JPH08506833A - 改善されたｈｃｖ診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白および非構造３蛋白（ＮＳ３）のエピトープ、エンベロープ蛋白のエピトープ、非構造４蛋白のエピトープおよびＨＣＶ非構造５蛋白のエピトープ、およびこれらを含む組換え蛋白；組換え蛋白の生産方法；前記組換え蛋白を含む、推定血清試料中のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体診断用試薬；およびこの試薬を用いたＣ型肝炎診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 改善されたＨＣＶ診断試薬発明の分野 本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−特異的エピトープ、一つ以上のＨＣＶ エピトープを含む組換え蛋白および前記組換え蛋白を使用して推定血清試料中の Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出する方法に関するものである。より詳細に は、本発明はＨＣＶコア（ｃｏｒｅ）蛋白と非構造３蛋白（ＮＳ３）のエピトー プ類（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）およびこれらを含む組換え蛋白、ＨＣＶエンベロープ （ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白と非構造４蛋白のエピトープ類およびこれらを含む組 換え蛋白、およびＨＣＶ非構造５蛋白のエピトープ類およびこれを含む組換え蛋 白；前記組換え蛋白の産生方法；前記組換え蛋白を含む、推定血清試料中のＣ型 肝炎ウイルスに対する抗体を診断するための試薬；および前記試薬を用いてＣ型 肝炎を診断する方法に関するものである。発明の背景 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は肝硬変又は肝細胞癌へ進展するウイルス性肝炎 の主原因であり、輸血により引き起こされる肝炎の７０−８０％程度はこのウイ ルスによるものと報告されている（Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．，ｅ ｔ，ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２，８３８−８４１（１９７５）；およびＤｉｅｎ ｓｔａｇ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，６ ，６７−８１，（１９８６）参照）。このウイルスは一本の陽性ＲＮＡ鎖から なるＲＮＡウイルスの一つであり、前記鎖のオープンリーディングフレーム（Ｏ ＲＦ）（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）からポリ蛋白前駆体（ｐｏｌ ｙｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を産生する（Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．，ｅ ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９−３６２（１９８９）；およびＣ ｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ，８８，２４５１−２４５５（１９９１））。 Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子構造は、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ） またはペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）のそれと類似し（Ｍｉｌｌｅｒ ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７ ，２０５７−２０６１（１９９０）；およびＭｕｒａｉｓｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１７２，５ １１−５１６（１９９１））、前記の類縁関係を基にして、Ｃ型肝炎ウイルスの ポリ蛋白はＮ−末端か らＣ−末端までコア−エンベロープ１（Ｅ１）一エンベロープ２／非構造１蛋白 （Ｅ２／ＮＳ１）−非構造２蛋白（ＮＳ２）−非構造３蛋白（ＮＳ３）−非構造 ４蛋白（ＮＳ４）−非構造５蛋白（ＮＳ５）から構成されているものと推定され る（Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ，８８，２４５１−２４５５（１９９１）；Ｔａｋａｍｉｚａｗａ， Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５−１１１３（１９９１ ）；およびＫａｔｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ，８７，６５２４−６５２８（１９９０））。 Ｃ型肝炎ウイルスの感染はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて血液試料 から直接Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡを検出することによって診断されることがで き（Ｈｏｓｏｄａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１５，７７７ −７８１（１９９２）；Ａｂｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１５ ，６９０−６９５（１９９２）；およびＡｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．，Ａｎｎａｌ ｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ，１１５，６４４−６４９（１ ９９１））、それにより、ウイルスのＲＮＡをかなり初期に、即ち、感染後１− ２週間以内に検出することができる；しかしながら、 そのような方法は多数の試料を分析する必要においては多い費用と長い時間が所 要される。他の診断方法は、例えば、Ｃ１００−３蛋白を用いた酵素−結合され たイムノアッセイによって血清試料中に存在するＣ型肝炎ウイルスに対する抗体 を検出する方法（Ｈｏｕｇｈｔｏｎｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ ８９／０４６ ６９；ＷＯ９０／１１０８９参照）がある。クオ（Ｋｕｏ）等は、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ，２４４，３６２−３８４（１９８９）中で輸血後肝炎患者の７０％以上がＣ １００−３蛋白に対する抗体を有することを開示した。 しかしながら、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体は一般的にＨＣＶ感染後４乃至 ６ヵ月までは生成されないので、診断試薬の活性成分として使用された前記のＣ １００−３抗原は初期段階の急性Ｃ型肝炎患者の抗体とは反応しなくて慢性Ｃ型 肝炎患者の抗体に対してのみ反応する。結果的に、これは疾患の初期段階で偽陰 性（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を示し（Ａｌｂｅｒ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａ ｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１，１４９４−１５００（１９８９） ；Ｍｙａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ，８７，９８３−９８７（１９９０））、更に、ＨＣＶによるもので なく自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍ ｕｎｏ ｄｉｓｅａｓｅ）に起因した肝炎の場合に相当な比率で偽陽性結果を示 す（ＭｃＦａｒｌａｎｅ，Ｉ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３３５，７ ５４−７５７（１９９０））。 オカモト（Ｏｋａｍｏｔｏ）らは日本人Ｃ型肝炎患者から収集した血清から採 取されたＨＣＶを用いて５′−末端領域とコア蛋白およびエンベロープ蛋白をコ ードする構造遺伝子を含むｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を開示し、この 配列を米国カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏ．）によって製造されたチンパンジ ーの血清から抽出したＨＣＶのそれと比較した。その結果から、オカモト（Okam oto）らは亜種（subspecific）のＣ型肝炎ウイルスの存在、および日本型ＨＣＶ に対するワクチンおよび診断試薬を製造するための日本型ＨＣＶから由来された 抗原の特異性を発見した（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，６０，１６７−１７ ７（１９９０））。ハラダ（Ｈａｒａｄａ）らはまた、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５ ，３０１５（１９９１）において構造遺伝子の５′−末端部分にコードされたコ ア蛋白が、推定患者から採取された試料に存在し得る抗−ＨＣＶ抗体を診断する ための抗原として使用された場合、該抗体がＣ１００−３蛋白を使用した場合に 比べ６−８週間早く検出ができることを 報告した。 また、チュー（Ｃｈｏｏ）らはコア構造遺伝子から発現されたコア蛋白とＮＳ ３遺伝子から発現されたＣ３３Ｃ蛋白を用いる改善された診断方法を開示し（Ｂ ｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ ．，４６，４２３−４４１（１９９０））、オカモトらは Ｃ型肝炎を診断するためにコア構造遺伝子の一部のヌクレオチド配列を用いて合 成されたポリペプチドを使用した。米国のＵＢＩ社（ＵＢＩ Ｃｏ．）はコア構 造遺伝子中にコード化された１５−６５個アミノ酸から構成された合成ポリペプ チドを抗−ＨＣＶ抗体を検出するための抗原として使用する他の診断方法を開発 した（Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，ＥＰ ４４２３９４（１９９１）；Ｈｏｓｅｉｎ， Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８，３６４ ７−３６５１（１９９１）参照）。加えて、米国のオルトダイアグノスチックシ ステムズ社（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．） は既存の第１世代診断試薬にコア抗原Ｃ２２−３、ＮＳ３部分蛋白Ｃ３３Ｃおよ びＮＳ４部分蛋白Ｃ２００を添加することによって製造された、抗−ＨＣＶ抗体 に対して改善された感度を有する第２世代診断試薬を報告し（ＭｃＨｕｔｃｈｉ ｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏ ｇｙ ，１５，１９−２５（１９９２））；アルター（Ａｌｔｅｒ）はＨＣＶ感染 後１５乃至２０週間のＨＣＶ患者から採取した血清から抗−ＨＣＶ抗体の検出が できることを報告した（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ ，１１５，６４４−６４９（１９９１））。 本発明者らまた、米国型または日本型ＨＣＶとは異なる韓国型Ｃ型肝炎ウイル ス（ＫＨＣＶ）の固有な遺伝子構造を明らかにし；ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ遺伝子か らＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ １４蛋白を、ＫＨＣＶ ＮＳ３遺伝子からＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白を、ＫＨＣＶ ＮＳ５遺伝子からＫＨＣＶ ４０３蛋白を、そ してＫＨＣＶエンベロープ遺伝子からエンベロープ蛋白を、組換え酵母または大 腸菌細胞中で発現させ；前記発現した蛋白の免疫特異性を確認し；前記蛋白を精 製する方法を報告し；これらＫＨＣＶ抗原蛋白を使用して酵素結合免疫吸着検定 法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ， ＥＬＩＳＡ）によってＣ型肝炎患者の血清から抗−ＨＣＶ抗体を検出するための 改善された診断方法を開発した（韓国特許公報第９３−６８３号参照）。 本発明者らは前記試薬等に比べ改善された正確性およ び迅速性を有するＨＣＶ診断試薬を開発するために努力してきた。その結果、Ｈ ＣＶに対する抗体ときわだった感度および正確性を有して反応するいくつかのＨ ＣＶエピトープ類を発見した。発明の概要 したがって、本発明の主要目的はＨＣＶ抗体との改善された反応性を有する前 記エピトープ；および一種以上のＨＣＶエピトープを含む組換え蛋白を提供する ことである。 本発明の他の目的は前記エピトープまたは前記組換え蛋白をコードするヌクレ オチド配列；発現時一種以上のＨＣＶエピトープを含む組換え蛋白を産生できる 、前記組換え蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター；お よび前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。 本発明のもう一つの目的は前記組換え蛋白をコードするヌクレオチド配列を含 む組換え発現ベクターで形質転換された前記宿主細胞を培養することを含む、一 種以上のＨＣＶエピトープを含む組換え蛋白の産生方法を提供することである。 本発明のまた他の目的は一種以上のＨＣＶエピトープを含有する一種以上の組 換え蛋白を活性成分として含む、 推定試料中の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための診断試薬；および前記試薬を含む 診断キットを提供することである。 本発明のまた他の目的は前記試薬またはキットを使用してＨＣＶ感染を初期に 迅速で正確に診断する方法を提供することである。 本発明の一態様によれば、ＨＣＶ非構造４蛋白のエピトープであるＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ；ＨＣＶエンベロープ蛋白のエピトープであるＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ，ＫＨ ＣＶＥ２ＡおよびＫＨＣＶ Ｅ２Ｅ蛋白；ＨＣＶコア蛋白のエピトープであるＫ ＨＣＶＣＯＲＥＥＰＩ蛋白；ＨＣＶ非構造３蛋白のエピトープであるＫＨＣＶ ５１８蛋白；および非構造５蛋白のエピトープを含むＫＨＣＶ ＮＳ５−１，２ 蛋白を含むＨＣＶエピトープ類；および１種以上の前記エピトープ類を含む組換 え蛋白類が提供される。図面の簡単な説明 本発明の前記および他の目的と特徴は、添付した図面と関連した好ましい態様 の下記説明を参照することによって明らかになり得るし、添付図面において、 図１はコア蛋白のエピトープ（ＣＯＲＥＥＰＩ）および非構造３蛋白のエピト ープをコードするヌクレオチド 配列；およびそこにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ示し、 図２はＮＳ４蛋白のエピトープ（ＮＳ４Ｅ）および非構造３蛋白のエピトープ 類（Ｅ１Ｇ，Ｅ２ＡおよびＥ２Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；およびそこ にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ示し、 図３はＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白をコードするヌクレオチド配列；および そこにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示し、 図４はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＫＨＣＶ８９７ ＤＮＡ断片 を増幅させるために使用された各プライマーの位置を示し、 図５は大腸菌細胞でＫＨＣＶ８９７ ＤＮＡ断片を発現させる目的で作製され た発現ベクターを示し、 図６Ａは大腸菌細胞でＫＨＣＶ８９７ ＤＮＡ断片を発現させた後ＳＤＳポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示し、図６ＢはＣ 型肝炎患者の血清を用いて図６Ａのゲルでウェスタンブロッティング分析した結 果を示し、 図７はＰＣＲによってエンベロープ蛋白をコードする遺伝子の多様なＤＮＡ断 片類（fragments）を増幅させるために使用された各プライマーの位置を示し、 図８は大腸菌細胞中エンベロープ蛋白の一部をコードするＤＮＡ断片を発現さ せる目的で作製された発現ベクターを示し、 図９Ａは大腸菌細胞でエンベロープ蛋白の一部をコードする多様なＤＮＡ断片 類を発現させた後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） した結果を示し、図９ＢはＣ型肝炎患者の血清を用いて図９Ａのゲルでウェスタ ンブロッティング分析した結果を示し、 図１０はＵＢＣＯＲＥ５１８蛋白を発現させる目的で作製される発現ベクター の作製過程を示した図式であり、 図１１Ａは大腸菌細胞でＵＢＣＯＲＥ５１８ ＤＮＡ断片を発現させた後ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示し、図１ １ＢはＣ型肝炎患者の血清を用いて図１１Ａのゲルでウェスタンブロッティング 分析した結果を示し、 図１２はユビキチン遺伝子と非構造４蛋白のエピトープ（ＮＳ４Ｅ蛋白）をコ ードするＤＮＡ断片とを含む組換えＤＮＡを発現させる目的で作製される発現ベ クターの作製過程を示した図式であり、 図１３はユビキチンとエンベロープ蛋白のエピトープであるＥ１Ｇ，Ｅ２Ａお よびＥ２Ｅを含む融合蛋白（fusion Protein）Ｅ１Ｅ２とを含むＵＢＥ１Ｅ２蛋 白をコ ードする組換えＤＮＡを発現させる目的で作製される発現ベクターの作製過程を 示した図式であり、 図１４Ａは大腸菌細胞で組換えＵＢＥ１Ｅ２蛋白を発現させた後ＳＤＳポリア クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示し、 図１４ＢはＣ型肝炎患者の血清を用いて図１４Ａのゲルでウェスタンブロッテ ィング分析した結果を示し、 図１５はユビキチン、ＮＳ４Ｅ蛋白およびＥ１Ｅ２蛋白を含むＵＢＮＳ４Ｅ１ Ｅ２蛋白をコードする組換えＤＮＡを発現させる目的で作製される発現ベクター の作製過程を示した図式であり、 図１６Ａは大腸菌細胞でＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白をコードする組換えＤＮＡを 発現させた後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した 結果を示し、 図１６ＢはＣ型肝炎患者の血清を用いて図１６Ａのゲルでウェスタンブロッテ ィング分析した結果を示し、 図１７はユビキチンとＮＳ５−１．