CN101502657A - 噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法。以噬菌体为载体,将EB病毒的gp350蛋白与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白展示在噬菌体表面,构建成重组噬菌体载体疫苗。gp350蛋白在噬菌体表面与其它蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白的共展示,具有免疫增强作用,相当于将佐剂的功能整合入疫苗本身。
Description
技术领域
本发明涉及一种噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,尤其是能够使用间隔子GPGPG连接的EB病毒的gp350蛋白与其它外源蛋白或蛋白表位的融合蛋白正确展示于噬菌体表面的重组噬菌体疫苗的构建方法。
背景技术
噬菌体展示是将外源遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中,将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体外壳蛋白融合在一起,并在噬菌体表面展示。利用噬菌体展示技术研制基因工程抗原具有多种优势:(1)噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物,能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应;(2)噬菌体有强的免疫原性,是天然的免疫佐剂,在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体,容易被免疫系统识别;(3)噬菌体可以募集T辅助细胞,而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应;(4)由于噬菌体颗粒是由感染的细菌细胞分泌,噬菌体颗粒可以方便的大规模生产抗原用抗原表位,还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇,构建多价抗原;(5)纯化简单、花费少;(6)噬菌体颗粒稳定,对理化因素的抵抗力强。由于应用噬菌体展示技术研究基因工程抗原具有以上的优点,弥补了传统抗原和其它基因工程抗原产量不高、纯化复杂等缺陷,对新型抗原的开发具有重要意义。
EB病毒,英文全称Epstein-Barr virus,又称为人类疱疹病毒4,英文全称Human herpesvirus4。gp350蛋白是EB病毒的(Epstein-Barr virus,EBV)包膜糖蛋白,可与C3d受体CD21结合并表现出广泛的生物活性。gp350蛋白对免疫系统有广泛的影响。表达gp350蛋白的细胞可活化补体,不表达gp350蛋白的细胞无活化能力,而纯化的gp350蛋白可以有效地激活补体旁路。gp350蛋白与B细胞CD21结合可以导致IL-6RNA和IL-6蛋白量的增高。gp350蛋白可使嗜中性白细胞胞内IL-8和巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)mRNA积聚,并伴有IL-8和MIP-1α分泌的增多。gp350蛋白多肽还能降低CD23(IgE低亲和性受体)与CD21的结合,抑制IL-4诱导的IgE和IgG4的产生。
CD21是B细胞表达的C3d受体,同时也是EB病毒的gp350蛋白的结合位点。EB病毒通过gp350蛋白与CD21的结合而感染人体,感染后可诱导B细胞产生Ig。gp350蛋白还同时具有ADCC的抗原决定簇和介导EBV吸附宿主细胞表面受体CR2的位点,是CR2的特殊配体,EB病毒结合到CD21,覆盖了Ig受体,诱导不同水平的B细胞增殖,以gp350蛋白作为CR2的配体,通过共交联mIg和CR2观察对B细胞的刺激阈,发现低浓度的anti-IgD-gp350能刺激B细胞高度增殖。这依赖于Ig结构和CR2,因为CR2抗体能有效地阻止这种增殖,这说明将gp350蛋白连接到那些具有弱免疫原性的分子能使细胞系扩展,并且激活那些同时结合了抗原和CR2配体gp350蛋白的抗原特殊的B细胞,因此,交联gp350蛋白携带分子是提高人类对弱免疫原性分子免疫应答的一个理想方法。而且这种方法勿需外源性辅助因子的参与就能使B细胞系扩展和激活。早先曾有人使用抗体交联到C3d与CR2共扼抗原的方法提高抗体应答,即抗原结合到补体C3;如果同时交联了mIg和CD21,在低浓度抗原时就能诱导B细胞激活,在缺少mIg情况下,以抗CD21抗体交联B细胞的CR2同样能诱导B细胞的增殖和分化,并伴有T细胞因子的出现。如果用gp350蛋白替代C3d有很多优点,它解决了由于注射包括补体在内的任何自身抗原可能产生的自身抗体带来的影响。产生针对gp350蛋白的抗体是有利的,可以提供对EB病毒媒介的疾病的保护作用。
基于上述理论基础,我们发明了一种构建噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的新方法,该方法适用于多种多表位、多蛋白融合的新型疫苗的设计构建。
发明内容
本发明将具有免疫增强作用的EB病毒的gp350蛋白与其它外源蛋白的融合蛋白共同展示于噬菌体载体表面组成新型的重组噬菌体疫苗,EB病毒的gp350蛋白能够发挥类似于传统疫苗中佐剂的作用。
