CN108118003A - 黑酵母菌、生产β-葡聚糖的培养基与方法、以及黑酵母菌培养物与组合物 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种黑酵母菌(Aureobasidium pullulans)及一种用于生产β‑葡聚糖的培养基，其可包含：碳源、氮源及抗坏血酸。还提供一种生产β‑葡聚糖的方法，包括将所述的黑酵母菌培养于发酵培养基中进行发酵。由于所述黑酵母菌具有不产生黑色素的优势，因此，通过改良培养基的组成和培养方法，可以有效地提高β‑葡聚糖的产量并减少工艺废液的排放。

Description

黑酵母菌、生产β-葡聚糖的培养基与方法、以及黑酵母菌培养 物与组合物

技术领域

本发明涉及一种生产β-葡聚糖的方法，特别是关于一种通过不产生黑色素的黑酵母菌以及发酵培养基，从而达到高产量生产β-葡聚糖的方法。

背景技术

黑酵母菌(Aureobasidium pullulans)，又名暗金黄担子菌或出芽短梗霉，是一种类似于酵母的真菌。黑酵母菌细胞壁的周边会产生多糖类物质，例如β-葡聚糖(β-glucan)。

β-葡聚糖已是台湾食品药物管理署及日本厚生劳动省所公告可供食品使用的原料之一，也是美国FDA公告的一般公认为安全的(GRAS，Generally Recognized As Safe)食品添加剂，在开发上相对没有食品安全的顾虑。

自例如大麦、燕麦、酵母菌和菇蕈类的原料萃取β-葡聚糖等有效成份时，必须经过使用多种化学药品的处理程序。在这些处理程序中，许多有益的微量成份可能丧失，而使产品不能获得预期的效果。通过植物产生的β-葡聚糖，则会根据其为野生的或养殖的，或者根据植物生长的条件、环境不同，而影响β-葡聚糖的含量。相较于例如大麦、燕麦、酵母菌和菇蕈类原料的工艺，通过黑酵母菌生产β-葡聚糖时，由于β-葡聚糖会分泌至胞外，可以省去萃取工艺并减少废液的产生。此外，通过黑酵母菌生产β-葡聚糖也不会有前述通过植物生产β-葡聚糖的缺点。

然而，虽然利用黑酵母菌生产β-葡聚糖有上述优点，但通过黑酵母菌发酵生产β-葡聚糖，仍因下列原因而受到限制：

(1)产量低：黑酵母菌的发酵过程中会产生可溶性胞外多醣，但随着多醣产量的增加，容易使整体发酵液形成黏稠的凝胶状，此高黏稠度的特性容易造成如通气、溶氧、搅拌等质传或热传等问题，进而影响β-葡聚糖的产量。

(2)多醣含有的黑色素难以去除：一般黑酵母菌株发酵产生的胞外多醣含有黑色素，因此产物的卖相较差。倘若要进一步将该黑色素去除，又会增加工艺上的不便，进而影响后续将其产品化的生产工艺。

发明内容

鉴于上述现有技术的问题，本发明的目的就是提供一种黑酵母菌，其具有较高的β-葡聚糖产量，并且所产生的β-葡聚糖几乎不含黑色素。

根据本发明的一个目的，提供一种黑酵母菌(Aureobasidium pullulans)，其于2016年10月19日保藏于日本独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(Patent Microorganisms Depositary,National Institute of Technology andEvaluation)，保藏编号为NITE BP-02372。

根据本发明的另一个目的，提供一种用于生产β-葡聚糖的培养基，可包含：碳源、氮源及抗坏血酸；其中碳源可选自：乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、糖蜜及其组合；以及氮源可选自：蛋白胨(peptone)、酵母提取物(yeast extract)、尿素、硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵、卵磷脂(lecithin)及其组合。

优选地，碳源可为蔗糖或葡萄糖。

优选地，基于所述发酵培养基的总体积，蔗糖的浓度可以为10～70g/L。优选地，基于所述发酵培养基的总体积，葡萄糖的浓度可为25～150g/L。

优选地，氮源可为卵磷脂。优选地，基于所述发酵培养基的总体积，卵磷脂的浓度可为小于或等于6g/L。优选地，基于所述发酵培养基的总体积，抗坏血酸的浓度可为小于或等于6g/L。

