CN108315275B - 一种高产“三素酶”秸秆腐熟剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产“三素酶”秸秆腐熟剂及其制备方法，其中高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备原料包含三素酶混合物、植物材料、糖和尿素，所述三素酶混合物由纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液组成，并且纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液的重量比为3‑7:5‑10:5‑10。本发明制备的高产“三素酶”秸秆腐熟剂使各菌群和谐共处、相互促进，达到优势互补的效果，提高有效活菌数，使其产酶量增加，能快速有效分解作物秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素，实现了秸秆生物质资源的快速处理和循环利用。

Description

一种高产“三素酶”秸秆腐熟剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农作物秸秆处理技术领域。更具体地，本发明涉及一种高产“三素酶”秸秆腐熟剂及其制备方法。

背景技术

农作物秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素，是世界上最为丰富的生物质资源，是当前生物质资源转化利用的核心。据不完全统计，我国目前年产各类秸秆9亿多吨，利用率尚不到50％，其中只有6-7％直接还田和过腹还田，未被利用的秸秆对环境造成了极其不利的影响。开发具有促进秸秆腐解的微生物菌剂，实现秸秆快速腐解还田、循环利用、提升土壤有机质，是资源循环利用的有效举措之一。

但秸秆的主要成分是纤维素(多糖类大分子物质)、半纤维素、木质素(高分子芳香族化合物)等大分子，这三者被称为植物体的“三素”。“三素”的特点是分子量大(几万至千万)、结构紧密有序(晶体和非晶体)、抗分解力强(非常稳定)，又因多数作物秸秆的表面还存在大量蜡质层，更增加了秸秆的分解难度。秸秆腐熟前几天为腐熟剂中的微生物生长繁殖期，对腐熟贡献小，只有等到该类微生物大量繁殖分泌各种木质素、半纤维素降解酶，破坏了木质素和半纤维素之间的紧密结合，暴露出内部的纤维素结构，才进入秸秆的快速腐解阶段。而往往由于微生物分泌的“三素酶”数量不够，活性不足，影响了秸秆腐解速度、程度。

可见，要使秸秆腐解的确是一件不易之事，需要能够产纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶的多种微生物共同参与，进行逐步有序的接力分解过程，才能完成秸秆“三素”的腐解。所以，在自然界中，秸秆的腐解通常需要一个长时间的作用过程，它是依靠自然界中存在的秸秆腐解的微生物所产生分解“三素”的酶，逐步作用才得以完成的。

中国专利申请CN201510628169.6公开了一种小麦秸秆腐熟剂，以枯草芽孢杆菌、绿色木霉、黑曲霉、白腐真菌和假丝酵母作为生产菌种，对小麦秸秆具有很好的降解作用，而且腐熟后的小麦秸秆有机肥能大大提高农作物产量和质量。

中国专利申请CN201410480655.3公开了一种应用于秸秆高效速腐的复合菌剂，由脱蜡菌剂和解素菌剂组成，其中所述的脱蜡菌剂为蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巴氏梭菌的复合菌剂，所述的解素菌剂为白腐真菌、曲霉菌、绿色木霉组成的复合菌剂，其可实现秸秆的高效速腐，并将其转化为环保的有机肥，实现生物能源的循环再生。

中国专利申请CN201710024868.9公开了一种用于有机物料堆肥的复合微生物菌剂，该菌剂主要由毕赤酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌、屎肠球菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、构巢曲霉、白腐真菌、宇佐曲霉、哈慈木霉、里氏木霉、黑曲霉组成。

中国专利申请CN201710382511.8公开了一组快速腐熟秸秆的好氧菌群，包括枯草芽孢杆菌、乙酸钙不动杆菌、巨大芽孢杆菌、粪产碱菌和蜡状芽孢杆菌，以及坚强芽孢杆菌，所述好氧菌群能通过其产生的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等各种分解酶协同分解秸秆有机固废物质。

中国专利申请CN201611204518.2公开了一种复合微生物菌剂，包括菌株YO-H、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、黑曲霉和哈茨木霉，在环境温度比较低的情况下也能快速启动腐熟，多种菌剂复配，腐熟效果好。