本发明通过下列技术方案实现:一种噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,其特征在于它将EB病毒的gp350蛋白用间隔子GPGPG与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白相连接,并共同展示在噬菌体表面组成重组噬菌体疫苗。
所述EB病毒的gp350蛋白编码序列如下:
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所述的间隔子GPGPG编码序列为:ggtccgggtccgggt。
所述外源蛋白是天然或人工合成的编码序列已知的蛋白;蛋白表位是天然或人工合成的蛋白编码序列已知的表位或经理论推测所得的序列已知的表位,且将EB病毒的gp350蛋白用间隔子GPGPG与单独的外源蛋白或蛋白表位连接,或者与多个外源蛋白的组合相连接,或者与多个蛋白表位的组合相连接,或者与外源蛋白及蛋白表位的组合相连接。
本发明所述的噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,具体经过下列步骤:
A、将EB病毒的gp350蛋白的编码序列用间隔子GPGPG的编码序列与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白的编码序列相连接,组成融合蛋白编码序列,外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白的编码序列表示为Xgene,表示为EBgp350-间隔子-Xgene;
B、利用现有公知技术将上述融合蛋白编码序列EBgp350-间隔子-Xgene由专门的商业公司在中间载体质粒上合成一段DNA序列,该DNA序列的5’端和3’端含有特定的限制性内切酶的酶切位点,用上述特定的限制性内切酶将上述DNA序列从中间质粒载体上切下后,插入噬菌体载体的多克隆位点相应的酶切位点之间,构建成为重组噬菌体,从而使利用间隔子GPGPG连接的EB病毒的gp350蛋白与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白能够正确展示于重组噬菌体表面,成为新型的噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:以噬菌体为载体,通过将EB病毒的gp350蛋白和疾病相关蛋白或蛋白表位融合蛋白展示表达在噬菌体表面,形成一个外源性的抗原复合物,经免疫进入机体后,通过抗原呈递系统,诱导针对噬菌体、gp350蛋白及疾病相关蛋白或其表位的特异性抗体,这种特异性抗体与疾病相关抗原蛋白结合形成抗原抗体复合物,从而被机体清除,最终达到预防或治疗相关疾病的目的。
本发明解决了下列技术难点:
在以噬菌体展示技术为依托,以噬菌体为载体的新型重组疫苗构建方法的基础上,打破了传统中疫苗佐剂的加入理念,将有佐剂作用的蛋白——EB病毒的gp350蛋白成功整合入重组疫苗本身,创立了疫苗免疫增强的新方法。经过多年的潜心研究与实验,付出了创造性的劳动,在实践中成功实施了该设计理念,构建出了新型的噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗并建立了技术平台。
目前我们已成功以T7噬菌体作为多表位疫苗的载体,通过用间隔子GPGPG的编码序列将EB病毒的gp350蛋白编码序列与乙肝病毒两个中和表位HBVpreS119-26和HBVpreS137-45、乙脑病毒prM蛋白模拟表位JEV mimotope以及麻疹病毒中和表位MV-F404-414编码序列相连组成融合蛋白编码序列,将该融合蛋白编码序列插入载体T7Select10-3b的多克隆位点,使其位于T710B基因的3′端。使EB病毒的gp350蛋白与乙肝乙脑麻疹(HBV-JEV-MV)多表位融合蛋白展示在T7噬菌体表面,构建了新型的乙肝乙脑麻疹(HBV-JEV-MV)多表位疫苗,以下表示为EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗。
通过大量的动物实验证明,该疫苗的免疫原性优于单纯的乙肝乙脑麻疹(HBV-JEV-MV)多表位噬菌体疫苗。
(1)EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗与HBV-JEV-MV多表位噬菌体疫苗的免疫效果比较观察。
昆明种小鼠随机分组,于0周、2周、4周腹腔注射免疫3次,分为以下几组EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗组、HBV-JEV-MV多表位噬菌体疫苗组、T7噬菌体空载体组、空白对照组、乙肝疫苗阳性对照组、乙脑灭活疫苗阳性对照组和麻疹减毒活疫苗阳性对照组,前三组三次免疫剂量均为1012pfu/只,空白对照组则注射相同体积的生理盐水,乙肝疫苗阳性对照组、乙脑灭活疫苗阳性对照组和麻疹减毒活疫苗阳性对照组分别注射现有的商品乙肝疫苗、乙脑灭活疫苗和麻疹减毒活疫苗。于末次免疫后4、8、12周测定血清中抗-HBV IgG、抗-JEV IgG和抗-MV IgG水平。结果显示,EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗组和HBV-JEV-MV多表位噬菌体疫苗组均能刺激机体产生抗-HBV IgG、抗-JEVIgG和抗-MV IgG,EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗组抗体水平明显高于HBV-JEV-MV多表位噬菌体疫苗组,而T7噬菌体空载体组和空白对照组无此效应。EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗组的免疫效果亦优于或等同于现有的商品乙肝疫苗、乙脑灭活疫苗和麻疹减毒活疫苗结果见表1。
