CN110714047B - 一种甾体中间体1,2位脱氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种甾体激素制备技术领域，具体是涉及到一种甾体中间体1,2位脱氢的方法，包括如下步骤，用诺卡氏菌对纯度为98％以上的底物精品进行转化，当转化率达到90％以上，且产物的晶型呈柱状或针状时，投入底物粗品，继续转化，得到发酵液，然后过滤，浓缩，干燥，得产物；所述底物为16α‑甲基‑雄甾‑4,9(11)‑二烯‑3,17‑二酮，所述产物为16α‑甲基‑雄甾‑1,4,9(11)‑三烯‑3,17‑二酮，本发明得到的产物的晶型符合要求，在原料杂质多的情况下，底物转化率高，得到的产物纯度和收率高。
Description
技术领域
本发明属于一种甾体激素制备技术领域，具体是涉及到一种甾体中间体1,2位脱氢的方法。
背景技术
16α-甲基-雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮，作为前端起始物料可以合成多种重要的皮质激素，例如地塞米松系列、倍他米松系列产品，这些药物在临床中有广泛和大量的应用。
地塞米松、倍他米松等产品均需要经过一次1,2位脱氢，不同的工艺路线脱氢步骤不同，但普遍在后端脱氢，目前已知工艺均存在脱氢效率不高，杂质难精制，收率不高的问题。
申请人于2018年申请过1件专利，公开号为CN108559766A，名称为甾体药物中间体的制备方法，其采用诺卡氏菌对化合物Ⅰ进行1,2位脱氢，收率可以达到75-85％，纯度可以达到99％。在应用诺卡氏菌对本发明的底物进行1,2位脱氢时，发现当原料的纯度较低时，产物主要为方片状、不规则圆片状或椭圆片状，产物的晶型不符合要求，可能的理由为杂质较多时产物分子、底物分子和杂质分子以某种方式共结晶，导致部分底物分子被包裹而转化不完全。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种甾体中间体1,2位脱氢的方法，得到的产物的晶型符合要求，在底物杂质多的情况下，底物转化率高，得到的产物纯度和收率高。
本发明的内容包括如下步骤，
用诺卡氏菌对纯度为98％以上的底物精品进行转化，当转化率达到90％以上，且产物的晶型呈柱状或针状时，投入底物粗品(纯度一般为92-97％)，继续转化(一般当转化率达到95％以上时，可以终止)，得到发酵液，然后过滤，浓缩，干燥，得产物；所述底物为16α-甲基-雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮，所述产物为16α-甲基-雄甾-1,4,9(11)-三烯-3,17-二酮。
所述底物的结构式为：
所述产物的结构式为：
本发明的诺卡氏菌(Nocardioides simplex)可以为市售商业菌或者保藏菌，比如北纳生物的编号为BNCC223330的菌。
用诺卡氏菌对底物精品进行转化后的物质以及采用本发明的方法得到的产物的晶型为柱状或针状，符合要求。
所述底物精品的精炼方法为，将底物粗品用溶剂回流，浓缩，干燥得到，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮中的一种或多种。
诺卡氏菌发酵用的培养基包括如下重量组分，葡萄糖1％-1.5％，玉米浆1％-1.5％，蛋白胨0.4％-0.6％，酵母膏0.05％-0.2％，磷酸二氢钾0.2％-0.3％和消泡剂0.01-0.05％，其他为水，发酵液的pH为6.3-6.8。优选的，培养基包括如下重量组分，葡萄糖1.2％，玉米浆1.2％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸二氢钾0.25％和消泡剂0.02％，其他为水。
发酵用的培养基的方法为，先用重量浓度为20％碱液调pH为8.0-8.2，118-121℃灭菌30分钟，灭后PH值为6.3-6.8，火圈保护下接种诺卡氏菌，温度30℃，空气流量0.5VVM，压力0.05MPa，转速180rpm进行培养，12-18小时检测无杂菌，OD至≥0.5*30。
