JP3610736B2 - Ｈｔｌｖ−ｉｉを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−ＩＩ型（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩと称する）を特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】
毛様細胞性白血病から分離されたウイルスであるヒトＴ細胞白血病ウイルス−ＩＩ型（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩと称する）に関しては、これまでにいくつかの疾患に関与することが示唆されており、最近では慢性疲労免疫機能障害症候群に関与すること（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，２９２２−２９２６（１９９１））及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−Ｉ型（以下、ＨＴＬＶ−Ｉと称する）様の痙性麻痺を伴う脊椎症に関与すること（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４０，７１４−７２３（１９９６））が報告されている。
ＨＴＬＶ−ＩＩはＨＴＬＶ−Ｉと近縁のウイルスであり、ＨＴＬＶ−Ｉは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、ＨＴＬＶ−Ｉによって引き起こされる痙性麻痺を伴う脊椎症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）等の疾患に関与することが明らかになっている。
しかし、現状においてはＨＴＬＶ−ＩＩ及びＨＴＬＶ−Ｉの関与する疾患に関して、有効な治療方法が確立されてはいないため、現段階においては感染拡大を防ぐことが最善の策であり、二次感染、特に輸血感染による感染拡大を如何に防ぐかに多大な努力が払われている。
【０００３】
二次感染を防ぐ手段は、感染者を特定することが挙げられ、その方法は、免疫学的な測定方法により被検者が陰性であるか陽性であるかを判断することにより達成されるものである。
より具体的に述べると、検体中の抗原を測定する場合と検体中の抗体を測定する場合の２つのパターンを用いることが可能である。
例えば、抗原を測定する場合には、抗体を用いた測定試薬と検体中の抗原とを接触させ、その後免疫反応の有無を判断することにより判定を行い、抗体を測定する場合には、前記とは逆に抗原を用いた測定試薬と検体中の抗体とを接触させ、同様に免疫反応の有無を判断することにより判定を行うことができる。
よって、抗原、抗体のいずれも特異的に反応を行えるものであれば測定試薬に用いることが可能である。
【０００４】
本発明の課題としているＨＴＬＶ−ＩＩに関しては前記したようにＨＴＬＶ−Ｉと近縁のウイルスであり、二者の間に非常に高いホモロジーが存在することが既に報告されており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，３１０１−３１０５（１９８５）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，６２０７−６２１１（１９８４））、このホモロジーの高さのためにＨＴＬＶ−ＩＩ抗原は精製が難しく、その取得が困難であった。さらに、それに伴いＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と称する。）の取得も困難であった。
【０００５】
現在、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を用いた試薬は存在するものの、用いられている抗原は合成ペプチドであるか又はリコンビナントであり、いわゆる変性状態の抗原であるため天然抗原と比べると反応性が低く、これは試薬としての感度にも影響を及ぼすものである。
【０００６】
【発明が解決する課題】
前記のようにＨＴＬＶ−ＩＩとＨＴＬＶ−Ｉとの間には高いホモロジーが存在しているため、これまでのＨＴＬＶ−ＩＩ抗体はＨＴＬＶ−Ｉ抗原との交差反応性が強く、ＨＴＬＶ−ＩＩを特定することが困難でその感染の診断も信頼性が高いとはとても言うことはできないものであった。
【０００７】
そこで、抗原として天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉを認識しないことを特徴とするＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を得ることができれば、直接、感染細胞を検出することができるため、より正確な診断を行うことができる試薬を提供することができ、本発明者らはそのような感度の高い試薬を提供することを課題としたものである。
【０００８】
また、抗原に関しては、既存の試薬についてその試薬に用いる抗原を遺伝子組み換え技術により得ているが、多量の抗原を効率良く得るためにはコストの面から大腸菌を用いる系が多用されている。そのため、天然抗原と比べると、「糖が結合していない。」、「不溶性である。」等の性質があり、取扱いが困難であった。そこで、取扱いが容易で、さらに高い抗原性を持つ抗原（例えば天然抗原等）を使用した測定試薬の提供が強く望まれていた。
【０００９】
しかし、一般的に用いられているレクチンカラムを利用する精製方法では、レクチンカラムが糖鎖による特異性に依存し、抗原特異的ではないことに由来して天然のＨＴＬＶ−ＩＩを分離することは困難であった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意検討した結果、天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しないモノクローナル抗体（以下、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と称する。）を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は、天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができ、ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しない抗体である。
よって、例えば該抗体を免疫測定試薬に用いれば、検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗原と該抗体とが免疫反応を行い、これを定量することにより被検者がＨＴＬＶ−ＩＩに感染しているか否かを正確に判定することができるものである。
【００１２】
さらに、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができるので、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞を直接測定することも可能である。
【００１３】
また、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体が天然の抗原を特異的に認識することを利用し、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体をアフィニティークロマトグラフィー等の精製手段に用いれば、ＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原を単離することが可能となる。よって、ＨＴＬＶ−ＩＩ持続感染株の培養によって得られた蛋白質は、種々細胞由来の非特異抗原を含むことが多いが、そこからでもＨＴＬＶ−ＩＩを単離することができ、技術的、設備的にも高度な技術を用いることなく、安価で、容易に、精製されたＨＴＬＶ−ＩＩが取得可能である。
【００１４】
該精製方法により得られた天然のＨＴＬＶ−ＩＩを測定試薬に用いれば、抗原性が高いため高感度にＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の検出を行うことができる。よって、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を使用して得られた天然のＨＴＬＶ−ＩＩを抗原として用いることで、従来よりも信頼性の高い試薬を提供することが可能となる。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体はＨＴＬＶ−ＩＩ由来のペプチドを免疫原として常法に従って免疫することにより得ることができるものである。
