BE1025029B1 - Polynucleotides et polypeptides d' adenovirus - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des séquences polynucléotidiques et polypeptidiques isolées, dérivées du nouvel adénovirus de chimpanzé ChAd157, ainsi que des polynucléotides recombinants, des vecteurs, des adénovirus, des cellules et des compositions comprenant lesdites séquences polynucléotidiques et polypeptidiques.

Description

(30) Données de priorité :

09/12/2016 GB 1620968.6 (73) Titulaire(s) :

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA

1330, RIXENSART

Belgique (72) Inventeur(s) :

AMMENDOLA Virginia 80145 NAPLES Italie

CAPONE Stefania 80145 NAPLES Italie

COLLOCA Stefano 80145 NAPLES

Italie

FOLGORI Antonella

80145 NAPLES Italie

MERONE Rosella

80145 NAPLES

Italie (54) POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES D' ADENOVIRUS (57) La présente invention concerne des séquences polynucléotidiques et polypeptidiques isolées, dérivées du nouvel adénovirus de chimpanzé ChAdl57, ainsi que des polynucléotides recombinants, des vecteurs, des adénovirus, des cellules et des compositions comprenant lesdites séquences polynucléotidiques et polypeptidiques.

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BREVET D'INVENTION BELGE

SPF Economie, PME, Classes Moyennes & Energie	Numéro de publication : 1025029 Numéro de dépôt : BE2017/5910
Office de la Propriété intellectuelle	Classification Internationale : C07K 14/075 C12N 15/861A61K 39/12 A61K 39/235 Date de délivrance : 10/10/2018

Le Ministre de l'Economie,

Vu la Convention de Paris du 20 mars 1883 pour la Protection de la propriété industrielle ;

Vu la loi du 28 mars 1984 sur les brevets d'invention, l'article 22, pour les demandes de brevet introduites avant le 22 septembre 2014 ;

Vu le Titre 1er “Brevets d’invention” du Livre XI du Code de droit économique, l'article XI.24, pour les demandes de brevet introduites à partir du 22 septembre 2014 ;

Vu l'arrêté royal du 2 décembre 1986 relatif à la demande, à la délivrance et au maintien en vigueur des brevets d'invention, l'article 28 ;

Vu la demande de brevet d'invention reçue par l'Office de la Propriété intellectuelle en date du 07/12/2017.

Considérant que pour les demandes de brevet tombant dans le champ d'application du Titre 1er, du Livre XI du Code de Droit économique (ci-après CDE), conformément à l'article XI. 19, §4, alinéa 2, du CDE, si la demande de brevet a fait l'objet d'un rapport de recherche mentionnant un défaut d'unité d'invention au sens du §ler de l'article XI.19 précité et dans le cas où le demandeur n'effectue ni une limitation de sa demande ni un dépôt d'une demande divisionnaire conformément aux résultats du rapport de recherche, le brevet délivré sera limité aux revendications pour lesquelles le rapport de recherche a été établi.

Arrête :

Article premier. - Il est délivré à

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA, Rue de l'institut 89, 1330 RIXENSART Belgique;

représenté par

PRONOVEM - Office Van Malderen, Avenue Josse Goffin 158, 1082, BRUXELLES;

un brevet d'invention belge d'une durée de 20 ans, sous réserve du paiement des taxes annuelles visées à l’article XI.48, §1 du Code de droit économique, pour : POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES D'

ADENOVIRUS .

INVENTEUR(S) :

AMMENDOLA Virginia, Via Gaetano Salvatore 486, 80145, NAPLES;

CAPONE Stefania, Via Gaetano Salvatore 486, 80145, NAPLES;

COLLOCA Stefano, Via Gaetano Salvatore 486, 80145, NAPLES;

FOLGORI Antonella, Via Gaetano Salvatore 486, 80145, NAPLES;

MERONE Rosella, Via Gaetano Salvatore 486, 80145, NAPLES;

PRIORITE(S) :

09/12/2016 GB 1620968.6;

DIVISION :

divisé de la demande de base :

date de dépôt de la demande de base :

Article 2. - Ce brevet est délivré sans examen préalable de la brevetabilité de l'invention, sans garantie du mérite de l'invention ou de l'exactitude de la description de celle-ci et aux risques et périls du (des) demandeur(s).

Bruxelles, le 10/10/2018,

Par délégation spéciale :

BE2017/5910

POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES D'ADENOVIRUS

on	de sa
Aies	très
et	d'une
les	gènes
oa	,r une

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention, concerne des séquences polynucléotidiques et polypeptidiques isolées, dérivées d'un nouvel adénovirus de chimpanzé ChAdl57, ainsi que des polynucleotides re combinants:, des vecteurs:, des adénovirus, des cellules et des Compositions comprenant lesdites séquences polynucléotidiques et polypeptidiques.

CONTEXTE DE L'INVENTION

L'adénovirus a été largement utilisé dans des applications de transfert génique en rais capacité à permettre un transfert de gè efficace dans une variété de tissus, cibles grande capacité de transgène. Classiquement, El d'adénovirus: sont délétés et remplacés cassette transgénique constituée du promoteur choisi, d'une séquence d'ADNc du gène d'intérêt et d'un signal poly A, résultant en un virus recombinant déficient p ο ύ r s a r ép: 1 i c a t i οn.

