JP2022550454A - Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、感染細胞においてB型肝炎ウイルス（HBV）を抑制するための組成物及び方法を提供する。例示的な方法は、感染細胞においてインターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化を誘導する1つ以上の薬剤と感染細胞を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の前記薬剤は、病原体関連分子パターン（PAMP）含有核酸分子、低分子薬剤（例えば、ベンゾチアゾール誘導体分子）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、感染細胞をNRTIと接触させる工程をさらに含む。本方法は、HBV感染を有する対象を治療するインビボ方法であって、1つ以上の治療効果組成物中に配合された1つ以上の薬剤の治療関連量を投与する工程を含む、方法であり得る。例示的な組成物は、対象におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染を治療するために製剤化され、RIG-Iアゴニスト、細胞内送達のためのビヒクル、及び薬学的に許容される担体を含む。【選択図】図5D

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年10月2日に出願された米国仮出願番号62/909,321の利益を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

配列リストに関するステイトメント
本願に付属する配列表は、紙媒体のコピーに代えてテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、72750_Sequence_Listing_final_2020-09-28.txtである。このテキストファイルは31kbであり、2020年9月28日に作成され、本明細書の提出とともにEFS-Webを介して提出される。

政府ライセンス権に関するステイトメント
本発明は、米国国立衛生研究所が授与する助成金番号R01 AI118916及びR01 AI127463による政府の支援を受けて行われたものである。政府は、この発明について一定の権利を有している。

B型肝炎ウイルス（HBV）は、世界中で2億5000万人以上が慢性的に感染している、世界的な公衆衛生問題である。慢性HBV感染は、HBV感染が年間70万人以上の死亡を引き起こすような肝硬変、肝細胞がん（HCC）、及び肝不全を含む肝臓疾患の主要な原因である[WHO, 2017]。

HBVは、部分的に逆転写によって複製する、小型の肝臓指向性のDNAウイルスである。HBVは、ソディウム-タウロコレート共輸送ポリペプチド（NTCP）受容体を介して肝細胞に特異的に侵入し、複製してビリオンを生産する。肝細胞の細胞質ゾルに入った後、ウイルスのヌクレオカプシドは核に移行し、ウイルスの弛緩した環状（relaxed circular、RC）DNAを分解及び放出する。核内では、RC DNAは共有結合閉環DNA（cccDNA）に変換される。これはプレゲノム（pg）RNA、プレ-S、S及びXウイルスRNAを含む全てのHBV RNA転写物の合成のための主要テンプレートとして機能する長寿命のウイルスミニクロモソームである。RC DNAを含む成熟したヌクレオカプシドを合成後、小胞体で出芽してエンベロープを獲得し、子孫ウイルス粒子を生成する。成熟したHBVヌクレオカプシドのプールの一部は、細胞内増幅経路と呼ばれるプロセスで、さらなるcccDNAの合成を促進するために使用される。このプロセスはcccDNAのプールが慢性感染を示す細胞あたり3～50分子の定常状態の集団として維持されることを促進する。感染細胞からのcccDNAの根絶又は枯渇のいずれかによって肝臓からcccDNAを除去することが、HBVの治癒に必須であると考えられる。

慢性HBVの現在の治療法は、(i)ウイルスの逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの機能を阻害するヌクレオチドアナログ（NAs）、及び(ii)HBV抗原産生の抑制のために自然免疫防御を誘導するペグインターフェロンアルファ（ペグ-IFNα）療法を含む2種類の療法に依存している。これらの治療法は、活発なウイルス複製を抑制し、cccDNAレベルを減少させ、疾患の進行を遅らせることができるが、cccDNAの核プールを排除することはできず、治療した患者には大きな副作用が伴う。cccDNAの残存期間は、インビボで6～22週間とされており、大部分の患者では、ウイルス複製を継続的に抑制するために、抗ウイルス療法による生涯にわたる治療が必要とされている。問題なのは、慢性HBVに対するIFNベースの療法は忍容性が低く、治療された患者のうち、臨床的HBV治癒を定義するHBsAgの完全な喪失を示すのは低い頻度であることである。

従って、抑制的なHPV治療法の開発にもかかわらず、cccDNAを特異的に根絶することができ、それによってより完全かつ機能的な治癒をもたらし、延長した抑制療法の有害な影響を回避する、有効な治療薬及び治療戦略に対するニーズが残っている。本明細書は、これらのニーズ及び関連するニーズに対処する。

この概要は、詳細な説明において以下でさらに説明される概念の選択を簡略化した形で紹介するために提供される。この概要は、請求された主題の重要な特徴を特定することを意図しておらず、また、請求された主題の範囲を決定する際の補助として使用することを意図していない。

一態様において、本明細書は、感染細胞（infected cell）におけるB型肝炎ウイルス（HBV）の共有結合閉環DNA（cccDNA）レベルを抑制するための方法を提供する。本方法は、感染細胞においてインターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化を誘導する薬剤（agent）と感染細胞を接触させる工程を含む。「cccDNAを抑制する」は、感染細胞におけるcccDNAの形成を阻害すること、又は感染細胞における既存のcccDNAの安定性を低下させることを含み得る。

いくつかの実施形態では、薬剤は、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）様受容体（RLR）シグナル伝達経路を誘導することによりIRF3活性化を誘導する。いくつかの実施形態において、薬剤は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含み、ここで、PAMPは、末端三リン酸を含む5'-アーム領域、少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、低分子薬剤である。いくつかの実施形態では、低分子薬剤は、ベンゾチアゾール誘導体分子、例えば、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む低分子薬剤であるか、又は含む。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子と低分子薬剤（例えば、ベンゾチアゾール誘導体分子、例えば、N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミド）の組み合わせを細胞と接触させる工程を含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、細胞をヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）と接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、NRTIは、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される。

いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。

別の態様において、本明細書は、それを必要とする対象におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染を治療又は予防する方法を提供する。本方法は、対象の感染細胞においてインターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化を誘導する組成物の治療上有効量を、対象に投与する工程を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子を含み、ここで、PAMPは、末端三リン酸を含む5'-アーム領域、少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、RIG-Iシグナル伝達を誘導する低分子薬剤である。いくつかの実施形態では、低分子薬剤は、低分子薬剤は、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む低分子薬剤などのベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子と低分子薬剤とを組み合わせて又は協調して、治療上有効な量を対象に投与する工程を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、対象にヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、NRTIは、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される。NRTIは、対象の感染細胞においてインターフェロン調節因子3（IRF3）の活性化を誘導する1つ以上の薬剤と組み合わせて又は協調して投与できる。

別の態様において、本明細書は、RIG-Iアゴニスト、細胞内送達のためのビヒクル、及び薬学的に許容される担体を含む、対象におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染を治療するための組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、RIG-Iアゴニストは、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含み、ここで、PAMPは、末端三リン酸を含む5'-アーム領域、少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、を含む。いくつかの実施形態では、RIG-Iアゴニストは、低分子薬剤であるか、又は含む。いくつかの実施形態では、低分子薬剤は、ベンゾチアゾール誘導体分子、例えば、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドなどの低分子薬剤であるか、又は含む。いくつかの実施形態では、組成物は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子と低分子薬剤（例えば、ベンゾチアゾール誘導体分子、例えば、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミド）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）をさらに含む。いくつかの実施形態では、NRTIは、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、HBVが感染した標的宿主細胞へのRIG-Iアゴニストの導入のために構成されたリポソーム、ナノカプセル、ナノ粒子、エキソソーム、マイクロ粒子、マイクロスフィア、脂質粒子、ベシクルなどである。

別の態様では、本明細書は、B型肝炎ウイルス（HBV）感染を有する対象の治療方法であって、本明細書に開示の組成物の治療上有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明の上述の態様及び付随する多くの利点は、添付の図面と合わせて考慮した場合、以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解されるようになるだろう。