２蛋白とを含むＵＳＮＳ５−１．２蛋白を コードする組換えＤＮＡを発現させる目的で作製される発現ベクターの作製過程 を示した図式であり、 図１８Ａは大腸菌細胞でＵＢＮＳ５−１．２蛋白をコ ードする組換えＤＮＡを発現させた後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示し、図１８ＢはＣ型肝炎患者の血清を用いて図 １８Ａのゲルでウェスタンブロッティング分析した結果を示し、および 図１９Ａは大腸菌細胞でＫＨＣＶ４０３蛋白と組換えＵＢＮＳ５−１．２蛋白 を発現させた後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し た結果を示し、図１９ＢはＣ型肝炎患者の血清を用いて図１９Ａのゲルでウェス タンブロッティング分析した結果を示す。発明の詳細な説明 本明細書に言及した全ての文献等は参考文献として本明細書に含まれているも のである。 本明細書中に使用された下記用語は次のような意味を有する： 用語“Ｃ型肝炎ウイルス”は非Ａ非Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の原因となるウイ ルスをいう。 用語ＨＣＶおよびＣ型肝炎は本明細書で交換的に使用する。 用語“韓国型Ｃ型肝炎ウイルス”または“ＫＨＣＶ”は、韓国人Ｃ型肝炎患者 から単離された新型ＨＣＶを言 い；そのｃＤＮＡは８４２番目、８４９番目および８５３番目アミノ酸がそれぞ れフェニルアラニン、ロイシンおよびトレオニンであるか、又はそれぞれロイシ ン、フェニルアラニンおよびアラニンであるアミノ酸配列をコードするヌクレオ チド配列のオープンリーディングフレームを有する。 用語“エピトープ”は免疫学的能力のある宿主で免疫応答を起こすことができ 、及び／又は相補的抗体にそれ自身特異的に結合できるポリペプチドの抗原決定 基を言う。本発明のエピトープは一般的に少なくとも６個のアミノ酸、望ましく は７または８個のアミノ酸からなる。 本明細書中に使用された他の用語は該当分野で使用され理解される正常的で通 常的な意味を有する。 以後、ＨＣＶ ｃＤＮＡの核酸番号またはＨＣＶ蛋白のアミノ酸番号は韓国特 許公開第９３−６８３号に開示した全体ＫＨＣＶヌクレオチド配列またはアミノ 酸配列を基にする。 以下、本発明をさらに詳細に説明する。１．エピトープの決定 ＨＣＶ，例えば、ＫＨＣＶ（ＫＨＣＶ ＬＢＣ１、１９９１年５月１４日付 アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に受託番号ＡＴＣＣ ７５０ ０８で寄託；韓国特許公開第９３−６８３号）のｃＤＮＡのヌクレオチド配列に 対する情報を用いて、ＫＨＣＶ８９７蛋白、エンベロープ蛋白または非構造５蛋 白をコードするｃＤＮＡ断片の５′−と３′−末端に該当するポリメラーゼ連鎖 反応用プライマーを合成する。 前記プライマーと、鋳型として、ＫＨＣＶ８９７遺伝子（１９９１年６月２７ 日付でＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ６８６４０として寄託）、ＫＨＣＶエンベ ロープ１遺伝子（１９９１年１２月１１日付でＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ６ ８８７８として寄託）、ＫＨＣＶエンベロープ２遺伝子（１９９１年１２月１１ 日付でＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ６９８６６およびＡＴＣＣ ７４１１７と して寄託）およびＫＨＣＶ ＮＳ５遺伝子（韓国特許公開第９３−６８３号参照 ）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって、ＫＨＣＶ８９７遺伝子 、ＫＨＣＶエンベロープ１および２遺伝子およびＫＨＣＶ ＮＳ５遺伝子のｃＤ ＮＡ断片を得た。各ｃＤＮＡ断片をベクターに挿入し、前記発現ベクターを用い て大腸菌のような適当な宿主生物を形質転換させた。形質転換された宿主細胞に よって産生されたポリペプチド をポリアクリルアミドゲルの上で電気泳動した後、Ｃ型肝炎患者の血清を使用し てウェスタンブロッティング分析を行うことによって、どのポリペプチドがＫＨ ＣＶ抗原のエピトープとして抗−ＫＨＣＶ抗体と特異的に反応するかを確認する 。確認されたエピトープの、ＫＨＣＶ ｃＤＮＡ全体配列での位置も加えて調査 する。 その結果、ＫＨＣＶ８９７蛋白のエピトープは、ＫＨＣＶ ｃＤＮＡの４３４ ８番目乃至４７１３番目のヌクレオチドに該当する３６６塩基対から発現された ＫＨＣＶ８９７蛋白のカルボキシ末端に存在するということが明らかになった。 （ＫＨＣＶ８９７蛋白のエピトープのアミノ酸およびヌクレオチド配列は図４参 照）。 エンベロープ蛋白の場合に、エピトープは、ＫＨＣＶ ｃＤＮＡの１２０１番 目乃至１５０９番目のヌクレオチドに該当する３０９塩基対から発現されたＫＨ ＣＶエンベロープ１蛋白のカルボキシ末端（Ｅ１Ｇ蛋白）；ＫＨＣＶ ｃＤＮＡ の１５１０番目乃至１７４９番目のヌクレオチドに該当する２４０塩基対から発 現されたＫＨＣＶエンベロープ２蛋白のアミノ末端（Ｅ２Ａ蛋白）；およびＫＨ ＣＶ ｃＤＮＡの２２８１番目乃至２５２９番目のヌクレオチドに該当する２４ ９塩基対から発現されたＫＨＣＶエンベロープ２蛋白のカルボキシ末端（Ｅ ２Ｅ蛋白）中に存在することが判る（Ｅ１Ｇ，Ｅ２ＡおよびＥ２Ｅ蛋白のアミノ 酸およびヌクレオチド配列は図２参照）。 また、ＮＳ５蛋白のエピトープは、ＫＨＣＶ４０３ｃＤＮＡ断片を含む６６４ ９番目乃至７８２４番目のヌクレオチドに該当する１，２００塩基対でコードさ れたＮＳ５蛋白のアミノ末端中に存在し、ＫＨＣＶ４０３に比べて高い感度でＫ ＨＣＶ患者の血清と特異的に反応する。２．一つ以上のＨＣＶエピトープを含む組換え蛋白 ＨＣＶ抗原のエピトープは効果的、かつ経済的な診断試薬およびワクチンの開 発において非常に重要である。特に、一つまたはそれ以上のエピトープを含む融 合蛋白が経済性、有効性および正確性においてさらに望ましく、一つより多いエ ピトープを含む融合蛋白質が最も好ましい。 一つより多くのＨＣＶエピトープを含むＨＣＶ組換え蛋白としては、好ましく は、ＫＨＣＶコア蛋白およびＮＳ３蛋白のエピトープを含む組換えＣＯＲＥ５１ ８融合蛋白、およびＫＨＣＶ Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ４蛋白のエピトープを含む 組換えＮＳ４Ｅ１Ｅ２融合蛋白が含められる。 組換え蛋白は、前記融合蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む多様な発現 ベクターシステムを使用することによって産生でき；ベクターは、前記融合蛋白 および他の特定蛋白、好ましくは、蛋白の安定性を増大させるか精製過程を容易 にするユビキチンを含む組換え融合蛋白を直接産生することができる。 例えば、目的ＨＣＶ蛋白は、ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片およびユビキチン遺伝子の 融合ポリヌクレオチドを大腸菌のような細菌中で発現させた後、ＵＢＰ１と命名 したユビキチン分解酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ）（Ｔｏｂｉａｓ，Ｊ．Ｗ ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１２０２１−１２０２ ８（１９９１））でインビトロ（in vitro）でユビキチンを切断することによっ て得ることができる。ＫＨＣＶ融合蛋白のみでなくユビキチンを含む組換え融合 蛋白もＫＨＣＶ蛋白の必需的な特徴、例えば、ＨＣＶの抗原性を維持する限り、 本発明に使用することができる。 前記発現システムは、ユビキチンがプロテアーゼ（proteinases）の攻撃から 目的蛋白質を保護または安定化させることができるので、目的蛋白が不安定で、 宿主細胞内でプロテアーゼによって容易に分解される場合に効果的に使用できる 。尚かつ、ユビキチンと融合した目的組 換え蛋白の発現は、抗−ユビキチン抗体を使用して確認でき、ユビキチンの特性 を用いて容易に精製できる。 ＨＣＶエピトープを含む目的ＨＣＶ蛋白を得るためには、ＨＣＶエピトープを コードするＨＣＶ ｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターで適合な宿主細胞を形質転 換させ、形質転換した細胞を発現が許容する条件下で培養する。 適切な宿主生物は当該分野で公知されている多数の要素を考慮して選択し得る 。このような要素は、例えば、選択されたベクターとの適合性、組換えプラスミ ドによってコードされた蛋白の毒性、目的蛋白の回収容易性、蛋白の特性、生物 学的安全性および費用を含む。前記要素の均衡が考慮すべきであり、特定組換え ＤＮＡ分子の発現において全ての宿主が同等に効果的でないことは勿論である。 本発明に使用できる適当な宿主生物は大腸菌などの細菌およびサッカロミセス ・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母 を含むが、それらに限定されない。 宿主細胞で産生されたポリペプチドは、通常の方法、例えば、細胞破壊、遠心 分離、透析、塩析、クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動および電気溶出を 組合わせて使用することによって単離、精製できる。 本発明のポリペプチドは、また適当な方法、例えば、排他的固相合成法（ｅｘ ｃｌｕｓｉｖｅ ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、部分固相法（ ｐａｒｔｉａｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、断片縮合法 または通常の液相合成法によって化学的に合成できる。メリフィルド（Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ）によって開示された固相合成法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ，８５，２１４９（１９６３）参照）が望ましい。 一方、蛋白において、生物学的および免疫学的な活性を実質的に変化させない アミノ酸置換が起きることは知られているし、例えば、ニューラツ（Ｎｅｕｒａ ｔｈ）らの文献“Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９））に、特に１４項の図５に記載している。この ような機能的に同等なアミノ酸置換は、産生された蛋白が同一な抗原的特性を維 持する限り本発明の範囲に含まれる。 本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸を示すために標準３文字略字を使 用する。前記略字の意味は通常の生化学教材、例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐ ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌ ｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙ ｏｒｋ，ｐｐ．９６，７９８（１９８４）に示している。 １）ＣＯＲＥ５１８蛋白の産生 韓国型Ｃ型肝炎ウイルス（韓国特許公開第９３−６８３号参照）のｃＤＮＡの ヌクレオチド配列に対する情報を用いて、ＫＨＣＶ ＮＳ３蛋白のエピトープを 含むＫＨＣＶ５１８蛋白をコードするＫＨＣＶ５１８ ｃＤＮＡ断片の５′−と ３′−末端に該当するポリメラーゼ連鎖反応用プライマーを合成する。ｃＤＮＡ の５′−末端に該当するプライマーは、コア蛋白のエピトープをコードするＣＯ ＲＥＥＰＩ遺伝子の３′−末端と結合できるようにその５′−末端にエンドヌク レアーゼの認識部位を有するように考案されており、ｃＤＮＡの３′−末端に該 当するプライマーは、終結コドンとエンドヌクレアーゼの認識部位を有するよう に考案されている。したがって、前記プライマー（primers）は融合蛋白の合成 がユビキチンの開始コドンから始め挿入された終結コドンで終わるようにし、融 合遺伝子が発現ベクター内へ容易にクローニングされるようにする。 また、前記プライマーの配列を適切に調節することによって前記二つのエピト ープをコードする前記遺伝子を反対の順序で配列でき、得た蛋白が同等な抗原特 性を維持する限り二つのエピトープの間に他のアミノ酸配列を 挿入することもできる。 前記プライマーと、鋳型として、ＫＨＣＶ８９７遺伝子（１９９１年６月２７ 日付ＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ６８６４０として寄託）とを用いてポリメラー ゼ連鎖反応を行うことによってＫＨＣＶ５１８遺伝子を増幅させ、制限エンドヌ クレアーゼで前記ＫＨＣＶ５１８遺伝子を切断することによって得た遺伝子断片 を、ＣＯＲＥＥＰＩ遺伝子を除いたＫＨＣＶ Ｃｏｒｅ１４遺伝子の部分の代わ りに、プラスミドｐｔｒｐ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４へ挿入してその発現ベクターを 得る。発現ベクターは大腸菌のような適当な宿主生物を形質転換させるのに使用 される。形質転換された宿主細胞によって産生されたポリペプチドを１５％ポリ アクリルアミドゲル上で電気泳動した後Ｃ型肝炎患者から得た血清を使用してウ ェスタンブロッティング分析を行うことによって、ＣＯＲＥ５１８蛋白が抗−Ｋ ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを確認する。 ２）ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の産生 韓国型Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ等のヌクレオチド配列に対する情報（韓国 特許公開第９３−６８３号参照）を用いて、例えば、適切なプライマーを用いた ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＮＳ４蛋白のエピトープ（ＮＳ ４Ｅ）およびエンベロープ蛋白のエピトープ（Ｅ１Ｇ、Ｅ２ＡおよびＥ２Ｅ）を コードするヌクレオチド配列を結合させる。先ず、エンベロープ蛋白のエピトー プ、即ち、Ｅ１Ｇ，Ｅ２ＡおよびＥ２Ｅを含むＥ１Ｅ２蛋白をコードするヌクレ オチド配列の５′−および３′−末端に該当するＰＣＲ用プライマー。前記ヌク レオチド配列の５′−末端に該当するプライマーは、ＮＳ４遺伝子の３′−末端 と結合できるように、その５′−末端にＮＳ４遺伝子の３′−末端にあるヌクレ オチドと同一な２１個のヌクレオチドを有するように考案されており、ｃＤＮＡ の３′−末端に該当するプライマーは、終結コドンおよびエンドヌクレアーゼの 認識部位を有するように考案されている。したがって、前記プライマーは融合蛋 白の合成がユビキチンの開始コドンから始めて挿入された終結コドンで終わるよ うにし、融合遺伝子が発現ベクター内へ容易にクローニングされるようにする。 また、前記プライマーの配列を適切に調節することによってそれぞれのエピト ープをコードする前記４種の遺伝子を任意の順に配列でき、得た蛋白が同等な抗 原特性を維持する限り、任意の二つのエピトープの間に他のアミノ酸配列が挿入 されることもできる。 前記プライマーおよび、鋳型として、プラスミドｐｔ ｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅ２（図１６参照）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこ とによってＥ１Ｅ２遺伝子を増幅させる。Ｅ１Ｅ２およびＮＳ４遺伝子を鋳型と して使用して２次ポリメラーゼ連鎖反応を実施することによってＮＳ４Ｅ１Ｅ２ 遺伝子を増幅させ、制限エンドヌクレアーゼで前記ＮＳ４Ｅ１Ｅ２遺伝子を切断 することにより得た遺伝子断片をプラスミドｐｔｒｐ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４内へ ＫＨＣＶ Ｃｏｒｅ１４遺伝子の代わりに挿入することによってその発現ベクタ ーを得る。この発現ベクターを用いて大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９ ）のような適当な宿主生物を形質転換させ、形質転換された宿主細胞を発現可能 な条件の下で培養する。形質転換された宿主細胞によって産生されたポリペプチ ドを１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、Ｃ型肝炎ウイルス患者か ら採取した血清を用いてウェスタンブロッティング分析を実施することによって 、ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白が抗−ＫＨＣＶ抗体と特異的に反応することを確認する。 ３）ＮＳ５−１．２蛋白の産生 韓国型Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡのヌクレオチド配列に対する情報（韓国特 許公開第９３−６８３号参照）を用いて、ＮＳ５−１．２蛋白をコードするＮＳ ５−１． ２ｃＤＮＡ断片の５′−および３′−末端に該当するポリメラーゼ連鎖反応用プ ライマーを合成する。ｃＤＮＡの５′−末端に該当するプライマーは、ユビキチ ン遺伝子の３′−末端と連結されるようにその５′−末端にエンドヌクレアーゼ の認識部位を有するように考案し、ＣＤＮＡの３′−末端に該当するプライマー は終結コドンおよびエンドヌクレアーゼの認識部位を有するように考案する。し たがって、前記プライマーは、融合蛋白の合成がユビキチンの開始コドンから始 めて挿入された終結コドンで終わるようにし、融合遺伝子が発現ベクター内へ容 易にクローニングされるようにする。 前記プライマーと、鋳型として、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１遺伝子（１９９１年５月 １４日付でＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ７５００８として寄託；韓国特許公開 第９３−６８３号参照）を用いたポリメラーゼ連鎖反応によってＮＳ５−１．２ 遺伝子を増幅させ、制限エンドヌクレアーゼで前記ＮＳ５−１．２遺伝子を切断 することによって得た遺伝子断片をプラスミドｐｔｒｐ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４へ ＫＨＣＶ Ｃｏｒｅ１４遺伝子の代わりに挿入することによってその発現ベクタ ーを得る。