免疫原としては、ＨＴＬＶ−ＩＩを産生するウイルス株から得られたＨＴＬＶ−ＩＩを精製した膜蛋白質の膜貫通部分又はＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜貫通部分由来のペプチドを用いることができる。
【００１６】
上記のように作製した抗原を、免疫動物に免疫する。このとき抗原は単独又はアジュバンドと共に免疫動物に投与することができる。免疫後は、抗体価の上昇を確認して血清を採取するが、必要に応じて追加免疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等の抗体産生細胞と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞とを、融合剤を用いて融合し、ハイブリドーマを作製することができる。
免疫動物としてはウサギ、モルモット、マウス、ラット等を用いることができ、アジュバンドとしては完全フロインドアジュバンド、不完全フロインドアジュバンド、ミョウバン、百日ぜき死菌体等を用いることができる。
また、融合剤としてはポリエチレングリコール、センダイウイルス等を用いることができる。
【００１７】
次いで、ハイブリドーマをＨＡＴ培地等の選択培地を用いて選択し、適当なクローニング方法で、モノクローナル化して培養を行い、この培養上清を酵素免疫測定法等の適当な免疫測定法で分析することによって、目的とする抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を産生しているクローンを選択するものである。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する手法は公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン （Ｎａｔｕｒｅ ２５６ ４９５ １９７５）、シェーラー （Ｎａｔｕｒｅ ２８５ ４４６ １９８０）等の方法、により行うことができる。
クローニング方法としては限界希釈法、軟寒天法、フィブリノーゲンゲル法、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いる方法等を挙げることができる。
【００１８】
前記のように得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生することができるが、例えば、マウスに本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を産生するハイブリドーマを投与して得られた腹水から目的のモノクローナル抗体を分離・精製することによって、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を取得することができる。このとき、用いるマウスによってはプリスタンをあらかじめ投与しておくことが好ましい。
また、分離精製の手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルロ過クロマトグラフィ−等を用いることができる。
【００１９】
また、別の取得方法としては、例えば、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養した培養上清から分離・精製を行うことによって本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を取得することができる。
分離・精製の手段は前記と同様の手法により行うことができる。
このように得られた本発明のモノクローナル抗体は、前記した通りＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜貫通部分を免疫原とするため、膜貫通部分の蛋白質に由来するペプチドを含むものであれば、天然抗原に限らずリコンビナント抗原又は合成抗原であっても認識することができるものである
【００２０】
このように得られた本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体又は該抗体により精製されたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原はＨＴＬＶ−ＩＩの感染診断のための測定試薬に用いることができる。このときに行うことができる測定方法は、試薬に用いたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗原とが免疫反応を行う測定方法であれば、公知であるどのような免疫測定方法でもよい。免疫測定方法としては、例えば、凝集法、比濁法、サンドイッチ法、競合法等を用いることができ、またこれらの免疫測定法において標識物を使用する場合にはその標識として酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
例えば、凝集法である間接凝集免疫測定法を用いて検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を測定する場合は、本発明により得られたＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を用いてＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を取得し、得られた該抗原を適当な不溶性担体に固定化する。これを検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と反応させ、凝集反応の有無によって検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体が存在するか否かを判定する。
不溶性担体としては、赤血球、ラテックス、ビーズ、磁性粒子等を用いることができる。
【００２２】
また、抗原又は抗体を不溶性担体に結合させる方法としては、物理吸着法又は化学結合法を採用することができる。
物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記担体と抗原又は抗体とを反応させることにより行うものである。
緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液等を使用することができ、反応は両者を混合させることにより容易に進行し、目的とする固定化抗原又は抗体を得ることができる。
また、化学結合法は、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・スルフィド法、公知の各種架橋剤を用いる方法等により行うものである（例えば、「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８７）参照）。この方法ではモノクローナル抗体に存在する官能基を利用することができるほか、抗体にチオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を導入した後、前記と同様の反応により抗体を不溶性担体に固定化することも可能である。
【００２３】
また、凝集反応の有無は、例えば、反応容器内で検体中の抗体と固定化された抗原とを反応させ、その容器底部への粒子の凝集パターンの違いにより判断することができ、このとき、凝集反応が起こった場合には検体をＨＴＬＶ−ＩＩ陽性と判定し、起こらなかった場合には陰性と判定するものである。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例及び参考例により本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
（参考例１）
ｐＷＴＩＩＥ２０の作成及び発現