表1 末次免疫后4、8、12周小鼠血清中抗-HBV IgG、抗-JEV IgG和抗-MV IgG水平
具体实施方式
下面结合实施对本发明做进一步描述,但本发明之内容并不局限于此。
实施例1
EB病毒的gp350蛋白与乙肝乙脑麻疹(HBV-JEV-MV)多表位融合蛋白联合噬菌体疫苗,以下称为EBgp350-HBV-JEV-MV噬菌体疫苗的构建方法,具体是:
A、融合蛋白编码序列的设计与构建
用间隔子GPGPG的编码序列将EB病毒的gp350蛋白、乙肝病毒两个中和表位HBVpreS1 19-26和HBVpreS1 37-45、乙脑病毒prM蛋白模拟表位JEV mimotope和麻疹病毒中和表位MV-F404-414的编码序列顺序相连,组成融合蛋白编码序列,其中间隔子GPGPG的编码序列为ggtccgggtccgggt;EB病毒的gp350蛋白的编码序列为:
atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggctttttt
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aacctgagcatgctggtgctgcagtgggcgagcctggcggtgctgaccctgctgctgctgctggtgatggcggat
tgcgcgtttcgtcgtaacctgagcaccagccatacctataccaccccgccgtatgatgatgcggaaacctatgtg;
乙肝病毒中和表位HBVpreS119~26的编码序列为ccgaacccgctgggcttttttccg;乙肝病毒中和表位HBVpreS137-45的编码序列为aacagcagcccgccggattgggatttt;乙脑病毒prM蛋白模拟表位JEV mimotope的编码序列为tatggcggcatttatatgnnnggc;麻疹病毒中和表位MV-F404-414的编码序列为attaaccaggatccggataaaattctgacctat;顺序连接而成的融合蛋白编码序列为:
atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggctttttt
aacgtggaaattctggaatttccgttttatccggcgtgcaacgtgtgcaccgcggatgtgaacgcgaccattaacttt
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ctggatgtgaccctgccgctgagcctgccgaccagcgcgcaggatagcaactttagcgtgaaaaccgaaatgctg
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accctgggcaaaaccagcccgaccagcgcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccgtggg
cgaaaccagcccgcaggcgaacaccaccaaccataccctgggcggcaccagcagcaccccggtggtgaccag
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gagcctgcgtccgagcagcattagcgaaaccctgagcccgagcaccagcgataacagcaccagccatatgccg
ctgctgaccagcgcgcatccgaccggcggcgaaaacattacccaggtgaccccggcgagcaccagcacccatc
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caccagcaccaaaccgggcgaagtgaacgtgaccaaaggcaccccgccgaaaaacgcgaccagcccgcagg
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ctttaccagcccgccggtgaccaccgcgcaggcgaccgtgccggtgccgccgaccagccagccgcgttttagc
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gtccgggtccgggtccgaacccgctgggcttttttccgggtccgggtccgggtaacagcagcccgccggattgg
gattttggtccgggtccgggttatggcggcatttatatgnnnggcggtccgggtccgggtattaaccaggatccgg
ataaaattctgacctat,称为EBgp350-HBVpreS1-JEV-MVF融合蛋白编码序列;
B、中间载体的构建
利用现有公知技术将A中设计的融合蛋白编码序列由商业公司在pGEM-T载体上合成一段DNA序列,并在该DNA序列的5’端引入EcoR
I酶切位点gaattc,3’端引入Xho I酶切位点ctcgag;
