TW201919653A - 用於治療ｂ型肝炎之治療組合物及方法 - Google Patents

用於治療ｂ型肝炎之治療組合物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201919653A
TW201919653A TW107120864A TW107120864A TW201919653A TW 201919653 A TW201919653 A TW 201919653A TW 107120864 A TW107120864 A TW 107120864A TW 107120864 A TW107120864 A TW 107120864A TW 201919653 A TW201919653 A TW 201919653A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
lipid
mol
sirna
peg
ifn
Prior art date
Application number
TW107120864A
Other languages
English (en)
Inventor
安卓亞 庫柯那提
艾美 Ｃ Ｈ 李
柯內里斯 A 瑞恩布蘭德
麥可 J 索非亞
愛蜜莉 P 西
Original Assignee
加拿大商艾爾布圖斯生技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 加拿大商艾爾布圖斯生技公司 filed Critical 加拿大商艾爾布圖斯生技公司
Publication of TW201919653A publication Critical patent/TW201919653A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明提供可用於治療B型肝炎之治療組合及治療方法。

Description

用於治療B型肝炎之治療組合物及方法
B型肝炎病毒(縮寫為「HBV」)為嗜肝性DNA病毒家族之一成員。該病毒粒子(有時稱為病毒體)包括外部脂質包膜及由蛋白質構成之二十面體核蛋白殼核心。該核蛋白殼封住病毒DNA及具有逆轉錄酶活性之DNA聚合酶。外部包膜含有與敏感細胞、通常肝細胞之病毒結合及進入該等細胞有關之包埋蛋白質。除感染性病毒粒子外，在感染個體之血清中可發現缺乏核心之絲狀體及球狀體。此等粒子並非感染性的，且由脂質及成為病毒體表面之一部分的蛋白質構成，該蛋白質稱為表面抗原(HBsAg)且在病毒生命週期期間過多地產生。
雖然HBV之基因組由環狀DNA組成，但其為罕見的，因為DNA並非完整雙鏈。全長鏈之一端連接至病毒DNA聚合酶。該基因組為3020-3320個核苷酸長(對於全長鏈)及1700-2800個核苷酸長(對於較短鏈)。反義鏈(非編碼)與病毒mRNA互補。在細胞感染後不久在核中發現完整雙鏈病毒DNA (共價閉環DAN或者cccDNA)。存在四種已知之由基因組編碼之基因，稱為C、X、P及S。核心蛋白由基因C (HBcAg)編碼，且其起始密碼子在產生前核心蛋白之同框AUG起始密碼子上游之前。HBeAg由前核心蛋白之蛋白水解加工產生。DNA聚合酶由基因P編碼。基因S為編碼表面抗原(HBsAg)之基因。HBsAg基因為一種長開放閱讀框架，但含有三個同框「起始」(ATG)密碼子，該等密碼子將該基因分成三段-S1前、S2前及S。因為該多個起始密碼子，產生具有三種不同尺寸之多肽，稱為大、中等及小。雖然並不完全瞭解由基因X編碼之蛋白質之功能，但其為病毒基因表現所需，且與肝癌顯現有關。HBV之複製為一個複雜過程。雖然複製發生在肝中，但病毒擴散至血液中，在受感染人中在血液中發現病毒蛋白質及針對其之抗體。HBV之結構、複製及生物學在D. Glebe及C.M.Bremer, Seminars in Liver Disease, 第33卷, 第2期, 第103-112頁 (2013)中予以評述。
人類感染HBV可引起肝臟之感染性炎症性疾病。受感染個體可能多年未展現症狀。據估計世界人口的三分之一在其生命中之一個時刻受感染，包括3.5×108 名慢性攜帶者。
病毒藉由暴露於感染血液或體液來傳播。圍產期感染亦可為主要感染途徑。該急性疾病引起肝臟炎症、嘔吐、黃疸及可能死亡。B型慢性肝炎最終可引起肝硬化及肝癌。
雖然大多數感染HBV者經由其免疫系統之作用清除感染，但一些受感染者遭受侵襲性感染過程(暴發型肝炎)；同時其他人慢性感染，從而增加其患上肝病之可能性。雖然當前批准若干藥物治療用於治療HBV感染，但受感染之個體對此等藥物治療之反應的成功程度不同，且此等藥物治療中無一者將病毒自受感染者體內清除。
D型肝炎病毒(HDV)為僅僅可在B型肝炎病毒(HBV)存在下繁殖之小型環狀包膜RNA病毒。詳言之，HDV自身進行繁殖需要HBV表面抗原蛋白。感染HBV與HDV均引起與僅僅感染HBV相比更嚴重的併發症。此等併發症包括在急性感染中經歷肝功能衰竭之可能性更大及快速進展至肝硬化，且在慢性感染中顯現肝癌之可能性增加。與B型肝炎病毒組合，D型肝炎在所有肝炎感染中之死亡率最高。HDV之傳播途徑類似於HBV。感染基本上侷限於處於高風險HBV感染者，尤其注射藥物使用者及接受凝血因子濃縮物者。
因此，仍舊需要用於治療人類HBV感染以及治療人類HBV/HDV感染之組合物及方法。
本發明提供可用於治療諸如HBV及/或HDV之病毒感染的治療組合及治療方法。
因此，本發明之某些實施例提供一種治療人類之B型肝炎之方法，其包括向該人類投與： 1) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 2) 干擾素(IFN)。
本發明之某些實施例亦提供一種治療人類之D型肝炎之方法，其包括向該人類投與： 1) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 2) 干擾素(IFN)。
本發明之某些實施例提供一種脂質奈米粒子調配物，其與干擾素組合用於預防性或治療性治療B型肝炎，其中該脂質奈米粒子調配物包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)。
本發明之某些實施例提供一種脂質奈米粒子調配物之用途，其與干擾素(IFN)組合用於製備供治療人類之B型肝炎用之藥劑，其中該脂質奈米粒子調配物包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)。
本發明之某些實施例提供一種組合物，其包含：(a) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 (b) 干擾素。
本發明之某些實施例提供一種套組，其包含： (a) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)； (b) 干擾素；及 (c) 關於該脂質奈米粒子調配物及該干擾素同時、相繼或分開投與之說明書。
本發明之某些實施例提供一種治療人類之B型肝炎及/或D型肝炎之方法，其包括向該人類投與： 1) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 2) 干擾素(IFN)。
本文所述之脂質奈米粒子調配物包括囊封在脂質粒子內之siRNA (亦即siRNA 1、siRNA 2及siRNA 3)之混合物。在某些實施例中，不同siRNA分子共同囊封在相同脂質粒子中。在某些實施例中，混合物中存在之各類siRNA物質囊封在其自身粒子中。在某些實施例中，一些siRNA物質共同囊封在相同粒子中，而其他siRNA物質囊封在不同粒子中。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物進一步包含陽離子脂質及非陽離子脂質。因此，在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物包含脂質奈米粒子群體，其中各脂質奈米粒子包含陽離子脂質、非陽離子脂質及至少一種選自siRNA 1、siRNA 2及siRNA 3之siRNA分子。在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物包含脂質奈米粒子群體，其中各脂質奈米粒子包含陽離子脂質、非陽離子脂質、siRNA 1、siRNA 2及siRNA 3。
在某些實施例中，該陽離子脂質係選自由以下組成之群：1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15 ))、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA；化合物(8 ))、4-(二甲基胺基)丁酸)(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(化合物(7 ))、5-(二甲基胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13 ))、其鹽及其混合物。
在某些實施例中，該陽離子脂質為：或其鹽。
在某些實施例中，該非陽離子脂質為膽固醇或其衍生物。
在某些實施例中，該非陽離子脂質為磷脂。
在某些實施例中，該非陽離子脂質為磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物。
在某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及其混合物。
在某些實施例中，該磷脂為DSPC。
在某些實施例中，該脂質奈米粒子調配物進一步包含抑制粒子聚集之結合脂質。
在某些實施例中，該抑制粒子聚集之結合脂質為聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。
在某些實施例中，該PEG-脂質結合物係選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(PEG-DMA)結合物及其混合物。
在某些實施例中，該PEG-脂質結合物為PEG-C-DMA結合物。
如本文所述，脂質奈米粒子調配物包含脂質奈米粒子群體。在某些實施例中，該陽離子脂質一般佔每個粒子中存在之總脂質之約48 mol%至約62 mol%。在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物包含磷脂及膽固醇或膽固醇衍生物，其中該磷脂一般佔每個粒子中存在之總脂質之約7 mol%至約17 mol%，且該膽固醇或其衍生物一般佔每個粒子中存在之總脂質之約25 mol%至約40 mol%。在某些實施例中，該抑制粒子聚集之結合脂質一般佔每個粒子中存在之總脂質之約0.5 mol%至約3 mol%。
干擾素(IFN)為一組由宿主細胞響應於諸如病毒、細菌及寄生蟲之某些病原體之存在以及腫瘤細胞之存在而製造及釋放的信號傳導蛋白。已在包括人類之動物中鑑別出超過二十種不同的IFN基因及蛋白質。此類干擾素可用於執行所主張之發明。在某些實施例中，IFN為IFN α(IFN-α)、 IFN β (IFN-β)或IFN λ (IFN-λ)。在某些實施例中，IFN經聚乙二醇化。在某些實施例中，IFN為IFN-α。在某些實施例中，IFN-α為聚乙二醇化IFN-α2a或聚乙二醇化IFN-α2b。在某些實施例中，IFN為IFN-β。在某些實施例中，IFN-β為聚乙二醇化IFN-β (例如TRK-560；Toray Industries)。在某些實施例中，IFN為IFN λ (IFN-λ)。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物經由注射投與。
在某些實施例中，IFN經由注射投與。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及IFN分開投與。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及IFN相繼投與。
在某些實施例中，首先投與脂質奈米粒子調配物且接著投與IFN。
在某些實施例中，首先投與IFN且接著投與脂質奈米粒子調配物。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及IFN同時投與。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及/或IFN投與兩次或更多次。
在某些實施例中，向人類投與包含脂質奈米粒子調配物、IFN及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在某些實施例中，本發明之方法進一步包括投與至少一種額外治療劑。
在某些實施例中，該至少一種額外治療劑係選自由以下組成之群： (A) 控制病毒複製之藥劑； (B) 降低病毒Ag之藥劑； (C) 免疫增強劑；及 (D) 免疫刺激劑。
此等類別之額外治療劑如下進一步描述為I、II及III類藥劑。
本發明之某些實施例提供一種脂質奈米粒子調配物，其與干擾素組合用於預防性或治療性治療B型肝炎，其中該脂質奈米粒子調配物包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)。
如本文所用，術語「組合」係指脂質奈米粒子調配物及干擾素同時或相繼使用，以及包含脂質奈米粒子調配物及干擾素之組合物。
本發明之某些實施例提供脂質奈米粒子調配物之用途，其與干擾素(IFN)組合用於製備供治療人類之B型肝炎用之藥劑，其中該脂質奈米粒子調配物包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)。
本發明之某些實施例提供一種組合物，其包含：(a) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 (b) 干擾素。
在某些實施例中，組合物為進一步包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在某些實施例中，該組合物進一步包含至少一種額外治療劑(例如本文中論述之I、II及/或III類藥劑)。
本發明之某些實施例提供一種套組，其包含： (a) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)； (b) 干擾素；及 (c) 關於該脂質奈米粒子調配物及該干擾素同時、相繼或分開投與之說明書。
在某些實施例中，該套組進一步包含至少一種額外治療劑(例如本文中論述之I、II及/或III類藥劑)。I. 控制病毒複製之藥劑
I類治療係針對控制、例如抑制病毒複製之藥劑的用途。 A. 逆轉錄酶抑制劑
在某些實施例中，逆轉錄酶抑制劑為核苷類似物。
在某些實施例中，逆轉錄酶抑制劑為核苷類似物逆轉錄酶抑制劑(NARTI或NRTI)。
在某些實施例中，逆轉錄酶抑制劑為核苷酸類似物逆轉錄酶抑制劑(NtARTI或NtRTI)。
術語逆轉錄酶抑制劑包括(但不限於)恩替卡韋(entecavir)、克拉夫定(clevudine)、替比夫定(telbivudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(adefovir)及替諾福韋(tenofovir)、替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil)、替諾福韋艾拉酚胺(tenofovir alafenamide)、反丁烯二酸替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate)、阿德福韋二匹伏酯(adefovir dipivoxil)、(1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥甲基)-4-亞甲基環戊-1-醇(美國專利第8,816,074號中描述)、恩曲他濱(emtricitabine)、阿巴卡韋(abacavir)、艾夫他濱(elvucitabine)、更昔洛韋(ganciclovir)、洛布卡韋(lobucavir)、泛昔洛韋(famciclovir)、噴昔洛韋(penciclovir)、胺多索韋(amdoxovir)及CMX157 (替諾福韋艾力德斯(tenofovir exalidex))。
術語逆轉錄酶抑制劑包括(但不限於)恩替卡韋、拉米夫定及((1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥甲基)-4-亞甲基環戊-1-醇)。
術語逆轉錄酶抑制劑包括(但不限於)以上提及之逆轉錄酶抑制劑的共價結合之胺基磷酸酯部分或胺基膦酸酯部分，或如例如美國專利第8,816,074號、US 2011/0245484 A1及US 2008/0286230A1中所述。
術語逆轉錄酶抑制劑包括(但不限於)包含胺基磷酸酯部分之核苷酸類似物，諸如((((1R,3R,4R,5R)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-羥基-2-甲基環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯及((((1R,2R,3R,4R)-3-氟-2-羥基-5-亞甲基-4-(6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯。亦包括其個別非對映異構體，包括例如((R)-(((1R,3R,4R,5R)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-羥基-2-甲基環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯及((S)-(((1R,3R,4R,5R)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-羥基-2-甲基環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯。
術語逆轉錄酶抑制劑包括(但不限於)胺基膦酸酯部分，諸如替諾福韋艾拉酚胺以及US 2008/0286230 A1中所述之逆轉錄酶抑制劑。用於製備含有立體選擇性胺基磷酸酯或胺基膦酸酯之活性劑的方法描述於例如美國專利第8,816,074號以及US 2011/0245484 A1及US 2008/0286230 A1。 B. 衣殼抑制劑
如本文所述，術語「衣殼抑制劑」包括能夠直接或間接抑制衣殼蛋白之表現及/或功能的化合物。舉例而言，衣殼抑制劑可包括(但不限於)抑制衣殼組裝、誘發非衣殼聚合物形成、促進過度衣殼組裝或方向錯誤之衣殼組裝、影響衣殼穩定及/或抑制RNA用殼體包裹的任何化合物。衣殼抑制劑亦包括抑制複製過程內之下游事件(例如病毒DNA合成、松環DAN (rcDNA)輸送至核、共價閉環DAN (cccDNA)形成、病毒成熟、出芽及/或釋放及其類似事件)中之衣殼功能的任何化合物。舉例而言，在某些實施例中，如例如使用本文所述之分析所量測，抑制劑可偵測地抑制衣殼蛋白之表現水準或生物活性。在某些實施例中，抑制劑抑制rcDNA及病毒生命週期之下游產物之水準達至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少90%、至少95%或至少99%。
術語衣殼抑制劑包括國際專利申請公開案第WO2013006394號、第WO2014106019號及第WO2014089296號中所述之化合物，包括以下化合物：。
術語衣殼抑制劑亦包括化合物Bay-41-4109 (參見國際專利申請公開案第WO/2013/144129號)、AT-61 (參見國際專利申請公開案第WO/1998/33501號；及King, RW等人, Antimicrob Agents Chemother.,1998 , 42, 12, 3179-3186)、DVR-01 及DVR-23 (參見國際專利申請公開案第WO 2013/006394號；及Campagna, MR等人, J. of Virology, 2013, 87, 12, 6931及其醫藥學上可接受之鹽：。
術語衣殼抑制劑亦包括化合物3、GLS-4及NVR 3-778該等化合物。 C. cccDNA 形成抑制劑
共價閉環DAN (cccDNA)在來自病毒rcDNA之細胞核中產生且用作病毒mRNA之轉錄模板。如本文所述，術語「cccDNA形成抑制劑」包括能夠直接或間接抑制cccDNA形成及/或穩定性之化合物。舉例而言，cccDNA形成抑制劑可包括(但不限於)抑制衣殼拆解、rcDNA進入核及/或rcDNA轉變成cccDNA之任何化合物。舉例而言，在某些實施例中，如例如使用本文所述之分析所量測，抑制劑可偵測地抑制cccDNA之形成及/或穩定性。在某些實施例中，抑制劑抑制cccDNA之形成及/或穩定性達至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%或至少90%。
術語cccDNA形成抑制劑包括國際專利申請公開案第WO2013130703號中所述之化合物，包括以下化合物：。