図1A～1Dは、F7低分子及びポリ-U/UC PAMPが、自然免疫遺伝子を差動的に誘導することを示す図である。(1A）F7の構造及び代表的なポリ-U/UC PAMP-RNA（配列番号1）の配列。（1B）IRF3トランスロケーションの免疫蛍光分析。HepG2-hNTCP細胞を2.5％DMSOを含む培地で培養し、センダイウイルス（SenV；10HAU/ml）に感染させ、又はF7（10μM）、X-RNA（リポソーム中200ng/ml）、もしくはポリ-U/UC PAMP（リポソーム中200ng/ml）で24時間処置した。細胞は3％パラホルムアルデヒドで固定し、マウス抗hNTCP（緑）、ウサギ抗IRF3（赤）抗体を用いて染色し、DAPI（青）でカウンターステインした。スケールバーは20μmを表す。(1C）F7とpoly-U/UCはIRF3の活性化と自然免疫系遺伝子の発現を誘導する。センダイウイルス、F7、X-RNA及びpoly-U/UC PAMPをHepG2-hNTCP及びdHepaRGに24時間及び48時間、表示通りに投与した。細胞ライセートをSDS-PAGEで分離した後、イムノブロット処理を行った。それぞれの抗体を用いて、チューブリンの発現レベルに対するp-IRF3（IRF3のS386リン酸化活性型）、IRF3（トータルIRF3）、及びIFIT1の蛋白質発現レベルを測定した。（1D）遺伝子発現解析。HepG2-hNTCP細胞に、上記のようにSenV、F7、X-RNA、poly-U/UC-RNAを24時間及び72時間投与し、回収した細胞から全細胞RNAを精製した。自然免疫遺伝子IFIT1、CXCL10、IFITM1、RSAD2、RIG-I、MDA5、SAMHD1、APOBEC3A、APOBEC3G、IFN-α、IFN-β及びIFN-λ3の発現レベルをqRT-PCRにより測定し、GAPDH発現レベルに対して正規化した。それぞれ、3つの独立した実験からの2.5％DMSO処置で達成されたものに対する平均倍率誘導として示される。 図2A～2Eは、cccDNA形成の治療的抑制を示す図である。(2A）感染及び処置のスキーム（上）及びcccDNAを含む蛋白質フリーDNAを測定するためのサザンブロット分析（下）である。HBV接種（1000Geq/細胞）とシクロスポリンA（CsA）、F7、X-RNA、及びポリ-U/UC PAMPの投与によるスケジュールを示す図である。HepG2-hNTCP細胞からHirt抽出法でcccDNAとPF-RC DNAを回収し、HBV特異的DNAプローブを用いたサザンブロット解析により解析した。ウイルス蛋白質フリーDNA（蛋白質フリーの弛緩環状DNA [PF-RC DNA]とcccDNA）を記した。（2B及び2C）HepG2-hNTCP（2B）又は分化HepaRG細胞（2C）を、1000 Geq/細胞のmoiでHBVに感染させ、CsA（10μM）又はF7を、示された濃度で投与した。(2B)と(2C)の上段、3dpiのHirt抽出後にDNAを単離し、HBV-DNAプローブを用いてサザンブロット解析を行ったものである。（2B）及び（2C）の下段では、HepG2-hNTCP及びdHepaRG細胞において、cccDNA形成に対するF7の阻害効果を、RT-qPCR分析を用いてそれぞれ測定した。(2D及び2E）HepG2-hNTCP（2D）又はdHepaRG細胞（2E）を、1000Geq/細胞のmoiでHBVに感染させ、CsA（10μM）、X-RNA（100ng/ml）又はポリ-U/UC PAMPを示された濃度で投与した。（2D）及び（2E）の上段は、サザンブロット解析によりDNAを解析した。（2D）及び（2E）の下段は、RT-qPCRによりDNAを解析した。IC₉₀及びIC₅₀値は、DMSO処置コントロールに対するcccDNAの減少に基づいて計算した。IC₉₀及びIC₅₀値は、3つの実験の平均値±1標準偏差である。細胞傷害性は、CellTiter-Glo^TM試薬を用いて、細胞生存率の指標として細胞ATP含量を測定することにより測定した。CC₅₀値は3回の実験の平均値±1標準偏差で示した。質量マーカーの位置は、各サザンブロット上に示されている。 図3A～3Fは、F7及びポリ-U/UC PAMPがデノボHBV cccDNA合成を抑制することを示す図である。（3A）上段落：感染及びポリ-U/UC PAMP処置スケジュール。細胞は、HBV感染前24時間（Pre）、感染後48時間（Post）、又は72時間（Pre/Post）のいずれかに100ng/mlのポリ-U/UC PAMPで処置した。3dpiで細胞を回収し、Hirt抽出物を調製した。（3B）HepG2-hNTCP細胞及び（3C）dHepaRG細胞をサザンブロット（上）及びRT-qPCR（下）により分析した。RT-qPCR解析では、DMSO処置したコントロールからの値をそれぞれ100％とし、データはコントロールサンプルにおけるcccDNAの平均±標準偏差（SD）パーセントで示した。*** P < 0.005、及びns=有意でない。（3D）HBV感染とF7処置スケジュール。細胞は、感染前24時間（Pre）、感染の間24時間（Co）、感染後48時間（Post）、又は96時間（pre/co/post）のいずれかにF7（10μM）で処置した。3Dpiで細胞を回収し、Hirt抽出物を調製した。HepG2-hNTCP（3E）及びdHepaRG細胞（3F）。上段はサザンブロット解析。下段はRT-qPCR解析と、コントロールDMS処置細胞と比較した処置細胞に残存するcccDNAの割合を示す。DMSO処置したコントロール培養物からの値を100％とした。データは平均値±標準偏差（SD）で示した。* P < 0.01、 ** P < 0.005、 *** P < 0.001、 ****P < 0.0001及びns= 有意差無し。CsAは処置コントロールとして使用した。サザンブロットについては、マスマーカーの位置が示されている。 図4A～4Dは、抗ウイルス活性の細胞内コンパートメント分析を示す図である。(4A）及び（4C）F7処置（4A）又はポリ-U/UC PAMP処置（4C）を伴うHBV感染のスキームである。HepG2-hNTCP培養物は24時間moi 1000 Geq/細胞でHBVを接種させた。処置0日に、培養物にF7（10μM）又はポリ-U/UC PAMP（100ng/ml）を加えた。3日間を通じて示された各時点でHirt抽出物の産生のために細胞を回収した。全細胞溶解物及び細胞質それぞれのマーカーとしてラミンB1及びカルネキシンをモニターするためのウェスタンブロット分析のために並行する培養物回収した。(4B）及び（4D）DNAをHBV特異的DNAプローブを用いたサザンブロットにより分析した。ウイルス蛋白質フリーDNA（蛋白質フリーの弛緩環状DNA [PF-RC DNA]とcccDNA）が示されている。マスマーカーの位置が示されている。下段は、ラミンB1及びカルネキシンの存在量のウェスタンブロットを示す。 図5A～5Fは、F7及びポリ-U/UC PAMP処置がHBV cccDNAを崩壊に向かわせることを示す図である。（5A）HBV感染及び処置スケジュール。0日目にHepG2-hNTCP細胞に1000Geq/細胞のmoiでHBVを感染させ、24時間インキュベートし、培地を交換した。3日目に細胞を回収するか、DMSO、ETV（500 nM）、F7（10 μM）、ポリ-U/UC（100ng/ml）、又はETCとF7又はポリ-U/UC PAMPの組み合わせで処置した。細胞は、20日間の時間経過にわたって、示された時点で回収した。（5B）、（5C）Hirt抽出によりDNAを単離し、HBV-特異的DNAプローブを用いたサザンブロット分析に供した。各レーンの下のパーセント値は、各処置前の3日目のコントロールと比較したcccDNAの相対量を示す。マスマーカーの位置が示されている。（5D）RT-qPCRによりcccDNAレベルを測定した。ミトコンドリアDNA（MT-CO3）に対する相対的なcccDNAの値を示す。統計的有意性はスチューデントのt検定を用いて決定した。データは平均値±標準偏差（SD）で示し、* P < 0.01、** P < 0.005、*** P < 0.001及びns=有意差無しとした。（E）RT-qPCR分析からのcccDNAの半減期は、各処置戦略下での3つの複製物の同時フィッティングから見積もった。C(t)は、処置後の時間「t」におけるcccDNAの％値であり、C(0)は、処置開始時のcccDNAの％値である。（5F）各処置シリーズの時間経過にわたるHBsAg。統計的有意性はスチューデントのt検定を用いて決定した。データは、平均±標準偏差（SD）で示し、** P < 0.005、及びns=有意差無しとした。 図6A～6Dは、F7及びポリ-U/UC PAMPが、RIG-Iを介してIRF3活性化を特異的にシグナルしてHBV cccDNAを抑制することを示す。（6A）F7をHepG2-hNTCP-NT（非標的ガイドRNAを発現）、RKO（RIG-I標的ガイドRNAを発現するRIG-Iノックアウト）、及びMKO（MDA5標的ガイドRNAを発現するMDA5ノックアウト）へ24時間投与した。細胞を回収しイムノブロットで解析した。チューブリンの発現レベルに対するp-IRF3（S386リン酸化、活性IRF3）、IRF3（トータルIRF）、IFIT1、RIG-I、及びMDA5の蛋白質発現のレベルを、それぞれの抗体を用いて測定した。（6B）HepG2-hNTCP-NT、RKO、及びMKO細胞を、100ng/mlのX-RNA又は100ng/mlもしくは200ng/mlのポリ-U/UC PAMPで、24時間処置した。細胞を回収し、（6A）と同様にイムノブロットで分析した。（6C及び6D）細胞に1000Geq/細胞のmoiでHBVを感染させた。24時間後の培養物を、DMSO（-；ネガティブコントロール）、CsA（処置コントロール）、（6C）10μMのF7又は（6D）X RNA又はポリ-U/UC PAMPで処置した。3日後に細胞を回収し、Hirt抽出物を調製し、HBV-DNAプローブを使用するサザンブロット分析に供した。マスマーカーの位置が示されている。各レーンの下の値は、－コントロール処置と比較した残存するcccDNAのパーセントを示す。 図7A～7Cは、初代ヒト肝細胞におけるcccDNAの抑制を示す図である。（7A）PHHを単独で培養するか、100ng/mlのX-RNA（X100）又は50ng/ml（P50）、100ng/ml（P100）又は200ng/ml（P200）のポリ-U/UC PAMPで処置するか、SenV（コントロール）で感染させて、24及び72時間後に回収した。細胞溶解物を、それぞれの抗体を用いて、p-IRF3（S386リン酸化、活性IRF3）、IRF3（トータルIRF3）、IFIT1、及びアクチン（コントロール）についてのイムノブロットにより分析した。（7B）PHH培養物を単独で培養するか、100ng/mlのX-RNA（X100）、又は100ng/ml（P100）又は200ng/ml（P200）のpoly-U/UCPAMPで処置するか、SenV（コントロール）で感染させ、24及び72後に回収した。細胞を回収し、RNAを抽出し、RT-qPCRで分析し、GAPDHの発現レベルに正規化された示された自然免疫遺伝子の発現レベルを測定した。値は、3つの独立した実験からの非処置細胞に対する平均倍率誘導としてヒートマップ上に示される。（7C）PHH培養物に200Geq/細胞のmoiでHBVを接種した。24時間後、培養物をCsA（処置コントロール；10μM）、100ng/mlのX-RNA（X100）、又は100ng/ml（P100）まあ葉200ng/ml（P200）のポリ-U/UC PAMPで処置した。3日後に細胞を回収し、単離Hirt抽出物からDNAを単離し、HBV特異的プローブを用いたサザンブロットにより解析した。ウイルス蛋白質フリーDNA（蛋白質フリーの弛緩環状DNA [PF-RC DNA]とcccDNA）を記した。各レーンの下の値は、非処置－コントロールと比較した残存するcccDNAのパーセントを示すマスマーカーの位置が左側に示されている。 図8A～8Lは、F7及びポリ-U/UCが、差動的な自然免疫遺伝子の発現を誘導することを示す一連のグラフである。HepG2-hNTCP細胞を、SenV（陽性コントロール）で感染させるか、又は示されるようにF7（示されるように5又は10uM）、X-RNA（100ng/ml；X-100及び200ng/ml；X-200）又はポリ-U/UC PAMP 100ng/ml又は200ng/mlで24（黒色カラム）及び72時間（灰色カラム）処置した。細胞は各時点で回収した。全細胞RNAを精製しIFIT1、CXCL10、IFITM1、RSAD2、RIG-I、MDA5、SAMHD1、APOBEC3A、APOBEC3G、IFN-α、IFN-β、及びIFN-λ3などの自然免疫遺伝子パネルの発現レベルを測定するためにRT-qPCR分析に供した。遺伝子発現レベルは、各サンプルのGAPDH発現レベルに対して正規化し、3つの独立した実験から2.5 % DMSO処置（ネガティブコントロール）で達成されたものに対する誘導倍率として表現した。データは、平均±標準偏差（SD）として示され、* P < 0.01、** P < 0.005、*** P < 0.0005、**** P < 0.0001、及びns=有意差無しとした。 図9A～9Eは、F7又はポリ-U/UC PAMPでの処置中の細胞の並列培養におけるHBV複製の動態を示す。（9A）HepG2-hNTCP細胞に1000Geq/細胞のmoiでHBVを感染させた。24時間後、細胞をF7（10μM）（上）、又は100ng/ml X RNA、又は100ng/ml poly-U/UC PAMP（下）で処置した。各時点で細胞を回収し、Hirt上清を調製し、サザンブロット解析に供した。（B）HBV pgRNAをRT-qPCRで解析した。「HBVのみ」の20Dpiからの値をRT-PCR解析において100％とした。データは、平均±標準偏差（SD）として示し、*** P < 0.001、**** P < 0.0001、及びns=有意差無しとした。（9C）10uMのF7（上）又は100ng/mlのXRNA又はポリ-U/UC PAMP（下）で処置した細胞からのHBV細胞内キャプシド関連DNAをサザンブロットにより分析した。（9D）F7（上）又はポリ-U/UC（下）で処置したHBV感染細胞からの分泌HBsAgをELISAにより検出した。（9E）細胞外HBV-DNAを、10uM（左）又は100ng/mlのXRNA又はポリ-U/UC PAMP（右）で処置した細胞からのqPCRにより測定した。データは、3つの独立した実験からの平均±標準偏差（SD）として示されている。*** P = 0.0002。 図10A～10Eは、F7及びポリ-U/UC PAMP処置のCC₅₀分析をグラフで示したものである。HepG2-NTCP細胞（10A及び10C）、dHepaRG（10B及び10D）、及びPHH（10E）を、漸増用量のF7又はポリ-U/UC PAMPで72時間処置した。細胞生存率は、ATP含量を測定することにより同時に測定し、値はモック処置細胞に対して正規化した。グラフは、3つの独立した実験のそれぞれにおける3重のサンプルの平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。ns=有意差無し。 図11は、cccDNAの半減期を示す図である。HepG2-NTCP細胞に3dpiで1000Geq/細胞でHBVを感染させ、培養物を未処理のままにするか、又は毎日培地を新鮮な培地のみ又はETVを含むものと交換することにより、50日間の全時間経過を通してETV（500nM）で処理した。細胞を指定された時点で回収し、DNAをHirt抽出物から単離し、HBV特異的プローブを用いたサザンブロットにより分析した。各レーンの下のパーセンテージ値は、3日目のレベルと比較して存在するcccDNAの相対量を示す。 図12は、RIG-I（RKO）又はMDA5（MKO）又は非標的ガイドRNA（NT）コントロールを標的とするCRISPR/Cas9ガイドRNAコンストラクトで形質導入したHepG2-hNTCP細胞の免疫ブロット分析である。細胞は100 U/mlのIFN-βで24時間処置した。細胞溶解物を調製しイムノブロットで解析した。RIG-I、MDA5、及びIFIT1及びチューブリン（ハウスキーピング蛋白質コントロール）のレベルをそれぞれの抗体を用いて測定した。

詳細な説明

B型肝炎ウイルス（HBV）は、持続感染、慢性肝炎、及び肝疾患を媒介する。HBVの共有結合閉環DNA（cccDNA）は、その除去がHBV治癒の礎と考えられているように、ウイルスの持続性の中心である。また、感染した肝細胞の病原体認識受容体（PRR）による検出がうまくいかず、自然免疫の活性化やインターフェロン制御因子3（IRF3）による抗ウイルス遺伝子発現の誘導が回避され、HBVの持続が促進される。本発明者らは、上記の課題に鑑み、自然免疫をシグナル伝達するPRRであるRIG-Iの誘導シグナルについて、cccDNAを抑制する能力を評価した。以下に詳述するように、2種類の異なるRIG-Iアゴニスト、「F7」と呼ばれる低分子化合物、及び5'-三リン酸ポリ-U/UC病原体関連分子パターン（PAMP）RNAを、概念実証のために採用した。HBV感染細胞のF7とポリ-U/UC PAMPによる処置は、IRF3活性化のRIG-Iシグナルを誘導し、cccDNA形成の抑制と確立したcccDNAの崩壊促進のための抗ウイルス遺伝子を誘導し、エンテカビルの作用に相加的であった。この研究は、RIG-I経路の誘導などによるIRF3の活性化が、自然免疫作用を誘導し、cccDNAの排除に向けた治療効果を提供することを実証している。

上記に従って、1つの局面において、本明細書は、感染細胞におけるB型肝炎ウイルス（HBV）共有結合閉環DNA（cccDNA）レベルを抑制するための方法を提供する。本方法は、感染細胞においてインターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化を誘導する薬剤と、感染細胞を接触させる工程を含む。

上記に示したように、B型肝炎ウイルスDNAは、感染細胞の核内でウイルスヌクレオカプシドから放出される。このウイルスDNAは、弛緩環状DNA（RC DNA、relaxed circular DNA）としてウイルスカプシドから放出される。RC DNAは共有結合閉環DNA（cccDNA、covalently closed circular DNA）に変換され、プレゲノミック（pg）RNA、プレS、S、XウイルスRNAを含む全てのHBV RNA転写物の合成のための主要テンプレートとなる。cccDNAは細胞内増幅経路を通して細胞内で複製され得る。cccDNAは、比較的長寿命であり、治療後であっても、長期的な慢性感染の基礎となり得る。本明細書で使用される用語「cccDNAを抑制する」は、感染細胞における新しいcccDNAの形成を阻害することを含む。「cccDNAを抑制する」という用語は、接触工程の前の感染細胞内の既存のcccDNAの安定性を低下させることも含み得る。安定性の低下は、cccDNAの半減期を減少させることにつながり得る。低下した安定性は、感染細胞内のcccDNAのレベルの減少によって観察され得る。いくつかの実施形態では、cccDNAのレベルの減少は、HBVにも感染している感染細胞（例えば、同じ系統又は組織型のもの）に対する相対的なものである。低下は、約5％低下、約10％低下、約15％低下、約20％低下、約25％低下、約30％低下、約35％低下、約40％低下、約45％低下、約50％低下、約55％低下、約60％低下、約65％低下、約70％低下、約75％低下、約80％低下、約85％低下、約90％低下、約95％低下、約97％低下、約99％低下、及び感染細胞におけるcccDNAレベルの全撲滅のような、任意の検出可能な低下でありえる。

細胞は、HBVに感染している任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、感染細胞は、肝細胞である。

ウイルス感染に対する自然免疫応答の重要な構成要素は、インターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化である。IRF3は、抗ウイルス遺伝子の発現を誘導し、またIFNを誘導する。抗ウイルス遺伝子は感染細胞でのウイルス複製を抑制し、IFNは抗ウイルス作用や免疫調節作用を持つ数百のインターフェロン刺激遺伝子（ISG）の発現を通じて、感染細胞と隣接するバイスタンダー細胞の両方でウイルス複製の抑制を誘導する。IFNによるウイルス感染の抑制に加え、ウイルス感染細胞のプログラム死は、ウイルスの拡散を防ぐ役割を果たすことができる。従って、得られるIFN作用及び細胞死シグナル伝達を含むIRF3作用の組み合わせは、多くのウイルスのためのウイルス制御の相乗的なプログラムを付与する。本明細書は、この経路が、典型的にはそのようなIRF3作用の誘発を回避するHBCに対して活用され得るという実証に部分的に基づいている。

いくつかの実施形態では、IRF3活性化を誘導する薬剤は、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）様受容体（RLR）シグナル伝達経路を誘導することによって間接的にIRF3活性化を誘導する。RLRは、RNAウイルス感染を認識するためのPRRとして機能する細胞質RNAヘリカーゼである。RLRには、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）、MDA5 （メラノーマ分化関連遺伝子5）、LGP2（ラボラトリーオブジェネティクスアンドフィジオロジー2）を含む。RIG-IとMDA5がタンデムアミノ末端カスパーゼ活性化及びリクルートメントドメイン（CARD）をコードしているのに対し、LGP2はCARDを欠き、RIG-IやMDA5によって開始されるシグナル伝達を制御する役割を果たすと考えられる。RIG-Iは、ウイルスのPAMP RNAを認識し結合した後、アダプター蛋白質であるミトコンドリア抗ウイルスシグナル（MAVS、IPS 1/VISA/Cardifとしても知られる）を介してシグナルを伝達する。RLRによる下流シグナル伝達は、インターフェロン制御因子（IRF）-3及びNF-κBを含む潜在的な転写因子の活性化を誘導し、感染細胞からのI型インターフェロン（IFN）の産生をもたらす。当業者であれば、既知の下流RLR調節遺伝子の転写をアッセイすることなどにより、RLR経路の活性化を容易に測定できるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、RLR活性化は、IFN-β又はISG54発現の増加によって実証できる。別の実施形態では、RLR活性化は、IRF-3リン酸化の増加によって実証できる。従って、いくつかの実施形態では、RLRシグナル伝達経路は、RIG-I、メラノーマ分化関連遺伝子5（MDA5）、ラボラトリーオブジェネティクスアンドフィジオロジー2（LGP2）、及び/又はミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達（MAVS）蛋白質を含む。

いくつかの実施形態では、RIG-Iシグナル伝達を誘導する薬剤は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含む。本明細書の開示によって包含される例示的なPAMP及びPAMP含有核酸分子は、U.S. Pub. Nos. 2015/0017207及び2018/0104325に開示されており、これらは自然免疫応答シグナル伝達のPAMP誘導を扱っており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書の開示によって包含されるPAMP含有核酸の要素及び例示的な実施形態はここで扱われる。