C、噬菌体疫苗的构建
利用现有公知技术用上述的限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切体系将上述DNA序列从中间质粒载体pGEM-T载体上切下后,插入T7Select10-3b噬菌体载体的多克隆位点相应的酶切位点之间,用T7Select PackagingKit包装,并用现有技术的PCR方法结合测序筛选鉴定出相应的重组噬菌体阳性克隆,从而完成重组噬菌体疫苗的构建,使得用间隔子GPGPG连接的EB病毒的gp350蛋白、乙肝病毒中和表位HBVpreS1 19-26、乙肝病毒中和表位HBVpreS1 37-45、乙脑病毒prM蛋白模拟表位JEV mimotope和麻疹病毒中和表位MV-F404-414融合蛋白能够正确展示于重组噬菌体表面,成为新型的噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体乙肝乙脑麻疹多表位疫苗。
实施例2
EB病毒的gp350蛋白与甲型肝炎病毒VP1蛋白融合蛋白联合噬菌体疫苗,以下称为EBgp350-HAV噬菌体疫苗的构建的方法,具体步骤是:
A、融合蛋白编码序列的设计与构建
用间隔子GPGPG的编码序列将EB病毒的gp350蛋白和甲型肝炎病毒VP1蛋白的编码序列顺序相连,组成融合蛋白编码序列;间隔子GPGPG的编码序列为:ggtccgggtccgggt;EB病毒的gp350蛋白的编码序列为:
atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggctttttt
aacgtggaaattctggaatttccgttttatccggcgtgcaacgtgtgcaccgcggatgtgaacgcgaccattaacttt
gatgtgggcggcaaaaaacataaactgaacctggattttggcctgctgaccccgcataccaaagcggtgtatcagc
cgcgtggcgcgtttggcggcagcgaaaacgcgaccaacctgtttctgctggaactgctgggcgcgggcgaactg
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tgcgcgtttcgtcgtaacctgagcaccagccatacctataccaccccgccgtatgatgatgcggaaacctatgtg;
甲型肝炎病毒VP1蛋白的编码序列为:
gttggagatgattcaggaggtttctcaacaacagtttctacagagcagaatgttcctgatcccc
aagttggcataaaagggaaagccaataggggaaagatggatgtatcaggagtgcaggcacctgt
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连接而成的融合蛋白编码序列为
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ctggatgtgaccctgccgctgagcctgccgaccagcgcgcaggatagcaactttagcgtgaaaaccgaaatgctg
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cgattccgggcaccggctatgcgtatagcctgcgtctgaccccgcgtccggtgagccgttttctgggcaacaacag
cattctgtatgtgttttatagcggcaacggcccgaaagcgagcggcggcgattattgcattcagagcaacattgtgtt
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cagctggagacttggagtcatcagtggatgatcccagatcagaggaggacagaagatttgag;
以下称为EBgp350-HAVvp1融合蛋白编码序列;
B、中间载体的构建
利用现有公知技术将A中设计的融合蛋白编码序列由商业公司在pGEM-T载体上合成为一段DNA序列,并在该DNA序列的5’端引入EcoR
I酶切位点gaattc,3’端引入Xho I酶切位点ctcgag;
C、噬菌体疫苗的构建
利用现有公知技术用上述的限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切体系将上述DNA序列从中间质粒载体pGEM-T载体上切下后,插入T7Select10-3b噬菌体载体的多克隆位点相应的酶切位点之间,用T7 Select PackagingKit包装并用PCR方法结合测序筛选鉴定出相应的重组噬菌体阳性克隆,从而完成重组噬菌体疫苗的构建,使得用间隔子GPGPG连接的EB病毒的gp350蛋白和甲型肝炎病毒VP1蛋白的融合合蛋白能够正确展示于重组噬菌体表面,成为新型的噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体甲型肝炎疫苗。
EB病毒的gp350蛋白编码序列如下:
atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggctttttt
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cgccgagcggccagaaaaccgcggtgccgaccgtgaccagcaccggcggcaaagcgaacagcaccaccgg
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aacctgagcatgctggtgctgcagtgggcgagcctggcggtgctgaccctgctgctgctgctggtgatggcggat
tgcgcgtttcgtcgtaacctgagcaccagccatacctataccaccccgccgtatgatgatgcggaaacctatgtg
间隔子GPGPG编码序列为:
ggtccgggtccgggt
乙肝病毒中和表位HBVpreS119~26的编码序列为:
ccgaacccgctgggcttttttccg
乙肝病毒中和表位HBVpreS137-45的编码序列为:
aacagcagcccgccggattgggatttt
乙脑病毒prM蛋白模拟表位JEV mimotope的编码序列为:
tatggcggcatttatatgnnnggc
麻疹病毒中和表位MV-F404-414的编码序列为:
attaaccaggatccggataaaattctgacctat
顺序连接而成的融合蛋白编码序列为:
atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggctttttt
aacgtggaaattctggaatttccgttttatccggcgtgcaacgtgtgcaccgcggatgtgaacgcgaccattaacttt
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cgtggatgtgtattttcaggatgtgtttggcaccatgtggtgccatcatgcggaaatgcagaacccggtgtatctgatt
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ctggatgtgaccctgccgctgagcctgccgaccagcgcgcaggatagcaactttagcgtgaaaaccgaaatgctg
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cattacctgcagcggctatgaaagccatgtgccgagcggcggcattctgaccagcaccagcccggtggcgaccc
cgattccgggcaccggctatgcgtatagcctgcgtctgaccccgcgtccggtgagccgttttctgggcaacaacag
cattctgtatgtgttttatagcggcaacggcccgaaagcgagcggcggcgattattgcattcagagcaacattgtgtt
tagcgatgaaattccggcgagccaggatatgccgaccaacaccaccgatattacctatgtgggcgataacgcgac
ctatagcgtgccgatggtgaccagcgaagatgcgaacagcccgaacgtgaccgtgaccgcgttttgggcgtggc
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tgcgcgtttcgtcgtaacctgagcaccagccatacctataccaccccgccgtatgatgatgcggaaacctatgtgg
gtccgggtccgggtccgaacccgctgggcttttttccgggtccgggtccgggtaacagcagcccgccggattgg
gattttggtccgggtccgggttatggcggcatttatatgnnnggcggtccgggtccgggtattaaccaggatccgg
ataaaattctgacctat
甲型肝炎病毒VP1蛋白的编码序列为:
gttggagatgattcaggaggtttctcaacaacagtttctacagagcagaatgttcctgatcccc
aagttggcataaaagggaaagccaataggggaaagatggatgtatcaggagtgcaggcacctgt
gggagctattacaacaattgaggatccagttttagcaaagaaagtacctgagacatttcctgaa
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ctcatttcttgtgtacttttacttttaattcaaacaataaagagtacacatttccaata
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tgtttcagttgtatagaggaccattggatttgacaattataatcacaggagccactgatgtgga
tggtatggcctggtttactccagtgggccttgctgtcgacaccccttgggtggaaaagaagtca
gctttgtctattgattataaaactgcccttggagctgttagatttaatacaagaagaacaggga
acattcagattagattgccatggtattcttatttgtatgccgtgtctggagcactggatggctt