底物精品的投料量为0.1％-0.5％，底物粗品的投料量为0.9％-10％，底物粗品的投料量与底物精品的投料量的比值不大于9。
诺卡氏菌发酵的条件为转速180rpm，通气量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa。
发酵液过滤，滤饼烘干后，滤饼用3-10倍的甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种进行提取。浓缩时，一般加入1-3倍的水水析，并蒸干溶剂。
本发明的有益效果是，本发明中，利用16α-甲基-雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮的精品和粗品进行分段投料转化，即避免了单用精品综合收率过低，又避免了单用粗品转化率不高导致产物纯度不高和难以后续利用的矛盾，使最终转化率达到95％以上，底物2％以下，且提取后产品收率达到90％以上，绝对收率超过86％，为地塞米松系列和倍他米松系列的脱氢统一提供了可能。
附图说明
图1为本申请实施例1的采用诺卡氏菌转化底物精品的产物晶型图。
图2为本申请实施例1的最终产物晶型图。
图3为本申请实施例2的采用诺卡氏菌转化底物精品的产物晶型图。
图4为本申请实施例2的最终产物晶型图。
图5为对比例1的最终产物的晶型图。
图6为对比例2的最终产物的晶型图。
具体实施方式
实施例1
本发明的脱氢方法包括，
1、经检测，底物粗品的纯度为96.1％，取150g投入2000ml单口烧瓶中，加入600ml二氯甲烷，300ml甲醇，回流30分钟，40℃浓缩至剩余约400ml，加入200ml甲醇，再次40℃浓缩至约300ml，降温至20℃，静置2小时，抽滤，滤饼用少量甲醇冲淋，滤饼称重得164.5g；滤饼按第一次的溶剂比例，再进行一次精制，得滤饼145g，80-90℃烘干，得底物精品131.95g；经检测HPLC纯度为98.23％，收率为87.97％；用20000r/min的万能粉碎机粉碎2次，取其中100g待用；另取500g底物粗品同样方法粉碎，待用。
2、在50L罐中配置培养基30L，118-121℃灭菌30分钟，无菌操作下接入200ml诺卡氏菌摇瓶菌种，转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa条件下培养16小时，取样检测，菌种正常，625nm下OD至0.51*30。培养基包括如下重量组分，葡萄糖1.2％，玉米浆1.2％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸二氢钾0.25％和消泡剂0.02％，其他为水。
3、投入第1步中粉碎好的底物精品100g，保持转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa进行转化；转化至36小时，取样检测，HPLC转化率为91.4％，观察晶型如图1所示。
4、投入第2步中粉碎好的底物粗品400g，同样条件继续转化至96小时，取样检测，HPLC转化率为96.1％，观察晶型如图2所示。
5、发酵液放出，两层滤纸抽滤，得湿品885g；将滤饼投入1500ml丙酮中，搅拌回流30分钟，降温至50℃，两层滤纸抽滤，滤饼用丙酮500ml再溶解提取一次，将两次抽滤的滤液合并，40℃减压浓缩，至产品开始析出，加入500ml自来水，继续浓缩至基本无丙酮，两层滤纸抽滤，滤饼用200ml水洗涤，取出滤饼，80-90℃烘干得目的产物466.3g，经HPLC检测含量为96.4％，综合收率为466.3/[(100/0.8797)+400]*100％＝90.78％，绝对收率为87.51％。
实施例2
本发明的脱氢方法包括，
1、经检测，底物粗品的纯度为95.4％，取150g投入2000ml单口烧瓶中，加入1500ml乙醇，回流60分钟，50-60℃浓缩至剩余约300ml，降温至20℃，静置2小时，抽滤，滤饼用少量乙醇冲淋，滤饼称重得159.3g；滤饼按第一次的溶剂比例，再进行一次精制，得滤饼145.6g，80-90℃烘干，得精品129.6g，收率为86.4％；经检测HPLC纯度为98.10％；用20000r/min的万能粉碎机粉碎2次，取其中100g待用；另取500g底物粗品同样方法粉碎，待用。