予備的事項として、本明細書で使用される用語「核酸」は、モノマー単位のポリマー又は「残基」を指す。核酸のモノマーサブユニット又は残基は、それぞれ、窒素塩基（即ち、ヌクレオベース）、5炭糖、及びリン酸基を含む。各残基の同一性は、典型的には、各残基の核酸塩基（又は窒素塩基）構造の同一性を参照して本明細書に示される。カノニカル核酸塩基としては、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、ウラシル(U)（RNAにおいてチミン(T)残基の代わりに）、及びシトシン(C)を含む。しかしながら、本明細書に開示される核酸は、当技術分野でよく知られているように、任意の修飾ヌクレオベース、ヌクレオベースアナログ、及び/又は非カノニカルヌクレオベースを含むことができる。核酸モノマー又は残基の修飾は、非カノニカルサブユニット構造をもたらす核酸モノマー又は残基の構造における任意の化学変化を包含する。そのような化学変化は、例えば、エピジェネティック修飾（例えば、ゲノムDNA又はRNAに対する）、又は放射線、化学的、又は他の手段に起因する損傷に起因し得る。修飾に起因し得る非カノニカルサブユニットの例示的かつ非限定的な例としては、ウラシル（DNA用）、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルメチルシトシン、5-カルボキシシトシンb-グルコシル-5-ヒドロキシ-メチルシトシン、8-オキソグアニン、2-アミノ-アデノシン、2-アミノ-デオキシアデノシン、2-チオチミジン、ピロロ-ピリミジン、2-チオシチジン、又はアベーシックリージョンを含む修飾に起因し得る。アベーシックリージョンは、デオキシリボース骨格に沿った位置にあるが、塩基を欠く。天然ヌクレオチドの既知のアナログは、ペプチド核酸（PNAs）やホスホロチオエートDNAなど、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする。

核酸の種類によって、核酸が結合している5炭糖は異なることがある。例えば、糖は、DNAではデオキシリボースであり、RNAではリボースである。また、本明細書のいくつかの実施形態では、核酸残基はヌクレオシド構造に関して、アデノシン、グアノシン、5-メチルウリジン、ウリジン、及びシチジンなどを参照できる。さらに、ヌクレオシドの代替的な命名法はまた、5炭糖の種類を推論するために、ヌクレオベースの前に「リボ」又は「デオキシロボ」接頭辞を示すことを含む。例えば、本明細書で時折使用される「リボシトシン」は、その残基におけるRNA分子中のリボース糖の存在を示すので、シチジン残基に相当する。核酸ポリマーは、デオキシリボヌクレオチド（DNA）ポリマー、mRNAを含むリボヌクレオチド（RNA）ポリマーであるか、又はそれらを含む。また、核酸はPNAポリマー、又は本明細書に記載されたポリマータイプのいずれかの組み合わせ（例えば、異なる糖を有する残基を含む）であるか、又はそれらを含む。

いくつかの実施形態では、PAMP含有核酸は合成である。この文脈では、「合成」という用語は、核酸の非天然の性質を指す。そのような核酸は、標準的な合成技術を用いてデノボで合成できる。あるいは、核酸PAMPsは、当該技術分野で周知の組換え技術を用いて、天然に存在する病原体配列から生成されるか、又は由来できる。いくつかの実施形態では、合成核酸PAMPコンストラクトの配列は、天然に生じない。

いくつかの実施形態では、PAMP含有核酸はRNAコンストラクトである。これらのいくつかの実施形態において、PAMP含有核酸は、HCVポリ-U/UC領域に由来するか、又はその配列を反映しており、この文脈では、典型的には、ポリ-U/UC PAMP RNAコンストラクトと呼ばれることがある。いくつかの実施形態では、ポリ-U/UC PAMP RNAコンストラクトは合成である。

本明細書の開示のPAMP含有核酸は、典型的には、(a)末端三リン酸（「ppp」又は「3 x p」）を含む5'-アーム領域、(b)ポリ-ウラシルコア（ポリ-Uコアとも呼ばれる）、及び(c)3'-アーム領域を含む。一実施形態では、3つの領域（a、b、及びc）は、単一核酸ポリマーマクロ分子内で共有結合で連結している。共有結合は、直接的（間に介在するリンカー配列なし）又は間接的（間に介在するリンカー及び/又は配列あり）であり得る。一実施形態では、5'-アーム領域は、ポリ-Uコアの5'-末端に共有結合で連結している。一実施形態では、3'-アーム領域は、ポリ-Uコアの3'-アーム領域に共有結合で連結している。ポリマーは、一本鎖又は二本鎖であり得、又は一本鎖部分と二本鎖部分の組み合わせで示され得る。

一実施形態では、ポリ-Uコアは、少なくとも8個の連続するウラシル残基を含む。さらなる実施形態では、ポリ-Uコアは、8～60個の連続するウラシル残基（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、及び60個の連続するウラシル残基）を含む。一実施形態では、ポリ-Uコアは、8個超の連続するウラシル残基を含む。一実施形態では、ポリ-Uコアは、12個以上の連続するウラシル残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリ-Uコアは、複数の連続するウラシル残基、例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、及び60個の連続するウラシル残基からなる。

一実施形態では、3'-アーム領域は、ウラシル残基ではない5'-最末端核酸残基を含む。代わりに、3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基は、アデニン残基、グアニン残基、又はシトシン残基、又は任意の非カノニカル残基であり得る。一実施形態では、3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基は、シトシン残基、グアニン残基、又はアデニン残基である。

一実施形態では、3'-アーム領域のヌクレオチド組成物は、少なくとも約40％がウラシル残基である。いくつかの実施形態では、3'-アーム領域は、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、又は少なくとも約95％がウラシル残基である。一実施形態では、3'-アーム領域は、連続したウラシル残基の複数のショートストレッチ（例えば、長さが約2～約15ヌクレオチド）を含み、それらの間に1つ以上のシトシン残基が散在する。一実施形態では、3'-アーム領域は、連続したウラシル残基の複数の短いストレッチ（例えば、長さが約2～約15ヌクレオチド）を含み、それらの間に1つ以上のグアニン残基が散在する。一実施形態では、3'-アーム領域は、連続しウラシル残基の複数の短いストレッチ（例えば、長さが約2～約15ヌクレオチド）を含み、それらの間に1つ以上のアデニン残基が散在する。一実施形態では、3'-アーム領域は、合成PAMP含有核酸分子のポリ-Uコアの長さを超えない連続したウラシル残基のストレッチを含む。一実施形態では、3'-アーム領域は、合成PAMP含有核酸分子のポリ-Uコアの長さに等しい及び/又はそれを超える連続したウラシル残基のストレッチを含まない。いくつかの実施形態では、3'-アーム領域は、少なくとも7個の連続するウラシル残基（例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、又は29個の連続するウラシル残基）を含む。

最小では、5'-アーム領域は、末端三リン酸（ppp）部位からなる。そのような実施形態では、三リン酸塩は、合成PAMP含有核酸分子の5'-末端にあり、「5'-ppp」として表すことができる。さらなる実施形態では、末端三リン酸は、ポリ-Uコア配列の5'-末端に直接連結されている。別の実施形態では、5'-アーム領域は、5'-末端三リン酸及び1つ以上の追加の核酸残基を含み、その配列は3'-末端で終結する。本実施形態の5'-アーム領域の1つ以上の追加の核酸残基は、末端三リン酸及びポリ-Uコアの5'-最末端ウラシル残基の間に配置される。当業者は、5'-アーム領域の1つ以上の追加の核酸残基は、任意の数の核酸残基であり得、制限なく任意の配列で示し得ることを容易に理解し得る。5'-アーム領域における1つ以上の追加の核酸残基の配列は、PAMP含有核酸分子の機能性に影響を与えない。例えば、U.S. Pub. Nos. 2015/0017207及び2018/0104325に記載されているように、5'-三リン酸（HCV X領域など）を含む非刺激性核酸へのポリ-Uコア領域の付加は、自然免疫系シグナル伝達のための刺激特性を与える。一実施形態では、5'-アーム領域の1つ以上の追加の核酸残基の配列は、HCV株のポリ-U/UC領域のポリUコアに対して「上流」または5'に天然に生じる、天然に生じるHCVゲノム配列の5'-末端部分全体からならない。別の言い方をすれば、この実施形態では、合成PAMP含有核酸分子全体は、5'三リン酸、コーディング領域全体、及び非翻訳3'ポリ-U/UC領域を完全に備えた、天然に生じるHCVゲノムではない。従って、この実施形態では、5'-アーム領域、5'-アーム領域の1つ以上の核酸残基、及びポリ-ウラシルコアは、HCVゲノム中に一緒に天然に生じない。しかしながら、本実施形態では、5'-アーム領域の1つ以上の核酸残基は、5'-アーム領域とポリ-ウラシルコアとの間に存在する天然に生じる配列全体のサブフラグメントを含み得るか、又はからなり得る。あるいは、本実施形態では、5'-アーム領域の1つ以上の核酸残基は、5'-末端とポリ-ウラシルコアとの間に存在する天然に生じるHCVゲノム配列の一部又は全体に加えて配列を有する。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも16ヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも約16ヌクレオチド～約1000ヌクレオチドの配列、例えば、約20～約1000ヌクレオチドの間、約30～約1000ヌクレオチドの間、約40～約1000ヌクレオチドの間、約50～約1000ヌクレオチドの間、約60～約1000ヌクレオチドの間、約70～約1000ヌクレオチドの間、約80～約1000ヌクレオチドの間、約90～約1000ヌクレオチドの間、約100～約1000ヌクレオチドの間、約150～約1000ヌクレオチドの間、約200～約1000ヌクレオチドの間、約250～約1000ヌクレオチドの間、約300～約1000ヌクレオチドの間、約350～約1000ヌクレオチドの間、約400～約1000ヌクレオチドの間、約450～約1000ヌクレオチドの間、約500～約1000ヌクレオチドの間、約550～約1000ヌクレオチドの間、約600～約1000ヌクレオチドの間、約650～約1000ヌクレオチドの間、及び700～約1000ヌクレオチドの間、及びそれらの任意の数又は範囲を含む。さらなる実施形態では、核酸は、約20～約100ヌクレオチドの間、約30～約100ヌクレオチドの間、約40～約100ヌクレオチドの間、約50～約100ヌクレオチドの間、約60～約100ヌクレオチドの間、約70～約100ヌクレオチドの間、約80～約100ヌクレオチドの間、及び約90～約100ヌクレオチドの間、及びそれらの任意の数又は範囲含む。いくつかの実施形態では、核酸は、約16と約60ヌクレオチドの間、例えば、約16と約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、及び60ヌクレオチドの間を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、及び60までのヌクレオチドを有し、3'-アームは、複数の短いストレッチ間に介在する1以上のシトシン又はグアニン残基を伴う2～15個の連続したウラシル残基の複数の短いストレッチを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、最大53ヌクレオチドを有し、3'-アーム領域は、少なくとも60％のウラシル残基を有する。

開示されたPAMP含有核酸が包含するPAMPの核酸配列の非限定的な例は、U.S. Pub. Nos. 2015/0017207及び2018/0104325及びSaito, T., et al. (2008). Innate immunity induced by composition-dependent RIG-I recognition of hepatitis C virus RNA. Nature 454, 523-527; and Schnell, G., et al. (2012). Uridine composition of the poly-U/UC tract of HCV RNA defines non-self recognition by RIG-I. PLoS pathogens 8, e1002839（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、配列番号34～132として本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、PAMP含有核酸は、配列番号34～123で開示された配列のいずれかにおけるポリ-Uコア領域及び/又は3'-アーム領域のいずれかから独立して選択されるポリ-Uコア領域及び/又は3'-アーム配列を含む。これらの例示的な非限定的配列は、以下の表1にも提供される。開示されたPAMP含有核酸は、本明細書に記載された配列のいずれかを含んでもよい。そのような例示的なPAMP含有核酸は、末端三リン酸（ppp）部位を有する、本明細書に記載されているような、PAMP含有分子の一般的な構造パラメータに従うであろうことが理解されるであろう。一実施形態では、PAMP含有分子は、以下の配列を含む。GGCCAUCCUGUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUCUCCUUUUUUUUUCCUCUUUUUUUCCUUUUCUUUCCUUU (配列番号124)。別の実施形態では、PAMP含有核酸は、以下の配列を含む。GGCCAUUUUCUUUUUUUUUUCUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUAUUUUCUUUAAU (配列番号125)。繰り返しになるが、示された配列を有する例示的なPAMP含有核酸はまた、5'-末端三リン酸（ppp）部位を含む上記の特徴を有することが理解されるであろう。

U.S. Pub. Nos. 2015/0017207及び2018/0104325に記載されているように、ポリウラシルコア配列を有するHCV由来のRNA PAMPsを有する核酸は、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）様受容体（RLR）シグナル伝達を誘発し得る。従って、いくつかの実施形態では、PAMP含有核酸分子は、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）様受容体（RLR）活性化を誘発できる。一実施形態では、RLRはRIG-Iである。当業者は、以下にさらに詳細に記載されるように、例えば、既知の下流のRLR制御遺伝子の転写をアッセイすることによって、RLRの活性化を容易に測定できるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、RLRの活性化は、IFN-β又はISG54発現の増加によって実証され得る。別の実施形態では、RLR活性化は、IRF3リン酸化の増加によって実証され得る。

いくつかの実施形態では、PAMP含有核酸分子は、RLR活性化の誘導をもたらすために、約80ng/ml以上の濃度で細胞に接触させる。 従って、いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約80ng/ml～約500ng/mlの濃度、例えば、100ng/ml～250ng/mlの濃度で、PAMP含有核酸分子薬剤を細胞に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約110ng/mL、約120ng/mL、約130ng/mL、約140ng/mL、約150ng/mL、約160ng/mL、約170ng/mL、約180ng/mL、約190ng/mL、約200ng/mL、約210ng/mL、約220ng/mL、約230ng/mL、約240ng/mL、約250ng/mL、約260ng/mL、約270ng/mL、約280ng/mL、約290ng/mL、約300ng/mL、約310ng/mL、約320ng/mL、約330ng/mL、約340ng/mL、約350ng/mL、約360ng/mL、約370ng/mL、約380ng/mL、約390ng/mL、約400ng/mL、約410ng/mL、約420ng/mL、約430ng/mL、約440ng/mL、約450ng/mL、約460ng/mL、約470ng/mL、約480ng/mL、約490ng/mL、及び約500ng/mLの濃度でPAMP含有核酸分子を細胞に接触させる工程を含む。

いくつかの実施形態では、薬剤は、低分子薬剤であるか、又は含む。当業者であれば、RLR及び/又はIRF3シグナル伝達経路を誘導する低分子薬剤を容易に同定できる。本明細書の開示に包含されるRLRシグナル伝達経路及び/又はIRF3シグナル伝達経路を誘導する例示的な低分子アゴニストは、例えば、Bedard, K.M., et al. (2012). Isoflavone agonists of IRF-3 dependent signaling have antiviral activity against RNA viruses. Journal of virology 86, 7334-7344; Pattabhi, S., et al. (2016). Targeting Innate Immunity for Antiviral Therapy through Small Molecule Agonists of the RLR Pathway. Journal of virology 90, 2372-2387; Probst, P., et al. (2017). A small-molecule IRF3 agonist functions as an influenza vaccine adjuvant by modulating the antiviral immune response. Vaccine 35, 1964-1971に記載され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、低分子薬剤は、ベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む。例示的な分子は、US 9884876に開示されている。後述の研究において概念実証として使用された1つの特定の実施形態では、低分子剤は、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを有する。本明細書では、この低分子薬剤を「F7」と称し、以下の構造を有する。
(F7)