中国专利申请CN201611135221.5公开了一种高产酶量协同菌型秸秆腐熟剂，其利用自然环境中产出的枯草芽孢杆菌为主的混合菌株和绿色木霉共同发酵，再通过筛选培养基选出产纤维素酶的菌株，通过辐照改性进一步提高菌株的产酶量，具有极佳的促秸秆腐熟效果。

中国专利申请CN201610126602.0公开了一种秸秆腐熟剂肥料，包括秸秆腐熟剂和有机肥料，筛选了自然条件下能够强力分解纤维素、半纤维素、木质素的娄彻氏链霉菌、米曲菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌作为腐熟剂菌剂。

中国专利申请CN201510898642.2公开了一种用于秸秆腐熟的微生物菌剂，该微生物菌剂由枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌和固体培养基组成。

孙芬芬等(微生物菌群发酵稻秸制备有机肥的研究)以枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、白腐真菌、黑曲霉为复合菌剂，研究了复合微生物菌群降解稻草秸秆快速还田的最优腐解发酵条件，发现所述复合微生物菌群组合可快速彻底地腐解稻秸，能在短期间完全腐熟秸秆。

涂宗财等(枯草芽孢杆菌BS-05产纤维素酶条件的研究)对枯草芽孢杆菌BS-05的产纤维素酶条件进行了研究优化。

吴昊等(里氏木霉与米根霉混合固态发酵产纤维素酶)发现里氏木霉与米根霉混合固态发酵产纤维素酶，表明里氏木霉与米根霉混合固态发酵产纤维素酶是可行的，通过对接种时间及接种比等发酵形式的调整可使混合菌产生有效的协同作用，促进纤维素酶的生产。

可见，现有技术存在用于分解秸秆的复合菌剂。但是，由于分解秸秆的“三素酶”是多酶体系，酶组分之间需要存在协同作用，所以要求多菌株的配合、相互补充，才能促进纤维素类物质的分解，尤其是细菌与真菌之间具有比较强的相互作用。现有技术缺乏能够有效分解秸秆的、具有明显协同作用的“三素酶”体系。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高产“三素酶”秸秆腐熟剂，所述高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备原料包含三素酶混合物、植物材料、糖和尿素，所述三素酶混合物由纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液组成，并且纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液的重量比为3-7:5-10:5-10。

其中三素酶混合物是指通过三种主要的发酵菌发酵产生的含有纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的三种酶的发酵产物，一般称作“三素酶”。这三种发酵产物能够实现对所添加的含有纤维素和木质素的植物材料的降解，从而实现秸秆腐熟剂含有作物生长环境所需要的纤维素、半纤维素和木质素。

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，所述纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液由枯草芽孢杆菌、米根霉和白腐真菌经过发酵制备得到。

其中枯草芽孢杆菌为能够分泌纤维素酶的任意枯草芽孢杆菌，可以从自然界中分离纤维素酶枯草芽孢杆菌，也可以从市场购买获得纤维素枯草芽孢杆菌，例如纤维素酶枯草芽孢杆菌菌株菌株BS-05等。

其中米根霉为任意能够分泌半纤维素酶的任意米根霉，可以从自然界中分离，也可以从市场购买得到。例如沂水锦润生物科技有限公司所销售的米根霉菌株。湖北远成赛创科技有限公司销售的米根霉菌株。

其中白腐真菌是任意能够分泌木质素酶的任意白腐真菌，可以从自然界中分离，也可以从市场购买得到。例如上海研生实业有限公司

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，所述高产“三素酶”秸秆腐熟剂中三素酶混合物占高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备原料总重量的百分比含量为0.90-3.50％。

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，所述植物材料为作物秸秆、作物叶片、林木枝叶、麸皮、米糠中的一种或多种，优选的，植物材料为麸皮和米糠的混合物。