2、在50L罐中配置培养基30L，118-121℃灭菌30分钟，无菌操作下接入200ml诺卡氏菌摇瓶菌种，转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa条件下培养16小时，取样检测，菌种正常，625nm下OD至0.54*30。培养基包括如下重量组分，葡萄糖1.0％，玉米浆1.5％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.05％，磷酸二氢钾0.2％和消泡剂0.05％，其他为水。
3、投入第1步中粉碎好的底物精品100g，保持转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa进行转化；转化至36小时，取样检测，HPLC转化率为90.8％，检测晶型如图3所示。
4、投入粉碎好的底物粗品400g，同样条件继续转化至96小时，取样检测，HPLC转化率为95.8％。检测晶型如图4所示。
5、发酵液放出，两层滤纸抽滤，得湿品877g；将滤饼投入1500ml丙酮中，搅拌回流30分钟，降温至50℃，两层滤纸抽滤，滤饼用丙酮500ml再溶解提取一次，将两次抽滤的滤液合并，40℃减压浓缩，至产品开始析出，加入500ml自来水，继续浓缩至基本无丙酮，两层滤纸抽滤，滤饼用200ml水洗涤，取出滤饼，80-90℃烘干得目的产物470g，经HPLC检测含量为95.2％，综合收率为470/[(100/0.864)+400]*100％＝91.13％，绝对收率为86.75％。
对比例1
脱氢方法包括，
1、经检测，底物粗品的纯度为96.1％，取500g用20000r/min的万能粉碎机粉碎2次，待用。
2、在50L罐中配置培养基30L，118-121℃灭菌30分钟，无菌操作下接入200ml诺卡氏菌摇瓶菌种，转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa条件下培养16小时，取样检测，菌种正常，625nm下OD至0.51*30。培养基包括如下重量组分，葡萄糖1.2％，玉米浆1.2％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸二氢钾0.25％和消泡剂0.02％，其他为水。
3、投入第1步中粉碎好的底物粗品500g，保持转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa进行转化；转化至96小时，取样检测，HPLC转化率为89.6％，继续转化至120小时，取样检测，HPLC转化率为89.7％，检测其晶型如图5所示。
4、发酵液放出，两层滤纸抽滤，得湿品901g；将滤饼投入1500ml丙酮中，搅拌回流30分钟，降温至50℃，两层滤纸抽滤，滤饼用丙酮500ml再溶解提取一次，将两次抽滤的滤液合并，40℃减压浓缩，至产品开始析出，加入500ml自来水，继续浓缩至基本无丙酮，两层滤纸抽滤，滤饼用200ml水洗涤，取出滤饼，80-90℃烘干得目的产物455g，经HPLC检测含量为89.1％，综合收率455/500*100％＝91.0％，绝对收率为81.08％。
对比例2
脱氢方法包括，
1、底物粗品的纯度为95.4％，取1000g投入10000ml反应釜中，加入4000ml二氯甲烷，2000ml甲醇，回流30分钟，40℃浓缩至剩余约3000ml，加入1500ml甲醇，再次40℃浓缩至约2000ml，降温至20℃，静置2小时，抽滤，滤饼用少量甲醇冲淋，滤饼称重得1064g；滤饼按第一次的溶剂比例，再进行一次精制，得滤饼978.84g，80-90℃烘干，得精品883g；仅检测器HPLC纯度为98.31％，收率为88.3％；用20000r/min的万能粉碎机粉碎2次，取其中500g待用。