いくつかの実施形態では、本方法は、感染細胞においてIRF3活性化を誘導する2種以上の薬剤と感染細胞を接触させる工程を含む。2種以上の薬剤（例えば、第1の薬剤、第2の薬剤、第三の薬剤など）は、単一の混和物に配合される場合など、一緒に細胞に接触させることができ、又は各薬剤の効果が重複する時間枠で細胞内に提示されるように調整された別々の投与で、細胞に接触させることも可能である。2種以上の薬剤は、例えば、PAMP含有核酸と低分子薬剤とを含み得る。PAMP含有核酸及び低分子薬剤の各々は、より詳細に上述したような各薬剤の特徴及び実施形態を包含できる。例えば、1つの例示的な実施形態において、2種以上の薬剤は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸を含み、ここで、PAMPは、末端三リン酸を含む5'-アーム領域、少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、を含む。さらに、この例示的な実施形態における低分子薬剤は、ベンゾチアゾール誘導体分子、例えば、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む低分子であるか又は含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、上記のように、感染細胞においてIRF3活性化を誘導する少なくとも1種の薬剤に加えて、逆転写酵素阻害剤と細胞を接触させる工程をさらに含む。例示的な逆転写酵素阻害剤は、ヌクレオチド又はヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NTRI）を含み得、これらは、ウイルスDNAを合成するために必要な天然に存在するヌクレオチド又はヌクレオシドのアナログである。NTRIは、増殖するウイルスDNAに取り込まれるために、天然のデオキシヌクレオチドと競合する。しかし、構造の違い（例えば、3'ヒドロキシル基の欠如）により、次にやってくるヌクレオチドが鎖の延長に必要なホスホジエステル結合を形成できないため、鎖の延長が阻害される。本明細書の開示に包含される例示的な非限定的NTRIには、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどを含む。当業者は、本明細書に開示された方法の実行のために、他の適切な逆転写酵素阻害剤を選択できる。

特定の実施形態において、本方法は、細胞を、
(1)病原体関連分子パターン(PAMP)を含む核酸分子であって、PAMPが、
末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び
詳細を上述した、少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
を含む、核酸分子、
(2) N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドなどのベンゾチアゾール誘導体分子などの低分子薬剤、及び
(3)ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選ばれるようなNRTI、
のうちの2以上と接触させる工程を含む。

特定の実施形態では、本方法は、上記のような病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子、及びラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選ばれたNRTIと感染細胞とを接触させる工程を含む。上記に示したように、複数の薬剤（NRTIを含む）、は、組み合わせ又は混合物で配合することができ、又は、それぞれが重複する時間枠で細胞内でその効果を発揮するように、別々に、しかし協調的に接触させることができる。以下により詳細に説明するように、記載された薬剤の同時投与は、感染細胞におけるcccDNAの抑制に対する相乗的な効果をもたらす。

上述した方法は、培養維持された感染細胞に適用される、インビトロの方法とできる。そのような実施形態において、本方法は、cccDNAの抑制に対するさらなる寄与のために、潜在的な抗ウイルス剤をスクリーニングすることを含み得る。

あるいは、本方法は、HBC感染を有する、又はHBV感染を有することが疑われる、又はHBV感染を有する危険性がある対象で実施されるインビボ法であり得る。従って、別の態様において、本明細書は、それを必要とする対象においてB型肝炎ウイルス（HBV）感染を治療又は予防する方法を提供する。本方法は、対象の感染細胞においてインターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化を誘導する組成物の治療上有効量を、対象に投与する工程を含む。

本明細書で使用される用語「治療する（treat）」は、対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物、例えば、別の霊長類、馬、犬、マウス、ラット、モルモット、ウサギなど）の疾患、障害又は状態（例えば、上記のHBV感染）の医療的管理を指す。治療は、疾患又は状態（例えば、HBV感染）の治療又は改善における成功の任意の指標を包含し得る。この文脈では、用語「」は、病原体（例えば、B型肝炎ウイルス）のコロニー形成の感染を防止又は抑制することを指す。さらに、用語「治療する」は、既に始まっている感染症に対処するなどの治療的使用を指す。一実施形態では、用語「治療する」は、宿主に活性病原体（例えば、B型肝炎ウイルス）が残らない程度に感染を治癒させることを意味する。別の実施形態では、用語「治療する」は、病原体（例えば、B型肝炎ウイルス）の複製速度を遅くする又は阻害するなどの、体内での感染の広がりを遅くする又は阻害することも包含する。この用語はまた、細胞（又は宿主組織もしくは体）内の病原体負担を軽減することを包含する。いくつかの実施形態において、これは、身体の細胞におけるcccDNAレベルを低下させることを包含する。この用語はまた、開示された薬剤を投与せずに病原体を除去するために宿主の内因性免疫応答が必要とする期間と比較して、病原体のクリアランスの速度を加速させることを包含する。症状の治療又は改善は、医師による検査の結果を含む、客観的又は主観的なパラメータに基づくことができる。従って、「治療する」という用語は、疾患又は状態（例えば、HBV感染）に関連する症状又は状態の緩和、又は発症の阻止もしくは抑制のために、本明細書の開示において開示される薬剤又は組成物を投与することを含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患もしくは状態、疾患もしくは状態の症状、又は疾患もしくは状態の副作用の改善、軽減、もしくは除去を指す。用語「治療上有効」は、治療効果をもたらし、容易に決定できる組成物の量を指す。

特定の実施形態では、組成物は、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含む。PAMPは、末端三リン酸を含む5'-アーム領域、少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域を含み得る。この態様に包含されるPAMP及び/又はPAMPを含む核酸の追加の実施形態及び特徴は、より詳細に上述されているため、ここでは繰り返さない。

別の実施形態では、組成物は、RIG-Iシグナル伝達を誘導する低分子薬剤であるか、又は含む。いくつかの実施形態では、低分子薬剤は、N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドなどのベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む。この態様に包含される低分子薬剤の追加の実施形態及び特徴は、より詳細に上述されているため、ここでは繰り返さない。

いくつかの実施形態では、組成物は、2種以上の治療薬（例えば、第1剤、第2剤などを含む）の混和物として製剤化される。あるいは、本方法は、別々の組成物（例えば、独立して第1の薬剤、第2の薬剤などを含む）を対象に投与することを含み得る。別々の投与は、それぞれの組成物の効果が対象において重複する時間枠で実現されるように、同時でるか又は調整できる。

組み合わせの実施形態の代表例は、第1の薬剤及び第2の薬剤（同じ組成物又は異なる組成物）の治療上有効量を対象に投与する工程を含む方法であって、
第1の薬剤が、末端三リン酸を含む5'-アーム領域、少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域、を含む核酸分子であるか、又は含み、ここで、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基であり、及び
第二の薬剤が、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む低分子などのベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む。

本方法はまた、対象に他の抗ウイルス療法、例えば、HBV感染を治療するための既知の療法を投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、治療方法は、上記のように、感染細胞においてIRF3活性化を誘導する少なくとも1種の薬剤に加えて、逆転写酵素阻害剤の治療上有効量を対象に投与する工程をさらに含む。例えば、本方法は、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選ばれるNRTIなどの治療量を投与する工程をさらに含み得る。

特定の実施形態では、本方法は、第1の薬剤及び第2の薬剤（単一の組成物中又は別々の組成物中）の治療上有効量を対象に投与する工程を含み、
第1の薬剤は、
末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリウラシルコア、及び
少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
を含む核酸分子であるか、又は含み、及び
第2の薬剤は、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどのNRTIであるか、又は含む。さらなる実施形態では、NRTIは、エンテカビル又はレムデシビルである。

いくつかの実施形態では、組成物（composition）又は組成物（compositions）は1回のみ投与される。代替的に、組成物（composition）又は組成物（compositions）は、医療専門家によって確立されたスケジュールに従って複数回投与される。スケジュールに影響を与える要因としては、観察されたcccDNAレベル、治療に対する耐性などを含む。

別の態様において、本明細書は、B型肝炎ウイルス（HBV）を治療するために製剤化された治療用組成物を提供する。この態様はまた、対象におけるHBV感染を治療及び/又は予防するために開示された治療用組成物を投与する方法を包含する。

この局面の治療用組成物は、RIG-Iアゴニスト、細胞内送達のためのビヒクル、及び薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、RIG-Iアゴニストは、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子である。核酸分子及びPAMPの特定の例示的な実施形態は、上記でより詳細に記載されており、この態様に包含される。他の実施形態では、RIG-Iアゴニストは、ベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む。例示的な実施形態は、上記でより詳細に記載されており、この態様に包含される。一実施形態では、RIG-Iアゴニストは、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む。

活性剤（agent）又は活性剤（agents）は、細胞内送達を促進するためにビヒクルに組み入れることができる。様々な治療用送達ビヒクル又はシステムが知られており、治療用組成物に適用できる。送達ビヒクル又はシステムは、例えば、抗原の送達に有利なエマルション、マイクロ粒子、免疫刺激複合体（ISCOMs）、ナノ粒子（例えば、粒子及び/又はマトリックスであり得る）、マイクロスフィア、リポソーム、ナノカプセルなどの粒子製剤を含み得る。このような送達ビヒクルの製剤化及び使用は、公知及び従来の技術を使用して実施できる。一実施形態では、開示されたPAMP含有核酸及び任意の追加の治療剤は、リポソーム送達ビヒクルに製剤化される。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造体である。多層膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰な水溶液に懸濁されると、自然に形成される。リポソームは、リン脂質が過剰な水溶液に懸濁することで自然に形成され、脂質成分は自己再配置を経て閉鎖構造を形成し、溶解した溶質を含む溶液を脂質二重層内及び/又は脂質二重層間で包み込む。リポソーム製剤の例示的な適用は、Yallapu, U., et al., Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review, Pharmaceutics 9(2):12 (2017)に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

上記の組成物又は治療の態様及び実施形態のいずれかにおいて、組成物又は薬剤は、既知の方法に従って、所望の治療投与のために適切に製剤化される。例えば、組成物は、既知の方法に従って、好ましい投与経路のために適切に製剤化され得る。医薬組成物は、全身投与の任意の経路（例えば、筋肉内、皮内、皮下、経皮、静脈内、腹腔内、頭蓋内、鼻腔内、粘膜、肛門、膣、口腔、又は頬の経路であり、それらは吸入され得る）による送達のために製剤かすることができる。特定の投与経路は、少なくとも自然免疫応答の要素を誘導することを意図した医薬組成物に特に適切である。特に、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、及び静脈内投与が特に適切である。

治療用組成物の導入に適した製剤は、投与経路によって異なる。非経口投与、例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、鼻腔内、及び皮下経路による投与に適した製剤は、水性及び非水性で等張の滅菌注射液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る）、及び懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液を含み得る。製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は複数回投与用密封容器で提示できる。

フリーベース又は薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合した水中で調製できる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、並びに油中に調製できる。通常の保管及び使用条件下では、このような製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含み得る。注射用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即席調製用の滅菌粉末を含む（U.S. Pat. No. 5,466,468、特に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。全ての場合において、形態は無菌であるべきであり、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動的であるべきである。それは、生産及び保管の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌のような微生物のコンタミネーション作用に対して保存されるべきものである。

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、マンニトール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び/又は植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコート剤の使用、分散液の場合の必要な粒子径の維持、界面活性剤の使用などによって維持できる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの各種抗菌剤、抗真菌剤によって促進できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。

フレーズ「薬学的に許容される」は、対象（例えば、ヒト）に投与されたときにアレルギー性又は類似の不快な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

全般的な定義
本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本明細書に開示された技術に熟練した者にとって同じ意味を有する。技術の定義及び用語について、実務者は、特に、Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010), Coligan, J.E., et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (2010), Mirzaei, H. and Carrasco, M. (eds.), Modern Proteomics - Sample Preparation, Analysis and Practical Applications in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer International Publishing, 2016, and Comai, L, et al., (eds.), Proteomic: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology, Springer International Publishing, 2017を参照。

便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で採用される特定の用語は、ここに提供される。定義は、特定の実施形態を説明することを助けるために提供され、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、請求された発明を限定することを意図していない。

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを参照することが明示的に示されているか、又は代替物が相互に排他的である場合を除き、「及び/又は」を意味するために使用されるが、本明細書の開示は代替物のみ及び「及び/又は」を参照する定義を支持する。特許請求の範囲又は明細書中で、「含む」という言葉と一緒に使用される「a」及び「an」という言葉は、特に明記されていない限り、1つ以上のものを意味する。

文脈から明らかに別の意味を要求されない限り、明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含むcomprise）」、「含む（comprising）」などの単語は、「含むが、限定されない」の意味で示される、排他的な意味とは対照的な包括的な意味又は網羅的な意味で解釈されるべきである。また、単数又は複数の数を使用する語は、それぞれ複数形及び単数形を含む。また、本願明細書において、「ここで」、「上述」、「後述」、及びこれらに類する語は、本願明細書の特定の部分を指すのではなく、全体としての本願明細書を指す。「約」の単語は、記載された参照番号の上又は下のマイナーバリエーションの範囲内の番号を示す。例えば、いくつかの実施形態において、「約」という単語は、記載された参照番号の上及び/又は下に10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%の範囲内の数字を指す。

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」又は「蛋白質」は、モノマーがアミド結合を介して一緒に結合したアミノ酸残基であるポリマーを指す。アミノ酸がアルファ-アミノ酸である場合、L-光学異性体又はD-光学異性体のいずれかを使用することができ、L-光学異性体が好ましい。本明細書で使用される用語ポリペプチド又は蛋白質は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖蛋白質のような修飾された配列を含む。ポリペプチドという用語は、天然に生じる蛋白質だけでなく、組換え又は合成で生産された蛋白質もカバーすることを特に意図している。

本明細書に開示の方法及び組成物の製品のために使用できる、と一緒に使用できる、の調製に使用できる、又はである材料、組成物、及びコンポーネントが開示される。これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されている場合、これらの化合物のいかなる単一の組み合わせ及び順列への具体的な言及が明示的に開示されていなくても、様々な個々の組み合わせ及び集合的な組み合わせのそれぞれが具体的に企図されていることが理解されよう。この概念は、本明細書に開示の全ての側面に適用され、記載された方法の工程を含むが、これらに限定されない。従って、任意の前述の実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせたり、置換したりできる。例えば、実行可能な様々な追加工程がある場合、これらの追加工程の各々は、開示された方法の任意の特定の方法の工程又は方法の工程の組み合わせで実行可能であり、そのような組み合わせ又は組み合わせのサブセットの各々は、具体的に企図されており、開示されているとみなされるべきであることが理解される。さらに、本明細書に記載された実施形態は、本明細書の他の場所に記載されたもの、又は当技術分野で知られているものなど、任意の適切な材料を用いて実施できることが理解される。

本明細書で引用された出版物及び引用された主題は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

以下の実施例は、本明細書に開示されている特定の特徴及び/又は実施形態を説明するために提供される。この実施例は、説明された特定の特徴又は実施形態に本発明を限定するように解釈されるべきではない。