优选地，培养基的初始pH值可为4至8。更优选地，培养基的初始pH值可为5至6。

根据本发明的另一个目的，提供一种用于生产β-葡聚糖的培养基，其包括：碳源及抗坏血酸；其中碳源可选自：乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、糖蜜及其组合；以及其中培养基可不含氮源。

根据本发明的再一个目的，提供一种生产β-葡聚糖的方法，其包括：将所述黑酵母菌培养于发酵培养基中进行发酵。

优选地，发酵培养基可为前面所述的培养基。

优选地，黑酵母菌可以在15至30℃的温度进行培养。

优选地，所述发酵是在转速为150～350rpm的条件下进行。

优选地，所述发酵是在通气量为1～2vvm的条件下进行。

优选地，还可以包括在进行发酵前先将黑酵母菌在种子培养基中增殖至稳定期(stationary phase)。

优选地，种子培养基可包含粒状酵母提取物(yeast extract granulated)、麦芽提取物(malt extract)、蛋白胨(peptone from soybean,enzymatic digest)及右旋糖(dextrose)。

根据本发明的再一个目的，提供一种含有β-葡聚糖的黑酵母菌培养物，可由前述方法制得。

根据本发明的再一个目的，提供一种组合物，其可包含所述的酵母菌培养物，以及任选的载剂。

总的来说，本发明至少提供下列优点：

(1)根据本发明的实施例的黑酵母菌株具有不产生黑色素的特性，可省去后续去除黑色素的处理程序。并且，通过改良本发明的培养基组成和培养方法，可有效提高β-葡聚糖的产量。

(2)通过生产β-葡聚糖的工艺及培养基组成配方的改良，让黑酵母菌的发酵液可以全部用于β-葡聚糖产品的制备，以得到高β-葡聚糖含量的产品，使得产品除了功效性外，也能易于储存与加工使用，同时减少工艺废液排放，达到节能减碳与环境友善的目的。

本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与优选的实施例和随本文附带的附图后，将变得明显。

附图简要说明

图1示出黑酵母菌12F0291的形态特征及显微构造。(A)菌落正面，MEA，25℃，5天；(B)菌落背面，MEA，25℃，5天；(C)菌落正面，PDA，25℃，5天；(D)菌落背面，PDA，25℃，5天；(E)菌丝及产孢构造(Bar＝10μm)；(F)分生孢子(Bar＝10μm)；(G)厚壁孢子(Bar＝5μm)。

图2示出利用不同初始pH值的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。

图3示出在不同碳源的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。

图4示出在不同浓度的蔗糖的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。

图5示出在不同浓度的葡萄糖的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。

图6示出在不同氮源的GCL发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。

图7示出利用含或不含氮源的发酵培养基培养黑酵母菌所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。

图8示出将黑酵母菌自冷冻的菌株甘油管解冻并进行培养、发酵的流程示意图。

图9示出黑酵母菌于YM培养基或发酵培养基中培养、发酵后的菌落外观及摇瓶外观。

图10示出黑酵母菌于YM培养基中培养1天或2天后的菌体量(以OD₆₀₀吸光值表现)。

图11示出黑酵母菌于YM培养基中培养48小时后的菌落外观。

图12示出将黑酵母菌进行发酵2、5、6及8天后发酵液中β-葡聚糖含量的分析结果。

在以下的详细描述中，为了解释本发明，提供了许多具体细节，以便能彻底理解所公开的实施方式。然而，显而易见的是，一个或多个实施方式可以在没有所述具体细节的情况下实现。在其它情况中，为了简化附图，已知的结构和流程将以示意性的方式显示。

具体实施方式

本发明的各个具体实例的细节说明如下。本发明的其他特征将会经由以下各个具体实例中的详细说明及申请专利范围而清楚呈现。

无须进一步的阐述，相信本发明所属技术领域技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为示例说明之用，而非以任何方式限制其它的公开内容。

除非另有说明，否则本文使用的全部技术和科学名词与本发明所属技术领域的技术人员通常所了解的含义相同。

本文所使用的冠词“一”是指该冠词的一或一个以上(即，至少一个)的语法宾语。

黑酵母菌潜力菌株筛选

初筛：

将保存于冷冻小管中的黑酵母菌(Aureobasidium pullulans)冷冻菌株活化后，涂抹在初筛培养基(成分如下表1所示)上，在25℃培养5～7日，观察菌落形态及颜色，选出培养后有较明显颜色变化的菌株。初筛总共进行了530个菌株的筛选，获得30株具有潜力的候选菌株进行后续的筛选。

表1初筛培养基(YM琼脂+蔗糖+苯胺蓝)

pH 6.2±0.2

候选菌株的筛选

从初筛所选出的30株候选菌株中，进一步筛选出具有潜力的生产菌株进行生产试验。简单地说，将候选菌株活化后，用含蔗糖的YMS培养基(成分如下表2所示)进行震荡培养，在25℃培养4日。接着，将培养基取样后，分别以酵素普鲁兰酶(pullulanase)分解普鲁兰(pullulan)，再以苯酚硫酸法(Phenol-sulfuric acid assay)进行总糖量测定，选出非普鲁兰(pullulan)多糖产量较高的菌株。

表2 YMS培养基(YM肉汤+蔗糖)

pH 6.2±0.2

接着，将前述所筛选出具有生产β-葡聚糖潜力的黑酵母菌株，以YM培养基(Difco^TM)活化后，进一步使用YMS培养基初步进行摇瓶测试，培养条件为25℃、150rpm，培养72小时后测量摇瓶发酵液中β-葡聚糖，测量方法如下所示，且测量结果如下表3所示，其中LQ为购自日本ADEKA公司的黑酵母发酵液状产品，产品规格为β-葡聚糖含量1％(10g/L)，作为阳性对照组。

黑酵母β-葡聚糖的测量方法

使用总膳食纤维分析试剂盒(Total Dietary Fiber Assay kit,Megazyme)，先取发酵液加入适当体积的缓冲液混合均匀后，再依次加入α-淀粉酶(α-amylase)、蛋白水解酶(Protease)以及淀粉葡萄糖苷酶(Amyloglucosidase)三种酵素处理后，以4倍体积的酒精进行沉淀，将β-葡聚糖自溶液中沉降分离出来，收集沉淀物以酒精清洗后干燥，干燥后的沉淀物用强酸和高温水解处理，经酸碱中和后测定葡萄糖，并计算β-葡聚糖的含量。详细步骤如下：

待测样品为发酵液时，称取5g样品加入3.5mL、0.08M磷酸缓冲液(pH 6.0)，并使其完全混合均匀。

将样品加入α-淀粉酶500μL(60mg/mL PB缓冲液)后在95℃水浴反应30分钟，每15分钟进行振荡使其混合均匀。将样品冷却至60℃后，用0.275M NaOH调节pH至7.5±0.1(约1000μL)，接着加入蛋白水解酶50μL，在60℃水浴反应30分钟。再用0.325M HCl调节pH至4.3±0.1(约800μL)后，加入淀粉葡萄糖苷酶50μL，在60℃水浴反应30分钟，得酵素处理后样品。

将酵素处理后的样品用95％EtOH加至40mL后，室温静置一小时以沉淀β-葡聚糖，使β-葡聚糖自溶液中沉降分离出来，接着再离心(10,000g)10分钟除去上层液。收集沉淀物后，再加入4mL 80％EtOH冲洗，再经离心(10,000g)5分钟移去上层液后，于常温下进行真空抽气干燥。

将隔夜干燥的样品加入1mL的72％(w/v)硫酸，室温静置60分钟后加入14mL去离子水。在沸腾水浴(100℃)处理2小时，若有大片残留物，则再进行高压釜(Autoclave)灭菌处理(121℃,20min)。待水解液冷却后用5mL 5N NaOH进行中和，用去离子水定容至25mL后，用葡萄糖分析用试剂盒(葡萄糖PAP试剂盒)测定葡萄糖含量。

由于在酵素处理过程中，将发酵液中α-键结合形式的多糖被α-淀粉酶分解，发酵液中存在大分子的蛋白质也被蛋白水解酶分解，最后再利用淀粉葡萄糖苷酶将短链聚合葡萄糖链分解成葡萄糖后，未受到上述酵素分解的聚合葡萄糖长链(此时将剩下β-键结合形式的葡聚糖)再以酒精沉淀方式自溶液中沉降分离出来进行干燥步骤。在干燥后再通过硫酸与高温水解测量葡萄糖含量，即为β-键结合形式的葡聚糖的含量。最后利用下述公式，依据该酵素法测得的葡萄糖浓度(C_glu)计算葡聚糖重量(W_BGP)。

W_BGP＝C_glu*0.9*1000*0.025，其中0.025为稀释倍数(25mL/1L)，1000为单位因子(mg/g)。

表3黑酵母潜力菌株初步摇瓶培养3天的β-葡聚糖测量结果

根据上表3的β-葡聚糖浓度，最后筛选出最佳的生产菌株6，即将其称为黑酵母菌12F0291。

菌株鉴定

根据本发明的一个实施例，自食品工业发展研究所的黑酵母菌种库中筛选出具有β-葡聚糖生产潜力的黑酵母菌12F0291，其于2016年10月19日保藏于日本独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，保藏编号为NITE BP-02372。

黑酵母菌12F0291是于2008年6月17日于台湾新竹县新埔镇的植物叶片分离、采样。如图1(A)及(B)部分所示，将黑酵母菌12F0291置于如下表4的MEA(麦芽提取物琼脂(Malt Extract Agar),Blakeslee's Formula)培养基中，在25℃培养时，菌落形态为平滑、黏稠，且表面具有透明黏液，颜色由灰黄色转变为橙色到棕色，菌落周围呈黄白色。请参照图1(C)及(D)部分所示，将黑酵母菌12F0291置于如下表5的PDA(马铃薯右旋糖琼脂(PotatoDextrose Agar),Difco^TM)培养基中，在25℃培养时，菌落形态为平滑、黏稠，且表面具有透明黏液，颜色由黄白色转变为橙红色，菌落周围呈黄白色。

表4 MEA培养基(MEA，Blakeslee's Formula)

表5 PDA培养基(PDA,Difco^TM)

更请参照图1(E)至(G)部分所示，将黑酵母菌12F0291通过显微镜观察，其菌丝平滑具有横隔，近横隔处呈现稍许缢缩，薄壁至厚壁，直径为3.4-5.8μm。当培养时间增长时，部份菌丝逐渐转变为橙褐色。产孢细胞(conidiogenous cells)未分化，位于透明菌丝中间或末端，偶而自分支长出，具有齿状构造(denticle)着生分生孢子(conidia)，分生孢子外壁平滑，形状多变，大小为4.0-11.0×3.0-6.0μm。厚壁孢子(chlamydospores)为透明或橙褐色，形状为近球形或椭圆形，大小为4.7-9.0×2.9-6.5μm。

将黑酵母菌12F0291的rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段进行序列比对，结果显示黑酵母菌12F0291与Aureobasidium pullulans var.melanogenum BCRC 34543T(＝CBS 105.22T)(BCRC database no.BCRC34543_05042009_FD_ITS)以及Aureobasidium pullulans NRRLY-12996(＝ATCC 42023)(GenBank accession no.HQ702508)最为接近。

综合所述菌落、产孢构造、分生孢子等形态特征以及rDNA ITTS-5.8S-ITSS2序列分析结果，鉴定黑酵母菌12F0291隶属于Aureobasidium pulllulans，且为Aureobasidiumpulllulans var.melanogenum。

生产β-葡聚糖的发酵培养基

为解决所述问题，本发明的一个实施例是关于一种用于生产β-葡聚糖的培养基。培养基中可包含：碳源、氮源及抗坏血酸；其中碳源可选自：乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、糖蜜及其组合；及氮源可选自：蛋白胨(peptone from soybean,enzymatic digest)、酵母提取物(yeast extract granulated)、尿素、硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵、卵磷脂(lecithin)及其组合。

在一个优选的实施例中，碳源可为蔗糖或葡萄糖。在一个更优选的实施例中，蔗糖的浓度可以为10～70g/L或者葡萄糖的浓度可为25～150g/L，浓度以培养基的总体积计算。在另一个优选的实施例中，氮源可为卵磷脂，且卵磷脂的浓度可为小于或等于6g/L。