2、在50L罐中配置培养基30L，118-121℃灭菌30分钟，无菌操作下接入200ml诺卡氏菌摇瓶菌种，转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa条件下培养16小时，取样检测，菌种正常，625nm下OD至0.57*30。培养基包括如下重量组分，葡萄糖1.2％，玉米浆1.2％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸二氢钾0.25％和消泡剂0.02％，其他为水。
3、投入第1步中粉碎好的底物精品500g，保持转速180rpm，流量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa进行转化，转化至96小时，取样检测，HPLC转化率为96.2％，经检测其晶型如图6所示。
4、发酵液放出，两层滤纸抽滤，得湿品872g；将滤饼投入1500ml丙酮中，搅拌回流30分钟，降温至50℃，两层滤纸抽滤，滤饼用丙酮500ml再溶解提取一次，将两次抽滤的滤液合并，40℃减压浓缩，至产品开始析出，加入500ml自来水，继续浓缩至基本无丙酮，两层滤纸抽滤，滤饼用200ml水洗涤，取出滤饼，80-90℃烘干得目的产物454.9g，经HPLC检测含量为96.3％，综合收率为454.9/(500/0.883)*100％＝80.34％，绝对收率为77.37％。
采用卡诺氏菌对底物粗品进行发酵后的产物，如图5所示，晶体形态为无定形。推测为杂质较多时，底物、产物、杂质分子结构比较配合，以至于会共结晶，形成无定型的晶体，而杂质较少时，没有杂质分子的有效介入，仅产物分子自身结晶，不会同底物分子共结晶，转化较为完全，此时的晶体为柱状或针状。本发明先对底物精品精品进行转化，然后在后期加入底物粗品后前期形成的有效晶体具有诱导作用，即产物分子在晶体基础上顺序排列，底物分子不能加入，逐步转化至接近完全。
对比例1中，单纯采用粗品进行转化，虽然绝对收率可以达到81％，但是产物的纯度太低，只有89.1％，产物中含有大量的原料(5-8％)，即底物，由于产物和原料在多种溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、甲苯、DMF等中都有较大且相似的溶解度，产物中的原料难以精制到2％以下，后续步骤无法使用。
从对比例2的数据可以看出，直接用底物精品进行转化，由于底物粗品精炼出精品的收率较低，只有87％左右，导致整体收率并不理想。
Claims (5)
1.一种甾体中间体1,2位脱氢的方法，其特征是，包括如下步骤，
用诺卡氏菌对纯度为98%以上的底物精品进行转化，当转化率达到90%以上，且产物的晶型呈柱状或针状时，投入底物粗品，继续转化，得到发酵液，然后过滤，浓缩，干燥，得产物；所述底物为16α-甲基-雄甾-4,9（11）-二烯-3,17-二酮，所述产物为16α-甲基-雄甾-1,4,9（11）-三烯-3,17-二酮；
底物精品的投料量为0.1%-0.5%，底物粗品的投料量为0.9%-10%，底物粗品的投料量与底物精品的投料量的比值不大于9，底物粗品中，底物的纯度为92-97%。
2.如权利要求1所述的甾体中间体1,2位脱氢的方法，其特征是，所述底物精品的精炼方法为，将底物粗品用溶剂回流，浓缩，干燥得到，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的甾体中间体1,2位脱氢的方法，其特征是，诺卡氏菌发酵用的培养基包括如下重量组分，葡萄糖1%-1.5%，玉米浆1%-1.5%，蛋白胨0.4%-0.6%，酵母膏0.05%-0.2%，磷酸二氢钾0.2%-0.3%和消泡剂0.01-0.05%，其他为水，发酵液的pH为6.3-6.8。
4.如权利要求1-3任一项所述的甾体中间体1,2位脱氢的方法，其特征是，诺卡氏菌发酵的条件为转速180rpm，通气量0.5vvm，温度30℃，压力0.05MPa。
5.如权利要求1-3任一项所述的甾体中间体1,2位脱氢的方法，其特征是，发酵液过滤，滤饼烘干后，滤饼用3-10倍的甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种进行提取。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |