TW201907009A

TW201907009A - 用於治療b型肝炎之治療組成物及方法

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Publication number: TW201907009A
Application number: TW107118741A
Authority: TW
Inventors: 艾美ＣＨ李; 愛蜜莉 P 西
Original assignee: 加拿大商艾爾布圖斯生技公司
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-02-16
Also published as: WO2018222910A1; US20220265817A1; EP3634431A1; CA3065518A1; AR111908A1; EP3634431A4

Abstract

本發明提供適用於治療B型肝炎之治療組合及治療方法。

Description

用於治療B型肝炎之治療組成物及方法

B型肝炎病毒(縮寫為「HBV」)為嗜肝DNA病毒家族之成員。病毒顆粒(有時稱為病毒體)包括外部脂質包膜及由蛋白質組成之二十面體核衣殼核心。核衣殼包含病毒DNA及具有逆轉錄酶活性之DNA聚合酶。外包膜包含經嵌入蛋白質，其參與病毒結合及進入易感細胞(通常為肝細胞)。除感染性病毒顆粒外，經感染個體血清中亦可發現缺少核心的絲狀及球形體。該等顆粒不具有傳染性，且由形成病毒顆粒表面一部分之脂質及蛋白質組成，稱為表面抗原(HBsAg)，且在病毒生命週期中過量產生。

HBV之基因組由環狀DNA構成，但由於DNA不完全是雙鏈，因此是不常見的。全長鏈之一端與病毒DNA聚合酶連接。基因組長3020-3320個核苷酸(全長鏈)及長1700-2800個核苷酸(對於較短鏈)。負義(非編碼)與病毒mRNA互補。病毒DNA在感染細胞後不久就在細胞核中找到。有四種基因組編碼之已知基因，稱為C，X，P及S。核心蛋白由基因C(HBcAg)編碼，且其起始密碼前有上游框內AUG起始密碼子，由其產生前核心蛋白。HBeAg藉由前核心蛋白之蛋白水解加工產生。DNA聚合酶由基因P編碼。基因S為編碼表面抗原(HBsAg)之基因。HBsAg基因是一個長開放閱讀框，但含有三個框內「起始」(ATG)密碼子，其將基因分成三個部分即前S1、前S2及S。由於多個起始密碼子，產生具有稱為大、中及小之三種不同尺寸之多肽。基因X編碼之蛋白質的功能尚未完全瞭解，但與肝癌之發展有關。HBV複製是一個複雜過程。儘管複製發生在肝臟中，但病毒會傳播到血液中，病毒蛋白及針對它們之抗體會在感染者身上找到。HBV之結構、複製及生物學在D.Glebe及C.M.Bremer, Seminars in Liver Disease, 第33卷, 第2期, 第103-112頁(2013)。

HBV感染人類可導致肝臟感染性炎性疾病。受感染個體可能許多年不會出現症狀。據估計，約三分之一世界人口在其生活中曾經有過一次感染，其中包括3.5億慢性攜帶者。

藉由暴露於傳染性血液或體液來傳播病毒。圍產期感染亦可能是主要的感染途徑。急性疾病導致肝臟炎症、嘔吐、黃疸，且可能導致死亡。慢性B型肝炎最終可能導致肝硬化及肝癌。

儘管大多數感染HBV之人藉由其免疫系統之作用來清除感染，但一些感染者會遭受侵襲性感染(暴發性肝炎)；而其他人則慢性感染，從而增加他們患肝病之機會。目前有若干種藥物經批准用於治療HBV感染，但受感染個體對該等藥物有不同程度的成功反應，且該等藥物均未從感染者身上清除病毒。

D型肝炎病毒(HDV)是一種小型環狀包膜RNA病毒，該病毒僅在B型肝炎病毒(HBV)存在下才能繁殖。特別是，HDV需要HBV表面抗原蛋白自身繁殖。與僅HBV感染相比，用HBV及HDV感染會導致更嚴重的併發症。該等併發症包括在急性感染中發生肝衰竭的可能性增加，且迅速發展為肝硬化，在慢性感染中發生肝癌的機會增加。與B型肝炎病毒相結合，D型肝炎在所有肝炎感染中之死亡率最高。HDV之傳播途徑與HBV之傳播途徑相似。感染主要限於HBV感染高危人群，特別是注射吸毒者及接受凝血因子濃縮劑的人群。

因此，持續需要用於治療人類HBV感染，以及用於治療人類中的HBV/HDV感染之組成物及方法。

本發明提供適用於治療病毒感染如HBV及/或HDV之治療組合及治療方法。如此，在某些實施例中，提供以下內容。

某些實施例提供一種用於治療人類B型肝炎之方法，其包含向人類投與：靶向HBV基因組之一部分之siRNA； PD-L1抑制劑；及抗-HBV疫苗。

某些實施例提供一種用於治療人類B型肝炎之方法，其包含向人類投與來自以下至少三種藥劑類別之至少一種藥劑： (A) 控制病毒複製之藥劑； (B) 減少病毒Ag之藥劑； (C) 免疫增強劑；及 (D) 免疫刺激劑。

某些實施例提供一種用於治療人類D型肝炎之方法，其包含向人類投與：靶向HBV基因組之一部分之siRNA； PD-L1抑制劑；及抗-HBV疫苗。

某些實施例提供一種用於治療人類D型肝炎之方法，其包含向人類投與來自以下至少三種藥劑類別之至少一種藥劑： (A) 控制病毒複製之藥劑； (B) 減少病毒Ag之藥劑； (C) 免疫增強劑；及 (D) 免疫刺激劑。

某些實施例提供一種用於治療人類B型肝炎及/或D型肝炎之方法，其包含首先向人類投與減少病毒Ag之藥劑且然後投與改善對B型肝炎病毒之免疫反應之藥劑。

在某些實施例中，該方法可以用於治療HBV及HDV。

在某些實施例中，該方法亦包含投與控制病毒複製之藥劑。

在某些實施例中，PD-L1抑制劑為抗-PD-L1 mAb。

在某些實施例中，抗-HBV疫苗是靶向HBV表面抗原的疫苗。

在某些實施例中，靶向HBV基因組之一部分之siRNA及PD-L1抑制劑同時投與。

在某些實施例中，抗-HBV疫苗在投與siRNA及PD-L1抑制劑後投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與siRNA及PD-L1抑制劑同時或之前投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑與投與siRNA及PD-L1抑制劑同時投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與siRNA及PD-L1抑制劑之前投與。

在某些實施例中，siRNA、PD-L1抑制劑及抗-HBV疫苗同時投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與siRNA、PD-L1抑制劑及抗-HBV疫苗同時或之前投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑與投與siRNA、PD-L1抑制劑及抗-HBV疫苗同時投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與siRNA、PD-L1抑制劑及抗-HBV疫苗之前投與。

在某些實施例中，該siRNA經投與，該PD-L1抑制劑之投與在開始投與siRNA之後開始，且該抗-HBV疫苗之投與在開始該PD-L1抑制劑之後開始。該等投與可在某些實施例中重疊。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑亦經投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑為逆轉錄酶抑制劑、衣殼抑制劑、cccDNA抑制劑、或進入抑制劑。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑為逆轉錄酶抑制劑。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑為衣殼抑制劑。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑為cccDNA抑制劑。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑為進入抑制劑。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑為恩替卡韋(entecavir)、克拉夫定(clevudine)、替比夫定(telbivudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(adefovir)、及替諾福韋(tenofovir)、替諾福韋地索普西(tenofovir disoproxil)、替諾福韋艾拉酚胺(tenofovir alafenamide)、替諾福韋地索普西富馬酸鹽、阿德福韋二匹伏酯(adefovir dipivoxil)、(1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥甲基)-4-亞甲基環戊烷-1-醇、恩曲他濱(emtricitabine)、阿巴卡韋(abacavir)、艾夫他濱(elvucitabine)、更昔洛韋(ganciclovir)、洛布卡韋(lobucavir)、泛昔洛韋(famciclovir)、噴西洛維(penciclovir)、氨多索韋(amdoxovir)或CMX157(替諾福韋exalidex)。

在某些實施例中，減少病毒Ag之藥劑為靶向HBV基因組之一部分(例如siRNA，或本文描述之siRNA分子之雙向或三向組合)之siRNA。

在某些實施例中，減少病毒Ag之藥劑為sAg分泌抑制劑。

在某些實施例中，減少病毒Ag之藥劑為抗-HBsAg藥劑。

在某些實施例中，免疫增強劑為檢查點抑制劑。

在某些實施例中，免疫增強劑為PD-L1抑制劑。

在某些實施例中，免疫增強劑為抗-PD-1 mAb、抗-PD-L1 mAb、抗-PD-L2 mAb、抗-CTLA4 mAb、抗-VISTA mAb、抗-LAG3 mAb、抗-TIM3 mAb、或肽模擬物。

在某些實施例中，免疫刺激劑為抗-HBV疫苗、干擾素、RIG-1促效劑、STING促效劑、TLR9促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR3促效劑、IL-7、IL-2、OX-40促效劑、或抗-GITR促效劑。

在某些實施例中，減少病毒Ag之藥劑及免疫增強劑經同時投與。

在某些實施例中，免疫刺激劑在投與減少病毒Ag之藥劑及免疫增強劑之後投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與減少病毒Ag之藥劑及免疫增強劑同時或之前投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與減少病毒Ag之藥劑及免疫增強劑同時投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與減少病毒Ag之藥劑及免疫增強劑之前投與。

在某些實施例中，減少病毒Ag之藥劑、免疫增強劑及免疫刺激劑經同時投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與減少病毒Ag之藥劑、免疫增強劑及免疫刺激劑同時或之前投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與減少病毒Ag之藥劑、免疫增強劑及免疫刺激劑同時投與。

在某些實施例中，控制病毒複製之藥劑在投與減少病毒Ag之藥劑、免疫增強劑及免疫刺激劑之前投與。

在某些實施例中，投與減少病毒Ag之藥劑，在開始投與減少病毒Ag之藥劑之後開始投與免疫增強劑，且在開始投與免疫增強劑之後開始投與免疫刺激劑。

在某些實施例中，來自四種藥劑類別中每一者之至少一種藥劑經投與。

在某些實施例中，改善免疫反應之藥劑是免疫增強劑。

在某些實施例中，改善免疫反應之藥劑是免疫刺激劑。

在某些實施例中，該方法亦包含投與控制病毒複製之藥劑。

本文提供之實施例揭示使用針對HBV具有不同作用機制之藥物進行的多種組合(例如三向組合)研究之結果。如本文所述，多種藥劑組合顯展示乎意料的協同相互作用，且組合通常缺乏拮抗作用。

相關申請案之交互參照

本專利申請案主張2017年5月31日申請之美國申請案序號62/513,261之權益，該申請案以引用方式併入本文中。

本發明提供適用於治療病毒感染如HBV及/或HDV之治療組合及治療方法。在某些實施例中，可以特定順序投與以下類別之治療劑治療以優化HBV治療，如本文所述。I. 控制病毒複製之藥劑

I類治療係關於使用控制(例如抑制)病毒複製之藥劑。 A. 逆轉錄酶抑制劑

在某些實施例中，逆轉錄酶抑制劑是核苷類似物。

在某些實施例中，逆轉錄酶抑制劑是核苷類似物逆轉錄酶抑制劑(NARTI或NRTI)。

在某些實施例中，逆轉錄酶抑制劑為核苷酸類似物逆轉錄酶抑制劑(NtARTI或NtRTI)。

術語逆轉錄酶抑制劑包括但不限於，恩替卡韋、克拉夫定、替比夫定、拉米夫定、阿德福韋、及替諾福韋、替諾福韋地索普西、替諾福韋艾拉酚胺、替諾福韋地索普西富馬酸鹽、阿德福韋二匹伏酯、(1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥基甲基)-4-亞甲基環戊烷-1-醇(描述於美國專利8,816,074中)、恩曲他濱、阿巴卡韋、艾夫他濱、更昔洛韋、洛布卡韋、泛昔洛韋、噴昔洛韋、氨多索韋、及CMX157(替諾福韋exalidex)。

術語逆轉錄酶抑制劑包括但不限於，恩替卡韋、拉米夫定、及(1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥甲基)-4-亞甲基環戊-1-醇。

術語逆轉錄酶抑制劑包括但不限於，上述逆轉錄酶抑制劑之經共價結合胺基磷酸酯或膦醯胺化物部分，或如例如美國專利案號8,816,074、US 2011/0245484 A1、及US 2008/0286230A1所述。

術語逆轉錄酶抑制劑包括但不限於包含胺基磷酸酯部分之核苷酸類似物，例如((((1R,3R,4R,5R)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-羥基-2-亞甲基環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯及((((1R,2R,3R,4R)-3-氟-2-羥基-5-亞甲基-4-(6-氧代-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯。亦包括其個別非鏡像異構物，包括例如((R)-(((1R,3R,4R,5R)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-羥基-2-亞甲基環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯及((S)-(((1R,3R,4R,5R)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-羥基-2-亞甲基環戊基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-(D或L)-丙胺酸甲酯。

術語逆轉錄酶抑制劑包括但不限於膦醯胺化物部分，例如替諾福韋艾拉酚胺，以及US 2008/0286230 A1所描述者。用於製備含有活性劑的立體選擇性胺基磷酸酯或膦醯胺化物的方法描述於例如美國專利號8,816,074以及US 2011/0245484 A1及US 2008/0286230 A1中。 B. 衣殼抑制劑

如本文所述，術語「衣殼抑制劑」包括能夠直接或間接抑制衣殼蛋白之表現及/或功能的化合物。例如，衣殼抑制劑可以包括但不限於任何抑制衣殼組裝、誘導非衣殼聚合物形成、促進過量衣殼組裝或經錯誤導向衣殼組裝、影響衣殼穩定化、及/或抑制RNA衣殼化之化合物。衣殼抑制劑亦包括任何在復製過程內之下游事件中抑制衣殼功能(例如，病毒DNA合成、鬆弛環狀DNA(rcDNA)轉運到細胞核中、共價閉合環狀DNA(cccDNA)形成、病毒成熟、萌芽及/或釋放、及其類似功能)之化合物。例如，在某些實施例中，抑制劑可偵測地抑制例如使用本文所述的測定法量測之衣殼蛋白之表現水平或生物學活性。在某些實施例中，抑制劑抑制病毒生命週期之rcDNA及下游產物水平達至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%或至少90%。

術語衣殼抑制劑包括國際專利申請公開案號WO2013006394、WO2014106019及WO2014089296中描述之化合物，包括以下化合物：。

術語衣殼抑制劑亦包括化合物Bay-41-4109 (參見國際專利申請公開案號WO/2013/144129)、AT-61 (參見國際專利申請公開案號WO/1998/33501；及King, RW等人, Antimicrob Agents Chemother.,1998 ,42 , 12, 3179–3186)、DVR-01 及DVR-23 ( 參見國際專利申請公開案號WO 2013/006394；及Campagna, MR等人, J. of Virology, 2013, 87, 12, 6931，及其醫藥學上可接受之鹽：

術語衣殼抑制劑亦包括化合物化合物3、GLS-4及NVR 3-778。 C.cccDNA 形成抑制劑

共價閉合環狀DNA(cccDNA)由病毒rcDNA在細胞核中產生，且用作病毒mRNA之轉錄模板。如本文所述，術語「cccDNA形成抑制劑」包括能夠直接或間接抑制cccDNA形成及/或穩定性之化合物。例如，cccDNA形成抑制劑可以包括但不限於任何抑制衣殼解組裝、rcDNA進入細胞核、及/或rcDNA轉化為cccDNA之化合物。例如，在某些實施例中，抑制劑可偵測地抑制cccDNA之形成及/或穩定性，如例如使用本文所述的測定法量測。在某些實施例中，抑制劑抑制cccDNA之形成及/或穩定性達至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%或至少90%。

術語cccDNA形成抑制劑包括國際專利申請公開案號WO2013130703中描述的化合物，包括以下化合物：。

術語cccDNA形成抑制劑包括但不限於在美國專利申請公開案號US 2015/0038515 A1中通常及具體描述者。術語cccDNA形成抑制劑包括但不限於1-(苯基磺醯基)-N-(吡啶-4-基甲基)-1H-吲哚-2-甲醯胺；1-苯磺醯基-吡咯烷-2-羧酸(吡啶-4-基甲基)-醯胺；2-(2-氯-N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(4-氯-N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-4-甲氧基苯磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(哌啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基甲基)丙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-3-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(嘧啶-5-基甲基)乙醯胺；2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(嘧啶-4-基甲基)乙醯胺；2-(N-(5-氯-2-氟苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙醯胺；2-[(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-(4-氟-苯磺醯基)-胺基]-N-吡啶-4-基甲基-乙醯胺；2-[(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-(甲苯-4-磺醯基)-胺基]-N-吡啶-4-基甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-溴-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶-4-基甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-(2-甲基-苯并噻唑-5-基)-乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-芐基]-乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-芐基]-乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-芐基乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶-4-基甲基-乙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶-4-基甲基-丙醯胺；2-[苯磺醯基(2-氟-5-三氟甲基-苯基)-胺基]-N-吡啶-4-基甲基-乙醯胺；4(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-N-(吡啶-4-基-甲基)丁醯胺；4-((2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-乙醯胺基)-甲基)-1,1-二甲基哌啶-1-鎓氯化物；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-(2-氯-5-三氟甲基-苯基)-苯甲醯胺；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-(2-甲基-1H-吲哚-5-基)-苯甲醯胺；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-(2-甲基-1H-吲哚-5-基)-苯甲醯胺；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-(2-甲基-苯并噻唑-5-基)-苯甲醯胺；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-(2-甲基-苯并噻唑-6-基)-苯甲醯胺；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-(2-甲基-苯并噻唑-6-基)-苯甲醯胺；4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-N-吡啶-4-基甲基-苯甲醯胺；N-(2-胺基乙基)-2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-乙醯胺；N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)-N-(2-(3,4-二氫-2,6-二氮雜萘-2(1H)-基)-2-氧代乙基)苯磺醯胺；N-苯并噻唑-6-基-4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-苯甲醯胺；N-苯并噻唑-6-基-4-(芐基-甲基-氨磺醯基)-苯甲醯胺；(2-(2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)乙醯胺基)乙基)胺基甲酸叔丁酯；及4-((2-(N-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)苯基磺醯胺基)-乙醯胺基)-甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯、以及可選地其組合。 D. 進入抑制劑

本發明之某些實施例係關於使用HBV進入抑制劑之藥劑。進入抑制劑包括Myrcludex-B、NTCP抑制劑小分子及FXR促效劑EYP001(參見，例如，Gripon, P., Cannie, I. and Urban, S. Efficient Inhibition of Hepatitis B Virus Infection by Acylated Peptides Derived from the Large Viral Surface Protein.Journal of Virology，79(3)：1613-1622；Volz, T., Allweiss, L., MBarek, M., Warlich, M., Lohse, A., Pollok, J., Alexandrov, A., Urban, S., Petersen, J., Lutgehetmann, M., Dandri, M. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus.Journal of Hepatology, 58(5): 861-867；Radreau, P., Procherot, M., Vonderscher, J., Lotteau, V., Andre, P. Effect of a novel synthetic FXR agonist EYP001 on hepatitis B virus replication in HepaRG cell line and primary human hepatocytes.AASLD LiverLearning, 摘要1652, 2015年11月16日；WO 2015/036442；WO 00/37077；US2007/0015796)例如，B型肝炎病毒使用其表面脂肽前-S1藉由其鈉/膽汁酸協同轉運蛋白(NTCP)對接成熟肝細胞且隨後進入細胞。Myrcludex B是一種合成的N-醯化前S1，其亦可對接到NTCP，阻止病毒的進入機制。II. 減少病毒 Ag 之藥物

II類治療係涉及使用減少病毒抗原之藥劑。 A. 寡聚核苷酸

寡聚核苷酸可經設計為靶向HBV基因組之一或多個基因及/或轉錄物。此類siRNA分子之實例是本文表A及實施例中所列之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合。

術語靶向B型肝炎基因組之寡聚核苷酸包括Arrowhead-ARC-520 (參見美國專利案號8,809,293；以及Wooddell CI等人,Molecular Therapy, 2013 ,21, 5, 973–985)。

術語靶向B型肝炎基因之寡聚核苷酸亦包括經分離雙鏈siRNA分子，各分子包括正義鍊及與該正義鏈雜交之反義鏈。siRNA靶向HBV基因組之一或多個基因及/或轉錄物。siRNA分子之實例是本文表A及實施例中列出之siRNA分子，包括本文描述之siRNA分子的特定組合，例如本文siRNA分子之雙向及三向組合。

另一個態樣，該術語包括如本文表B中所列出之經分離正義鍊及反義鏈。

在另一個態樣，該術語包括靶向GalNAc及REP 2139、REP-2165之siRNA分子(參見例如WO 2016/077321，Al-Mathtab等人, PLoS ONE 11(6):e0156667. doi:10.1371/journal.pone.0156667以及Guillot等人, Poster P0556, EASL, 2015)。 B. sAg 分泌抑制劑

如本文所述，術語「sAg分泌抑制劑」包括能夠直接或間接抑制攜帶亞病毒顆粒及/或來自經HBV感染細胞之含DNA病毒顆粒之sAg (S、M及/或L表面抗原)之分泌的化合物。例如，在某些實施例中，抑制劑可偵測地抑制sAg之分泌，如使用此項技藝已知或本文所述之測定法(例如ELISA測定法或西方墨點法測定)量測。在某些實施例中，抑制劑將sAg之分泌抑制至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、或至少90%。在某些實施例中，抑制劑將患者血清sAg水平減少至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、或至少90%。

術語sAg分泌抑制劑包括在美國專利案號8,921,381所述之化合物以及在美國專利申請公開案號2015/0087659及2013/0303552所述之化合物。例如，該術語包括化合物PBHBV-001及PBHBV-2-15以及其醫藥學上可接受之鹽：。 C. 抗 -HBsAg 劑

本發明之某些態樣係關於抗-HBsAg抗體例如 mAb之應用。本發明之某些態樣係關於使用B型肝炎免疫球蛋白(HBIG)。III. 改善免疫反應之藥物

III類治療係關於使用改善針對病毒感染之免疫反應之藥劑。在某些實施例中，至少一種『免疫增強劑』與至少一種『免疫刺激劑』組合使用。這種組合可以進一步與至少一種控制病毒複製之藥劑及/或至少一種減少病毒抗原之藥劑組合使用。 A. 免疫增強劑

本發明之某些態樣係關於使用用於藉由減少或消除免疫衰竭、例如藉由使用檢查點抑制劑來改善免疫反應從而增強免疫反應之藥劑。

在某些實施例中，免疫增強劑為PD-L1抑制劑。PD-L1抑制劑是一組用於抑制程序性死亡配體1(PD-L1)與其受體程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)之締合之藥劑。

免疫增強劑包括以下項：抗-PD-1mAb (例如，納武單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)；抗-PD-L1 mAb (例如，阿特朱單抗(Atezolizumab)、阿維魯單抗(Avelumab))；抗-PD-L2 mAb；抗-CTLA4 mAb (例如， 伊匹單抗( Ipilimumab))；抗-VISTA mAb(例如， JNJ-61610588)；抗-LAG3 mAb (例如，BMS-986016)；抗-TIM3 mAb (例如， TSR-022)；肽模擬物(例如，AUNP-12)；及小分子化合物(參見例如Zak等人, Oncotarget, 2016, 7(21):30323-35) B. 免疫刺激劑

術語「免疫刺激劑」包括能夠調節免疫反應(例如，刺激先天免疫反應及/或適應性免疫反應(例如，佐劑))之化合物。術語免疫刺激劑包括聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly I：C)及乾擾素。

術語免疫刺激劑包括IFN基因刺激劑(STING)及白細胞介素之促效劑。該術語亦包括HBsAg釋放抑制劑、TLR-7促效劑(GS-9620，RG-7795)、T細胞及/或B細胞刺激劑(GS-4774，OX-40促效劑(BMS 986178)、抗-GITR促效劑(BMS-986156) )、RIG-1抑制劑(SB-9200)、及SMAC模擬物(Birinapant)。

該術語亦包括以下項：抗-HBV疫苗(Engerix-B、RECOMBIVAX HB、GS-4744、Heplisav-B)；干擾素(聚乙二醇化IFN-α2a、PEG化IFN-α2b、IFN-α、IFN-λ)； RIG-I促效劑(SB-9200)； STING促效劑(cGAMP、cGAMP雙硫代磷酸酯、ADU S100、及其他小分子化合物)； TLR9促效劑(CYT-009、CpG二核苷酸)； TLR7促效劑(GS-9620)； TLR8促效劑(GS-9688)； TLR3促效劑(Ampligen/poly I:C12U)； IL-7(CYT107)；及 IL-2(阿地白介素)。

術語「B型肝炎病毒」(縮寫為HBV)係指正肝去氧核糖核酸病毒屬病毒種，其係嗜肝DNA病毒家族病毒之一部分，且能夠引起人類肝臟炎症。

術語「肝炎D病毒」(縮寫為HDV)係指D型肝炎病毒屬病毒種，其能夠引起人類的肝臟炎症。

如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之典型疾病病程之臨床干預。合乎需要之治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理學結果、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態及緩和或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。

如本文所用，術語「小干擾RNA」或「siRNA」係指能夠在siRNA與靶基因或序列處於相同細胞內時減少或抑制靶基因或序列表現之雙鏈RNA(即，雙鏈體RNA)(例如藉由與siRNA序列互補之mRNA的降解或抑制其翻譯)。siRNA可以與靶基因或序列具有大致或完全同一性，或可包含錯配區域(即，錯配基序)。在某些實施例中，siRNA可長約19-25個(雙鏈體)核苷酸，且較佳長約20-24、21-22、或21-23個(雙鏈體)核苷酸。siRNA雙鏈體可包含約1至約4個核苷酸或約2至約3個核苷酸之3'突出端及5'磷酸末端。siRNA之實例包括但不限於由兩個單獨鏈分子組裝之雙鏈多核苷酸分子，其中一條鍊是正義鏈，且另一條鍊是互補反義鏈。