根据本发明的一个实施例，用于生产β-葡聚糖的培养基可通过以下方法配制。配制培养基时就加入抗坏血酸，此时pH约为3.0，接着使用NaOH_(aq)将pH值调节至4.0至8.0，优选为5.0至6.0，然后进行高压釜(Autoclave)灭菌，待冷却后再接入种子。在另一个实施例中，也可以在配制培养基时先将其pH值调节至12.0，经过高压釜灭菌后，于无菌操作台内以0.22μm过滤器将抗坏血酸溶液经过滤后加入经灭菌的培养基中，使培养基的pH值在4.0至8.0之间，优选为5.0至6.0之间，再接入种子。在一个优选的实施例中，抗坏血酸的浓度可为小于或等于6g/L。

根据本发明的一个实施例，将解冻的黑酵母12F0291甘油管，以0.3％(v/v)的接菌量活化至YM培养基(成分如下表6所示)中，并在温度25℃、转速150rpm、培养48小时的条件下进行种子培养，再接种于下列(表7～表13)不同的发酵培养基中，在温度25℃、转速150rpm、培养2天后检测各发酵培养基中β-葡聚糖的含量，测量方法同前所述，在此不再赘述。

表6 YM培养基(YM肉汤,Difco^TM)

pH 6.2±0.2

在一个实施例中，将黑酵母菌12F0291接种于初始pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0及8.0的SCL发酵培养基中进行发酵，以生产β-葡聚糖，并测定其发酵所产生的β-葡聚糖浓度。本文中所述“初始pH值”是指培养基经配制完成且尚未进行任何培养时的pH值。请参照图2，其示出利用不同初始pH值的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。如图所示，在初始pH值为4.0至8.0的发酵培养基中，黑酵母菌12F0291明显能生产较多的β-葡聚糖，其中更以培养在初始pH值为5.0及6.0的发酵培养基中的黑酵母菌12F0291生产的β-葡聚糖最多，浓度分别为7.95g/L及8.23g/L。

在一个实施例中，将黑酵母菌12F0291接种于不同碳源的发酵培养基中进行发酵，以生产β-葡聚糖。详细的说，在本实施例中，黑酵母菌12F0291分别接种于以蔗糖(成分如表7所示)、葡萄糖(成分如表8所示)或糖蜜(Molasses，成分如表9所示)作为碳源的发酵培养基中进行发酵，并测定其发酵所产生的β-葡聚糖浓度。请参照图3，其是在不同碳源的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度的测定结果。如图所示，不论是利用蔗糖(SCL)、葡萄糖(GCL)或糖蜜(MCL)作为碳源的发酵培养基中，黑酵母菌12F0291均能生产β-葡聚糖，而其中以培养于利用蔗糖(SCL)及葡萄糖(GCL)作为碳源的发酵培养基中的黑酵母菌12F0291能够生产的β-葡聚糖较多，约为9g/L。

表7 SCL发酵培养基

pH 5.55

表8 GCL发酵培养基

pH 5.51

表9 MCL发酵培养基

pH 5.54

在一个优选的实施例中，将黑酵母菌12F0291接种于不同浓度的蔗糖的发酵培养基中进行发酵，以生产β-葡聚糖。详细的说，在本实施例中，将黑酵母菌12F0291分别接种于含0、10、20、30、40及50g/L的蔗糖的发酵培养基(成分如表10所示)中进行发酵，并测定其发酵所产生的β-葡聚糖浓度。结果请参照图4，其是利用黑酵母菌12F0291在不同浓度的蔗糖的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。如图所示，发酵所产生的β-葡聚糖浓度随着发酵培养基中蔗糖浓度而升高，而在本实施例中，以50g/L蔗糖的发酵培养基中能得到的β-葡聚糖的浓度最高，约为8g/L。

表10具不同浓度的蔗糖的发酵培养基

pH 5.55～5.60

在一个优选的实施例中，将黑酵母菌12F0291接种于不同浓度的葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，以生产β-葡聚糖。详细的说，在本实施例中，将黑酵母菌12F0291分别接种于含25、50、75、100、125及150g/L的葡萄糖的发酵培养基(成分如表11所示)中进行发酵，并测定其发酵所产生的β-葡聚糖浓度。结果请参照图5，其是利用黑酵母菌12F0291在不同浓度的葡萄糖的发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。如图所示，发酵所产生的β-葡聚糖浓度大致随着发酵培养基中葡萄糖浓度而升高，而在本实施例中，以100g/L葡萄糖的发酵培养基中能得到的β-葡聚糖的浓度最高，约为9.31g/L。