gggagataagacagattctacatttggattggtttctattcagattgcaaattacaatcattct
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gagctccattaaattcaaatgctatgttgtccactgagtccatgatgagtagaattgcagctgg
agacttggagtcatcagtggatgatcccagatcagaggaggacagaagatttgag
连接而成的融合蛋白编码称为EBgp350-HAVvp1,其编码序列为:
atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggctttttt
aacgtggaaattctggaatttccgttttatccggcgtgcaacgtgtgcaccgcggatgtgaacgcgaccattaacttt
gatgtgggcggcaaaaaacataaactgaacctggattttggcctgctgaccccgcataccaaagcggtgtatcagc
cgcgtggcgcgtttggcggcagcgaaaacgcgaccaacctgtttctgctggaactgctgggcgcgggcgaactg
gcgctgaccatgcgtagcaaaaaactgccgattaacattaccaccggcgaagaacagcaggtgagcctggaaag
cgtggatgtgtattttcaggatgtgtttggcaccatgtggtgccatcatgcggaaatgcagaacccggtgtatctgatt
ccggaaaccgtgccgtatattaaatgggataactgcaacagcaccaacattaccgcggtggtgcgtgcgcagggc
ctggatgtgaccctgccgctgagcctgccgaccagcgcgcaggatagcaactttagcgtgaaaaccgaaatgctg
ggcaacgaaattgatattgaatgcattatggaagatggcgaaattagccaggtgctgccgggcgataacaaatttaa
cattacctgcagcggctatgaaagccatgtgccgagcggcggcattctgaccagcaccagcccggtggcgaccc
cgattccgggcaccggctatgcgtatagcctgcgtctgaccccgcgtccggtgagccgttttctgggcaacaacag
cattctgtatgtgttttatagcggcaacggcccgaaagcgagcggcggcgattattgcattcagagcaacattgtgtt
tagcgatgaaattccggcgagccaggatatgccgaccaacaccaccgatattacctatgtgggcgataacgcgac
ctatagcgtgccgatggtgaccagcgaagatgcgaacagcccgaacgtgaccgtgaccgcgttttgggcgtggc
cgaacaacaccgaaaccgattttaaatgcaaatggaccctgaccagcggcaccccgagcggctgcgaaaacatt
agcggcgcgtttgcgagcaaccgtacctttgatattaccgtgagcggcctgggcaccgcgccgaaaaccctgatt
attacccgtaccgcgaccaacgcgaccaccaccacccataaagtgatttttagcaaagcgccggaaagcaccacc
accagcccgaccctgaacaccaccggctttgcggcgccgaacaccaccaccggcctgccgagcagcacccatg
tgccgaccaacctgaccgcgccggcgagcaccggcccgaccgtgagcaccgcggatgtgaccagcccgaccc
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caaagcgccggatatgaccagcccgaccagcgcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccc
cggcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccctgggcaaaaccagcccgaccagcgcggtg
accaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccccggcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccattccg
accctgggcaaaaccagcccgaccagcgcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccgtggg
cgaaaccagcccgcaggcgaacaccaccaaccataccctgggcggcaccagcagcaccccggtggtgaccag
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gagcctgcgtccgagcagcattagcgaaaccctgagcccgagcaccagcgataacagcaccagccatatgccg