較佳地，化學合成siRNA。亦可以藉由用大腸桿菌 RNA酶III或切丁酶裂解較長dsRNA(例如，長度大於約25個核苷酸之dsRNA)來產生siRNA。該等酶將dsRNA加工成有生物活性的siRNA (參見例如 ，Yang等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002)；Calegari等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002)；Byrom等人,Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003)；Kawasaki等人,Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003)；Knight等人,Science, 293:2269-2271 (2001)；及Robertson等人,J. Biol. Chem., 243:82 (1968))。較佳地，dsRNA長度為至少50個核苷酸至約100、200、300、400、或500個核苷酸。dsRNA可長至1000、1500、2000、5000個核苷酸或更長。dsRNA可編碼完整基因轉錄物或部分基因轉錄物。在某些情況下，siRNA可由質粒編碼(例如，轉錄成自動折疊成具有發夾環之雙鏈體的序列)。

片語「抑制靶基因之表現」係指siRNA沉默、減少或抑制靶基因(例如，HBV基因組內的基因)之表現的能力。為了檢查基因沉默程度，將測試樣品(例如來自目標生物體之表現目標基因之生物樣品或培養物中之表現靶基因的細胞樣品)與沈默、減少或抑制目標基因之表現之siRNA接觸。將測試樣品中靶基因之表現與不接觸siRNA之對照樣品(例如來自目標生物體之表現目標基因之生物樣品或培養物中之表現靶基因之細胞樣品)中靶基因之表現進行比較。對照樣品(例如，表現靶基因之樣品)可賦予100%值。在具體實施例中，當測試樣品相對於對照樣品的值(例如， 僅緩衝液、靶向不同基因之siRNA序列、加擾siRNA序列等)係約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、或0%時，達成靶基因之表現之沉默、抑制、或減少。合適測定包括但不限於使用熟習此項技藝者已知之技術例如像斑點印跡、北方墨點法、原位雜交、ELISA、免疫沉澱、酶功能、以及熟習此項技藝者已知之表型測定法檢測蛋白質或mRNA水平。治療性核酸諸如siRNA之「有效量」或「治療有效量」係足以產生期望效果之量，例如靶序列之表現與在siRNA不存在下偵測到之正常表現水平相比之抑制。在具體實施例中，當用siRNA獲得之相對於對照(例如，僅緩衝液、靶向不同基因之siRNA序列、加擾siRNA序列等 )之值係約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、或0%時，達成靶基因或靶序列之表現之抑制。用於量測靶基因或靶序列之表現之合適測定包括但不限於，使用熟習此項技藝者已知之技術例如點印跡、北方墨點法、原位 雜交、ELISA、免疫沉澱、酶功能、以及熟習此項技藝者已知之表型測定法檢測蛋白質或mRNA水平。

如本文所用之術語「核酸」係指含有至少兩個單鍊或雙鏈形式之核苷酸(即脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合物且包括DNA及RNA。「核苷酸」含有糖脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、鹼、及磷酸酯基團。核苷酸藉由磷酸酯基團連接在一起。「鹼」包括嘌呤及嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、及天然類似物、以及嘌呤及嘧啶的合成衍生物，其包括但不限於使具有新反應基團之修飾，該等新反應基團例如但不限於胺、醇、硫醇、羧酸鹽、及烷基鹵化物。核酸包括含有已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鍵之核酸，其為合成的、天然存在的及非天然存在的，且具有與參照核酸相似之結合特性。此等類似物及/或經修飾殘基之實例包括但不限於，硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、及肽-核酸(PNA)。另外，核酸可包括一或多個UNA部分。

術語「核酸」包括任何寡核苷酸或多核苷酸，其中含有多至60個核苷酸之片段通常稱為寡核苷酸且較長片段稱為多核苷酸。脫氧核糖寡核苷酸由稱為脫氧核糖之5碳糖組成，該糖在該糖的5'及3'碳處共價連接至磷酸酯以形成交替的無支鏈聚合物。DNA可為例如反義分子、質粒DNA、預縮合DNA、PCR產物、載體、表現盒、嵌合序列、染色體DNA、或該等組之衍生物及組合之形式。核糖寡核苷酸由類似重複結構組成，其中5碳糖是核糖。RNA可為例如小干擾RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小發夾RNA(shRNA)、不對稱干擾RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA (vRNA)、及其組合。因此，術語「多核苷酸」及「寡核苷酸」係指由核苷酸或核苷單體組成之聚合物或寡聚物，該等單體由天然存在的鹼基、糖及糖間(主鏈)鍵組成。術語「多核苷酸」及「寡核苷酸」亦包括包含非天然存在的單體或其類似地起作用之部分的聚合物或低聚物。此類經修飾或取代寡核苷酸通常由於各種性質而優於天然形式，該等性質例如經增強細胞攝取、經降低免疫原性及在核酸酶存在下增加之穩定性。

除非另有說明，否則特定核酸序列亦隱含地包括其保守修飾的變體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP、及互補序列、以及明確指出的序列。具體而言，簡併密碼子取代可以藉由產生其中一或多個經選定(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列實現(Batzer等人,Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人,J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985)；Rossolini等人,Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994))。

「經分離之」或「經純化之」DNA分子或RNA分子是在其天然環境外存在的DNA分子或RNA分子。經分離DNA分子或RNA分子可以純化形式存在或可存在於非天然環境中，例如轉基因宿主細胞。例如，「經分離之」或「經純化之」核酸分子或其生物活性部分當藉由重組技術產生時大體上不含其他細胞材料或培養基，或當化學合成時大體上不含化學前驅物或其他化學品。在一個實施例中，「經分離」核酸不含在核酸所來源之生物體基因組DNA中天然側接核酸之序列(即位於核酸5'及3'末端之序列)。例如，在不同實施例中，經分離核酸分子可含有小於約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb、或0.1 kb之在核酸所來源之細胞基因組DNA中天然地側接核酸分子之核苷酸序列。

術語「基因」係指包含產生多肽或前驅物多肽所需的部分長度或全長編碼序列之核酸(例如 DNA或RNA)序列。

如本文所用，「基因產物」係指基因產物諸如RNA轉錄物或多肽。

術語「經解鎖之核鹼基類似物」(縮寫為「UNA」)係指其中核糖環之C2'及C3'原子未共價連接之無環核鹼基。術語「經解鎖之核鹼基類似物」包括具有以下結構之核鹼基類似物，該結構經鑑定為結構A：其中R是羥基，且鹼是任何天然或非天然鹼基，例如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、及胸腺嘧啶(T)。UNA包括在美國專利案序號8,314,227中鑑定為無環2'-3'-開環核苷酸單體之分子。

術語「脂質」係指一組有機化合物，包括但不限於脂肪酸酯，且特徵在於不溶於水，但可溶於許多有機溶劑。它們通常分為至少三類：(1)「簡單脂質」，包括脂肪及油以及蠟；(2)「複合脂質」，包括磷脂及醣脂；以及(3)「衍生脂質」，如類固醇。

術語「脂質顆粒」包括可用於將治療性核酸(例如 siRNA)遞送至目標靶位(例如細胞、組織、器官及其類似靶位)之脂質調配物。在較佳實施例中，脂質顆粒通常由陽離子脂質、非陽離子脂質、及可選地防止顆粒聚集之綴合脂質形成。包括核酸分子(例如，siRNA分子)之脂質顆粒稱為核酸-脂質顆粒。通常，核酸完全封裝在脂質顆粒內，從而保護核酸免於酶促降解。

在某些情況下，核酸-脂質顆粒對於全身應用是非常有用的，因為該等顆粒可在靜脈內(iv)注射後表現出延長的循環壽命，該等顆粒可在遠端部位(例如， 與投與部位物理分離之部位)積累，且該等顆粒可介導該等遠端位點處靶基因表現的沉默。如PCT公開案號WO 00/03683中所述，核酸可以與縮合劑複合且封裝在脂質顆粒內，為了所有目的，其揭露內容以引用方式整體併入本文。

脂質顆粒的平均直徑通常為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95nm 、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm，且基本無毒。另外、當存在於脂質顆粒中時，核酸在水溶液中對核酸酶降解具有抗性。核酸-脂質顆粒及其製備方法揭露於例如美國專利公開案號20040142025及20070042031中，該等揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

如本文所用，「脂質封裝的」可係指提供治療性核酸例如siRNA的脂質顆粒，其具有完全封裝、部分封裝或兩者。在一較佳實施例中，核酸(例如， siRNA)完全封裝在脂質顆粒中(例如，形成核酸-脂質顆粒)。

術語「脂質綴合物」係指抑制脂質顆粒聚集之綴合脂質。此類脂質綴合物包括但不限於PEG-脂質綴合物，例如像與二烷基氧基丙基(例如 PEG-DAA綴合物)偶聯之PEG、與二醯基甘油(例如 PEG-DAG綴合物)偶聯之PEG、與膽固醇偶聯之PEG、與磷脂醯乙醇胺偶聯之PEG、及與神經醯胺綴合之PEG(參見例如 美國專利案號5,885,613)、陽離子PEG脂質、聚噁唑啉(POZ)-脂質綴合物(例如 POZ-DAA綴合物)、聚醯胺寡聚體(例如 ATTA-脂質綴合物)、及其混合物。POZ-脂質綴合物之附加實例描述於PCT公開案號WO 2010/006282中。PEG或POZ可直接綴合至脂質或可藉由接頭部分連接至脂質。可使用適用於將PEG或POZ偶聯至脂質之任何接頭部分，包括例如不含酯接頭部分及含酯接頭部分。在某些較佳實施例中，使用不含酯接頭部分，例如醯胺或胺基甲酸酯。

術語「兩親脂質」部分地係指任何合適材料，其中脂質材料之疏水部分定向成疏水相，而親水部分定向成水相。親水特性源自極性或帶電基團如碳水化合物、磷酸鹽、羧酸、硫酸根合、胺基、巰基、硝基、羥基、及其他類似基團之存在。藉由包括非極性基團可賦予疏水性，該等非極性基團包括但不限於長鏈飽和及不飽和脂族烴基團及經一或多個芳族、脂環族或雜環基團取代之此類基團。兩親化合物之實例包括但不限於磷脂、胺脂質、及鞘脂。

磷脂之代表性實例包括但不限於磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、及二亞油醯磷脂醯膽鹼。缺乏磷之其他化合物例如鞘脂、鞘醣脂家族、二醯基甘油、及b-醯氧基酸，亦在指定為兩親脂質之組內。另外，上述兩親脂質可與其他脂質混合，該等其他脂質包括甘油三酯及甾醇。

術語「中性脂質」係指在所選pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在之許多脂質物質中的任一者。在生理pH下，此類脂質包括例如二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂、及二醯甘油。

術語「非陽離子脂質」係指任何兩親脂質以及任何其他中性脂質或陰離子脂質。

術語「陰離子脂質」係指在生理pH下帶負電荷之任何脂質。該等脂質包括但不限於磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、N-十二烷醯磷脂醯乙醇胺、N-琥珀醯磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯磷脂醯乙醇胺、賴胺醯磷脂醯甘油、棕櫚醯甘油磷脂醯甘油(POPG)、及其他與中性脂質相連之陰離子修飾基團。

術語「疏水脂質」係指具有非極性基團之化合物，該等非極性基團包括但不限於長鏈飽和及不飽和脂族烴基及可選地經一或多個芳族、脂環族或雜環基團取代之基團。合適實例包括但不限於二醯基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基胺基、1,2-二醯氧基-3-胺基丙烷、及1,2-二烷基-3-胺基丙烷。

術語「陽離子脂質」及「胺脂質」在本文中可互換使用，以包括具有一、兩、三或更多個脂肪酸或脂肪烷基鍊、及pH可滴定胺基頭基(例如， 烷基胺基或二烷基胺基頭基)之彼等脂質及其鹽。陽離子脂質通常在低於陽離子脂質之pK_a 之pH下質子化(即帶正電荷)，且在高於pK_a 之pH下係基本上中性的。陽離子脂質亦可稱為可滴定陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質包含：可質子化叔胺(例如 pH可滴定)頭基；C₁₈ 烷基鏈，其中各烷基鏈獨立地具有0至3個(例如， 0 、 1 、 2 、或3)雙鍵；及頭基與烷基鏈之間之醚、酯或縮酮鍵。此等陽離子脂質包括但不限於DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2、及C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(亦稱為MC2)、以及DLin-M-C3-DMA (亦稱為MC3)。

可適當地將化合物作為醫藥學上可接受之酸或鹼鹽投與。醫藥學上可接受之鹽之實例為與形成生理學上可接受之陰離子的酸形成之有機酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽、及α-甘油磷酸鹽。亦可形成合適無機鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽及碳酸鹽。

醫醫藥上可接受之鹽可使用此項技術中熟知之標準程序獲得，例如藉由使諸如胺之充足鹼性化合物與提供生理可接受之陰離子之適合酸反應。亦可製備羧酸之鹼金屬(例如鈉、鉀或鋰)或鹼土金屬(例如鈣)鹽。

術語「鹽」包括任何陰離子及陽離子絡合物，例如陽離子脂質及一或多種陰離子之間形成之絡合物。陰離子之非限制性實例包括無機及有機陰離子，例如氫化物、氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、草酸鹽(例如半草酸鹽)、磷酸鹽、膦酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氮化物、亞硫酸氫鹽、硫化物、亞硫酸鹽、重硫酸鹽、硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、丙烯酸鹽、聚丙烯酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、衣康酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、蘋果酸鹽、扁桃酸鹽、惕各酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、聚甲基丙烯酸鹽、高氯酸鹽、氯酸鹽、亞氯酸鹽、次氯酸鹽、溴酸鹽、次溴酸鹽、碘酸鹽、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、砷酸鹽、亞砷酸鹽、鉻酸鹽、重鉻酸鹽、氰化物、氰酸鹽、硫氰酸鹽、氫氧化物、過氧化物、高錳酸鹽、及其混合物。在具體實施例中，本文揭露之陽離子脂質之鹽係結晶鹽。

術語「烷基」包括含有1至24個碳原子之直鍊或支鏈、非環狀或環狀飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基包括但不限於甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、及其類似基團，而飽和支鏈烷基包括但不限於異丙基、仲丁基 、異丁基、叔丁基、異戊基、及其類似基團。代表性飽和環狀烷基包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、及其類似基團，而不飽和環狀烷基包括環戊烯基、環己烯基及其類似基團。

術語「烯基」包括如上所定義之烷基，其在相鄰碳原子之間含有至少一個雙鍵。鏈烯基包括順式及反式異構體。代表性直鍊及支鏈烯基包括但不限於乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、及其類似基團。

術語「炔基」包括如上所定義之任何烷基或烯基，其在相鄰碳之間另外含有至少一個三鍵。代表性直鍊及支鏈炔基包括但不限於乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基、及其類似基團。

術語「醯基」包括其中連接點處之碳經氧代基取代之任何烷基、烯基或炔基，如下所定義。以下為醯基之非限制性實例：-C(=O)烷基、-C(=O)烯基、及-C(=O)炔基。

術語「雜環」包括飽和、不飽和、或芳族5至7員單環或7至10員雙環雜環，且其含有1或2個獨立選自氮、氧、及硫之雜原子，且其中氮及硫雜原子可以可選經氧化，且氮雜原子可以可選地經季銨化，包括其中任何上述雜環稠合到苯環上之雙環。雜環可藉由任何雜原子或碳原子連接。雜環包括但不限於如下定義之雜芳基以及嗎啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙內醯基、戊內醯胺基、環氧乙烷基、環氧丙烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基、及其類似基團。

術語「可選經取代烷基」、「可選經取代烯基」、「可選經取代炔基」、「可選經取代醯基」及「可選經取代雜環」意指當經取代時至少一個氫原子經取代基替代。在氧代取代基(=O)情況下，兩個氫原子經替代。在這點上，取代基包括但不限於氧代、鹵素、雜環、-CN、-OR^x 、-NR^x R^y 、-NR^x C(=O)R^y _、 -NR^x SO₂ R^y 、-C(=O)R^x 、-C(=O)OR^x 、-C(=O)NR^x R^y 、-SO_n R^x 、及-SO_n NR^x R^y ，其中n為0、1或2，R^x 及R^y 係相同或不同的且獨立地為氫、烷基或雜環，且各烷基及雜環取代基可進一步經以下一或多者取得：氧代、鹵素、-OH、-CN、烷基、-OR^x 、雜環、-NR^x R^y 、-NR^x C(=O)R^y _、 -NR^x SO₂ R^y 、-C(=O)R^x 、-C(=O)OR^x 、-C(=O)NR^x R^y 、-SO_n R^x 、及-SO_n NR^x R^y 。當在一系列取代基之前使用時，術語「可選經取代之」意指列表中之各取代基可如本文所述可選經取代。

術語「鹵素」包括氟、氯、溴及碘。

術語「促融合(fusogenic)」係指脂質顆粒與細胞膜融合之能力。膜可為質膜或細胞器周圍之膜，例如內體，核等。

如本文所用，術語「水溶液」係指全部或部分包含水之組成物。

如本文所用，術語「有機脂質溶液」係指全部或部分包含具有脂質之有機溶劑之組成物。

當用於描述脂質顆粒時，術語「電子緻密核心」係指當使用低溫透射電子顯微鏡檢查(「cyroTEM」)觀察時脂質顆粒內部之黑色外觀。一些脂質顆粒具有電子緻密核心且缺少脂質雙層結構。一些脂質顆粒具有電子密度核心，缺乏脂質雙層結構，且具有倒六角或立方相結構。儘管不希望受理論束縛，但認為非雙層脂質填充提供在內部具有水及核酸之脂質圓柱體之三維網絡，即基本上與含有核酸之水性通道互穿之脂質小滴酸。

如本文所用，「遠端部位」係指物理上分離之部位，其不限於相鄰毛細血管床，而是包括廣泛分佈於整個生物體中之部位。

與核酸-脂質顆粒相關之「血清穩定」意指在暴露於可顯著降解遊離DNA或RNA之血清或核酸酶測定後，顆粒不會顯著降解。合適測定法包括例如標準血清測定法、DNA酶測定法、或RNA酶測定法。

如本文所用，「全身遞送」係指遞送導致活性劑(例如生物體內之siRNA)之廣泛生物分佈的脂質顆粒。一些投與技術可導致某些藥劑而非其他藥劑之全身遞送。全身遞送意味著有用的較佳治療量之藥劑暴露於身體大部分部位。為獲得廣泛生物分佈，通常需要血液壽命，使得藥物在到達投與部位之疾病部位遠端之前不會迅速降解或清除(例如藉由首過器官(肝臟、肺等 )或藉由快速非特異性細胞結合)。脂質顆粒之全身遞送可藉由此項技藝已知之任何方式，包括例如靜脈內、皮下及腹膜內。在一較佳實施例中，脂質顆粒之全身遞送是藉由靜脈內遞送。

如本文所用，「局部遞送」係指將活性劑例如siRNA直接遞送至生物體內靶位點。例如，藥劑可藉由直接注射到疾病部位、其他靶部位或靶器官諸如肝臟、心臟、胰腺、腎、及其類似器官而局部遞送。

如本文所用，術語「病毒顆粒負荷量」係指存在於體液例如血液中之病毒顆粒(例如，HBV及/或HDV)數量之量度。例如，顆粒負荷可表示為每毫升例如血液中之病毒顆粒數量。可使用基於核酸擴增之測試以及基於非核酸之測試來執行粒子負載測試(參見例如 Puren等人, The Journal of Infectious Diseases, 201:S27-36 (2010))。表 A

寡核苷酸(例如表B中所示之正義及反義RNA鏈)與靶多核苷酸序列特異性雜交或互補。如本文所用之術語「可特異性雜交的」及「互補的」表示足夠的互補性程度，使得在DNA或RNA靶標與寡核苷酸之間發生穩定及特異性結合。應理解，寡核苷酸不需要與有待可特異性雜交之靶核酸序列100%互補。在較佳實施例中，在寡核苷酸與靶序列之結合干擾靶序列之正常功能以引起其效用或表現喪失時寡核苷酸系可特異性雜交的，且存在足夠程度的互補性以避免寡核苷酸與非靶序列在需要特異性結合之條件下，即在活體內 測定或治療性治療情況下或在活體外 測定情況下之生理條件下、在進行測定之條件下進行非特異性結合。因此，與其靶向或其特異性雜交之基因或mRNA序列之區域相比，寡核苷酸可包括1、2、3或更多個鹼基取代。表 B. 生成 siRNA 分子

可以幾種形式提供siRNA，包括以一或多種經分離小干擾RNA(siRNA)雙鏈體形式、以較長雙鏈RNA (dsRNA)形式、或以由DNA質粒中之轉錄盒轉錄之siRNA或dsRNA之形式。在一些實施例中，siRNA可酶促產生或藉由部分/全部有機合成產生，且經修飾核糖核苷酸可藉由活體外 酶促或有機合成引入。在某些情況下，化學製備各鏈。合成RNA分子之方法係此項技藝已知的，例如， 如Verma及Eckstein (1998)所述或如本文所述之化學合成方法。

用於分離RNA、合成RNA、雜交核酸、製備及篩選cDNA文庫、以及進行PCR之方法在此項技藝中是熟知的(參見例如 ，Gubler及Hoffman,Gene , 25:263-269 (1983)；Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上 )，PCR方法亦是如此(參見美國專利案號4,683,195及4,683,202；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis等人編, 1990))。表現文庫亦為熟習此項技藝者所熟知。揭露一般方法之其他基本文本包括Sambrook等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第2版 1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編, 1994)。此等參考文獻之揭露內容出於所有目的以引用方式併入本文中。

通常，化學合成siRNA。包含siRNA分子之寡核苷酸可使用此項技藝已知之多種技術中之任一種來合成，例如在Usman等人 ,J. Am. Chem. Soc. , 109:7845 (1987)；Scaringe等人 ,Nucl. Acids Res. , 18:5433 (1990)；Wincott等人 ,Nucl. Acids Res. , 23:2677-2684 (1995)；以及Wincott等人 , Methods Mol. Bio. , 74:59 (1997)。寡核苷酸之合成利用常見核酸保護及偶聯基團，如5'-端處之二甲氧基三苯甲基及3'-端處之亞磷醯胺。作為非限制性實例，可使用0.2mmol規模方案在Applied Biosystems合成儀上進行小規模合成。或者，以0.2mmol規模合成可在來自Protogene (Palo Alto, CA)之96孔板合成儀上進行。但是，較大或較小規模之合成亦在該範圍之內。用於寡核苷酸合成之合適試劑、用於RNA去保護之方法、及用於RNA純化之方法為熟習此項技藝者已知的。

siRNA分子可由兩個不同的寡核苷酸組裝而成，其中一個寡核苷酸包含正義鏈，且另一個包含siRNA之反義鏈。例如，每條鏈可單獨合成且在合成及/或脫保護後藉由雜交或連接而連接在一起。含有治療性核酸之載劑系統 脂質顆粒

脂質顆粒可包含一或多種siRNA(例如，本文表A或實例中所述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)、陽離子脂質、非陽離子脂質、及抑制顆粒聚集之綴合脂質。在一些實施例中，siRNA分子完全封裝在脂質顆粒之脂質部分內，使得脂質顆粒中之siRNA分子在水溶液中對核酸酶降解具有抗性。在其他實施例中，本文所述之脂質顆粒對人類基本上無毒。脂質顆粒之平均直徑通常為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、或約70至約90 nm。在某些實施例中，脂質顆粒之中值直徑為約30 nm至約150 nm。脂質顆粒之脂質:核酸比例(例如脂質:siRNA比率)(質量/質量比)通常亦為約1:1至約100:1、約1:1至約50:1、約2:1至約25:1、約3:1至約20:1、約5:1至約15:1、或約5:1至約10:1。在某些實施例中，核酸-脂質顆粒之脂質:siRNA質量比為約5:1至約15:1。

脂質顆粒包括含有一或多個siRNA分子的血清穩定的核酸-脂質顆粒(例如， 如本文表A或實例所述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如，siRNA分子之雙向及三向組合)、陽離子脂質(例如，如本文所述之一或多種式I-III陽離子脂質或其鹽)、非陽離子脂質(例如一或多種磷脂及膽固醇之混合物)、及抑制顆粒聚集之綴合脂質(例如一或多種PEG-脂質綴合物)。脂質顆粒可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個siRNA分子(例如，本文表A或實例中描述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)，其靶向本文所述之一或多種基因。核酸-脂質顆粒及其製備方法描述於例如美國專利案號5,753,613；5,785,992；5,705,385；5,976,567；5,981,501；6,110,745；及6,320,017；及PCT公開案號WO 96/40964，其揭露內容各自出於所有目的以引用方式整體併入本文。

在核酸-脂質顆粒中，一或多種siRNA分子(例如，如本文表A或實例所述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)可完全封裝在顆粒脂質部分內，從而保護siRNA免受核酸酶降解。在某些情況下，在37℃下顆粒暴露於核酸酶至少約20、30、45、或60分鐘後，核酸-脂質顆粒中之siRNA基本上不降解。在某些其他情況下，在37℃下在血清中溫育顆粒至少約30、45或60分鐘或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、或36小時後，核酸-脂質顆粒中之siRNA基本上不降解。在其他實施例中，siRNA與顆粒之脂質部分複合。調配物之益處之一在於，核酸-脂質顆粒組成物對人類基本上無毒。