ＨＴＬＶ−ＩＩ持続感染株（Ｃ３−４４）から膜蛋白質（ｇｐ２１Ｅ）に相当する遺伝子とＴＲＸ遺伝子との融合遺伝子を宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養にて波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。３時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １％トライトンＸ１００ ０．５Ｍ塩化ナトリウム １０％ショ糖 ５％グリセロールを４００ｍｌ加え、氷冷下で１回目の超音波破砕処理を行った。発現した融合蛋白質は、遠心後不溶性成分（インクルージョンボディ）として沈殿物として回収された。得られた不溶性成分に３Ｍ尿素 １０ｍＭジチオスレイトール ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １％トライトンＸ１００ ０．５Ｍ塩化ナトリウム １０％ショ糖 ５％グリセロールを４００ｍｌ加え、氷冷下で２回目の超音波破砕処理を行った。遠心後 ２回目超音波処理沈殿物に２００ｍｌの５Ｍ塩酸グアニジン ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １０ｍＭジチオスレイトールを加え、可溶化を行った。可溶化物は、２０％アセトニトリル ２０ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシア社製）にて精製を行った。アセトニトリルで溶出したところ、約３５％〜４５％アセトニトリル溶出画分に精製ＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩ ２０Ｅを回収した。回収物は、３Ｍ尿素５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０に透析を行って、目的の抗原を取得し、免疫原とした。その反応性はＢＢＩ社由来のＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清パネルで確認した。
【００２６】
（実施例１）
ＴＲＸ−ｐ２１Ｅ（１００μｇ／ｍＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウスにβグルカンパウダー（ＯＰＴＩＶＡＮＴ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と共に接種し、その脾臓細胞をミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合させ、用いた抗原との反応性及びＨＴＬＶ−ＩＩ持続感染株（Ｃ３−４４）破砕物の反応性を指標に抗体産生株をスクリーニングし、ハイブリドーマ ｇｐ２１−３４を得た。該ハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体
ｇｐ２１−３４と称する）のサブクラスはＩｇＧ１であった。
本実施例により得られたハイブリドーマ ｇｐ２１−３４は生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６０４７である。
【００２７】
（実施例２）
ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞としてＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４を、更にＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞としてＭＴ−２及びＴＣＬ−Ｋａｎを、対照ウィルス非感染Ｔ細胞としてＭＯＬＴ−４を用いて間接免疫蛍光抗体法によりモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４の特異性を確認した。各細胞を免疫蛍光抗体法用のスライドガラスに塗布し、メタノールで固定後、モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４（×１０００倍希釈液）と反応させた。洗浄後、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ、再び洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４と反応し、ＴＣＬ−Ｋａｎ、ＭＴ−２及びＭＯＬＴ−４とは反応しなかった。この結果を図１に示す。
よって、モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＨＴＬＶ−ＩＩ抗原と特異的であることが確認された。
【００２８】
（実施例３）
ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞としてＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４並びにＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞としてＭＴ−２及びＴＣＬ−Ｋａｎの各細胞から、０．１％−ＮＰ４０及び１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むトリスＮａＣｌ ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）緩衝液で抽出した細胞抽出液を用いて、ウェスタンブロット法によりモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４の特異性を確認した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動はゲル濃度１２．５％で常法に従って実施した。泳動後ニトロセルロース膜に転写し、モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４（×１０００倍希釈）と反応させ、洗浄後、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。再び洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質と反応させた。モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４とのみ反応し、２０Ｋｄバンドとして確認された。この結果を図２に示す。
本実施例の結果より、モノクロ−ナル抗体 ｇｐ２１−３４はＨＴＬＶ−ＩＩエンベロ−プ蛋白質の膜蛋白質部分を特異的に認識していることが確認された。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原の測定試薬に用いることができ、さらに、ＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原の精製に用いることができる。精製されたＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原を、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の測定試薬に用いれば、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染の診断において高感度で信頼性の高い試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】間接蛍光抗体法によるモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４の反応特異性を示す図である。
【図２】ウェスタンブロット法によるモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４の反応特異性を示す図である。
【図３】発現ベクター ｐＷＴＩＩＥ２０の制限酵素切断地図である。

Claims (4)

1. 抗原として天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉを認識しないモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体の免疫原がＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質であるｐ２１Ｅであるモノクローナル抗体。
2. モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０４７のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体ｇｐ２１−３４）である請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 請求項１または２のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
4. 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０４７（ハイブリドーマｇｐ２１−３４）で寄託された請求項３記載のハイブリドーマ。

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