JP2015136310A - β−グルカンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前培養は、アウレオバジディム属(Aureobasidium )属に属する微生物の胞子または菌糸を栄養源含有培地に接種して好気的に増殖させることによって行うことができる。典型的には、20〜40℃、好ましくは24〜28℃の範囲内の温度で、2〜3日間通気培養することが好ましく、通気撹拌培養することがより好ましい。前培養では、本培養での培養液量に対して10%程度の前培養液を準備することが好ましい。
前培養で得られた菌体を、上記の気泡型培養装置20の培養槽1に入れ、新鮮な液体培地を加えて、本培養を開始する。本培養では、上記の前培養と同様の条件にてアウレオバシジウム(Aureobasidium)属に属する微生物の培養を行うことができる。ただし本発明においては、培養槽1の底部から酸素含有気体を気泡状に導入しつつ培養する。
(1)β−グルカン及び残糖濃度の測定
培養液1mLに蒸留水を9mL加えて10倍に希釈した溶液をAとした。またAを蒸留水で10倍に希釈した溶液をBとした。B液を0.5mLとり、これにフェノール液0.5mLを加え、2.5mLの濃硫酸を加えて激しく撹拌し、25分室温放置後分光光度計を用いて吸光度を測定し、その値をRTとした。一方A液を0.2mLとり、これにエタノール0.8mLを加え、激しく撹拌した後高速遠心機を用いて19,300gで遠心分離した。その上澄み液を0.5mLとり、これにフェノール液0.5mLを加え、2.5mLの濃硫酸を加えて激しく撹拌し、25分室温放置後分光光度計を用いて吸光度(490nm)を測定し、その値をRSとした。次いでグルコースの10g/L溶液を作成し、前記同様の操作で硫酸発色した後吸光度を測定し、その時の吸光度の値をRTSとした。全糖濃度、残糖濃度、β−グルカン濃度を、それぞれ次式から算出した。
・残糖濃度(g/L)=(0.01×50×RS)/RTS
・β−グルカン濃度(g/L)=(全糖濃度−残糖濃度)×0.75
溶液中の亜硫酸ソーダは下記の反応式に従い溶存酸素濃度に依存して硫酸ソーダに酸化される。
酸素の溶け込み速度は下記式(1)で表せる。
図1に示した構造の気泡塔型培養装置であって、3L容の培養槽1を有し、エアースパージャー11として焼結ステンレスからなるものを培養槽1の底部に装着した培養装置を用いて、アウレオバシジウム プルランス M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)の培養を行った。図2には用いた焼結ステンレスエアースパージャーの写真(図2A)及びそのノズル部分の模式図(図2B)を示す。
図1に示した構造の気泡塔型培養装置であって、エアースパージャー11としてシングルノズルからなるものを培養槽1の底部に装着した培養装置を用いた以外は、調製例1と同様にして培養を行った。図3には用いたシングルノズルエアースパージャーの写真(図3A)及びそのノズル部分の模式図(図3B)を示す。
通気攪拌型培養装置である3L容ジャーファーメンター(「MDL300型」、株式会社丸菱バイオエンジ)を用いて、調製例1と同じ培地と同じ前培養液にて、アウレオバシジウム プルランス M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)の培養を行なった。その際、β−グルカンの生産期での溶存酸素(DO)濃度がほぼ10v/v%に維持されるように、攪拌翼の回転速度及び通気量(0.5vvmに固定)を設定した。
調製例1〜3について、それぞれの培養装置の最終培養成績ならびに通気と撹拌に要したエネルギー所要量を比較した。なおエネルギー所要量は、以下の文献に基づいて、下記式(4)〜(7)により計算した。
・Futamura, T., Ishihara, H., Tamura, Yasutake, T., Huang, G., Kojima, M.,and Okabe, M.: Kojic Acid Production in an Airlift Bioreactor Using Partially Hydrolyzed Raw Corn Starch. J. Biosci. Bioeng., 92 (4), 360-365 (2001).
評価1に示されたように、気泡塔型培養装置においてエアースパージャーとして焼結ステンレスからなるものを用いた方が、シングルノズルからなるものを用いた場合に比較して、β−グルカンの収量が高く、より効率的であった。そこで、それぞれの酸素供給能力を比較した。
調製例1で使用した培地において、米糠濃度のみ1.5倍とし、他の成分は同一とした米糠高濃度培地を用いて、他は調製例1と同様にして、アウレオバシジウム プルランス M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)の培養を行なった。その際、β−グルカンの生産期での溶存酸素(DO)濃度がほぼ10v/v%に維持されるように、通気量を制御した。結果的に最高2vvmに設定した。
気泡塔型培養装置にかえて通気攪拌型培養装置である3L容ジャーファーメンター(「MDL300型」、株式会社丸菱バイオエンジ)を用いて、他は調製例4と同様にして、アウレオバシジウム プルランス M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)の培養を行なった。その際、β−グルカンの生産期での溶存酸素(DO)濃度がほぼ10v/v%に維持されるように、通気量を1.33vvm(最大値)に固定した上で、攪拌翼の回転速度を制御した。この回転速度は、初期100rpmが最終400rpmまで増加した。
評価1と同様、それぞれの培養装置の通気と撹拌に要したエネルギー所要量を比較した。評価1での通常培地の結果とともに、その結果を表8にまとめて示す。
調製例1と同じ条件で気泡塔型培養装置による培養を開始した。残糖濃度が0.1g/L以下となった時点で、焼結ステンレスからなるエア-スパージャー11からの空気の吹込みを停止した。培養液取出口10から培養液1.35Lを回収した後、抜出量と等量の培地を送液ポンプ2bにより培地供給槽2から補充して、再び空気の吹込みを開始して培養を再開した。この反復回分培養を全部で10回繰り返した。培養経過の結果を表9に示す。また図4に、培養液中の残糖濃度(g/L)、回収した培養液中のβ−グルカン濃度(g/L)、β−グルカンの累積収量(g)の結果を図示する。
まず調製例6と同じ条件で気泡塔型培養装置による回分培養を開始した。培養開始後3日目に培養液中の残糖濃度が0.2g/L以下になっていることを確認してから、培地供給槽2から新鮮培地の供給を開始し、一日あたり0.5Lの速度で連続的に供給した。また、培養液取出口10から培養液を一日あたり0.5Lの速度で回収した。培養液を連続培養操に切り替えてから4日後には定常状態に到達し、そのあと60日の連続運転が可能であった。培養経過の結果を表10に示す。また図5に、培養液の濁度(UOD)、培養液中の残糖濃度(g/L)、回収した培養液中のβ−グルカン濃度(g/L)、β−グルカンの累積収量(g)の結果を図示する。
1a:胴部
1b:蓋部
2:培地供給槽
2a:通液管
2b:送液ポンプ
3:指示器
4:ジャケット
5:pHセンサー
6:溶存酸素(DO)センサー
7:排水口
8:給水口
9:気泡
10:培養液取出口
11:エアースパージャー
12:エアーフィルター
13:フローメーター
14:コンプレッサー
15:排気管
16:通気管
20:気泡型培養装置
Claims (10)
- 培養槽にアウレオバシジウム(Aureobasidium)属に属する微生物と液体培地とを入れ、前記培養槽の底部から酸素含有気体を気泡状に導入して、該気体により撹拌しつつ培養して、前記微生物が産生するβ−グルカンを得ることを特徴とするβ−グルカンの製造方法。
- 前記培養槽として、筒状の壁面部と逆錐状の底面部とからなる胴部と蓋部とからなり、前記胴部の壁面部下方には培養槽の内部と連通する培養液取出口が設けられ、前記胴部の逆錐状の底面部の最下部には孔が設けられ、その孔には培養槽の内部に向けて前記酸素含有気体を気泡状に導入するためのエアースパージャーが挿入され、前記蓋部には前記エアースパージャーを通じて培養槽の内部に導入される気体の量に相当する量の気体を外部へと排出するための排気管が設けられ、前記胴部の逆錐状の底面部の逆錐の母線と鉛直線とのなす傾斜角θが20〜40°である、該培養槽を用いる、請求項1記載のβ−グルカンの製造方法。
- 前記酸素含有気体を金属焼結体からなるノズルにより気泡状に導入する、請求項1又は2記載のβ−グルカンの製造方法。
- 培養時の酸素移動容量係数が200min−1以上700min−1以下となるように、前記培養槽の底部から前記酸素含有気体を気泡状に導入する、請求項1〜3のいずれか1つに記載のβ−グルカンの製造方法。
- 培養時の通気量が0.125vvm以上2.0vvm以下となるように、前記培養槽の底部から前記酸素含有気体を気泡状に導入する、請求項1〜4のいずれか1つに記載のβ−グルカンの製造方法。
- 前記培養槽は液体培地供給口と培養液取出口とを備え、前記培養は、所定時間培養を行った後の培養液の一部を前記培養液取出口から無菌的に回収し、ついで新鮮な液体培地を前記液体培地供給口から無菌的に補充してさらに培養するようにして、これを所定間隔おいて繰り返す、請求項1〜5のいずれか1つに記載のβ−グルカンの製造方法。
- 前記培養槽は液体培地供給口と培養液取出口とを備え、前記培養は、所定時間培養を行った後の培養液の一部を無菌的に回収し、ついで新鮮な液体培地を無菌的に補充してさらに培養するようにして、これを連続的に行う、請求項1〜5のいずれか1つに記載のβ−グルカンの製造方法。
- 請求項1〜5に記載の方法にて前記微生物を所定の菌数まで培養した後に、請求項7に記載の方法に切り替えて培養を行う、β−グルカンの製造方法。
- 前記微生物がアウレオバシジウム プルランス(Aureobasidium pullulans)に属する微生物である、請求項1〜8のいずれか1つに記載のβ−グルカンの製造方法。
- 前記微生物がアウレオバシジウム プルランスM−2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)である、請求項1〜9のいずれか1つに記載のβ−グルカンの製造方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2018088909A (ja) * | 2016-11-30 | 2018-06-14 | 財團法人食品工業發展研究所 | アウレオバシジウム・プルランス、β−グルカン生産用培地及び方法、アウレオバシジウム・プルランス培養物及びそれを含む組成物 |
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