術語「完全封裝」表示核酸-脂質顆粒中之siRNA (例如，如本文表A或實例所述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)在暴露於可顯著降解遊離DNA或RNA之血清或核酸酶測定後未顯著降解。在經完全封裝系統中，在通常會降解100%遊離siRNA之處理中，降解顆粒中較佳小於約25%之siRNA，更佳小於約10%，且最佳降解顆粒中小於約5%之siRNA。「完全封裝」亦表明核酸-脂質顆粒係血清穩定的，即它們在體內 投與時不會迅速分解成其組成部分。

在核酸情況下，可藉由執行膜不可滲透螢光染料排除測定法來判定完全封裝，該測定法使用當與核酸結合時螢光增強之染料。具體染料諸如OliGreen^® 及RiboGreen^® (Invitrogen Corp.；Carlsbad, CA)可用於定量測定質粒DNA、單鏈脫氧核糖核苷酸、及/或單鏈或雙鏈核糖核苷酸。藉由將染料加入到脂質體調配物中、量測所得螢光、且與在添加少量非離子型洗滌劑後經觀察到之螢光進行比較來判定封裝。經洗滌劑介導之脂質體雙層破壞釋放經封裝之核酸，使其與膜不可滲透染料相互作用。核酸封裝可以經計算為E = (I_o – I)/I_o _，其中I 及I_o 係指在添加洗滌劑之前及之後之螢光強度(參見 Wheeler 等人 , Gene Ther., 6:271-281 (1999) )。

在一些情況下，核酸-脂質顆粒組成物包含完全封裝在顆粒脂質部分內之siRNA分子，使得約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%、或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%(或其任何分數或其中之範圍)之顆粒具有封裝於其中之siRNA。

在其他情況下，核酸-脂質顆粒組成物包含完全封裝在顆粒脂質部分內之siRNA，使得約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%、或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% (或其任何分數或其中之範圍)之輸入siRNA經封裝在顆粒中。

視脂質顆粒之預期用途而定，組分之比例可以變化，且特定調配物之遞送效率可使用例如內體釋放參數(ERP)測定法來量測。陽離子脂質

多種陽離子脂質或其鹽中之任一者可單獨或與一或多種其他陽離子脂質物質或非陽離子脂質物質組合用於脂質顆粒中。陽離子脂質包括其(R)及/或(S)鏡像異構體。

在一個態樣，陽離子脂質為二烷基脂質。例如，二烷基脂質可包括包含兩個飽和或不飽和烷基鏈之脂質，其中各烷基鏈可經取代或未經取代。在某些實施例中，兩個烷基鏈各包含至少例如8個碳原子、10個碳原子、12個碳原子、14個碳原子、16個碳原子、18個碳原子、20個碳原子、22個碳原子、或24個碳原子。

在一個態樣，陽離子脂質為三烷基脂質。例如，三烷基脂質可包括包含三個飽和或不飽和烷基鏈之脂質，其中各烷基鏈可經取代或未經取代。在某些實施例中，三個烷基鏈各包含至少例如8個碳原子、10個碳原子、12個碳原子、14個碳原子、16個碳原子、18個碳原子、20個碳原子、22個碳原子、或24個碳原子。

在一個態樣，具有以下結構之式I陽離子脂質係有用的：(I)，或其鹽，其中： R¹ 及R² 為相同或不同的，且獨立地為氫(H)或可選經取代之C₁ -C₆ 烷基、C₂ -C₆ 烯基、或C₂ -C₆ 炔基，或者R¹ 及R² 可連接形成4-6個碳原子及1或2個選自由氮(N)、氧(O)、及其混合物所組成之組之雜原子的可選經取代雜環； R³ 不存在或為氫(H)或C₁ -C₆ 烷基以提供季胺； R⁴ 及R⁵ 為相同或不同，且獨立地為可選經取代之C₁₀ -C₂₄ 烷基、C₁₀ -C₂₄ 烯基、C₁₀ -C₂₄ 炔基、或C₁₀ -C₂₄ 醯基，其中R⁴ 及R⁵ 中之至少一者包含至少兩個不飽和位點；且 n為0、1、2、3或4。

在一些實施例中，R¹ 及R² 獨立地為可選經取代之C₁ -C₄ 烷基、C₂ -C₄ 烯基、或C₂ -C₄ 炔基。在一較佳實施例中，R¹ 及R² 均為甲基。在其他較佳實施例中，n為1或2。在其他實施例中，當pH高於陽離子脂質之pK_a 時，R³ 不存在，且當pH低於陽離子脂質之pK_a 時，R³ 為氫，使得胺基頭基經質子化。在另一個實施例中，R³ 為可選經取代之C₁ -C₄ 烷基以提供季胺。在進一步實施例中，R⁴ 及R⁵ 獨立地為可選經取代之C₁₂ -C₂₀ 或C₁₄ -C₂₂ 烷基、C₁₂ -C₂₀ 或C₁₄ -C₂₂ 烯基、C₁₂ -C₂₀ 或C₁₄ -C₂₂ 炔基、或C₁₂ -C₂₀ 或C₁₄ -C₂₂ 醯基，其中R⁴ 及R⁵ 中之至少一者包含至少兩個不飽和位點。

在某些實施例中，R⁴ 及R⁵ 獨立地選自由以下所組成之組：十二碳二烯基部分、十四碳二烯基部分、十六碳二烯基部分、十八碳二烯基部分、二十碳二烯基部分、十二碳三烯基部分、十四碳三烯基部分、十六碳三烯基部分、十八碳三烯基部分、二十碳三烯基部分、花生四烯基部分、及二十二碳六烯醯基部分、以及其醯基衍生物(例如亞油醯基、亞麻醯基、γ-亞麻醯基等 )。在一些情況下，R⁴ 及R⁵ 中之一者包含支鏈烷基(例如植烷醯基部分)或其醯基衍生物(例如植烷醯基部分)。在某些情況下，該十八碳二烯基部分為亞油醯基部分。在某些其他情況下，十八碳三烯基部分為亞麻醯基部分或γ-亞麻醯基部分。在某些實施例中，R⁴ 及R⁵ 均為亞油醯基部分、亞麻醯基部分、或γ-亞麻醯基部分。在具體實施例中，式I陽離子脂質為1,2-二亞油醯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞亞麻醯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞油醯基氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDMA)、1,2-二亞油醯氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDAP)、或其混合物。

在一些實施例中，式I陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳為結晶鹽)。在一具體實施例中，式I陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。

陽離子脂質例如DLinDMA及DLenDMA以及附加陽離子脂質之合成描述於美國專利公開案號20060083780中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。陽離子脂質例如C2-DLinDMA及C2-DLinDAP以及附加陽離子脂質之合成描述於國際專利申請案號WO2011/000106中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

另一個態樣，具有以下結構之式II陽離子脂質(或其鹽)為有用的：(II)，其中R¹ 及R² 為相同或不同的且獨立地為可選經取代之C₁₂ -C₂₄ 烷基、C₁₂ -C₂₄ 烯基、C₁₂ -C₂₄ 炔基、或C₁₂ -C₂₄ 醯基；R³ 及R⁴ 為相同或不同的，且獨立地為可選經取代之C₁ -C₆ 烷基、C₂ -C₆ 烯基、或C₂ -C₆ 炔基，或者R³ 及R⁴ 可連接形成4至6個碳原子及1或2個選自氮及氧之雜原子之可選經取代之雜環；R⁵ 不存在或為氫(H)或C₁ -C₆ 烷基以提供季胺；m、n及p為相同或不同的，且獨立地為0、1或2，條件為m、n及p不同時為0；q為0、1、2、3或4；且Y及Z為相同或不同的，且獨立地為O、S或NH。在一較佳實施例中，q為2。

在一些實施例中，式II陽離子脂質為2,2-二亞油醯基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C2-DMA；「XTC2」或「C2K」)、2,2-二亞油醯基-4-(3-二甲基胺基丙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C3-DMA；「C3K」)、2,2-二亞油醯基-4-(4-二甲基胺基丁基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C4-DMA；「C4K」)、2,2-二亞油醯基-5-二甲基胺基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油醯基-4-N-甲基哌嗪子基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-MPZ)、2,2-二亞油醯基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、2,2-二油醯基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DO-K-DMA)、2,2-二硬脂醯基-4二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DS-K-DMA)、2,2-二亞油醯基-4-N-嗎啉代-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-MA)、2,2-二亞油醯基-4-三甲基胺基-[1,3]-二氧戊環氯化物(DLin-K-TMA.Cl)、2,2-二亞油醯基-4,5-雙(二甲基胺基甲基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K² -DMA)、2,2-二亞油醯基-4-甲基哌嗪-[1,3]-二氧戊環(D-Lin-K-N-甲基哌嗪)、或其混合物。在一個實施例中，式II陽離子脂質為DLin-K-C2-DMA。

在一些實施例中，式II陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳為結晶鹽)。在一具體實施例中，式II陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。

陽離子脂質例如DLin-K-DMA以及附加陽離子脂質之合成描述於在PCT公開案號WO 09/086558中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。陽離子脂質例如DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、DLin-K-MPZ、DO-K-DMA、DS-K-DMA、DLin-K-MA、DLin-K-TMA.Cl、DLin-K² -DMA、及D-Lin-K-N-甲基哌嗪、以及另外陽離子脂質描述於2009年10月9日申請之題為「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」的PCT申請案號PCT/US2009/060251中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

另一個態樣，具有以下結構之式III陽離子脂質為有用的：(III) 或其鹽，其中：R¹ 及R² 為相同或不同的，且獨立地為可選經取代之C₁ -C₆ 烷基、C₂ -C₆ 烯基、或C₂ -C₆ 炔基，或者R¹ 及R² 可連接形成4至6個碳原子及1或2個選自由氮(N)、氧(O)、及其混合物所組成之組之雜原子的可選經取代雜環；R³ 不存在或為氫(H)或C₁ -C₆ 烷基以提供季胺；R⁴ 及R⁵ 不存在或存在且當存在時為相同或不同的且獨立地為可選經取代之C₁ -C₁₀ 烷基或C₂ -C₁₀ 烯基；且n為0、1、2、3或4。

在一些實施例中，R¹ 及R² 獨立地為可選經取代之C₁ -C₄ 烷基、C₂ -C₄ 烯基、或C₂ -C₄ 炔基。在一較佳實施例中，R¹ 及R² 均為甲基。在另一較佳實施例中，R⁴ 及R⁵ 均為丁基。在另一較佳實施例中，n為1。在其他實施例中，當pH高於陽離子脂質之pK_a 時，R³ 不存在，且當pH低於陽離子脂質之pK_a 時，R³ 為氫，使得胺基頭基經質子化。在另一個實施例中，R³ 為可選經取代之C₁ -C₄ 烷基以提供季胺。在進一步實施例中，R⁴ 及R⁵ 獨立地為可選經取代之C₂ -C₆ 或C₂ -C₄ 烷基或者C₂ -C₆ 或C₂ -C₄ 烯基。

在另一個實施例中，式III陽離子脂質包含胺基頭基及一或兩個烷基鏈之間之酯鍵。在一些實施例中，式III陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳為結晶鹽)。在一個具體的實施例中，式III陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。

雖然式III中之各烷基鏈含有在位置6、9及12(即，順式 , 順式 , 順式 -Δ⁶ ,Δ⁹ ,Δ¹² )處之順式雙鍵，在一個替代實施例中，一或兩條烷基鏈中之這些雙鍵之一者、兩者、或三者可處於反式構型中。

在具體實施例中，式III陽離子脂質具有以下結構：γ-DLenDMA (15 )

陽離子脂質例如γ-DLenDMA (15 )以及附加陽離子脂質之合成描述於2009年7月1日申請且題為「Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之美國臨時申請案號61/222,462，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

陽離子脂質例如DLin-M-C3-DMA (「MC3」)以及附加陽離子脂質(例如 MC3之某些類似物)之合成描述於2009年6月10申請且題為「Novel Lipids and Compositions for the Delivery of Therapeutics」之美國臨時申請案號61/185,800，以及2009年12月18日申請且題為「Methods and Compositions for Delivery of Nucleic Acids」之美國臨時申請案號61/287,995中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文中。

脂質顆粒中可包括之其他陽離子脂質或其鹽之實例包括但不限於陽離子脂質，例如WO2011/000106中描述者，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文，以及陽離子脂質例如N,N-二油醯基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、1,2-二油醯氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂醯氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二硬脂醯基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、3-(N-(N’,N’-二甲基胺基乙烷)-胺基甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉荳蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺-碳醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨(DOSPA)、雙十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧代戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9’,1-2’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油醯氧基芐胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油醯基胺基甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亞油醯基胺基甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯基胺基甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油醯基氧基-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油醯基氧基-3-嗎啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油醯基硫代-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油醯基氧基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油醯基氧基-3-(N-甲基哌嗪子基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油醯基胺基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油醯基胺基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亞油醯基氧代-3-(2-N,N-二甲基胺基)eth氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二油醯基胺基甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DO-C-DAP)、1,2-二肉豆蔻油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DMDAP)、1,2-二油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化物(DOTAP.Cl)、二亞油醯基l甲基-3-二甲基胺基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA；也稱為DLin-M-K-DMA或DLin-M-DMA)、及其混合物。可包括在脂質顆粒中之附加陽離子脂質或其鹽描述於美國專利公開案號20090023673中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文中。

陽離子脂質例如CLinDMA以及附加陽離子脂質之合成描述於美國專利公開案號20060240554中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。陽離子脂質諸如DLin-C-DAP、DLinDAC、DLinMA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLinTMA.Cl、DLinTAP.Cl、DLinMPZ、DLinAP、DOAP、及DLin-EG-DMA以及附加陽離子脂質之合成描述於PCT公開案號WO 09/086558中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。。陽離子脂質例如DO-C-DAP、DMDAP、DOTAP.Cl、DLin-M-C2-DMA以及附加陽離子脂質之合成描述於2009年10月9日申請且題為「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之PCT申請案號PCT/US2009/060251，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。許多其他陽離子脂質及相關類似物之合成已描述於美國專利案號5,208,036；5,264,618；5,279,833；5,283,185；5,753,613；以及5,785,992；以及PCT公開案號WO 96/10390，其揭露內容各自出於所有目的以引用方式整體併入本文。此外，可使用許多陽離子脂質之商業製劑，例如， LIPOFECTIN ^® (包括DOTMA及DOPE，可獲自Invitrogen)；LIPOFECTAMINE^® (包括DOSPA及DOPE，可獲自Invitrogen)；及TRANSFECTAM^® (包括DOGS，可獲自Promega公司)。

在一些實施例中，陽離子脂質佔存在於顆粒中之總脂質之約50 mol%至約90 mol%、約50 mol%至約85 mol%、約50 mol%至約80 mol%、約50 mol%至約75 mol%、約50 mol%至約70 mol%、約50 mol%至約65 mol%、約50 mol%至約60 mol%、約55 mol%至約65 mol%、或約55 mol%至約70 mol%(或其任何分數或其中之範圍)。在具體實施例中，陽離子脂質佔存在於顆粒中之總脂質之約50 mol%、51 mol%、52 mol%、53 mol%、54 mol%、55 mol%、56 mol%、57 mol%、58 mol%、59 mol%、60 mol%、61 mol%、62 mol%、63 mol%、64 mol%、或65 mol% (或其任何分數)。

在其他實施例中，陽離子脂質佔存在於顆粒中之總脂質之約2 mol%至約60 mol%、約5 mol%至約50 mol%、約10 mol%至約50 mol%、約20 mol%至約50 mol%、約20 mol%至約40 mol%、約30 mol%至約40 mol%、或約40 mol%(或其任何分數或其中之範圍)。

適用於脂質顆粒中之陽離子脂質之附加百分比及範圍描述於PCT公開案號WO 09/127060、美國公開申請案號US 2011/0071208、PCT公開案號WO2011/000106、及美國公開申請案號US 2011/0076335中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

應該理解，存在於脂質顆粒中之陽離子脂質之百分比為目標量，且調配物中存在之陽離子脂質之實際量可發生變化，例如± 5 mol%。例如，在一示例性脂質顆粒調配物中，陽離子脂質之目標量為57.1 mol%，但陽離子脂質之實際量可為該目標量之± 5 mol%、± 4 mol%、± 3 mol%、± 2 mol%、± 1 mol%、± 0.75 mol%、± 0.5 mol%、± 0.25 mol%、或± 0.1 mol%，該調配物之其餘物由其他脂質組分構成(加入至多100 mol%存在於顆粒中之總脂質；然而，熟習此項技藝者將理解，總100 mol%由於四捨五入而稍微偏離，例如99.9 mol%或100.1 mol%)。

下面展示適用於包含在脂質顆粒中之陽離子脂質之其他實例N,N-二甲基-2,3-雙((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)丙-1-胺(5 )2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(6 )(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲胺基)丁酸酯(7) 3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(8 )(Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-16-烯-11-基5-(二甲基胺基)戊酸酯(53 )(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基6-(二甲基胺基)己酸酯(11 )(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基5-(二甲基胺基)戊酸酯(13 )12-癸基二十一碳烯-11-基5-(二甲基胺基)戊酸酯(14 )。非陽離子脂質

脂質顆粒中使用之非陽離子脂質可為能夠產生穩定複合物之各種中性不帶電荷、兩性離子或陰離子脂質中之任一者。

非陽離子脂質之非限制性實例包括磷脂例如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、磷酸二鯨蠟脂、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯卵磷脂(DPPC)、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯-磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯-磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯油醯-磷脂醯甘油(POPG)、二油醯磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉荳蔻醯磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、單甲基磷脂醯乙醇胺、二甲基磷脂醯乙醇胺、二反式油醯-磷脂醯乙醇胺(DEPE)、硬脂醯基油醯-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼、及其混合物。亦可使用其他二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。該等脂質中之醯基較佳為衍生自具有C₁₀ -C₂₄ 碳鏈之脂肪酸之醯基，例如月桂醯基、肉荳蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、或油醯基。

非陽離子脂質之其他實例包括甾醇諸如膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物之非限制性實例包括極性類似物，諸如5α-膽甾烷醇、5β-共聚甾烷醇、膽固醇基-(2'-羥基)-乙醚、膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚、及6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5α-膽甾烷、膽甾烯酮、5α-膽甾烷酮、5β-膽甾烷酮、及膽甾醇癸酸酯；及其混合物。在較佳實施例中，膽固醇衍生物為極性類似物，諸如膽固醇-(4'-羥基)-丁醚。膽甾醇基-(2’-羥基)-乙醚之合成描述於在PCT公開案號WO 09/127060中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

在一些實施例中，存在於脂質顆粒中之非陽離子脂質包含一或多種磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物或由其組成。在其他實施例中，存在於脂質顆粒中之非陽離子脂質包含一或多種磷脂或由其組成，例如不含膽固醇之脂質顆粒調配物。在其他實施例中，存在於脂質顆粒中之非陽離子脂質包含膽固醇或其衍生物或由其組成，例如不含磷脂之脂質顆粒調配物。

適合使用之非陽離子脂質之其他實例包括含非磷脂之脂質，例如硬脂胺、十二烷胺、十六烷基胺、乙醯棕櫚酸酯、甘油蓖麻油酸酯、硬脂酸十六烷醇酯、肉荳蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸類聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸醯胺、十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂、或其類似物。

在一些實施例中，非陽離子脂質佔存在於顆粒中之總脂質之約10 mol%至約60 mol%、約20 mol%至約55 mol%、約20 mol%至約45 mol%、約20 mol%至約40 mol%、約25 mol%至約50 mol%、約25 mol%至約45 mol%、約30 mol%至約50 mol%、約30 mol%至約45 mol%、約30 mol%至約40 mol%、約35 mol%至約45 mol%、約37 mol%至約45 mol%、或約35 mol%、36 mol%、37 mol%、38 mol%、39 mol%、40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、或45 mol% (或其任何分數或其中之範圍)。

在脂質顆粒含有磷脂及膽固醇或膽固醇衍生物之混合物之實施例中，混合物可佔存在於顆粒中之總脂質之多至40 mol%、45 mol%、50 mol%、55 mol%、或60 mol%。

在一些實施例中，混合物中之磷脂組分可佔存在於顆粒中之總脂質之約2 mol%至約20 mol%、約2 mol%至約15 mol%、約2 mol%至約12 mol%、約4 mol%至約15 mol%、或約4 mol%至約10 mol% (或其任何分數或其中之範圍)。在某一實施例中，混合物中之磷脂組分佔存在於顆粒中之總脂質之約5 mol%至約17 mol%、約7 mol%至約17 mol%、約7 mol%至約15 mol%、約8 mol%至約15 mol%、或約8 mol%、9 mol%、10 mol%、11 mol%、12 mol%、13 mol%、14 mol%、或15 mol% (或其任何分數或其中之範圍)。作為非限制性實例，包含磷脂及膽固醇之混合物之脂質顆粒調配物可包含約7 mol%(或其任何分數)之磷脂例如DPPC或DSPC，例如與存在於該顆粒中之總脂質之約34 mol% (或其任何分數)之膽固醇或膽固醇衍生物膽固醇或膽固醇衍生物混合。作為另一非限制性實例，包含磷脂及膽固醇之混合物之脂質顆粒調配物可包含約7 mol%(或其任何分數)之磷脂例如DPPC或DSPC，例如與存在於該顆粒中之總脂質之約32 mol% (或其任何分數)之膽固醇或膽固醇衍生物膽固醇或膽固醇衍生物混合。

作為進一步實例，有用的脂質調配物具有約10:1之脂質與藥物(例如，siRNA)比率(例如，脂質:藥物比率為9.5:1至11:1、或9.9:1至11:1、或10:1至10.9:1)。在某些其他實施例中，有用的脂質調配物具有約9:1之脂質與藥物(例如，siRNA)比率(例如，脂質:藥物比率為8.5:1至10:1、或8.9:1至10:1、或9:1至9.9:1，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1、及9.8:1)。

在其他實施例中，混合物中之膽固醇組分可佔存在於顆粒中之總脂質之約25 mol%至約45 mol%、約25 mol%至約40 mol%、約30 mol%至約45 mol%、約30 mol%至約40 mol%、約27 mol%至約37 mol%、約25 mol%至約30 mol%、或約35 mol%至約40 mol%(或其任何分數或其中之範圍)。在某些較佳實施例中，混合物中之膽固醇組分佔存在於顆粒中之總脂質之約25 mol%至約35 mol%、約27 mol%至約35 mol%、約29 mol%至約35 mol%、約30 mol%至約35 mol%、約30 mol%至約34 mol%、約31 mol%至約33 mol%、或約30 mol%、31 mol%、32 mol%、33 mol%、34 mol%、或35 mol% (或其任何分數或其中之範圍)。

在脂質顆粒不含磷脂之實施例中，膽固醇或其衍生物可佔存在於顆粒中之總脂質之最高達約25 mol%、30 mol%、35 mol%、40 mol%、45 mol%、50 mol%、55 mol%、或60 mol%。

在一些實施例中，無磷脂脂質調配物中之膽固醇或其衍生物可佔存在於顆粒中之總脂質之約10 mol%至約60 mol%、約25 mol%至約45 mol%、約25 mol%至約40 mol%、約30 mol%至約45 mol%、約30 mol%至約40 mol%、約31 mol%至約39 mol%、約32 mol%至約38 mol%、約33 mol%至約37 mol%、約35 mol%至約45 mol%、約30 mol%至約35 mol%、約35 mol%至約40 mol%、或約30 mol%、31 mol%、32 mol%、33 mol%、34 mol%、35 mol%、36 mol%、37 mol%、38 mol%、39 mol%、或40 mol% (或其任何分數或其中之範圍)。作為非限制性實例，脂質顆粒調配物可包含存在於顆粒中之總脂質之約37 mol% (或其任何分數)的膽固醇。作為另一非限制性實例，脂質顆粒調配物可包含存在於顆粒中之總脂質之約35 mol% (或其任何分數)的膽固醇。

在其他實施例中，非陽離子脂質佔存在於顆粒中之總脂質之約5 mol%至約 90 mol%、約10 mol%至約85 mol%、約20 mol%至約80 mol%、約10 mol% (例如，僅磷脂)、或約60 mol% (例如，磷脂及膽固醇或其衍生物) (或其任何分數或其中之範圍)。

適用於脂質顆粒中之非陽離子脂質之附加百分比及範圍描述於PCT公開案號WO 09/127060、美國公開申請案號US 2011/0071208、PCT公開案號WO2011/000106、及美國公開申請案號US 2011/0076335中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

應該理解，存在於脂質顆粒中之陽離子脂質之百分比為目標量，且調配物中存在之陽離子脂質之實際量可發生變化，例如± 5 mol%、± 4 mol%、± 3 mol%、± 2 mol%、± 1 mol%、± 0.75 mol%、± 0.5 mol%、± 0.25 mol%、或± 0.1 mol%。脂質綴合物

除了陽離子及非陽離子脂質之外，脂質顆粒亦可包含脂質綴合物。經綴合脂質可用於防止顆粒聚集。合適的綴合脂質包括但不限於PEG-脂質綴合物、POZ-脂質綴合物、ATTA-脂質綴合物、陽離子聚合物-脂質綴合物(CPL)、及其混合物。在某些實施例中，顆粒包含PEG-脂質綴合物或ATTA-脂質綴合物以及CPL。

在一較佳實施例中，脂質綴合物為PEG-脂質。PEG-脂質之實例包括但不限於例如 PCT公開案號WO 05/026372中所述之與二烷氧基丙基偶聯之PEG (PEG-DAA)、例如美國專利公開案號20030077829及2005008689中所述之與二醯基甘油偶聯之PEG (PEG-DAG)、與磷脂偶聯之PEG諸如磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)、例如美國專利案號5,885,613中所述之與神經醯胺綴合之PEG、與膽固醇或其衍生物綴合之PEG、及其混合物。此等專利案文獻之揭露內容出於所有目的以引用方式併入本文中。