Les /adénovirus recombinants sont. utiles en thérapie génique et en tant que vaccins. Les vecteurs viraux basés sur des adénovirus de chimpanzé 25 représentent une alternative à l'utilisation de vecteurs adénoviraux d'origine humaine développement de vaccins génétiques. Les isolés de chimpanzés sont étroitement adénovirus isolés d'humains, tel que ceci évidence par leur propagation efficace cellules d'origine humaine. Cependant, étant donné que pour . r· adénovirus liés aux est mis en dans des

BE2017/5910 les adénovirus humains et de chimpanzés sont de proches parents, une réactivité croisée sérologique entre les deux espèces virales est possible,

II. existe Un besoin pour des vecteurs qui délivrent efficacement des molécules à une cible et minimisent l'effet de l'immunité préexistante envers des sérotypes adénoviraux sélectionnés dans la population. Un aspect de 1'immunité préexistante qui est observé chez les humains est l'immunité humorale, 1.0 qui peut résulter en la production et la persistance d'anticorps qui sont spécifiques des protéines adénovirales. La réponse humorale élicitée par .1 ' adénovirus est .principalement dirigée contre les trois protéines structurales majeures de la capside : 15 la fibre, le penton et 1'hexon.

RESUME DE L'INVENTION

La présente invention concerne un polynucléotide isolé, dems lequel, le polynucléotide code pour un polypeptide sélectionné dans le groupe constitué de :

(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; et (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la. séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : ‘1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides 25 aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.

1/invention concerne également un polynucléotide recombinant comprenant un polynucléotide sélectionné 30 dans le groupe constitué de :

BE2017/5910 ayant la un polynucléotide qui code pour un polypeptide séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ;

et dérivé po1yhuclé ot ide (b) un une f one antin' f one qui code pour un

tlouncl d	'un polypeptide	ayant 1	a séquence	d!acides
és selon	SEQ ID NO :	1, dans	lequel 1	e. dérivé
tionnel a	une séquence d	’acides	aminés qui	présente
identité	d'au moins 99,	8 % sur	toute sa	longueur

1.

NO avec

L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide sélecti onné dans le groupe constitué de :

un polynucleotide qui code pour un polypeptide ayant la

ID NO : 1 ;

et un polynucléotide qui code pour un dérivé acides fonctionnel d' un. polypeptide

aminés selon SEQ	ID NO :	1, dans
fonctionne.]. a une	séquence d’	'acides
une identité d'au	moins 99,	8: % sur
avec la séquence c	t'acides ami	.nés de

aminés toute

SEO ID lequel le

L'invention concerne également dérivé qui présente sa longueur

NO : 1.

un adénovirus recombinant comprenant au moins un polynucléotide ou un polypeptide (a) un sélectionné dans le groupe constitué de : polynucléotide qui code pour un polypepti ayant la (b) séquence d’acides aminés selon SEQ un polynucléotide qui code pour

ID NO : 1 ;

un dérivé fonctionnel d'un polypeptide aminés selon SEQ ID NO :

ayant la séquence d' ., dans lequel le acides dérivé .fonctionnel a une séquence d ’acides aminés qui présente

BE2017/5910

une identité d'au	moins 99,8 %	sur toute sa	longueur
avec la séquence d	'acides aminés	de SEQ ID NO	: 1 ;
(c) un polyj	septide ayant	la séquence	d ’acides
aminés selon SEQ I	D KO : 1 ; et
(d) un dérivf	3 fonet i o nne1	d'un polypeptide ayant

la séquence d'acides aminés selon SEQ ID N.Q : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquencé d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d’acides aminés de 10 SEQ ID NO : 1.

La présente invention concerne également une composition comprenant au moins l’un de :

(a) un polynucléotide isolé qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'¹ acides aminés selon SEQ

ID NO : 1 ;

(b) un polynucléotide isolé qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO *. 1, dans lequel le

dérivé fonctionnel a une séquence	d’acides	aminés qui
présente	une identité d'au	moins	99,8 % si	ar toute sa
longueur 1 «	avec la séquence d'-	acides	amines ck	ï SEQ ID NO
.1. / (C)	un polypeptide	isolé	ayant 1	a séquence
d'acides	aminés selon SEQ ID	NO : 1	r
(d)	un dérivé fonction	nel isolé d'un	polypeptide
ayant la	séquence d'acides s	iminés	selon SEQ	ID NO : 1,

dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence

d'acides aminés	qui présente nne	identité d'au moins
99,8 % sur toute	sa longueur avec	la séquence d'acides
aminés de SEQ ID	NO : 1 ;

BE2017/5910 (e) un vecteur comprenant un polynucléotide tel

	que décrit en (a) ou .(b). ci-di	sssus ; et
	(f) un adénovirus re>	combinant	comprenant	un
	polynucléotide tel que décrit	en (a) ou	(b) ci-des	;sus,
5	et un excipient pharmaceutiqui	sment a-ccep:	table.
	La présente invention	concerne	également	une

cellule comprenant au moins l’un de :

	(a) un polynucléot polypeptide ayant la séq:	ride Lience	isole qui t d'acides ai	code pour un .ni n é s s e Ion S EQ
1:0:	ID NO t 1,
	( b) un po1ynu c l éot ide	isolé qui	code pour un

dérivé- fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO * 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides. aminés qui 15 présente une identité -d^rau moins 99,-8 % sur toute sa longueur avec la séquence d’acides aminés de SEQ T.D NO ;

(c) un vecteur comprenant un polynucléotide tel que décrit en (a) ou (b) ci-dessus, et (d) un adénovirus recombinant comprenant un polynucléotide tel que décrit en (a) ou (b) ci-dessus.