術語cccDNA形成抑制劑包括(但不限於)美國專利申請公開案第US 2015/0038515 A1號中一般及特別描述之cccDNA形成抑制劑。術語cccDNA形成抑制劑包括(但不限於) 1-(苯基磺醯基)-N-(吡啶基-4-基甲基)-1H-吲哚-2-甲醯胺；1-苯磺醯基-吡咯啶-2-甲酸(吡啶基-4-基甲基)-醯胺；2-(2-氯-N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基甲基)乙醯胺；2-(4-氯-N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-4-甲氧基苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(哌啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基甲基)丙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-3-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(嘧啶-5-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(嘧啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(5-氯-2-氟苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基甲基)乙醯胺；2-[(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-(4-氟-苯磺醯基)-胺基]-N-吡啶基-4-基甲基-乙醯胺；2-[(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-(甲苯-4-磺醯基)-胺基]-N-吡啶基-4-基甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-溴-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶基-4-基甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-(2-甲基-苯并噻唑-5-基)-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯甲基]-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯甲基]-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-苯甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶基-4-基甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶基-4-基甲基-丙醯胺；2-[苯磺醯基-(2-氟-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶基-4-基甲基-乙醯胺；4 (N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶基-4-基-甲基)丁醯胺；氯化4-((2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-乙醯胺基)-甲基)-1,1-二甲基哌啶-1-鎓；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-苯甲醯胺；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-(2-甲基-1H-吲哚-5-基)-苯甲醯胺；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-(2-甲基-1H-吲哚-5-基)-苯甲醯胺；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-(2-甲基-苯并噻唑-5-基)-苯甲醯胺；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-(2-甲基-苯并噻唑-6-基)-苯甲醯胺；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-(2-甲基-苯并噻唑-6-基)-苯甲醯胺；4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-N-吡啶基-4-基甲基-苯甲醯胺；N-(2-胺基乙基)-2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-乙醯胺；N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-N-(2-(3,4-二氫-2,6-萘啶-2(1H)-基)-2-側氧基乙基)苯磺醯胺；N-苯并噻唑-6-基-4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-苯甲醯胺；N-苯并噻唑-6-基-4-(苯甲基-甲基-胺磺醯基)-苯甲醯胺；(2-(2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)乙醯胺基)-乙基)胺基甲酸第三丁酯；及4-((2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-乙醯胺基)-甲基)哌啶-1-甲酸第三丁酯及視情況其組合。 D. 進入抑制劑
本發明之某些實施例係針對作為HBV進入抑制劑之藥劑的用途。進入抑制劑包括Myrcludex-B、NTCP抑制劑小分子及FXR促效劑EYP001 (參見例如Gripon, P., Cannie, I.及Urban, S. Efficient Inhibition of Hepatitis B Virus Infection by Acylated Peptides Derived from the Large Viral Surface Protein. Journal of Virology, 79(3): 1613-1622；Volz, T., Allweiss, L., MBarek, M., Warlich, M., Lohse, A., Pollok, J., Alexandrov, A., Urban, S., Petersen, J., Lutgehetmann, M., Dandri, M. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology, 58(5): 861-867；Radreau, P., Procherot, M., Vonderscher, J., Lotteau, V., Andre, P. Effect of a novel synthetic FXR agonist EYP001 on hepatitis B virus replication in HepaRG cell line and primary human hepatocytes. AASLD LiverLearning, Abstract 1652, 2015年11月16日；WO 2015/036442；WO 00/37077；US2007/0015796)。舉例而言，B型肝炎病毒使用其表面脂肽前S1經由其鈉/膽汁酸協同轉運蛋白(NTCP)與成熟肝細胞對接且隨後進入細胞。Myrcludex B為亦可與NTCP對接，阻斷病毒之進入機制之合成N-醯化前S1。II. 降低病毒 Ag 之藥劑
II類治療係針對降低病毒抗原之藥劑的用途。A. 寡聚核苷酸
寡聚核苷酸可經設計以靶向HBV基因組之一或多個基因及/或轉錄體。此類siRNA分子之實例為實例1中所闡述之siRNA分子。
術語靶向B型肝炎基因組之寡聚核苷酸包括Arrowhead-ARC-520 (參見美國專利第8,809,293號；及Wooddell CI等人,Molecular Therapy, 2013 ,21, 5, 973-985)。
術語靶向B型肝炎基因組之寡聚核苷酸亦包括經分離之雙鏈siRNA分子，其各包括有義鏈及與有義鏈雜交之反義鏈。siRNA靶向HBV基因組之一或多個基因及/或轉錄體。
在另一個態樣中，此術語包括靶向GalNAc之siRNA分子及REP 2139、REP-2165 (參見例如WO 2016/077321；Al-Mathtab等人, PLoS ONE 11(6):e0156667. doi:10.1371/journal.pone.0156667；及Guillot等人, Poster P0556, EASL, 2015)。B. sAg 分泌抑制劑
如本文所述，術語「sAg分泌抑制劑」包括能夠直接或間接抑制載有來自HBV感染細胞之亞病毒粒子及/或含DNA之病毒粒子的sAg (S、M及/或L表面抗原)分泌之化合物。舉例而言，在某些實施例中，如例如使用此項技術中已知或本文所述之分析，例如ELISA分析或藉由西方墨點法所量測，抑制劑可偵測地抑制sAg之分泌。在某些實施例中，抑制劑抑制sAg之分泌達至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%或至少90%。在某些實施例中，抑制劑使患者中sAg之血清水準減少至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%或至少90%。
術語sAg分泌抑制劑包括美國專利第8,921,381號中所述之化合物，以及美國專利申請公開案第2015/0087659及2013/0303552號中所述之化合物。舉例而言，術語包括化合物PBHBV-001及PBHBV-2-15及其醫藥學上可接受之鹽：。 C. 抗 HBsAg 藥劑
本發明之某些態樣係針對抗HBsAg抗體，例如mAb之用途。本發明之某些態樣係針對B型肝炎免疫球蛋白(HBIG)之用途。III. 提高免疫反應之藥劑
III類治療係針對提高針對病毒感染之免疫反應之藥劑的用途。在某些實施例中，至少一種『免疫增強劑』與至少一種『免疫刺激劑』組合使用。此類組合可用於與至少一種控制病毒複製之藥劑及/或至少一種降低病毒抗原之藥劑進一步組合。 A. 免疫增強劑
本發明之某些態樣係針對用於藉由例如使用檢查點抑制劑減少或消除免疫耗盡，從而提高免疫反應來提高免疫反應之藥劑的用途。
在某些實施例中，免疫增強劑為PD-L1抑制劑。PD-L1抑制劑為一組用於抑製程式化死亡-配位體1 (PD-L1)與其受體程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1)締合之藥劑。
免疫增強劑包括以下： 抗PD-1 mAb (例如納武單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab))； 抗PD-L1 mAb (例如阿特珠單抗(Atezolizumab)、阿利庫單抗(Avelumab))； 抗PD-L2 mAb； 抗CTLA4 mAb (例如伊匹單抗(Ipilimumab)) ； 抗VISTA mAb (例如JNJ-61610588)； 抗LAG3 mAb (例如BMS-986016)； 抗TIM3 mAb (例如TSR-022)； 肽模擬物(例如AUNP-12)；及 小分子化合物(參見例如Zak等人, Oncotarget, 2016, 7(21):30323-35) B. 免疫刺激劑
術語「免疫刺激劑」包括能夠調節免疫反應(例如刺激先天及/或適應性免疫反應(例如佐劑))之化合物。術語免疫刺激劑包括聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)及干擾素。
術語免疫刺激劑包括IFN基因刺激蛋白(STING)及介白素之促效劑。該術語亦包括HBsAg釋放抑制劑、TLR-7促效劑(GS-9620、RG-7795)、T細胞及/或B細胞刺激劑(GS-4774、OX-40促效劑(BMS 986178)、抗GITR促效劑(BMS-986156))、RIG-1抑制劑(SB-9200)及SMAC-模擬物(Birinapant)。
該術語亦包括以下： 抗HBV疫苗(Engerix-B、RECOMBIVAX HB、GS-4744、Heplisav-B)； 干擾素(聚乙二醇化IFN-α2a、聚乙二醇化IFN-α2b、IFN-α、IFN-λ)； RIG-I促效劑(SB-9200)； STING促效劑(cGAMP、cGAMP雙硫代磷酸酯、ADU S100及其他小分子化合物)； TLR9促效劑(CYT-009、CpG二核苷酸)； TLR7促效劑(GS-9620)； TLR8促效劑(GS-9688)； TLR3促效劑(Ampligen/聚I:C12U)； IL-7 (CYT107)；及 IL-2 (阿地白介素(aldesleukin))。
術語「B型肝炎病毒」(縮寫為HBV)係指嗜肝DNA病毒屬之病毒物種，其為病毒之肝DNA病毒家族之一部分且能夠在人類中引起肝臟炎症。
術語「D型肝炎病毒」(縮寫為HDV)係指δ病毒屬之病毒物種，其為能夠在人類中引起肝臟炎症。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變體，諸如「治療(treat或treating)」係指試圖改變所治療之個體之典型疾病過程的臨床介入。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩和症狀、減少疾病之任何直接或間接病理結果、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病病況及症狀緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
如本文所用之術語「小干擾RNA」或「siRNA」係指當siRNA處於與標靶基因或序列相同之細胞中時能夠減少或抑制標靶基因或序列之表現(例如藉由介導與siRNA序列互補之mRNA降解或抑制其轉譯)的雙鏈RNA (亦即雙鏈RNA)。siRNA可與標靶基因或序列基本上或完全一致，或可包含錯配區(亦即錯配基元)。在某些實施例中，siRNA可為約19-25 (雙鏈)個核苷酸長，且較佳約20-24、21-22或21-23 (雙鏈)個核苷酸長。siRNA雙鏈體可包含具有約1至約4個核苷酸或約2至約3個核苷酸之3'懸垂物及5'磷酸末端。siRNA之實例包括不限於由兩個單獨鏈分子組裝之雙鏈多核苷酸分子，其中一鏈為有義鏈且另一鏈為互補反義鏈。
較佳地，siRNA以化學方式合成。siRNA亦可藉由用大腸桿菌核糖核酸酶III或Dicer使更長dsRNA (超過約25個核苷酸長之dsRNA)裂解而產生。此等酶將dsRNA加工成生物活性siRNA (參見例如Yang等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002)；Calegari等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002)；Byrom等人,Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003)；Kawasaki等人,Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003)；Knight等人,Science, 293:2269-2271 (2001)；及Robertson等人,J. Biol. Chem., 243:82 (1968))。較佳地，dsRNA為至少50個核苷酸至約100個、200個、300個、400個或500個核苷酸長。dsRNA可長達1000個、1500個、2000個、5000個核苷酸，或更長。dsRNA可編碼整個基因轉錄體或部分基因轉錄體。在某些情況下，siRNA可藉由質體編碼(例如轉錄為自動摺疊成具有髮夾環之雙鏈體之序列)。
短語「抑制標靶基因之表現」係指siRNA使標靶基因(例如HBV基因組內之基因)沉默、減少或抑制其表現之能力。為檢查基因沉默之程度，使測試樣品(例如來自表現標靶基因之所關注之生物體的生物樣品或表現標靶基因之培養細胞之樣品)與使標靶基因沉默、減少或抑制其表現之siRNA接觸。將測試樣品中標靶基因之表現與未與siRNA接觸之對照樣品(例如來自表現標靶基因之所關注之生物體的生物樣品或表現標靶基因之培養細胞之樣品)中標靶基因之表現相比。對照樣品(例如表現標靶基因之樣品)可分配100%之值。在特定實施例中，當相對於對照樣品(例如僅僅緩衝液、靶向不同基因之siRNA序列、加擾siRNA序列等)測試樣品之值為約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%時，實現標靶基因之沉默、表現抑制或減少。合適分析包括不限於使用熟習此項技術者已知之技術，諸如斑點墨點法、北方墨點法、原位雜交、ELISA、免疫沈澱、酶功能以及熟習此項技術者已知之表型分析檢查蛋白質或mRNA水準。諸如siRNA之治療性核酸之「有效量」或「治療有效量」為足以產生所需作用，例如與在缺乏siRNA下所偵測之正常表現水準相比標靶序列之表現抑制的量。在特定實施例中，當相對於對照(例如僅僅緩衝液、靶向不同基因之siRNA序列、加擾siRNA序列等)在siRNA下獲得之值為約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%時，實現標靶基因或標靶序列之表現抑制。用於量測標靶基因或標靶序列之表現之合適分析包括(但不限於)使用熟習此項技術者已知之技術，諸如斑點墨點法、北方墨點法、原位雜交、ELISA、免疫沈澱、酶功能以及熟習此項技術者已知之表型分析檢查蛋白質或mRNA水準。
如本文所用之術語「核酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之含有至少兩個核苷酸(亦即去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合物且包括DNA及RNA。「核苷酸」含有糖去氧核醣(DNA)或核糖(RNA)、鹼基及磷酸基。核苷酸經由磷酸基連接在一起。「鹼基」包括嘌呤及嘧啶，其進一步包括天然產化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷及天然類似物，及嘌呤及嘧啶之合成衍生物，該等衍生物包括(但不限於)置放新反應基團，諸如但不限於胺、醇、硫醇、羧酸酯基及烷基鹵之修飾。核酸包括含有已知核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵的核酸，其為合成、天然存在及非天然存在的，且具有與參考核酸類似之結合性質。此類類似物及/或經修飾之殘基之實例包括不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸及肽-核酸(PNA)。另外，核酸可包括一或多個UNA部分。
術語「核酸」包括任何寡核苷酸或多核苷酸，其中含有至多60個核苷酸之片段一般稱為寡核苷酸，且更長片段稱為多核苷酸。去氧核糖寡核苷酸由稱為去氧核醣之5碳糖在此糖之5'及3'碳與磷酸基共價接合組成以形成交替的未分支聚合物。DNA可呈例如反義分子、質體DNA、預縮合DNA、PCR產物、載體、表現卡閘、嵌合序列、染色體DNA或此等組之衍生物及組合的形式。核糖寡核苷酸由類似重複結構組成，其中5碳糖為核糖。RNA可呈例如小干擾RNA (siRNA)、Dicer-受質dsRNA、小髮夾RNA (shRNA)、不對稱之干擾RNA (aiRNA)、微RNA (miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA (vRNA)及其組合的形式。因此，術語「多核苷酸」及「寡核苷酸」係指由天然存在的鹼基、糖及糖間(主鏈)鍵組成的核苷酸或核苷單體之聚合物或寡聚物。術語「多核苷酸」及「寡核苷酸」亦包括類似地發揮功能的包含非天然存在之單體的聚合物或寡聚物或其部分。由於諸如細胞吸收提高、免疫原性降低及在核酸酶存在下穩定性增加之性質，此類經修飾或取代之寡核苷酸常常比天然形式更佳。
除非另外指示，否則特定核酸序列亦暗中涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。具體而言，簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來實現(Batzer等人,Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人,J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985)；Rossolini等人,Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994))。
「經分離」或「純化」之DNA分子或RNA分子為離開其天然環境存在之DNA分子或RNA分子。經分離之DNA分子或RNA分子可呈純化形式存在或可存在於諸如轉殖基因宿主細胞之非天然環境中。舉例而言，「經分離」或「純化」之核酸分子或其生物活性部分基本上不含其他細胞物質，或當藉由重組技術產生時基本上不含培養基，或當以化學方式合成時基本上不含化學前驅物或其他化學物質。在一個實施例中，「經分離」之核酸不含在核酸所源自之生物體之基因組DNA中天然側接核酸的序列(亦即位於核酸之5'及3'末端之序列)。舉例而言，在多個實施例中，經分離之核酸分子可含有少於約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb之在核酸所源自之細胞之基因組DNA中天然側接核酸分子之核苷酸序列。
術語「基因」係指包含為產生多肽或前驅多肽所必需之部分長度或整個長度編碼序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。
如本文所用之「基因產物」係指基因之產物，諸如RNA轉錄物或多肽。
術語「解鎖核鹼基類似物」(縮寫為「UNA」)係指非環狀核鹼基，其中核糖環之C2'及C3'原子並非共價連接。術語「解鎖核鹼基類似物」包括具有以下鑑別為結構A之結構的核鹼基類似物： 結構A其中R為羥基，且鹼基為任何天然或非天然鹼基，諸如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)及胸腺嘧啶(T)。UNA包括在美國專利序號8,314,227中鑑別為非環狀2'-3'-開環-核苷酸單體之分子。