前記発現ベクターを用いて大腸菌のような適当な宿主生物を形質転換 させる。形質転換された宿主細胞によって産生され たポリペプチドを１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、Ｃ型肝炎ウ イルス患者から採取した血清を用いてウェスタンブロッティング分析を実施する ことによって、ＮＳ５−１．２蛋白が抗−ＫＨＣＶ抗体と特異的に反応すること を確認する。３．混合されたＨＣＶ抗原ポリペプチドを含有するＣ型肝炎診断試薬の製造 本発明による診断試薬は、ＫＨＣＶ ＮＳ ４Ｅ，ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ，ＫＨＣ Ｖ Ｅ２Ａ，ＫＨＣＶ Ｅ２Ｅ，ＣＯＲＥＥＰＩ，ＫＨＣＶ ５１８およびＫＨ ＣＶ ＮＳ５−１．２を含む一つ以上のＨＣＶエピトープおよび／または一つ以 上の前記エピトープを含有する組換え蛋白を含む。 また、本発明は本質的に、一つ以上のＫＨＣＶエピトープを持ったＫＨＣＶポ リペプチドを含む診断試薬からなる、前記手法を実施することに必要な試薬を含 有するＣ型肝炎診断キットを提供する。 好ましくは、ＫＨＣＶ ｃｏｒｅおよびＮＳ３蛋白のエピトープを含む組換え ＣＯＲＥ５１８融合蛋白、ＫＨＣＶ Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ４蛋白のエピトープ を含む組換えＮＳ４Ｅ１Ｅ２融合蛋白、および／または組換えＮＳ５−１．２蛋 白を含む。 診断試薬が、混合物内にＨＣＶエピトープを含有する組換え蛋白を一種より多 く含む際、各蛋白の比率は任意的に調節できるが、各蛋白を同モル量で使用する ことが通常好ましい。 本発明による新規診断方法は以下の段階を含む： （ｉ）一つ以上のＫＨＣＶポリペプチドを含む診断試薬を固体支持体、例えば 、マイクロタイタープレート（microtiter plate）のウェルに加えて、前記ＫＨ ＣＶ抗原をウェルの表面に吸着させ； （ｉｉ）希釈剤で希釈された推定試料を前記抗原−被覆されたウェルに加え、 そこで血清内にある抗−ＫＨＣＶ抗体がある場合、抗原−抗体複合体が形成され るようにし； （ｉｉｉ）酵素、例えば、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈ ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））結合された抗−ヒトＩｇＧ抗 体を前記ウェルに加えて、抗−ヒトＩｇＧ抗体−ＨＲＰが段階（ｉｉ）で形成さ れた複合体の抗体に結合されるようにし； （ｉｖ）酵素のための基質、例えば、ペルオキシダーゼのためのＯ−フェニレ ンジアミンニ塩酸塩（ＯＰＤ）および過酸化水素をウェルに加えて発色反応を起 す。推 定血清が抗−ＫＨＣＶ抗体を含むと、酵素と基質との反応の結果として色が現れ る。薄い硫酸を添加することによって発色反応を停止させる。 色濃度の程度はマイクロウェルリーダーで測定でき；その結果を基にして抗− ＨＣＶ抗体の存在を決定する。診断方法のための固体支持体はポリスチレンビー ズやニトロセルロースストリップ（ｓｔｒｉｐｓ）であってもよい。 一種より多くのＫＨＣＶエピトープを含有する本発明の組換え蛋白が診断試薬 の製造に使用する際、これは混合物として唯一のエピトープを有する既存のいず れかのＨＣＶ抗原を使用する場合よりももっと経済的、かつ正確な診断を可能に する。また、ＫＨＣＶエピトープを含む組換え蛋白の混合物を含有する本発明の 診断試薬および診断キットは優れた診断結果を示す。 下記実施例は、本発明の範囲を制限するものでなく、本発明を詳細に説明する ためのものであり、実施例に使用された実験方法は、別に言及しない限り下記の 参照実施例による。 なお、別に記載しない限り、固体混合物中固体、液体中液体および液体中固体 について下記に示した％はそれぞれｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌおよびｗｔ／ｖ ｏｌの 基準である。 参照例１：制限エンドヌクレアーゼを使用したＤＮＡの切断 滅菌された１．５mlエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に制限エンドヌ クレアーゼと反応緩衝溶液を５０乃至１００μｌの反応容量になるように入れ３ ７℃で１乃至２時間反応させた。反応が完了した後、制限エンドヌクレアーゼを 不活性化するために反応混合物を６５℃で１５分間熱処理した（または耐熱性エ ンドヌクレアーゼの場合はフェノールで抽出しエタノールで沈澱させた）。 本参照実施例で使用された制限酵素および反応緩衝溶液はＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｊｏｌｌａ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入し た。 制限エンドヌクレアーゼの反応のための１０倍（１０×）反応緩衝溶液の組成 は次のようである： １０倍 ＮＥＢ反応緩衝溶液１：１００ｍＭビストリスプロパン−ＨＣｌ、１ ００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ），ｐＨ７．０ １０倍 ＮＥＢ反応緩衝溶液２：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０ １０倍 ＮＥＢ反応緩衝溶液３：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０ １０倍 ＮＥＢ反応緩衝溶液４：２００ｍＭトリス−酢酸塩、１００ｍＭ 酢 酸マグネシウム、５００ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０参照 例２：フェノール抽出およびエタノール沈澱 ＤＮＡと酵素との反応が完了した後、反応混合物中の酵素を不活性化させるか ＤＮＡを回収するために反応混合物をフェノールで抽出するが、この抽出には１ ０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液であ らかじめ平衡されたフェノールを使用した。 フェノールによる抽出は、同容量の試料とフェノールを強く振って混合し、１ ５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、水性層を新しい試験管に移すことに よって行った。上記工程を３回繰返した。 次に、水性層を同容量のクロロホルム（クロロホルム：イソブタノール＝２４ ：１）で抽出し、水性層をさらに分離した後；ここに０．１容量の３Ｍ酢酸ナト リウムおよび２．５容量の無水エタノールを加え；この混合物を−７０℃で３０ 分間または−２０℃で１２時間以上静 置した後、１５，０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間遠心分離して核酸を回収し た。 参照例３：連結反応（Ligation reaction） ＮＥＢから購入したＴ４ ＤＮＡリガーゼおよび１０倍連結反応溶液（０．５ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂、０．２Ｍ ＤＴＴ、１ ０ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍｇ／ml牛血清アルブミン（ＢＳＡ））を使用してＤＮ Ａの連結反応を行った。反応容量は通常的に２０μｌであり、ＤＮＡの粘着末端 （ｃｏｈｅｓｉｖe ｅｎｄｓ）の連結のためには１０単位、平滑末端を有する ＤＮＡの連結のためには１００単位のＴ４リガーゼを使用した。 前記反応は１６℃で５時間行うか４℃で１４時間以上行い；反応が終了した後 、反応混合物を６５℃で１５分間加熱してＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化させた 。 参照例４：大腸菌の形質転換 大腸菌菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）、Ｅ ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）またはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０５（ＡＴＣＣ ４７０１６））の形質転換は当該分野で公知の方法、例えば 、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））、またはコヘン（Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２ ））による方法を使用して行うことができる。 参照例５：オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは自動化された固相ホスホアミダイト法（ｓｏｌｉｄ ｐ ｈａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いてＤＮ Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ｍｏｄｅｌ Ｎ ｏ．３８０Ｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で合成した。 合成されたオリゴヌクレオチドを変性ポリアクリルアミドゲル（２Ｍ尿素、１ ２％アクリルアミドおよびビス（２９：１）、５０ｍＭトリス、５０ｍＭホウ酸 、１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ₂）、電気泳動、およびアセトニトリル：水（５０： ５０）を溶出剤として使用するＣ₁₈ ＳＥＰ−ＰＡＫ（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ． ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）カラムクロマトグラフィーによって精製し、その量は２６０ｎ ｍにおけるＯ．Ｄ．を測定することによって決定した。 参照例６：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） １０乃至１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１０μｌの１０倍Ｔａｑポリメラーゼ反応 緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１０μｌのｄＮＴＰの混合溶液 （各々１０ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２μｇの各々 のプライマー（一般的に、二つのプライマーが反応に使用され、三つのプライマ ーが使用された場合、中間に位置したプライマーは０．０２μｇの量で使用した ）および０．５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）の混合物に蒸留水を加え総容量を１０ ０μｌにし；反応混合物の蒸発を防止するためにここに５０μｌの鉱油を添加し た。 ＰＣＲは温度サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて行い、温度サイクルは９５℃ で１分→５５℃で１分→７２℃で２分間のサイクルを２５回以上繰返し、最終的 に７２℃で１０分間反応させるようにプログラムされた。 反応が終了した後、混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させるこ とによってＰＣＲ産物を回収し、 沈澱物を２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ Ａ、ｐＨ７．５）に溶かした。 参照例７：ＨＲＰ−結合された抗ヒトＩｇＧ抗体の産生 ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．， Ａｒｉｚｏｎａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＨＦ−１００１）を、ヒトＩ ｇＧ−付着されたセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムおよびプロテイ ン（ｐｒｏｔｅｉｎ）−Ｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ ）を用いるクロマトグラフィーによって精製して９０％以上の純度を有する抗体 を得た。収得した抗体を過ヨウ素酸ナトリウム法（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄ ａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎａｋａｎｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅ ｍｃｙｔｏｃｈｅｍ ，２２，１０８４（１９７４））によって西洋ワサビペルオ キシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を用いて次のよ うに標識した： ５mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ．，Ｎｏ．８１４．３９３）を１．２mlの蒸留水に 溶かした溶液に、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて調製 した０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液０． ３mlを添加し、混合物を室温で２０分間反応を行った。得た溶液を１ｍＭ酢酸ナ トリウム緩衝液に対して１６時間透析した。 このペルオキシダーゼ溶液１．５mlを、精製抗体が１０mg／mlの濃度で溶解さ れている２０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．５）１mlと混合し、混合物を室 温で２時間反応させた。その後、ここにホウ水素化ナトリウム蒸留水溶液（４mg ／ml）１００μｌを添加して還元反応によって未反応シッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ ′ｓ ｂａｓｅ）を除去した。この溶液をリン酸緩衝生理食塩水に対して一晩の 間透析した後、セファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２００カラムを通過さ せ未反応抗体またはペルオキシダーゼを除去した。 実施例１：非構造３蛋白のエピトープの決定 〈段階１〉ＫＨＣＶ ８９７ ＤＮＡの部分断片の増幅（１−１）プライマーの 作製 非構造３蛋白をコードするＫＨＣＶ ８９７ ＤＮＡの部分断片を増幅させ、 それぞれを、ｔｒｐプロモーターの調節下にユビキチン遺伝子を含有する発現ベ クターにクローニングするために、下記プライマーを合成した： プライマーＰ８９７Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の３９１６番目乃至３９３６ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰ５１８Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４１９５番目乃至４２１６ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰ３６５Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４３４８番目乃至４３６９ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰ２５７Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４４４７番目乃至４４６８ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰ１５０Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４５６４番目乃至４５８５ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰ８９７ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４７１２番目ヌクレオチドの後 で翻訳を終了させる終了コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）およびＳａｌＩの認識 部位を含む）； プライマーＰ６５２ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４５６２番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＳａｌＩの認識部位を含む）； プライマーＰ５７０ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４４８７番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＳａｌＩの認識部位を含む）； プライマーＰ４３０ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４３４６番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＳａｌＩの認識部位を含む）；および プライマーＰ２９０ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４２０８番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＳａｌＩの認識部位を含む）。 （１−２）ポリマラーゼ連鎖反応 ８個の異なる試験管を用意して次のようなプライマーを加えた。 