表11具不同浓度的葡萄糖的发酵培养基

pH 5.56～5.62

在一个实施例中，以表8所示的GCL发酵培养基作为基础培养基，再分别额外添加尿素(urea)、蛋白胨(Peptone from soybean,enzymatic digest)、酵母提取物(Yeastextract granulated)、硝酸钾(KNO₃)、硝酸钠(NaNO₃)以及硫酸铵((NH₄)₂SO₄)等不同氮源。在一个实施例中，氮源添加浓度可分别为2、4、8g/L，并将不同氮源添加浓度的培养基的初始pH值依次调节至如表12中所示。将在YM培养基中培养48小时后的菌液，以20％(v/v)的接菌量接种于含有不同氮源的GCL发酵培养基中，并在培养条件25℃、150rpm、于摇瓶培养48小时后分析β-葡聚醣含量。

表12含不同氮源的GCL发酵培养基

结果请参照图6，其是利用黑酵母菌12F0291在不同氮源的GCL发酵培养基所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。如图所示，在含不同氮源的发酵培养基中，均能使黑酵母菌12F0291进行发酵产生β-葡聚糖。值得注意的是，在添加蛋白胨(Peptone from soybean,enzymatic digest)、酵母提取物(Yeast extract granulated)及硝酸钾(KNO₃)三组(组别3、4及5)中，随着所添加的氮源浓度的增加，β-葡聚糖的浓度有逐步下降的趋势。而在尿素(Urea)及硝酸钠(NaNO₃)两组(组别2、6)中，添加氮源浓度为4g/L的组别具有较高的β-葡聚糖产量，但相较于添加氮源浓度为2g/L的组别，β-葡聚糖产量提高的幅度不大，且在添加氮源浓度为8g/L的组别中，β-葡聚糖的浓度最低。而在仅添加卵磷脂的组别中(组别1)，将黑酵母菌12F0291进行发酵48小时后，可产生约8g/L的β-葡聚糖，且其产量高于添加硫酸铵的组别约4倍。

不含氮源的生产β-葡聚糖的发酵培养基

在本实施例中，将黑酵母菌12F0291接种于不含氮源的发酵培养基中进行发酵，以生产β-葡聚糖。具体地说，在本实施中是将黑酵母菌12F0291培养在用于生产β-葡聚糖的培养基中进行发酵。培养基包含碳源及抗坏血酸；碳源可选自：乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖及其组合。其中，培养基可不含氮源。

在一个具体实施例中，利用卵磷脂作为黑酵母菌12F0291发酵所使用的氮源。也就是说，将黑酵母菌12F0291分别接种于含有卵磷脂(如表7的SCL发酵培养基)作为氮源或不含氮源(成分如表13的SC发酵培养基)的发酵培养基中进行发酵，并测定其发酵所产生的β-葡聚糖浓度。请参照图7，其是利用含或不含氮源的发酵培养基培养黑酵母菌12F0291所产生的β-葡聚糖的浓度测定结果。如图所示，不论是含有卵磷脂或不含卵磷脂的发酵培养基中，黑酵母菌12F0291均能生产β-葡聚糖。只是其中培养于含有卵磷脂的发酵培养基中的黑酵母菌12F0291能够生产的β-葡聚糖较多，约为9.37g/L，而培养于不含卵磷脂之发酵培养基中的黑酵母菌12F0291能够生产约2.74g/L的葡聚糖。

表13 SC发酵培养基

生产β-葡聚糖的工艺

在本实施例中，提出一种生产β-葡聚糖的方法，包括将所述的黑酵母菌培养在发酵培养基中进行发酵。在一个实施例中，发酵培养基可为如所述的各种培养基，并可以下列条件进行培养：

在一个实施例中，黑酵母菌可于15至37℃的温度下进行培养；优选地，可于20至35℃的温度下进行培养；最优选地，可于23至30℃的温度下进行培养。在一个实施例中，可以在转速100～450rpm的条件下进行培养；优选地，可以在转速120～400rpm的条件下进行培养；最优选地，可以在转速150～350rpm的条件下进行培养。在一个实施例中，可以在通气量为0.5～3vvm的条件下进行培养；优选地，可以在通气量为0.8～2.5vvm的条件下进行培养；最优选地，可以在通气量为1～2vvm的条件下进行培养。