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，所述植物材料为麸皮和米糠的混合物，所述糖为赤砂糖。

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，所述麸皮、米糠、赤砂糖和尿素的重量分别占高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备原料总重量的百分比含量为35.05-77.09％、29.83-67.04％、0.82-2.46％和0.07-0.22％。

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，原料三素酶混合物、麸皮、米糠、赤砂糖与尿素含量超出上述含量范围，即它们的含量低于所述的含量下限或者高于它们的上限都会导致所产生的木质素、纤维素和半纤维素的含量不足，无法解决秸秆的分解、土壤改良问题、土壤的土传病害防治问题等。

优选的，高产“三素酶”秸秆腐熟剂中，根据GB 20287-2006《农用微生物菌剂》标准分析方法进行分析测定，其中，秸秆腐熟剂中的总有效活菌数≥5亿/g，纤维素酶活≥150U/g。优选地，总有效活菌数≥5.5亿/g，纤维素酶活≥165U/g。

本发明还提供了上述高产“三素酶”秸秆腐熟剂用于处理作物秸秆的用途，其特征在于所述用途为腐熟秸秆。

本发明还提供了应用上述高产“三素酶”秸秆腐熟剂腐熟作物秸秆的方法，其特征在于将高产“三素酶”秸秆腐熟剂加入到秸秆中，所述秸秆为还田的作物秸秆，所述作物秸秆为小麦，玉米，大豆、水稻的秸秆，优选作物秸秆为小麦或玉米的秸秆。

优选的，上述应用高产“三素酶”秸秆腐熟剂腐熟作物秸秆的方法中，所述高产“三素酶”秸秆腐熟剂的亩施用量为2-5kg。

本发明还提供了上述高产“三素酶”秸秆腐熟剂的用途，其特征在于所述用途为改良土壤、促进作物生长和抑制土传病害。

本发明另一方面还提供了上述高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：

分别制备纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液，然后充分混合纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液，得到发酵产物组合物，然后将发酵组合物与植物材料和糖混合进行一级扩培，得到一级扩培菌种，然后再将一级扩培菌种与植物材料、糖和尿素混合进行二级扩培，二级扩培后得到高产“三素酶”秸秆腐熟剂。

优选的，上述制备方法中，所述纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法为：

用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌种接种到种子培养基斜面试管中，在温度37℃下活化15-20h；用接种环挑取两环活化枯草芽孢杆菌菌种接种到150ml摇瓶培养基中，在恒温摇床中在温度37℃与转速120r/min的条件下培养20-30h；待培养液温度降至35～40℃时，按照以发酵培养基重量计4-7％的接种量，把摇瓶培养物接种到发酵罐培养基中，在温度35～37℃、通气量1:1、罐压0.05MPa与转速120r/min的条件下进行发酵；发酵第12h开始取样检测，每两小时取样一次，显微镜镜检，待芽孢形成率达到90％以上时，发酵结束，制成纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液。

优选的，米根霉发酵物的制备方法为：

斜面试管米根霉菌种在PDA固态培养基的平板上划线，把接种好的平板放入生化培养箱中保持温度28～32℃，培养48～72h，待平板长满菌丝，然后转接于装有150ml PDA液体培养基的500ml三角瓶中，然后放入恒温摇床，培养条件为28～32℃，转速200～220r/min，振荡培养48～72h，使菌丝长满培养液，得到米根霉培养液。

将米根霉固体培养基添加适量的水控制温度121℃进行灭菌60min。灭菌后待固体培养基降至室温或30～35℃时，接种米根霉培养液，接种量为米根霉固体培养基重量的3-5％。将米根霉培养液与固体培养基充分的搅拌均匀，放入发酵盘进行发酵，发酵过程控制条件为：1～3天温度28～32℃，湿度70％～80％，第四天开始湿度为室内正常湿度，发酵5～6天待表面长满孢子，检测孢子量，在温度30～35℃的条件下低温干燥粉碎，提取孢子粉，得到米根霉发酵物。