適合使用之附加PEG-脂質包括但不限於mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn 3-胺基甲醯基甘油酯(PEG-C-DOMG)。PEG-C-DOMG之合成描述於在PCT公開案號WO 09/086558中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。另外合適的PEG-脂質綴合物包括但不限於 1-[8’-(1,2-二肉荳蔻醯基-3-丙氧基)-甲醯胺基-3’,6’-二氧雜辛烷基]胺基甲醯基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2KPEG-DMG)。2KPEG-DMG之合成描述於美國專利案號7,404,969中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

PEG為具有兩個末端羥基之乙烯PEG重複單元之直鏈水溶性聚合物。PEG按其分子量分類；例如，PEG 2000具有約2,000道爾頓之平均分子量，且PEG 5000具有約5,000道爾頓之平均分子量。PEG可自Sigma Chemical公司及其他公司商購獲得，且包括但不限於以下：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇胺(MePEG-NH₂ )、單甲氧基聚乙二醇甲苯磺酸酯(MePEG-TRES)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)、以及含末端羥基而非末端甲氧基之此等化合物(例如， HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH₂ 等 )。其他PEG例如在美國專利案號6,774,180及7,053,150中描述者(例如， mPEG(20KDa)胺)亦適用於製備PEG-脂質綴合物。此等專利案之揭露內容出於所有目的以引用方式併入本文中。另外，單甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH₂ COOH)特別適用於製備PEG-脂質綴合物(包括例如 PEG-DAA綴合物)。

本文所述之PEG-脂質綴合物之PEG部分可包含範圍自約550道爾頓至約10,000道爾頓之平均分子量。在某些情況下，PEG部分之平均分子量為約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如，約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等 )。在較佳實施例中，PEG部分之平均分子量為約2,000道爾頓或約750道爾頓。

在某些情況下，PEG可以可選地經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。PEG可直接綴合至脂質或可藉由接頭部分連接至脂質。可使用適用於將PEG偶聯至脂質之任何接頭部分，包括例如不含酯接頭部分及含酯接頭部分。在較佳實施例中，接頭部分為不含酯接頭部分。如本文所用，術語「不含酯接頭部分」係指不含羧酸酯鍵(-OC(O)-)之接頭部分。合適的不含酯接頭部分包括但不限於醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)(O)-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀醯基(-(O)CCH₂ CH₂ C(O)-)、琥珀醯胺基(-NHC(O)CH₂ CH₂ C(O)NH-)、醚、二硫化物、以及其組合(例如含有胺基甲酸酯接頭部分及醯胺基接頭部分之接頭)。在一較佳實施例中，胺基甲酸酯接頭用於將PEG偶聯到脂質。

在其他實施例中，使用含酯接頭部分將PEG偶聯至脂質。合適的含酯接頭部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯、及其組合。

具有不同鏈長度及飽和度之各種醯基鏈基團之磷脂醯乙醇胺可綴合至PEG以形成脂質綴合物。此等磷脂醯乙醇胺可商購獲得，或者可使用熟習此項技藝者已知之習知技術分離或合成。鏈長度在C₁₀ 至C₂₀ 範圍內之含有磷脂醯乙醇胺之飽和或不飽和脂肪酸碳為較佳的。亦可使用具有單不飽和或雙不飽和脂肪酸之磷脂醯乙醇胺及飽和與不飽和脂肪酸之混合物。合適的磷脂醯乙醇胺包括但不限於二肉荳蔻醯-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、及二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺(DSPE)。

術語「ATTA」或「聚醯胺」包括但不限於美國專利案號6,320,017及6,586,559中描述之化合物，該等專利案之揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。該等化合物包括具有下式之化合物：(IV)，其中R為選自由氫、烷基及醯基組成的組之成員；R¹ 為選自由氫及烷基組成的組之成員；或可選地，R及R¹ 與其所結合之氮形成疊氮基部分；R² 為選自氫、可選經取代之烷基、可選經取代之芳基、及胺基酸側鏈之組之成員；R³ 為選自由氫、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、肼基、胺基、及NR⁴ R⁵ 所組成之組之成員，其中R⁴ 及R⁵ 獨立地為氫或烷基；n為4至80；m為2至6；p為1至4；q為0或1。其他聚醯胺將為熟習此項技術者所顯而易知。

術語「二醯基甘油」或「DAG」包括具有2個脂肪醯基鏈之化合物，R¹ 及R² 兩者均獨立地具有介於2至30之間個藉由酯鍵連接至甘油的1位及2位之碳。醯基可為飽和的或具有不同不飽和度。合適的醯基包括但不限於月桂醯基(C₁₂ )、肉荳蔻醯基(C₁₄ )、棕櫚醯基(C₁₆ )、硬脂醯基(C₁₈ )、及二十碳醯基(C₂₀ )。在較佳實施例中，R¹ 及R² 為相同的，即， R ¹ 及R² 均為肉荳蔻醯基(即，二肉荳蔻醯基)，R¹ 及R² 均為硬脂醯基(即，二硬脂醯) 等。二醯基甘油具有以下通式：(V)。

術語「二烷氧基丙基」或「DAA」包括具有2個烷基鏈R¹ 及R² 之化合物，該兩個烷基鏈均獨立地具有2至30個碳。烷基可為飽和的或具有不同不飽和度。二烷氧基丙基具有以下通式：(VI)。

在一較佳實施例中，PEG-脂質為具有下式之PEG-DAA綴合物：(VII)，其中R¹ 及R² 為獨立選擇的且為具有約10至約22個碳原子之長鏈烷基；PEG為聚乙二醇；且L為如上所述之不含酯接頭部分或含酯接頭部分。長鏈烷基可為飽和的或不飽和的。合適的烷基包括但不限於癸基(C₁₀ )、月桂基(C₁₂ )、肉荳蔻基(C₁₄ )、棕櫚基(C₁₆ )、硬脂基(C₁₈ )、及二十烷基(C₂₀ )。在較佳實施例中，R¹ 及R² 為相同的，即 R¹ 及R² 均為肉荳蔻基(即，肉荳蔻基)，R¹ 及R² 均為硬脂基(即，二硬脂基)等。

在以上式VII中，PEG之平均分子量範圍為約550道爾頓至約10,000道爾頓。在某些情況下，PEG之平均分子量為約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如，約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等 )。在較佳實施例中，PEG之平均分子量為約2,000道爾頓或約750道爾頓。PEG可以可選地經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在某些實施例中，末端羥基經甲氧基或甲基取代。

在一較佳實施例中，「L」為不含酯接頭部分。合適的不含酯接頭包括但不限於醯胺接頭部分、胺基接頭部分、羰基接頭部分、胺基甲酸酯接頭部分、脲接頭部分、醚接頭部分、二硫鍵接頭部分、琥珀醯胺基接頭部分、及其組合。在較佳實施例中，不含酯接頭部分為胺基甲酸酯接頭部分(即，PEG-C -DAA綴合物)。在另一較佳實施例中，不含酯接頭部分為醯胺基接頭部分(即，PEG-A -DAA綴合物)。在又一較佳實施例中，不含酯接頭部分為琥珀醯胺基接頭部分(即，PEG-S -DAA綴合物)。

在具體實施例中，PEG-脂質綴合物選自：(66 )(PEG-C-DMA)；及(67 )(PEG-C-DOMG)。

使用熟習此項技藝者已知之標準技術及試劑合成PEG-DAA綴合物。應該認識到，PEG-DAA綴合物將含有各種醯胺、胺、醚、硫代、胺基甲酸酯、及脲鍵。熟習此項技藝者將認識到，用於形成該等鍵之方法及試劑為眾所周知的且容易獲得的。參見例如 March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992)；Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989)；及Furniss, VOGEL’S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 第5版 (Longman 1989)。亦應理解，存在的任何官能團可能需要在合成PEG-DAA綴合物之不同點進行保護及脫保護。熟習此項技藝者將認識到，此等技術為眾所周知的。參見例如 Green及Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)。

較佳地，PEG-DAA綴合物為PEG-二癸基氧基丙基(C₁₀ )綴合物、PEG-二月桂氧基丙基(C₁₂ )綴合物、PEG-二肉荳蔻氧基丙基(C₁₄ )綴合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C₁₆ )綴合物、或PEG-二硬脂氧基丙基(C₁₈ )綴合物。在該等實施例中，PEG之平均分子量較佳為約750或約2,000道爾頓。在一特別較佳實施例中，PEG-脂質綴合物包含PEG2000-C-DMA，其中「2000」表示PEG之平均分子量，「C」表示胺基甲酸酯接頭部分，且「DMA」表示二肉荳蔻氧基丙基。在另一特別較佳實施例中，PEG-脂質綴合物包含PEG750-C-DMA，其中「750」表示PEG之平均分子量，「C」表示胺基甲酸酯接頭部分，且「DMA」表示二肉荳蔻醯氧基丙基。在具體實施例中，PEG之末端羥基經甲基取代。熟習此項技藝者將容易地理解，其他二烷氧基丙基可用於PEG-DAA綴合物中。

除了上述內容之外，對於熟習此項技藝者而言顯而易見的是可使用其他親水性聚合物代替PEG。可用於代替PEG之合適聚合物之實例包括但不限於聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺及聚二甲基丙烯醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸、及衍生化纖維素諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。

除了上述組分之外，脂質顆粒可進一步包含陽離子聚(乙二醇)(PEG)脂質或CPL(參見例如 Chen等人, Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)；美國專利案號6,852,334；PCT公開案號WO 00/62813，其揭露內容各自出於所有目的以引用方式整體併入本文)。

合適的CPL包括式VIII化合物： A-W-Y (VIII)，其中A、W及Y如下所述。

關於式VIII，「A」為用作脂質錨之脂質部分，例如兩親脂質、中性脂質、或疏水性脂質。合適的脂質實例包括但不限於二醯基甘油基、二烷基甘油基、N-N-二烷基胺基、1,2-二醯氧基-3-胺基丙烷、及1,2-二烷基-3-胺基丙烷。

「W」為聚合物或低聚物，例如親水聚合物或低聚物。較佳地，親水性聚合物為非免疫原性或具有低固有免疫原性之生物相容性聚合物。或者，若與合適的佐劑一起使用，則親水性聚合物可為弱抗原性的。合適的非免疫原性聚合物包括但不限於PEG、聚醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物、及其組合。在一較佳實施例中，聚合物之分子量為約250至約7,000道爾頓。

「Y」為聚陽離子部分。術語聚陽離子部分係指在所選pH、較佳為生理pH下具有正電荷、較佳為至少2個正電荷之化合物、衍生物或官能團。合適聚陽離子部分包括鹼性胺基酸及其衍生物，例如精胺酸、天冬醯胺、麩胺酸、賴胺酸、及組胺酸；精胺；亞精胺；陽離子樹枝狀物；多胺；多胺糖；及胺基多醣。聚陽離子部分可為直鏈的，諸如直鏈四賴胺酸、分支或樹枝狀結構。在所選定pH值下，聚陽離子部分具有介於約2至約15個之間之正電荷，較佳為介於約2至約12個之間之正電荷，更佳為介於約2至約8個之間之正電荷。所使用聚陽離子部分之選擇可藉由所需顆粒應用類型來判定。

聚陽離子部分上之電荷可分佈於整個顆粒部分周圍，或者該等電荷可為顆粒部分之一特定區域中電荷密度之離散濃度，例如電荷尖峰。若電荷密度分佈在粒子上，則電荷密度可均勻分佈或不均勻分佈。包括聚陽離子部分之電荷分佈之所有變化。

脂質「A」及非免疫原性聚合物「W」可藉由各種方法且較佳藉由共價連接連接。熟習此項技藝者已知之方法可用於「A」及「W」之共價連接。合適的連接包括但不限於醯胺、胺、羧基、碳酸酯、胺基甲酸酯、酯、及腙鍵。對於熟習此項技藝者顯而易見的是，「A」及「W」必須具有互補官能團以實現連接。脂質上之一基團及聚合物上之另一基團這兩個基團之反應將提供所需連接。例如，當脂質為二醯甘油且末端羥基例如用NHS及DCC活化以形成活性酯且然後與含有胺基之聚合物例如聚醯胺反應(參見例如， 美國專利案號6,320,017及6,586,559，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文)時，在兩個基團之間將形成醯胺鍵。

在某些情況下，聚陽離子部分可具有經連接配體，例如用於絡合鈣之靶向配體或螯合部分。較佳地，在配體連接後，陽離子部分保持正電荷。在某些情況下，經連接配體具有正電荷。合適的配體包括但不限於具有反應官能團之化合物或裝置，且包括脂質、兩親脂質、載劑化合物、生物親和性化合物、生物材料、生物聚合物、生物醫學裝置、分析可偵測化合物、治療活性化合物、酶、肽、蛋白質、抗體、免疫刺激劑、放射性標記、螢光素、生物素、藥物、半抗原、DNA、RNA、多醣、脂質體、病毒體、膠束、免疫球蛋白、官能團、其他靶向部分、或毒素。

在一些實施例中，脂質綴合物(例如 PEG-脂質)佔存在於顆粒中之總脂質之0.1 mol%至約3 mol%、約0.5 mol%至約3 mol%、或約0.6 mol%、0.7 mol%、0.8 mol%、0.9 mol%、1.0 mol%、1.1 mol%、1.2 mol%、1.3 mol%、1.4 mol%、1.5 mol%、1.6 mol%、1.7 mol%、1.8 mol%、1.9 mol%、2.0 mol%、2.1 mol%、2.2 mol%、2.3 mol%、 2.4 mol%、2.5 mol%、2.6 mol%、2.7 mol%、2.8 mol%、2.9 mol%、或3 mol%(或其任何分數或其中之範圍)。

在其他實施例中，脂質綴合物(例如，PEG-脂質)佔存在於顆粒中之總脂質之約0 mol%至約20 mol%、約0.5 mol%至約20 mol%、約2 mol%至約20 mol%、約1.5 mol%至約18 mol%、約2 mol%至約15 mol%、約4 mol%至約15 mol%、約2 mol%至約12 mol%、約5 mol%至約12 mol%、或約2 mol%(或其任何分數或其中之範圍)。

在進一步實施例中，脂質綴合物(例如，PEG-脂質)佔存在於顆粒中之總脂質之約4 mol%至約10 mol%、約5 mol%至約10 mol%、約5 mol%至約9 mol%、約5 mol%至約8 mol%、約6 mol%至約9 mol%、約6 mol%至約8 mol%、或約5 mol%、6 mol%、7 mol%、8 mol%、9 mol%、或10 mol% (或其任何分數或其中之範圍)。

應該理解，存在於脂質顆粒中之脂質綴合物之百分比為目標量，且調配物中存在之脂質綴合物之實際量可發生變化，例如± 5 mol%、± 4 mol%、± 3 mol%、± 2 mol%、± 1 mol%、± 0.75 mol%、± 0.5 mol%、± 0.25 mol%、或± 0.1 mol%。

適用於脂質顆粒中之脂質綴合物之附加百分比及範圍描述於PCT公開案號WO 09/127060、美國公開申請案號US 2011/0071208、PCT公開案號WO2011/000106、及美國公開申請案號US 2011/0076335中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

熟習此項技藝者將理解，脂質綴合物之濃度可根據所用脂質綴合物及脂質粒子變成促融合物之速率而變化。

藉由控制脂質綴合物之組成及濃度，可控制脂質綴合物從脂質顆粒交換之速率，且進而控制脂質顆粒變成促融合物之速率。例如，當使用PEG-DAA綴合物作為脂質綴合物時，脂質顆粒變成促融合物之速率可例如藉由改變脂質綴合物之濃度、藉由改變PEG之分子量、或藉由改變PEG-DAA綴合物上之烷基之鏈長度及飽和度而改變。另外，可使用其他變量來改變及/或控制脂質顆粒變成促融合物之速率，該等變量包括例如pH、溫度、離子強度等。在閱讀本揭露後，可用於控制脂質顆粒變成促融合物之速率的其他方法對於熟習此項技藝者而言將變得顯而易見。而且，藉由控制脂質綴合物之組成及濃度，可控制脂質粒度。附加載劑系統

適合使用之附加基於脂質之載劑系統之非限制性實例包括脂質複合物(參見例如 美國專利公開案號20030203865；及Zhang等人 ,J. Control Release , 100:165-180 (2004))、pH (參見例如 美國專利公開案號20020192275)、可逆掩蔽之脂質複合物(參見例如 美國專利公開案號20030180950)、基於陽離子脂質之組成物(參見例如 美國專利案號6,756,054；以及US專利公開案號20050234232)、陽離子脂質體(參見例如 美國專利公開案號20030229040、20020160038、及20020012998；美國專利案號5,908,635；以及PCT公開案號WO 01/72283)、陰離子脂質體(參見例如 美國專利公開案號20030026831)、pH敏感性脂質體(參見例如 美國專利公開案號20020192274；及AU 2003210303)、抗體包被之脂質體(參見例如 美國專利公開案號20030108597；及PCT公開案號WO 00/50008)、細胞類型特異性脂質體(參見例如 美國專利公開案號20030198664)、含有核酸及肽之脂質體(參見例如 美國專利案號6,207,456)、含有用可釋放親水聚合物衍生化之脂質之脂質體(參見例如 美國專利公開案號20030031704)、脂質包載之核酸(參見例如 PCT公開案號WO 03/057190及WO 03/059322)、脂質封裝之核酸(參見例如 美國專利公開案號20030129221；及美國專利案號5,756,122)、其他脂質體組成物(參見例如 美國專利公開案號20030035829及20030072794；以及美國專利案號6,200,599)、脂質體及乳劑之穩定混合物(參見例如 EP1304160)、乳液組成物(參見例如 美國專利案號6,747,014)、及核酸微乳液(參見例如 美國專利公開案號20050037086)。

適合使用之基於聚合物之載劑系統之實例包括但不限於陽離子聚合物-核酸複合物(即多聚複合物)。為形成多聚複合物，通常可將核酸(例如， siRNA分子，例如本文表A或實例中描述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)與具有直鏈、支鏈、星形或樹狀聚合物結構之陽離子聚合物複合，該陽離子聚合物將核酸縮合成能夠與細胞表面處之陰離子蛋白聚醣相互作用並藉由胞吞作用進入細胞之帶正電顆粒。在一些實施例中，多聚複合物包含與陽離子聚合物複合之核酸(例如 siRNA分子，諸如本文表A或實例中所述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)，該陽離子聚合物諸如聚乙烯亞胺(PEI)(例如參見 美國專利案號6,013,240；可自Qbiogene, Inc.(Carlsbad, CA)以In vivo jetPEIä形式商購獲得，PEI之直鏈形式)、聚丙烯亞胺(PPI)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚-L-賴氨酸(PLL)、二乙烯基胺基乙基(DEAE)-右旋糖酐、聚(β-胺基酯)(PAE)聚合物(參見例如 Lynn等人 ,J. Am. Chem. Soc. , 123:8155-8156 (2001))、殼聚糖、聚醯胺基胺(PAMAM)樹枝狀物(參見例如 Kukowska-Latallo等人 ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 93:4897-4902 (1996))、卟啉(參見例如 美國專利案號6,620,805)、聚乙烯醚(參見例如 美國專利公開案號20040156909)、聚環狀脒(參見例如 美國公開案號20030220289)、其他包含伯胺、亞胺、胍、及/或咪唑基團之聚合物(參見例如 美國專利案號6,013,240；PCT公開案號WO/9602655；PCT公開案號WO95/21931；Zhang等人 ,J. Control Release , 100:165-180 (2004)；及Tiera等人 ,Curr. Gene Ther. , 6:59-71 (2006))、及其混合物。在其他實施例中，該多聚複合物包含如美國專利公開案號20060211643、20050222064、20030125281、及20030185890、以及PCT公開案號WO 03/066069中所述之陽離子聚合物-核酸複合物；如美國專利公開案號20040071654中所述之可生物降解的聚(b-胺基酯)聚合物-核酸複合物；如美國專利公開案號20040142475中所述之含有聚合物基質之微粒；如美國專利公開案號20030157030中所述之其他微粒組成物；如美國專利公開案號20050123600中所述之縮合核酸複合物；以及如AU 2002358514及PCT公開案號WO 02/096551中所述之奈米膠囊及微膠囊組成物。

在某些情況下，siRNA可與環糊精或其聚合物複合。基於環糊精之載劑系統之非限制性實例包括美國專利公開案號20040087024中所述之環糊精-修飾的聚合物-核酸複合物；美國專利案號6,509,323、6,884,789、及7,091,192中所述之直鏈環糊精共聚物-核酸複合物；及美國專利案號7,018,609中所述之環糊精聚合物絡合劑-核酸複合物。在某些其他情況下，siRNA可與肽或多肽複合。基於蛋白質之載劑系統之實例包括但不限於PCT公開案號WO95/21931中所述之陽離子寡肽-核酸複合物。脂質顆粒之製備

核酸-脂質顆粒可藉由此項技藝已知之任何方法形成，該等方法包括但不限於連續混合方法、直接稀釋方法、及在線稀釋方法，在該核酸-脂質顆粒內核酸(例如， 本文表A或實例中所述之siRNA、包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)截留在顆粒脂質部分內且受到保護免於降解。

在具體實施例中，陽離子脂質可包含單獨或與其他陽離子脂質組合之式I-III脂質或其鹽。在其他實施例中，非陽離子脂質為卵鞘磷脂(ESM)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、1-棕櫚醯-2-油醯-磷脂醯膽鹼(POPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、單甲基磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、14:0 PE (1,2-二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE))、16:0 PE (1,2-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺(DPPE))、18:0 PE (1,2-二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE))、18:1 PE (1,2-二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE))、18:1反式PE (1,2-反式油醯-磷脂醯乙醇胺(DEPE))、18:0-18:1 PE (1-硬脂醯-2-油醯-磷脂醯乙醇胺(SOPE))、16:0-18:1 PE (1-棕櫚醯-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE))、聚乙二醇基聚合物(例如 PEG 2000、PEG 5000、PEG-修飾之二醯基甘油、或PEG修飾之二烷基氧基丙基)、膽固醇、其衍生物、或其組合。

在某些實施例中，核酸-脂質顆粒藉由連續混合方法產生，該連續混合方法例如一種包括以下各項之方法：在第一儲器中提供包含siRNA之水溶液、在第二儲器中提供有機脂質溶液(其中存在於有機脂質溶液中之脂質溶解於有機溶劑例如低級烷醇諸如乙醇中)、且將水溶液與有機脂質溶液混合以使得有機脂質溶液與水溶液混合以基本上瞬間產生將siRNA封裝在脂質囊泡內之脂質囊泡(例如脂質體)。該方法及用於執行該方法之設備描述於美國專利公開案號20040142025中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文中。

將脂質及緩衝溶液連續引入混合環境例如混合室中之作用能夠用緩衝溶液連續稀釋脂質溶液，從而在混合時基本上立即產生脂質囊泡。如本文所用，片語「用緩衝溶液連續稀釋脂質溶液」(及其變體)通常意指脂質溶液在水合過程中以足夠力充分快速稀釋以實現囊泡產生。藉由將包含核酸之水溶液與有機脂質溶液混合，有機脂質溶液在緩衝溶液(即水溶液)存在下經歷連續逐步稀釋以產生核酸-脂質顆粒。

使用連續混合方法形成之核酸-脂質顆粒之尺寸通常為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、小於約120 nm、110 nm、100 nm、90 nm、或80 nm、或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm、或150 nm (或其任何分數或其中之範圍)。如此形成之顆粒不會聚集，且可選地具有實現均勻粒度之尺寸。

在另一實施例中，核酸-脂質顆粒經由直接稀釋方法產生，該直接稀釋方法包括形成脂質囊泡(例如脂質體)溶液、且立即並直接將脂質囊泡溶液引入含有受控量之稀釋緩衝液之收集容器中。在較佳態樣中，收集容器包括一或多個經組態成攪動收集容器內容物以促進稀釋之元件。在一態樣中，存在於收集容器中之稀釋緩衝液之量基本上等於引入其中之脂質囊泡溶液之體積。作為非限制性實例，當引入含有等體積稀釋緩衝液之收集容器中時，45%乙醇中之脂質囊泡溶液將有利地產生更小顆粒。

在又一實施例中，核酸-脂質顆粒藉由在線稀釋方法產生，在該在線稀釋方法中包含稀釋緩衝液之第三儲器流體聯接至第二混合區域。在該實施例中，在第一混合區域中形成之脂質泡囊(例如脂質體)溶液立即且直接與稀釋緩衝液在第二混合區域中混合。在較佳態樣中，第二混合區域包括T型連接器，該T型連接器配置成使得脂質囊泡溶液及稀釋緩衝液流動以180°相反流形式相遇；然而，可使用提供較淺角度之連接器，例如約27°至約180°(例如約90°)。泵機構向第二混合區輸送可控緩衝液流。在一態樣中，提供至第二混合區域之稀釋緩衝液之流速經控制為基本上等於自第一混合區域引入至其中之脂囊泡溶液之流速。該實施例有利地允許更好地控制與脂質囊泡溶液混合之稀釋緩衝液在第二混合區域中之流動，且因此亦允許在整個第二混合過程中更好地控制緩衝液中之脂質囊泡溶液之濃度。稀釋緩衝液流速之該控制有利地允許在經降低濃度下形成小粒度。

該等方法及用於進行該等直接稀釋及在線稀釋方法之裝置詳細描述於美國專利公開案號20070042031中，其揭露內容出於所有目的以引用方式併入本文。

使用直接稀釋及在線稀釋方法形成之核酸-脂質顆粒之尺寸通常為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、小於約120 nm、110 nm、100 nm、90 nm、或80 nm、或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm、或150 nm (或其任何分數或其中之範圍)。如此形成之顆粒不會聚集，且可選地具有實現均勻粒度之尺寸。