術語「脂質」係指包括(但不限於)脂肪酸酯且特徵在於不溶於水但可溶於許多有機溶劑之一組有機化合物。其通常分成至少三個類別：(1)「單純脂質」，其包括脂肪及油類以及蠟；(2)「複合脂質」，其包括磷脂及糖脂；及(3)「衍生脂質」，諸如類固醇。
術語「脂質粒子」包括可用於遞送治療性核酸(例如siRNA)至所關注之標靶位點(例如細胞、組織、器官及其類似物)的脂質調配物。在較佳實施例中，脂質粒子通常由陽離子脂質、非陽離子脂質及視情況預防粒子聚集之結合脂質形成。包括核酸分子(例如siRNA分子)之脂質粒子稱為核酸-脂質粒子。通常，核酸完全囊封在脂質粒子內，從而使核酸避免經酶降解。
在某些情況下，核酸-脂質粒子非常適用於全身應用，因為其在靜脈內(i.v.)注射後可展現長循環壽命，所以其可累積在遠端部位(例如與投與部位物理分離之部位)，且其可在此等遠端部位介導標靶基因表現之沉默。核酸可與縮合劑複合，且囊封在脂質粒子內，如PCT公開案第WO 00/03683號中所闡述，該公開案之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
脂質粒子通常具有約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm之平均直徑，且基本上無毒。另外，核酸在存在於脂質粒子中時，在水溶液中抗核酸酶降解。核酸-脂質粒子及其製備方法揭示於例如美國專利公開案第20040142025號及第20070042031號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
如本文所用，「囊封脂質」可指為治療性核酸、諸如siRNA提供完全囊封、部分囊封或兩者之脂質粒子。在一較佳實施例中，核酸(例如siRNA)完全囊封在脂質粒子中(例如以形成核酸-脂質粒子)。
術語「脂質結合物」係指抑制脂質粒子聚集之結合脂質。此類脂質結合物包括(但不限於) PEG-脂質結合物，諸如與二烷氧基丙基偶合之PEG (例如PEG-DAA結合物)、與二醯基甘油偶合之PEG (例如PEG-DAG結合物)、與膽固醇偶合之PEG、與磷脂醯乙醇胺偶合之PEG及與神經醯胺偶合之PEG (參見例如美國專利第5,885,613號)、陽離子型PEG脂質、聚噁唑啉(POZ) -脂質結合物(例如POZ-DAA結合物)、聚醯胺寡聚物(例如ATTA-脂質結合物)及其混合物。POZ-脂質結合物之額外實例描述於PCT公開案第WO 2010/006282號中。PEG或POZ可直接結合於脂質或可經由連接子部分連接於脂質。可使用適合於將PEG或POZ與脂質偶合之任何連接子部分，例如不含酯之連接子部分及含酯之連接子部分。在某些較佳實施例中，使用不含酯之連接子部分，諸如醯胺或胺基甲酸酯。
術語「兩性脂質」部分係指其中脂質物質之疏水性部分定向至疏水性相，而親水性部分定向至水相之任何合適物質。親水性特徵源自諸如碳水化合物、磷酸酯、羧基、硫酸根基、胺基、巰基、硝基、羥基及其他類似基團之極性或帶電基團的存在。可藉由包括非極性基團賦予疏水性，該等非極性的基團包括(但不限於)長鏈飽和及不飽和脂肪烴基及經一或多個芳族、環脂族或雜環基團取代之此類基團。兩性化合物之實例包括(但不限於)磷脂、胺基脂及鞘脂。
磷脂之代表性實例包括(但不限於)磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼及二亞油醯基磷脂醯膽鹼。缺乏磷之其他化合物，諸如鞘脂、鞘糖脂家族、二醯基甘油及β-醯氧基酸，亦在稱為兩性脂質之組內。另外，上述兩性脂質可與包括甘油三酯及固醇之其他脂質混合。
術語「中性脂質」係指在所選pH值下呈不帶電或中性兩性離子形式存在的許多脂質物質中之任一者。在生理pH值下，此類脂質包括例如二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂及二醯基甘油。
術語「非陽離子脂質」係指任何兩性脂質以及任何其他中性脂質或陰離子脂質。
術語「陰離子脂質」係指在生理pH值下帶負電之任何脂質。此等脂質包括(但不限於)磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、N-十二烷醯基磷脂醯乙醇胺、N-丁二醯基磷脂醯乙醇胺、N‑-戊二醯基磷脂醯乙醇胺、離胺醯基磷脂醯甘油、棕櫚醯基油醯基磷脂醯甘油(POPG)及與中性脂質接合之其他陰離子型改質基團。
術語「疏水性脂質」係指具有非極性基團之化合物，該等非極性基團包括(但不限於)長鏈飽和及不飽和脂肪烴基及視情況經一或多個芳族、環脂族或雜環任選取代之此類基團。合適實例包括(但不限於)：二醯基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基胺基、1,2-二醯氧基-3-胺基丙烷及1,2-二烷基-3-胺基丙烷。
術語「陽離子脂質」及「胺基脂質」在本文中可互換使用以包括具有一個、兩個、三個或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈及pH可滴定之胺基頭基(例如烷基胺基或二烷基胺基頭基)之彼等脂質及其鹽。陽離子脂質通常在低於陽離子脂質之pKa 的pH值下經質子化(亦即帶正電)，卻在超過pKa 之pH值基本上中性。陽離子脂質亦可稱為可滴定之陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質包含：可質子化之三級胺(例如pH可滴定)頭基；C18 烷基鏈，其中各烷基鏈獨立地具有0至3 (例如0、1、2或3)個雙鍵；及在頭基與烷基鏈之間的醚、酯或縮酮鍵。此類陽離子脂質包括(但不限於) DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA (亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2及C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA (亦稱為MC2)及DLin-M-C3-DMA (亦稱為MC3)。
投與呈醫藥學上可接受之酸或鹼之鹽形式的化合物可為適當的。醫藥學上可接受之鹽之實例為用形成生理學上可接受之陰離子之酸形成的有機酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽及α-甘油磷酸鹽。亦可形成合適無機鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽及碳酸鹽。
可使用此項技術中熟知之標準程序，例如藉由使諸如胺之足夠鹼性化合物與合適酸反應，得到生理學上可接受之陰離子來獲得醫藥學上可接受之鹽。亦可製備羧酸之鹼金屬(例如鈉、鉀或鋰)或鹼土金屬(例如鈣)鹽。
術語「鹽」包括任何陰離子及陽離子錯合物，諸如在陽離子脂質與一或多個陰離子之間形成的錯合物。陰離子之非限制性實例包括無機及有機陰離子，例如氫離子、氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、草酸根(例如半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氫根、二氫磷酸根、氧化物、碳酸根、碳酸氫根、硝酸根、亞硝酸根、氮化物、亞硫酸氫根、硫化物、亞硫酸根、硫酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氫根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、檸檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、反丁烯二酸根、順丁烯二酸根、衣康酸根、羥乙酸根、葡糖酸根、蘋果酸根、扁桃酸根、惕各酸根、抗壞血酸根、水楊酸根、聚甲基丙烯酸根、過氯酸根、氯酸根、亞氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亞砷酸根、鉻酸根、重鉻酸根、氰化物、氰酸根、硫氰酸根、氫氧化物、過氧化物、過錳酸根及其混合物。在特定實施例中，本文揭示之陽離子脂質之鹽為結晶鹽。
術語「烷基」包括含有1至24個碳原子之非環狀或環狀之直鏈或支鏈飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基包括(但不限於)甲基、乙基、正-丙基、正丁基、正戊基、正己基及其類似基團，而飽和支鏈烷基包括不限於異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基及其類似基團。代表性飽和環狀烷基包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環己基及其類似基團，而不飽和環狀烷基包括不限於環戊烯基、環己烯基及其類似基團。
術語「烯基」包括在相鄰碳原子之間含有至少一個雙鍵之如上定義之烷基。烯基包括順式與反式異構體。代表性直鏈及支鏈烯基包括(但不限於)乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基及其類似基團。
術語「炔基」包括在相鄰碳之間另外含有至少一個參鍵的如上定義之任何烷基或烯基。代表性直鏈及支鏈炔基包括不限於乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基及其類似基團。
術語「醯基」包括其中在連接點處之碳經如下定義之側氧基取代之任何烷基、烯基或炔基。以下為醯基之非限制性實例：-C(=O)烷基、-C(=O)烯基及-C(=O)炔基。
術語「雜環」包括5至7員單環或7至10員雙環雜環，其為飽和、不飽和或芳族，且含有1或2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子，且其中氮及硫雜原子可視情況經氧化，且氮雜原子可視情況四級銨化，包括以上雜環中之任一個與苯環稠合之雙環。雜環可經由任何雜原子或碳原子連接。雜環包括(但不限於)如下定義之雜芳基以及嗎啉基、吡咯啶酮基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、乙內醯脲基、戊內醯胺基、環氧乙烷基、環氧丙烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫硫哌喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫硫哌喃基及其類似基團。
術語「視情況經取代之烷基」、「視情況經取代之烯基」、「視情況經取代之炔基」、「視情況經取代之醯基」及「視情況經取代之雜環」意謂當取代時至少一個氫原子經取代基置換。在側氧基取代基(= O)之情況下，置換兩個氫原子。關於此，取代基包括(但不限於)側氧基、鹵素、雜環、-CN、-ORx 、-NRx Ry 、-NRx C(=O)Ry 、-NRx SO2 Ry 、-C(=O)Rx 、-C(=O)ORx 、-C(=O)NRx Ry 、-SOn Rx 及-SOn NRx Ry ，其中n為0、1或2，Rx 及Ry 相同或不同且獨立地為氫、烷基或雜環，且烷基及雜環取代基中之每一者可進一步經以下中之一或多個取代：側氧基、鹵素、-OH、-CN、烷基、-ORx 、雜環、-NRx Ry 、-NRx C(=O)Ry 、-NRx SO2 Ry 、-C(=O)Rx 、-C(=O)ORx 、-C(=O)NRx Ry 、-SOn Rx 及-SOn NRx Ry 。術語「視情況經取代」在用於一系列取代基前時意謂系列中之各取代基可如本文所述視情況經取代。
術語「鹵素」包括氟、氯、溴及碘。
術語「可融合」係指脂質粒子與細胞膜融合之能力。膜可為質膜或包圍例如核內體、核等細胞器之膜。
如本文所用，術語「水溶液」係指完全或部分包含水之組合物。
如本文所用，術語「有機脂質溶液」係指完全或部分包含具有脂質之有機溶劑的組合物。
術語「電子緻密核」在用於描述脂質粒子時，係指在使用低溫透射電子顯微術(「cyroTEM」)目測時脂質粒子之內部部分的深色外觀。一些脂質粒子具有電子緻密核且缺乏脂質雙層結構。一些脂質粒子具有電子緻密核，缺乏脂質雙層結構且具有反六角形或立方體相結構。雖然不希望受理論束縛，但認為非雙層脂質包裝為脂質圓柱體之3維網路在內部提供水及核酸，亦即基本上脂質小滴經含有核酸之水性通道滲透。
如本文所用之「遠端部位」係指不侷限於相鄰毛細血管床，而包括在生物體中廣泛分佈之部位的物理上分離部位。
關於核酸-脂質粒子之「血清穩定」意謂粒子在暴露於將顯著地降解游離DNA或RNA之血清或核酸酶分析後不顯著降解。合適分析包括例如標準血清分析、去氧核糖核酸酶分析或核糖核酸酶分析。
如本文所用之「全身遞送」係指引起諸如siRNA之活性劑在生物體內之廣泛生物分佈的脂質粒子之遞送。一些投與技術可全身遞送某些藥劑，而非其他。全身遞送意謂適用、較佳治療量之藥劑暴露於身體大部分。為實現廣泛生物分佈、一般需要血液壽命，使得藥劑在到達遠離投與部位之疾病部位前不迅速降解或清除(諸如藉由首過器官(肝、肺等)或藉由快速非特異性細胞結合)。脂質粒子之全身遞送可藉由此項技術中已知之任何方式，包括例如靜脈內、皮下及腹膜內。在一較佳實施例中，脂質粒子之全身遞送係藉由靜脈內遞送。
如本文所用之「局部遞送」係指諸如siRNA之活性劑直接遞送至生物體內之標靶位點。舉例而言，藥劑可藉由直接注射至疾病部位、其他標靶部位或標靶器官，諸如肝、心臟、胰臟、腎及其類似器官而局部遞送。
如本文所用之術語「病毒粒子負荷」係指存在於諸如血液之體液中的病毒粒子(例如HBV及/或HDV)之數目的量度。舉例而言，粒子負荷可表示為每毫升例如血液之病毒粒子數目。粒子負荷測試可使用基於核酸擴增之測試以及非基於核酸之測試進行(參見例如Puren等人, The Journal of Infectious Diseases, 201:S27-36 (2010))。
寡核苷酸(諸如實例中闡述之有義及反義RNA鏈)特異性地與標靶多核苷酸序列雜交或互補。如本文所用之術語「可特異性地雜交」及「互補」指示足夠程度之互補性，使得DNA或RNA標靶與寡核苷酸之間發生穩定及特異性結合。應瞭解欲可特異性地雜交，寡核苷酸不必與其標靶核酸序列100%互補。在較佳實施例中，當寡核苷酸與標靶序列之結合干擾標靶序列之正常功能以致於引起效用或表現損失時，寡核苷酸為可特異性地雜交，且存在足夠程度之互補性以避免寡核苷酸與非標靶序列在意欲特異性結合之條件下，亦即在活體內分析或治療性治療之情況下在生理條件下或在活體外分析之情況下在進行分析之條件下非特異性地結合。因此，與其靶向或特異性地雜交之基因或mRNA序列區域相比，寡核苷酸可包括1個、2個、3個或更多個鹼基取代。產生 siRNA 分子
siRNA可呈若干形式提供，包括例如呈一或多種經分離之小干擾RNA (siRNA)雙鏈體、呈更長雙鏈RNA (dsRNA)或呈在DNA質體中自轉錄卡閘轉錄之siRNA或dsRNA。在一些實施例中，siRNA可酶促產生或藉由部分/全部有機合成產生，且可藉由活體外酶促或有機合成引入經修飾之核糖核苷酸。在某些情況下，各鏈以化學方式製備。合成RNA分子之方法為此項技術中已知，例如如Verma及Eckstein (1998)中所述或如本文所述之化學合成方法。
用於分離RNA、合成RNA、核酸雜交、製備及篩選cDNA文庫及進行PCR之方法為此項技術中所熟知(參見例如Gubler及Hoffman,Gene , 25:263-269 (1983)；Sambrook等人, 上述；Ausubel等人, 上述)，PCR方法亦如此(參見美國專利第4,683,195號及第4,683,202號；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis等人編輯, 1990))。表現文庫亦為熟習此項技術者所熟知。揭示通用方法之額外基本文本包括Sambrook等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第2版 1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；及Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯, 1994)。此等參考文獻之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
通常，siRNA以化學方式合成。包含siRNA分子之寡核苷酸可使用此項技術中已知之多種技術，諸如以下中所述之彼等技術中之任一種來合成Usman等人,J. Am. Chem. Soc. , 109:7845 (1987)；Scaringe等人,Nucl. Acids Res. , 18:5433 (1990)；Wincott等人,Nucl. Acids Res. , 23:2677-2684 (1995)；及Wincott等人, Methods Mol. Bio. , 74:59 (1997)。寡核苷酸之合成利用常見核酸保護基團及偶合基團，諸如在5'-末端之二甲氧基三苯甲基及在3'-末端之亞磷醯胺。作為非限制性實例，小規模合成可在Applied Biosystems合成器上使用0.2 μmol規模方案進行。可替代地，0.2 μmol規模之合成可在來自Protogene (Palo Alto, CA)之96孔盤合成器上進行。但是，更大或更小規模之合成亦在範疇內。適於寡核苷酸合成之試劑、RNA脫除保護基之方法及RNA純化方法為熟習此項技術者已知。
siRNA分子可自兩個不同寡核苷酸組裝，其中一個寡核苷酸包含siRNA之有義鏈且另一個寡核苷酸包含siRNA之反義鏈。舉例而言，各鏈可分開合成且在合成及/或脫除保護基後藉由雜交或連接而接合在一起。含有治療性核酸之載劑系統 脂質粒子
脂質粒子可用於遞送本文所述之siRNA分子(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)。脂質粒子可包含一或多個siRNA (例如實例1中所述之三個siRNA分子)、陽離子脂質、非陽離子脂質及抑制粒子聚集之結合脂質。在一些實施例中，siRNA分子完全囊封在脂質粒子之脂質部分內，以便脂質粒子中之siRNA分子在水溶液中抗核酸酶降解。在其他實施例中，本文所述之脂質粒子對人類基本上無毒。脂質粒子通常具有約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm或約70至約90 nm之平均直徑。在某些實施例中，脂質粒子具有約30 nm至約150 nm之中值粒徑。脂質粒子亦通常具有約1:1至約100:1、約1:1至約50:1、約2:1至約25:1、約3:1至約20:1、約5:1至約15:1或約5:1至約10:1之脂質:核酸比率(例如脂質:siRNA比率) (質量/質量比)。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5:1至約15:1之脂質:siRNA質量比。
脂質粒子包括血清穩定之核酸-脂質粒子，其包含一或多個siRNA分子(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)、陽離子脂質(例如一或多個如本文中所闡述之式I-III之陽離子脂質或其鹽)、非陽離子脂質(例如一或多種磷脂及膽固醇之混合物)及抑制粒子聚集之結合脂質(例如一或多個PEG-脂質結合物)。脂質粒子可包含至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個靶向本文所述之一或多種基因的siRNA分子(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)。核酸-脂質粒子及其製備方法描述於例如美國專利第5,753,613號、第5,785,992號、第5,705,385號、第5,976,567號、第5,981,501號、第6,110,745號及第6,320,017號以及PCT公開案第WO 96/40964號中，該等案之揭示內容各以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
在核酸-脂質粒子中，一或多個siRNA分子(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)可完全囊封在粒子之脂質部分內，從而使siRNA避免核酸酶降解。在某些情況下，在粒子在37℃下暴露於核酸酶至少約20分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘後核酸-脂質粒子中之siRNA基本上不降解。在某些其他情況下，在粒子在37℃下在血清中培育至少約30分鐘、45分鐘或60分鐘或至少約2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、30小時、32小時、34小時或36小時後核酸-脂質粒子中之siRNA基本上不降解。在其他實施例中，siRNA與粒子之脂質部分複合。調配物之益處之一為核酸-脂質粒子組合物對人類基本上無毒。
術語「完全囊封」指示核酸-脂質粒子中之siRNA (例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)在暴露於將顯著降解游離DNA或RNA之血清或核酸酶分析後不顯著降解。在完全囊封之系統中，較佳粒子中少於約25%之siRNA在通常將降解100%游離siRNA之處理中降解，更佳粒子中少於約10%且最佳少於約5% siRNA降解。「完全囊封」亦指示核酸-脂質粒子為血清穩定的，亦即其在活體內投與後不迅速分解成其組成部分。
