧化物酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
步骤（b）的反应体系中多功能过氧化物酶的作用剂量≥0.1 U/mg塑料产品；
所述酶解反应的温度≥30℃、反应体系pH为4.5~5.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解反应在苹果酸-苹果酸钠缓冲液中进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多功能过氧化物酶由微生物发酵制得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多功能过氧化物酶的制备方法包括：
（1）将SEQ ID NO.1所示的PEvp基因与pET载体连接，并转化至大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌；
（2）将步骤（1）构建的重组大肠杆菌在适宜的温度下培养，收集培养物中的多功能过氧化物酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多功能过氧化物酶还经过变性、复性处理。
6.权利要求1~5任一所述的方法在聚乙烯塑料产品降解方面的应用。
7.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的多功能过氧化物酶的基因，含有所述多功能过氧化物酶的基因的重组质粒，或携带所述多功能过氧化物酶的基因的微生物细胞在聚乙烯塑料产品降解方面的应用，其特征在于，所述多功能过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多功能过氧化物酶在降解聚乙烯或含聚乙烯的塑料中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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