試験管Ａ：プライマーＰ８９７Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ６５２ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｂ：プライマーＰ８９７Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ５７０ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｃ：プライマーＰ８９７Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ４３０ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｄ：プライマーＰ８９７Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ２９０ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｅ：プライマーＰ１５０Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ８９７ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｆ：プライマーＰ２５７Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ８９７ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｇ：プライマーＰ３６５Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ８９７ＳＡＬ ２ μｇ 試験管Ｈ：プライマーＰ５１８Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰ８９７ＳＡＬ ２ μｇ それぞれの試験管にＫＨＣＶ ８９７ ＤＮＡを含有する５０ｎｇのプラスミ ドｐｔｒｐ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７（ＡＴＣＣ ６８６４０）、１０μｌの１０ 倍ポリ メラーゼ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄ ＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラー ゼを入れ、蒸留水を加え総容量を１００μｌに調節した。 蒸発を防止するために各反応混合物に鉱油５０μｌを添加し；参照例６のよう な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動さ せた。その結果、試験管Ａに約６５０ｂｐのＤＮＡが、試験管Ｂに約５８０ｂｐ のＤＮＡが、試験管Ｃに約４４０ｂｐのＤＮＡが、試験管Ｄに約３００ｂｐのＤ ＮＡが、試験管Ｅに約１６０ｂｐのＤＮＡが、試験管Ｆに約２６０ｂｐのＤＮＡ が、試験管Ｇに約３７０ｂｐのＤＮＡが、試験管Ｈに約５２０ｂｐのＤＮＡがそ れぞれ増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前記のようなポリアクリルアミドゲ ル電気泳動で精製し、それぞれ断片６５２、断片５７０、断片４３０、断片２９ ０、断片１５０、断片２５７、断片３６５および断片５１８と命名した。ＫＨＣ Ｖ ８９７ ＤＮＡにおいての各断片の位置およびそれらの製造のために使用さ れたプライマーが図４に示されている。 〈段階２〉発現ベクターの作製 （２−１）制限エンドヌクレアーゼを用いた断片およびベクターＤＮＡの切断 〈段階１〉で得たそれぞれのＤＮＡ断片２μｇを参照例１のようにＮＥＢ緩衝 液３中ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩで完全切断した。生成された断片をそれぞれ断 片６５２−Ｔ２／Ｌ、５７０−Ｔ２／Ｌ、４３０−Ｔ２／Ｌ、２９０−Ｔ２／Ｌ 、１５０−Ｔ２／Ｌ、２５７−Ｔ２／Ｌ、３６５−Ｔ２／Ｌ、および５１８−Ｔ ２／Ｌと命名した。 一方、２μｇのプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４（ＡＴＣＣ ６８ ６４２；大韓民国特許公開第９３−６８３号参照）も又、ＮＥＢ緩衝液３中Ｓａ ｃＩＩおよびＳａｌＩで完全切断した。生成混合物を７％アガロースゲルで電気 泳動させ２．７ｋｂ断片を分離し、これをｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌと命名し た。 前記断片を下記のように連結反応に使用した： 連結反応試験管Ａに１００ｎｇの断片６５２−Ｔ２／Ｌを入れ； 連結反応試験管Ｂに１００ｎｇの断片５７０−Ｔ２／Ｌを入れ； 連結反応試験管Ｃに１００ｎｇの断片４３０−Ｔ２／Ｌ を入れ； 連結反応試験管Ｄに１００ｎｇの断片２９０−Ｔ２／Ｌを入れ； 連結反応試験管Ｅに１００ｎｇの断片１５０−Ｔ２／Ｌを入れ； 連結反応試験管Ｆに１００ｎｇの断片２５７−Ｔ２／Ｌを入れ； 連結反応試験管Ｇに１００ｎｇの断片３６５−Ｔ２／Ｌを入れ； 及び連結反応試験管Ｈに１００ｎｇの断片５１８−Ｔ２／Ｌをそれぞれ入れた。 それぞれの試験管に５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μｌの１０ 倍連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを入れ、蒸留水を加え総 容量を２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で１２時間実施した。 それぞれの連結反応混合物で大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）細胞を形質転換させ、それから参照例４によって目的組換え発現ベ クターを単離した。 断片６５２を含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ６５ ２と命名し、断片５７０を含有するベクターを里離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨ ＣＶ ５７０と命名し、断片４３０を含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ− ＫＨＣＶ ４３０と命名し、断片２９０を含有するベクターを単離してｐｔｒｐ Ｈ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ２９０と命名し、断片１５０を含有するベクターを単離し てｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ １５０と命名し、断片２５７を含有するベクタ ーを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ２５７と命名し、断片３６５を含有 するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ３６５と命名し、及び断 片５１８を含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ５１８と 命名した（図５参照）。 〈段階３〉ＫＨＣＶ ８９７ ＤＮＡ 部分断片の発現 〈段階２〉で得た各ベクターで大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を形質転換させた。 形質転換された大腸菌細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する液状 ルリア（Ｌｕｒｉａ）培地（６％バクトートリプトン、０．５％酵母抽出物、１ ％ＮａＣｌ）中３７℃で１２時間振盪培養した。３ｍｌの培養液を３００ｍｌの Ｍ９培地（４０ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、２２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、８．５ｍＭ ＮａＣ ｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ、１％グルコース、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０． １ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．４％カザミノ酸、１ ０μｇ／ｍｌ Ｖｉｔ．Ｂ₁、４０μｇ／ｍｌアンピシリン）に移して３７℃で ４時間振盪培養した。６５０ｎｍで培養液のＯ．Ｄ．が０．３に至ると、インド ールアクリル酸（ＩＡＡ）を培養液に加え最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよう に調節した。５時間後、生成培養液を１１，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し て大腸菌細胞沈降物（precipitates）を収集した。 〈段階４〉ＫＨＣＶ ８９７蛋白のエピトープの確認 前記〈段階３〉で得た各細胞沈降物をレムリの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｍ ｅｔｈｏｄ）（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））によって１５％Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥさせ、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ ｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）Ｒ２５０で染色して組換え蛋白の発現を確 認した。その結果は図６Ａに示されている。 図６Ａで、Ｍ列は標準分子量の大きさのマーカー（ｍａｒｋｅｒ）を示し；第 １列はいかなるＫＨＣＶ ＤＮＡ断片も持たないプラスミドを有する大腸菌の産 物を示し；第２列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ８９７で形質転換された大腸 菌の産物を示し；第３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ２９０で形質転換され た大腸菌の産物を示し；第４列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ４３ ０で形質転換された大腸菌の産物を示し；第５列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ５７０で形質転換された大腸菌の産物を示し；第６列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｋ ＨＣＶ ６５２で形質転換された大腸菌の産物を示し；第７列はｐｔｒｐＨ−Ｕ Ｂ−ＫＨＣＶ ５１８で形質転換された大腸菌の産物を示し；第８列はｐｔｒｐ Ｈ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ３６５で形質転換された大腸菌の産物を示し；第９列はｐ ｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ ２５７で形質転換された大腸菌の産物を示し；第１ ０列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ １５０で形質転換された大腸菌の産物を示 す。 ゲル上で分離された蛋白をトウビンの方法（Ｔｏｗｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６、４７５０（１９７９））を用 いてニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，孔の大きさ（ｐ ｏｒｅ ｓｉｚｅ）０．２２μｍ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の上にブロッティング する。フィルターを０．５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢＳ（１０ｍ Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に入れ室温で２時間軽く振盪 して、蛋白に対するＩｇＧの非特異的結合を遮断した。０．５％ゼラチンと０． ０５％ツイーン２０とを含有したＰＢＳで、韓国型ＨＣ Ｖ患者らから精製されたＩｇＧを最終濃度１６μｇ／ｍｌになるように希釈させ 製造されたＩｇＧ溶液に、フィルターを入れ、室温で１時間軽く振盪して蛋白と ＩｇＧとを反応させた。フィルターを０．２％ツイーン２０含有ＰＢＳで各５分 づつ４回洗浄した。このフィルターを、０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン ２０とを含有する５００倍容量のＰＢＳを用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識された山羊抗−ヒトＩ ｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＨＲＰ，Ｂｉｏ−ＲａｄＬａ ｂ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を希釈させ製造した抗−ヒトＩｇＧ抗体溶液に入れ、 室温で１時間振盪した。フィルターを、０．２％ツイーン２０含有ＰＢＳで各５ 分づつ４回洗浄した後、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。 このフィルターに４００μｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフトールと０．０３％ 過酸化水素とを含有する５０ｍＭトリス緩衝液を加え発色反応を起す。このウェ スタンブロッティングの結果が図６Ｂに示されている。図６Ｂで、Ｍ列および第 １列乃至１０列は図６Ａと同一な試料を示し：第５乃至１０列は陽性結果を、第 ３列および４列は陰性結果を示す。 したがって、図６Ａおよび図６Ｂで分かるように、Ｋ ＨＣＶ ８９７蛋白のエピトープはＫＨＣＶ ８９７蛋白のカルボキシ末端領域 （ＫＨＣＶ ３６５蛋白）に存在し、即ち、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４３４８番目 乃至４７１３番目のヌクレオチドからなる３６６塩基対によってコードされる。 しかしながら、前記ＫＨＣＶ ３６５蛋白はＫＨＣＶ ８９７蛋白に比べ低い免 疫反応性を示す。このような事実から、ＫＨＣＶ ３６５蛋白のＮ−末端にある アミノ酸は、それらがＮ−末端アミノ酸として発現する際、エピトープとして作 用できないということが推定できる。それ故に、前記ＫＨＣＶ ３６５蛋白と延 長された（ｅｘｔｅｎｃｔｅｄ）Ｎ−末端アミノ酸とを含み、ＫＨＣＶ ８９７ 蛋白に匹敵する免疫反応性を有するＫＨＣＶ ５１８蛋白を以下ＨＣＶ診断試薬 の製造のために使用した。 実施例２：ＨＣＶエンベロープ蛋白のエピトープの決定 〈段階１〉ＨＣＶエンベロープ遺伝子の部分断片の増幅 （１−１）プライマーの作製 ＫＨＣＶエンベロープ遺伝子断片を増幅させ、それぞれをｔｒｐプロモーター の調節下にユビキチン遺伝子を含む発現ベクター内にクローニングするために、 下記プライマーを合成した： プライマーＰＥ１Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の９１６番目乃至９３７番目 のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ１ＤＴ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１１２９番目乃至１１４９ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ１ＥＧＴ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１２０１番目乃至１２２１ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ１ＦＴ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１３２７番目乃至１３４７ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ１ＡＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１１２８番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ１ＢＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１２００番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ１ＣＤＥＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１３２６番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ１ＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２８３５番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ２Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１５０９番目乃至１５２９ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ２ＢＴ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１７４９番目乃至１７６９ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ２ＤＦＴ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２０１０番目乃至２０３０ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ２ＥＴ２： （ＳａｃＩＩの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２２８０番目乃至２３００ 番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ２ＡＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１７４８番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ２ＢＣＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２００９番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ２ＤＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２２７９番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）； プライマーＰＥ２ＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２５２８番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 １４個の異なる試験管を用意して次のようにプライマーを加えた： 試験管Ａ：プライマーＰＥ１Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＸＨＯ ２μｇ 試験管Ｂ：プライマーＰＥ１Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＡＸＨＯ ２μ ｇ 試験管Ｃ：プライマーＰＥ１Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＢＸＨＯ ２μ ｇ 試験管Ｄ：プライマーＰＥ１Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＣＤＥＸＨＯ ２μｇ 試験管Ｅ：プライマーＰＥ１ＤＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＣＤＥＸＨＯ ２μｇ 試験管Ｆ：プライマーＰＥ１ＥＧＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＣＤＥＸＨ Ｏ ２μｇ 試験管Ｇ：プライマーＰＥ１ＦＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＸＨＯ ２μ ｇ 試験管Ｈ：プライマーＰＥ１ＥＧＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ１ＸＨＯ ２ μｇ 試験管Ｉ：プライマーＰＥ２Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰＥ２ＡＸＨＯ ２μ ｇ 試験管Ｊ：プライマーＰＥ２ＢＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ２ＢＣＸＨＯ ２μｇ 試験管Ｋ：プライマーＰＥ２Ｔ２ ２μｇ、プライマーＰＥ２ＢＣＸＨＯ ２ μｇ 試験管Ｌ：プライマーＰＥ２ＤＦＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ２ＤＸＨＯ ２μｇ 試験管ＭニプライマーＰＥ２ＥＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ２ＸＨＯ ２μ ｇ 試験管Ｎ：プライマーＰＥ２ＤＦＴ２ ２μｇ、プライマーＰＥ２ＸＨＯ ２ μｇ 各試験管に、鋳型として、試験管Ａ乃至Ｈにはエンベロープ１遺伝子を含むベ クターｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１（ＡＴＣＣ ６８８７８）、そして試験管Ｉ乃至 Ｎにはエンベロープ２遺伝子を含むベクターｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｎ およびｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｃ（ＡＴＣＣ ６９８８６および７４１ １７）をそれぞれ５０ｎｇづつ入れ、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１ ０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴ Ｐ，２ｍＭ ｄＡＴＰ，２ｍＭ ＴＴＰ，２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５μｌの１ ０単位Ｔａｑポリメラーゼを入れた後、蒸留水を加え総容量を１００μｌに調節 した。 各反応混合物へ蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を添加し、参照例６のよ うな温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、試験管Ａに約６００ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｂに約２２０ｂｐのＤ ＮＡ、試験管Ｃに約３００ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｄに約４１０ｂｐのＤＮＡ、試 験管Ｅに約２００ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｆに約１１０ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｇに 約１９０ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｈに約３００ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｉに約２１０ ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｊに約３００ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｋに約５０５ｂｐのＤ ＮＡ、試験管Ｌに約２９０ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｍに約２４０ｂｐのＤＮＡ、及 び試験管Ｎに約５２０ｂｐのＤＮＡがそれぞれ増幅されたことを確認した。ＤＮ Ａを前記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、それぞれ断 片（ｓｅｇｍｅｎｔ）Ｅ１、断片Ｅ１Ａ、断片Ｅ１Ｂ、断片Ｅ１Ｃ，断片Ｅ１Ｄ 、断片Ｅ１Ｅ、断片Ｅ１Ｆ、断片 Ｅ１Ｇ，断片Ｅ２Ａ、断片Ｅ２Ｂ、断片Ｅ２Ｃ，断片Ｅ２Ｄ、断片Ｅ２Ｅおよび 断片Ｅ２Ｆと命名した。エンベロープ遺伝子の各断片の位置およびその製造に使 用されたプライマーが図７に示されている。 〈段階２〉発現ベクターの作製 〈段階１〉の（１−３）で得た２μｇの各ＤＮＡ断片を参照例１のようにＮＥ Ｂ緩衝液３中ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで完全切断した。 １４本の連結反応試験管それぞれに前記で得た１００ｎｇのＤＮＡ断片を入れ た。各試験管に実施例１の〈段階２〉で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ− Ｔ２／Ｌ、２μｌの１０倍連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを入 れ、蒸留水を加え総容量を２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で１２時間実 施した。 １４個の大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞分画を各連結反応混 合物でそれぞれ形質転換させた。 断片Ｅ１を含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１と命名し；断 片Ｅ１Ａを含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ａと命名し；断 片Ｅ１Ｂを含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｂと命名し；断 片Ｅ１Ｃを含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｃと命名し；断 片Ｅ１Ｄを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｄと命名し；断片Ｅ１Ｅを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅと命名し；断片Ｅ１Ｆを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｆと命名し；断片Ｅ１Ｇを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｇと命名し；断片Ｅ２Ａを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ａと命名し；断片Ｅ２Ｂを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｂと命名し；断片Ｅ２Ｃを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｃと命名し；断片Ｅ２Ｄを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｄと命名し；断片Ｅ２Ｅを含 有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｅと命名し；及び断片Ｅ２Ｆ を含有するベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｆと命名した（図８参照 ）。 〈段階３〉エンベロープ遺伝子断片の発現 前記〈段階２〉で作製されたエンベロープ遺伝子断片を含む各プラスミドで形 質転換された大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞を、実施例１の〈 段階３〉のような方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した 。 〈段階４〉エンベロープ蛋白のエピトープの同定 エンベロープ蛋白のエピトープは実施例１の〈段階４〉のような方法で〈段階 ３〉の細胞沈降物を使用することによって同定し、その結果は図９に示されてお り、図でＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂはウェスタンブロッティングの 結果である。 図９で、第１列はいかなるエンベロープ遺伝子断片も持たないプラスミドを有 した大腸菌の産物を示し；第２列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１で形質転換された大 腸菌の産物を示し；第３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ａで形質転換された大腸菌 の産物を示し；第４列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｂで形質転換された大腸菌の産 物を示し；第５列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｃで形質転換された大腸菌の産物を 示し；第６列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｄで形質転換された大腸菌の産物を示し ；第７列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅで形質転換された大腸菌の産物を示し；第 ８列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｆで形質転換された大腸菌の産物を示し；第９列 はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｇで形質転換された大腸菌の産物を示し；第１０列は ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ａで形質転換された大腸菌の産物を示し；第１１列はｐ ｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｂで形質転換された大腸菌の産物を示し；第１２列はｐｔ ｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｃで形質転換された大腸菌の産物を示し；第 １３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｄで形質転換された大腸菌の産物を示し；第１ ４列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｅで形質転換された大腸菌の産物を示し；及び第 １５列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｆで形質転換された大腸菌の産物を示す。 多様なエンベロープ遺伝子断片を含有するプラスミドで形質転換された大腸菌 細胞を用いて、韓国型Ｃ型肝炎患者の血清から得た抗−ＫＨＣＶ抗体に対するそ れらの特異性を確認したウェスタンブロッティングの結果が下記表Ｉおよび図９ Ｂに示されている。 表Ｉおよび図９Ｂで分かるように、エンベロープ遺伝子断片Ｅ１Ｇ，Ｅ２Ａお よびＥ２Ｅをそれぞれ含有するプラスミドで形質転換された大腸菌の産物を示す 第９列、１０列および１４列は陽性シグナルを示すが、エンベロ ープ遺伝子断片Ｅ１Ａ，Ｅ１Ｂ，Ｅ２Ｂ，Ｅ２Ｄ等を含有するプラスミドで形質 転換された大腸菌の産物を示すその他の列は陰性シグナルを示す。 それ故に、エンベロープ蛋白のエピトープは、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１２０１ 番目乃至１５０９番目のヌクレオチドに該当する３０９塩基対から発現されたＫ ＨＣＶエンベロープ１蛋白のカルボキシ末端領域（Ｅ１Ｇ蛋白）；ＫＨＣＶ−Ｌ ＢＣ１の１５１０番目乃至１７４９番目のヌクレオチドに該当する２４０塩基対 から発現されたＫＨＣＶエンベロープ２蛋白のアミノ末端領域（Ｅ２Ａ蛋白）； およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２２８１番目乃至２５２９番目のヌクレオチドに該 当する２４９塩基対から発現されたＫＨＣＶエンベロープ２蛋白のカルボキシ末 端領域（Ｅ２Ｅ蛋白）に存在することが明らかになった（Ｅ１Ｇ、Ｅ２Ａおよび Ｅ２Ｅ蛋白のアミノ酸およびヌクレオチド配列については図２参照）。 下記実施例３乃至５は一種より多くのＨＣＶエピトープを含有する組換え蛋白 の産生を示す。 実施例３：ＫＨＣＶ ＵＢ ＣＯＲＥ５１８蛋白の産生 〈段階１〉ＫＨＣＶ ５１８ ＤＮＡの増幅 （１−１）プライマーの作製 ＫＨＣＶ ５１８ ＤＮＡ（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４ １９６番目乃至４７１３番目のヌクレオチドの領域からなる）を増幅させ、これ をｔｒｐプロモーターの調節下にユビキチン遺伝子とＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ６８６４２；韓国特許公告第９３−６８３号参照）とを含有 する発現ベクター内へクローニングするために、下記プライマーを合成した。 プライマーＰＫ５１８Ｔ２： （ＳａｃＩＩの認識部位、６個のグリシンコドンおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４ １９５番目乃至４２１５番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＫ５１８ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４７１３番目のヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終 了コドンおよびＳａｌＩの認識部位を含む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＫ５１８Ｔ２および２μｇのプライマーＰＫ５ １８ＳＡＬを入れた。該試験管に５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴ ＣＣ７５００８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、 １０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ，２ｍＭ ｄＡＴＰ，２ｍＭ ＴＴＰ，２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを入れ、蒸留水 を加えて総容量を１００μｌに調節した。 反応混合物に、蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を入れ、参照例６のよう な温度サイクルを２５回繰り返しことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約５２０ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前 記（１−２）と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し断片ＧＬ ＹＫ５１８と命名した。 〈段階２〉発現ベクターの作製 ２μｇのプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４（ＡＴＣＣ ６８６４２ ；大韓民国特許公開第９３−６８３号）を参照例１のようにＮＥＢ緩衝液３中Ｓ ａＩＩで完全切断した後、同一条件下でＳａｃＩＩで部分的に切断した。生成混 合物を７％アガロースゲルで電気泳動して３．０ｋｂ断片を単離し、これを断片 ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ（Ｔ２）／Ｌと命名した。 〈段階１〉の（１−３）で得た２μｇの断片ＧＬＹＫ ５１８を参照例１のようにＮＥＢ緩衝液３中ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩで完全切 断した。 反応試験管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れた。ここに５０ｎｇのｐ ｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ（Ｔ２）／Ｌ、２μｌの１０倍連結反応緩衝液、１０ 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水を加え総容量を２０μｌに調節した 。連結反応は１６℃で１２時間実施した。 連結反応混合物で大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を形質転換させ て、一つのオープンリーディングフレイムにユビキチン遺伝子およびＫＨＣＶ ＣＯＲＥ １４ ＤＮＡと連結された断片ＧＬＹＫ５１８（図１０参照）を含有 するプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ５１８を含む組換え大腸菌形質転換 体を得た（“ＣＯＲＥ ５１８ ＤＮＡ”）。 〈段階３〉ＣＯＲＥ５１８ ＤＮＡの発現 前記〈段階２〉で作製されたプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ５１８で 形質転換された大腸菌Ｗ３１１０細胞を実施例１の〈段階３〉のような方法で培 養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。 発現されたＣＯＲＥ５１８蛋白とＣ型肝炎患者から抽出された血清との反応性 は実施例１の〈段階４〉のよう な方法で前記細胞沈降物を使用することによって確認し、その結果は図１１に示 されてあり、図でＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂはウェスタンブロッテ ィングの結果である。 図１１で、第１列および４列はプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ５１８ を有しない大腸菌の産物を示し；第２列および５列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲ Ｅ５１８で形質転換された大腸菌の産物を示し；第３列は標準分子大きさマーカ ー（ｍａｒｋｅｒ）、即ち、ゲルの上から７０、４３、２９、１８および１４キ ロダルトンを示す。 