脂質顆粒可藉由可用於確定脂質體尺寸之任何方法來確定尺寸。可進行尺寸確定以獲得期望的尺寸範圍及相對窄的粒度分佈。

若干技術可用於將顆粒尺寸確定成所需尺寸。一種用於脂質體且同樣適用於本發明顆粒之確定尺寸方法描述於美國專利案號4,737,323中，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。藉由浴或探針超聲處理來超聲處理顆粒懸浮液，會引起尺寸逐漸減小至小於約50 nm之顆粒。均化為另一種依靠剪切能將較大顆粒碎裂成較小顆粒之方法。在典型均化程序中，顆粒通過標準乳化均質器再循環直至觀察到通常介於約60與約80 nm之間之選定粒度。在這兩種方法中，粒度分佈可藉由習知的激光束粒度分析或QELS來監測。

通過小孔聚碳酸酯膜或不對稱陶瓷膜擠出顆粒亦為一種用於將顆粒尺寸減小至相當明確限定之尺寸分佈的有效方法。通常，懸浮液循環通過膜一或多次，直到達到所需粒度分佈。顆粒可通過連續較小孔隙膜擠出，以實現尺寸逐漸減小。

在一些實施例中，存在於顆粒中的核酸(例如，siRNA分子)進行預縮合，如美國專利申請案號09/744,103中所述，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

在其他實施例中，該等方法可進一步包含添加可用於使用本發明組成物進行細胞脂質轉染之非脂質聚陽離子。合適的非脂質聚陽離子之實例包括海美溴銨(自Aldrich Chemical公司以POLYBRENE^® 銷售，Milwaukee, Wisconsin, USA)或其他海美銨鹽。其他合適聚陽離子包括例如聚-L-鳥胺酸、聚-L-精胺酸、聚-L-賴胺酸、聚-D-賴胺酸、聚烯丙基胺、及聚乙烯亞胺之鹽。該等鹽之加入較佳在顆粒形成之後。

在一些實施例中，所形成核酸-脂質顆粒中之核酸(例如，siRNA)與脂質比率(質量/質量比)範圍將為約0.01至約0.2、約0.05至約0.2、約0.02至約0.1、約0.03至約0.1、或約0.01至約0.08。起始材料之比率(投入量)亦在此範圍內。在其他實施例中，顆粒製劑使用約400 μg核酸/10 mg總脂質，或使用以下核酸與脂質質量比：約0.01至約0.08、且更佳約0.04，其對應於1.25 mg總脂質/50 µg核酸。在其他較佳實施例中，顆粒之核酸:脂質質量比為約0.08。

在其他實施例中，所形成核酸-脂質顆粒中之脂質與核酸(例如，siRNA)比率(質量/質量比)範圍將為約1 (1:1)至約100 (100:1)、約5 (5:1)至約100 (100:1)、約1 (1:1)至約50 (50:1)、約2 (2:1)至約50 (50:1)、約3 (3:1)至約50 (50:1)、約4 (4:1)至約50 (50:1)、約5 (5:1)至約50 (50:1)、約1 (1:1)至約25 (25:1)、約2 (2:1)至約25 (25:1)、約3 (3:1)至約25 (25:1)、約4 (4:1)至約25 (25:1)、約5 (5:1)至約25 (25:1)、約5 (5:1)至約20 (20:1)、約5 (5:1)至約15 (15:1)、約5 (5:1)至約10 (10:1)、或約5 (5:1)、6 (6:1)、7 (7:1)、8 (8:1)、9 (9:1)、10 (10:1)、11 (11:1)、12 (12:1)、13 (13:1)、14 (14:1)、15 (15:1)、16 (16:1)、17 (17:1)、18 (18:1)、19 (19:1)、20 (20:1)、21 (21:1)、22 (22:1)、23 (23:1)、24 (24:1)、或25 (25:1)、或其任何分數或其中之範圍。起始材料之比率(投入量)亦在此範圍內。

如前所述，經綴合脂質可進一步包括CPL。本文討論用於製備脂質顆粒-CPL(含CPL脂質顆粒)之各種通用方法。兩種通用技術包括「插入後」技術，亦即將CPL插入到例如預先形成之脂質顆粒中，以及「標準」技術，其中CPL包括在脂質混合物中，例如在脂質顆粒形成步驟期間。插入後技術形成主要在脂質顆粒雙層膜外表面中具有CPL之脂質顆粒，而標準技術提供在內部及外部表面具有CPL之脂質顆粒。該方法尤其適用於由磷脂(其可含有膽固醇)製成之囊泡以及含有PEG-脂質之囊泡(例如PEG-DAA及PEG-DAG)。製成脂質顆粒-CPL之方法例如在美國專利案號5,705,385；6,586,410；5,981,501；6,534,484；及6,852,334；美國專利公開案號20020072121；及PCT公開案號WO 00/62813中教授，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。脂質顆粒之投與

脂質顆粒(例如， 核酸脂質顆粒)可經吸附到與其混合或接觸之幾乎任何細胞類型。一旦經吸附，顆粒可經一部分細胞內吞，與細胞膜交換脂質，或與細胞融合。顆粒之siRNA部分之轉移或摻入可藉由該等途徑中之任何一者進行。特別是，當發生融合時，顆粒膜經整合到細胞膜中，且顆粒內容物與細胞內液體結合。

脂質顆粒(例如， 核酸-脂質顆粒)可單獨投與或與根據投與途徑及標準藥物實踐而選擇之醫藥學上可接受之載劑(例如生理鹽水或磷酸鹽緩衝液)混合投與。通常，將使用正常緩衝鹽水(例如 135-150 mM NaCl)作為醫藥學上可接受之載劑。其他合適的載劑包括例如水、緩沖水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸、及其類似物，包括用於增強穩定性之糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。附加合適載劑描述於例如 REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版 (1985)。如本文所用，「載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、媒介物、包衣、稀釋劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體、及其類似物。片語「生理學上可接受」係指分子實體及組成物在投與人類時並不產生過敏性或類似的不良反應。

通常在脂質顆粒形成後加入醫藥學上可接受之載劑。因此，在脂質顆粒形成後，可將顆粒稀釋到醫藥學上可接受之載劑，例如正常緩衝鹽水中。

藥物調配物中顆粒之濃度可廣泛變化，亦即小於約0.05%、通常為或至少約2%至5%、至多達約10重量%至90重量%，且將主要藉由流體體積、黏度等根據所選特定投與模式而選擇。例如，可增加濃度以降低與治療相關之流體負荷。這對於患有動脈粥樣硬化相關性充血性心力衰竭或嚴重高血壓之患者可能特別理想。或者，可將由刺激性脂質組成之顆粒稀釋至低濃度以減少投與部位之炎症。

藥物組成物可藉由習知且公知之滅菌技術進行滅菌。水溶液可經封裝以在無菌條件下使用或過濾且凍乾，經凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液組合。該組成物可含有接近生理條件所需之醫藥學上可接受之輔助物質，例如pH調節劑及緩沖劑、張度調節劑、及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、及氯化鈣。此外，顆粒懸浮液可包括脂質保護劑，其在存儲時保護脂質免受自由基及脂質過氧化損傷。親脂性自由基猝滅劑例如α-生育酚及水溶性鐵特異性螯合劑例如鐵草胺為合適的。體內投與

用於體內治療之全身遞送，例如經由身體系統諸如循環將本文描述之siRNA分子，例如本文表A或實例中描述之siRNA，包括本文描述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合遞送至遠端靶細胞，已使用核酸-脂質顆粒實現，諸如PCT公開案號WO 05/007196、WO 05/121348、WO 05/120152、及WO 04/002453所述者，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文。

對於體內投與，投與可以此項技藝已知之任何方式進行，例如藉由注射、口服投與、吸入(例如，經鼻或氣管內)、透皮應用、或直腸投與。可藉由單次或分次劑量完成投與。藥物組成物可非經腸投與，即關節內、靜脈內、腹膜內、皮下、或肌內投與。在一些實施例中，藥物組成物藉由快速濃注在靜脈內或腹膜內投與(參見例如 美國專利案號5,286,634)。細胞內核酸遞送亦已在Straubringer等人 ,Methods Enzymol. , 101:512 (1983)；Mannino等人 ,Biotechniques, 6:682 (1988)；Nicolau等人 ,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst ., 6:239 (1989)；及Behr,Acc. Chem. Res ., 26:274 (1993)中有所討論。投與基於脂質之治療劑之其他方法描述於例如美國專利案號3,993,754；4,145,410；4,235,871；4,224,179；4,522,803；及4,588,578。脂質顆粒可藉由在疾病部位直接注射或藉由在疾病部位遠端部位注射而投與(參見例如 Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71(1994))。上述參考文獻之揭露內容出於所有目的以引用方式併入本文中。

在脂質顆粒靜脈內投與之實施例中，在注射後約8、12、24、36、或48小時，顆粒之總注射劑量之至少約5%、10%、15%、20%、或25%存在於血漿中。在其他實施例中，在注射後約8、12、24、36、或48小時，脂質顆粒之總注射劑量之多於約20%、30%、40%及多至約60%、70%或80%存在於血漿中。在某些情況下，在投與後約1小時，多種顆粒之多於約10%存在於人血漿中。在某些其他情況下，在投與顆粒後至少約1小時可偵測到脂質顆粒之存在。在一些實施例中，在投與後約8、12、24、36、48、60、72、或96小時，細胞中可偵測到siRNA分子之存在。在其他實施例中，在投與後約8、12、24、36、48、60、72、或96小時，可偵測到siRNA分子下調靶序列諸如病毒或宿主序列之表現。在其他實施例中，藉由siRNA分子下調靶序列例如病毒或宿主序列之表現，優先發生於受感染細胞及/或能夠被感染之細胞中。在進一步實施例中，在投與後約12、24、48、72、或96小時、或約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、或28天，可偵測到siRNA分子在投與部分近端或遠端部位處之存在或效果。在附加實施例中，脂質顆粒非經腸或腹膜內投與。

單獨或與其他合適組分一起使用之組成物可製成氣霧劑調配物(即它們可「霧化」)以藉由吸入(例如鼻內或氣管內)投與(參見 Brigham等人 ,Am. J. Sci ., 298:278 (1989))。氣霧劑調配物可置放於加壓可接受推進劑(諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣、及其類似物)中。

在某些實施例中，藥物組成物可藉由鼻內噴霧劑、吸入劑、及/或其他氣霧劑遞送媒介物遞送。例如在美國專利案號5,756,353及5,804,212中已描述經由鼻用氣霧劑噴霧劑直接將核酸組成物遞送至肺部之方法。同樣，使用鼻內微粒樹脂及溶血磷脂醯甘油化合物遞送藥物(美國專利案5,725,871)在製藥領域亦為眾所周知的。類似地，美國專利案號5,780,045中描述呈聚四氟乙烯支撐基質形式之透黏膜藥物遞送。上述專利之揭露內容出於所有目的以引用方式併入本文中。

適於非經腸投藥、例如藉由關節內(在關節中)、靜脈內、肌內、經皮、腹膜內、及皮下途徑之調配物包括水性及非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、及使調配物與預定接受者之血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。

通常，當靜脈內投與時，脂質顆粒調配物與合適藥物載劑一起配製。合適調配物見於例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版 (1985)。可使用各種水性載劑，例如水、緩沖水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸、及其類似物，且其可包括用於增強穩定性之糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，將使用正常緩衝鹽水(135-150 mM NaCl)作為醫藥學上可接受之載劑，但其他合適的載劑將足夠。此等組成物可藉由習知脂質體滅菌技術諸如過濾來滅菌。該組成物可含有接近生理條件所需之醫藥學上可接受之輔助物質，例如pH調節劑及緩沖劑、張力調節劑、潤濕劑、及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨糖醇酐單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。該等組成物可使用上述技術進行滅菌，或者其可在無菌條件下生產。所得水溶液可經封裝以在無菌條件下使用或過濾且凍乾，經凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液組合。

在某些應用中，本文揭露之脂質顆粒可藉由口服投與遞送至個體。顆粒可摻入賦形劑且以可吸收片劑、頰含片劑、錠劑、膠囊、丸劑、口含錠、酏劑、漱口水、懸浮液、口腔噴霧劑、糖漿劑、麵片、及其類似物形式使用(參見例如 美國專利案5,641,515、5,580,579、及5,792,451，其揭露內容出於所有目的以引用方式整體併入本文)。該等口服劑型亦可含有以下各項：黏合劑、明膠；賦形劑、潤滑劑、及/或調味劑。當單位劑型為膠囊時，除以上所述之材料之外，其亦可含有液體載劑。各種其他材料可作為包衣存在或可存在以另外改進劑量單位之實物形式。當然，用於製備任何單位劑型之任何材料皆應為醫藥學上純的且在所用量下實質上無毒。

通常，該等口服調配物可含有至少約0.1%之脂質顆粒或更多，儘管顆粒百分比當然可變化且可方便地在總調配物之重量或體積之約1%或2%與約60%或70%之間、或更多。自然，各治療上有用的組成物中之顆粒量可以一種方式製備，使得在化合物之任何給定單位劑量下將獲得合適劑量。各因素諸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、投與途徑、產品貨架壽命、以及其他藥理學考慮因素將由熟習製備此類藥物調配物技藝者考慮，且因此，各種劑量及治療方案可能為合意的。

適用於口服投與之調配物可由以下組成：(a)液體溶液，例如有效量之經包裝siRNA分子(例如，本文表A或實例中所述之siRNA分子，包括本文所述之siRNA分子之特定組合，例如siRNA分子之雙向及三向組合)懸浮於稀釋劑例如水、鹽水、或PEG400中；(b)膠囊、小藥囊、或片劑，其各自含有預定量之siRNA分子，如液體、固體、顆粒、或明膠；(c)於適當液體中之懸浮液；及(d)合適乳液。片劑形式可包括以下一或多者：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸、及其他賦形劑、著色劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑、及醫藥學上相容之載劑。口含錠形式可包含siRNA分子於調味劑例如蔗糖中，以及糖錠包含治療性核酸於惰性基質，諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠、乳液、凝膠、及其類似物中，除siRNA分子之外亦含有此項技術中所已知之載劑。

在其使用之另一個實例中，可將脂質顆粒摻入寬範圍之局部劑型中。例如，含有核酸-脂質顆粒之懸浮液可以凝膠、油、乳液、局部用乳膏劑、糊劑、軟膏劑、洗劑、泡沫劑、摩絲、及其類似物形式配製及投與。

投與之顆粒的量將視siRNA分子與脂質之比率、所用特定siRNA、所治療之HBV病毒株、患者之年齡、體重及病況、及臨床醫師之判斷而定，但通常將為約0.01與約50 mg/每公斤體重之間，較佳約0.1與約5 mg/kg體重之間，或每次投與(例如注射)約10⁸ -10¹⁰ 個顆粒。

下面描述選自稱為1m至15m之siRNA之組之不同siRNA之可能的「雙向」及「三向」組合(參見表 A)。在實例中描述其他組合，例如三向組合。術語「組合」意指經組合之siRNA分子一起存在於同一物質組成物中(例如一起溶解於同一溶液內；或一起存在於同一脂質顆粒內；或一起存在於同一脂質顆粒藥物調配物中，儘管藥物調配物內之各脂質顆粒可包括或可不包括siRNA組合之各不同siRNA)。經組合之siRNA分子通常未共價連接在一起。

某些個別siRNA各自用名稱1m至15m鑒別，如表A所示。組合內之各siRNA編號以連接號(-)分開；例如，符號「1m-2m」代表siRNA編號1m及siRNA編號2m之組合。連接號不意味著該組合內之不同siRNA分子彼此共價連接。不同siRNA組合由分號分開。組合內之siRNA編號之順序並不重要。例如，組合1m-2m等同於組合2m-1m，因為該等符號兩者均描述siRNA編號1m與siRNA編號2m之組合。

siRNA 1m至15m之雙向siRNA組合為：1m-2m；1m-3m；1m-4m；1m-5m；1m-6m；1m-7m；1m-8m；1m-9m；1m-10m；1m-11m；1m-12m；1m-13m；1m-14m；1m-15m；2m-3m；2m-4m；2m-5m；2m-6m；2m-7m；2m-8m；2m-9m；2m-10m；2m-11m；2m-12m；2m-13m；2m-14m；2m-15m；3m-4m；3m-5m；3m-6m；3m-7m；3m-8m；3m-9m；3m-10m；3m-11m；3m-12m；3m-13m；3m-14m；3m-15m；4m-5m；4m-6m；4m-7m；4m-8m；4m-9m；4m-10m；4m-11m；4m-12m；4m-13m；4m-14m；4m-15m；5m-6m；5m-7m；5m-8m；5m-9m；5m-10m；5m-11m；5m-12m；5m-13m；5m-14m；5m-15m；6m-7m；6m-8m；6m-9m；6m-10m；6m-11m；6m-12m；6m-13m；6m-14m；6m-15m；7m-8m；7m-9m；7m-10m；7m-11m；7m-12m；7m-13m；7m-14m；7m-15m；8m-9m；8m-10m；8m-11m；8m-12m；8m-13m；8m-14m；8m-15m；9m-10m；9m-11m；9m-12m；9m-13m；9m-14m；9m-15m；10m-11m；10m-12m；10m-13m；10m-14m；10m-15m；11m-12m；11m-13m；11m-14m；11m-15m；12m-13m；12m-14m；12m-15m；13m-14m；13m-15m；及14m-15m。

siRNA 1m至15m之三向siRNA組合為：1m-2m-3m；1m-2m-4m；1m-2m-5m；1m-2m-6m；1m-2m-7m；1m-2m-8m；1m-2m-9m；1m-2m-10m；1m-2m-11m；1m-2m-12m；1m-2m-13m；1m-2m-14m；1m-2m-15m；1m-3m-4m；1m-3m-5m；1m-3m-6m；1m-3m-7m；1m-3m-8m；1m-3m-9m；1m-3m-10m；1m-3m-11m；1m-3m-12m；1m-3m-13m；1m-3m-14m；1m-3m-15m；1m-4m-5m；1m-4m-6m；1m-4m-7m；1m-4m-8m；1m-4m-9m；1m-4m-10m；1m-4m-11m；1m-4m-12m；1m-4m-13m；1m-4m-14m；1m-4m-15m；1m-5m-6m；1m-5m-7m；1m-5m-8m；1m-5m-9m；1m-5m-10m；1m-5m-11m；1m-5m-12m；1m-5m-13m；1m-5m-14m；1m-5m-15m；1m-6m-7m；1m-6m-8m；1m-6m-9m；1m-6m-10m；1m-6m-11m；1m-6m-12m；1m-6m-13m；1m-6m-14m；1m-6m-15m；1m-7m-8m；1m-7m-9m；1m-7m-10m；1m-7m-11m；1m-7m-12m；1m-7m-13m；1m-7m-14m；1m-7m-15m；1m-8m-9m；1m-8m-10m；1m-8m-11m；1m-8m-12m；1m-8m-13m；1m-8m-14m；1m-8m-15m；1m-9m-10m；1m-9m-11m；1m-9m-12m；1m-9m-13m；1m-9m-14m；1m-9m-15m；1m-10m-11m；1m-10m-12m；1m-10m-13m；1m-10m-14m；1m-10m-15m；1m-11m-12m；1m-11m-13m；1m-11m-14m；1m-11m-15m；1m-12m-13m；1m-12m-14m；1m-12m-15m；1m-13m-14m；1m-13m-15m；1m-14m-15m；2m-3m-4m；2m-3m-5m；2m-3m-6m；2m-3m-7m；2m-3m-8m；2m-3m-9m；2m-3m-10m；2m-3m-11m；2m-3m-12m；2m-3m-13m；2m-3m-14m；2m-3m-15m；2m-4m-5m；2m-4m-6m；2m-4m-7m；2m-4m-8m；2m-4m-9m；2m-4m-10m；2m-4m-11m；2m-4m-12m；2m-4m-13m；2m-4m-14m；2m-4m-15m；2m-5m-6m；2m-5m-7m；2m-5m-8m；2m-5m-9m；2m-5m-10m；2m-5m-11m；2m-5m-12m；2m-5m-13m；2m-5m-14m；2m-5m-15m；2m-6m-7m；2m-6m-8m；2m-6m-9m；2m-6m-10m；2m-6m-11m；2m-6m-12m；2m-6m-13m；2m-6m-14m；2m-6m-15m；2m-7m-8m；2m-7m-9m；2m-7m-10m；2m-7m-11m；2m-7m-12m；2m-7m-13m；2m-7m-14m；2m-7m-15m；2m-8m-9m；2m-8m-10m；2m-8m-11m；2m-8m-12m；2m-8m-13m；2m-8m-14m；2m-8m-15m；2m-9m-10m；2m-9m-11m；2m-9m-12m；2m-9m-13m；2m-9m-14m；2m-9m-15m；2m-10m-11m；2m-10m-12m；2m-10m-13m；2m-10m-14m；2m-10m-15m；2m-11m-12m；2m-11m-13m；2m-11m-14m；2m-11m-15m；2m-12m-13m；2m-12m-14m；2m-12m-15m；2m-13m-14m；2m-13m-15m；2m-14m-15m；3m-4m-5m；3m-4m-6m；3m-4m-7m；3m-4m-8m；3m-4m-9m；3m-4m-10m；3m-4m-11m；3m-4m-12m；3m-4m-13m；3m-4m-14m；3m-4m-15m；3m-5m-6m；3m-5m-7m；3m-5m-8m；3m-5m-9m；3m-5m-10m；3m-5m-11m；3m-5m-12m；3m-5m-13m；3m-5m-14m；3m-5m-15m；3m-6m-7m；3m-6m-8m；3m-6m-9m；3m-6m-10m；3m-6m-11m；3m-6m-12m；3m-6m-13m；3m-6m-14m；3m-6m-15m；3m-7m-8m；3m-7m-9m；3m-7m-10m；3m-7m-11m；3m-7m-12m；3m-7m-13m；3m-7m-14m；3m-7m-15m；3m-8m-9m；3m-8m-10m；3m-8m-11m；3m-8m-12m；3m-8m-13m；3m-8m-14m；3m-8m-15m；3m-9m-10m；3m-9m-11m；3m-9m-12m；3m-9m-13m；3m-9m-14m；3m-9m-15m；3m-10m-11m；3m-10m-12m；3m-10m-13m；3m-10m-14m；3m-10m-15m；3m-11m-12m；3m-11m-13m；3m-11m-14m；3m-11m-15m；3m-12m-13m；3m-12m-14m；3m-12m-15m；3m-13m-14m；3m-13m-15m；3m-14m-15m；4m-5m-6m；4m-5m-7m；4m-5m-8m；4m-5m-9m；4m-5m-10m；4m-5m-11m；4m-5m-12m；4m-5m-13m；4m-5m-14m；4m-5m-15m；4m-6m-7m；4m-6m-8m；4m-6m-9m；4m-6m-10m；4m-6m-11m；4m-6m-12m；4m-6m-13m；4m-6m-14m；4m-6m-15m；4m-7m-8m；4m-7m-9m；4m-7m-10m；4m-7m-11m；4m-7m-12m；4m-7m-13m；4m-7m-14m；4m-7m-15m；4m-8m-9m；4m-8m-10m；4m-8m-11m；4m-8m-12m；4m-8m-13m；4m-8m-14m；4m-8m-15m；4m-9m-10m；4m-9m-11m；4m-9m-12m；4m-9m-13m；4m-9m-14m；4m-9m-15m；4m-10m-11m；4m-10m-12m；4m-10m-13m；4m-10m-14m；4m-10m-15m；4m-11m-12m；4m-11m-13m；4m-11m-14m；4m-11m-15m；4m-12m-13m；4m-12m-14m；4m-12m-15m；4m-13m-14m；4m-13m-15m；4m-14m-15m；5m-6m-7m；5m-6m-8m；5m-6m-9m；5m-6m-10m；5m-6m-11m；5m-6m-12m；5m-6m-13m；5m-6m-14m；5m-6m-15m；5m-7m-8m；5m-7m-9m；5m-7m-10m；5m-7m-11m；5m-7m-12m；5m-7m-13m；5m-7m-14m；5m-7m-15m；5m-8m-9m；5m-8m-10m；5m-8m-11m；5m-8m-12m；5m-8m-13m；5m-8m-14m；5m-8m-15m；5m-9m-10m；5m-9m-11m；5m-9m-12m；5m-9m-13m；5m-9m-14m；5m-9m-15m；5m-10m-11m；5m-10m-12m；5m-10m-13m；5m-10m-14m；5m-10m-15m；5m-11m-12m；5m-11m-13m；5m-11m-14m；5m-11m-15m；5m-12m-13m；5m-12m-14m；5m-12m-15m；5m-13m-14m；5m-13m-15m；5m-14m-15m；6m-7m-8m；6m-7m-9m；6m-7m-10m；6m-7m-11m；6m-7m-12m；6m-7m-13m；6m-7m-14m；6m-7m-15m；6m-8m-9m；6m-8m-10m；6m-8m-11m；6m-8m-12m；6m-8m-13m；6m-8m-14m；6m-8m-15m；6m-9m-10m；6m-9m-11m；6m-9m-12m；6m-9m-13m；6m-9m-14m；6m-9m-15m；6m-10m-11m；6m-10m-12m；6m-10m-13m；6m-10m-14m；6m-10m-15m；6m-11m-12m；6m-11m-13m；6m-11m-14m；6m-11m-15m；6m-12m-13m；6m-12m-14m；6m-12m-15m；6m-13m-14m；6m-13m-15m；6m-14m-15m；7m-8m-9m；7m-8m-10m；7m-8m-11m；7m-8m-12m；7m-8m-13m；7m-8m-14m；7m-8m-15m；7m-9m-10m；7m-9m-11m；7m-9m-12m；7m-9m-13m；7m-9m-14m；7m-9m-15m；7m-10m-11m；7m-10m-12m；7m-10m-13m；7m-10m-14m；7m-10m-15m；7m-11m-12m；7m-11m-13m；7m-11m-14m；7m-11m-15m；7m-12m-13m；7m-12m-14m；7m-12m-15m；7m-13m-14m；7m-13m-15m；7m-14m-15m；8m-9m-10m；8m-9m-11m；8m-9m-12m；8m-9m-13m；8m-9m-14m；8m-9m-15m；8m-10m-11m；8m-10m-12m；8m-10m-13m；8m-10m-14m；8m-10m-15m；8m-11m-12m；8m-11m-13m；8m-11m-14m；8m-11m-15m；8m-12m-13m；8m-12m-14m；8m-12m-15m；8m-13m-14m；8m-13m-15m；8m-14m-15m；9m-10m-11m；9m-10m-12m；9m-10m-13m；9m-10m-14m；9m-10m-15m；9m-11m-12m；9m-11m-13m；9m-11m-14m；9m-11m-15m；9m-12m-13m；9m-12m-14m；9m-12m-15m；9m-13m-14m；9m-13m-15m；9m-14m-15m；10m-11m-12m；10m-11m-13m；10m-11m-14m；10m-11m-15m；10m-12m-13m；10m-12m-14m；10m-12m-15m；10m-13m-14m；10m-13m-15m；10m-14m-15m；11m-12m-13m；11m-12m-14m；11m-12m-15m；11m-13m-14m；11m-13m-15m；11m-14m-15m；12m-13m-14m；12m-13m-15m；12m-14m-15m；及13m-14m-15m。

siRNA雙向及三向組合適用於例如治療人類HBV及/或HDV感染，並適用於改善至少一種與HBV感染及/或HDV感染相關之症狀。

在某些實施例中，siRNA藉由核酸脂質顆粒投與。

在某些實施例中，關於包括使用封裝在脂質顆粒內之siRNA混合物的方法，將不同siRNA分子共封裝在同一脂質顆粒中。

在某些實施例中，關於包括使用封裝在脂質顆粒內之siRNA混合物的方法，存在於混合物中之各類型siRNA種類經封裝在其自身顆粒中。

在某些實施例中，關於包括使用封裝在脂質顆粒內之siRNA混合物的方法，一些siRNA物質經封裝在同一顆粒中，而其他siRNA物質經封裝在不同顆粒中。兩或更多種藥劑之配製及投與