在核酸背景下，完全囊封可藉由進行不可滲透膜之螢光染料排除分析來確定，其使用在與核酸締合時螢光增強之染料。諸如OliGreenÒ 及RiboGreenÒ (Invitrogen Corp.；Carlsbad, CA)之特定染料可用於定量測定質體DNA、單鏈去氧核糖核苷酸及/或單鏈或雙鏈核糖核苷酸。囊封藉由添加染料至脂質體調配物，量測所得螢光，且將其與在添加少量非離子型清潔劑後所觀察到之螢光比較來測定。清潔劑介導之脂質體雙層之破環釋放所囊封之核酸，使其與不可滲透膜之染料相互作用。核酸囊封可計算為E = (Io - I)/Io ，其中I 及Io 係指在添加清潔劑之前及之後的螢光強度(參見Wheeler等人,Gene Ther. , 6:271-281 (1999))。
在一些情況下，核酸-脂質粒子組合物包含完全囊封在粒子之脂質部分內之siRNA分子，使得約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% (或其任何分數或其中之範圍)的粒子裏囊封siRNA。
在其他情況下，核酸-脂質粒子組合物包含完全囊封在粒子之脂質部分內之siRNA，使得約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% (或其任何分數或其中之範圍)之輸入siRNA囊封在粒子中。
視脂質粒子之預期用途而定，組分之比例可變化且可使用例如內體釋放參數(ERP)分析來量測特定調配物之遞送效率。陽離子脂質
多種陽離子脂質或其鹽中之任一種可單獨或與一或多種其他陽離子脂質物質或非陽離子脂質物質組合用於脂質粒子中。陽離子脂質包括其(R)及/或(S)對映異構體。
在一個態樣中，陽離子脂質為二烷基脂質。舉例而言，二烷基脂質可包括包含兩個飽和或不飽和烷基鏈之脂質，其中烷基鏈中之每一者可經取代或未經取代。在某些實施例中，兩個烷基鏈中之每一者包含至少例如8個碳原子、10個碳原子、12個碳原子、14個碳原子、16個碳原子、18個碳原子、20個碳原子、22個碳原子或24個碳原子。
在一個態樣中，陽離子脂質為三烷基脂質。舉例而言，三烷基脂質可包括包含三個飽和或不飽和烷基鏈之脂質，其中烷基鏈中之每一者可經取代或未經取代。在某些實施例中，三個烷基鏈中之每一者包含至少例如8個碳原子、10個碳原子、12個碳原子、14個碳原子、16個碳原子、18個碳原子、20個碳原子、22個碳原子或24個碳原子。
在一個態樣中，具有以下結構之式I之陽離子脂質適用：(I), 或其鹽，其中 R1 及R2 相同或不同，且獨立地為氫(H)或視情況經取代之C1 -C6 烷基、C2 -C6 烯基或C2 -C6 炔基，或R1 及R2 可接合形成視情況經取代之具有4至6個碳原子及1或2個選自由氮(N)、氧(O)及其混合物組成之群之雜原子的雜環； R3 不存在或為氫(H)或C1 -C6 烷基以提供四級胺； R4 及R5 相同或不同，且獨立地為視情況經取代之C10 -C24 烷基、C10 -C24 烯基、C10 -C24 炔基或C10 -C24 醯基，其中R4 及R5 中之至少一者包含至少兩個不飽和位點；及 N為0、1、2、3或4。
在一些實施例中，R1 及R2 獨立地為視情況經取代之C1 -C4 烷基、C2 -C4 烯基或C2 -C4 炔基。在一個較佳實施例中，R1 及R2 均為甲基。在其他較佳實施例中，n為1或2。在其他實施例中，當pH超過陽離子脂質之pKa 時，R3 不存在，且當pH低於陽離子脂質之pKa 時，R3 為氫，使得胺基頭基質子化。在一替代實施例中，R3 為視情況經取代之C1 -C4 烷基以提供四級胺。在進一步實施例中，R4 及R5 獨立地為視情況經取代之C12 -C20 或C14 -C22 烷基、C12 -C20 或C14 -C22 烯基、C12 -C20 或C14 -C22 炔基或C12 -C20 或C14 -C22 醯基，其中R4 及R5 中之至少一者包含至少兩個不飽和位點。
在某些實施例中，R4 及R5 獨立地選自由以下組成之群：十二碳二烯基部分、十四碳二烯基部分、十六碳二烯基部分、十八碳二烯基部分、二十碳二烯基部分、十二碳三烯基部分、十四碳三烯基部分、十六碳三烯基部分、十八碳三烯基部分、二十碳三烯基部分、花生四烯醯基部分及二十二碳六烯醯基部分以及其醯基衍生物(例如亞油醯基、亞麻醯基、γ-亞麻醯基等)。在一些情況下，R4 及R5 中之一者包含支鏈烷基(例如植烷基部分)或其醯基衍生物(例如植烷醯基部分)。在某些情況下，十八碳二烯基部分為亞油醯基部分。在某些其他情況下，十八碳三烯基部分為亞麻醯基部分或γ-亞麻醯基部分。在某些實施例中，R4 及R5 均為亞油醯基部分、亞麻醯基部分或γ-亞麻醯基部分。在特定實施例中，式I之陽離子脂質為1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞油醯氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDMA)、1,2-二亞油醯氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDAP)或其混合物。
在一些實施例中，式I之陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳結晶鹽)。在一特定實施例中，式I之陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。
諸如DLinDMA及DLenDMA之陽離子脂質以及額外陽離子脂質的合成描述於美國專利公開案第20060083780號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。諸如C2-DLinDMA及C2-DLinDAP之陽離子脂質以及額外陽離子脂質的合成描述於國際專利申請案第WO2011/000106號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
在另一個態樣中，具有以下結構之式II之陽離子脂質(或其鹽)適用：(II)， 其中R1 及R2 相同或不同，且獨立地為視情況經取代之C12 -C24 烷基、C12 -C24 烯基、C12 -C24 炔基或C12 -C24 醯基；R3 及R4 相同或不同且獨立地為視情況經取代之C1 -C6 烷基、C2 -C6 烯基或C2 -C6 炔基，或R3 及R4 可接合形成視情況經取代之具有4至6個碳原子及1或2個選自氮及氧之雜原子之雜環；R5 不存在或為氫(H)或C1 -C6 烷基以提供四級胺；m、n及p相同或不同，且獨立地為0、1或2，其限制條件為m、n及p不同時為0；q為0、1、2、3或4；且Y及Z相同或不同且獨立地為O、S或NH。在一較佳實施例中，q為2。
在一些實施例中，式II之陽離子脂質為2,2-二亞油醯基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA；「XTC2」或「C2K」)、2,2-二亞油醯基-4-(3-二甲基胺基丙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C3-DMA；「C3K」)、2,2-二亞油醯基-4-(4-二甲基胺基丁基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C4-DMA；「C4K」)、2,2-二亞油醯基-5-二甲基胺基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油醯基-4-N-甲基哌嗪基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MPZ)、2,2-二亞油醯基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二油醯基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DO-K-DMA)、2,2-二硬脂醯基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DS-K-DMA)、2,2-二亞油醯基-4-N-嗎啉基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MA)、2,2-二亞油醯基-4-三甲基胺基-[1,3]-二氧雜環戊烷氯化物 (DLin-K-TMA.Cl)、2,2-二亞油醯基-4,5-雙(二甲基胺基甲基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K2 -DMA)、2,2-二亞油醯基-4-甲基哌嗪-[1,3]-二氧雜環戊烷(D-Lin-K-N-甲基哌嗪)或其混合物。在一些實施例中，式II之陽離子脂質為DLin-K-C2-DMA。
在一些實施例中，式II之陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳結晶鹽)。在一特定實施例中，式II之陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。
諸如DLin-K-DMA之陽離子脂質以及額外陽離子脂質的合成描述於PCT公開案第WO 09/086558號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。諸如DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、DLin-K-MPZ、DO-K-DMA、DS-K-DMA、DLin-K-MA、DLin-K-TMA.Cl、DLin-K2-DMA及D-Lin-K-N-甲基哌嗪之陽離子脂質以及額外陽離子脂質的合成描述於2009年10月9日申請之標題為「「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之PCT申請案第PCT/US2009/060251號中，其揭示內容以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的。
在另一個態樣中，具有以下結構之式III之陽離子脂質適用：(III) 或其鹽，其中：R1 及R2 相同或不同，且獨立地為視情況經取代之C1 -C6 烷基、C2 -C6 烯基或C2 -C6 炔基，或R1 及R2 可接合形成視情況經取代之具有4至6個碳原子及1或2個選自由氮(N)、氧(O)及其混合物組成之群之雜原子之雜環；R3 不存在或為氫(H)或C1 -C6 烷基以提供四級胺；R4 及R5 不存在或存在且當存在時相同或不同且獨立地為視情況經取代之C1 -C10 烷基或C2 -C10 烯基；且n為0、1、2、3或4。
在一些實施例中，R1 及R2 獨立地為視情況經取代之C1 -C4 烷基、C2 -C4 烯基或C2 -C4 炔基。在一較佳實施例中，R1 及R2 均為甲基。在另一較佳實施例中，R4 及R5 均為丁基。在又一個較佳實施例中，n為1。在其他實施例中，當pH超過陽離子脂質之pKa 時，R3 不存在，且當pH低於陽離子脂質之pKa 時，R3 為氫，使得胺基頭基質子化。在一替代實施例中，R3 為視情況經取代之C1 -C4 烷基以提供四級胺。在進一步實施例中，R4 及R5 獨立地為視情況經取代之C2 -C6 或C2 -C4 烷基或C2 -C6 或C2 -C4 烯基。
在一替代實施例中，式III之陽離子脂質在胺基頭基與一個或兩個烷基鏈之間包含酯鍵。在一些實施例中，式III之陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳結晶鹽)。在一特定實施例中，式III之陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。
雖然式III中每一烷基鏈在位置6、9及12處含有順式雙鍵(亦即順式, 順式, 順式- Δ6 ,Δ9 ,Δ12 )，但在一替代實施例中，一或兩個烷基鏈中此等雙鍵中之一個、兩個或三個可呈反式組態。
在一特定實施例中，式III之陽離子脂質具有以下結構：γ-DLenDMA (15 ) 。
諸如γ-DLenDMA (15 )之陽離子脂質以及額外陽離子脂質之合成描述於2009年7月1日申請之標題為「Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之美國臨時申請案第61/222,462號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
諸如DLin-M-C3-DMA (「MC3」)之陽離子脂質以及額外陽離子脂質(例如MC3之某些特類似物)之合成描述於2009年6月10日申請之標題為「Novel Lipids and Compositions for the Delivery of Therapeutics,」之美國臨時申請案第61/185,800號及2009年12月18日申請之標題為「Methods and Compositions for Delivery of Nucleic Acids」之美國臨時申請案第61/287,995號中，該等案之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
可包括在脂質粒子內之其他陽離子脂質或其鹽之實例包括(但不限於)諸如WO2011/000106中描述之陽離子脂質的陽離子脂質，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的；以及諸如以下之陽離子脂質：氯化N,N-二油烯基-N,N-二甲基銨(DODAC)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DSDMA)、氯化N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化N-(1-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、溴化N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基銨(DMRIE)、三氟乙酸2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基銨(DOSPA)、二-十八烷醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲基胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亞油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-嗎啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油醯基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油醯基氧基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油醯基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油醯基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油醯基側氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二油烯基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DO-C-DAP)、1,2-二肉豆蔻油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DMDAP)、1,2-二油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化物(DOTAP.Cl)、二亞油基甲基-3-二甲基胺基丙酸鹽(DLin-M-C2-DMA；亦稱為DLin-M-K-DMA或DLin-M-DMA)及其混合物。可包括在脂質粒子內之額外陽離子脂質或其鹽描述於美國專利公開案第20090023673號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
諸如CLinDMA之陽離子脂質以額外陽離子脂質的合成描述於美國專利公開案第20060240554號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。諸如、DLin-C-DAP、DLinDAC、DLinMA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLinTMA.Cl、DLinTAP.Cl、DLinMPZ、DLinAP、DOAP及DLin-EG-DMA之陽離子脂質以及額外陽離子脂質的合成描述於PCT公開案第WO 09/086558號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。諸如DO-C-DAP、DMDAP、DOTAP.Cl、DLin-M-C2-DMA之陽離子脂質以及額外陽離子脂質的合成描述於2009年10月9日申請之標題為「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之PCT申請案第PCT/US2009/060251號中，其揭示內容以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的。許多其他陽離子脂質及相關類似物之合成已描述於美國專利第5,208,036號、第5,264,618號、第5,279,833號、第5,283,185號、第5,753,613號及第5,785,992號以及PCT公開案第WO96/10390號中，其揭示內容各以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。另外，可使用陽離子脂質之許多商業製劑，諸如LIPOFECTIN® (包括DOTMA及DOPE，可獲自Invitrogen)；LIPOFECTAMINE® (包括DOSPA及DOPE，可獲自Invitrogen)；及TRANSFECTAM® (包括DOGS，可獲自Promega Corp.)。
在一些實施例中，陽離子脂質佔粒子中存在之總脂質的約50 mol %至約90 mol %、約50 mol %至約85 mol %、約50 mol %至約80 mol %、約50 mol %至約75 mol %、約50 mol %至約70 mol %、約50 mol %至約65 mol %、約50 mol %至約60 mol %、約55 mol %至約65 mol %或約55 mol %至約70 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。在特定實施例中，陽離子脂質佔粒子中存在之總脂質的約50 mol %、51 mol %、52 mol %、53 mol %、54 mol %、55 mol %、56 mol %、57 mol %、58 mol %、59 mol %、60 mol %、61 mol %、62 mol %、63 mol %、64 mol %或65 mol % (或其任何分數)。
在其他實施例中，陽離子脂質佔粒子中存在之總脂質的約2 mol %至約60 mol %、約5 mol %至約50 mol %、約10 mol %至約50 mol %、約20 mol %至約50 mol %、約20 mol %至約40 mol %、約30 mol %至約40 mol %或約40 mol %(或其任何分數或其中之範圍)。
適用於脂質粒子中之陽離子脂質之其他百分比及範圍描述於PCT公開案第WO 09/127060號、美國公開申請案第US 2011/0071208號、PCT公開案第WO2011/000106號及美國公開申請案第US 2011/0076335號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
應瞭解脂質粒子中存在之陽離子脂質之百分比為目標量，且調配物中存在之陽離子脂質之實際量可例如變化±5 mol%。舉例而言，在一例示性脂質粒子調配物中，陽離子脂質之目標量為57.1 mol %，但陽離子脂質之實際量可為該目標量± 5 mol %、± 4 mol %、± 3 mol %、± 2 mol %、± 1 mol %、± 0.75 mol %、± 0.5 mol %、± 0.25 mol %或± 0.1 mol %，調配物其餘部分由其他脂質組分組成(粒子中存在之總脂物累加至100 mol%；但是，此項技術之技術人員將瞭解由於捨入，總mol%可稍微偏離100%，例如99.9 mol%或 100.1 mol%)。
可用於包括在脂質粒子中之陽離子脂質之進一步實例顯示如下：N,N-二甲基-2,3-雙((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-胺(5 )2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧雜環戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙胺(6 )4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(7 )3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(8 )5-(二甲基胺基)戊酸(Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-16-烯-11-基酯(53 )6-(二甲基胺基)己酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(11 )5-(二甲基胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(13 )5-(二甲基胺基)戊酸12-癸基二十二烷-11-基酯(14 )。非陽離子脂質
用於脂質粒子中之非陽離子脂質可為能夠產生穩定錯合物之多種中性不帶電、兩性離子或陰離子脂質中之任一者。