〈段階４〉ＵＢＣＯＲＥ５１８蛋白の精製 （４−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 〈段階３〉で得た３ｇの大腸菌細胞沈降物を４０ｍｌの緩衝液１（２０ｍＭト リス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、 １ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（phenyl methyl sulfonyl fluorid e）、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ）に懸濁させた。リゾチーム（lysozyme）を 最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌになるように懸濁液に加え、生成溶液を氷の上で３０ 分間恒温処理した。産物を超音波粉砕機（ＨＥＡＴ ＳＹＳＴＥＭＳ ＵＬＴＲ ＡＳＯＮＩＣＳ， ＮＣ．， Ｗ２２５，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して８０％の出力および５０％の効率（ｄｕｔ ｙ−ｃｙｃｌｅ）で氷浴で約１５分間超音波処理して、細胞を破鎖し大腸菌細胞 の均質物（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を得た。 前記で得た細胞均質物を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１，Ｒｏｔｏ ｒ ＪＡ ２０）で１５，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して溶解された蛋白 を除去し不溶性沈降物を得た。 （４−２）不溶性沈降物の洗浄 （４−１）で得た沈降物を１％トリトンＸ−１００を含有する４ｍｌの緩衝液 ２（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプ トエタノール）に懸濁させた。懸濁液を室温で３０分間攪拌した後、遠心分離機 （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１，Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）で１５，０００ｒｐ ｍで２５分間遠心分離して溶解された蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （４−３）不溶性沈降物の溶解 （４−２）の不溶性沈降物を４Ｍ尿素を含有する１００ｍｌの緩衝液３（５０ｍ Ｍトリス、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノー ル）に懸濁させた。懸濁液を室温で２時間攪拌し、遠心分離し て不溶性沈降物を除去し上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を得た。 （４−４）ＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー （４−３）で得た上澄液を、前記緩衝液３で平衡化されたＤＥＡＥ−セファロ ースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１．２５cm×４cm）に４ｍｌ／分の流速で通 過させ、同一緩衝液を加えカラム内に残っている遊離蛋白を溶出させた。次に、 ０乃至０．３Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を有する２００ｍｌの緩衝液３を４ｍｌ／ 分の流速で加えて結合された蛋白を溶出させ、溶出物を２ｍｌ分画として収集し た。蛋白分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＵＢＣＯＲＥ５１８蛋白を含有 する分画を収集した。 （４−５）ＦＰＬＣ−ＭＯＮＯ Ｓクロマトグラフィー （４−４）で収集されたＵＢＣＯＲＥ５１８蛋白を含有する蛋白分画をＹＭ１ ０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で２０ｍｌの容量に濃縮した。濃 縮物を、４Ｍ尿素を含有する緩衝液４（５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化されたＧ−２５カ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２．５cm×９０cm）に通過させた。溶出物をさらに 、同一緩衝液で平衡化されたＦＰＬＣ−ＭｏＮ ｏ Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＨＲ ５／５，０．５cm×５cm）に０．７ ｍｌ／分の流速で通過させ、同一緩衝液を加えカラム内に残っている遊離蛋白を 溶出させた。次に、０．２ＭのＮａＣｌを含む同一緩衝液を加えて結合された蛋 白を溶出させた。０．２乃至０．４ＭＮａＣｌの線形（ｌｉｎｅａｒ）濃度勾配 を有した２００ｍｌの緩衝液５（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０）を加えて、結 合された蛋白を溶出させ溶出物を０．７ｍｌづつの分画として収集した。蛋白分 画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％以上の純度を有するＵＢＣＯＲＥ５ １８蛋白を含有する分画を収集し、精製された蛋白の抗原的特異性をウェスタン ブロッティング分析を用いて確認した。 実施例４．ＫＨＣＶ ＵＢ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の産生 〈段階１〉ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ ＤＮＡ用発現ベクター （１−１）プライマーの作製 ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ ＤＮＡ（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５４２２番目乃至５５４ ７番目のヌクレオチドの領域からなる）を作製し、これをｔｒｐプロモータの調 節下でユビキチンを含む発現ベクターにクローニングするために、次のようなプ ライマーを合成した： プライマーＰＮＳ４ＥＴ２： （ＳａｃII認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５４２２番目乃至５４４２番目 のヌクレオチドを含む）；および プライマーＰＮＳ４ＥＳＡＬ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５５４７番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＳａｌＩ認識部位を含む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーＰＮＳ４ＥＴ２ ２μｇおよびプライマーＰＮＳ４ＥＳＡ Ｌ ２μｇを入れた。試験管に５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴＣ Ｃ ７５００８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝溶液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留水を加えて総容量を １００μｌに調節した。 蒸発を防止するために反応混合物に鉱油５０μｌを入れ、参照例６と同様な温 度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動さ せた。その結果、約１３０ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを 前記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片ＮＳ４Ｅと 命名した。 〈段階２〉発現ベクターの作製 前記（１−３）で得た断片ＮＳ４Ｅ ２μｇを参照例１のようにＮＥＢ緩衝溶 液３中でＳａｃＩＩおよびＳａｌＩを用いて完全に切断した。 連結反応試験管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れた。試験管に実施例 １の〈段階２〉で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μｌの１ ０倍連結反応緩衝溶液、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを入れて、蒸留水を加え 総容量を２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で１２時間実施した。 連結反応混合物で大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を形質転換させ て断片ＮＳ４Ｅを含有するプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅを含む組換え 大腸菌細胞を得た（図１２）。 〈段階３〉ＫＨＣＶ Ｅ１Ｅ２蛋白の産生 （３−１）プライマーの作製 ＨＣＶエンベロープ蛋白のエピトープを含有するＫＨ ＣＶ Ｅ１Ｅ２遺伝子を増幅し、これをｔｒｐプロモーターの調節下でユビキチ ン遺伝子を含む発現ベクターにクローニングするために、下記プライマーを合成 した： プライマーＰＥ２ＥＴ２： （ＳａｃII認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２２８１番目乃至２２９８番目 のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ２ＥＧＥ１Ｇ： （Ｅ２Ｅ ＤＮＡの３′−末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２５０９番目乃至２ ５２９番目のヌクレオチド領域、およびＥ１Ｇ遺伝子の５′−末端領域のＫＨＣ Ｖ−ＬＢＣ１の１２０１番目乃至１２２１番目のヌクレオチド領域を含む）；お よび プライマーＰＥ２ＡＸＨＯ； （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１７４９番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩ認識部位を含む）。 （３−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーＰＥ２ＥＧＥ１Ｇ ２μｇおよびプライマーＰＥ２ＡＸＨ Ｏ ２μｇを入れた。この試験 管に、鋳型として、５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７５０ ０８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（ ２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、 ２．５単位のＴａｑポリメラーゼを入れ、ここに蒸留水を加え総容量を１００μ ｌに調節した。 反応混合物に、蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を加え、参照例６のよう な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （３−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（３−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約５５０ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前 記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片ＧＥ１ＧＥ２ Ａと命名した。 （３−４）第２ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーＰＥ２ＥＴ２ ２μｇおよびプライマーＰＥ２ＡＸＨＯ ２μｇを入れた。この試験管に、鋳型として、５０ｎｇのプラスミドｐＹＬＢＣ −Ａ／Ｇ−ＵＢＥ２Ｃ（ＡＴＣＣ ７４１１７、韓国特許出願公開第９３−６８ ３号参照）および５０ｎｇの断片ＧＥ１ＧＥ２Ａ、１０μｌの１０倍ポリメラー ゼ緩衝液、１０ μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ 、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを入れ、ここに蒸留水 を加え総容量を１００μｌに調節した。 反応混合物の蒸発を防止するために鉱油５０μｌを添加し、参照例６でのよう な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （３−５）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（３−４）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前 記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片Ｅ１Ｅ２と命 名した。 （３−６）発現ベクターの作製 （３−５）で得たＤＮＡ断片２μｇを参照例１と同様にＮＥＢ緩衝液３中Ｓａ ｃIIおよびＸｈｏＩで完全に切断した。 試験管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れた。 ここに実施例１の〈段階２〉で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ 、２μｌの１０倍連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸 留水を加え総容量を２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で １２時間行った。 連結反応混合物で大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を形質転換させ て、断片Ｅ１Ｅ２を含有するプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅ２を含む組換 え大腸菌細胞を得た（図１３）。 （３−７）Ｅ１Ｅ２ ＤＮＡの発現 前記（３−６）で作製されたプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅ２で形質転 換された大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞を実施例１の〈段階３ 〉と同様な方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。 （３−８）発現されたＵＢＥ１Ｅ２蛋白およびそのＣ型肝炎患者の血清との反応 性確認 ＵＢＥ１Ｅ２蛋白の発現およびＣ型肝炎患者から採取した血清とのその反応性 は前記（３−７）の細胞沈降物を用いて実施例１の〈段階４〉と同様な方法で確 認し、その結果を図１４に示す。ここで、ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、 Ｂはウェスタンブロッティングの結果である。 図１４ＡおよびＢで、第１列および４列はプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１ Ｅ２を含まない大腸菌の産物を示し、第２列および５列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ １Ｅ２ で形質転換された大腸菌の産物を示し、及び第３列は標準分子大きさマーカー、 即ちゲルの上から４３、２９、１８および１４キロダルトンを示す。 〈段階４〉ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の産生 〈段階４−Ａ〉ＮＳ４Ｅ１Ｅ２遺伝子の増幅 （４−Ａ−１）プライマーの作製 ＨＣＶエンベロープ蛋白のエピトープをコードする遺伝子およびＫＨＣＶ Ｎ Ｓ４Ｅ ＤＮＡの一部を増幅させ、これをｔｒｐプロモーターの調節下にユビキ チン遺伝子を含有する発現ベクターにクローニングするために、下記プライマー を合成した。 プライマーＰＮＳ４ＥＴ２： （ＳａｃIIの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５４２２番目乃至５４４２番 目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＮＳ４ＥＧＥ２Ｃ３： （ＮＳ４Ｅ ＤＮＡの３′−末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５５３０番目乃至 ５５４７番目のヌクレオチドの領域、１個のプロリンコドン、６個のグリシンコ ドンおよびＥ２Ｅ遺伝子の５′−末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ １の２２８１番目乃至２２９８番目のヌクレオチドの領域を前記順序のように含 む）；および プライマーＰＥ２ＡＸＨＯ： （ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１７４９番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含む）。 （４−Ａ−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＮＳ４ＥＧＥ２Ｃ３および２μｇのプライマー ＰＥ２ＡＸＨＯを入れた。この試験管に、鋳型として、５０ｎｇのｐｔｒｐＨ− ＵＢ−Ｅ１Ｅ２（〈段階３〉の（３−６））、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩 衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、 蒸留水を加えて総容量を１００μｌに調節した。 蒸発を防止するために、５０μｌの鉱油を反応混合物に加え、参照例６のよう な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを行った。 （４−Ａ−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（４−Ａ−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアク リルアミドゲルで電気泳動した。その結果、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅された ことを確認した。