优选的，木质素酶白腐真菌发酵液的制备方法为：

将白腐真菌斜面菌种接种到PDA液体培养基，在恒温摇床中37℃下进行振荡培养得到白腐真菌培养液。发酵罐培养基进行灭菌，灭菌结束冷却后，接种白腐真菌培养液，接种量为发酵罐培养基重量的3-5％，然后进行35-37℃、罐压0.04mpa-0.06mpa、转速150-200rp/min发酵培养22h左右，制成木质素酶白腐真菌发酵液。

优选的，一级扩培的方法为：

将麸皮70-90份加适量水拌匀在蒸箱中灭菌1小时，灭菌后取出摊开放凉；待温度降至35-40℃，然后取1-2份赤砂糖加适量水溶解，将3-7份纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、5-10份米根霉发酵物、5-10份木质素酶白腐真菌发酵液，洒在麸皮上翻匀，保持水分30％-45％进行发酵培养48小时，得到一级扩培菌种。

优选的，所述二级扩培的方法为：

向一级扩培菌种中添加米糠400-600份、麸皮400-600份、赤砂糖10-20份、尿素1-2份混合均匀，控制水分35-40％进行发酵，35-75℃培养96小时，检验其有效活菌数、纤维素酶活，摊晾，待水分降至15％以下，即得秸秆腐熟剂。

优选的，上述制备方法中，所述纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液制备中，所述种子培养基是按照下述制备方法制备的：将5重量份牛肉膏、10重量份蛋白胨、5重量份氯化钠与18重量份琼脂粉溶于1000重量份蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的种子培养基；

优选的，上述制备方法中，所述纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液制备中，所述摇瓶培养基是按照下述制备方法制备的：将5重量份牛肉膏、10重量份蛋白胨与5重量份氯化钠溶于1000重量份蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的摇瓶培养基；

优选的，上述制备方法中，所述纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液制备中，所述发酵罐培养基是按照下述制备方法制备的：3.2重量份豆粕粉、1.5重量份玉米浆、0.5重量份葡萄糖、0.05重量份硫酸镁与0.2重量份磷酸氢二钾溶于1000重量份蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。

优选的，上述制备方法中，所述米根霉发酵物制备中，所述PDA固态培养基是按照下述制备方法制备的：在PDA液体培养基中加入琼脂粉18克/L。

优选的，上述制备方法中，所述米根霉发酵物制备中，所述PDA液体培养基是按照下述制备方法制备的：土豆去皮200g，切成小块加水煮沸20分钟，然后双层纱布过滤，取滤液加葡萄糖20克，总量补至1000ml分装三角瓶灭菌；

优选的，上述制备方法中，所述米根霉发酵物制备中，所述米根霉固体培养基的配方为：麸皮55重量份，米糠45重量份，葡萄糖2重量份，磷酸二氢钾2重量份，硫酸铵1.5重量份，硫酸镁0.4重量份，碳酸钙0.5重量份，含水量45～55％。

优选的，上述制备方法中，所述木质素酶白腐真菌发酵液制备中，所述PDA液体培养基的制备与米根霉发酵物制备中的PDA液体培养基相同。

优选的，上述制备方法中，所述木质素酶白腐真菌发酵液制备中，所述发酵罐培养基是按照下述制备方法制备的：称取葡萄糖600g，磷酸二氢钾180g，硫酸镁15g，氯化钙6g，七水硫酸亚铁6g，七水硫酸锌0.6g，硫酸铜1.2g，硫酸锰60mg，溶于60L蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。

在本发明中，如无特别说明，所述份数均指重量份数；所述百分比“％”均指重量百分比。

在本发明中，检测孢子量的方法是平板计数法，所述方法是本领域技术人员所熟知的。

在本发明中，制备上述各种培养基使用的原料都是目前市场上销售的产品，例如由北京奥博星生物技术有限公司以商品名牛肉膏销售的牛肉膏、由北京奥博星生物技术有限公司以商品名蛋白胨销售的蛋白胨、由河南振新生物技术股份有限公司以商品名豆粕粉销售的豆粕粉。

本发明使用的麸皮、米糠、赤砂糖与尿素，都是目前市场上销售的产品。例如由河南枣花粮油有限公司以商品名优质麸皮销售的麸皮、由广西南宁宁发科技有限公司以商品名米糠销售的米糠、由青岛大汇有限公司以商品名赤砂糖的赤砂糖、由河南金茂化工有限责任公司以商品名尿素销售的尿素。

在本发明中使用的灭菌设备是由上海博讯实业有限公司以商品名立式压力蒸汽灭菌器销售的产品。

本发明的有益效果是：

本发明制备的高产“三素酶”秸秆腐熟剂使各菌群和谐共处、相互促进，达到优势互补的效果，提高有效活菌数，使其产酶量增加，能快速有效分解作物秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素，实现了秸秆生物质资源的快速处理和循环利用。

本发明的高产“三素酶”秸秆腐熟剂施用于作物生产的土壤中，其能够有效地腐熟土壤中含有纤维素和木质素的植物残体，提高土壤的粘性和土壤的透气性，能够实现改良土壤、促进作物生长和抑制土传病害的作用。

具体实施方式

下面结合实施例和应用对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限下述实施例。除非另有说明，下述实施例所述份数均指重量份数，所述百分比“％”均指重量百分比。下面实施例中所用的米根霉菌株和白腐真菌均是从自然界中分离获得的，其经过鉴定满足米根霉的菌种和白腐真菌的要求，其不具备特殊性，故可以替代常规的米根霉和白腐真菌。

一、秸秆腐熟剂的制备

制备实施例1：制备本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂

A步骤：高产纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液制备

将高产纤维素酶枯草芽孢杆菌菌株BS-05进行活化：用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌种接种到种子培养基斜面试管中，在温度37℃下活化18h；用接种环挑取两环活化枯草芽孢杆菌菌种接种到150ml摇瓶培养基中，在恒温摇床中在温度37℃与转速120r/min的条件下培养24h；待培养液温度降至35℃时，按照以发酵培养基重量计5％的接种量，把摇瓶培养物接种到发酵培养基中，在温度35℃、通气量1:1、罐压0.05MPa与转速120r/min的条件下进行发酵；发酵第12h开始取样检测，每两小时取样一次，显微镜镜检，待芽孢形成率达到90％以上时，发酵结束，制成枯草芽孢杆菌发酵液，有效菌含量100亿/g以上。

其中，

所述种子培养基是按照下述制备方法制备的：将5重量份牛肉膏、10重量份蛋白胨、5重量份氯化钠与18重量份琼脂粉溶于1000重量份蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的种子培养基。

所述摇瓶培养基是按照下述制备方法制备的：将5重量份牛肉膏、10重量份蛋白胨与5重量份氯化钠溶于1000重量份蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的摇瓶培养基。

所述发酵罐培养基是按照下述制备方法制备的：3.2重量份豆粕粉、1.5重量份玉米浆、0.5重量份葡萄糖、0.05重量份硫酸镁与0.2重量份磷酸氢二钾溶于1000重量份蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。

B步骤：米根霉发酵物制备

将米根霉斜面试管菌种，在PDA固态培养基的平板上划线，把接种好的平板放入生化培养箱中保持温度28℃，培养72h，待平板长满菌丝，然后转接于装有150mlPDA培养基液体的500ml三角瓶中，然后放入恒温摇床，培养条件28℃，转速200r/min，振荡培养72h，使菌丝长满培养液。

固体培养基物料充分混合均匀，添加适量水控制温度121℃进行灭菌60min。灭菌后待固体培养基降至室温时，进行接种，接种量为3％。把菌种与固体培养基充分的搅拌均匀，放入发酵盘进行发酵，发酵过程控制：第1～3天温度28℃，湿度70％，第四天开始湿度为室内正常湿度，发酵6天待表面长满孢子，检测孢子量，低温干燥粉碎，提取孢子粉，得到米根霉发酵物，有效菌含量50亿/g以上。

其中，

所述PDA液体培养基是按照下述制备方法制备的：土豆去皮200g，切成小块加水煮沸20分钟，然后双层纱布过滤，取滤液加葡萄糖20克，总量补至1000ml分装三角瓶灭菌。