非陽離子脂質之非限制性實例包括磷脂，諸如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、磷酸二鯨蠟酯、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯甘油(POPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、二反式油醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE)、硬脂醯基油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼及其混合物。亦可使用其他二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。此等脂質中之醯基較佳為衍生自具有C10 -C24 碳鏈之脂肪酸之醯基，例如月桂醯基、肉豆寇醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。
非陽離子脂質之其他實例包括固醇，諸如膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物之非限制性實例包括極性類似物，諸如5α-膽甾烷醇、5β-糞甾醇、膽甾醇基-(2'-羥基)-乙醚、膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚及6-酮基膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5α-膽甾烷、膽甾烯酮、5α-膽甾烷酮、5β-膽甾烷酮及膽甾醇基癸酸酯及其混合物。在較佳實施例中，膽固醇衍生物為極性類似物，諸如膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚。膽甾醇基-(2'-羥基)-乙醚之合成描述於PCT公開案第WO 09/127060號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
在一些實施例中，脂質粒子中存在之非陽離子脂質包含一或多種磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物或由該混合物組成。在其他實施例中，脂質粒子中存在之非陽離子脂質包含一或多種磷脂或由一或多種磷脂組成，例如無膽固醇之脂質粒子調配物。在其他實施例中，脂質粒子中存在之非陽離子脂質包含膽固醇或其衍生物或由膽固醇或其衍生物組成，例如無磷脂之脂質粒子調配物。
適用非陽離子脂質之其他實例包括不含磷之脂質，諸如硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、乙醯基棕櫚酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸類聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸醯胺、溴化雙十八烷基二甲基銨、神經醯胺、鞘磷脂及其類似物。
在一些實施例中，非陽離子脂質佔粒子中存在之總脂質之約10 mol %至約60 mol %、約20 mol %至約55 mol %、約20 mol %至約45 mol %、約20 mol %至約40 mol %、約25 mol %至約50 mol %、約25 mol %至約45 mol %、約30 mol %至約50 mol %、約30 mol %至約45 mol %、約30 mol %至約40 mol %、約35 mol %至約45 mol %、約37 mol %至約45 mol %或約35 mol %、36 mol %、37 mol %、38 mol %、39 mol %、40 mol %、41 mol %、42 mol %、43 mol %、44 mol %或45 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。
在脂質粒子含有磷脂與膽固醇或膽固醇衍生物之混合物的實施例中，混合物可佔粒子中存在之總脂質之多達約40 mol %、45 mol %、50 mol %、55 mol %或60 mol %。
在一些實施例中，混合物中之磷脂可佔粒子中存在之總脂質的約2 mol %至約20 mol %、約2 mol %至約15 mol %、約2 mol %至約12 mol %、約4 mol %至約15 mol %或約4 mol %至約10 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。在某些實施例中，混合物中之磷脂組分佔粒子中存在之總脂質的約5 mol %至約17 mol %、約7 mol %至約17 mol %、約7 mol %至約15 mol %、約8 mol %至約15 mol %或約8 mol %、9 mol %、10 mol %、11 mol %、12 mol %、13 mol %、14 mol %或15 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。作為非限制性實例，包含磷脂與膽固醇之混合物的脂質粒子調配物可包含約7 mol % (或其任何分數)之諸如DPPC或DSPC之磷脂，例如呈與佔粒子中存在之總脂質約34 mol % (或其任何分數)之膽固醇或膽固醇衍生物之混合物。作為另一非限制性實例，包含磷脂與膽固醇之混合物的脂質粒子調配物可包含約7 mol % (或其任何分數)之諸如DPPC或DSPC之磷脂，例如呈與佔粒子中存在之總脂質約32 mol % (或其任何分數)之膽固醇或膽固醇衍生物之混合物。
藉助於進一步實例，適用之脂質調配物具有約10:1之脂質比藥物(例如siRNA)比率(例如9.5:1至11:1或9.9:1至11:1或10:1至10.9:1之脂質:藥物比率)。在某些其他實施例中，適用之脂質調配物具有約9:1之脂質比藥物(例如siRNA)比率(例如8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1之脂質:藥物比率)。
在其他實施例中，混合物中之膽固醇組分可佔粒子中存在之總脂質的約25 mol %至約45 mol %、約25 mol %至約40 mol %、約30 mol %至約45 mol %、約30 mol %至約40 mol %、約27 mol %至約37 mol %、約25 mol %至約30 mol %或約35 mol %至約40 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。在某些較佳實施例中，混合物中之膽固醇組分佔粒子中存在之總脂質的約25 mol %至約35 mol %、約27 mol %至約35 mol %、約29 mol %至約35 mol %、約30 mol %至約35 mol %、約30 mol %至約34 mol %、約31 mol %至約33 mol %或約30 mol %、31 mol %、32 mol %、33 mol %、34 mol %或35 mol %(或其任何分數或其中之範圍)。
在脂質粒子不含磷脂之實施例中，膽固醇或其衍生物可佔粒子中存在之總脂質之多達約25 mol %、30 mol %、35 mol %、40 mol %、45 mol %、50 mol %、55 mol %或60 mol %。
在一些實施例中，無磷脂之脂質粒子中膽固醇或其衍生物可佔粒子中存在之總脂質之約25 mol %至約45 mol %、約25 mol %至約40 mol %、約30 mol %至約45 mol %、約30 mol %至約40 mol %、約31 mol %至約39 mol %、約32 mol %至約38 mol %、約33 mol %至約37 mol %、約35 mol %至約45 mol %、約30 mol %至約35 mol %、約35 mol %至約40 mol %或約30 mol %、31 mol %、32 mol %、33 mol %、34 mol %、35 mol %、36 mol %、37 mol %、38 mol %、39 mol %或40 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。作為非限制性實例，脂質粒子調配物可包含佔粒子中存在之總脂質之約37 mol % (或其任何分數)的膽固醇。作為另一非限制性實例，脂質粒子調配物可包含佔粒子中存在之總脂質之約35 mol % (或其任何分數)的膽固醇。
在其他實施例中，非陽離子脂質佔粒子中存在之總脂質的約5 mol %至約90 mol %、約10 mol %至約85 mol %、約20 mol %至約80 mol %、約10 mol % (例如僅僅磷脂)或約60 mol % (例如磷脂及膽固醇或其衍生物)(或其任何分數或其中之範圍)。
適用於脂質粒子中之非陽離子脂質之其他百分比及範圍描述於PCT公開案第WO 09/127060號、美國公開申請案第US 2011/0071208號、PCT公開案第WO2011/000106號及美國公開申請案第US 2011/0076335號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
應瞭解脂質粒子中存在之非陽離子脂質之百分比為目標量，且調配物中存在之非陽離子脂質之實際量可變化例如± 5 mol %、± 4 mol %、± 3 mol %、± 2 mol %、± 1 mol %、± 0.75 mol %、± 0.5 mol %、± 0.25 mol %或± 0.1 mol %。脂質結合物
除陽離子及非陽離子脂質外，脂質粒子可進一步包含脂質結合物。結合脂質適用之原因在於其防止粒子聚集。合適結合脂質包括(但不限於) PEG-脂質結合物、POZ-脂質結合物、ATTA-脂質結合物、陽離子聚合物-脂質結合物(CPL)及其混合物。在某些實施例中，粒子包含PEG-脂質結合物或ATTA-脂質結合物連同CPL。
在一較佳實施例中，脂質結合物為PEG-脂質。PEG-脂質之實例包括(但不限於)如例如PCT公開案第WO 05/026372號中所述之與二烷氧基丙基偶合之PEG (PEG-DAA)、如例如美國專利公開案第20030077829號及第2005008689號中所述之與二醯基甘油偶合之PEG (PEG-DAG)、與諸如磷脂醯乙醇胺之磷脂偶合之PEG (PEG-PE)、如例如美國專利第5,885,613號中所述之與神經醯胺結合之PEG、與膽固醇或其衍生物結合之PEG及其混合物。此等專利文件之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
適用之其他PEG-脂質包括不限於mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn 3-胺甲醯基甘油酯(PEG-C-DOMG)。PEG-C-DOMG之合成描述於PCT公開案第WO 09/ 086558號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。其他合適PEG-脂質結合物包括不限於1-[8'-(1,2-二肉豆蔻醯基-3-丙氧基)-甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛烷基]胺甲醯基-ω-甲基-聚(乙二醇) (2KPEG-DMG)。2KPEG-DMG之合成描述於美國專利第7,404,969號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
PEG為乙烯PEG重複單位之線性水溶性聚合物，具有兩個末端羥基。PEG藉由其分子量分類；舉例而言，PEG 2000具有約2,000道爾頓(dalton)之平均分子量，且PEG 5000具有約5,000道爾頓之平均分子量。PEG可購自Sigma Chemical Co.及其他公司，且包括(但不限於)以下：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-丁二醯亞胺基丁二酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2 )、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)以及含有末端羥基代替末端甲氧基之此類化合物(例如HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2 等)。諸如美國專利第6,774,180號及第7,053,150號中所述之PEG的其他PEG (例如mPEG (20 KDa)胺)亦可用於製備PEG-脂質結合物。此等專利之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。另外，單甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2 COOH)尤其可用於製備PEG-脂質結合物，包括例如PEG-DAA結合物。
本文所述之PEG-脂質結合物之PEG部分可包含在約550道爾頓至約10,000道爾頓範圍內之平均分子量。在某些情況下，PEG部分具有約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等)之平均分子量。在較佳實施例中，PEG部分具有約2,000道爾頓或約750道爾頓之平均分子量。
在某些情況下，PEG可視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。PEG可直接結合於脂質或可經由連接子部分連接於脂質。可使用適合於將PEG與脂質偶合之任何連接子部分，例如不含酯之連接子部分及含酯之連接子部分。在一較佳實施例中，連接子部分為不含酯之連接子部分。如本文所用，術語「不含酯之連接子部分」係指不含羧酸酯鍵(-OC(O)-)之連接子部分。合適不含酯之連接子部分包括(但不限於)醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯基(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫基(-S-S-)、醚(-O-)、丁二醯基(-(O)CCH2 CH2 C(O)-)、丁二醯亞胺基 (-NHC(O)CH2 CH2 C(O)NH-)、醚、二硫基以及其組合(諸如含有胺基甲酸酯基連接子部分與醯胺基連接子部分兩者之連接子)。在一較佳實施例中，胺基甲酸酯基連接子用於將PEG與脂質偶合。
在其他實施例中，含酯連接子部分用於將PEG與脂質偶合。合適含酯連接子部分包括例如碳酸酯基(-OC(O)O-)、丁二醯基、磷酸酯基(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯基及其組合。
具有變化鏈長度及飽和度之多種醯基鏈基的磷脂醯乙醇胺可與PEG結合以形成脂質結合物。此類磷脂醯乙醇胺可購得，或可使用熟習此項技術者已知之習知技術分離或合成。含有碳鏈長度在C10 至C20 範圍內之飽和或不飽和脂肪酸的磷脂醯基-乙醇胺為較佳。亦可使用具有單不飽和脂肪酸或雙不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸之混合物的磷脂醯乙醇胺。合適磷脂醯乙醇胺包括(但不限於)二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)及二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)。
術語「ATTA」或「聚醯胺」包括不限於美國專利第6,320,017號及第6,586,559號中之所述之化合物，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。此等化合物包括具有下式之化合物：(IV)， 其中R為選自由氫、烷基及醯基組成之群之成員；R1 為選自由氫及烷基組成之群之成員；或視情況，R及R1 與其結合之氮形成疊氮基部分；R2 為選自氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之芳基及胺基酸側鏈之群的成員；R3 為選自由氫、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、肼基、胺基及NR4 R5 組成之群之成員，其中R4 及R5 獨立地為氫或烷基；n為4至80；m為2至6；p為1至4；且q為0或1。熟習此項技術者顯而易見可使用其他聚醯胺。
術語「二醯基甘油」或「DAG」包括具有2個藉由酯鍵鍵結至丙三醇之位置1及2之脂肪醯基鏈R1 及R2 的化合物，兩者均獨立地具有2至30個碳。醯基可為飽和或具有變化之不飽和度。合適醯基包括(但不限於)月桂醯基(C12 )、肉豆寇醯基(C14 )、棕櫚醯基(C16 )、硬脂醯基(C18 )及二十碳醯基(C20 )。在較佳實施例中，R1 及R2 相同，亦即R1 及R2 均為肉豆寇醯基(亦即二肉豆蔻醯基)，R1 及R2 均為硬脂醯基(亦即二硬脂醯基)等。二醯基甘油具有以下通式：(V)。
術語「二烷氧基丙基」或「DAA」包括具有2個烷基鏈R1 及R2 之化合物，兩者均獨立地具有2至30個碳。烷基可為飽和或具有變化之不飽和度。二烷氧基丙基具有以下通式：(VI)。
在一較佳實施例中，PEG-脂質為具有下式之PEG-DAA結合物：(VII)， 其中R1 及R2 經獨立地選擇且為具有約10至約22個碳原子之長鏈烷基；PEG為聚乙二醇；且L為如上所述之不含酯之連接子部分或含酯之連接子部分。長鏈烷基可為飽和或不飽和。合適烷基包括(但不限於)癸基(C10 )、月桂基(C12 )、肉豆寇基(C14 )、棕櫚基(C16 )、硬脂醯基(C18 )及二十碳基(C20 )。在較佳實施例中，R1 及R2 相同，亦即R1 及R2 均為肉豆寇基(亦即二肉豆寇基)，R1 及R2 均為硬脂基(亦即二硬脂基)等。
在以上式VII中，PEG具有在約550道爾頓至約10,000道爾頓範圍內之平均分子量。在某些情況下，PEG具有約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等)之平均分子量。在較佳實施例中，PEG具有約2,000道爾頓或約750道爾頓之平均分子量。PEG可視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在某些實施例中，末端羥基經甲氧基或甲基取代。
在一較佳實施例中，「L」為不含酯之連接子部分。合適之不含酯之連接子包括(但不限於)醯胺基連接子部分、胺基連接子部分、羰基連接子部分、胺基甲酸酯基連接子部分、脲連接子部分、醚連接子部分、二硫基連接子部分、丁二醯亞胺基連接子部分及其組合。在一較佳實施例中，不含酯之連接子部分為胺基甲酸酯基連接子部分(亦即PEG-C -DAA結合物)。在另一較佳實施例中，不含酯之連接子部分為醯胺基連接子部分(亦即PEG-A -DAA結合物)。在又一較佳實施例中，不含酯之連接子部分為丁二醯亞胺基連接子部分(亦即PEG-S -DAA結合物)。
在特定實施例中，PEG-脂質結合物係選自：(66 ) (PEG-C-DMA)；及(67 ) (PEG-C-DOMG)。
PEG-DAA結合物使用熟習此項技術者已知之標準技術及試劑合成。將認識到PEG-DAA結合物將含有多種醯胺、胺、醚、硫基、胺基甲酸酯基及脲鍵。熟習此項技術者將認識到用於形成此等鍵之方法及試劑為熟知且容易獲得。參見例如March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992)；Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989)；及Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 第5版(Longman 1989)。亦瞭解存在之任何官能基可能需要在PEG-DAA結合物合成中之不同時刻保護及脫除保護基。熟習此項技術者將認識到此類技術為熟知。參見例如Green及Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)。
PEG-DAA結合物較佳為PEG-二癸基氧基丙基(C10 )結合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12 )結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14 )結合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16 )結合物或PEG-二硬脂基氧基丙基(C18 )結合物。在此等實施例中，PEG較佳具有約750或約2,000道爾頓之平均分子量。在一個尤其較佳實施例中，PEG-脂質結合物包含PEG2000-C-DMA，其中「2000」表示PEG之平均分子量，「C」表示胺基甲酸酯基連接子部分，且「DMA」表示二肉豆蔻基氧基丙基。在另一尤其較佳實施例中，PEG-脂質結合物包含PEG750-C-DMA，其中「750」表示PEG之平均分子量，「C」表示胺基甲酸酯基連接子部分，且「DMA」表示二肉豆蔻基氧基丙基。在特定實施例中，PEG之末端羥基經甲基取代。熟習此項技術者容易瞭解其他二烷氧基丙基可用於PEG-DAA結合物中。
除上述外，熟習此項技術者顯而易見其他親水性聚合物可代替PEG使用。可用於代替PEG之合適聚合物之實例包括(但不限於)聚乙烯吡咯啶酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺及聚二甲基丙烯醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸及衍生之纖維素，諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。