実施例1
本実施例は、RIG-Iシグナル伝達経路の誘導がcccDNAを不安定にし、肝細胞における新しいcccDNAの形成を防止することを実証し、cccDNA及び対応するB型肝炎ウイルス感染を根絶する戦略を提供するものである。

イントロダクション
急性ウイルス感染は、典型的には、細胞内の自然免疫の活性化を引き起こし、細胞内の抗ウイルス防御を誘導する。このプロセスは、ウイルスの複製及び感染部位からの拡散を制御し、全身的なウイルス制御のための適応免疫応答を制御するために役立つ。自然免疫の活性化は、ウイルス核酸を含むウイルス複製産物に埋め込まれた病原体関連分子パターン（PAMP）を宿主細胞が感知することによって起こる。PAMPは、細胞内のパターン認識受容体（PRR）によって感知される。ウイルス感染を感知するPRRには、Toll様受容体（TLR）、NOD様受容体（NLR）、細胞内DNAセンサーcGAS、STING、IFI16、DAIなどのほか、レチノイン酸誘導性遺伝子-I（RIG-I）及びメラノーマ分化抗原5（MDA5）を含むRIG-I様受容体（RLR）なども含まれる。各PRRは、侵入してくるウイルスやウイルス複製産物に由来する特定のPAMPを検出する。一方、ウイルス感染時に生成される特定の宿主細胞核酸もPRRシグナルを誘発できる。TLR、RLR、又はSTINGシグナルの誘導は、インターフェロン制御因子（IRF）3やNF-κBなどの潜在的な転写因子の下流活性化を促し、抗ウイルスエフェクター遺伝子やケモカイン、IFN、その他の免疫制御サイトカインなどの免疫制御遺伝子の発現を促進させる。しかし、ヒト肝細胞にHBVが感染した場合、PRRは活性化も阻害もせず、自然免疫のシグナル伝達を阻害することが明らかになった。このことは、HBVが「ステルス」ウイルスであるという概念を補強するものであり、以前に非ヒト霊長類感染モデルにおいてインビボで示されたとおりである。

以前の研究は、PAMP RNAに応答するRIG-Iシグナルが、自然免疫の活性化及び同じく慢性肝炎を引き起こすC型肝炎ウイルス（HCV）の複製を抑制する抗ウイルス防御を誘導できることを示している。HCV PAMPは、HCVゲノムの3'非翻訳領域にある100ntのポリウリジン/シトシン（ポリ-U/UC）モチーフである。5'ppp合成RNAとして細胞に導入されると、ポリ-U/UC PAMPはRIG-Iを特異的に活性化し、IRF3の活性化と抗ウイルス自然免疫を駆動し、インビトロでHCV感染を抑制し、インビボで肝自然免疫を活性化する。さらに、低分子ベンゾチアゾール、あるいは5'ppp RNAリガンドが、RIG-Iに結合して活性化したり、IRF3の活性化や自然免疫を誘導し、RNAウイルス感染を治療的に抑制したり、免疫応答を増強することも明らかにされた。これらの研究は、RIG-I経路が肝細胞において機能し、RIG-Iの標的活性化が強力な抗ウイルス作用を付与し、肝臓で完全に作動することを示している。しかしながら、RIG-I及びIRF3の直接的な標的化及び活性化が、HBV感染にどのように影響するかは不明である。

ここでは、インビトロでのHBV感染の治療おいて、標的化されたRIG-I活性化を評価した。ポリ-U/UC PAMP RNA又はRIG-Iの低分子活性化剤によって生じるRIG-Iシグナル伝達は、強固なIRF3活性化及びRIG-I依存性の抗ウイルス作用を誘導し、cccDNAレベルを抑制した。この結果は、IRF3を介したRIG-I応答が、cccDNAの半減期（t_1/2）を短縮し、cccDNAの崩壊動態を付与する役割を果たすこと、また、ヒトのナトリウム/タウロコール酸共輸送ポリペプチド（hNTCP）を異所性に発現させたHepG2細胞（HepG2-hNTCP）、分化HepaRG細胞（dHepaRG）、及び初代ヒト肝細胞（PHHs）でRC DNA形成を阻害すること、それに伴ってHBsAg分泌を抑制することを実証している。RIG-Iを標的とすることで細胞傷害性は促進されない。驚くべきことに、治療用ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（NRTI）であるエンテカビルと併用すると、ポリ-U/UC PAMP処置は、確立したcccDNAプールを急速に枯渇させることができた。従って、標的化されたRIG-I活性化及びIRF3指向の自然免疫活性化を活性化するプロセスは、HBV治癒に向けた新規かつ有効な治療アプローチを提供する。

結果
RIG-I及びIRF3アゴニストは肝細胞の自然免疫活性化を誘発する
IRF3の低分子アゴニストは、IRF3標的遺伝子の誘導及び様々なRNAウイルスに対する抗ウイルス作用をもたらす自然免疫活性化を付与することが以前に同定された（Bedard, K.M., et al. (2012). Isoflavone agonists of IRF-3 dependent signaling have antiviral activity against RNA viruses. Journal of virology 86, 7334-7344; Pattabhi, S., et al. (2016). Targeting Innate Immunity for Antiviral Therapy through Small Molecule Agonists of the RLR Pathway. Journal of virology 90, 2372-2387; Probst, P., et al. (2017). A small-molecule IRF3 agonist functions as an influenza vaccine adjuvant by modulating the antiviral immune response. Vaccine 35, 1964-1971）。US 9884876に公開された構造（N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミド）（ここではF7と称する）を抗HBV活性の分析用に生成した（図1A）。同様に、5'pppとウイルスRNAのポリ-U/UC領域を含むHCVゲノム内に～100ntのPAMPモチーフが同定され、これはRIG-Iによって特異的に認識され、抗ウイルス遺伝子発現につながるIRF3活性化のRIG-Iシグナル伝達をもたらす（Saito, T., et al. (2008). Innate immunity induced by composition-dependent RIG-I recognition of hepatitis C virus RNA. Nature 454, 523-527; 及びSchnell, G., et al. (2012). Uridine composition of the poly-U/UC tract of HCV RNA defines non-self recognition by RIG-I. PLoS pathogens 8, e1002839 (図1A, 下段)）。HBV感染に対するF7とポリ-U/UC PAMPの治療作用を評価した。まず、HepG2-hNTCP細胞を、10μMのF7又はリポソーム中に配合された200ng/mlのポリ-U/UC PAMPで24時間処置した。コントロール細胞は、DMSOで処置するか、センダイウイルス（SenV；RIG-I依存シグナリングの強力な活性化因子）に感染させるか、又は200ng/mlのリポソーム中のX-RNA（ポリ-U/UC PAMPと同様の質量のHCVゲノム由来の非PAMP/非シグナル5'ppp含有100nt RNAモチーフ（Saito et al. (2008)、前掲）でトランスフェクトした。核へのIRF3トランスロケーションによって示されるように、SenVコントロールと同様に、F7及びポリ-U/UC PAMPの両方の処置は、自然免疫活性化を特異的に誘導し、DMSO又はX RNAはいずれも誘導しなかった（図1B）。イムノブロット分析により、HepG2-hNTCP細胞及びdHepaRG細胞の両方において用量依存的に、F7及びポリ-U/UC PAMP処置はIRF3リン酸化及びIRF3標的遺伝子であるIFIT1の発現を特異的に誘導し、XRNA処置は誘導しないことが示された（Fensterl, V., and Sen, G.C. (2011). The ISG56/IFIT1 gene family. Journal of interferon & cytokine research: the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research 31, 71-78; 及びFensterl, V., and Sen, G.C. (2015). Interferon-induced Ifit proteins: their role in viral pathogenesis. Journal of virology 89, 2462-2468）（図1C）。mRNA発現はまた、F7又はポリ-U/UC PAMPに対する応答について、IFN、ISG、及び直接IRF3標的遺伝子を含む自然免疫応答遺伝子のパネルにわたって評価した（図1D；図8A～図8L）。ポリ-U/UC PAMP処置では、I型及びIII型IFNとISGの発現が誘導されたが、F7処置ではIRF3標的遺伝子の発現のみが誘導された。IFNの発現がIRF3とNF-kBの両方の活性化に依存するめに対し、F7はIRF3を特異的に活性化するがNF-kBを活性化しないことから、この違いは、各分子のシグナル伝達特性やIFNの性質と一致する（Bedard et al. (2012)、前掲）。一方、ポリ-U/UC PAMPは、両方の転写因子のRIG-Iシグナルを引き起こして、IRF3標的遺伝子、IFN、ひいてはISGを誘導する（Saito, T., et al. (2008), 前掲; Schnell, G., et al. (2012), 前掲）。特に、ポリ-U/UC PAMP処置によって誘導されたI型IFN、SAMHD1、APOBEC3A、及びAPOBEC3Gは、HBV感染に対して抗ウイルス活性を示した（Bonvin, M., et al. (2006). Interferon-inducible expression of APOBEC3 editing enzymes in human hepatocytes and inhibition of hepatitis B virus replication. Hepatology (Baltimore, Md) 43, 1364-1374; Chen, Z., et al. (2014). Inhibition of Hepatitis B virus replication by SAMHD1. Biochemical and biophysical research communications 450, 1462-1468; Lucifora, J., et al. (2014). Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science (New York, NY) 343, 1221-1228）。総合すると、これらの結果は、F7及びポリ-U/UC PAMPが、IRF3の活性化及びIRF3標的遺伝子の誘導で始まる処置細胞における自然免疫活性化を誘導することを示している。

IRF3活性化はHBV cccDNA形成を抑制する
IRF3活性化がHBV感染及び感染細胞におけるcccDNAの生産にどのように影響するかを決定するために、HepG2-hNTCP細胞をHBV感染後にF7又はポリ-U/UC PAMP（100 ng/ml [=2.94nM]又は200 ng/ml [=5.87nM]）で処置した。HBV侵入阻害剤抗ウイルスコントロールとしてシクロスポリンA（CsA）処置を採用した（Watashi, K., et al. (2014). Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology (Baltimore, Md) 59, 1726-1737）。図2Aに示すように、細胞を感染後3日目（dpi）に回収し、蛋白質フリーDNAを単離するためのHirt抽出方法を用いて抽出物を調製した（Guo, H., et al. (2007). Characterization of the Intracellular Deproteinized Relaxed Circular DNA of Hepatitis B Virus: an Intermediate of Covalently Closed Circular DNA Formation. Journal of Virology 81, 12472-12484; Hirt, B. (1967). Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. Journal of molecular biology 26, 365-369）。サザンブロット分析により、F7及びポリ-U/UC PAMP処置は、DMSO、又はX-RNA処置コントロールの発現レベルに比べて、HBV cccDNA形成を抑制することが示された。さらに、cccDNAの前駆体であるPF-RC（蛋白質フリー弛緩環状）DNAのレベルも、F7又はポリ-U/UC PAMP処置により顕著に減少した。F7とポリ-U/UCPAMPは共にIRF3を活性化するため、これらの結果は、IRF3応答とHBV感染肝細胞におけるcccDNAの形成の抑制を関連付けるものである。

IRF3の活性化がHBV複製サイクルにどのように影響するかをさらに決定するために、ウイルスDNA、ウイルスRNA、細胞外HBV DNA及び分泌HBsAgの発現を、感染/処置の時間経過にわたって分析した。図9Aに示すように、PF-RC DNAは1dpiまでに初めて検出された。cccDNA合成はコントロール処置細胞で2dpiまでに起こり、PF-RC及びcccDNAは共に20dpiの時間経過にわたって蓄積した。しかし、F7又はポリ-U/UC PAMPで処置した細胞では、2dpi以内にcccDNAの生産が顕著に抑制された。感染/処置時間経過にわたるpgRNAの生産は、非処置コントロール細胞において6dpiから20dpiまで蓄積したが、F7又はポリ-U/UC PAMPで処置した細胞において著しく抑制されることが示された（図9B）。HBV感染/処置の時間経過に伴って生成される逆転写のカプシド関連細胞内HBV DNA中間体のレベルも測定した。その結果、コントロール/非処置細胞では、6～20dpiに弛緩環状（RC）DNA、二本鎖線状（DL）DNA、一本鎖（SS）DNA産物が蓄積することが判明した。しかし、F7又はポリ-U/UC PAMP処置により、これらのDNAのレベルは著しく低下した。興味深いことに、流入するウイルスカプシド関連HBV DNAのレベル（1～2dpiから観察）は、処置によって影響を受けず、代わりにその生成が6dpi以内に抑制された（図9C）。HBV DNA及びRNA全体の抑制は、F7又はポリ-U/UC PAMPで処置した細胞からの培養上清中の分泌HBsAgのレベルの有意な減少に関連していた（図9D）。重要なことは、F7及びポリ-U/UC PAMP処置の両方が、細胞外HBV DNAの減少によって明らかになったデノボHBV生成の阻害をもたらすことである（図9E）。これらの結果は、F7及びポリ-U/UC PAMP処置が、cccDNA合成に続くステップでHBV複製に影響を与え、ウイルスRNAの転写、逆転写HBV DNA、及び子孫ビリオンの生成に影響を与えることを示すものである。

HBVに対するF7及びポリ-U/UC PAMPの抗ウイルス活性を評価するために、用量反応分析を実施した。F7及びポリ-U/UC PAMPの90％最大阻害濃度（IC₉₀）及び半-最大阻害濃度（IC₅₀）の値、並びに細胞傷害性濃度、CC₅₀を測定するために、HepG2-hNTCP及びdHepaRG細胞の2種類の細胞株を使用した。培養物を濃度の高いF7又はポリ-U/UCで処置した後、HBVを感染させ、3dpiで回収した。サザンブロット及びqPCR分析は、cccDNAレベルが、濃度の高いF7（図2B及び2C）及びポリ-U/UC PAMP（図2D及び2E）によって線形的に減少したことを示した。IC₉₀及びIC₅₀値は、F7に関して、HepG2-hNTCP細胞では約17.38μM及び8.48μM、分化HepaRG細胞では12.84μM及び3.38μMと定義された。処置した細胞からのATP放出で測定した50％細胞傷害性濃度（CC₅₀）は、40μM超であった（図10A及び10B）。ポリ-U/UC PAMPのIC₉₀及びIC₅₀値は、HepG2-NTCP細胞においてそれぞれ約11.97nM及び1.94nM、dHepaRG細胞においてそれぞれ3.3nM及び1.61nMであり、23.49nM（=800ng/ml）超のCC₅₀であると決定した（図10C及び図10D）。

デノボHBV cccDNA合成の抑制
cccDNA生合成に対するF7及びポリ-U/UCの阻害効果をさらに明確するために、HepG2-hNTCP及びdHepaRG細胞においてタイム-オブ-アディション実験を実施した。ポリ-U/UC PAMPについては、感染前24時間（前処置）、1～3dpi（後処置）、感染前24時間以降から3dpi（前/後処置）の処置を実施した（図3A）。F7については、感染前24時間の処置（前処置）、感染時に開始した24時間の処置（共処置）、1～3dpiの処置（後処置）、又は感染前24時間から開始して3dpiまで継続する処置（前/共/後処置）を実施した（図3D）。CsAとウイルス接種の共処置を陽性コントロールとして含めた。培養物にHBVを接種し、サザンブロット及びqPCR分析を用いてcccDNAレベルを評価するために、時間経過とともに回収した。驚くべきことに、HepG2-hNTCP及びHepaRG細胞の両方において、cccDNAの合成は、ポリ-U/UC PAMPレジメン全体で一様に有意に抑制され、CsA処置と同様のレベルまで抑制されたことがわかった（図3B及び図3C）。比較として、F7は、前又は共治療で1回投与した場合、HBV cccDNAレベルにほとんど影響を及ぼさなかったが、感染後又は感染前から3日間のコースを通して投与した場合、cccDNAレベルの著しい抑制を媒介した（図3D～図3F）。これらの結果は、ポリ-U/UC PAMPが、HBV感染後の即時及び持続的なcccDNA合成に影響を与える自然免疫応答を誘導し、一方、F7が、ウイルス侵入後のcccDNA合成に影響を与える自然免疫応答を誘導することを示す。