ＤＮＡを前記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ て精製し断片ＧＥＮＶＥＰＩ−IIIと命名した。 （４−Ａ−４）第２ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＮＳ４ＥＴ２および２μｇのプライマーＰＥ２ ＡＸＨＯを入れた。この試験管に、鋳型として、前記〈段階１〉で得た５０ｎｇ のプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ、前記（４−Ａ−２）で得た５０ｎｇ の断片ＧＥＮＶＥＰＩ−III、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌ の２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、 ２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを入れ、蒸留水を加え総 容量を１００μｌに調節した。 反応混合物に蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を添加し、参照例６のよう な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを行った。 （４−Ａ−５）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（４−Ａ−４）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳 動した。その結果、約９２０ｂｐのＤＮＡが増幅したことを確認した。ＤＮＡを 前記と 同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片ＮＳ４Ｅ１Ｅ２と 命名した。 〈段階４−Ｂ〉発現ベクターの作製 〈段階４−Ａ〉の（４−Ａ−５）で得た２μｇのＤＮＡ断片を参照例１のよう にＮＥＢ緩衝液３中ＳａｃIIおよびＸｈｏＩを用いて完全に切断した。 試験管に前記で得た１００ｎｇのＤＮＡ断片を入れた。試験管に実施例１の〈 段階２〉で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μｌの１０倍連 結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水を加え総容量を ２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で１２時間行った。 上記連結反応混合物を用いて大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を形 質転換させて、断片ＮＳ４Ｅ１Ｅ２を含むプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４ Ｅ１Ｅ２を含む組換え大腸菌細胞を得た（図１５）。 〈段階４−Ｃ〉断片ＮＳ４Ｅ１Ｅ２ ＤＮＡの発現 前記〈段階４−Ｂ〉で作製したプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ１Ｅ２ を含む大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）形質転換体を実施例１の〈段 階３〉のような方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。 〈段階４−Ｄ〉発現したＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白およびＣ型肝炎患者から採取し た血清とのその反応性の確認 大腸菌内でのＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の産生およびＣ型肝炎患者から採取した 血清とその反応性は実施例１の〈段階４〉のような方法で〈段階４−Ｃ〉の細胞 沈降物を用いることによって確認し、その結果を図１６に示しており、ここでＡ はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂはウェスタンブロッティングの結果である 。 図１６ＡおよびＢで、第１列および第４列はプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｎ Ｓ４Ｅ１Ｅ２を含まない大腸菌の産物を示し、第２列および第５列はｐｔｒｐＨ −ＵＢ−ＮＳ４Ｅ１Ｅ２で形質転換した大腸菌の産物を示し、及び第３列は標準 分子大きさマーカー、即ち、ゲルの上部から９２、７０、４３、２９および１８ キロダルトンを示す。 〈段階４−Ｅ〉ＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の精製 （４−Ｅ−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 〈段階４−Ｃ〉で得た２ｇの大腸菌細胞沈降物を実施例３の〈段階４〉（４− １）のように処理して細胞を破壊し、それから不溶性沈降物を得た。 （４−Ｅ−２）不溶性沈降物の洗浄 （４−Ｅ−１）で得た沈降物を実施例３の〈段階４〉 （４−２）のように処理して溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （４−Ｅ−３）４Ｍ尿素を用いた洗浄 （４−Ｅ−２）の不溶性沈降物を４Ｍ尿素を含む３０mlの緩衝液２に懸濁させ た。この懸濁液を室温で２時間攪拌し遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１ 、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を用いて１５，０００ｒｐｍで遠心分離することに よって溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （４−Ｅ−４）６Ｍ塩化グアニジン（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ） を用いた洗浄 （４−Ｅ−３）の不溶性沈降物を、６Ｍ塩化グアニジンを含む３０mlの緩衝液 ２に懸濁させた。懸濁液を室温で２時間攪拌し遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を用いて１５，０００ｒｐｍで遠心分離す ることによって溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （４−Ｅ−５）１％ＳＤＳを用いた沈降物の溶解 （４−Ｅ−４）の不溶性沈降物を１％ＳＤＳを含有する１０mlのＰＢＳ（１０ ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁させた。懸濁液を室 温で１２時間攪拌し遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、 Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を用いて１５，０００ｒｐｍで遠心分離することによ って不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。 （４−Ｅ−６）Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィー （４−Ｅ−５）で得た１０mlの上澄液をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、 Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して４ml容量に濃縮した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を用いて１５，０００ｒｐｍで２５分 間遠心分離して、不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。上澄液を、０．１％ＳＤ Ｓを含むＰＢＳで平衡化されたＳ−３００樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ ＫＢ，２．５cm×９０cm）に４０ml／時間の流速で通過させゲル濾過クロマトグ ラフィーを行った。溶出した蛋白を２mlの分画として収集し、１５％ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥして９０％以上の純度を有するＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白を含む分画を収集 した後、精製した蛋白の抗原的特異性をウェスタンブロッティング分析法を用い て確認した。 実施例５：ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白の産生 〈段階１〉ＮＳ５−１．２ＤＮＡの増幅 （１−１）プライマーの作製 ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２ ＤＮＡ（ＫＨＣＶ ＬＢ Ｃ１の６６４９番目乃至７８２４番目のヌクレオチドの領域からなる）を増幅し 、これをｔｒｐプロモーターの調節下にユビキチン遺伝子を含む大腸菌発現ベク ターにクローニングするために、下記のプライマーを合成した。 プライマーＰＮＳ５Ｔ２： （ＳａｃIIの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の６６４９番目乃至６６６９番 目のヌクレオチドを含む）；および プライマーＰＮＳ５−１．２ＳＡＬ： （ＫＨＣＶ ＬＢＣ１の７８２４番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了 コドンおよびＳａｌＩ認識部位を含む） （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＮＳ５Ｔ２および２μｇのプライマーＰＮＳ５ −１．２ＳＡＬを入れた。この試験管に、鋳型として、５０ｎｇのＫＨＣＶ Ｌ ＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７５００８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝 液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍ Ｍ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ を加え、これに蒸留水を加えて総容量を１００μｌに調節した。 反応混合物に蒸発を防止するために、５０μｌの鉱油を加え、参照例６のよう な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約１．２ｋｂＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前記 と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し断片ＮＳ５−１．２と 命名した。 〈段階２〉発現ベクターの作製 〈段階１〉の（１−３）で得た２μｇのＤＮＡ断片を参照例１のようにＮＥＢ 緩衝液３中でＳａｃIIおよびＳａｌＩを用いて完全に切断した。 試験管に、前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れた。この試験管に実施例１ の〈段階２〉で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μｌの１０ 倍連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水を加え総容 量を２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で１２時間実施した。 上記連結反応混合物を用いて大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴ ＣＣ ３７３３９）を形質転換させて、断片ＮＳ５−１．２を含有するプラスミ ドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５−１．２を含む組換え大腸菌細胞を得た（図１７） 。 〈段階３〉断片ＮＳ５−１．２ ＤＮＡの発現 前記〈段階２〉で作製されたプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５−１．２を 用いて形質転換させた大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞を実施例 １の〈段階３〉のような方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収 集した。 〈段階４〉発現したＫＨＣＶ ＵＢＮＳ５−１．２蛋白およびそのＣ型肝炎患者 から採取した血清との反応性の確認 大腸菌内でのＵＢＮＳ５−１．２蛋白の産生およびＣ型肝炎患者から採取した 血清とその反応性は実施例１の〈段階４〉のような方法で〈段階３〉の細胞沈降 物を使用して確認し、その結果を図１８に示す。ここでＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの 結果であり、Ｂはウェスタンブロッティングの結果である。 図１８ＡおよびＢで、第１列はプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５−１．２ を含まない大腸菌の産物を示し、第２列および３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５ −１．２で形質転換された大腸菌の産物を示す。 〈段階５〉Ｃ型肝炎患者から採取された血清に対するＫＨＣＶ ＵＢＮＳ５−１ ．２蛋白とＫＨＣＶ ４０３蛋白の反応性の比較 Ｃ型肝炎患者から採取された血清とＵＢＮＳ５−１．２蛋白の反応性は実施例 １の〈段階４〉のような方法で前記〈段階３〉の細胞沈降物を使用することによ って確認し、その結果を前記のような方法で韓国特許公開第９３−１２１０７号 によってＫＨＣＶ ４０３蛋白が産生されている酵母細胞沈降物を使用すること によって確認されたＫＨＣＶ ４０３蛋白の反応性と比較した。その結果は図１ ９に示されており、図でＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂはウェスタンブ ロッティングの結果である。 図１９ＡおよびＢで、第１列はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＣＯ４−ＵＢ−ＫＨＣＶ ４０３（Ａ ＴＣＣ ７４７０９）の産物を示し；第２列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５−１． ２で形質転換された大腸菌の産物を示す。この結果からＵＢＮＳ５−１．２蛋白 がＣ型肝炎患者から採取した血清に対してＫＨＣＶ ４０３蛋白よりより強い反 応性を有することが分かる。 〈段階６〉ＵＢＮＳ５−１．２蛋白の精製 （６−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 〈段階３〉で得た３ｇの大腸菌細胞沈降物を実施例３の〈段階４〉（４−１） のように処理して細胞を破壊しそれから不溶性沈降物を得た。 （６−２）不溶性沈降物の洗浄 （６−１）で得た沈降物を実施例３の〈段階４〉（４−２）のように処理して 溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （６−３）不溶性沈降物の溶解 （６−２）の不溶性沈降物を８Ｍ尿素を含む１００mlの緩衝液３（５０ｍＭト リス、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール） に懸濁させた。この懸濁液を室温で１時間攪拌し遠心分離して不溶性沈降物を除 去し上澄液を得た。 （６−４）ＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー （６−３）で得た上澄液を、前記緩衝液３で平衡化されたＤＥＡＥ−セファロ ースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２．５cm×３cm）に２ml／分の流速で通過さ せ、同一緩衝液を加えカラムに残っている遊離蛋白を溶出させた。その後、０乃 至０．３Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を有する３００mlの緩衝液３を８ml／分の流速 で加え吸着し た蛋白を溶出し、溶出物を４ml分画として収集した。蛋白分画を１５％ＳＤＳ− ＰＡＧＥしてＵＢＮＳ５−１．２蛋白を含む分画を収集した。 （６−５）Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィー （６−４）で収集した蛋白分画をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ．Ｓ ．Ａ．）を用いて３mlの容量に濃縮した後、８Ｍ尿素を含有する緩衝液３で平衡 化されたＳ−３００樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１．２cm×１２０cm）に １０ml／時の流速で通過させた。溶出した蛋白を０．５ml分画で集め、１５％Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥして高純度のＵＢＮＳ５−１．２蛋白を含有する分画を収集した 。 （６−６）ＦＰＬＣ−フェニル−スペロース（ＦＰＬＣ−ｐｈｅｎｙｌ−ｓｕｐ ｅｒｏｓｅ）クロマトグラフィ （６−５）で収集した蛋白分画をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ．Ｓ ．Ａ．）を通過させ４mlの容量に濃縮した。濃縮物を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍ．Ｗ．ｃｕｔ ｏｆｆ ６，０００−８，０００）を使用してＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０ ，１５ｍＭ ＮａＣｌ）に対して透析して尿素を除去した。この溶液に １．５Ｍの最終濃度となるように塩化ナトリウムを添加した。産物を同一緩衝液 で平衡化したＦＰＬＣ−フェニル−スペロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｈ Ｒ ５／５，０．５cm×５cm）に０．７ml／分の流速で通過させ、同一緩衝液を 加えカラムに残っている遊離蛋白を溶出した。その後、１．５Ｍ乃至０Ｍ塩化ナ トリウムの線形濃度勾配を有するＰＢＳを加え結合した蛋白を溶出し、溶出物を ０．７mlずつの分画として収集した。蛋白分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして９ ５％以上の純度を有するＵＢＮＳ５−１．