除上述組分外，脂質粒子可進一步包含陽離子聚(乙二醇) (PEG)脂質或CPL (參見例如Chen等人,Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)；美國專利第6,852,334號；PCT公開案第WO 00/62813號，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的)。
合適CPL包括式VIII之化合物： A-W-Y (VIII)， 其中A、W及Y如下所述。
參考式VIII，「A」為用作脂質錨之脂質部分，諸如兩性脂質、中性脂質或疏水性脂質。合適脂質實例包括(但不限於)：二醯基甘油基、二烷基甘油基、N-N-二烷基胺基、1,2-二醯氧基-3-胺基丙烷及1,2-二烷基-3-胺基丙烷。
「W」為聚合物或寡聚物，諸如親水性聚合物或寡聚物。親水性聚合物較佳為生物相容性聚合物，其無免疫原性或具有低的固有免疫原性。可替代地，若與適當佐劑一起使用，則親水性聚合物可具有弱抗原性。合適無免疫原性聚合物包括(但不限於) PEG、聚醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物及其組合。在一較佳實施例中，聚合物具有約250至約7,000道爾頓之分子量。
「Y」為多陽離子部分。術語多陽離子部分係指在所選pH值下、較佳在生理pH值下具有正電荷、較佳至少2個正電荷之化合物、衍生物或官能基。合適多陽離子部分包括鹼性胺基酸及其衍生物，諸如精胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸及組胺酸；精胺；亞精胺；陽離子樹枝狀聚合物；多胺；多胺糖；及胺基多醣。多陽離子部分結構上可為線性，諸如線性四聚離胺酸，為分支或樹枝狀聚合物。多陽離子部分在所選pH值下具有約2至約15個正電荷、較佳約2至約12個正電荷且更佳約2至約8個正電荷。需要時，所採用之多陽離子部分之選擇可由粒子應用類型而定。
多陽離子部分上之電荷可分佈在整個粒子部分周圍，或可替代地，其在粒子部分之一特定區域中可為離散濃度之電荷密度，例如電荷峰值。若電荷密度分佈在粒子上，則電荷密度可相等分佈或不相等分佈。涵蓋多陽離子部分之電荷分佈之所有變化。
脂質「A」及無免疫原性聚合物「W」可藉由多種方法且較佳藉由共價連接來連接。熟習此項技術者已知之方法可用於「A」與「W」之共價連接。合適鍵包括(但不限於)醯胺鍵、胺鍵、羧基鍵、碳酸酯鍵、胺基甲酸酯鍵、酯鍵及腙鍵。熟習此項技術者顯而易見「A」及「W」實現鍵須具有互補官能基。此兩個基團之反應將提供所需鍵，一個基團在脂質上且另一個在聚合物上。舉例而言，當脂質為二醯基甘油且末端羥基經例如NHS及DCC活化以便形成活性酯且接著與含有胺基之聚合物、諸如與聚醯胺反應時(參見例如美國專利第6,320,017號及第6,586,559號，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的)，兩個基團之間將形成醯胺鍵。
在某些情況下，多陽離子部分可連接有配位體，諸如靶向配位體或用於與鈣錯合之螯合部分。較佳地，在連接配位體之後，陽離子部分維持正電荷。在某些情況下，連接之配位體具有正電荷。合適配位體包括(但不限於)具有反應性官能基之化合物或裝置，且包括脂質、兩性脂質、載體化合物、生物親和性化合物、生物材料、生物聚合物、生物醫學裝置、分析上可偵測之化合物、治療活性化合物、酶、肽、蛋白質、抗體、免疫刺激物、放射性標記、螢光團、生物素、藥物、半抗原、DNA、RNA、多醣、脂質體、病毒顆粒、膠束、免疫球蛋白、官能基、其他靶向部分或毒素。
在一些實施例中，脂質結合物(例如PEG-脂質)佔粒子中存在之總脂質的約0.1 mol %至約3 mol %、約0.5 mol %至約3 mol %或約0.6 mol %、0.7 mol %、0.8 mol %、0.9 mol %、1.0 mol %、1.1 mol %、1.2 mol %、1.3 mol %、1.4 mol %、1.5 mol %、1.6 mol %、1.7 mol %、1.8 mol %、1.9 mol %、2.0 mol %、2.1 mol%、2.2 mol%、2.3 mol %、2.4 mol %、2.5 mol %、2.6 mol %、2.7 mol %、2.8 mol %、2.9 mol %或3 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。
在其他實施例中，脂質結合物(例如PEG-脂質)佔粒子中存在之總脂質的約0 mol %至約20 mol %、約0.5 mol %至約20 mol %、約2 mol %至約20 mol %、約1.5 mol %至約18 mol %、約2 mol %至約15 mol %、約4 mol %至約15 mol %、約2 mol %至約12 mol %、約5 mol %至約12 mol %或約2 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。
在進一步實施例中，脂質結合物(例如PEG-脂質)佔粒子中存在之總脂質的約4 mol %至約10 mol %、約5 mol %至約10 mol %、約5 mol %至約9 mol %、約5 mol %至約8 mol %、約6 mol %至約9 mol %、約6 mol %至約8 mol %或約5 mol %、6 mol %、7 mol %、8 mol %、9 mol %或10 mol % (或其任何分數或其中之範圍)。
應瞭解脂質粒子中存在之脂質結合物之百分比為目標量，且調配物中存在之脂質結合物之實際量可變化例如± 5 mol %、± 4 mol %、± 3 mol %、± 2 mol %、± 1 mol %、± 0.75 mol %、± 0.5 mol %、± 0.25 mol %或± 0.1 mol %。
適用於脂質粒子中之脂質結合物之其他百分比及範圍描述於PCT公開案第WO 09/127060號、美國公開申請案第US 2011/0071208號、PCT公開案第WO2011/000106號及美國公開申請案第US 2011/0076335號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
此項技術之一般技術人員將瞭解脂質結合物之濃度可視所採用之脂質結合物及脂質粒子變成可融合時之速率而變化。
藉由控制脂質結合物之組成及濃度，可控制脂質結合物自脂質粒子交換之速率及繼而脂質粒子變成可融合之速率。舉例而言，當PEG-DAA結合物用作脂質結合物時，脂質粒子變成可融合之速率可例如藉由變化脂質結合物之濃度、藉由變化PEG之分子量或藉由變化PEG-DAA結合物上烷基之鏈長及飽和度來變化。另外，包括例如pH值、溫度、離子強度等其他變數可用於變化及/或控制脂質粒子變成可融合之速率。熟習此項技術者在閱讀本發明後將顯而易見可用於控制脂質粒子變成可融合之速率之其他方法。此外，藉由控制脂質結合物之組成及濃度，可控制脂質粒度。額外載體系統
適用之其他基於脂質之載體系統的非限制性實例(參見例如參見例如美國專利公開案第20030203865號；及Zhang等人,J. Control Release , 100:165-180 (2004))、pH敏感性脂質複合物(參見例如美國專利公開案第20020192275號)、可逆地遮蔽之脂質複合物(參見例如美國專利公開案第20030180950號)、基於陽離子脂質之組合物(參見例如美國專利第6,756,054號；及美國專利公開案第20050234232號)、陽離子脂質體(參見例如美國專利公開案第20030229040號、第20020160038號及第20020012998號；美國專利第5,908,635號；及PCT公開案第WO 01/72283號)、陰離子脂質體(參見例如美國專利公開案第20030026831號)、pH敏感性脂質體(參見例如美國專利公開案第20020192274號；及AU 2003210303)、經抗體塗佈之脂質體(參見例如美國專利公開案第20030108597號；及PCT公開案第WO 00/50008號)、細胞類型特異性脂質體(參見例如美國專利公開案第20030198664號)、含有核酸及肽之脂質體(參見例如美國專利第6,207,456號)、含有經可釋放之親水性聚合物衍生之脂質的脂質體(參見例如美國專利公開案第20030031704號)、脂質包裹之核酸(參見例如PCT公開案第WO 03/057190號及第WO 03/059322號)、脂質囊封之核酸(參見例如美國專利公開案第20030129221號；及美國專利第5,756,122號)、其他脂質體組合物(參見例如美國專利公開案第20030035829號及第20030072794號；及美國專利第6,200,599號)、脂質體與乳液之穩定混合物(參見例如EP1304160)、乳液組合物(參見例如美國專利第6,747,014號)及核酸微乳液(參見例如美國專利公開案第20050037086號)。
適用之基於聚合物之載體系統的實例包括(但不限於)陽離子聚合物-核酸複合物(亦即多聚複合物)。為形成多聚複合物，核酸(例如本文所述之siRNA分子或其組合)通常與具有線性、分支、星形或樹枝狀聚合物結構之陽離子聚合物複合，該陽離子聚合物使核酸縮合成能夠與陰離子蛋白多糖在細胞表面相互作用且藉由胞吞作用進入細胞之帶正電粒子。在一些實施例中，多聚複合物包含與陽離子聚合物複合之核酸(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)，該陽離子聚合物諸如聚乙烯亞胺(PEI) (參見例如美國專利第6,013,240號；可以活體內jetPEIä購自Qbiogene, Inc. (Carlsbad, CA)，PEI之一種線性形式)、聚丙烯亞胺(PPI)、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚-L-離胺酸(PLL)、二乙胺基乙基(DEAE)-葡聚糖、聚(β-胺基酯) (PAE)聚合物(參見例如Lynn等人,J. Am. Chem. Soc. , 123:8155-8156 (2001))、殼聚糖、聚醯胺胺(PAMAM)樹枝狀聚合物(參見例如Kukowska-Latallo等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 93:4897-4902 (1996))、卟啉(參見例如美國專利第6,620,805號)、聚乙烯醚(參見例如美國專利公開案第20040156909號)、多環脒鹽(參見例如美國專利公開案第20030220289號)、包含一級胺、亞胺、胍及/或咪唑基團之其他聚合物(參見例如美國專利第6,013,240號；PCT公開案第WO/9602655號；PCT公開案第WO95/21931號；Zhang等人,J. Control Release , 100:165-180 (2004)；及Tiera等人,Curr. Gene Ther. , 6:59-71 (2006))及其混合物。在其他實施例中，多聚複合物包含如美國專利公開案第20060211643號、第20050222064號、第20030125281號及第20030185890號以及PCT公開案第WO 03/066069號中所述之陽離子聚合物-核酸複合物；如美國專利公開案第20040071654號中所述之生物可降解之聚(β-胺基酯)聚合物-核酸複合物；如美國專利公開案第20040142475號中所述之含有聚合物基質之微粒；如美國專利公開案第20030157030號中所述之其他微粒組合物；如美國專利公開案第20050123600號中所述之縮合核酸複合物；及如AU 2002358514及PCT公開案第WO 02/096551號中所述之奈米囊及微米囊。
在某些情況下，siRNA可與環糊精或其聚合物複合。基於環糊精之載體系統之非限制性實例包括美國專利公開案第20040087024號中所述之經環糊精修飾之聚合物-核酸複合物；美國專利第6,509,323號、第6,884,789號及第7,091,192號中所述之線性環糊精共聚物-核酸複合物；及美國專利第7,018,609號中所述之環糊精聚合物-複合劑-核酸複合物。在某些其他情況下，siRNA可與肽或多肽複合。基於蛋白質之載體系統之一實例包括(但不限於) PCT公開案第WO95/21931號中所述之陽離子寡肽-核酸複合物。脂質粒子之製備
其中核酸(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)包裹在粒子脂質部分內且避免降解之核酸-脂質粒子可藉由此項技術中已知之任何方法，包括(但不限於)連續混合法、直接稀釋法及串聯稀釋法形成。
在特定實施例中，陽離子脂質可包含單獨或與其他陽離子脂質組合之式I-III之脂質或其鹽。在其他實施例中，非陽離子脂質為卵鞘磷脂(ESM)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼(POPC)、二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼(DPPC)、單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、14:0 PE (1,2-二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE))、16:0 PE (1,2-二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE))、18:0 PE (1,2-二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE))、18:1 PE (1,2-二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE))、18:1反式PE (1,2-二反式油醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE))、18:0-18:1 PE (1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE))、16:0-18:1 PE (1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE))、基於聚乙二醇之聚合物(例如PEG 2000、PEG 5000、經PEG修飾之二醯基甘油或經PEG修飾之二烷氧基丙基)、膽固醇、其衍生物或其組合。
在某些實施例中，核酸-脂質粒子經由連續混合法產生，該方法為例如一種包括以下之方法：提供包含於第一儲集層中之siRNA之水溶液，提供於第二儲集層中之有機脂質溶液(其中有機脂質溶液中存在之脂質在例如低碳數烷醇(諸如乙醇)之有機溶劑中溶解，且將水溶液與有機脂質溶液混合，以便有機脂質溶液與水溶液混合，以使得基本上瞬間產生將siRNA囊封在脂囊泡內之脂囊泡(例如脂質體)。此方法及用於進行此方法之設備詳細描述於美國專利公開案第20040142025號中，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。
將脂質及緩衝溶液連續引入混合環境，諸如混合室中之行為引起脂質溶液經緩衝溶液連續稀釋，從而基本上在混合後瞬間產生脂囊泡。如本文所用，短語「脂質溶液經緩衝溶液連續稀釋」(及變體)一般意謂在足夠力下脂質溶液足夠迅速地在水合過程中稀釋，以便產生囊泡。藉由混合包含核酸之水溶液與有機脂質溶液，有機脂質溶液在緩衝溶液(亦即水溶液)存在下進行連續逐步稀釋以產生核酸-脂質粒子。
使用連續混合法形成之核酸-脂質粒子通常具有約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、少於約120 nm、110 nm、100 nm、90 nm或80 nm或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm (其任何分數或其中之範圍)之尺寸。由此形成之粒子不聚集且視情況篩分以實現均勻粒度。
在另一實施例中，核酸-脂質粒子經由直接稀釋法產生，該方法包括形成脂囊泡(例如脂質體)溶液且立即且直接將脂囊泡溶液引入含有控制量之稀釋緩衝液之收集容器。在較佳態樣中，收集容器包括一或多個經組態以攪拌收集容器之內含物從而促進稀釋之元件。在一個態樣中，收集容器中存在之稀釋緩衝液之量基本上等於引入其中之脂囊泡溶液之體積。作為非限制性實例，於45%乙醇中之脂囊泡溶液在引入含有同等體積之稀釋緩衝液之收集容器時將有利地產生較小粒子。
在又一實施例中，核酸-脂質粒子經由串聯稀釋法產生，在該方法中含有稀釋緩衝液之第三儲集層以流體方式連接至第二混合區。在此實施例中，在第一混合區中結成之脂囊泡(例如脂質體)溶液立即且直接與第二混合區中之稀釋緩衝液混合。在較佳態樣中，第二混合區包括T形連接器，該T形連接器經配置以便脂囊泡溶液及稀釋緩衝液流呈相反180°流相遇；但是，可使用提供較淺角度之連接器，例如約27°至約180°(例如約90°)。抽吸機制將緩衝液之可控制流遞送至第二混合區。在一個態樣中，提供至第二混合區中之稀釋緩衝液之流速經控制以基本上等於自第一混合區引入其中之脂囊泡溶液之流速。此實施例有利地允許對與第二混合區中脂囊泡溶液混合之稀釋緩衝液之流動的更多控制，因此亦對整個第二混合過程中緩衝液中脂囊泡溶液之濃度進行更多控制。對稀釋緩衝液流速之此類控制有利地允許在降低濃度下形成小粒度。
此方法及用於進行此直接稀釋及串聯稀釋方法之設備詳細描述於美國專利公開案第20070042031號中，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。
使用直接稀釋及串聯稀釋法形成之核酸-脂質粒子通常具有約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、少於約120 nm、110 nm、100 nm、90 nm或80 nm或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm (其任何分數或其中之範圍)之尺寸。由此形成之粒子不聚集且視情況篩分以實現均勻粒度。
脂質粒子可藉由可用於將脂質體篩分之任何方法篩分。可進行篩分以便實現所需尺寸範圍及粒度之相對狹窄分佈。
若干技術可用於將粒子篩分至所需尺寸。用於脂質體及同等應用於本發明粒子之一種篩分方法描述於美國專利第4,737,323號中，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。藉由浴或探針超音波處理對粒子懸浮液進行超音波處理使尺寸逐漸減小至尺寸少於約50 nm之粒子。均質性為另一方法，其取決於剪切能以將較大粒子碎成較小粒子。在典型均質化程序中，粒子穿過標準乳液均質器再循環，直至觀察到通常介於約60 nm與約80 nm之間的所需粒度。在兩種方法中，粒度分佈可藉由習知雷射束粒度鑑別或QELS監測。
擠壓粒子穿過小孔聚碳酸酯膜或不對稱陶瓷膜亦為一種有效降低粒度至相對界限分明之尺寸分佈的方法。通常，懸浮液循環穿過膜一或多次，直至實現所需粒度分佈。粒子可擠壓穿過愈來愈小孔之膜，以實現尺寸逐漸減小。
在一些實施例中，粒子中存在之核酸(例如siRNA分子)如例如美國專利申請案第09/744,103號中所述預先縮合，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
在其他實施例中，方法可進一步包括添加非脂質聚陽離子，其可用於使用本發明之組合物實現細胞之脂質體轉染。合適非脂質聚陽離子之實例包括海美溴銨 (hexadimethrine bromide)(以商標名稱POLYBRENE® 出售，來自Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA)或抗肝素靈之其他鹽。其他合適聚陽離子包括例如聚-L-鳥胺酸、聚-L-精胺酸、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、聚烯丙基胺及聚乙烯亞胺。此等鹽之添加較佳在已形成粒子之後進行。
在一些實施例中，所形成之核酸-脂質粒子中核酸(例如siRNA)與脂質比率(質量/質量比)將在約0.01至約0.2、約0.05至約0.2、約0.02至約0.1、約0.03至約0.1或約0.01至約0.08之範圍內。起始物質(輸入)之比率亦屬於此範圍。在其他實施例中，粒子製備使用每10 mg總脂質約400 μg核酸，或約0.01至約0.08且更佳約0.04之核酸與脂質質量比，對應於每50 μg核酸1.25 mg總脂質。在其他較佳實施例中，粒子具有約0.08之核酸:脂質質量比。
在其他實施例中，所形成之核酸-脂質粒子中脂質與核酸(例如siRNA)比率(質量/質量比)將在約1 (1:1)至約100 (100:1)、約5 (5:1)至約100 (100:1)、約1 (1:1)至約50 (50:1)、約2 (2:1)至約50 (50:1)、約3 (3:1)至約50 (50:1)、約4 (4:1)至約50 (50:1)、約5 (5:1)至約50 (50:1)、約1 (1:1)至約25 (25:1)、約2 (2:1)至約25 (25:1)、約3 (3:1)至約25 (25:1)、約4 (4:1)至約25 (25:1)、約5 (5:1)至約25 (25:1)、約5 (5:1)至約20 (20:1)、約5 (5:1)至約15 (15:1)、約5 (5:1)至約10 (10:1)或約5 (5:1)、6 (6:1)、7 (7:1)、8 (8:1)、9 (9:1)、10 (10:1)、11 (11:1)、12 (12:1)、13 (13:1)、14 (14:1)、15 (15:1)、16 (16:1)、17 (17:1)、18 (18:1)、19 (19:1)、20 (20:1)、21 (21:1)、22 (22:1)、23 (23:1)、24 (24:1)或25 (25:1)範圍內或其任何分數或其中之範圍。起始物質(輸入)之比率亦屬於此範圍。