核に分配されたIRF3アゴニストの抗ウイルス作用のcccDNA合成抑制
F7及びポリ-U/UC PAMP処置によって影響を受けたHBV cccDNA合成の段階を特定するために、3dpiの時間経過にわたってcccDNAレベルを評価した。細胞にHBVを4℃で6時間接種し、その後接種物を除去し、細胞をすすぎ、37℃の培地に置いて同期感染を開始させ（時間0）、その時点で細胞を3dpiまでF7（図4A）、又はポリ-U/UC PAMP（図4C）で処置した。全細胞(W)、核(N)、及び細胞質(C)抽出物を、時間経過、感染後3及び6時間、及び1～3dpiにわたって毎日回収し、PF-RC及びcccDNAの存在量をサザンブロットで分析した。図4Bに示すように、PF-RC DNAは、感染後3時間（hpi）から細胞質画分及び全細胞溶解物画分において、及び6hpiまでに核画分において検出されたが、F7処置から2～3dpi後に蓄積が減少した。cccDNAは非処置細胞において1dpiまでに検出されたが、cccDNA蓄積はF7処置細胞において遅延し、減少した。ポリ-U/UC PAMP処置についても同様の時間経過で細胞を回収した（図4C参照）。細胞内画分におけるHBV DNAの評価も、PF-RC DNAが、非処置細胞において3及び6hpiに全細胞及び細胞質抽出物中に早期に存在し、その後核画分にレベルが蓄積することを示した。核内のPF-RC DNAレベルは、1-3dpiからポリ-U/UC PAMPで処置した細胞で、処置した細胞におけるcccDNAの減少と同時に減少した（図4D）。これらの結果は、HBV cccDNA生合成に対するF7及びポリ-U/UCの阻害効果が、HBV複製プロセスの初期のPF-RC DNAのcccDNAへの変換工程に影響を与え得、処置中の1～3dpiにおいて核で生じることを示唆する。

IRF3の活性化は単独及びETVとの組み合わせでHBV cccDNAの安定性を制限する
IRF3活性化に対する宿主応答がどのようにHBV cccDNAレベルを抑制するかを決定するために、F7又はポリ-U/UC PAMP単独処置及びETV/F7又はETV/ポリ-U/UC PAMPの組み合わせが、cccDNA崩壊動態に及ぼす影響を評価した。cccDNA崩壊を評価するために、HBV感染細胞のF7及びポリ-U/UC PAMP処置を、エンテカビル（ETV）処置と比較した。3 dpiから開始して、フレッシュなETV、F7、又はポリ-U/UC PAMPで毎日培地を交換することによって20 dpiまで処置を維持した（図5A）。ETVはヌクレオシドアナログであり、ウイルスの逆転写と新たに合成されたHBV DNAの複製を阻止し、それによってデノボ形成によるcccDNAの補充を防止するものである。ETVは100倍のIC₅₀でHBVに感染した培養物に適用した（Langley, D.R., et al. (2007). Inhibition of Hepatitis B Virus Polymerase by Entecavir. Journal of virology 81, 3992-4001）。それによって、レベルが最初のcccDNAプールからのみ維持される条件下でのcccDNA半減期の測定が可能になる。次に、細胞を処置時間経過にわたって回収し、DNA抽出物をサザンブロット及びqPCRアッセイによって分析した。図5Bに示すように、cccDNAレベルは、非処置コントロール細胞において、感染時間経過にわたって緩やかに増加した。ETV処置培養物からの細胞は、3dpi培養物と同様のレベルで時間経過にわたってcccDNAレベルを安定的に維持し、我々のインビトロ培養系において20dpi以上の持続的で安定したcccDNAを示し、40日以上という報告済みのcccDNA半減期（t_1/2）とよく一致した（図11、（Huang, Q., et al. (2020). Rapid Turnover of HBV cccDNA Indicated by Monitoring Emergence and Reversion of Signature-Mutation in Treated Chronic Hepatitis B Patients. Hepatology; Ko, C., et al. (2018). Hepatitis B virus genome recycling and de novo secondary infection events maintain stable cccDNA levels. J Hepatol 69, 1231-1241）。しかしながら、F7単独処置は、サザンブロット分析によって測定されるcccDNAの崩壊を刺激した（図5B）。F7処置によるcccDNAの崩壊動態の促進は、RT-PCR分析によっても確認された（図5D）。F7単独処置は、cccDNAのt_1/2を減少させたが、ETVとF7の組み合わせは、それらの抗ウイルス効果をさらに高め、20dpiまでにcccDNAの存在量と持続性をほとんど検出できないレベルまで減少させた（図5B及び図5D）。また、ポリ-U/UC PAMPの単回投与による単独処置は、サザンブロットで分析したように、X RNAコントロールで処置した細胞では蓄積し続ける一方で、cccDNAの存在量を減少させることがわかった（図5C）。ポリ-U/UC PAMPによるcccDNAレベルに対する抑制効果は、qPCRアッセイによっても確認された（図5D）。また、ポリ-U/UC PAMPとETVの組み合わせは、ETV又はポリ-U/UC PAMP単独よりも処置時間経過にわたってcccDNAの存在量と持続性を低減する役割を果たし、cccDNAは共処置で20dpi後にほとんど検出されないことが判明した（図5C）。数学的モデリングにより、F7又はポリ-U/UC処置とETVの組み合わせは、それぞれの共処置と比較して単独処置から生じるcccDNAのt_1/2を平均8.7日から6.5日（F7）及び7.7日から6.9日（ポリ-U/UC PAMP）へと低減した（図5E及び表2）。細胞のETV処置もX RNA処置も、HBsAgの生成及び分泌に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ポリ-U/UC PAMP及びF7単独、及び組み合わせ処置は、HBsAgの分泌を抑制した（図5F）。従って、F7及びポリ-U/UC PAMPは、確立されたcccDNAの治療的崩壊をもたらす。さらに、F7及びポリ-U/UC PAMPとETVとの組み合わせ処置は、cccDNAのt_1/2及び持続性を数週間（Huang, Q., et al. (2020), supra; Ko, C., et al. (2018), 前掲）から7日未満に抑制する相加的抗ウイルス作用をもたらす。

F7又はポリ-U/UC PAMP処置によるIRF3の活性化及びHBV感染細胞におけるcccDNAの抑制が、IRF3アゴニスト処置のオフターゲット効果として起こるのではなく、RIG-Iに依存しているかどうかを確認した。ノンターゲッティングガイドRNA（HepG2-hNTCP-NT）、又はRIG-I発現のノックアウト（KO）用ガイドRNA（HepG2-hNTCP-RKO）又はMDA5（HepG2-hNTCP-MKO）を発現するHepG2-hNTCP細胞をCRISPR/CAS9ゲノム編集技術を用いて作製した。異なる細胞集団のイムノブロット解析は、HepG2-hNTCP-RKO又はHepG2-hNTCP-MKO細胞が、それぞれ検出可能なレベルのRIG-I又はMDA5を発現しないことを示す（図12）。F7（図6A）又はポリ-U/UC PAMP（図6B）による細胞の処置は、HepG2-hNTCP-RKO細胞が処置に応答しない一方で、HepG2-hNTCP-NTコントロール細胞及びHepG2-hNTCP-MKO細胞がF7に完全に応答してIFIT1の発現と付随してリン酸化/活性化IRF3が蓄積していることを示す。HepG2-hNTCP-MKO細胞は、RIG-I依存性IRF3活性化を誘発するためのF7及びポリ-U/UC PAMPの特異性を明らかにするためのRLR KOコントロールとして役立つ（Saito et al. (2008), 前掲）。次に、各細胞集団をHBVに感染させ、その後、1dpiでF7又はポリ-U/UC PAMPで1回処置した。cccDNAレベルのサザンブロット解析のために、3dpiで細胞を回収した。各細胞集団の平行培養を、DMSO又は単回投与X-RNA（ネガティブコントロール）、又は治療コントロールとしてCsAで処置した。F7処置は、HepG2-hNTCP-NT及びHepG2-hNTCP-MKO細胞においてcccDNAレベルを減少させたが、HepG2-hNTCP-RKO細胞においては減少させなかった（図6C）。同様に、HepG2-hNTCP-NT及びHepG2-hNTCP-MKO細胞においてcccDNAがポリ-U/UC PAMP処置によって抑制されたが、HepG2-hNTCP-RKO細胞では抑制されなかったことから、cccDNAのポリ-U/UC PAMP抑制はRIG-Iに依存していた（図6D）。これらの結果は、HBVに対するF7及びポリ-U/UC PAMPの抗ウイルス作用がRIG-Iを介して特異的にシグナル伝達することを示し、それぞれをIRF3を活性化してcccDNAの抑制を付与するRIG-Iアゴニストとして明確にするものである。

IRF3活性化のRIG-Iシグナルは初代ヒト肝細胞におけるHBV感染を抑制する
ポリ-U/UC PAMPによるIRF3活性化のRIG-Iシグナル伝達の抗ウイルス作用を検証するために、ヒト肝組織と同レベルの肝細胞マーカー遺伝子の発現を保持する非不死化及び末期分化初代ヒト肝細胞（PHH）においてHBV感染を評価した。PHH培養物をポリ-U/UC PAMP用量反応にわたって処置し、自然免疫の活性化を評価した。50-200ng/mlのポリ-U/UC PAMPでPHH培養を処置すると、ホスホセリン386 IRF3の蓄積とIFIT1の発現で示されるIRF3活性が誘導された。100ng/mlのX-RNAでの処置は、PHHの自然免疫活性化を誘導しなかったが、細胞は、SenVコントロールの急性感染に完全に応答し（図7A）、PHHがインタクトRIG-I経路を保有することが実証された。さらに、ポリ-U/UC PAMPでのPHH処置は、自然免疫遺伝子の発現を強固に誘導し、X-RNAは誘導しなかった（図7B）。cccDNAレベルを、次にポリ-U/UC PAMPで処置したHBV感染PHにおいて評価した。PHH培養物をHBVに感染させ、1dpiでポリ-U/UC PAMPによる単回処置を施した。細胞を3dpiで回収し、DNAを抽出し、サザンブロット分析に供した。図7Cに示すように、ポリ-U/UC PAMPでの処置は、感染PHHにおけるcccDNAレベルを、CsA処置と同様のレベルまで抑制した。従って、IRF3のRIG-Iシグナル伝達及び自然免疫活性化を誘発するためのポリ-U/UC処置は、HBV感染PHHにおいて、cccDNAを抑制する応答を誘発する。これらの結果は、HBV感染の関連初代細胞におけるウイルス制御のためのRIG-I経路を標的とする治療法の有効性を示すものである。

ディスカッション
HBVに感染した肝細胞の核におけるcccDNAの持続は、慢性HBV感染を媒介する鍵である。ここで、近年の分析は、所定のプールcccDNAが約5～21週間のインビボでのt_1/2を有することを示している（Huang, Q., et al. (2020), 前掲）。問題なのは、慢性HBV感染の治療のための現在の治療法が、cccDNAを有意に減少させることも排除することもないことである（Maynard, M., et al. (2005). Sustained HBs seroconversion during lamivudine and adefovir dipivoxil combination therapy for lamivudine failure. J Hepatol 42, 279-281; Werle-Lapostolle, et al. (2004). Persistence of cccDNA during the natural history of chronic hepatitis B and decline during adefovir dipivoxil therapy. Gastroenterology 126, 1750-1758; Zoulim, F., and Durantel, D. (2015). Antiviral therapies and prospects for a cure of chronic hepatitis B. Cold Spring Harb Perspect Med 5）。HBV治療薬の現在のヌクレオシドアナログクラスのメンバーは、患者のウイルス抑制を維持するために、長期間、しばしば生涯にわたって投与される。さらに、これらの治療法はウイルス複製を完全に停止する能力に漏れがあり（Huang, Q., et al. (2020), 前掲）、その結果、核のcccDNAプールは長期間の治療後も持続する（Gish, R., et al. (2012). Selection of chronic hepatitis B therapy with high barrier to resistance. Lancet Infect Dis 12, 341-353; Werle-Lapostolle, et al. (2004), 前掲; Zoulim, F., and Locarnini, S. (2009). Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues. Gastroenterology 137, 1593-1608.e1591-1592）。しかし重要なことに、急性HBV感染時のcccDNAの抑制は、APOBEC3デアミナーゼの発現と関連するIFN-α、IFN-γ、又は腫瘍壊死因子αによるサイトカイン駆動型の非細胞溶解メカニズムによって起こり得ることが明らかにされている（Lucifora et al. (2014) supra; Xia, Y., et al. (2016). Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology 150, 194-205). Pharmacological induction of intrahepatic cytokine responses has been coined as an ideal curative approach to chronic hepatitis B (Chang, J., et al. (2012). The innate immune response to hepatitis B virus infection: implications for pathogenesis and therapy. Antiviral research 96, 405-413）。このアプローチは、特定のサイトカインによって駆動される自然免疫及び免疫調節シグナル伝達プログラムを活用し、その作用によってcccDNAを抑制できる遺伝子の発現を誘導するが、慢性HBV治療のためのサイトカイン療法は、サイトカイン治療の幅広いオフターゲット、非肝部作用による全身毒性という障害に直面することになり（Kwon, H., and Lok, A.S. (2011). Hepatitis B therapy. Nature reviews Gastroenterology & hepatology 8, 275-284; Locarnini, S., et al. (2015). Strategies to control hepatitis B: Public policy, epidemiology, vaccine and drugs. Journal of hepatology 62, S76-86）、HBVに対する現在のNA治療薬と連動することもできるターゲット指向の治療戦略の必要性を強調する。