1/invention concerne également un. polypeptide adénoviral isolé, sélectionné dans le groupe constitué de :

.(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; et.

(b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel re dérivé: fonctionnel a une séquence d’acides 30 aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur

BE2017/5910 toute sa longueur avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO : 1.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figures 1A-.1D - Alignement des séquences de la 5 protéine fibre des adénovirus simiens indiqués.

ChAdl57 (SEQ ID NO : 1)

ChAd3 (SEQ ID NO : 27)

PanAdB	(SEQ	ID NO	: 28)
ChAdl7	(SEQ,	ID NO	: 29)
10 ChAdl9	(SEQ	ID NO	: Bö)
ChAd24	(SEQ	ID NO	: 31)
ChAdl55	(SE<	2 ID N(	3 : 7)
ChAdl1	(SEQ	I D NO	: 32)
ChAdEO	(SEQ	ID NO	: 33)
15 ChAd31	(SEQ	ID NO	: 34)
PauAdl	(SEQ	ID NO	: 35)
PanAd2	(SEQ	ID NO	: 36)
Figure	2	Re pré sen ta t i on s chômai1 qu e	de 1
nsi vette BAC	du s·	Qus-gn	supe C
20 Figure	3	Rep	présentât ion s chémat ique	de 1
navette plas	midi-	que du	sous-groupe C
Figure	4 ...	Répré	sent at ion. schématique du	vecteù
pChAdl.57 ΔΕ1	/Tet<	0 hCMV	GAG
Figure	5	Représentation schématique	de 1
25 navette pARS	Sue	ciesC /	AdSorf6-2

Figure 6 ~ Représentation schématique du plasmide portant le ChAdl57 RG

Figure 7 - Expression de transgènes par

ChAdl57/GAG, ChAdl9/GAG et ChAdl55/GAG

Figure 8 - Analyse par Western de lysats de cellules Hela infectées av.ec ChAdl55/RG et ChAdl57/RG

B E2017/5910

Figure 9 - Pouvoir immunelogique de ChAdl57/GAG, ChAdl55/GAG et ChAdl9 GAG chez des souris BALB/c

Figure 10 - Pouvoir immunologique de ChAdl57/RG et ChAdlS.5/RG' chez, des souris BALB/c

Figure 11 ~ Titres de neutralisation suivant la pré-immunisation de souris avec différents vecteurs Ch Ad

Figure 12 - ELlSpot d/IFNy suivant la vaccination de souris avec ChAdl57/GAG après différents régimes de ] p pr é -immuni s at ion

DESCRIPTION DES SEQUENCES

SEQ	ID NO	: 1 - Séquence	polypeptidique de la
fibre de	ChAdl57
SEQ	ID NO :	2 - Séquence pol	. yn uc1éot i dique	codant.
pour la f	'ibre de	ChAdl.57
SEQ	ID NO ;	3 - Séquence pol	. yp ept id i que du	penton
de ChAd15	>7
SEQ	ID NO :	4 - Séquence pol	. yn ucléo t idique	codant

de poux le penton de ChAdl57

SEQ ID NO : 5 ~ Séquence polypeptidique de 1'hexon ChAdl57

SEQ ID NO : 6 - Séquence polynucléotidique codant pour 1/hexon de ChAdl57

SEQ ID NO : 7 - Séquence polypeptidique de la fibre de ÇhAdlSS

SEQ: ID NO : 8 - Séquence polynucléotidique codant pour la fibre de ChAdlSS

SEQ ID NO î: 9 - Sequence polypeptidique du penton de 'ChAdl55

SEQ ID NO : 10 - Sequence polynucléotidique codant pour le penton de ChAdlSS

BE2017/5910

SEQ ID NO : 11 - Sequence polypeptidique de

1'hexon de ChAdi 55

SEQ ID NO : 12 - Séquence polynucléotidique codant pour 1'hexon de ChAdlSS

SEQ ID NO : 13 - Séquence polynucléotidique codant pour ChAdlSh de type sauvage

SEQ ID NO : 1'4 - Séquence polynucléotidique de ia navette BAC de sous-groupe C (#1365)