２蛋白を含む分画を収集し、精製した 蛋白の抗原的特異性はウェスタンブロッティング分析法によって確認した。 実施例６．個別ＫＨＣＶ蛋白および本発明の組換え蛋白を用いたＥＬＩＳＡ（ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）による 抗−ＨＣＶ抗体の検出 ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ １４、ＫＨＣＶ ４０３およびＫＨＣＶ ＮＳ５−１． ２蛋白をそれぞれ５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で０．３μｇ ／mlの濃度に希釈した。ＫＨＣＶ Ｅ２ＣおよびＫＨＣＶ Ｅ１蛋白も同一緩衝 液でそれぞれ０．２μｇ／mlおよび０．１μｇ／mlの濃度に希釈した。希釈した 蛋白溶液を、マ イクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，ｉｍｍｕｌｏｎ ｔｙｐｅ １ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）のウェルに２００μｌ／ウェルの量で入れ 、３７℃で２時間培養した。 前記プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ ７．４、以下“洗浄液”という）で１回洗浄した。０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチ ンを含有するＰＢＳを２５０μｌ／ウェルの量でウェルに加え、後に起こるかも しれない非特異的反応を防止するために、プレートを３７℃で１時間培養して残 っている蛋白吸着部位を遮断した。前記ウェルを前記洗浄液で２回洗浄し、０． ２５％ゼラチン、１．０％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡお よび０．０２％チメロサールを含有するＰＢＳを１９０μｌづつ各ウェルに入れ た。その後、ＨＣＶ患者および正常供与者から採取した１０μｌの血清試料を前 記ウェルに加え、数秒間軽く混合した。 ３７℃で１時間反応させたウェルを洗浄液で５回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ ）胎仔ウシ血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１５フィコル（Ｆｉ ｃｏｌｌ、Ｓｉｇｍａ，ｖ／ｖ）、０．０５％ツイーン２０および０．０２％チ メロサールを含有するＰＢＳで１μ ｇ／ml濃度に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ９４８０４，Ｕ．Ｓ．Ａ．，０．１ mg蛋白／ml）で標識された抗−ヒトＩｇＧ抗体を含有する溶液を２００μｌ／ウ ェルの量で前記ウェルに加えた。 産物を３７℃で１時間培養し、前記洗浄液で５回洗浄した。その後、５０ｍＭ クエン酸塩緩衝液でＯ−フェニレンジアミンニ塩酸塩錠剤（ＯＰＤ ｔａｂｌｅ ｔ，Ｓｉｇｍａ）を１０mg／mlの濃度に溶解させ、リン酸塩を加えｐＨ５．５に 調節することによって製造した基質溶液２００μｌづつを各ウェルに入れた後、 室温の暗所で３０分間培養した。産物に、各ウェル当り５０μｌづつの４Ｎ硫酸 を加え発色反応を中止させ、４９２ｎｍ波長でマルチスキャンタイターテック（ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ｔｉｔｅｒｔｅｋ）（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ）で各ウェルのＯ ．Ｄ．を測定した。 また、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１ml当り２５０ｎｇの ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ ５１８蛋白、１２５ｎｇのＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白 および１２５ｎｇのＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白を含有する混合抗原溶液を使 用して前記のような過程を繰返した。 個別ＫＨＣＶ抗原および混合抗原を用いて抗−ＫＨＣ Ｖ抗体を検出する前記過程の結果が下記表IIに示されている。 前記試験で、カットオフ値は次にように決定した。 イムノブロッチング分析法を使用してＲＩＢＡII診断キット（Ｏｒｔｈｏ Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で確認された５０９個の ＨＣＶ−陰性および７６個のＨＣＶ−陽性血清試料を前記診断過程によって試験 して下記表IIIに示した結果を得た。 次に、カットオフ値はそれを調節するための下記一般式（ｇｅｎｅｒａｌ ｅ ｑｕａｔｉｏｎ）を用いて計算した： カットオフ値＝陰性試料のＯＤ₄₉₀の平均＋ ３×陰性試料のＯＤ₄₉₀の標準偏差 したがって、計算されたカットオフ値０．３８３および陰性試料のＯＤ₄₉₀の 分布を参照してカットオフ値０． ４が得られた。 前記表IIで判るように、混合抗原のみでなく個別抗原も抗−ＨＣＶ抗体を検出 するための診断試薬として使用できるが、混合抗原が陰性および陽性試料間でさ らに敏感で明確な結果を示す。 実施例７：ＫＨＣＶエピトープを含有する個別組換え蛋白および混合ＫＨＣＶ抗 原を用いた抗−ＫＨＣＶ抗体の検出 ５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）でＫＨＣＶ Ｅ１Ｅ２蛋白お よびＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白をそれぞれ０．２μｇ／mlの濃度に希釈し、 ５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１ml当り２５０ｎｇのＫＨＣＶ ＣＯＲＥ ５１８蛋白、１２５ｎｇのＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白および１ ２５ｎｇのＮＳ５−１．２蛋白を含有する抗原溶液を製造した。希釈した蛋白溶 液を２００μｌ／ウェルの量でマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ， ｉｍｍｕｌｏｎｔｙｐｅ １ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）のウェルに 入れ実施例６のような過程を繰り返して下記表IVに示した結果を得た。 上記表IVで分かるように、Ｃ型肝炎患者から得た血清から抗−ＫＨＣＶ抗体を 検出するにおいて、ＫＨＣＶＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白がＫＨＣＶ Ｅ１Ｅ２蛋白より さらに効果的であり、混合抗原は混合物に含まれた他の抗原の付加効果によって ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白よりさらに大きい効能を示す。 また、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）でＫＨＣＶ ＣＯＲＥ ＥＰＩ、ＫＨＣＶ ５１８およびＫＨＣＶ ＣＯＲＥ５１８蛋白をそれぞれ１２ ５ｎｇ／mlの濃度に希釈し、抗原溶液をマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔ ｅｃｈ，Ｉｍｍｕｌｏｎ ｔｙｐｅ １ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ） のウェルに２００μｌ／ウェルの量で加え、Ｃ型肝炎患者から抽出した１３６個 の血清（大韓民国ソウルの現代中央病院（Ｈｙｕｎｄａｉ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈ ｏｓｐｉｔａｌ）から入手）を使用して実施例６のような過程を繰り返した。前 記過程から得た結果を、ＰＣＲ方法によって得た結果と比較して表Ｖに示した。 表Ｖで分かるように、ＫＨＣＶ ＣＯＲＥＥＰＩ蛋白およびＫＨＣＶ ５１８ 蛋白を用いて得た診断結果は、前記二つのＫＨＣＶ蛋白のエピトープを含むＫＨ ＣＶＣＯＲＥ５１８蛋白を用いて得た診断結果よりやや敏感でなかった。 実施例８：従来の技術と本発明の診断方法の比較 輸血後ヒトＨＣＶ血清転換パネル（Ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｎｏａｌ ｐａ ｎｅｌｓ）（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，７８０ Ｐａｒｋ Ｎｏｒｔ ｈ Ｂｌｕｄ，Ｃｌａｒｋｓｔｏｎ，ＧＡ ３００２１ Ｕ．Ｓ．Ａ．）から定 期別に得た試料を用いて実施例６のような過程を繰り返すことによって試料内の 抗−ＨＣＶ抗体を検出し、その結果をオルト（Ｏｒｔｈｏ）第１世代およびアボ ット（Ａｂｂｏｔｔ）第１世代ＨＣＶ診断キットを用いて得た結果と比較して下 記表VIに示した。 前記結果は、本発明の診断キットが他の第１世代診断キットよりさらに早期に （約５〜６週早く）、そして本発明の診断方法がＲＩＢＡIIキットによって採択 されたイムノブロッティング分析法に比べ便利なＥＬＩＳＡ方法を使用するにも 拘らすＲＩＢＡIIキットに匹敵する程度で抗−ＨＣＶ抗体を検出することができ ることを示す。 実施例９：診断の正確度 本発明の診断結果の正確度を証明するために、オルトダイアグノスチックシス テムス社によって製造され販売されるＣ型肝炎診断キットで陽性と診断された１ ８個の血清試料を実施例７の過程によって本発明の診断キットで再度診断し、ま た確認分析法（Ｖａｎ ｄｅｒ ｐｏｅｌ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃ ｅｔ ３３７，３１７−３１９（１９９１））として勧奨されるＣ型肝炎診断用 オルト第２世代イムノブロッティングキット（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ ９３３４９１ ）で製造者の指示の通り診断した。この結果は表VIIに要約されており、本発明 の診断キットがオルト社のＣ型肝炎診断キットに比べ低い偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示すことを表す。 実施例１０．診断キットの特異性 本発明の診断試栗の特異性および感度を証明するために、ラッキーＩ（（株） ラッキーによって開発された診断キットとして、韓国特許公開第９３−６８３号 で開示されていた）、アボット第２世代診断キット（ＡｂｂｏｔｔII）およびＵ ＢＩ（ＵＢＩ Ｃｏ．，Ｕ．Ｓ．）からなる群から選択されたいずれかのＣ型肝 炎診断キットを使用して陽性と判定された９４個の試料を実施例７の方法によっ て本発明の診断キットで再度診断した。その結果は下記表VIIIに要約されている 。 表VIIIから分かるように、全ての診断キットはほぼ等しい感度を示し、本発明 の診断キット（ラッキーII）（ＬｕｃｋｙII）は他のＣ型肝炎診断キットに比べ 高い特異性を示す。 また、前記４種の診断キット（アボットII、ＵＢＩ、ラッキーＩおよびラッキ ーII）中のいずれか一つで陰性と診断された血清試料から無作為に２７８個の血 清試料を選択し、選択された試料の平均吸光度（ＯＤ₄₉₂）を計算した。同じ過 程を繰り返し、ラッキーＩ、アボットIIおよびＵＢＩからなる群から選択された いずれか一つを使用して陽性と診断された９４個の血清試料の平均吸光度を得た 。 陽性試料の平均吸光度値および陰性試料の平均吸光度値を平均カットオフ値で それぞれ分けて陽性試料および陰性試料の平均シグナル／カットオフ（Ｓ／Ｃ） 値を得た。その結果を下記表IXに示した。表IXで分かるように、 ラッキーIIとＵＢＩとが陽性および陰性試料のＳ／Ｃ値間に最も大きい差異を示 し、これはそれらが他のものよりもさらに明白なシグナルを出すことを意味する 。しかし、ＵＢＩの高いＳ／Ｃ値は、低いカットオフ値に多少によるもので、結 果的に、高い偽陽性判定率を示すことができるので、重要でない。 本発明は前記特定実施態様と関連して記述されたが、本発明関連分野の熟練者 が添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内に本発明を多様に変 形および変化させ得ることは勿論である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キム チュン ヒュング 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユセ オング―ク ドリオング―ドン 386―１ ラッキー ドーミトリー 219 (72)発明者 ソー ホング セオブ 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユセ オング―ク ドリオング―ドン 386―４ ラッキー ドーミトリー 301 (72)発明者 ヤング ジャエ ヨウング 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユセ オング―ク ドリオング―ドン 386―４ ラッキー アパートメント ビー―304 (72)発明者 キム イン ソオ 大韓民国 305―345 ダエジェオン ユセ オング―ク シンスング―ドン 153 ラ ッキー ハナ アパートメント 102―402 (72)発明者 キム ジョオ ホ 大韓民国 302―223 ダエジェオン セオ ―ク タンバング―ドン 835 コングジ ャク ハニャング アパートメント 10― 303

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記アミノ酸配列を有するＫＨＣＶ ＣＯＲＥＥＰＩ，ＫＨＣＶ ５１８， ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ，ＫＨＣＶ ＥＩＧ，ＫＨＣＶ Ｅ２Ａ，ＫＨＣＶ Ｅ２Ｅ およびＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２からなる群から選択されたＣ型肝炎ウイルスの 抗原蛋白： ２．請求の範囲第１項に記載のＣ型肝炎ウイルスの抗原蛋白を一つ以上含む組換 え蛋白。 ３．ＫＨＣＶ ＣＯＲＥＥＰＩおよびＫＨＣＶ ５１８を含む請求の範囲第２項 に記載の組換え蛋白。 ４．ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ、ＫＨＣＶ Ｅ２ＡおよびＫＨＣＶ Ｅ２Ｅを含む請求の 範囲第２項に記載の組換え蛋白。 ５．更にＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅを含む請求の範囲第４項に記載の組換え蛋白。 ６．更にユビキチンを含む請求の範囲第２項〜第５項のいずれかに記載の組換え 蛋白。 ７．請求の範囲第１項に記載のＣ型肝炎抗原蛋白をコードするヌクレオチド配列 を含むＤＮＡ断片。 ８．ＫＨＣＶ ＣＯＲＥＥＰＩおよびＫＨＣＶ ５１８をコードするヌクレオチ ド配列を含む請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ断片。 ９．ＫＨＣＶ ＮＳ４ＥおよびＫＨＣＶ ５１８をコードするヌクレオチド配列 を含む請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ断片。 10．ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ、ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ、ＫＨＣＶ Ｅ２ＡおよびＫＨＣＶ Ｅ２Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ 断片。 11．ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ、ＫＨＣＶ Ｅ２ＡおよびＫＨＣ Ｖ Ｅ２Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む請求の範囲第７項に記載のＤＮ Ａ断片。 12．請求の範囲第７項〜第１１項のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含む発現ベク ター。 13．ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ ５１８、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ１Ｅ２ 、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５−１．２およびｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅ２からな る群から選択された請求の範囲第１２項に記載の発現ベクター。 14．請求の範囲第１２項または第１３項に記載の発現ベクターで形質転換された 大腸菌細胞。 15．請求の範囲第１４項に記載の大腸菌形質転換体を培養し、培養物から抗原蛋 白を回収することを含むＣ型肝炎ウイルスの抗原蛋白の産生方法。 16．ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ ５１８で形質転換された大腸菌細胞を用いて ＫＨＣＶ ５１８を産生する請求の範囲第１５項に記載の方法。 17．ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ１Ｅ２で形質転換された大腸菌細胞を用いてＫ ＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２を産生する請求の範囲第１５項に記載の方法。 18．ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ５−１．２で形質転換された大腸菌細胞を用いてＫ ＨＣＶ ＮＳ５−１．２を産生する請求の範囲第１５項に記載の方法。 19．ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ ５１８、ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２およびＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２からなる群から選択された一つ以上の抗原蛋白を含有する、推定 試料内のＣ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体検出用診断試薬。 20．請求の範囲第１９項に記載の診断試薬を用いることによって、推定試料内の Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体を検出する診断方法。 21．前記診断を酵素−結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を使用して行う請求の 範囲第２０項に記載の診断方法。