概念実証として、RIG-IのF7低分子及びポリ-U/UC PAMPアゴニストを使用して、IRF3を活性化するためにRIG-I及びRLR経路を標的とし、肝細胞に送達すると、HBV感染の細胞培養モデルにおいてHBV cccDNAを有効に抑制するIRF3を通じて特定のRIG-I依存自然免疫応答を誘導されることがここで実証された。さらに、F7やポリ-U/UC PAMPの投与は、現在のNA HBV治療薬のように新たに合成されるHBV rcDNAの生成を抑制するのではなく、cccDNAのデノボ生合成を抑制し、cccDNAの分解を促進することがメカニズム研究で示されている。F7とポリ-U/UC PAMPの投与は、IRF3の活性化とIRF3標的遺伝子の発現を誘導する（図1A～1D）。従って、F7及びポリ-U/UC PAMPのcccDNAを抑制する基本的なメカニズムは、おそらく、cccDNA合成をブロックするIRF3標的遺伝子の作用と、感染細胞からそれを枯渇させるためにcccDNAの不安定化と分解を促進する作用を付与することが関与していると考えられる。細胞のF7処理は、NF-kBにシグナル伝達を与えず、代わりに下流のIRF3のみを活性化するこのクラスの化合物のRIG-I活性化特性のため、I型又はIII型IFNの発現を誘導しない（Bedard et al. (2012), supra; Probst, et al. (2017), 前掲）。従って、F7の場合、cccDNAを抑制する抗ウイルス作用は、IFNの作用とは独立して、IRF3応答遺伝子を介して作用する。以上の結果から、ポリ-U/UC PAMPは、ISGを誘導できる低レベルのIFNと同様に、IRF3標的遺伝子の発現も強固に誘導することがわかった。これらの中には、HBV複製に対する抗ウイルスエフェクターとして知られるAPOBEC3遺伝子が含まれている（Bonvin, et al. (2006). Interferon-inducible expression of APOBEC3 editing enzymes in human hepatocytes and inhibition of hepatitis B virus replication. Hepatology (Baltimore, Md) 43, 1364-1374; Turelli, P., et al. (2004). Inhibition of Hepatitis B Virus Replication by APOBEC3G. Science 303, 1829）。IRF3の活性化は、T細胞の走化性因子であるCXCL10を含む様々な免疫調節サイトカインやケモカインの発現及び生産を駆動し（Sankar, S., et al. (2006). IKK-i signals through IRF3 and NFkappaB to mediate the production of inflammatory cytokines. Cell Signal 18, 982-993; Zhai, Y., et al. (2008). CXCL10 regulates liver innate immune response against ischemia and reperfusion injury. Hepatology 47, 207-214）、ユビキチン化や様々な細胞シグナル伝達過程を制御する因子の発現を誘導する（Maelfait, J., and Beyaert, R. (2012). Emerging role of ubiquitination in antiviral RIG-I signaling. Microbiol Mol Biol Rev 76, 33-45) and a variety of cell signaling process (Zhou, Y., et al. (2017). Post-translational regulation of antiviral innate signaling. Eur J Immunol 47, 1414-1426）。そのためIRF3標的遺伝子には、APOBEC遺伝子の既知の作用に加え、様々な抗cccDNAエフェクターが含まれていることが提案されている。こらのエフェクター遺伝子は、i) cccDNA増幅を抑制し、ii) cccDNAを不安定化し、及び/又はcccDNAの分解を促進する多面的な作用を付与する。実際、F7又はポリ-U/UC PAMPで細胞を処置すると、cccDNAのt_1/2が著しく減少し、この減少は、これらのいずれかとエンテカビルで細胞を共処置するとさらに促進された。また、ポリ-U/UC PAMPについては、cccDNAに対する抗ウイルス作用は、低レベルのIFN誘導によって指向されるIFNを介した作用も含み得る（Isorce, N., et al. (2016). Antiviral activity of various interferons and pro-inflammatory cytokines in non-transformed cultured hepatocytes infected with hepatitis B virus. Antiviral research 130, 36-45; Lucifora, J., et al. (2014), 前掲; Phillips, S., et al. (2017). Peg-Interferon Lambda Treatment Induces Robust Innate and Adaptive Immunity in Chronic Hepatitis B Patients. Frontiers in Immunology 8; Robek, M.D., et al. (2005). Lambda Interferon Inhibits Hepatitis B and C Virus Replication. Journal of Virology 79, 3851-3854; Xu, F., et al. (2018). Type III interferon-induced CBFβ inhibits HBV replication by hijacking HBx. Cellular & Molecular Immunology）。興味深いことに、ポリ-U/UC PAMPでの処置に起因するIFN及び特異的ISGのこれらの作用は、F7での処置と比較して半減期が多少短くなる結果、cccDNAの抑制に寄与した可能性がある。F7とポリ-U/UC PAMPの抗ウイルス作用には、cccDNAの生合成に寄与する細胞のDNA修復機構を変化させる作用も含まれている可能性が示唆された。HBVは宿主のDNA修復因子を利用してRC-DNAの不連続性を修復し、転写を許容するcccDNAに変換するため、TDP2（Koniger, C., et al. (2014). Involvement of the host DNA-repair enzyme TDP2 in formation of the covalently closed circular DNA persistence reservoir of hepatitis B viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, E4244-4253）、DNAリガーゼ（Long, Q., et al. (2017). The role of host DNA ligases in hepadnavirus covalently closed circular DNA formation. PLoS pathogens 13, e1006784）、DNAトポイソメラーゼ（Sheraz, M., et al. (2019). Cellular DNA Topoisomerases Are Required for the Synthesis of Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA. Journal of virology 93）、DNAポリメラーゼ（pol α, λ, κ）（Qi, Y., et al. (2016). DNA Polymerase kappa Is a Key Cellular Factor for the Formation of Covalently Closed Circular DNA of Hepatitis B Virus. PLoS pathogens 12, e1005893; Tang, L., et al. (2019). DNA Polymerase alpha is essential for intracellular amplification of hepatitis B virus covalently closed circular DNA. PLoS pathogens 15, e1007742）などcccDNA代謝に関与することが知られているいくつかの細胞のDNA修復蛋白質がRIG-I/IRF3シグナルによって制御されている候補であり得る。

本研究は、RIG-I及びIRF3が、cccDNAの抑制を通じたHBV感染の制御のためにRLR自然免疫プログラムを活性化するように特異的に標的化され、t_1/2を処置のない場合の数週間又は数ヶ月に比べて数日に短縮できることを実証している。このように、自然免疫とRLR経路を標的とすることは、HBV治療において単独又はNAとの併用で提供可能なHBVに対する新しい抗ウイルス療法に向けた有効な戦略を提供するものである。cccDNAの枯渇をもたらすRIG-I及びIRF3によって誘導される自然免疫標的を決定することは、HBV治癒に向けたこれらの新規薬剤候補の作用機構及び独自の抗ウイルス特性に対する洞察をもたらすであろう。

方法及び材料

実験モデル及び対象の詳細
細胞培養：HepG2のサブクローンであるヒトNTCP安定発現ヒト肝細胞株C3Aを、10 %熱不活性化FBS、1 x Glutamax（GIBCO）、100 U/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したDulbecco modified Eagle medium（DMEM）で維持して、以前に記述されたように1μg/mlピューロマシンを含む培地で選択/増殖させた（Guo, F., et al. (2017). HBV core protein allosteric modulators differentially alter cccDNA biosynthesis from de novo infection and intracellular amplification pathways. PLoS pathogens 13, e1006658; Ko, C., et al. (2014a). DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Is a Host Factor That Restricts Hepatitis B Virus Replication at the Transcriptional Level. Journal of virology 88, 13689-13698）。テトラサイクリン（TET）誘導的にHBVの生成を支持するHepAD38細胞株を、以前に記述されたように維持した（Watashi, K., et al. (2013). Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). The Journal of Biological Chemistry 288, 31715-31727)。ヒト肝前駆体HepaRG細胞株を、10％FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、ハイドロコルチゾン21-ヘミスクシネート（Cayman）、ヒトインシュリン（Sigma）及び1×Glutamax（GIBCO）を添加した完全William's E培地で培養した（Gripon, P., et al. (2002). Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 15655-15660）。PHHで再構成されたヒト化肝臓を持つキメラマウスから、初代ヒト肝細胞を新たに分離した。回収したPHHは、10％熱不活性化FBS、15μg/ml L-プロリン、25ng/ml インスリン、50nMデキサメタゾン、5ng/ml EGF、及び0.1mM L-アスコルビン酸2-ホスフェイトを添加したDMEM中で、以前に記述されたように培養を行った（Ishida, Y., et al. (2015). Novel robust in vitro hepatitis B virus infection model using fresh human hepatocytes isolated from humanized mice. The American journal of pathology 185, 1275-1285）。

CRISPRシステムを用いたHepG2-hNTCP-NT/ RIG-I/MDA5 KO細胞株の作製：ヒトタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（hNTCP）の発現のために、dHepaRG細胞から調製したcDNAクローンから遺伝子コード配列を増幅させた。カルボキシル末端のC9タグをPCR増幅によって付加した。形質転換された細胞を20μg/mlのブラストサイジンで選択し、最もよく成長した単細胞クローンをHBV感染を支持する能力についてスクリーニングした。CRISPR/Cas媒介遺伝子ノックアウトのために、ガイドRNA（gRNA）配列をBenchlingのCRISPRツール（Biology Software, 2017, https://benchling.com）で設計した。gRNA標的オリゴヌクレオチドを、In-Fusionクローニングキット（Takara）を用いてCas9-t2a-PRRLレンチウイルスベクターにクローニングした。遺伝子ノックアウトに用いたgRNA配列は、gRIG-I：5'-GGGTCTTCCGGATATAATCC-3'（配列番号28）、及びgMDA5：5'-GTGGTTGGACTCGGGAATTCG-3'（配列番号29）であった（Esser-Nobis, K., et al. (2019). Comparative Analysis of African and Asian Lineage-Derived Zika Virus Strains Reveals Differences in Activation of and Sensitivity to Antiviral Innate Immunity. Journal of virology 93）。導入後、細胞を10μg/mlのピューロマイシンで連続選択下におき、ノックアウトをウェスタンブロットで確認した。

方法の詳細
HBVの感染：HBV（遺伝子型D）は、HepAD38細胞の上清から、PEG濃縮とその後のショ糖勾配により、以前に記述されたように精製した（Ko, C., et al. (2014). DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Is a Host Factor That Restricts Hepatitis B Virus Replication at the Transcriptional Level. Journal of Virology 88, 13689-13698; Watashi, K., et al. (2013), 前掲）。HBV感染については、コラーゲンコートしたプレートに細胞を播種した。1日後、4％ポリエチレングリコール8000（PEG-8000）を含むDMEM中で細胞にHBVを感染させた。感染の倍率（ウイルスゲノム当量/細胞として表現）は、各図記号に示されている。接種物を24時間後に除去し、感染培養物を回収まで2.5％DMSOを含む完全DMEM中で、以前に記述されたように維持した（Ni, Y., et al. (2014). Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology 146, 1070-1083）。

試薬：F7は、IRF3アゴニストのハイスループットスクリーンで同定されたベンゾチアゾールのコア構造に基づく低分子である（US 9884876; Probst, et al. (2017), 前掲）。F7（N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミド）（図1A参照）構造はUS 9884876から入手し、本研究で使用するためにMedchem Source, Inc.によってデノボ合成された。センダイウイルス（SenV）株Cantellのワーキングストックは、以前に記述されたように生成した（Loo, Y.M., et al. (2008). Distinct RIG-I and MDA5 signaling by RNA viruses in innate immunity. Journal of virology 82, 335-345）。Mirus Trans-IT mRNAトランスフェクション試薬を使用し、X-RNA及びPAMP-RNAで細胞を処置した。シクロスポリンA（C1832）及びエンテカビル（SML1103）は、シグマ・アルドリッチから入手した。

インビトロ転写：ポリ-U/UC PAMP-RNA及びX-RNAはそれぞれ、ポリ-U/UC PAMP RNA用（フォワード：5′-TAATACGACTCACTATAGGCCATCCTGTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCCTTTTTTTTTCCTCTTTTTTTCCTTTTCTTTCCTTT-3′（配列番号30）、リバース：5'- AAAGGAAAGAAAAGGAAAAAAAGAGGAAAAAAAAAGGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAACAGGATGGCCTATAGTGAGTCGTATTA -3'（配列番号31））、及びX-RNA用（フォワード：5′-TAATACGACTCACTATAGGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACGGCTAGCTGTGAAAGGTCCGTGAGCCGCTTGACTGCAGAGAGTGCTGATACTGGCCTCTCTGCAGATCAAGT-3′（配列番号32）、リバース：5'- ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTCAAGCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTAGCCGTGACTAGGGCTAAGATGGAGCCACCTATAGTGAGTCGTATTA -3'（配列番号33））のT7プロモーター連結相補オリゴヌクレオチドから、以前に記述されたように合成した（Kell, A., et al. (2015). Pathogen-Associated Molecular Pattern Recognition of Hepatitis C Virus Transmitted/Founder Variants by RIG-I Is Dependent on U-Core Length. Journal of Virology 89, 11056-11068; Saito, T., et al. (2008), 前掲）。RNA産物は、T7 RNAポリメラーゼとT7 MEGAshortscriptキット（Ambion）を用いて、販売元の指示書に従って生成した。10μgのオリゴヌクレオチド混合物をグラジエントPCRプログラム（95℃2分、及び1℃/30秒で徐々に50℃まで温度を下げて）でアニーリングした。アニーリング後、反応混合物をRNase-フリーマイクロ遠心チューブに、各ヌクレオチド7.5mM、10x反応バッファー、鋳型DNA 2μg、T7酵素を販売元の記載通りに組み入れ、37℃で4時間インキュベートしてインビトロ転写を可能にした。その後、DNA鋳型をTurbo DNase処理で除去し、未組み込みのヌクレオチドと蛋白質をフェノール-クロロホルム抽出で除去した。RNAは、販売元の記載に従ってエタノールと酢酸アンモニウムを使用して沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁させた。RNA濃度は、Nanodrop分光光度計を用いた吸光度によって測定した。RNAの品質と純度は、変性2％ホルムアルデヒドアガロースゲルで評価した。

逆転写定量リアルタイムqPCR（RT-qPCR）分析：TRIZOL試薬と販売元のプロトコール（Invitrogen）を用いて細胞から細胞全RNAを抽出した。精製したRNAからiScript select cDNA synthesis kit（Biorad、Inc）を用いてランダム及びオリゴ（dT）プライミングの両方によりcDNAを合成した。HBV cccDNA発現解析のために、DNeasyキット（QIAGEN社）を用いて全DNAを抽出した。選択的cccDNA PCR解析のため、単離したDNAを37℃の反応液10μl中、10ユニットのT5エキソヌクレアーゼ（NEB）で30分間処理し、95℃で5分間熱不活性化後、Nucleaseフリーウォーターで4倍希釈を行った。細胞外HBV DNAの定量のために、外部のHBVプラスミド標準を使用してPCRをプログラムした（Ko, C., et al. (2018), 前掲）。全ての標的遺伝子の相対的mRNAレベルを、ΔΔCT法を用いて実施したRT-qPCRによって定量化し、発現レベルをハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。リアルタイムPCRアッセイは、Applied Biosystems 7300サーモサイクラーを用い、SYBR green法（Applied Biosystems）を用いて実施した。ヒト及びHBV遺伝子のRT-qPCR分析のためのプライマー配列情報を表3に提供する。

HBV DNAのサザンブロット分析：サザンブロット解析を細胞質ウイルスカプシドから単離したDNAについて、以前に記述されたように行った（Ko, C., et al. (2014). DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Is a Host Factor That Restricts Hepatitis B Virus Replication at the Transcriptional Level. Journal of Virology 88, 13689-13698; Ko, C., et al. (2014b). Residues Arg703, Asp777, and Arg781 of the RNase H Domain of Hepatitis B Virus Polymerase Are Critical for Viral DNA Synthesis. Journal of Virology 88, 154-163）。cccDNAを含むHBV-DNAの蛋白質フリー形態を検出するために、以前に記述されたように改変Hirt抽出法を使用した（Cai, D., et al. (2013). A southern blot assay for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA from cell cultures. Methods in Molecular Biology (Clifton, NJ) 1030, 151-161; Guo, H., et al. (2007). Characterization of the Intracellular Deproteinized Relaxed Circular DNA of Hepatitis B Virus: an Intermediate of Covalently Closed Circular DNA Formation. Journal of Virology 81, 12472-12484）。Hirt抽出した蛋白質フリーDNA調製物をプラスミドセーフなATP依存性DNase（Epicentre）で消化した。抽出したウイルスDNAを1.2 %アガロースゲルで分離し、アップワードキャピラリートランスファーで正帯電ナイロン膜（GE healthcare, Amersham）に移送し、ジゴキシゲニン標識HBV特異的DNAプローブとハイブリダイズさせた。DNAシグナルをDIG発光検出キット（Roche）により検出した。

イムノブロット解析：イムノブロット解析は、本質的には以前に記述されたように行った（Lee, S., et al. (2016). Hepatitis B virus X protein enhances Myc stability by inhibiting SCF(Skp2) ubiquitin E3 ligase-mediated Myc ubiquitination and contributes to oncogenesis. Oncogene 35, 1857-1867）。細胞は、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Sigma Aldrich）存在下、0.1 %ドデシル硫酸ナトリウムを含むRIPAバッファーで溶解させた。溶解物をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動した。膜を適切な一次抗体を用いて4℃で一晩プローブし、その後対応するHRP結合二次抗体を用いた。以下の一次抗体を本研究に使用した。ウサギ抗IRF3ホスホセリン386（Cell Signaling）、ウサギ抗IRF3（Cell Signaling）、ウサギ抗IFIT1（抗体972；IFIT1 437-490 aaペプチド配列に対してウサギで生成）、ウサギ抗RIG-I（抗体969；RIG-I aa 1-227ペプチド配列に対してウサギで生成）、ウサギ抗MDA5（Enzo Life Sciences）、ウサギ抗Lamin B1（Abcam）、マウス抗カルネキシン（Abcam）及びマウス抗αチューブリン（Cell signaling）。

免疫蛍光分析：免疫蛍光分析は、本質的には以前に記述されたように行った（Lee, S., et al. (2016), 前掲）。簡潔には、コラーゲンでコートされた24mmカバースリップ上に播種した細胞を、3％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.2％Triton-X 100で透過化した。次に、IRF3に特異的なマウスモノクローナル抗体AR1（Rustagi, A., et al. (2013). Two new monoclonal antibodies for biochemical and flow cytometric analyses of human interferon regulatory factor-3 activation, turnover, and depletion. Methods (San Diego, Calif) 59, 225-232）及びウサギ抗ヒトNTCP（Invitrogen）と共にインキュベートし、その後、それぞれAlexa Flour 594-、又は488-結合特異的二次抗体（Invitrogen）及び4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）インキュベーションを施した。免疫染色後、カバースリップをプロロングゴールド抗フェード試薬（Life Technologies）でマウントし、Nikon Elipse-Ti共焦点顕微鏡で画像を収集した。

細胞傷害性アッセイ：細胞傷害性は、HepG2-C3A-hNTCP及びdHepaRG細胞の培養物から、CellTiter-Gloを用いて、以前に記述されたように評価した（Edwards, T.C., et al. (2019). Inhibition of HBV replication by N-hydroxyisoquinolinedione and N-hydroxypyridinedinone ribonuclease H inhibitors. Antiviral research 164, 70-80）。細胞をDMEM培地で96ウェル培養プレートに播種し、連続希釈した化合物又はポリ-U/UC PAMPの存在下又は非存在下でインキュベーションした。それぞれの細胞傷害性は、CellTiter-Glo^TM試薬（Promega）を用いて細胞生存率の指標としてATP含量を販売元の指示書に従い測定した。プレートは発光プレートリーダー（Berthold）を用いて読み取り、各ウェルから生じた相対発光単位（RLU）データを、未処置のコントロールと比較したパーセントシグナルとして算出した。そして、値はCC₅₀値（50％細胞傷害性濃度；それぞれ、未処置細胞と比較して50％の吸光度の減少をもたらす化合物又はポリ-U/UC PAMPの濃度）として表した。試験は3重で行い、各実験を3回繰り返した。選択性指数（SI）の計算のために、40より大きいCC₅₀値は最大値である40を割り当てた。化合物の選択性指数（SI）は、以下のように算出した。SI=CC₅₀/IC₅₀。

HBV侵入アッセイ及び細胞分画：細胞に、4％PEGの存在下で、4℃で6時間、HBVを接種した。HBVの侵入を評価するために、プロテイナーゼKを含むPBSで洗浄して接種物を除去し、アタッチメント後に細胞を37℃にシフトした。インキュベーションと処置の後、細胞を低張力バッファー（100 mM HEPES、15 mM MgCl₂、100 mM KCL、Nonidet P-40）で溶解し、ダウスホモジナイザーでホモジナイズした。細胞質画分を遠心分離により核ペレットから分離した（6,000×g、5分間、4℃）。核ペレットを抽出バッファー（20mM HEPES、15mM MgCl₂、420mM NaCl、0.2mM EDTA、及びDTT及びプロテアーゼインヒビターカクテルを含む25%(v/v)グリセロール）に再懸濁させた。各細胞画分を1％SDS（v/v）と混合し、Hirt抽出法を用いて蛋白質フリーDNAを抽出した。

ELISA：ELISAでは、細胞からの上清を回収し、10,000×gで5分間遠心分離し、液体画分を回収して分析に用いた。HBsAg ELISAは、Hepatitis B virus s Antigen (HBsAg) Detection Kit (AlphaLISA; PerkinElmer)を用いて、回収した上清に対して販売元の指示書に従って実施した。

cccDNA半減期解析モデル：処置下におけるcccDNA崩壊を解析するために、以下の数理モデルを採用した。t≦τの場合C(t)=C(0)、それ以外はC(t)=C(0) e^-λ(t-τ)（ここでC(t)は処置後の時刻tにおけるcccDNA量、C(0)は処置開始時のcccDNA、λはcccDNAの崩壊速度、τは処置によってcccDNAの崩壊が生じるまでの遅延時間である）。4つの処置のそれぞれの下で3つ複製データを同時にフィッティングすることにより、MATLAB R2017bを使用したλ及びτを見積もった。cccDNAの半減期は、ln (2)/λとして計算し、表2に示している。MATLABの関数nlparci（最小二乗推定値の漸近正規近似法）を用いてパラメータλとτの95%信頼区間を推定し（Vandeginste, B. (1989). Nonlinear regression analysis: Its applications, D. M. Bates and D. G. Watts, Wiley, New York, 1988. ISBN 0471-816434. Price: ￡34.50. Journal of Chemometrics 3, 544-545）、表2に示している。

統計解析：統計分析は、Graphpadソフトウェアを使用して多重比較で行った。連続変数は、平均±標準偏差（SD）として示した。全ての検定において、p値≦0.05は統計的に有意であるとみなした。

例示的な実施形態が図示され、説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がそこになされ得ることが理解されよう。

Claims (54)

1. 感染細胞におけるB型肝炎ウイルス（HBV）の共有結合閉環DNA（cccDNA）レベルを抑制する方法であって、感染細胞においてインターフェロン制御因子3（IRF3）の活性化を誘導する薬剤を感染細胞に接触させる工程を含む、方法。
2. 前記cccDNAを抑制することが、感染細胞におけるcccDNAの形成を阻害することを含む、請求項1に記載の方法。
3. 前記cccDNAを抑制することが、感染細胞における既存のcccDNAの安定性を低下させることを含む、請求項1に記載の方法。
4. 前記薬剤が、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）様受容体（RLR）シグナル伝達経路を誘導することによりIRF3活性化を誘導する、請求項1～3の1項に記載の方法。
5. 前記RLRシグナル伝達経路が、RIG-I、メラノーマ分化関連遺伝子5（MDA5）、ラボラトリーオブジェネティクスアンドフィジオロジー2（LGP2）、及び/又はミトコンドリア抗ウイルスシグナル（MAVS）蛋白質を含む、請求項4記載の方法。
6. 前記薬剤が、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含み、前記PAMPは、
   末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
   少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
   少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
   を含む、請求項1～5の1項に記載の方法。
7. 前記ポリ-ウラシルコアが8～30個のウラシル残基からなる、請求項6に記載の方法。
8. 前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基がシトシン残基又はグアニン残基である、請求項6に記載の方法。
9. 前記3'-アーム領域は少なくとも90％がウラシル残基である、請求項6に記載の方法。
10. 前記3'-アーム領域が少なくとも7個の連続したウラシル残基を含む、請求項6に記載の方法。
11. 前記5'-アーム領域が、前記末端三リン酸と前記ポリ-ウラシルコアとの間に配置された1つ以上の核酸残基をさらに含む、請求項6に記載の方法。
12. 前記5'-アーム領域が前記末端三リン酸からなり、前記末端三リン酸が前記ポリ-ウラシルコアの5'末端に直接連結されている、請求項6に記載の方法。
13. 前記核酸分子が少なくとも16個のヌクレオチドの配列を含む、請求項6に記載の方法。
14. 前記薬剤が低分子薬剤である、請求項1～5の1項に記載の方法。
15. 前記低分子薬剤がベンゾチアゾール誘導体分子である、又は含む、請求項14記載の方法。
16. 前記低分子薬剤が化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む、請求項15に記載の方法。
17. 前記感染細胞においてIRF3活性化を誘導する2種以上の薬剤を前記感染細胞に接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
18. 前記2種以上の薬剤が、
    核酸分子であって、
    末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
    少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
    少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
    を含む、核酸分子、及び
    低分子薬剤であって、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含むようなベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む、低分子薬剤、
    を含む、請求項17に記載の方法。
19. 前記細胞をヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）と接触させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
20. 前記NRTIが、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される、請求項1に記載の方法。
21. 前記薬剤が、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含み、前記PAMPが、
    末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
    少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
    少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
    を含み、
    前記方法が、前記細胞を、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択されるNRTIと接触させる工程を含む、
    請求項1に記載の方法。
22. 前記感染細胞が肝細胞である、請求項1～21いずれかに記載の方法。
23. それを必要とする対象におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染を治療又は予防する方法であって、前記対象の感染細胞においてインターフェロン調節因子3（IRF3）の活性化を誘導する組成物の治療上有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
24. 前記組成物が、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含み、前記PAMPは、
    末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
    少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
    少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
    を含む、請求項23に記載の方法。
25. 前記ポリ-ウラシルコアが8～30個のウラシル残基からなる、請求項24に記載の方法。
26. 前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基がシトシン残基又はグアニン残基である、請求項24に記載の方法。
27. 前記3'-アーム領域は少なくとも90％がウラシル残基である、請求項24に記載の方法。
28. 前記3'-アーム領域が少なくとも7個の連続したウラシル残基を含む、請求項24に記載の方法。
29. 前記5'-アーム領域が前記末端三リン酸と前記ポリ-ウラシルコアとの間に配置された1つ以上の核酸残基をさらに含む、請求項24に記載の方法。
30. 前記5'-アーム領域が末端三リン酸からなり、前記末端三リン酸が前記ポリ-ウラシルコアの5'末端に直接連結されている、請求項24に記載の方法。
31. 前記核酸分子が少なくとも16個のヌクレオチドの配列を含む、請求項24に記載の方法。
32. 前記組成物が、RIG-Iシグナル伝達を誘導する低分子薬剤であるか、又は含む、請求項23に記載の方法。
33. 前記薬剤がベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む、請求項32に記載の方法。
34. 前記低分子薬剤が化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む、請求項33に記載の方法。
35. 請求項23に記載の方法であって、第1の薬剤及び第2の薬剤の治療上有効量を前記対象に投与する工程を含み、
    前記第1の薬剤は、
    末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
    少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
    少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
    を含む核酸分子であるか、又は含み、
    前記第2の薬剤は、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含む、低分子薬剤であるか、又は含む、
    方法。
36. ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）の治療上有効な量を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項23～35の1項に記載の方法。
37. 前記NRTIが、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される、請求項36に記載の方法。
38. 請求項23に記載の方法であって、第1の薬剤及び第2の薬剤の治療上有効な量を前記対象に投与する工程を含み、
    前記第1の薬剤は、
    末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
    少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
    少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5'-最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
    を含む核酸分子であるか、又は含み、
    前記第2の薬剤は、NRTIであるか、又は含む、
    方法。
39. 前記NRTIが、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される、請求項38に記載の方法。
40. 対象におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染症を治療するための組成物であって、
    RIG-Iアゴニスト、
    細胞内送達のためのビヒクル、及び
    薬学的に許容される担体、
    を含む、組成物。
41. 前記RIG-Iアゴニストが、病原体関連分子パターン（PAMP）を含む核酸分子であるか、又は含み、前記PAMPは、
    末端三リン酸を含む5'-アーム領域、
    少なくとも8個の連続したウラシル残基を含むポリ-ウラシルコア、及び
    少なくとも8個の核酸残基を含む3'-アーム領域であって、前記3'-アーム領域の5'最末端核酸残基はウラシルでなく、且つ前記3'-アーム領域は少なくとも30％がウラシル残基である、3'-アーム領域、
    を含む、請求項40に記載の組成物。
42. 前記ポリ-ウラシルコアが8～30個のウラシル残基を含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
43. 前記3'-アーム領域の5-'最末端核酸残基がシトシン残基又はグアニン残基である、請求項41に記載の組成物。
44. 前記3'-アーム領域は少なくとも90％がウラシル残基である、請求項41に記載の組成物。
45. 前記3'-アーム領域が少なくとも7個の連続したウラシル残基を含む、請求項41に記載の組成物。
46. 前記5'-アーム領域が、前記末端三リン酸と前記ポリ-ウラシルコアとの間に配置された1つ以上の核酸残基をさらに含む、請求項41に記載の組成物。
47. 前記5'-アーム領域が末端三リン酸からなり、前記末端三リン酸が前記ポリ-ウラシルコアの5'末端に直接連結されている、請求項41に記載の組成物。
48. 前記核酸分子が少なくとも16個のヌクレオチドの配列を含む、請求項41に記載の組成物。
49. 前記RIG-Iアゴニストが、化学式N-(6-ベンザミド-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)ナフタレン-2-カルボキサミドを含むようなベンゾチアゾール誘導体分子であるか、又は含む、請求項40の組成物。
50. ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）をさらに含む、請求項40～49の1項に記載の組成物。
51. 前記NRTIが、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、テノホビルアラフェナミド（TAF）、クレブジン、ベシーボ、ザダキシン、レムデシビルなどから選択される、請求項50に記載の組成物。
52. 前記RIG-Iアゴニストは前記ビヒクルに組み込まれている、請求項40～51の1項に記載の組成物。
53. 前記ビヒクルが、HBVが感染した標的宿主細胞へのRIG-Iアゴニストの導入のために構成されたリポソーム、ナノカプセル、ナノ粒子、エキソソーム、マイクロ粒子、マイクロスフィア、脂質粒子、ベシクルなどである、請求項40～51の1項に記載の組成物。
54. B型肝炎ウイルス（HBV）感染を有する対象の治療方法であって、請求項40～53のいずれかに記載の組成物の治療上有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。

Images