應該理解，該等藥劑可一起配製成單一製劑，或者其可單獨配製，且因此可同時或依次分開投與。在一個實施例中，當藥劑依次投與(例如在不同時間)時，可投與藥劑以使其生物學效應重疊(即各藥劑在單一給定時間產生生物學效應)。

視所選藥劑而定，可配製藥劑且使用任何可接受之投與途徑投與。例如，合適途徑包括但不限於口服、舌下、頰下、局部、透皮、非經腸、皮下、腹膜內、肺內、及鼻內、及需要時局部治療、病灶內投與。在一個實施例中，本文鑑定之小分子藥物可口服投與。在另一個實施例中，寡聚核苷酸可藉由注射(例如，進入血管，如靜脈)或皮下投與。在一些實施例中，有需要之受試者經口服投與一或多種藥劑(例如以丸劑形式)，以及亦藉由注射或皮下投與一或多種寡聚核苷酸。

通常，靶向B型肝炎基因組之寡聚核苷酸例如以脂質奈米粒子調配物靜脈內投與，然而，本發明不限於包含寡聚核苷酸之靜脈內調配物或其中靜脈內投與寡聚核苷酸之治療方法。

可藉由在環境溫度下在適當pH下且在所需純度下與生理上可接受之載劑(亦即在所用劑量及濃度下對受體無毒之載劑)混合而單獨配製試劑。調配物之pH主要視特定用途及化合物濃度而定，但可典型地在約3至約8範圍內之任一處。試劑通常將作為固體組成物儲存，儘管凍乾調配物或水溶液為可接受的。

包含藥劑之組成物可以與良好醫療實踐一致之方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定人類、個別患者之臨床病狀、病症起因、投與部位、投藥方法、投藥時程、及醫學從業者已知之其他因素。

該等藥劑可以任何便利的可投與形式投與，例如片劑、散劑、膠囊、溶液、分散液、懸浮液、糖漿、噴霧劑、栓劑、凝膠、乳液、貼片等。此等組成物可含有藥物製劑中便利之組分，例如稀釋劑、載劑、pH調節劑、甜味劑、填充劑、及其他活性劑。若需要非經腸投藥，則該等組成物應為無菌的且呈適用於注射或輸注之溶液或懸浮液形式。

適合載劑及賦形劑係熟習此項技藝者已知的且詳細描述於Ansel, Howard C.等人, Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004；Gennaro, Alfonso R等人. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000；及Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005。調配物亦可包括一或多種緩衝劑、穩定劑、界面活性劑、濕潤劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、抗氧化劑、乳濁劑(opaquing agent)、助流劑、加工助劑、著色劑、甜味劑、芳香劑、調味劑、稀釋劑、及其他已知添加劑以提供藥物之精美外觀或有助於製造醫藥產品(亦即藥劑)。

藥劑通常至少以一定水平給藥以達到所需生物學效應。因此，有效給藥方案將給予至少達到期望生物學效應之最小量或生物學有效劑量，然而，劑量不應高至超過具有不可接受之副作用的生物效應之益處。因此，有效給藥方案將給予不超過最大耐受劑量(「MTD」)。最大耐受劑量經定義為產生可接受之劑量限制性毒性發生率(「DLT」)之最高劑量。造成不可接受之DLT率之劑量經認為是不耐受的。通常，特定時程之MTD在第1階段臨床試驗中建立。該等試驗通常在患者中藉由以下項進行：以囓齒動物中之1/10嚴重毒性劑量(「STD10」)之安全起始劑量(以mg/m² 為基礎)開始且在三組中累積患者，根據經改進之斐波納契序列(modified Fibonacci sequence)遞增劑量，其中更高的遞增步驟曾經具有逐漸減小之相對增量(例如，其後劑量增加100%、65%、50%、40%、及30%至35%)。劑量遞增在三名患者組中繼續，直至達到不耐受劑量。產生可接受之DLT率之下一個較低劑量水平視為MTD。

經投與藥劑之量將視所用特定藥劑、正在治療之HBV病毒株、患者之年齡、體重及病況、及臨床醫生之判斷而定，但通常將在約0.2至2.0克/天之間。套組

一個實施例提供一種套組。該套組可包括包含該組合之容器。合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包裝等。容器可由多種材料例如玻璃或塑料形成。容器可保存有效於治療病況之組合且可具有無菌入口(sterile access port)(例如，容器可為具有可經皮下注射用注射針刺破之塞子之靜脈輸液袋或小瓶)。

套組可進一步包含在容器上或與容器聯合之標籤或藥品說明書。術語「藥品說明書」用於指慣常包括於治療劑之商業封裝中且含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症之資訊及/或有關該等治療劑之使用的警示的說明書。在一個實施例中，標籤或藥品說明書指示治療劑可用於治療病毒感染，例如B型肝炎。

在某些實施例中，套組適用於傳遞固體口服形式之治療劑，諸如片劑或膠囊。此套組較佳包括多個單位劑量。此等套組可包括具有按其預期用途順序定向之劑量的卡。該種套組之實例為「泡殼包裝」。泡殼包裝為封裝工業中所熟知且廣泛用於封裝醫藥單位劑型。若需要，可提供記憶輔助裝置，例如呈數字、字母、或其他標記之形式或帶有日曆插入物，指定可投與劑量之治療時程中之日期。

根據另一個實施例，套組可包含(a)其中含有一種藥劑之第一容器；及(b)其中含有第二種藥劑之第二容器。或者或另外，套組可進一步包含第三容器，該容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

該套組可進一步包含用於投與治療劑之用法說明書。例如，套組可進一步包含用於將治療劑同時、依次或單獨投與於有需要之患者之用法說明書。

在某些其他實施例中，套組可包含用於容納單獨組成物之容器，例如分開之瓶或分開之箔片包裝，然而，單獨組成物亦可包含在單個未分開之容器內。在某些實施例中，套組包含用於投與單獨治療劑之用法說明書。當單獨治療劑較佳以不同劑型(例如口服及非經腸)投與、以不同劑量間隔投與時，或當處方醫師期望滴定組合之單獨治療劑時，套組形式為特別有利的。

治療劑組合治療B型肝炎之能力可使用此項技藝眾所周知之藥理學模型來判定。

現將藉由以下非限制性實例說明本發明。實例

以下化合物在實例中受到引用。化合物3-4 可用已知程序製備。國際專利申請公開案號WO2014/106019及WO2013/006394亦描述可用於製備化合物3 -4 之合成方法。實例 1

使用B型肝炎病毒(HBV)之小鼠模型評估免疫刺激劑及HBV靶向siRNA二者作為獨立治療及彼此組合之抗-HBV效果。

以下脂質奈米顆粒(LNP)調配物用於遞送HBV siRNA。表中展示之值為摩爾百分數。縮寫DSPC意指二硬脂醯磷脂醯膽鹼。

陽離子脂質具有以下結構(13 )：。

使用靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物。三種siRNA之序列展示如下。

在第-27天，藉由流體動力學注射(HDI；快速1.3 mL注射到尾靜脈)將10微克質粒pAAV/HBV1.2 (獲自Pei-Jer Chen博士，最初描述於Huang, LR等人,Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103(47): 17862–17867))投與至C3H/HeN小鼠。該質粒攜帶HBV基因組之1.2倍超長拷貝且表現HBV表面抗原(HBsAg)及其他HBV產物。使用酶免疫測定法監測小鼠血清HBsAg表現。基於血清HBsAg水平將動物(隨機化)分為組，使得a)證實所有動物均表現HBsAg，且b)在開始治療之前HBsAg組平均值彼此相似。

如下用免疫刺激劑處理動物：在第0天，藉由HDI投與20微克高分子量聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly(I:C))。如下用脂質奈米顆粒(LNP)封裝之HBV靶向siRNA處理動物：在第0天、第7天、及第14天每一天，靜脈內投與等同於1 mg/kg siRNA之量的測試物品。由於HBsAg表現水平在該小鼠HBV模型中不完全穩定，因此包括陰性對照組；在個體動物中血清HBsAg之絕對濃度通常隨時間推移而下降。為證明治療特異性效果，將治療組與陰性對照動物進行比較。

藉由在第0天(治療前)、第3天、第7天、第14天、及第21天收集少量血液且分析血清HBsAg含量來判定治療效果。若可能，將樣品適當稀釋以生成定量分析範圍內之值。低於定量下限(LLOQ)之個體值經設定為LLOQ之一半。表1展示治療組平均值(n=4或5；±平均值之標準誤差)血清HBsAg濃度，其表示為第0天個體動物治療前基線值之百分比。

該等資料表明響應於HBV siRNA及poly(I:C)之組合的HBsAg減少程度以及減少效應之持續時間。兩種治療之組合較之單獨治療產生更大效應。表 1. 三種 HBV siRNA 及免疫刺激劑 Poly(I:C) 對 HBV 感染小鼠模型中之血清 HBsAg 的單一及組合治療效果 實例 2

B型肝炎病毒(HBV)小鼠模型用於評估HBV衣殼化小分子抑制劑(化合物3 )及HBV靶向siRNA二者作為獨立治療及彼此組合之抗-HBV效果。

陽離子脂質具有以下結構(7 )：。

在第-7天，藉由流體動力學注射(HDI；快速1.6 mL注射到尾靜脈)將10微克質粒pHBV1.3 (按照Guidotti, L.等人,Journal of Virology, 1995, 69(10): 6158–6169)投與至NOD.CB17-Prkdc ^scid /J小鼠。該質粒攜帶HBV基因組之1.3倍超長拷貝，當該基因組表現時，生成包括HBV DNA及其他HBV產物之B型肝炎病毒顆粒。作為各種治療之抗-HBV效應之讀數，使用定量PCR測定法(來自Tanaka, Y.等人, Journal of Medical Virology, 2004, 72: 223-229之引物/探針序列)自總提取DNA量測小鼠血清HBV DNA濃度。

如下用化合物3 處理動物：在第0天開始，在第0天與第7天之間，以每天兩次的頻率口服投與50 mg/kg或100 mg/kg劑量之化合物3 ，總計十四個劑量。將化合物3 溶解於共溶劑調配物中以用於投與。向陰性對照動物投與單獨共溶劑調配物或鹽水。如下用脂質奈米顆粒(LNP)封裝之HBV靶向siRNA處理動物：在第0天，靜脈內投與等同於0.1 mg/kg siRNA之量的測試物品。HBV表現水平在此HBV小鼠模型中並不完全穩定；為證明治療特異性效果，在此將治療組與陰性對照動物進行比較。

藉由在第0天(治療前)、第4天及第7天收集血液且分析血清HBV DNA含量來判定該等治療之效果。表2展示治療組平均值(n=7或8；±平均值之標準誤差)血清HBV DNA濃度，其表示為第0天個體動物治療前基線值之百分比。

該等資料表明響應於化合物3 及HBV siRNA之組合的血清HBV DNA減少程度以及減少效應之持續時間。兩種治療之組合較之單獨治療產生更大效應。表 2. 化合物 3 及三種 HBV siRNA 對 HBV 感染小鼠模型中之血清 HBV DNA 的單一及組合治療效果 實例 3

B型肝炎病毒(HBV)小鼠模型用於評估HBV衣殼化小分子抑制劑(化合物3) 作為獨立治療及與經批准化合物恩替卡韋(ETV)組合之抗-HBV效果。

如下用化合物3 處理動物：在第0天開始，在第0天與第7天之間，以每天兩次的頻率口服投與100 mg/kg劑量之化合物3 ，總計十四個劑量。將化合物3 溶解於共溶劑調配物中以用於投與。向陰性對照動物投與單獨共溶劑調配物或鹽水。如下用ETV處理動物：在第0天開始，在第0天與第6天之間，以每天一次的頻率口服投與100 ng/kg或300 ng/kg劑量之ETV，總計七個劑量。將ETV溶解於DMSO中至2 mg/mL，且然後用鹽水稀釋以供投與。HBV表現水平在此HBV小鼠模型中並不完全穩定；為證明治療特異性效果，在此將治療組與陰性對照動物進行比較。

藉由在第0天(治療前)、第4天及第7天收集血液且分析血清HBV DNA含量來判定該等治療之效果。將Ct值低於定量下限(LLOQ)之樣品設定為計算組平均值之一半LLOQ。表3展示治療組平均值(n=5-8；±平均值之標準誤差)血清HBV DNA濃度，其表示為第0天個體動物治療前基線值之百分比。

該等資料表明響應於化合物3 及ETV之組合的血清HBV DNA減少程度以及減少效應之持續時間。兩種治療之組合較之單獨治療產生更大效應。表 3. 化合物 3 及 ETV 對 HBV 感染小鼠模型中之血清 HBV DNA 的單一及組合治療效果 實例 4-6 活體外 組合研究目標：

使用HBV細胞培養模型系統在活體外判定HBV衣殼化小分子抑制劑(化合物3 )、HBV聚合酶之逆轉錄酶抑制劑抑制劑恩替卡韋(ETV)、及旨在促進所有病毒mRNA轉錄物及病毒抗原之有效敲低的siRNASIRNA-NP 之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。SIRNA-NP 之組成：

SIRNA-NP 為靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物的脂質奈米顆粒調配物。以下脂質奈米顆粒(LNP)調配物在本文報告之實驗中用於遞送HBV siRNA。表中展示之值為摩爾百分數。縮寫DSPC意指二硬脂醯磷脂醯膽鹼。

陽離子脂質具有以下結構(7 )：。

三種siRNA之序列展示如下。 活體外 組合實驗方案：

活體外 組合研究使用Prichard及Shipman之方法(Prichard MN及Shipman C Jr.,Antiviral Research , 1990,14 (4-5), 181-205；及Prichard MN等人,MacSynergy II) 進行。開發AML12-HBV10細胞株，如Campagna等人 (Campagna等人,J. Virology, 2013, 87 (12), 6931-6942)所述。其為用HBV基因組穩定轉染之小鼠肝細胞系，且可表現HBV前基因組RNA，並以四環素調節方式支持HBV rcDNA(鬆散環狀DNA)合成。將AML12-HBV10細胞鋪板在補充有10%胎牛血清+ 1%青黴素-鏈黴素而無四環素之DMEM/F12培養基之96孔經組織培養處理之微量滴定板中且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，將細胞轉換到新鮮培養基並用其對應EC₅₀ 值附近之濃度範圍的抑制劑A及抑制劑B處理，且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育48 h持續時間。將抑制劑以100% DMSO (ETV及化合物3 )或生長培養基(SIRNA-NP )稀釋且測定中之最終DMSO濃度≤0.5%。將這兩種抑制劑單獨以及以棋盤方式組合進行測試，使得各濃度之抑制劑A與各濃度之抑制劑B組合以判定其對抑制rcDNA產生之組合效果。在48小時溫育後，使用bDNA測定(Affymetrix)使用HBV特異性定製探針組及製造商說明書量測存在於經抑制劑處理孔中之rcDNA水平。將自各孔產生之RLU資料計算為未經處理對照孔之抑制%，且使用MacSynergy II程式分析，以使用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 µM² % (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 µM² % (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為重要的；超過100 µM² % (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為顯著的；體積接近1000 µM² % (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。同時，使用複製板評估抑制劑組合對細胞活力之效果，該等複製板用於使用cell-titer glo試劑(Promega)根據製造商說明書判定ATP含量作為細胞活力之量度。實例 4 ：化合物 3 及恩替卡韋之活體外 組合：

測試化合物3 (在2倍稀釋系列及9點滴定中濃度範圍為2.5 μM至0.01 μM)與恩替卡韋(在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為0.075 μM至0.001 μM)之組合。在表1中展示用單獨或組合之化合物3 或恩替卡韋治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表4中展示化合物3 及恩替卡韋之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用(表1)預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的(表4)。實例 5 ：化合物 3 及 SIRNA-NP 之活體外 組合：

測試化合物3 (在2倍稀釋系列及9點滴定中濃度範圍為2.5 μM至0.01 μM)與SIRNA-NP (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為0.5 μg/mL至0.006 μg/mL)之組合。在表2中展示用單獨或組合之化合物3 或SIRNA-NP 治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表4中展示化合物3 及SIRNA-NP 之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用(表2)預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的(表4)。實例 6 ：恩替卡韋及 SIRNA-NP 之活體外 組合：

測試恩替卡韋(在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為0.075 μM至0.001 μM)與SIRNA-NP (在2倍稀釋系列及9點滴定中濃度範圍為0.5 μg/mL至0.002 μg/mL)之組合。在表3中展示用單獨或組合之恩替卡韋或SIRNA-NP 治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表4中展示恩替卡韋及SIRNA-NP 之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用(表3)預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的(表4)。表 1 ：恩替卡韋 (ETV) 及化合物 3 之活體外 組合 表 2 ：化合物 3 及 SIRNA-NP 之活體外 組合 表 3 ：恩替卡韋及 SIRNA-NP 之活體外 組合 表 4 ：在 AML12-HBV10 細胞培養系統中使用 bDNA 測定法利用 rcDNA 定量進行活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 7-9 活體外 組合研究目標：

判定利用兩種化合物組合之組合治療對HBV DNA複製、cccDNA形成、及cccDNA表現及穩定性之影響。已研究兩種HBV衣殼化小分子抑制劑化合物3 及4 ；兩種經FDA批准之HBV聚合酶逆轉錄酶抑制劑恩替卡韋(ETV)及拉米夫定(3TC)；及脂質奈米顆粒(LNP)配製之病毒mRNA及病毒抗原表現之siRNA抑制劑SIRNA-NP 。該等研究旨在使用HBV細胞培養模型系統在活體外判定組合是累加、協同或拮抗。LNP 調配物：

陽離子脂質具有以下結構(7 )： SiRNA

三種siRNA之序列展示如下。 活體外 組合實驗方案：

使用Cai等人 (Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2012. Vol 56(8):4277-88)描述之測定係統的修改進行活體外 組合研究。先前開發之HepDE19細胞培養系統(Guo等人. J. Virology (2007) 81(22): 12472-12484)以四環素(Tet)調節性方式支持HBV DNA複製及cccDNA形成，且產生可偵測報導分子，其依賴於cccDNA之產生及維持。

在HepDE19細胞培養系統中，報導分子為前核心RNA及其同源蛋白產物經分泌之HBV「e抗原」(HBeAg)。在HepDE19細胞中，前核心RNA及HBeAg僅由cccDNA環狀模板產生，因為HBeAg之ORF及其5'RNA前導序列在經整合病毒基因組之相對末端之間分開，且僅與cccDNA之形成鄰接。儘管基於HepDE19細胞培養系統之測定法有效於判定活性，但高通量篩選之結果可能較複雜，因為HBeAg ELISA與在HepDE19細胞中大部分以cccDNA非依賴性方式表現之核心抗原(HBcAg)病毒HBeAg同源物交叉反應。為克服此併發症，已開發一種替代性細胞培養系統(在本文中稱為DESHAe82細胞培養系統且描述於PCT/EP/2015/06838)，其在DESHAe82細胞轉基因中之HBeAg N端編碼序列中包括框內HA表位標籤，而不會破壞對HBV複製、cccDNA轉錄、及HBeAg分泌而言重要的任何順式元件。

已開發用HA抗體作為捕獲抗體且用HBeAg作為偵測抗體來偵測經HA標記之HBeAg的化學發光ELISA測定法(CLIA)，其消除來自HBcAg之污染信號。與HA-HBeAg CLIA測定法結合之DESHAe82細胞係表現出高水平cccDNA合成及HA-HBeAg產生及分泌、以及具有低噪音之高特異性讀出信號。此外，開發一種用於特異性偵測DE19或DESHAe82細胞中之前核心RNA之定量逆轉錄及聚合酶鍊式反應(qRT-PCR)的方案，且其亦用於偵測cccDNA依賴性mRNA(前核心RNA)，其經翻譯成產生HBeAg或HA-HBeAg。

為測試化合物組合，將DESHAe82或DE19細胞(如實例中所示)鋪板在補充有10%胎牛血清+ 1%青黴素-鏈黴素且具有Tet之DMEM/F12培養基之96孔經組織培養處理之微量滴定板中且在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，將細胞轉換到不具有Tet之新鮮培養基並用其對應EC₅₀ 值附近之濃度範圍的抑制劑A及抑制劑B處理，且在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育48 h持續時間。將抑制劑以100% DMSO (ETV、3TC、化合物3 及化合物4 )或生長培養基(SIRNA-NP )稀釋且測定中之最終DMSO濃度為0.5%。將這兩種抑制劑單獨以及以棋盤方式組合進行測試，使得各測試濃度之抑制劑A與各測試濃度之抑制劑B組合以判定其對抑制cccDNA形成及表現之組合效果。將未經處理之陰性對照樣品(0.5%DMSO或僅培養基)包括在各板上之多個孔中。在溫育9天後，去除培養基且對細胞進行RNA提取以量測cccDNA依賴性前核心mRNA水平。藉由遵循製造商說明書(真空歧管加工、緩衝液RA4之額外多兩次洗滌)使用96孔格式之總RNA分離套組(MACHEREY-NAGEL，目錄740466.4)提取總細胞RNA。將RNA樣品以無RNA酶水洗脫。使用Roche LightCycler480及RNA Master Hydrolysis探針(目錄號04991885001，Roche)使用用於特異性偵測cccDNA依賴性前核心RNA之引物及條件進行定量實時RT-PCR。亦藉由標準方法偵測GAPDH mRNA水平且將其用於標準化前核心RNA水平。將前核心RNA水平之抑制及因此cccDNA表現計算為為未經處理對照孔之抑制%，且用Prichard-Shipman組合模型使用MacSynergyII程式分析(Prichard MN, Shipman C Jr. Antiviral Research, 1990. 第14卷(4-5):181-205；Prichard MN, Aseltine KR及Shipman, C. MacSynergy II. University of Michigan 1992)，以用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則來判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為重要的；超過100 (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為顯著的；體積接近1000 (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。

同時，以兩種方式評估抑制劑組合對細胞活力及增殖之效果：1)對測試孔進行直接顯微鏡檢查，及2)使用以10-20%細胞密度接種之複製板，在4天后，使用Cell-Titer Glo試劑(Promega)按照製造商說明書測定該複製板之細胞內ATP含量。將細胞活力及密度計算為未經處理之陰性對照孔百分比。實例 7 ：化合物 3 及恩替卡韋之活體外 組合：

測試化合物3 (在半log稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為10 μM至0.0316 μM)與恩替卡韋(在半log、3.16倍稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為0.010 μM至0.00003 μM)之組合。表7a中展示該組合之抗病毒活性；表7b中展示協同作用及拮抗作用體積。表9d展示根據Prichard及Shipman量測協同作用及拮抗作用體積之2次重複之組合結果以及解釋。在該測定係統中，該組合導致對前核心RNA表現之協同抑制。藉由顯微鏡檢查未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 7a. 化合物 3 及恩替卡韋組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之平均抑制百分比 ( 每資料點 n=2 個樣品 ) 表 7b. MacSynergy 體積計算 化合物 3 及恩替卡韋組合： 在 99.99% 置信水平下「大於累加」抑制水平 實例 8 ：化合物 4 及恩替卡韋之活體外 組合：