如先前所論述，結合脂質可進一步包括CPL。本文中論述用於製造脂質粒子-CPL (含CPL之脂質粒子)之多種通用方法。兩種通用技術包括「後插入」技術，亦即，CPL插入例如預先形成之脂質粒子；及「標準」技術，其中在例如脂質粒子形成步驟期間CPL包括於脂質混合物中。後插入技術產生主要在脂質粒子雙層膜之外表面中具有CPL之脂質粒子，而標準技術提供在內表面和外表面上具有CPL之脂質粒子。該方法尤其可用於由磷脂製成之囊泡(其可含有膽固醇)，以及含有PEG-脂質(諸如PEG-DAA及PEG-DAG)之囊泡。製造脂質粒子-CPL之方法在例如美國專利第5,705,385號、第6,586,410號、第5,981,501號、第6,534,484號及第6,852,334號、美國專利公開案第20020072121號及PCT公開案第WO 00/62813號中教示，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。脂質粒子之投與
脂質粒子(例如核酸-脂質粒子)可吸附至幾乎其混合或接觸之任何細胞類型。一旦吸附，粒子可由一部分細胞內吞，與細胞膜交換脂質，或與細胞融合。粒子之siRNA部分之轉移或併入可經由此等通道中之任一個進行。詳言之，當發生融合時，粒子膜整合至細胞膜中且粒子之內含物與細胞內流體組合。
脂質粒子(例如核酸-脂質粒子)可單獨或呈與根據投藥途徑及標準醫藥實踐選擇之醫藥學上可接受之載劑(例如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液)的混合物投與。一般地，生理緩衝食鹽水(例如135-150 mM NaCl)將用作醫藥學上可接受之載劑。其他合適載劑包括例如水、緩衝水、0.4%生理食鹽水、0.3%甘胺酸及其類似物，包括用於提高穩定性之醣蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。額外合適載劑描述於例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版(1985)中。如本文所用，「載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、媒劑、包衣、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體及其類似物。短語「醫藥學上可接受」係指當向人類投與時不產生過敏或類似不良反應之分子實體及組合物。
醫藥學上可接受之載劑一般在形成脂質粒子後添加。因此，在形成脂質粒子之後，粒子可在諸如生理緩衝食鹽水之醫藥學上可接受之載劑中稀釋。
醫藥調配物中粒子之濃度可廣泛地變化，亦即自以重量計少於約0.05%、通常或至少約2%至5%至多達約10%至90%，且將主要根據所選特定投與模式由流體體積、黏性等選擇。舉例而言，可增加濃度以降低與治療有關之流體負荷。此在患有動脈粥樣硬化相關之充血性心臟衰竭或重度高血壓之患者中可尤其合乎需要。可替代地，由刺激性脂質構成之粒子可稀釋至低濃度以減輕投與部位處之炎症。
醫藥組合物可藉由習知之熟知殺菌技術殺菌。水溶液可經包裝以供使用，或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑在投與前與無菌水溶液組合。根據需要組合物可含有醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條件，諸如pH值調節及緩衝劑、張力調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣。另外，粒子懸浮液可包括脂質保護劑，其保護脂質在儲存時避免自由基及脂質過氧化損傷。諸如α生育酚之親脂性自由基猝滅劑及諸如鐵草銨之水溶性鐵特異性螯合劑為合適的。活體內投與
用於活體內療法之全身遞送，例如經由身體系統，諸如循環遞送本文所述之siRNA分子，諸如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合至遠端標靶細胞可使用核酸-脂質粒子，諸如PCT公開案第WO 05/007196號、第WO 05/121348號、第WO 05/120152號及第WO 04/002453號中所述之核酸-脂質粒子實現，該等公開案之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
對於活體內投與而言，投與可呈此項技術中已知之任何方式，例如藉由注射、經口投與、吸入(例如經鼻內或氣管內)、經皮塗敷或經直腸投與。投與可經由單一或分次劑量實現。醫藥組合物可非經腸，亦即經關節內、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投與。在一些實施例中，醫藥組合物在靜脈內或腹膜內藉由彈丸注射(參見例如美國專利第5,286,634號)投與。細胞內核酸遞送亦論述於Straubringer等人,Methods Enzymol. , 101:512 (1983)；Mannino等人,Biotechniques, 6:682 (1988)；Nicolau等人,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst ., 6:239 (1989)；及Behr,Acc. Chem. Res ., 26:274 (1993)中。投與基於脂質之治療劑之其他方法描述於例如美國專利第3,993,754號、第4,145,410號、第4,235,871號、第4,224,179號、第4,522,803號及第4,588,578號中。脂質粒子可藉由直接注射在疾病部位或藉由注射在遠離疾病部位之部位來投與(參見例如Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. 第70-71頁(1994))。以上描述之參考文獻之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
在脂質粒子經靜脈內投與之實施例中，粒子總注射劑量之至少約5%、10%、15%、20%或25%在注射後約8小時、12小時、24小時、36小時或48小時存在於血漿中。在其他實施例中，脂質粒子總注射劑量之超過約20%、30%、40%及多達約60%、70%或80%在注射後約8小時、12小時、24小時、36小時或48小時存在於血漿中。在某些情況下，多個粒子中超過約10%在投與之後約1小時存在於人類血漿中。在某些其他情況下，在投與粒子之後至少約1小時可偵測到脂質粒子之存在。在一些實施例中，在投與之後約8小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時或96小時在細胞中可偵測到siRNA分子之存在。在其他實施例中，在投與之後約8小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時或96小時可偵測到siRNA分子對諸如病毒或宿主序列之標靶序列之表現的下調。在其他實施例中，siRNA分子對諸如病毒或宿主序列之標靶序列之表現的下調優先發生在受感染細胞及/或能夠被感染之細胞。在進一步實施例中，在投與之後約12小時、24小時、48小時、72小時或96小時或約6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、19天、20天、22天、24天、26天或28天，可偵測到接近或遠離投與部位之部位處細胞中siRNA分子之存在或作用。在其他實施例中，脂質粒子非經腸或腹膜內投與。
單獨或與其他合適組分組合之組合物可製成氣溶膠調配物(亦即其可「霧化」)以經由吸入來投與(例如經鼻內或氣管內) (參見Brigham等人,Am. J. Sci ., 298:278 (1989))。氣溶膠調配物可置於諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物的經加壓之可接受之推進劑中。
在某些實施例中，醫藥組合物可藉由鼻內噴霧、吸入及/或其他氣溶膠遞送媒劑遞送。用於經由經鼻氣溶膠噴霧直接遞送核酸組合物至肺之方法已描述於例如美國專利第5,756,353號及第5,804,212號中。同樣，使用鼻內微粒樹脂及溶血磷脂醯基-丙三醇化合物遞送藥物(美國專利5,725,871)亦為醫藥領域中所熟知。類似地，呈聚四氟乙烯支撐基質形式之經黏膜藥物遞送描述於美國專利第5,780,045號中。以上描述之專利之揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的。
適合於非經腸投與，諸如藉由關節內(在關節中)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內及皮下途徑之調配物包括水性及非水性之等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者之血液等滲之溶質；及水性及非水性之無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。
一般地，當經靜脈內投與時，脂質粒子調配物與合適醫藥載劑一起調配。合適調配物可見於例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版(1985)中。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.4%生理食鹽水、0.3%甘胺酸及其類似物，且可包括用於提高穩定性之醣蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。一般地，生理緩衝鹽水(例如135-150 mM NaCl)將用作醫藥學上可接受之載劑，但其他合適載劑亦滿足需要。此等組合物可藉由習知脂質體滅菌技術，諸如過濾來滅菌。根據需要組合物可含有醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條件，諸如pH值調節及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺酯等。此等組合物可使用以上提及之技術殺菌，或可替代地，其可在無菌條件下產生。所得水溶液可經包裝以供使用，或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑在投與前與無菌水溶液組合。
在某些應用中，本文揭示之脂質粒子可經由經口投與遞送至個體。粒子可併入有賦形劑，且呈可攝取錠劑、口頰錠、糖衣錠、膠囊、丸劑、口含錠、酏劑、嗽口水、懸浮液、口腔噴霧、糖漿、糯米紙及其類似物形式使用(參見例如美國專利第5,641,515號、第5,580,579號及第5,792,451號，其揭示內容以引用的方式整體併入本文中以達成所有目的)。此等口服劑型亦可含有以下：黏合劑、明膠；賦形劑、潤滑劑及/或調味劑。當單位劑型為膠囊時，除上述物質外，其可含有液體載劑。多種其他物質可作為包衣存在或以其他方式修飾劑量單元之外觀。當然，用於製備任何單位劑型之任何物質應為醫藥學上純的且在所採用之量下基本上無毒。
通常，此等口服調配物可含有至少約0.1%之脂質粒子或更多，雖然粒子之百分比當然可變化且宜介於總調配物之重量或體積之約1%或2%與約60%或70%或更多之間。當然，各治療有用組合物中粒子之量可以如下方式製備，以使得在化合物之任何既定單位劑量中將獲得合適劑量。製備此類醫藥調配物之技術之技術人員將預期諸如溶解性、生體可用率、生物半衰期、投藥途徑、產品貨架期以及其他藥理學考慮因素之因素，因而多種劑量及治療方案可為合乎需要的。
適合於經口投與之調配物可由以下組成：(a)液體溶液，諸如有效量之經包裝之siRNA分子(例如包含實例1中所述之三種siRNA分子之組合)懸浮在諸如水、生理食鹽水或PEG 400之稀釋劑中；(b)膠囊、小藥囊或錠劑，各含有預定量之siRNA分子，呈液體、固體、顆粒或明膠；(c)於適當液體中之懸浮液；及(d)合適乳液。錠劑形式可包括以下中之一或多個：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸鈣、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、填充劑、黏合劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑及醫藥學上可相容之載劑。口含錠形式可包含siRNA分子於例如蔗糖之調味劑中，以及包含治療性核酸於諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠乳液、凝膠及其類似物之除siRNA分子外含有此項技術中已知之載劑的惰性基質中的軟錠劑。
在其使用之另一實例中，脂質粒子可併入大量局部劑型中。舉例而言，含有核酸-脂質粒子之懸浮液可呈凝膠、油、乳液、局部乳膏、糊劑、軟膏、洗劑、泡沫、慕思及其類似物調配及投與。
所投與之粒子之量將視siRNA分子與脂質之比率、所使用之特定siRNA、所治療之HBV菌株、患者之年齡、體重及狀況及臨床醫師之判斷而定，但一般介於每公斤體重約0.01與約50 mg之間，較佳介於約0.1與約5 mg/kg體重之間，或每次投與約108 -1010 個粒子(例如注射)。
如本文所用，術語「組合」意謂組合之siRNA分子一起存在於相同物質組合物中(例如一起溶解於相同溶液內；或一起存在於相同脂質粒子內；或一起存在於脂質粒子之相同醫藥調配物中，不過醫藥調配物內之各脂質粒子可包括或不包括siRNA組合之各不同siRNA)。組合之siRNA分子通常不共價連接在一起。
在某些實施例中，在本發明之方法中使用siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)之組合。
在某些實施例中，siRNA經由核酸脂質粒子投與。
在某些實施例中，關於包括使用囊封在脂質粒子內之siRNA之混合物的方法，不同的siRNA分子共同囊封於相同脂質粒子中。
在某些實施例中，關於包括使用囊封在脂質粒子內之siRNA之混合物的方法，存在於混合物中之各類型siRNA物質囊分在其自身粒子中。
在某些實施例中，關於包括使用囊封在脂質粒子內之siRNA之混合物的方法，一些siRNA物質共同囊封在相同粒子中，而其他siRNA物質囊封在不同粒子中。兩種或更多種藥劑之調配及投與
如本文所述，本發明之方法包括投與脂質奈米粒子調配物、干擾素及視情況至少一種額外治療劑。應瞭解此等藥劑可一起調配於單一製劑中，或其可分開調配，因此分開投與，同時或相繼。在一個實施例中，當藥劑相繼(例如在不同時間)投與時，藥劑可經投與以便其生物作用重疊(各藥劑在單一給定時間產生生物作用)。
在某些實施例中，首先投與脂質奈米粒子調配物且接著投與IFN。
在某些實施例中，首先投與IFN且接著投與脂質奈米粒子調配物。
在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物之投與在投與IFN之前例如約30週至約1週、約24週至約6週或約12週至約6週開始(亦即脂質奈米粒子在單藥治療期投與)。在某些實施例中，脂質奈米粒子在投與IFN之前投與兩次或更多次。
在某些實施例中，此類單藥治療期後面為共同治療期。在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及IFN在共同治療期期間同時投與人類(例如在同一週、天或小時)。舉例而言，在某些實施例中，IFN及脂質奈米粒子調配物在彼此之約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天內投與。在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及IFN之投與在同一天開始。在某些實施例中，IFN及脂質奈米粒子在彼此之約12小時、11小時、10小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時或1小時內投與。在某些實施例中，IFN之投與在投與脂質奈米粒子調配物前約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天開始。在某些實施例中，IFN之投與在投與脂質奈米粒子調配物前約3天開始。在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及IFN之投與在同一天開始。在某些實施例中，IFN之投與在投與脂質奈米粒子調配物前約12小時、11小時、10小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時或1小時開始。在某些實施例中，脂質奈米粒子調配物及/或IFN在共同治療期期間投與兩次或更多次。
藥劑可經調配且使用任何可接受之投藥途徑投與，視所選藥劑而定。舉例而言，合適途徑包括(但不限於)經口、舌下、經頰、局部、經皮、非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內，及對於局部治療必要時，損害內投與。在一個實施例中，本文中鑑別之小分子藥劑可經口投與。在另一實施例中，寡聚核苷酸可藉由注射(例如至血管，諸如靜脈)或皮下投與。在一些實施例中，有需要之個體經口投與一或多種藥劑(例如呈丸劑形式)，且亦藉由注射或皮下投與一或多種寡聚核苷酸。在一些實施例中，有需要之個體藉由注射或皮下投與干擾素及脂質奈米粒子調配物。
通常，靶向B型肝炎基因組之寡聚核苷酸例如於脂質奈米粒子調配物中經靜脈內投與；但是，本發明不侷限於包含寡聚核苷酸之靜脈內調配物或其中寡聚核苷酸經靜脈內投與之治療方法。
藥劑可藉由在周圍溫度下在適當pH值下且在所需純度下與生理學上可接受之載劑，亦即在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒之載劑混合而個別地調配。調配物之pH值主要視化合物之特定用途及濃度而定，但通常可在約3至約8之範圍內變化。藥劑通常將呈固體組合物儲存，不過凍乾調配物或水溶液亦可接受。
包含藥劑之組合物可以符合良好醫療實踐之方式調配、給藥及投與。在此背景下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定人類、個別患者之臨床病狀、病症之起因、投與部位、投與方法、投藥時程及開業醫生已知之其他因素。
藥劑可以任何合宜之投與形式投與，例如錠劑、粉劑、膠囊、溶液、分散液、懸浮液、糖漿、噴霧、栓劑、凝膠、乳液、貼片等。此類組合物可含有醫藥製劑中習知之組分，例如稀釋劑、載劑、pH調節劑、甜味劑、增積劑及其他活化劑。若意欲非經腸投與，則組合物將為無菌的且呈適合於注射或輸注之溶液或懸浮液形式。
合適載劑及賦形劑為熟習此項技術者所熟知且詳細描述於例如Ansel, Howard C.等人, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004；Gennaro, Alfonso R.等人, Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000；及Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005。調配物亦可包括以下中之一或多種：緩衝劑、穩定劑、界面活性劑、潤濕劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、抗氧化劑、避光劑、助流劑、加工助劑、著色劑、甜味劑、芳香劑、調味劑、稀釋劑及已知提供藥物之精美呈現或幫助製造藥品(亦即藥劑)的其他添加劑。
藥劑通常至少以實現所需生物作用之水準給與。因此，有效給藥方案將至少給與實現所需生物作用之最低量，或生物有效劑量，但是，劑量不應高致不可接受之副作用超過生物作用之益處。因此，有效給藥方案將給與至多最大耐受劑量(「MTD」)。最大耐受劑量定義為產生可接受之劑量限制性毒性(「DLT」)發生率的最高劑量。引起不可接受之DLT率的劑量視為不耐受。通常，特定時程之MTD在1期臨床試驗中確定。此等通常在患者中藉由以囓齒類動物中嚴重中毒劑量(以mg/m2 計算) 1/10 (「STD10」)之安全開始劑量開始，且以一群三個增加患者，根據經修改之斐波納契序列(Fibonacci sequence)逐步升高劑量來進行，其中愈高升高步驟具有愈遞減之相對增量(例如100%、65%、50%、40%及30%之劑量增加至其後35%)。在一群三個患者中繼續逐步升高劑量，直至到達不耐受劑量。產生可接受之DLT率之下一較低劑量水準視為MTD。
所投藥劑之量將視所用特定藥劑、所治療之HBV菌株、患者之年齡、體重及病狀及臨床醫師之判斷而定，但一般介於每日約0.2至2.0克之間。套組
一個實施例提供套組。套組可包含有包含組合之容器。合適容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包裝等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器可容納有效治療病狀之組合且可具有無菌入口(例如容器可為具有皮下注射針可刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。
套組可進一步包含在容器上或與容器相連之標籤或包裝說明書。術語「包裝說明書」用於指通常包括在治療劑之商業包裝內之說明書，其含有有關適應症、用量、劑量、投與、禁忌症及/或關於此類治療治療劑使用之警告的資訊。在一個實施例中，標籤或包裝說明書指示治療劑可用於治療病毒感染，諸如B型肝炎。
在某些實施例中，套組適合於遞送治療劑之固體口服形式，諸如錠劑或膠囊。此類套組較佳包括許多單位劑量。此類套組可包括具有按其預期用途之次序取向之劑量的卡片。此類套組之一實例為「泡罩包裝」。泡罩包裝為包裝工業中熟知，且廣泛用於包裝醫藥單位劑型。必要時，記憶輔助工具可例如呈數目、字母或其他記號形式或利用日曆插入物提供，指定治療時程中可投與劑量之日。