ctgctgaccagcgcgcatccgaccggcggcgaaaacattacccaggtgaccccggcgagcaccagcacccatc
atgtgagcaccagcagcccggcgccgcgtccgggcaccaccagccaggcgagcggcccgggcaacagcag
caccagcaccaaaccgggcgaagtgaacgtgaccaaaggcaccccgccgaaaaacgcgaccagcccgcagg
cgccgagcggccagaaaaccgcggtgccgaccgtgaccagcaccggcggcaaagcgaacagcaccaccgg
cggcaaacataccaccggccatggcgcgcgtaccagcaccgaaccgaccaccgattatggcggcgatagcacc
accccgcgtacccgttataacgcgaccacctatctgccgccgagcaccagcagcaaactgcgtccgcgttggac
ctttaccagcccgccggtgaccaccgcgcaggcgaccgtgccggtgccgccgaccagccagccgcgttttagc
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gtccgggtccgggtgttggagatgattcaggaggtttctcaacaacagtttctacagagcagaatg
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ttccctagagctccattaaattcaaatgctatgttgtccactgagtccatgatgagtagaattg
cagctggagacttggagtcatcagtggatgatcccagatcagaggaggacagaagatttgag;
Claims (5)
1、一种噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,其特征在于它将EB病毒的gp350蛋白用间隔子GPGPG与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白相连接,并共同展示在噬菌体表面组成重组噬菌体疫苗。
2、按权利要求1所述的噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,其特征在于所述EB病毒的gp350蛋白编码序列如下:atggaagcggcgctgctggtgtgccagtataccattcagagcctgattcagctgacccgtgatgatccgggcttttttaacgtggaaattctggaatttccgttttatccggcgtgcaacgtgtgcaccgcggatgtgaacgcgaccattaactttgatgtgggcggcaaaaaacataaactgaacctggattttggcctgctgaccccgcataccaaagcggtgtatcagccgcgtggcgcgtttggcggcagcgaaaacgcgaccaacctgtttctgctggaactgctgggcgcgggcgaactggcgctgaccatgcgtagcaaaaaactgccgattaacattaccaccggcgaagaacagcaggtgagcctggaaagcgtggatgtgtattttcaggatgtgtttggcaccatgtggtgccatcatgcggaaatgcagaacccggtgtatctgattccggaaaccgtgccgtatattaaatgggataactgcaacagcaccaacattaccgcggtggtgcgtgcgcagggcctggatgtgaccctgccgctgagcctgccgaccagcgcgcaggatagcaactttagcgtgaaaaccgaaatgctgggcaacgaaattgatattgaatgcattatggaagatggcgaaattagccaggtgctgccgggcgataacaaatttaacattacctgcagcggctatgaaagccatgtgccgagcggcggcattctgaccagcaccagcccggtggcgaccccgattccgggcaccggctatgcgtatagcctgcgtctgaccccgcgtccggtgagccgttttctgggcaacaacagcattctgtatgtgttttatagcggcaacggcccgaaagcgagcggcggcgattattgcattcagagcaacattgtgtttagcgatgaaattccggcgagccaggatatgccgaccaacaccaccgatattacctatgtgggcgataacgcgacctatagcgtgccgatggtgaccagcgaagatgcgaacagcccgaacgtgaccgtgaccgcgttttgggcgtggccgaacaacaccgaaaccgattttaaatgcaaatggaccctgaccagcggcaccccgagcggctgcgaaaacattagcggcgcgtttgcgagcaaccgtacctttgatattaccgtgagcggcctgggcaccgcgccgaaaaccctgattattacccgtaccgcgaccaacgcgaccaccaccacccataaagtgatttttagcaaagcgccggaaagcaccaccaccagcccgaccctgaacaccaccggctttgcggcgccgaacaccaccaccggcctgccgagcagcacccatgtgccgaccaacctgaccgcgccggcgagcaccggcccgaccgtgagcaccgcggatgtgaccagcccgaccccggcgggcaccaccagcggcgcgagcccggtgaccccgagcccgagcccgcgtgataacggcaccgaaagcaaagcgccggatatgaccagcccgaccagcgcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccccggcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccctgggcaaaaccagcccgaccagcgcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccccggcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccattccgaccctgggcaaaaccagcccgaccagcgcggtgaccaccccgaccccgaacgcgaccagcccgaccgtgggcgaaaccagcccgcaggcgaacaccaccaaccataccctgggcggcaccagcagcaccccggtggtgaccagcccgccgaaaaacgcgaccagcgcggtgaccaccggccagcataacattaccagcagcagcaccagcagcatgagcctgcgtccgagcagcattagcgaaaccctgagcccgagcaccagcgataacagcaccagccatatgccgctgctgaccagcgcgcatccgaccggcggcgaaaacattacccaggtgaccccggcgagcaccagcacccatcatgtgagcaccagcagcccggcgccgcgtccgggcaccaccagccaggcgagcggcccgggcaacagcagcaccagcaccaaaccgggcgaagtgaacgtgaccaaaggcaccccgccgaaaaacgcgaccagcccgcaggcgccgagcggccagaaaaccgcggtgccgaccgtgaccagcaccggcggcaaagcgaacagcaccaccggcggcaaacataccaccggccatggcgcgcgtaccagcaccgaaccgaccaccgattatggcggcgatagcaccaccccgcgtacccgttataacgcgaccacctatctgccgccgagcaccagcagcaaactgcgtccgcgttggacctttaccagcccgccggtgaccaccgcgcaggcgaccgtgccggtgccgccgaccagccagccgcgttttagcaacctgagcatgctggtgctgcagtgggcgagcctggcggtgctgaccctgctgctgctgctggtgatggcggattgcgcgtttcgtcgtaacctgagcaccagccatacctataccaccccgccgtatgatgatgcggaaacctatgtg。
3、按权利要求1所述的噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,其特征在于所述的间隔子GPGPG编码序列为:ggtccgggtccgggt。
4、按权利要求1所述的噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,其特征在于所述外源蛋白是天然或人工合成的编码序列已知的蛋白;蛋白表位是天然或人工合成的蛋白编码序列已知的表位或经理论推测所得的序列已知的表位,且将EB病毒的gp350蛋白用间隔子GPGPG与单独的外源蛋白或蛋白表位连接,或者与多个外源蛋白的组合相连接,或者与多个蛋白表位的组合相连接,或者与外源蛋白及蛋白表位的组合相连接。
5、按权利要求1所述的噬菌体与EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗的构建方法,其特征在于经过下列步骤:
A、将EB病毒的gp350蛋白的编码序列用间隔子GPGPG的编码序列与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白的编码序列相连接,组成融合蛋白编码序列,外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白的编码序列表示为Xgene,表示为EBgp350-间隔子-Xgene;
B、利用现有公知技术将上述融合蛋白编码序列EBgp350-间隔子-Xgene由专门的商业公司在中间载体质粒上合成一段DNA序列,该DNA序列的5’端和3’端含有特定的限制性内切酶的酶切位点,用上述特定的限制性内切酶将上述DNA序列从中间质粒载体上切下后,插入噬菌体载体的多克隆位点相应的酶切位点之间,构建成为重组噬菌体,从而使利用间隔子GPGPG连接的EB病毒的gp350蛋白与其它外源蛋白或蛋白表位或其组合的融合蛋白能够正确展示于重组噬菌体表面,成为新型的噬菌体和EB病毒的gp350蛋白融合载体疫苗。
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