測試化合物4 (在半log稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為10 μM至0.0316 μM)與恩替卡韋(在半log、3.16倍稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為0.010 μM至0.00003 μM)之組合。表8a中展示該組合之抗病毒活性；表8b中展示協同作用及拮抗作用體積。表9d展示根據Prichard及Shipman量測協同作用及拮抗作用體積之2次重複之組合結果以及解釋。在該測定係統中，該組合導致對前核心RNA表現之協同抑制。藉由顯微鏡檢查未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 8a. 化合物 4 及恩替卡韋組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之平均抑制百分比 ( 每資料點 n=2 個樣品 ) 表 8b.MacSynergy 體積計算化合物 4 及恩替卡韋組合： 在 99.99% 置信區間下「大於累加」抑制水平 實例 9 ：化合物 3 及 SIRNA-NP 之活體外 組合：

測試化合物3 (在半log稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為10 μM至0.0316 μM)與SIRNA-NP (在半log、3.16倍稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為0.10 μM至0.000 μg/ml)之組合。表9a中展示該組合之抗病毒活性；表9b中展示協同作用及拮抗作用體積。表9d展示根據Prichard及Shipman量測協同作用及拮抗作用體積之4次重複之組合結果以及解釋。在該測定係統中，該組合導致對前核心RNA表現之協同抑制。藉由顯微鏡檢查或Cell-Titer Glo測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制(表9c)。表 9a. 化合物 3 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之平均抑制百分比 ( 每資料點 n=4 個樣品 ) 表 9b. MacSynergy 體積計算化合物 3 及 SIRNA-NP 組合： 在 99.99% 置信水平下「大於累加」抑制水平 表 9c. 化合物 3 及 SIRNA-NP 組合之細胞毒性：相對於對照之細胞活力平均百分比 表 9d. 在 DESHAe82 細胞培養系統中藉由 qRT-PCR 利用 cccDNA 衍生化前核心 RNA 定量進行活體外 組合研究之結果匯總 實例 10

該實例之目標為比較各組合治療之抗-HBV活性以及如下護理治療之經建立HBV標準，該等組合治療包括HBV衣殼化小分子抑制劑化合物3及封裝HBV靶向siRNA之脂質奈米顆粒調配物SIRNA-NP：抑制HBV DNA聚合酶活性之核苷或核苷酸類似物恩替卡韋(ETV) (de Man RA等人,Hepatology ,34(3) , 578-82 (2001))及經由1型干擾素受體活化限制病毒傳播之聚乙二醇化干擾素α-2a(pegINF α-2a) (Marcellin等人 ,N Engl J Med. ,51(12) , 1206-17 (2004))。將該等組合之效力與單獨使用化合物3、SIRNA-NP及ETV之單一療法治療以及使用化合物3之媒介物的陰性對照治療條件進行比較。

該工作在慢性B型肝炎病毒(HBV)感染之公認人源化肝臟嵌合小鼠模型中進行(Tsuge等人 ,Hepatology ,42(5) , 1046-54 (2005))。在第0天開始之治療階段之前，在動物中建立持續的HBV感染水平。測試物品劑量如下：化合物3，口服100 mg/kg，每日兩次；SIRNA-NP，靜脈內3 mg/kg，每2週一次；ETV，口服1.2 µg/kg，每日一次；pegIFN α-2a，皮下30 µg/kg，每週兩次。

基於以下各項評估抗-HBV效應：使用來自Bio-Rad Laboratories之GS HBsAg EIA 3.0酶聯免疫吸附測定套組根據製造商說明書之血清HBsAg水平；及使用定量PCR測定法自總提取DNA量測之血清HBV DNA水平(來自Tanaka等人 ,Journal of Medical Virology ,72 , 223-229 (2004)之引物/探針序列)。

雙重及三重組合治療產生更大抗病毒活性，例如血清HBV DNA水平相對於所研究之單一療法治療更強烈地減少。特別地，在第28天，血清HBV DNA水平用化合物3及SIRNA-LNP或化合物3及pegIFNα-2a之組合治療後減少超過2.5 log10，且在用化合物3及ETV之組合治療後減少超過2 log10，相比之下用ETV或化合物3或SIRNA-LNP之單一療法治療觀察到1.0至1.5 log10減少。利用化合物3及SIRNA-NP及ETV或化合物3及SIRNA-NP及pegINFα-2a之三重組合治療至第28天相對於雙重組合治療證實對HBV DNA水平之稍微提高的作用。維持SIRNA-NP抑制B型肝炎蛋白(抗原)產生之能力，如血清HBsAg水平所示(當與其他抗病毒治療共同投與時)。表10a：組合治療及單一療法治療對血清HBV DNA水平之影響表10b：組合治療及單一療法治療對血清HBsAg水平之影響實例 11 活體外 組合研究目標：

使用HBV細胞培養模型系統在活體外 判定HBV衣殼化小分子抑制劑(化合物3)及HBV聚合酶核苷類似物抑制劑替諾福韋(TDF)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的 活體外 組合實驗方案：

活體外 組合研究使用Prichard及Shipman之方法(Prichard MN及Shipman C Jr.,Antiviral Research , 1990,14 (4-5), 181-205；及Prichard MN等人,MacSynergy II) 進行。HepDE19細胞培養系統為HepG2(人類肝癌)衍生化細胞系，其以四環素(Tet)調節性方式支持HBV DNA複製及cccDNA形成且產生HBV rcDNA及依賴於cccDNA產生及維持之可偵測報導分子(Guo等人 2007. J. Virol 81:12472-12484)。將HepDE19 (50,000個細胞/孔)鋪板在補充有10%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素及1 μg/ml四環素之DMEM/F12培養基之96孔經膠原塗覆經組織培養處理之微量滴定板中且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，將細胞轉換到無四環素新鮮培養基中且在37℃及5%CO₂ 下溫育4 h_。然後將細胞轉換到無四環素新鮮培養基並用其對應EC₅₀ 值附近之濃度範圍的抑制劑A及抑制劑B處理，且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育7天持續時間。將抑制劑替諾福韋(TDF)及化合物3以100% DMSO稀釋且測定中之最終DMSO濃度≤0.5%。將這兩種抑制劑單獨以及以棋盤方式組合進行測試，使得各濃度之抑制劑A與各濃度之抑制劑B組合以判定其對抑制rcDNA產生之組合效果。將細胞用化合物組合溫育7天後，使用具有HBV特異性定製探針組及製造商說明書之Quantigene 2.0 bDNA測定套組(Affymetrix, Santa Clara, CA)量測存在於經抑制劑處理孔中之rcDNA水平。使用Victor發光板讀取器(PerkinElmer Model 1420 Multilabel計數器)讀出板，且將自各孔產生之相對發光單位(RLU)資料計算為未經處理對照孔之抑制%，且使用MacSynergy II程式分析，以使用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 µM² % (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 µM² % (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為重要的；超過100 µM² % (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為顯著的；體積接近1000 µM² % (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。使用Microsoft Excel中之XL-Fit模塊分析來自經單一化合物處理之細胞的RLU資料，以使用4-參數曲線擬合算法判定EC₅₀ 值。同時，使用複製板評估化合物對細胞活力之影響，該等複製板以5,000個細胞/孔之密度鋪板且溫育4天，以使用cell-titer glo試劑(CTG；Promega Corporation, Madison, WI)根據製造商說明書測定ATP含量作為細胞活力之量度。化合物3及替諾福韋(TDF)之活體外 組合：

測試化合物3 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為3 μM至0.037 μM)與替諾福韋(在2倍稀釋系列及9點滴定中濃度範圍為1 μM至0.004 μM)之組合。在表11a中展示用單獨或組合之化合物3或TDF治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表11b中展示在該實驗中測定之化合物3及TDF之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之基於各化合物之單獨貢獻的累加相互作用(表11b)預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的(表11a及11b)。表11a.在HepDE19細胞培養模型中使用rcDNA定量利用bDNA測定法之化合物3及TDF組合之抗病毒活性：相對於陰性對照之平均抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 表11b：在HepDE19細胞培養系統中使用bDNA測定法利用rcDNA定量進行活體外 組合研究之結果之匯總：實例 12 活體外 組合研究目標：

為判定組合治療中之兩種化合物在經B型肝炎病毒(HBV)轉染之細胞培養物中產生協同、拮抗或累加作用。化合物化合物5為B型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌之小分子抑制劑，且SIRNA-NP為靶向病毒mRNA及病毒抗原表現之脂質奈米顆粒(LNP)封裝之RNAi抑制劑。在該活體外 研究中使用HBV細胞培養系統來判定組合治療之作用。小分子化學結構： LNP 調配物：

SIRNA-NP為靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物的脂質奈米顆粒調配物。以下脂質奈米顆粒(LNP)產品在本文報告之實驗中用於遞送HBV siRNA。表中展示之值為摩爾百分數。二硬脂醯磷脂醯膽鹼縮寫為DSPC。

陽離子脂質具有以下結構：。siRNA

三種siRNA之序列展示如下。 活體外 組合實驗方案：

活體外 組合研究使用Prichard及Shipman之方法(Prichard MN及Shipman C Jr., Antiviral Research, 1990, 14(4-5), 181-205；及Prichard MN等人,MacSynergy II )進行。HepG2.2.15細胞培養系統為源自人肝母細胞瘤HepG2細胞之細胞系，其已用adw2-亞型HBV基因組穩定轉染，如先前Sells等人. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1987. 第84卷:1005–1009)所解釋。HepG2.2.15細胞分泌Dane樣病毒顆粒，產生HBV DNA，且亦產生病毒蛋白、B型肝炎e抗原(HBeAg)及B型肝炎表面抗原(HBsAg)。

為測試化合物組合，將HepG2.2.15 (30,000個細胞/孔)鋪板在補充有1%青黴素-鏈黴素、20 µg/mL遺傳黴素(G418)、10%牛胎兒血清之RPMI + L-麩胺酸培養基的96孔經組織培養處理之微量滴定板中，且在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，用新鮮培養基補充細胞，隨後加入以0.1 μM至0.000015 μM之濃度範圍溶解於100% DMSO中之化合物5。將SIRNA-NP溶解於100% RPMI培養基中且以2.5 nM至0.025 nM之濃度範圍加入至細胞中。將微量滴定細胞板在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育6天持續時間。連續稀釋度跨越關於各化合物之EC₅₀ 值之濃度範圍，其中該測定之最終DMSO濃度為0.5%。除了以棋盤方式對化合物進行組合測試外，亦單獨測試化合物5及SIRNA-NP二者。

將未經處理之陽性對照樣品(培養基中之0.5% DMSO)包括在各板上之多個孔中。在溫育6天後，自經處理細胞除去培養基以用於HBsAg化學發光免疫測定法(CLIA)(Autobio Diagnostics, 目錄號CL0310-2)中。生成HBsAg標準曲線以驗證HBsAg定量水平處於測定偵測限內。藉由使用Cell-Titer Glo試劑(Promega)根據製造商說明書測定細胞內三磷酸腺苷(ATP)且藉由在整個抑制劑治療持續時間期間對細胞進行顯微鏡分析來評估其餘經抑制劑處理細胞之細胞毒性。將細胞活力計算為未經處理之陽性對照孔百分比。

使用EnVision多模式板閱讀器(PerkinElmer Model 2104)讀取板。使用自各孔產生之相對發光單位(RLU)將HBsAg水平計算為為未經處理陽性對照孔之抑制%，且用Prichard-Shipman組合模型使用MacSynergyII程式分析(Prichard MN, Shipman C Jr. Antiviral Research, 1990. 第14卷(4-5):181-205；Prichard MN, Aseltine KR及Shipman, C. MacSynergy II. University of Michigan 1992)，以用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則來判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為顯著的；超過100 (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為重要的；體積接近1000 (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。使用Microsoft Excel中之XL-Fit模塊分析來自經單一化合物處理之細胞的RLU資料，以使用4-參數曲線擬合算法判定EC₅₀ 值。

測試化合物5 (在半log、3.16倍稀釋系列及8點滴定中濃度範圍為0.1 μM至0.000015 μM)與SIRNA-NP (在半log、3.16倍稀釋系列及6點滴定中濃度範圍為2.5 nM至0.025 nM)之組合。利用由4次技術重複組成之各測定完成三次組合結果。表12e展示根據Prichard及Shipman對協同作用及拮抗作用體積進行之量測。表12a1、12a2、及12a3中展示該組合之抗病毒活性；表12b1、12b2、及12b3中展示協同作用及拮抗作用體積。表12d1、12d2、及12d3中展示該組合之累加抑制活性。在該測定係統中，該組合導致對HBsAg分泌之累加抑制。藉由顯微鏡檢查或Cell-Titer Glo測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制(表12c1、12c2、及12c3)。試驗 1 表 12a1. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之平均抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 表 12b1. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之 MacSynergy 體積計算： 99.99%置信區間(Bonferroni調整96%) 表 12c1. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合 之細胞毒性： 相對於對照之細胞活力平均百分比表 12d1. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之累加抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 試驗 2 表 12a2. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之平均抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 表 12b2. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之 MacSynergy 體積計算： 99.9%置信區間(Bonferroni調整96%) 表 12c2. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合 之細胞毒性： 相對於對照之細胞活力平均百分比表 12d2. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之累加抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 試驗 3 表 12a3. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之平均抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 表 12b3. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之 MacSynergy 體積計算： 99.99%置信區間(Bonferroni調整96%) 表 12c3. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合 之細胞毒性： 相對於對照之細胞活力平均百分比表 12d3. 化合物 5 及 SIRNA-NP 組合之抗病毒活性： 相對於陰性對照之累加抑制百分比(每資料點n=4個樣品) 表 12e. 在 HepG2.2.15 細胞培養系統中藉由 CLIA 使用 HBsAg 定量進行活體外 組合研究之結果之匯總 *在99.9%置信區間實例 13 活體外 組合研究目標

這項研究之目標為使用HBV細胞培養物模型系統在活體外判定替諾福韋(呈前藥替諾福韋地索普西富馬酸鹽或TDF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)或恩替卡韋(呈恩替卡韋水合物或ETV形式，為HBV聚合酶核苷類似物抑制劑)及SIRNA-NP(旨在促進所有病毒mRNA轉錄物及病毒抗原之有效敲低的siRNA)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。替諾福韋及恩替卡韋之化學結構： SIRNA-NP 之組成：

SIRNA-NP為靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物的脂質奈米顆粒調配物。以下脂質奈米顆粒(LNP)調配物用於遞送HBV siRNA。表中展示之值為摩爾百分數。縮寫DSPC意指二硬脂醯磷脂醯膽鹼，且PEG為PEG 2000。

陽離子脂質具有以下結構：。

三種siRNA之序列展示如下。 活體外 組合實驗方案：

活體外 組合研究使用Prichard及Shipman之方法(Prichard MN, Shipman C, Jr.,Antiviral Res ,14 , 181-205 (1990))進行。開發HepDE19細胞株，如Guo等人 (Guo等人 ,J Virol ,81 , 12472-12484 (2007))所述。其為用HBV基因組穩定轉染之人類肝細胞系，且可表現HBV前基因組RNA，並以四環素調節方式支持HBV rcDNA(鬆散環狀DNA)合成。將HepDE19細胞鋪板在補充有10%胎牛血清+ 1%青黴素-鏈黴素而無四環素之DMEM/F12培養基之96孔經組織培養處理之微量滴定板中且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，將細胞轉換到新鮮培養基並用其對應EC₅₀ 值附近之濃度範圍的抑制劑A及抑制劑B處理，且在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育7天持續時間。將抑制劑以100% DMSO (ETV及TDF)或生長培養基(SIRNA-NP)稀釋且測定中之最終DMSO濃度≤0.5%。將這兩種抑制劑單獨以及以棋盤方式組合進行測試，使得各濃度之抑制劑A與各濃度之抑制劑B組合以判定其對抑制rcDNA產生之組合效果。在48小時溫育後，使用bDNA測定(Affymetrix)使用HBV特異性定製探針組及製造商說明書量測存在於經抑制劑處理孔中之rcDNA水平。將自各孔產生之RLU資料計算為未經處理對照孔之抑制%，且使用MacSynergy II程式分析，以使用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 µM² % (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 µM² % (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為重要的；超過100 µM² % (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為顯著的；體積接近1000 µM² % (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。同時，使用複製板評估抑制劑組合對細胞活力之效果，該等複製板用於使用Cell-TiterGlo試劑(Promega)根據製造商說明書判定ATP含量作為細胞活力之量度。結果及結論： TDF 及 SIRNA-NP 之活體外 組合：

測試TDF (在2倍稀釋系列及10點滴定中濃度範圍為1.0 μM至0.004 μM)與SIRNA-NP(在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為25 ng/mL至0.309 ng/mL)之組合。在表13a中展示用單獨或組合之TDF或SIRNA-NP治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表13c中展示TDF及SIRNA-NP之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用(表13a)預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (Prichard MN. 1992. MacSynergy II, University of Michigan)之上述解釋標準，發現組合為累加的(表13c)。恩替卡韋及 SIRNA-NP 之活體外 組合：

測試恩替卡韋(在2倍稀釋系列及10點滴定中濃度範圍為4.0 nM至0.004 μM)與SIRNA-NP(在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為25 ng/mL至0.309 μg/mL)之組合。在表13b中展示用單獨或組合之ETV或SIRNA-NP治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表13c中展示ETV及SIRNA-NP之EC₅₀ 值。當兩種抑制劑以上述濃度範圍組合時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現該等濃度組合為累加的。表 13a ：替諾福韋地索普西富馬酸鹽及 SIRNA-NP 之活體外 組合 表 13b ：恩替卡韋及 SIRNA-NP 之活體外 組合 表 13c ：在 AML12-HBV10 細胞培養系統中使用 bDNA 測定法利用 rcDNA 定量進行活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 14

以下化合物在實例中受到引用。化合物20 可用已知程序製備。例如，化合物20 可以如國際專利申請公開案號WO2015113990中所述製備

使用B型肝炎病毒(HBV)小鼠模型評估sAg產生小分子抑制劑及HBV靶向siRNA(SIRNA-NP )二者作為獨立治療及彼此組合之抗-HBV效果。

陽離子脂質具有以下結構：

藉由尾靜脈注射向C57/Bl6小鼠投與AAV1.2 1E11病毒基因組(描述於Huang, LR等人Gastroenterology , 2012, 142(7):1447-50)。該病毒質粒含有HBV基因組之1.2倍超長拷貝且表現HBV表面抗原(HBsAg)及其他HBV產物。使用酶免疫測定法監測小鼠血清HBsAg表現。基於血清HBsAg水平將動物(隨機化)分為組，使得a)證實所有動物均表現HBsAg，且b)在開始治療之前HBsAg組平均值彼此相似。

如下用化合物20 處理動物：在第0天開始，在第0天與第28天之間，以每天兩次的頻率口服投與3.0 mg/kg劑量之化合物20 ，總計56個劑量。將化合物20 溶解於共溶劑調配物(formation)中以用於投與。向陰性對照動物單獨投與共溶劑調配物或不用任何測試物品處理。如下用脂質奈米顆粒(LNP)封裝之HBV靶向siRNA處理動物：在第0天，靜脈內投與等同於0.3 mg/kg siRNA之量的測試物品。將各治療之HBsAg表現水平與該組之第0天(給藥前)值進行比較。

藉由在第0天(治療前)、第7天、第14天、及第28天收集血液且分析血清HBsAg含量來判定該等治療之效果。表14展示治療組平均值(對於siHBV及媒介物組合治療n=5 (n=4)；±平均值之標準誤差)血清HBsAg濃度，其表示為第0天個體動物治療前基線值之百分比。

該等資料表明響應於單獨或組合之化合物20 及HBV siRNA之組合的血清HBsAg減少程度。在各測試時間點，化合物20 及HBV siRNA治療之組合產生與任何個別單一療法治療一樣好或更好的血清HBsAg減少。表 14. 化合物 20 及三種 HBV siRNA 對 HBV 感染小鼠模型中之血清 HBV sAg 的單一及組合治療效果 實例 15-24 用於原代人肝細胞研究之材料及方法 動物

FRG小鼠購自Yecuris (Tualatin, OR, USA)。下表展示小鼠之詳細資訊。該研究由WuXi IACUC(動物護理及使用委員會機構，IACUC協議R20160314-小鼠)批准。允許小鼠適應新環境7天。監測小鼠一般健康及日常生理及行為異常之任何跡象。FRG 小鼠技術資料 測試物品

化合物3 、22 、23 、24 、及25 由Arbutus Biopharma提供。Peg-干擾素α-2a(Roche，180 μg/0.5ml)由WuXi提供。TAF、恩替卡韋、替諾福韋、拉米夫定、及TDF由WuXi提供在DMSO溶液中。下表展示關於化合物之資訊。測試物品之資訊 病毒

D型HBV自HepG2.2.15培養上清液濃縮。下表展示病毒之資訊。HBV 之資訊 *GE、HBV基因組等效物。試劑

用於該研究之主要試劑為QIAamp 96 DNA血液套組(QIAGEN # 51161)、FastStart Universal Probe Master (Roche # 04914058001)、Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Biolite # 35004)、HBeAg ELISA kit (Antu # CL 0312)、及HBsAg ELISA套組(Antu # CL 0310)。儀器

用於該研究之主要儀器為BioTek Synergy 2、SpectraMax (Molecular Devices)、7900HT Fast Real-Time PCR System (ABI)、及Quantistudio 6 Real-Time PCR System (ABI)。原代人肝細胞 (PHH) 之收穫

應用小鼠肝臟灌注分離PHH。藉由Percoll進一步純化經分離肝細胞。將細胞用培養基重懸且接種到96孔板(6×10⁴ 個細胞/孔)或48孔板(1.2×10⁵ 個細胞/孔)中。在接種後一天(第1天)用D型HBV感染PHH。PHH 之培養及處理。

在第2天，將測試化合物稀釋且加入到細胞培養板中。每隔一天更新一次含化合物之培養基。第8天收集細胞培養物上清液用於HBV DNA及抗原測定。測定 EC₅₀ 值。

以7個濃度、3倍稀釋、重複三次測試化合物。雙重組合研究 。

在5×5基質板中重複三次測試兩種化合物。在第 8 天藉由 Cell Counting Kit-8 對細胞毒性進行測定

自細胞培養板中移出培養基，且然後將CCK8 (Biolite # 35004)工作溶液加入到細胞中。在37℃下將板溫育(incybated)，且在450nm波長處量測吸光度，且藉由SpectraMax在650nm波長處量測參考吸光度。藉由 qPCR 定量培養上清液中之 HBV DNA

用QIAamp 96DNA血液套組(Qiagen-51161)分離第8天收穫之培養上清液中的DNA。對於各樣本，使用100 μl培養上清液提取DNA。用100 μl、150 μl或180 μl AE洗脫DNA。藉由qPCR定量培養上清液中之HBV DNA。藉由MacSynergy軟體分析組合效果。以下描述引物。引物資訊 藉由 ELISA 量測培養上清液中之 HBsAg 及 HBeAg

藉由HBsAg/HBeAg ELISA套組(Autobio)根據手冊量測在第8天收穫之培養上清液中的HBsAg/HBeAg。將樣品用PBS稀釋以獲得標準曲線範圍內之信號。用下式計算抑制率。藉由MacSynergy軟體分析組合效果。

抑制%HBsAg =[1-HBsAg樣品量/DMSO對照之HBV量]×100。

抑制%HBeAg =[1-HBeAg樣品量/DMSO對照之HBV量]×100。SIRNA-NP

SIRNA-NP 為靶向HBV基因組之三種siRNA之混合物的脂質奈米顆粒調配物。以下脂質奈米顆粒(LNP)調配物用於遞送HBV siRNA。表中展示之值為摩爾百分數。縮寫DSPC意指二硬脂醯磷脂醯膽鹼。

陽離子脂質具有以下結構：。

三種siRNA之序列展示如下。 聚乙二醇化干擾素 α2a (IFNα2a) 之組成：

該藥劑購自商業來源：

亦使用以下化合物實例 15 化合物 24 及 TDF 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物24 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於胺基苯并二氫吡喃化學類別)及替諾福韋(呈前藥替諾福韋地索普西富馬酸鹽或TDF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試TDF (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與24 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為1000 nM至12.36 nM)之組合。在如下所示之表15a、15b及15c中展示用單獨或組合之24 或TDF治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。TDF及24 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表15d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為協同或累加的且不具有拮抗作用(表15d)。藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 15a ：化合物 24 及 TDF 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 15b ：化合物 24 及 TDF 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 15c ：化合物 24 及 TDF 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 15d ：在 PHH 細胞培養系統中進行化合物 24 及 TDF 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 16 化合物 23 及 TDF 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物23 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於胺基苯并二氫吡喃化學類別)及替諾福韋(呈前藥替諾福韋地索普西富馬酸鹽或TDF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的結果及結論

測試TDF (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與化合物23 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為2000 nM至24.69 nM)之組合。在如下所示之表16a、16b及16c中展示用單獨或組合之化合物23 或TDF治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。TDF及化合物23 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表16d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為協同或累加的且不具有拮抗作用(表16d)。藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 16a ：化合物 23 及 TDF 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 16b ：化合物 23 及 TDF 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 16c ：化合物 23 及 TDF 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 16d ：在 PHH 細胞培養系統中進行化合物 23 及 TDF 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 17 化合物 23 及 TAF 之活體外 組合 活體外 組合研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物23 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於胺基苯并二氫吡喃化學類別)及替諾福韋(呈前藥替諾福韋艾拉酚胺或TAF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的結果及結論