请参照下表14，其列出了多个示例性的具体培养条件，将黑酵母菌于这些培养条件下进行培养、发酵。接着，测量发酵后的菌液中β-葡聚糖的含量，可以发现在这些培养条件下黑酵母菌均能生产β-葡聚糖(图未示)。

表14黑酵母菌的不同发酵条件

具体地说，请参照图8至图12所示。图8显示将黑酵母菌12F0291及表3所示的潜力菌株3、4、5自冷冻的菌株甘油管解冻并进行培养、发酵的流程示意图。将菌株甘油管中的黑酵母菌冷冻菌株以0.3％接菌量接种至表6的YM培养基中，在培养条件25℃、150rpm、于摇瓶中进行种子培养48小时后，将菌液改接种于表15所示的高GCL发酵培养基中，以培养条件25℃、150rpm分别进行发酵2、5、6、8天，以产生β-葡聚糖。在一个优选的实施例中，黑酵母菌在YM培养基中培养，可使菌体增殖至稳定期(stationary phase)后，再于发酵培养基中进行发酵。

表15高GCL发酵培养基

如图9至图11所显示，其是黑酵母菌于YM培养基或发酵培养基中培养、发酵后的菌落外观、摇瓶外观及菌数计数结果。请参照图9，于YM培养基(图中)中培养时，四株菌的菌液颜色皆呈米黄色，其中以菌株编号4的菌株菌颜色稍微较深。但在高GCL发酵培养基(图下侧)中，菌株编号4的菌液略呈棕色，菌株编号5的菌液略呈黄色，而黑酵母菌12F0291与菌株编号3的菌液呈米白色。

请参照图10及表16，其分别为种子培养24、48小时的菌液OD₆₀₀的测定结果及活菌数计数结果。由其可知，本实施例所采用的4株菌株，在培养24小时后，其生长速度相似，没有明显差异。然而，在培养48小时后，菌株编号4的菌株，其OD₆₀₀明显较低，表示其生长速度相较于菌株编号3的菌株偏低。黑酵母菌12F0291与菌株编号5的菌株的生长速度则差不多。

表16种子培养48小时后的活菌数计数结果

请参照图12，其是将所述菌株培养2、5、6及8天后，发酵液中β-葡聚糖含量的分析结果。由图可知，黑酵母菌12F0291与菌株编号4、菌株编号5的菌株的发酵液中β-葡聚糖含量会随着发酵时间增加而增加。菌株编号4的菌株于培养8天后，其β-葡聚糖含量约为3g/L，低于其余3株菌株发酵8天所产生的β-葡聚糖含量。值得注意的是，菌株编号3的菌株所产生的β-葡聚糖含量于培养2天后约为8g/L，但在培养5天后，其发酵液中β-葡聚糖含量却降至4g/L，接着又于培养8天后大幅增加至16g/L。综上所述，虽然各菌株所产生的β-葡聚糖的量不同，但确实利用根据本发明实施例的方法及发酵培养基，均可使所述的黑酵母菌株产生β-葡聚糖。

在一个实施例中，提供一种含有β-葡聚糖的黑酵母菌培养物，其是由前述方法所制得。值得注意的是，根据前述方法所制得的培养物，可进一步用离心或过滤方式将黑酵母菌的菌体去除。在一个实施方式中，未去除菌体的黑酵母菌培养物可应用于饲料、宠物保健品、生物制剂和拮抗酵母菌等。在另一个实施方式中，去除菌体的黑酵母菌培养物可应用于食品、液态饮料、美容饮品和化妆保养品等。

因此，在另一个实施例中，提供一种组合物，其包含如所述黑酵母菌培养物，以及任选的载剂。所述组合物可应用于，包括但不限于，医药品或食品等领域中。

依据本发明的组合物可利用本发明所属技术领域技术人员所熟知的技术，制备成适合于经非肠道、局部或口服使用的剂型。

优选地，所述组合物能够制成适于口服(oral administration)的剂型，包括但不限于：溶液(solution)、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、粉末(powder)、锭剂(tablet)、丸剂(pill)、糖浆(syrup)、口含锭(lozenge)、片剂(troche)、口香糖(chewinggum)、胶囊(capsule)、浓浆(slurry)以及类似物。