根據另一實施例，套組可包含(a)其中含有一種藥劑之第一容器；及(b)其中含有第二藥劑之第二容器。可替代地或另外，套組可進一步包含第三容器，該第三容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者立場合乎需要之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
套組可進一步包含關於投與治療劑之指導。舉例而言，套組可進一步包含關於同時、相繼或分開投與治療劑至有需要之患者之指導。
在某些其他實施例中，套組可包含用於含有分開組合物之容器，諸如分開之瓶子或分開之箔包裝，但是，分開組合物亦可含於單個未分開之容器中。在某些實施例中，套組包含關於投與分開治療劑之指導。當分開治療劑較佳呈不同劑型投與(例如經口及非經腸)、以不同劑量時間間隔投與或藉由開處方之醫師意欲滴定組合之個別治療劑時，套組形式尤其有利。
治療劑組合治療B型肝炎之能力可使用此項技術熟知之藥理學模型確定。
現藉由以下非限制性實例說明本發明。實例 1 IFNα2a 與 siRNA 組合之活體外組合 研究目標：
為確定siRNA分子(靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物的脂質奈米粒子調配物且抑制HBV DNA、HBsAg及HBeAg之產生)與聚乙二醇化干擾素α2a (IFNα2a，一種活化肝細胞中之先天免疫路徑且臨床上用於治療慢性B型肝炎之抗病毒細胞介素)之雙藥物組合為累加、協同或拮抗的，在活體外在細胞培養模型系統中使用HBV感染之人類初級肝細胞。脂質奈米粒子調配物：
脂質奈米粒子調配物包含靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物。具體而言，在本文中報導之實驗中以下脂質奈米粒子(LNP)調配物用於遞送HBV siRNA。在整個本實例中此調配物稱為siRNA-NP2 。表中所示之值為莫耳百分比。縮寫DSPC意謂二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。 陽離子脂質具有以下結構：
靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物用於此實驗中。三種siRNA之序列顯示如下。 結果及結論：
將IFNα2a (3倍連續稀釋且5點滴定，濃度範圍為25.0 IU/mL至0.31 IU/mL)與上文論述之siRNA-NP2 (3倍連續稀釋且5點滴定，濃度範圍為5.0 ng/mL至0.06 ng/mL)組合進行測試。HBV DNA、HBsAg及HBeAg之平均抑制%以及在單獨IFNa2a或siRNA-NP2 治療或組合下觀察到之3個重複實驗之標準偏差展示於如下所指示之表1、2及3中。在較早期實驗中確定IFNα2a及siRNA-NP2 之EC50 值且展示於表4中；自不同批次PHH細胞觀察到一些變化。
當雙抑制劑組合之觀察值與針對以上濃度範圍自累加相互作用所預期之情況相比較時，(表4)根據MacSynergy II分析及使用以上由Prichard及Shipman (1992)所述之解釋標準，發現組合為協同或累加的，視所量測之終點(HBV DNA、HBsAg或HBeAg)而定。藉由顯微術或CellTiter-Glo分析未觀察到細胞活力之顯著抑制。表 1 ：活體外 IFNα2a 與 siRNA-NP2 之組合對 HBV DNA 之作用 表 2 ：活體外 IFNα2a 與 siRNA-NP2 之組合對 HBsAg 之作用 表 3 ：活體外 IFNα2a 與 siRNA-NP2 之組合對 HBeAg 之作用 表 4 ：在 PHH 細胞培養系統中 IFNα2a 及 siRNA-NP2 之活體外組合研究的結果概述：
所有公開案、專利及專利文件均以引用的方式併入本文中，如同以引用的方式個別地併入一般。已參考多種特定及較佳實施例及技術描述本發明。但是，應瞭解可進行許多變化及修改，同時保持在本發明之精神及範疇內。

Claims (48)

  1. 一種用於治療人類之B型肝炎的方法，其包括向該人類投與： 1) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 2) 干擾素(IFN)。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該IFN為IFNα (IFN-α)、IFNβ (IFN-β)或IFNλ (IFN-λ)。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該IFN為IFN-α。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該IFN-α為聚乙二醇化IFN-α2a或聚乙二醇化IFN-α2b。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中該脂質奈米粒子調配物進一步包含陽離子脂質及非陽離子脂質。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該陽離子脂質係選自由以下組成之群：1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15 ))、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA；化合物(8 ))、4-(二甲基胺基)丁酸)(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(化合物(7 ))、5-(二甲基胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13 ))、其鹽及其混合物。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該陽離子脂質為：。
  8. 如申請專利範圍第5項至第7項中任一項之方法，其中該非陽離子脂質為膽固醇或其衍生物。
  9. 如申請專利範圍第5項至第7項中任一項之方法，其中該非陽離子脂質為磷脂。
  10. 如申請專利範圍第5項至第7項中任一項之方法，其中該非陽離子脂質為磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物。
  11. 如申請專利範圍第9項或第10項之方法，其中該磷脂係選自由以下組成之群：二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及其混合物。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該磷脂為DSPC。
  13. 如申請專利範圍第5項至第12項中任一項之方法，其中該脂質調配物進一步包含抑制粒子聚集之結合脂質。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該抑制粒子聚集之結合脂質為聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該PEG-脂質結合物係選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(PEG-DMA)結合物及其混合物。
  16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該PEG-脂質結合物為PEG-C-DMA結合物。
  17. 如申請專利範圍第5項至第16項中任一項之方法，其中該陽離子脂質佔該調配物內每個粒子中存在之總脂質之約48 mol%至約62 mol%。
  18. 如申請專利範圍第10項至第17項中任一項之方法，其包含磷脂及膽固醇或膽固醇衍生物，其中該磷脂佔該調配物內每個粒子中存在之總脂質之約7 mol%至約17 mol%，且該膽固醇或其衍生物占該調配物內每個粒子中存在之總脂質之約25 mol%至約40 mol%。
  19. 如申請專利範圍第13項至第18項中任一項之方法，其中該抑制粒子聚集之結合脂質佔該調配物內每個粒子中存在之總脂質之約0.5 mol%至約3 mol%。
  20. 如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之方法，其中該脂質奈米粒子調配物經由注射投與。
  21. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之方法，其中該IFN經由注射投與。
  22. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之方法，其中該脂質奈米粒子調配物及該IFN分開投與。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之方法，其中該脂質奈米粒子調配物及該IFN相繼投與。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中首先投與該脂質奈米粒子調配物且接著投與該IFN。
  25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中首先投與該IFN且接著投與該脂質奈米粒子調配物。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之方法，其中該脂質奈米粒子調配物及該IFN同時投與。
  27. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之方法，其中向該人類投與包含該脂質奈米粒子調配物、該IFN及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
  28. 如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之方法，其進一步包括投與至少一種額外治療劑。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該至少一種額外治療劑係選自由以下組成之群： (A) 控制病毒複製之藥劑； (B) 降低病毒Ag之藥劑； (C) 免疫增強劑；及 (D) 免疫刺激劑。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為逆轉錄酶抑制劑、衣殼抑制劑、cccDNA抑制劑或進入抑制劑。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為逆轉錄酶抑制劑。
  32. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為衣殼抑制劑。
  33. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為cccDNA抑制劑。
  34. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為進入抑制劑。
  35. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為恩替卡韋(entecavir)、克拉夫定(clevudine)、替比夫定(telbivudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(adefovir)及替諾福韋(tenofovir)、替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil)、替諾福韋艾拉酚胺(tenofovir alafenamide)、反丁烯二酸替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate)、阿德福韋二匹伏酯(adefovir dipivoxil)、(1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥甲基)-4-亞甲基環戊-1-醇、恩曲他濱(emtricitabine)、阿巴卡韋(abacavir)、艾夫他濱(elvucitabine)、更昔洛韋(ganciclovir)、洛布卡韋(lobucavir)、泛昔洛韋(famciclovir)、噴昔洛韋(penciclovir)、胺多索韋(amdoxovir)或CMX157 (替諾福韋艾力德斯(tenofovir exalidex))。
  36. 如申請專利範圍第29項至第35項中任一項之方法，其中該降低病毒Ag之藥劑為靶向HBV基因組之一部分的siRNA。
  37. 如申請專利範圍第29項至第35項中任一項之方法，其中該降低病毒Ag之藥劑為sAg分泌抑制劑。
  38. 如申請專利範圍第29項至第35項中任一項之方法，其中該降低病毒Ag之藥劑為抗HBsAg藥劑。
  39. 如申請專利範圍第29項至第38項中任一項之方法，其中該免疫增強劑為檢查點抑制劑。
  40. 如申請專利範圍第29項至第38項中任一項之方法，其中該免疫增強劑為PD-L1抑制劑。
  41. 如申請專利範圍第29項至第38項中任一項之方法，其中該免疫增強劑為抗PD-1 mAb、抗PD-L1 mAb、抗PD-L2 mAb、抗CTLA4 mAb、抗VISTA mAb、抗LAG3 mAb、抗TIM3 mAb、肽模擬物或小分子化合物。
  42. 如申請專利範圍第29項至第41項中任一項之方法，其中該免疫刺激劑為抗HBV疫苗、干擾素、RIG-I促效劑、STING促效劑、TLR9促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR3促效劑、IL-7、IL-2、OX-40促效劑或抗GITR促效劑。
  43. 一種脂質奈米粒子調配物，其與干擾素組合用於預防性或治療性治療B型肝炎，其中該脂質奈米粒子調配物包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)。
  44. 一種脂質奈米粒子調配物之用途，其與干擾素(IFN)組合用於製備供治療人類之B型肝炎用的藥劑，其中該脂質奈米粒子調配物包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)。
  45. 一種組合物，其包含：(a) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 (b) 干擾素。
  46. 如申請專利範圍第45項之組合物，其為進一步包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
  47. 一種套組，其包含： (a) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)； (b) 干擾素；及 (c) 關於該脂質奈米粒子調配物及該干擾素同時、相繼或分開投與之說明書。
  48. 一種用於治療人類之D型肝炎的方法，其包括向該人類投與： 1) 脂質奈米粒子調配物，其包含siRNA 1 (SEQ ID NO:1及2)、siRNA 2 (SEQ ID NO:3及4)及siRNA 3 (SEQ ID NO:5及6)；及 2) 干擾素(IFN)。
TW107120864A 2017-06-16 2018-06-15 用於治療ｂ型肝炎之治療組合物及方法 TW201919653A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762520981P 2017-06-16 2017-06-16
US62/520,981 2017-06-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201919653A true TW201919653A (zh) 2019-06-01

Family

ID=64660917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107120864A TW201919653A (zh) 2017-06-16 2018-06-15 用於治療ｂ型肝炎之治療組合物及方法

Country Status (3)

Country Link
AR (1) AR112166A1 (zh)
TW (1) TW201919653A (zh)
WO (1) WO2018232330A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114173784A (zh) * 2019-07-18 2022-03-11 埃尼奥制药公司 降低干扰素的副作用的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3062591A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Gritstone Oncology, Inc. Alphavirus neoantigen vectors
JP7457733B2 (ja) 2019-05-30 2024-03-28 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 改変アデノウイルス
WO2021236389A2 (en) * 2020-05-16 2021-11-25 Bond Jason R Treatment of known and unknown viral infection with lipid agents
AU2021320896A1 (en) 2020-08-06 2023-03-23 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067249B2 (en) * 2003-05-19 2006-06-27 The University Of Hong Kong Inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication by RNA interference
US20080096839A1 (en) * 2005-03-09 2008-04-24 Mogam Biotechnology Research Institute Small Interfering Rna and Pharmaceutical Composition for Treatment of Hepatitis B Comprising the Same
CN101242857A (zh) * 2005-08-15 2008-08-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于HBV治疗的PEG-IFNa和利巴韦林
WO2012000104A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
CN107208095B (zh) * 2014-10-02 2021-11-16 阿布特斯生物制药公司 用于使乙型肝炎病毒基因表达沉默的组合物和方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114173784A (zh) * 2019-07-18 2022-03-11 埃尼奥制药公司 降低干扰素的副作用的方法
CN114173784B (zh) * 2019-07-18 2023-12-01 埃尼奥制药公司 降低干扰素的副作用的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AR112166A1 (es) 2019-09-25
WO2018232330A1 (en) 2018-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230372245A1 (en) Lipid formulations for nucleic acid delivery
US20230212578A1 (en) Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
US20180245074A1 (en) Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2016071857A1 (en) Compositions and methods for silencing ebola virus expression
AU2015328012A1 (en) Compositions and methods for silencing Hepatitis B virus gene expression
WO2017019891A2 (en) Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
US11904052B2 (en) Methods for ameliorating infusion reactions
TW201919653A (zh) 用於治療ｂ型肝炎之治療組合物及方法
TW201907009A (zh) 用於治療b型肝炎之治療組成物及方法
US20240050463A1 (en) Therapeutic compositions and methods for treating hepatitis b
AU2013202932A1 (en) Novel lipid formulations for nucleic acid delivery