測試TAF (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與化合物23 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為2000 nM至24.69 nM)之組合。在如下所示之表17a及17b中展示用單獨或組合之化合物23 或TAF治療觀察到3次重複之HBV DNA及HBsAg平均抑制%以及標準偏差。TAF及化合物23 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表17c中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的且不具有拮抗作用(表17c)。藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 17a ：化合物 23 及 TAF 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 17b ：化合物 23 及 TAF 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 17c ：在 PHH 細胞培養系統中進行化合物 23 及 TAF 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 18 IFNα2a 及化合物 25 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞判定化合物25 (HBV DNA、HBsAg及HBeAg之小分子抑制劑，屬於二氫喹吖嗪酮化學類別)及聚乙二醇化干擾素α2a(IFNα2a，為在肝細胞中激活先天免疫途徑之抗病毒細胞因子)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試IFNα2a (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 IU/mL至0.123 IU/mL)與化合物25 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)之組合。在如下所示之表18a、18b、及18c中展示用單獨或組合之IFNa2a或化合物25 治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。IFNα2a及化合物25 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表18d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為協同的且不具有拮抗作用(表18d)。藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 18a ： IFNα2a 及化合物 25 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 18b ： IFNα2a 及化合物 25 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 18c ： IFNα2a 及化合物 25 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 18d ：在 PHH 細胞培養系統中進行 IFNα2a 及化合物 25 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 19 化合物 25 及化合物 3 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物3 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於氨磺醯苯甲醯胺化學類別)及化合物25 (HBV DNA、HBsAg及HBeAg之小分子抑制劑，屬於二氫喹吖嗪酮化學類別)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試化合物25 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與化合物3 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為5000 nM至61.73 nM)之組合。在如下所示之表19a、19b及19c中展示用單獨或組合之化合物25 或化合物3 治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。化合物25 及化合物3 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表19d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為協同的且不具有拮抗作用(表19d)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 19a ：化合物 25 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 19b ：化合物 25 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 19c ：化合物 25 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 19d ：在 PHH 細胞培養系統中進行化合物 25 及化合物 3 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 20 化合物 3 及 TAF 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物3 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於氨磺醯苯甲醯胺化學類別)及替諾福韋(呈前藥替諾福韋艾拉酚胺或TAF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試TAF (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與化合物3 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為5560 nM至68.64 nM)之組合。在如下所示之表20a、20b、及20c中展示用單獨或組合之TAF或化合物3 治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。TAF及化合物3 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表20d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加或協同的且不具有拮抗作用(表20d)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 20a ： TAF 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 20b ： TAF 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 20c ： TAF 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 20d ：在 PHH 細胞培養系統中進行 TAF 及化合物 3 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 21 IFNα2a 及化合物 22 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞判定化合物22 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於氨磺醯苯甲醯胺化學類別)及聚乙二醇化干擾素α2a(IFNα2a，為在肝細胞中激活先天免疫途徑之抗病毒細胞因子)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試IFNα2a (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 IU/mL至0.123 IU/mL)與化合物22 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為5000 nM至61.721 nM)之組合。在如下所示之表21a、21b、及21c中展示用單獨或組合之IFNa2a或化合物22 治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。IFNα2a及化合物22 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表21d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加至協同的且不具有拮抗作用(表21d)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 21a ： IFNα2a 及化合物 22 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 21b ： IFNα2a 及化合物 22 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 21c ： IFNα2a 及化合物 22 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 21d ：在 PHH 細胞培養系統中進行 IFNα2a 及化合物 22 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 22 化合物 22 及 TAF 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物22 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於氨磺醯苯甲醯胺化學類別)及替諾福韋(呈前藥替諾福韋艾拉酚胺或TAF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試TAF (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與化合物22 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為5000 nM至61.721 nM)之組合。在如下所示之表22a、22b、及22c中展示用單獨或組合之化合物22 或TAF治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。TAF及化合物22 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表22d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的且不具有拮抗作用(表22d)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 22a ：化合物 22 及 TAF 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 22b ：化合物 22 及 TAF 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 22c ：化合物 22 及 TAF 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 22d ：在 PHH 細胞培養系統中進行化合物 22 及 TAF 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 23 化合物 22 及化合物 25 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞在活體外判定化合物22 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於氨磺醯苯甲醯胺化學類別)及化合物25 (HBV DNA、HBsAg及HBeAg之小分子抑制劑，屬於二氫喹吖嗪酮化學類別)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試化合物25 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 nM至0.12 nM)與化合物22 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為5000 nM至61.73 nM)之組合。在如下所示之表23a、23b、及23c中展示用單獨或組合之化合物25 或化合物22 治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。化合物25 及化合物22 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表23d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為協同或累加的且不具有拮抗作用(表23d)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 23a ：化合物 22 及化合物 25 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 23b ：化合物 22 及化合物 25 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 23c ：化合物 22 及化合物 25 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 23d ：在 PHH 細胞培養系統中進行化合物 22 及化合物 25 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 24 IFNα2a 及化合物 3 之活體外 組合 研究目標

在細胞培養模型系統中使用經HBV感染之人原代肝細胞判定化合物3 、及聚乙二醇化干擾素α2a(IFNα2a，為在肝細胞中激活先天免疫途徑之抗病毒細胞因子)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。結果及結論

測試FNα2a (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為10.0 IU/mL至0.123 IU/mL)與化合物3 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為5000 nM至61.73 nM)之組合。在如下所示之表24a、24b、及24c中展示用單獨或組合之IFNa2a或化合物3 治療觀察到3次重複之HBV DNA、HBsAg、及HBeAg平均抑制%以及標準偏差。IFNα2a及化合物3 之EC₅₀ 值在早期實驗中測定且展示於表24d中；自不同批次之PHH細胞觀察到一些差異。

當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為協同的且不具有拮抗作用(表24d)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或CCK8測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 24a ： IFNα2a 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBV DNA 之效果 表 24b ： IFNα2a 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBsAg 之效果 表 24c ： IFNα2a 及化合物 3 在活體外 之組合對 HBeAg 之效果 表 24d ：在 PHH 細胞培養系統中進行 IFNα2a 及化合物 3 在活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 25 TAF 及 SIRNA-NP 之活體外 組合 研究目標

使用HBV細胞培養模型系統在活體外判定替諾福韋(呈前藥替諾福韋艾拉酚胺或TAF之形式，為HBV聚合酶核苷酸類似物抑制劑)及SIRNA-NP (旨在促進所有病毒mRNA轉錄物及病毒抗原之有效敲低的siRNA)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。HepDE19 中之活體外 組合實驗方案

使用Prichard及Shipman (1990)之方法(Prichard MN, Shipman C, Jr. 1990. A three-dimensional model to analyze drug-drug interactions. Antiviral Res 14:181-205 AND Prichard MN. 1992. MacSynergy II, University of Michigan)進行活體外組合研究.開發HepDE19細胞株，如Guo等人 (2007)(Guo H, Jiang D, Zhou T, Cuconati A, Block TM, Guo JT. 2007. Characterization of the intracellular deproteinized relaxed circular DNA of hepatitis B virus: an intermediate of covalently closed circular DNA formation. J Virol 81:12472-12484)所述。其為用HBV基因組穩定轉染之人類肝細胞系，且可表現HBV前基因組RNA，並以四環素調節方式支持HBV rcDNA(鬆散環狀DNA)合成。將HepDE19細胞鋪板在補充有10%胎牛血清+ 1%青黴素-鏈黴素而無四環素之DMEM/F12培養基之96孔經組織培養處理之微量滴定板中且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，將細胞轉換到新鮮培養基並用其對應EC₅₀ 值附近之濃度範圍的抑制劑A及抑制劑B處理，且在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育7天持續時間。將抑制劑以100% DMSO (TAF)或生長培養基(SIRNA-NP )稀釋且測定中之最終DMSO濃度≤0.5%。將這兩種抑制劑單獨以及以棋盤方式組合進行測試，使得各濃度之抑制劑A與各濃度之抑制劑B組合以判定其對抑制rcDNA產生之組合效果。在48小時溫育後，使用bDNA測定(Affymetrix)使用HBV特異性定製探針組及製造商說明書量測存在於經抑制劑處理孔中之rcDNA水平。將自各孔產生之RLU資料計算為未經處理對照孔之抑制%，且使用MacSynergy II程式分析，以使用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 µM² % (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 µM² % (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為顯著的；超過100 µM² % (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為重要的；體積接近1000 µM² % (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。同時，使用複製板評估抑制劑組合對細胞活力之效果，該等複製板用於使用Cell-TiterGlo試劑(Promega)根據製造商說明書判定ATP含量作為細胞活力之量度。結果及結論

測試TAF (在2倍稀釋系列及9點滴定中濃度範圍為200.0 nM至0.781 nM)與SIRNA-NP (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為60 ng/mL至0.741 ng/mL)之組合。表25A中展示用單獨或組合之TAF或SIRNA-NP治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表25B中展示TAF及SIRNA-NP 之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值(表25A)進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現組合為累加的且不具有拮抗作用(表25B)。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或Cell-TiterGlo測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 25A ：替諾福韋艾拉酚胺及 SIRNA-NP 之活體外 組合 表 25B ：在 DE19 細胞培養系統中使用 bDNA 測定法利用 rcDNA 定量進行活體外 組合研究之結果之匯總： 實例 26 化合物 3 及 GLS4 之活體外 組合 研究目標

使用HBV細胞培養模型系統在活體外判定化合物3 (HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於氨磺醯苯甲醯胺化學類別之)及GLS4(HBV衣殼化小分子抑制劑，屬於雜芳基二氫嘧啶或HAP化學類別)之兩種藥物組合為累加、協同或拮抗的。HepDE19 中之活體外 組合實驗方案

使用Prichard及Shipman(1990)之方法進行活體外 組合研究。開發HepDE19細胞株，如Guo等人 (2007)所述。其為用HBV基因組穩定轉染之人類肝細胞系，且可表現HBV前基因組RNA，並以四環素調節方式支持HBV rcDNA(鬆散環狀DNA)合成。將HepDE19細胞鋪板在補充有10%胎牛血清+ 1%青黴素-鏈黴素而無四環素之DMEM/F12培養基之96孔經組織培養處理之微量滴定板中且在37℃及5%CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育過夜。次日，將細胞轉換到新鮮培養基並用其對應EC₅₀ 值附近之濃度範圍的抑制劑A及抑制劑B處理，且在37℃及5% CO₂ 下在濕潤恆溫箱中溫育7天持續時間。將兩種抑制劑以100% DMSO稀釋且測定中之最終DMSO濃度≤0.5%。將這兩種抑制劑單獨以及以棋盤方式組合進行測試，使得各濃度之抑制劑A與各濃度之抑制劑B組合以判定其對抑制rcDNA產生之組合效果。在48小時溫育後，使用bDNA測定(Affymetrix)使用HBV特異性定製探針組及製造商說明書量測存在於經抑制劑處理孔中之rcDNA水平。將自各孔產生之RLU資料計算為未經處理對照孔之抑制%，且使用MacSynergy II程式分析，以使用Prichard及Shipman建立之如下解釋指導原則判定組合為協同、累加或拮抗的：協同作用體積在95% CI下＜25 µM² % (log體積＜2)=可能不顯著；25-50 µM² % (log體積＞2及＜ 5) =微小但顯著的，50-100 µM² % (log體積＞5及＜9) =中等，在活體內 可能為重要的；超過100 µM² % (log體積＞9) =強協同作用，在活體內 可能為顯著的；體積接近1000 µM² % (log體積＞90) =異乎尋常高的檢查資料。同時，使用複製板評估抑制劑組合對細胞活力之效果，該等複製板用於使用Cell-TiterGlo試劑(Promega)根據製造商說明書判定ATP含量作為細胞活力之量度。結果及結論

測試化合物3 (在3倍稀釋系列及5點滴定中濃度範圍為3.0 μM至0.04 μM)與GLS4 (在2倍稀釋系列及9點滴定中濃度範圍為2.0 μM至0.008 μM)之組合。在表26a中展示用單獨或組合之化合物3 或GLS4治療觀察到4次重複之rcDNA平均抑制%及標準偏差。表26b中展示化合物3 及GLS4之EC₅₀ 值。當將兩種抑制劑組合之觀察值與上述濃度範圍之累加相互作用預期值(表26a)進行比較時，根據MacSynergy II分析且使用Prichard及Shipman (1992)之上述解釋標準，發現該組合為大部分累加的以及極其輕微拮抗的(表26b)，拮抗作用程度微小但顯著。在經分析樣品中藉由顯微鏡檢查或Cell-TiterGlo測定法未觀察到細胞活力或增殖之顯著抑制。表 26a ：化合物 3 及 GLS4 之活體外 組合 表 26b ：在 DE19 細胞培養系統中使用 bDNA 測定法利用 rcDNA 定量進行活體外組合研究之結果之匯總： 實例 27

開發用於慢性HBV之治癒受到病毒抑制宿主免疫反應之能力及cccDNA庫之存在的挑戰。用於慢性HBV之治癒應解決涉及病毒持續存在之多種因素，且可能需要具有不同作用機制之藥物組合。在該實例中考察一種該組合策略。

使用B型肝炎病毒(HBV)小鼠模型評估主要以免疫增強劑、免疫刺激劑及HBV靶向siRNA作為抗原減少劑之組合治療之抗-HBV效果。

將三種HBV靶向siRNA之該混合物作為脂質奈米顆粒(LNP)調配物投與。

以下脂質奈米顆粒(LNP)調配物在本文報告之實驗中用於遞送HBV siRNA。表中展示之值為摩爾百分數。縮寫DSPC意指二硬脂醯磷脂醯膽鹼。

陽離子脂質具有以下結構：

在治療開始前，經由靜脈內注射向C57BL/6小鼠投與攜帶HBV基因組1.2倍超長拷貝之腺相關病毒(AAV)載體之1×10¹¹ 個病毒基因組(最初描述於Dion, S等人,Journal of Virology, 2013, 87(10): 5554-5563)。該病毒載體之引入引起HBV表面抗原(HBsAg)及其他HBV產物表現且產生針對HBV之免疫耐受狀態。當未發生HBV暴露或抗-HBV治療時，一部分動物未投與該攜帶HBV之AAV載體且將其用作陰性對照以證明基線HBV特異性免疫反應。使用酶免疫測定法監測小鼠中之血清HBsAg表現及抗-HBsAg抗體水平。使用定量聚合酶鍊式反應(QPCR)測定法監測血清HBV DNA。基於陰性抗體反應及血清HBsAg水平將動物(隨機化)分為組，使得a)證實所有動物均表現HBsAg，且b)在開始治療之前HBsAg組平均值彼此相似。

如下用脂質奈米顆粒(LNP)封裝之HBV靶向siRNA處理動物：在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、及第35天每一天，靜脈內投與等同於1 mg/kg siRNA之量的測試物品。同時，用免疫增強劑如下處理動物：在第0天及每三天或四天直至第41天，藉由腹膜內註射投與200微克抗鼠程序性死亡配體1抗體(PD-L1，克隆10F.9G2，大鼠抗小鼠PD-L1，獲得自BioXCell，目錄號BP0101)。在用siRNA及抗-PD-L1組合治療後，投與由兩微克重組HBsAg疫苗(Engerix-B，由吸附到氫氧化鋁上之酵母重組HBsAg組成，獲得自GlaxoSmithKline，國家藥品編碼58160-821-11)組成之免疫刺激劑，與50微克由胞苷-鳥苷(CpG)二核苷酸組成之佐劑(小鼠B類TLR9配體，硫代磷酸酯鹼基之序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT – 3’，獲得自Invivogen，目錄號tlrl-1826)同時投與。

藉由處死動物且分離肝臟淋巴細胞以在酶聯免疫斑點(Elispot)測定法中藉由細胞因子IFN-γ及IL-2之產生鑒定T細胞對HBV之反應來判定治療對HBV免疫反應之作用。表27A展示第42天治療反應(n=4之集合；±技術性重複之標準偏差)。為證明治療特異性效果，將治療組與陰性對照動物進行比較。單獨使用抗-PD-L1或HBV siRNA之治療誘導一些HBV免疫反應；在使用該兩種藥劑聯合治療後觀察到最大效果。

藉由在第0天(治療前)、第14天、第21天、第28天、第42天、第56天、第70天、第91天、第112天、及第140天收集少量血液來判斷在治療停止期間及治療停止後對血清HBsAg及血清HBV DNA之效果。表27B展示治療組匯集結果(n=8之集合)血清HBsAg濃度，其表示為在第0天組匯集之治療前基線值之百分比。資料表明HBsAg減少為HBV siRNA治療之結果，而非抗-PD-L1治療本身之結果。HBV siRNA及抗-PD-L1之組合治療在治療時導致HBsAg減少，但是在治療停止後未能持續控制HBsAg。相反，用HBV siRNA及抗-PD-L1之組合治療、然後加入免疫刺激劑疫苗，會在停止治療後能夠控制HBsAg相當長時間。該非治療性病毒控制與血清抗-HBsAg抗體之產生升高相吻合。表27C展示以國際單位/毫升表示之治療組平均值(n=8；±平均標準誤差)血清抗-HBsAg抗體水平。血清HBV DNA分析在對各組合治療之響應方面產生與對於血清HBsAg所述大致相似之趨勢。在包括HBV siRNA治療但未在HBV siRNA不存在下投與抗-PD-L1之任何治療組中在第42天量測到大約至少一倍半log10血清HBV DNA減少至測定偵測限以下。僅在免疫刺激疫苗與HBV siRNA及抗-PD-L1之組合的情況下實現HBV DNA之部分治療停止後控制。

資料表明HBsAg及HBV DNA減少由HBV siRNA治療引起，當將用於控制HBV抗原血症之藥物(HBV siRNA)及免疫增強劑(抗-PD-L1)組合時HBV免疫反應更大，且當在用其他兩種藥劑治療後添加第三種藥劑免疫刺激劑(疫苗)時對HBsAg及HBV DNA之減少作用甚至在治療停止後仍為持久的(持續至治療後觀測期結束)。三種治療之組合產生較之單獨治療或兩種藥劑(抗原減少劑加免疫增強劑)之組合形式更大且更持久之抗-HBV效果。表 27A. 在 HBV 感染小鼠模型中在第 42 天抗原減少 HBV 靶向 siRNA 及免疫增強劑抗 -PD-L1 抗體對 HBV T 細胞細胞因子反應之單一及組合治療效果 表 27B. 在 HBV 感染小鼠模型中抗原減少 HBV 靶向 siRNA 、免疫增強劑抗 -PD-L1 抗體及免疫刺激劑疫苗對血清 HBsAg 之單一及組合治療效果 表 27C. 在 HBV 感染小鼠模型中抗原減少 HBV 靶向 siRNA 、免疫增強劑抗 -PD-L1 抗體及免疫刺激劑疫苗對血清抗 -HBsAg 抗體之產生之單一及組合治療效果 ¹ =評估組彙集血清，因此無可用誤差計算 N/A =不能獲得

所有公開案、專利及專利文件均以引用方式併入本文，恰如以引用的方式單獨地併入一般。本發明已參考各種特定及較佳實施例及技術加以描述。然而，應理解在保持在本發明精神及範疇內，可進行許多變化及改變。

Claims

一種用於治療人類B型肝炎之方法，其包含向該人類投與：靶向HBV基因組之一部分之siRNA； PD-L1抑制劑；及抗-HBV疫苗。
如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含投與控制病毒複製之藥劑。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該PD- L1抑制劑為抗-PD-L1 mAb。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中該抗-HBV疫苗為靶向HBV表面抗原之疫苗。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中靶向該HBV基因組之一部分之該siRNA及該PD-L1抑制劑同時投與。
如申請專利範圍第5項之方法，其中該抗-HBV疫苗在投與該siRNA及該PD-L1抑制劑之後投與。
如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑在投與該siRNA及該PD-L1抑制劑同時或之前投與。
如申請專利範圍第7項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑在投與該siRNA及該PD-L1抑制劑同時投與。
如申請專利範圍第7項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑在投與該siRNA及該PD-L1抑制劑之前投與。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該siRNA、該PD-L1抑制劑、及該抗-HBV疫苗同時投與。
如申請專利範圍第10項之方法，其中控制病毒複製之藥劑在投與該siRNA、該PD-L1抑制劑、及該抗-HBV疫苗同時或之前投與。
如申請專利範圍第10項之方法，其中控制病毒複製之藥劑在投與該siRNA、該PD-L1抑制劑、及該抗-HBV疫苗同時投與。
如申請專利範圍第10項之方法，其中控制病毒複製之藥劑在投與該siRNA、該PD-L1抑制劑、及該抗-HBV疫苗之前投與。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中該siRNA經投與，該PD-L1抑制劑之投與在開始siRNA投與之後開始，且該抗-HBV疫苗之投與在開始該PD-L1抑制劑之後開始。
如申請專利範圍第14項之方法，其中控制病毒複製之藥劑亦經投與。
一種用於治療人類B型肝炎之方法，其包含向該人類投與來自以下至少三種藥劑類別之至少一種藥劑： (A) 控制病毒複製之藥劑； (B) 減少病毒Ag之藥劑； (C) 免疫增強劑；及 (D) 免疫刺激劑。
如申請專利範圍第16項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為逆轉錄酶抑制劑、衣殼抑制劑、cccDNA抑制劑、或進入抑制劑。
如申請專利範圍第17項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為逆轉錄酶抑制劑。
如申請專利範圍第17項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為衣殼抑制劑。
如申請專利範圍第17項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為cccDNA抑制劑。
如申請專利範圍第17項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為進入抑制劑。
如申請專利範圍第16項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑為恩替卡韋、克拉夫定、替比夫定、拉米夫定、阿德福韋、及替諾福韋、替諾福韋地索普西、替諾福韋艾拉酚胺、替諾福韋地索普西富馬酸鹽、阿德福韋二匹伏酯、(1R,2R,3R,5R)-3-(6-胺基-9H-9-嘌呤基)-2-氟-5-(羥甲基)-4-亞甲基環戊烷-1-醇、恩曲他濱、阿巴卡韋、艾夫他濱、更昔洛韋、洛布卡韋、泛昔洛韋、噴西洛維、氨多索韋或CMX157(替諾福韋exalidex)。
如申請專利範圍第16項至第22項中任一項之方法，其中該減少病毒Ag之藥劑為靶向HBV基因組之一部分的siRNA。
如申請專利範圍第16項至第22項中任一項之方法，其中該減少病毒Ag之藥劑為sAg分泌抑制劑。
如申請專利範圍第16項至第22項中任一項之方法，其中該減少病毒Ag之藥劑為抗-HBsAg劑。
如申請專利範圍第16項至第25項中任一項之方法，其中該免疫增強劑為檢查點抑制劑。
如申請專利範圍第16項至第25項中任一項之方法，其中該免疫增強劑為PD-L1抑制劑。
如申請專利範圍第16項至第27項中任一項之方法，其中該免疫增強劑為抗-PD-1 mAb、抗-PD-L1 mAb、抗-PD-L2 mAb、抗-CTLA4 mAb、抗-VISTA mAb、抗-LAG3 mAb、抗-TIM3 mAb、或肽模擬物。
如申請專利範圍第16項至第28項中任一項之方法，其中該免疫刺激劑為抗-HBV疫苗、干擾素、RIG-1促效劑、STING促效劑、TLR9促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR3促效劑、IL-7、IL-2、OX-40促效劑、或抗GITR促效劑。
如申請專利範圍第16項至第29項中任一項之方法，其中該減少病毒Ag之藥劑及該免疫增強劑同時投與。
如申請專利範圍第30項之方法，其中該免疫刺激劑在投與該減少病毒Ag之藥劑及該免疫增強劑之後投與。
如申請專利範圍第16項至第31項中任一項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑在投與該減少病毒Ag之藥劑及該免疫增強劑同時或之前投與。
如申請專利範圍第32項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑在投與該減少病毒Ag之藥劑及該免疫增強劑同時投與。
如申請專利範圍第32項之方法，其中該控制病毒複製之藥劑在投與該減少病毒Ag之藥劑及該免疫增強劑之前投與。
如申請專利範圍第16項至第29項中任一項之方法，其中該減少病毒Ag之藥劑、該免疫增強劑、及該免疫刺激劑同時投與。
如申請專利範圍第35項之方法，其中控制病毒複製之藥劑在投與該減少病毒Ag之藥劑、該免疫增強劑、及該免疫刺激劑同時或之前投與。
如申請專利範圍第35項之方法，其中控制病毒複製之藥劑在投與該減少病毒Ag之藥劑、該免疫增強劑、及該免疫刺激劑同時投與。
如申請專利範圍第35項之方法，其中控制病毒複製之藥劑在投與該減少病毒Ag之藥劑、該免疫增強劑、及該免疫刺激劑之前投與。
如申請專利範圍第16項至第29項中任一項之方法，其中該減少病毒Ag之藥劑經投與，該免疫增強劑之投與在開始投與該減少病毒Ag之藥劑之後開始，且該免疫刺激劑之投與在開始投與該免疫增強劑之後開始。
如申請專利範圍第16項之方法，其中來自四種藥劑類別中每一者之至少一種藥劑經投與。
一種用於治療人類B型肝炎之方法，其包含首先向該人類投與減少病毒Ag之藥劑且然後投與改善對B型肝炎病毒之免疫反應之藥劑。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該改善免疫反應之藥劑為免疫增強劑。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該改善免疫反應之藥劑為免疫刺激劑。
如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之方法，其進一步包含投與控制病毒複製之藥劑。
一種用於治療人類D型肝炎之方法，其包含向該人類投與：靶向HBV基因組之一部分之siRNA； PD-L1抑制劑；及抗HBV疫苗。
一種用於治療人類D型肝炎之方法，其包含向該人類投與來自以下至少三種藥劑類別之至少一種藥劑： (A) 控制病毒複製之藥劑； (B) 減少病毒Ag之藥劑； (C) 免疫增強劑；及 (D) 免疫刺激劑。