如本文中所用的，术语“载剂”可指一种当投药时不会在投予的个体内造成过敏性反应或其它非所期望的效用的载剂。在本申请案中，载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏合剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)或其类似物。

于是，所述黑酵母菌培养物或包含其的组合物，可以作为食品添加剂(foodadditive)，通过已知方法在制备原料时被添加，或是配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

根据本发明的实施例，食品产品的种类包括但不限于：奶粉(milk powder)、饮料(beverages)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、健康食品(health foods)、膳食补充品(dietary supplements)、果冻(jellys)、婴儿配方(infant formulas)、色拉酱(dressings)、蛋黄酱(mayonnaise)、涂酱(spreads)、鲜乳油(creams)、酱料(sauces)、布丁(puddings)、冰淇淋(ice-cream)、烘培产品(bakery products)、蕃茄酱(ketchup)、芥末(mustard)、保鲜剂(antistalingagent)、生物制剂(biocontrol agnet,BCA)或拮抗酵母菌(antagonisitic yeast)等。

综上所述，通过根据本发明的实施例所述的黑酵母菌，其具有不产生黑色素的优势(如图9所示)。并且，通过改良所述培养基的组成和培养方法，可有效提高β-葡聚糖的产量。

进一步，通过改良生产β-葡聚糖的工艺及培养基组成配方，让黑酵母菌的发酵液可以全部用于β-葡聚糖产品的制备，以得到高β-葡聚糖含量的产品，让产品除了功效性外，也能易于储存与加工使用，同时减少工艺废液排放，达到节能减碳与环境友善的目的，除了可以保留β-葡聚醣之外，也可保留黑酵母含有的功能性物质。

以上所述仅为示例性，而非为限制性。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于申请专利范围所界定的范围中。

Claims (20)

1.一种黑酵母菌(Aureobasidium pullulans)，其于2016年10月19日保藏于日本独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，保藏编号为NITE BP-02372。

2.一种用于生产β-葡聚糖的发酵培养基，其包含：

碳源、氮源及抗坏血酸；

其中所述碳源选自：乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、糖蜜及其组合；以及

所述氮源选自：蛋白胨、酵母提取物、尿素、硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵、卵磷脂及其组合。

3.如权利要求2所述的发酵培养基，其中所述碳源是蔗糖或葡萄糖。

4.如权利要求3所述的发酵培养基，其中基于所述发酵培养基的总体积，所述蔗糖的浓度为10～70g/L。

5.如权利要求3所述的发酵培养基，其中基于所述发酵培养基的总体积，所述葡萄糖的浓度为25～150g/L。

6.如权利要求2所述的发酵培养基，其中所述氮源是卵磷脂。

7.如权利要求6所述的发酵培养基，其中基于所述发酵培养基的总体积，所述卵磷脂的浓度为小于或等于6g/L。

8.如权利要求2所述的发酵培养基，其中基于所述发酵培养基的总体积，所述抗坏血酸的浓度为小于或等于6g/L。

9.如权利要求2所述的发酵培养基，其中所述培养基的初始pH值为4至8。

10.如权利要求9所述的发酵培养基，其中所述培养基的初始pH值为5至6。

11.一种用于生产β-葡聚糖的发酵培养基，其包含：

碳源及抗坏血酸；

其中所述碳源选自：乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、糖蜜及其组合；且

其中所述培养基不含氮源。

12.一种生产β-葡聚糖的方法，其包括：将如权利要求1所述的黑酵母菌培养在发酵培养基中进行发酵。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述发酵培养基为如权利要求2至11中任一项所述的发酵培养基。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述黑酵母菌在15至30℃的温度进行培养。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述发酵是在转速为150～350rpm的条件下进行。

16.如权利要求12所述的方法，其中所述发酵是在通气量为1～2vvm的条件下进行。

17.如权利要求第12项所述的方法，还包括在进行发酵前先将所述黑酵母菌在种子培养基中增殖至稳定期。

18.如权利要求12所述的方法，其中所述种子培养基包含酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、右旋糖及水。

19.一种含有β-葡聚糖的黑酵母菌培养物，其是通过如权利要求12至18中任一项的方法而制得。

20.一种组合物，其包含如权利要求19的黑酵母菌培养物，以及任选的载剂。