所述PDA固态培养基是按照下述制备方法制备的：在PDA液体培养基中加入琼脂粉18克/L。

所述固体培养基的配方为：麸皮55重量份，米糠45重量份，葡萄糖2重量份，磷酸二氢钾2重量份，硫酸铵1.5重量份，硫酸镁0.4重量份，碳酸钙0.5重量份，含水量50％。

C步骤：木质素酶白腐真菌发酵液制备

将木质素酶白腐真菌进行活化：将白腐真菌斜面菌种接种到PDA液体培养基，在恒温摇床中进行37℃、振荡培养。发酵罐培养基进行灭菌，灭菌结束冷却后，进行接种，接种量为3％，将种子液接种到灭过菌的发酵罐培养基中，进行35℃、罐压0.04mpa、转速150rp/min发酵培养22h，制成白腐真菌发酵液，有效菌含量50亿/g以上。

其中，

所述PDA液体培养基的制备方法同步骤B。

所述发酵罐培养基是按照下述制备方法制备的：称取葡萄糖600g，磷酸二氢钾180g，硫酸镁15g，氯化钙6g，七水硫酸亚铁6g，七水硫酸锌0.6g，硫酸铜1.2g，硫酸锰60mg，溶于60L蒸馏水中，混合均匀，接着在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。

D步骤：一级扩培

将麸皮80份加适量水拌匀在蒸箱中灭菌1小时，灭菌后取出摊开放凉；待温度降至35℃，然后取1.5份赤砂糖加适量水溶解，将5份步骤A得到的枯草芽孢杆菌发酵液、7.5份步骤B得到的米根霉发酵物、7.5份步骤C得到的白腐真菌发酵液，洒在麸皮上翻匀，保持水分35％进行发酵培养48小时，得到一级扩培菌种。

E步骤：二级扩培

向一级扩培菌种中添加米糠500份、麸皮500份、赤砂糖15份、尿素1.5份混合均匀，控制水分35％进行发酵，45℃培养96小时，检验其有效活菌数、纤维素酶活，摊晾，待水分降至15％以下，即得“三素酶”秸秆腐熟剂。

制备得到的高产“三素酶”秸秆腐熟剂根据GB 20287-2006《农用微生物菌剂》标准分析方法进行了分析测定，其结果表明，其总有效活菌数≥5.7亿/g；纤维素酶活≥168U/g。

制备实施例2：含枯草芽孢杆菌发酵液和米根霉发酵物的秸秆腐熟剂

枯草芽孢杆菌发酵液和米根霉发酵物的制备方法同制备实施例1的A步骤和B步骤。

一级扩培：

将麸皮80份加适量水拌匀在蒸箱中灭菌1小时，灭菌后取出摊开放凉；待温度降至35℃，然后取1.5份赤砂糖加适量水溶解，将8份枯草芽孢杆菌发酵液、12份的米根霉发酵物，洒在麸皮上翻匀，保持水分35％进行发酵培养48小时，得到一级扩培菌种。

二级扩培：

向一级扩培菌种中添加米糠500份、麸皮500份、赤砂糖15份、尿素1.5份混合均匀，控制水分35％进行发酵，45℃培养96小时，检验其有效活菌数、纤维素酶活，摊晾，待水分降至15％以下，即得秸秆腐熟剂。

制备实施例3：含枯草芽孢杆菌发酵液和白腐真菌发酵液的秸秆腐熟剂

枯草芽孢杆菌发酵液和白腐真菌发酵液的制备方法同制备实施例1的步骤A和步骤C。

一级扩培：

将麸皮90份加适量水拌匀在蒸箱中灭菌1小时，灭菌后取出摊开放凉；待温度降至40℃，然后取2份红糖加适量水溶解，将7份枯草芽孢杆菌发酵液、13份白腐真菌发酵液，洒在麸皮上翻匀，保持水分45％进行发酵培养48小时，得到一级扩培菌种。

二级扩培：

向一级扩培菌种中添加米糠470份、麸皮600份、赤砂糖20份、尿素1份混合均匀，控制水分40％进行发酵，55℃培养96小时，检验其有效活菌数、纤维素酶活，摊晾，待水分降至15％以下，即得秸秆腐熟剂。

制备实施例4：含米根霉发酵物和白腐真菌发酵液的秸秆腐熟剂

米根霉发酵物和白腐真菌发酵液的制备方法同制备实施例1的步骤B和步骤C。

一级扩培：

将麸皮85份加适量水拌匀在蒸箱中灭菌1小时，灭菌后取出摊开放凉；待温度降至36℃，然后取2份赤砂糖加适量水溶解，将11份米根霉发酵物、10份白腐真菌发酵液，洒在麸皮上翻匀，保持水分38％进行发酵培养48小时，得到一级扩培菌种。

二级扩培：

向一级扩培菌种中添加米糠540份、麸皮475份、赤砂糖15份、尿素1.7份混合均匀，控制水分40％进行发酵，55℃培养96小时，检验其有效活菌数、纤维素酶活，摊晾，待水分降至15％以下，即得秸秆腐熟剂。

二、秸秆腐熟剂对腐熟作物秸秆试验

试验实施例1：对玉米秸秆的腐熟试验

试验时间：2015年10月1日-2016年6月5日

试验地点：河南省三门峡市陕州区。

试验方法：试验设计5个处理，每个处理3个重复

处理1：常规施肥+秸秆还田；

处理2：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例1秸秆腐熟剂；

处理3：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例2秸秆腐熟剂；

处理4：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例3秸秆腐熟剂；

处理5：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例4秸秆腐熟剂；

试验设3次重复，处理随机排列，每个重复的试验面积为60平方米。

观察与记载

(1)秸秆腐熟剂程度记载：使用腐熟剂秸秆还田后分别在第3、5、7、10、12天观察记载秸秆定性腐解度，结果见下表1。秸秆腐解程度可定性比较，统计时把秸秆颜色青暗、青灰、微黄、褐黄、黑黄分别定为1、2、3、4、5级；秸秆气味中的无明显变化、霉味、氨味、酒味、腐烂味分别定为0、1、2、3、4级；手感软化程度中的硬、微软、软、腐烂分别定为1、2、3、4级。统计时各处理中的腐解程度数值为三大指标级别数值之和，数值越大表示腐烂越快，腐熟作用越明显。

表1不同处理的玉米秸秆腐熟情况

从表1中可以看出：本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂(处理2)比不添加腐熟剂(处理1)的秸秆腐熟效果好，腐熟时间短，腐熟更彻底。进一步地，本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂的腐熟效果还明显优于含有两种菌剂的腐熟剂(处理3-5)。

(2)测产：作物成熟后及时进行田间测产，计算产量，结果见下表2。

表2不同处理对小麦产量影响(kg/亩)

处理	重复1	重复2	重复3	平均产量
					1	409.55	428.11	420.96	419.54
2	527.88	530.46	536.16	531.50
					3	477.83	490.15	477.33	481.77
4	459.42	467.21	472.65	466.43
					5	448.72	461.18	458.47	456.12

从表2中可以看出，使用本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂(处理2)与不添加腐熟剂(处理1)的处理相比，小麦产量明显增加。进一步地，本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂的增产效果还明显优于含有两种菌剂的腐熟剂(处理3-5)。可以看出，使用高产“三素酶”秸秆腐熟剂不仅可保护环境，避免污染，还可提高下茬作物产量，增加农民收入。

同时对土壤改良情况进行测量，发现应用“三素酶”秸秆腐熟剂的土壤的粘性更大，透气性更好，而且作物在生长期的土传病害降低20％左右，对于两种菌剂的腐熟剂来说，其土传病害抑制率没有“三素酶”秸秆腐熟剂的高，其只能降低土传病害的10％左右。

试验实施例2：对小麦秸秆的腐熟试验

试验时间：2016年6月10日-2016年10月15日

试验地点：河南省三门峡市陕州区。

试验方法：试验设计5个处理，每个处理3个重复

处理1：常规施肥+秸秆还田；

处理2：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例1秸秆腐熟剂；

处理3：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例2秸秆腐熟剂；

处理4：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例3秸秆腐熟剂；

处理5：常规施肥+秸秆还田+2公斤制备实施例4秸秆腐熟剂；

试验设3次重复，处理随机排列，每个重复的试验面积为60平方米。

观察与记载

(1)秸秆腐熟剂程度记载：使用腐熟剂秸秆还田后分别在第3、5、7、10、12天观察记载秸秆定性腐解度。秸秆腐解程度可定性比较，统计时把秸秆颜色微黄、中黄、褐黄、黑黄分别定为1、2、3、4级；秸秆气味中的无明显变化、霉味、氨味、酒味、腐烂味分别定为0、1、2、3、4级；手感软化程度中的硬、微软、软、腐烂分别定为1、2、3、4级。统计时各处理中的腐解程度数值为三大指标级别数值之和，数值越大表示腐烂越快，腐熟作用越明显。

表3不同处理的小麦秸秆腐熟情况

从表3中可以看出：本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂(处理2)比不添加腐熟剂(处理1)的秸秆腐熟效果好，腐熟时间短，腐熟更彻底。进一步地，本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂的腐熟效果还明显优于含有两种菌剂的腐熟剂(处理3-5)。

(2)测产：作物成熟后及时进行田间测产，计算产量，结果见下表4。

表4不同处理对玉米产量影响(kg/亩)

处理	重复1	重复2	重复3	平均产量
					1	625.7	641.8	633.4	633.6
2	775.3	782.6	788.4	782.1
					3	692.5	683.5	680.6	685.5
4	677.2	685.5	672.4	678.4
					5	681.4	701.2	693.7	692.1

从表4中可以看出，使用本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂(处理2)与不添加腐熟剂(处理1)的处理相比，小麦产量明显增加。进一步地，本发明高产“三素酶”秸秆腐熟剂的增产效果还明显优于含有两种菌剂的腐熟剂(处理3-5)。可以看出，使用高产“三素酶”秸秆腐熟剂不仅可保护环境，避免污染，还可提高下茬作物产量，增加农民收入。

然后将枯草芽孢杆菌、米根霉、白腐真菌分别用市场购买的其他的菌株重复上述实验，得到结论是相同的，就是应用纤维素枯草芽孢杆菌发酵液、半纤维素米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液制备的秸秆腐熟剂具有优异的效果，其比两种发酵产物制备的腐熟剂具有更多的有益效果，对于土壤的改良获得了预料不到的技术效果。

Claims (5)

1.一种高产“三素酶”秸秆腐熟剂，其特征在于所述高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备原料由三素酶混合物、麸皮、米糠、糖和尿素组成，所述三素酶混合物由纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液组成，并且纤维素酶枯草芽孢杆菌发酵液、米根霉发酵物和木质素酶白腐真菌发酵液的重量比为3-7:5-10:5-10，所述高产“三素酶”秸秆腐熟剂中三素酶混合物占高产“三素酶”秸秆腐熟剂的制备原料总重量的百分比含量为0.90-3.50%，根据GB 20287-2006《农用微生物菌剂》标准分析方法进行分析测定，其中，秸秆腐熟剂中的总有效活菌数≥5亿/g，纤维素酶活≥150U/g。

2.根据权利要求1所述的秸秆腐熟剂，其特征在于所述糖为赤砂糖。

3.权利要求1-2任一项所述的高产“三素酶”秸秆腐熟剂用于处理作物秸秆的用途，其特征在于所述用途为腐熟秸秆。

4.应用权利要求1-2任一项所述的高产“三素酶”秸秆腐熟剂腐熟作物秸秆的方法，其特征在于将高产“三素酶”秸秆腐熟剂加入到秸秆中，所述作物秸秆为小麦或玉米的秸秆。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述高产“三素酶”秸秆腐熟剂的亩施用量为2-5kg。