SEQ	ID NO : 15 - Séquence	p o 1 yn u clé o t i d i qu e	de
10 pChAdlSV.	ÛE1 TetO. hCMV RpsLKana#155	1
SEQ H-n VT Μ	ID NO : 16 - Séquence pol	ynue1é o tldi qu e de	Gag
tï LJ- </ .LU SEQ	ID NO : 17 - Séquence	pô1ynuc1éoti dique	de
pChAdlST	ΔΕΙ/TetO hCMV GAG#1557
15 SEQ	ID NO : 18 - Séquence	p o 1 y nu c 1 é o t i d i que	de
1'amorce	1 Ad5orf6
SEQ	ID NO : 19 - Séquence	p o 1 y nue 1 é 011 d i q ue-	de
l'amorce	2 Ad5orf6
SEQ	ID NO : 20 - Séquence	polynucléot idique	de
20 l'amorce	1 Fibre-polyA E4
SEQ	ID NO : 21 - Séquence	p o i y nu c1éot idi que :	de
.1'amorce	2 Fibre-polyA E4
SEQ	ID NO : 22 - Séquence	p o 1 y n u c 1 éo t idique.	de
ChAd'157 ~	ÛElE4_Ad5E4orf6/TetO hCMV	Rp s L-Kana #1594
25 SEQ	ID NO : 23 - séquence polynucléotidique de	la
qlycopro	téine de la rage
SEQ	I'D NO : 24 - Séquence	; jo1y nucléo t idique	de
pChAd.157	Δ E1E 4 Ad5E4Or f 6/Tet0 hCMV	' RG#}75«
SEQ	ID NO : 25 - Séquence	poJ ynucléoridigue	de
30 1ramorcé	CMFfor

BE2017/5910

SEQ ID NO : 26 - Sequence polynuclcolidigue. de

1'amorce CMErev

SEQ	ID NO :	27 - Séquence	d'acides	èiminés	pour la
protéine	fibre	de	ChAd3
5 SEQ	ID NO	;	28 ~ Séquence	d’acides	aminé s	pour	1 3
protéine	fibre	de	Pan.Ad3
SEC)	ID NO	•	29 - Séquence	d'acides	aminés	pour	la
protéine	fibre	de	ChAdl?
SEQ	ID NO	•	30 - Séquence	d’acides	aminés	pour	la
10 protéine	fibre	de	ChAdl9
SEQ	ID NO	*·	31 -- séquence	d'acides	amines	peur	la
prot.erne	fibre	de	ChAd24
SEQ	ID NO	:	32 - Séquence	d'acides	aminés:	pour	la
protéine	fibre	de	ChAdl1
15 SEQ	ID NO	;	33 - Sequence	d'acides	aminés	pour	.1.3
protéine	fibre	de	ChAd20
SEQ	ID NO	-	34 ~ Séquence	d'acides	aminés	pour	la
protéine	fibre	de	ChAd3I
SEQ	ID NO	:	35 - Séquence	d'acides	aminés	pour	la
20 protéine	fibre	de	PanAdl
SEQ	ID NO	•	36 - Séquence	d'acides	aminés	pour	la
protéine	fibre	de	PanAd2
SEQ	ID NC	> :	37 - Séquence polynu	rcléotidique	de

hCMV(tetO)

SEQ ID NO : 38 - Séquence polynucléotidique du plasmide navette #1376 de sous-groupe C

SEQ ID NO : 39 - Séquence polynucléotidique de de BGH polyA

SEQ ID NO : 4:0 - Séquence polynucléotidique de pARS SpeciesC Ad5orf6-2

BE2017/5910

SEQ. ID NO : 41 - Séquence polynucléotidique de la sonde CMWÄM-TAMRA

SEQ ID NO : 42 ~ Séquence polynucléotidique codant pour le promoteur du hCMV

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Les vecteurs, les compositions et les procédés de la présente invention peuvent présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes améliorées parrapport à l'état de l'art , comprenant de manière non 10 limitative une productivité plus élevée, une immunogénicité améliorée, une expression accrue de transgènes ou un profil distinct de réactivité croisée sérologique.

Les vecteurs, les compositions et les procédés de 15 la présente invention peuvent p.résentep une combinaison de propriétés, comme la productivité, 1'immunogénicité, 1'expression de transgènes et/ou la réactivité croisée sérologique, ce qui signifie qu'ils constituent une alternative de valeur aux approches connues.

.Adénovirus

Les adénovirus ont une morphologie caractéristique c omp r e n an t t r ois la base du penton conjointement à un i c o s a é d r i g u e l'hexon (II), à bouton (IV) ,

3Ö avec une capside protéines majeures, (III) et une fibre certain nombre d'autres protéines mineures, VT, VIII, du virus est un ADN doubleintimement associé à la à un petit peptide pX autre protéine, V, est

IX, Ilia et iVaî.. Le génome brin linéaire. L'ADN viral est protéine VII très basique (anciennement dénommé mu) .

empaquetée avec ce complexe ADN-protéine et fournit un et

Une

BE2017/5910

lien structural	avec la c·	apsidf	s via la.	p r o t é i ne VI. Le
virus contient	également	une	protéase	codée par le
virus, qui est	nécessaire	pour traiter	une partie des
p r o t. é i ne s s t r u c	turaies et	prod:	□ire le v	irus infectieux
mature.
I.e génome	d'adénoV	irus	est .b le	n caractérisé.
1'org an isa. t i on	globale	du	génome a	adénoviral est
généralement cons ervée corcerne	mt les ca	dre s de .lecture
ouverts s péci f i	que s posit	ionné	s de man:	1ère s im.il a ire,
e,g. 1' emplacemi	snt des gèr	tes El	.A, E1B, E	2 A, E2B, El, E4

.LI, L2, L3, L4 et 15 de chaque virus. Chaque extrémité du génome adénoviral comprend une séquence connue en tant que séquence répétée inversée terminale (ITR), qui est nécessaire pour la réplication virale. Le virus

15:	comprend égale	ment une pro	téas<	s codée pa?	? le virus, qui
	est necessaire	i pour trait	er i	me partie	des. protéines
	structurales	requises p	our	produire	les virions
	infectieux. L.	a. structure	du	génome a	tdénoviral est
	décrite en se	basant, sur .1	.'ordre dans le	quel les gènes
20	viraux sont exprimés sui	va nt	la trans	duetion de la
	cellule hôte	Plus spécifiquement, on	fait référence
	aux gènes vi.	eaux comme	aux	gènes pr<	âcoces (E) ou
	tardifs (L) se	Ion que la t	r.ans.i	oription se produit avant
	ou après le début de la r	épli	cation de	l’ADN. Dans la
25	phase précoce	de la trans·	duct :	ton, les gènes E1A, ETE,
	Ξ2Α, E2B, E3 <	st E4 de l'a	.déno	virus sont	exprimés pour
	préparer la o	ellule hôte	p.oui	? la répit	cation vi raie.
	Durant lai phase tardive d	i' inf	ection, I'	expression des
	gènes tardifs	L1-L5., qui	cod	ent pour	les composants
30	structuraux de	s particules	viri	aies, est c	Activée.

B E2017/5910

Les adénovirus sont spécifiques de l'espèce et des sérotypes différents, i.e. des types de virus qui ne sont pas neutralisés de manière croisée par des anticorps, ont été isolés d'une variété d'espèces de mammifères.. Par exemple, plus de 50 sérotypes ont été isolés d'humains qui sont divisés en 6 sons-groupes (AF ; B est sous-divisé en B1 et B2) en fonction de l'homologie de séquence et. de leur capacité à agglutiner les globules. rouges (Tat sis and Ertl pg Molecular Therapy (.2004) 10 : 616, 629-620) . De nombreux adénovirus ont été isolés de simiens non humains tels que les chimpanzés, les bonobos, les macaqués rhésus et les gorilles, et ils sont classés dans les mêmes groupés humains en fonction des relations 15 phylogénétiques .basées sur les séquences des hexons ou des fibres (Colloea et al. (2012) Science Translational Medicine 4 : .1-9 ; Roy et al. (2004) Virology 324 :

361-372 ; Roy et al. (2010) Journal of Gene Medicine 13 : .17-25) .

2Q W02005071093 décrit des adénovitus' de chimpanzé, y compris ChAdl9. WO2016198621 (PCT/EP2016/063329) décrit les adénovirus de chimpanzé ChAdlSS, et est intégré au présent document à titre de référence pour les fins de définition des vecteurs dérivés de ChAdl55.

Protéines de capside adénovirale incluant.....la protéine fibre et polynucleotides codant pour ces protéines

Comme souligné ci-dessus, la capside adénovirale comprend trois protéines majeures, l'hexon, le penton 30 et la fibre. L'hexon représente la majorité des composants structuraux de la capside, qui est

BE2017/5910 constituée de 240 capsomères d'hexon trimériques et de 12 bases du penton. L'hexon a trois doubles -tonneaux conservés, alors que le dessus présente trois tours, chaque tour contenant une boucle de chaque sous-unité 5 qui forme la plupart de la capside. La base de l'hexon est hautement, conservée entre les sérotypes adénoviraux, alors que les boucles de surface sont variables (Tatsis and Ert.l Molecular Therapy (2004} 1.0 : 616,629-629}.

Le penton est une autre protéine de capside 10. adénovirale qui forme une base pentamérique à laquelle la fibre s'attache. La protéine de fibre trimérique dépasse de la base: du penton au niveau de chacun des 12 sommets de la capside et est une structure de type tige à bouton. Une différence remarquable dans la surface 15 des capsides adénovirales par rapport à celles de la plupart des autres virus icosaédriques est la présence de la longue et fine protéine fibre. Le rôle principal de la protéine fibre est la fixation de la capside virale à la surface de la cellule via son interaction avec un récepteur cellulaire.

Les protéines fibres de nombreux sérotypes d'adénovirus partagent une architecture commune : une queue N-terminale, une tige centrale constituée de séquences répétées, et. un domaine globulaire bouton C25 terminal (ou « tête ») . Le domaine: de la tige centrale est constitué d'un nombre variable de répétitions bêta.

former une structure allongée de trois brins en spirale queue N-terminale à la structure de bouton globulaire, qui est responsable

BE2017/5910 nature, globulàire du domaine bouton de l'adénovirus présente de grandes surfaces de liaison du récepteur latéralement et au sommet. IV effet de cette architecture· est de projeter le site de liaison du 5 récepteur loin de la capside du virus, libérant ainsi le virus des contraintes stériques présentées par la surface de la capside relativement plate.

Bien que les fibres de nombreux sérotypes d' adenovirus aient la même, architecture globale, elles :10 ont des séquences d'acides aminés variables qui influencent leur fonction et leur structure. Bar exemple, de nombreuses régions exposées sur la surface du bouton de la fibre présente un site de liaison du récepteur facilement adaptable. La forme globulaire du 15 bouton de la fibre permet aux récepteurs de se lier au niveau des côtés du bouton ou sur le dessus du bouton de la fibre. Ces sites de liaison se trouvent typiquement sur les boucles exposées à la surface reliant les brins bêta qui sont faiblement conservées 20 parmi les? adénovirus humains. Les chaînes latérales exposées sur ces boucles donnent au bouton une variété de caractéristiques de surface tout en préservant la structure tertiaire et quaternaire. Par exemple, le potentiel électrostatique et les distributions de 25. charges au niveau des surfaces du bouton peuvent varier en raison de la vaste gamme de points isoélectriques dans les séquences du bouton de la fibre, d'un pi d'environ 9 pour Ad8, Ad 19, et Ad 37 à environ 5 pour les adénovirus du sous-groupe B. En tant que ligand 30 viral complexe sur le plan structural, la protéine fibre permet la présentation d'une variété de surfaces

BE2017/5910

de	liaison (bout«	un) dans un	nombre dorienta	tions et de
di	st a n c e s ( t i g e}	depuis	La capside virale.
	L'une des	variât)	ions	les plus évide	ntes entre
ce	r t a i n s s é r ό t y p	>es est	la	longueur de la	fibre. Des
et	udes ont mis ë	»n évidi	an ce	que la longueur	de la tige
de	la fibre ir	if luençait	f ort emen t 1'int e	raction du
bo	uton et du virus avec	ses	récepteurs cible	s. De plus,
la	capacité à	se plier	des protéines f	ihres peut

également varier entre les sérotypes. Bien que les pg répétitions bêta dans la. tige forment une structure hautement stable et régulière, des études par microscopie électronique (EM) ont mis en évidence des charnières distinctes dans la fibre. L'analyse de la séquence protéique de plusieurs fibres de sérotypes j 5 adénoviraux montre une interruption dans les sequences répétées de la tige au niveau de la troisième répétition bêta à partir de la queue N-terminale, ce qui est fortement corrélé à l’une des charnières dans la tige, comme- ceci est observé par microscopie pg électronique. Les charnières dans la fibre permettent au bouton d'adopter une variété d'orientations par rapport à la capside virale, qui peuvent empêcher les encombrements stériques à 1’engagement du récepteur nécessitant la présentation correcte du site de liaison 25 du récepteur sur le bouton. Par exemple, les fibres rigides des adénovirus du sous-groupe D nécessitent ainsi un récepteur flexible ou un pré-positionné pour la fixation du virus, étant donné qu'ils sont incapables de se plier eux-mêmes. (Nicklin et ai. 3Q Molecular Therapy 2005 12 : 384-393)

B E2017/5910

L^r i d e n t i t i ca t on des cellulaires spécifiques de différents sérotypes d'Ad et la connaissance de la manière dont ils contribuent au «s permises par l'utilisation de la technologie de pseudotypage par les fibres. Bien que les adénovirus de certains sous-groupes utilisent eur primaire, clsir des récepteurs primaires alternatifs _r conduisant un tropisme largement différent in vitro et in vivo.

Les de nettes dans leurs structures primaires et telles que la rigidité de la tige de la longueur de la tige de la fibre, et l'absence d'un site de liaison de

CAR et/ou le motif putatif de

H S P G, cο n jo intement aux différences de charge nette l'intérieur du bouton de la fibre. Le pseudotypage de particules des Ad 5 avec une autre tige et un autre la possibilité de supprimer * important de liaison en outre, peut permettre une délivrance plus efficace des transgènes (et potentiellement plus par rapport types de cellules à celle obtenue avec les Ad neutralisation des particules d'Ad pseudotypées par les fibres peut également être réduite si les fibres proviennent d'adénovirus ayant une seroprevalence inférieure chez les humains ou les modèles expérimentaux, une situation qui favorise 1’administration fructueuse du vecteur (Nicklin et al. Molecular Therapy (2005) 12 : 384-393). En outre, une

B E2017/5910 fibre de longueur totale, ainsi que des régions de bouton de fibre isolées, mais pas l'hexon ou le penton seul, sont capables d'induire la maturation des cellules- dendritiques et sont associées à l'induction d'une puissante réponse des lymphocytes T CD8+ (Molinier-Frenkel et al. J. Biol. Chem. (2-0Ό3) 278 :

37175-37182). Globalement, la fibre adénovirale joue un rôle important au moins dans la liaison aux récepteurs et 1’immunogénicité des vecteurs adénoviraux.

L'alignement proposé sur la figure 1 illustre les différences entre les protéines fibres des adénovirus simiens du groupe C. Un élément frappant est que les séquences de la fibre de ces adénovirus peuvent être largement groupées en séquences ayant une fibre courte, par exemple ChAdl57, ou une fibre longue, par exemple ChAdl.55. Ce: différentiel de longueur est dû à une délétion de 36 acides aminés à la position 321 approximativement dans la fibre courte par rapport à la fibre longue. En outre, il existe un certain nombre de substitutions d'acides aminés qui diffèrent entre le sous-groupe fibre courte versus longue, mais qui restent cohérentes à l'intérieur de chaque sous-groupe. Bien que la fonction exacte de ces différences n'ait pas encore été élucidée, étant donné la fonction et l'immunogénicité de la fibre, ces différences sont probablemerrt pertinentes,. Il a été rais en évidence que l'un des déterminants du tropisme viral était la longueur: de la tige de la fibre. Il a été mis en évidence qu'un. vecteur AdS avec une tige plus courte avait une efficacité de liaison au récepteur CAR inférieure et une infectivité infé'rieur-e (Ambriovic18

BE2017/5910

Ristov A. et al

Virology.

(2003) 312(2}

Le postulat a été émis courte conduisant à

77(13} : 72

Dans un de des déficience rigidité accrue de la fibre plus une (Wu, aspect , fixation moin efficace au

Virol. (2003) l^f invention concerne un fibre isolé d'adénovirus de chimpanzé polynucleotides isolés codant pour le polypeptide de fibre de 1'adénovirus de chimpanzé

C.hAdl57.

Ou s'attend à ce que la protéine fibre contribue à une faible séroprévalence et à ce qu’elle puisse, ainsi, être utilisée indépendamment des polypeptides de 1'hexon et du penton de ChAdl57 ou en combinaison (avec l'un ou l'autre ou les deux de l'hexon et du penton) pour supprimer l'affinité d'un adénovirus envers des anticorps neutralisants préexistants, e.g. pour fabriquer un adénovirus recombinant avec une

2g séroprévalence réduite. Un tel adénovirus recombinant peut être un adénovirus chimère avec des protéines de capside de différents sérotypes avec au moins une protéine fibre de ChAdl57,

	La séquence polypeptidique	de la fibre	de	ChAdl57
25 est.	donnée	dans SEQ ID NO : 1.
	La sé	q ue n ce p o 1 yp ep tri d i qu e	du penton	de	ChAdl57
est	donnée	dans SEQ ID NO : 3.
	La sé	que n c e po1yp eptldi qu e	de 1'hexon	de	ChAdl57
est	donnée	dans SEQ ID NO : 5.

B E2017/5910

Polypeptides, adénovirus recombinants, compositions ou ce11u1es c omp renani des séquences polypeptidiques de la fibre de ChAdl57 ou un dérivé fonctionnel de celle-ci

De manière adaptée, le polypeptide isolé,

1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule dé l'invention comprennent un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1.

Le polypeptide, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de 1/invention peuvent |q comprendre un polypeptide qui est un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec 15 la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.

En variante, le dérivé fonctionnel n'a pas plus d'une, addition, d'une délétion ou d'une substitution relativement à SEQ ID NO : 1, par exemple une substitution par rapport à SEQ ID NO : 1.

2p. De manière adaptée, le polypeptide, 1'.adénovirus recombinant., la composition ou la cellule selon .1'invention comprend en outre :

(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 60 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de 30 SEQ ID NO : 3, et/ou

BE2017/5910 (a) un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) cm dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant

la séquence d.’acideé aminés selon SEQ: ID NO	: 5, dans
lequel le. dérivé fonctionnel a une séquence	; d’acides
aminés qui présente une identité d'au moins	60 % sur
toute sa longueur avec la: séquence a'acides	aminés de

SEQ ID NO : 5.

De manière adaptée, le dérivé fonctionnel d'un 10 polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ ID NO : 3 a une séquence d’acides aminés qui présente une identité d'au moins 70 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, comme d'au moins 80 %, en particulier d'au moins 90 %, par 1:5 exemple d'au moins 95 % ou d'au moins 98 %.

De manière adaptée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins- 70 % sur toute- sa longueur avec 20 la séquence d’acides aminés de SEQ I'D NO : 5, comme d'au moins 80 %, en particulier d'au moins 90 %, par exemple d'au moins 95 % ou d'au moins 98 %.

En particulier, le polypeptide-, l'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule selon 25 l'invention comprend en outre :

(a) aminés se	un :lon	polypeptide SEQ ID NO : 3	ayant la ; et/ou	séquence	d'acides
	(-0)	un	polypeptide	ayant la	séquence	d’acides
ami	Inès selon.	SEQ ID NO : 5

BE2017/5910

Po1ÿriuc1éotides iso1és, _t vecteurs, adénovir os recombinants, compost. tlons ou cellules comprenant de s polynucleotides codant, pour la fibre de ChAdl57.....ou un dér i vé f bactionne 1 de celle --pi

De manière adaptée, le polynucléotide isolé, le vecteur, 1'adénovirus recombinant₍ la composition ou la cellule de .1’.invention comprennent un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1. De manière adaptée, le 10 polynucléotide a une séquence selon SEQ ID NO 2.

Lorsque le polynucléotide isolé, le vecteur, l'adénovirus recombinant, la composition ou la: cellule de l'invention comprend un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d’un polypeptide ayant la 15 séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel Le dérivé fonctionnel a une séquence d’acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence: -d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, le polynucléotide a, de manière adaptée., 20 une séquence selon SEQ ID NO : 2 dans laquelle un codon a été ajouté, délété ou modifié pour coder pour un acide aminé différent.

De manière adaptée, le polynucléotide, le vecteur, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la. cellule 25 de 1'invention comprend en outre un polynucléotide codant pour :

(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ ID NO : 3, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides

BE2017/5910 aminés qui présente une identité d'au moins 60 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et/ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 / ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ ID NO : 5, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides | g, aminés qui présente une identité d'au moins 60 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.

De manière adaptée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ 3 5 ID NO : 3 a une séquence d’acides aminés qui présente une identité, d'au moins 70 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, comme d'au moins 80 %, en particulier d'au moins 90 %, par exemple d'au moins 95 % ou d'au moins 98 %.

De manière adaptée, lie dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 70 % sur toute sa longueur avec la séquence d’acides aminés d.e

SEQ ID NO :

5, comme

9d'au moins 80 %, en particulierd'au moins %, pa r exemple d'au moins 95 % ou d'au moins 98 %.

En particulier, polynucléotide, le vecteur,

1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de 1'invention comprend

3Q codant pour

BE2017/5910 (a) un.

polype p t i de d'acides aminés selon ; et/ou (b) un po1ypept ide ayant la séquence d'acides le vecteur,

1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de

1'invention peut en outre comprendre * (a) un polynucléotide selon SEQ ID NO (b) un polynucléotide selon SEQ I'D NO et/ou

Squelettes de ChAdl57

L'invention concerne des séquences polynucléotidiques isolées d¹adénovirus de chimpanzé ChAdlSl, y compris celles de ChAdl57 non modifié de type sauvage et des constructions de .squelette modifiées de ChÂdl57t Ces constructions de squelette modifiées comprennent celles proposées dans les exemples , par exemple pChAdl57AEl TetO hCMV RpsLKana#1551 {SEQ ID NO : 15) et ChAdl57

ΔΕ1Ε4 Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL~Kana#1594 (SEQ ID NO :

2.2) . Les squelettes de ChAdl57 peuvent être utilisés dans la construction d'adénovirus recombinants compétents pour la réplication ou incompétents pour la réplication, par exemple pour la délivrance de 2 5 t r a n s gèn e s .

1/annotation de la séquence de pChAdl.57 ΔΕΙ/TetO hCMV GAG (SEQ ID NO : 17) est donnée ci-dessous.

BE2017/5910

Atii-iohiiti οπ5 ChAcÎ157DÉl JTetÓhCMV GAG

T.X 3187 . . 3651

IVa2 'mplvrm‘lit (Πΐιι. .5045, 5325 . .5337)

Pol romptement (481 6. .>V-i7, 13762.. 13770)

VA RNA1 10238. .19 V·) pTP ” .ei>tPiurnt (Rim .. 111 >, 1 ^ '· 2 .BUN

48K lu652. .11914 pilla 11938. .13714

I.ÎÏ 13807. .1 5588 pVII 15603..16199

V 16279,.173013 pX )7415..17^0 pvi 17750..13503

Hexon 18623..21499 /15/).,22158

DSP Complement (22274. .23926)

K 2397 6.. 2 6447'

22K 26104...2673 9

33K J jxr> (. 611.4. . '6473,1 >U Z«. . 270il}

K2e promctei Complement 127027..27274) pV.ni 27136. .27819

Ê3 12K 27820..28137

F.3 'VU-alpb ij 0 .61.30.,2 335

Γ > qph'K îh. ..'1/ e

E.3A 11K 30776. .31072

1:5

E3 RID alpha 31 034 .. 313.56

E 3 Rï D bat a 3155·) .3)757

E3 15K 31750. .32136

U exon Complement (32167..32331) fibre 32342..33973

E4 OP.F6/7

E4 ORF6

E4 ORF4 ' . uple ».„t 1141' !.. Ml’ t, ΛιΡ. . 5 Ml)

Complement: (34457. .35341)

Complement ( 35241. . .35606)

E4 OR F.3

E4 ORE2

E4 ORB’l

Complement { 35i·/? . . 35969) i’> •mvlcment ( . 3oJbc)

Complement. (36411 < . 36797)

Dans un mode de réalisation, les fragments des séquences de SEQ ID NO : 15, 22 et leurs brins complémentaires, leur ADNc et leur ARN complémentaires 25 sont proposés. De manière adaptée, les fragments sont d'une longueur d'au -moins 15 nucléotides, de manière plus adaptée d'une longueur de 3-0 nucléotides, de manière plus adaptée d’une longueur de 60 nucléotides, de manière- plus adaptée d'une longueur de 120 30 nucléotides, de manière plus adaptée de 240, de manière plus adaptée d'une longueur de 4 80 nucléotides et. comprennent des fragments fonctionnels, en d'autres

BE2017/5910 termes., des fragments qui présentent un intérêt biologique. Par exemple, un fragment fonctionnel peut exprimer un produit adénoviral voulu .ou peut être utile dans la production de vecteurs viraux recombinants. De 5 tels fragments comprennent les séquences géniques proposées dans la liste ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, les séquences isolées de SEQ ID NO : 1.5, 22 et leurs brins complémentaires, leur ADNc et leur ARN complémentaires sont proposés.

Les produits géniques de 1'adénovirus ChAdl57, par exemple les protéines, les enzymes, et les fragments de celui-ci, qui sont codés par les acides nucléiques adénoviraux,, et les fragments susmentionnés de ceux-ci, décrits dans le présent document sont proposés. De Ig tellesprptéine.s comprennent celles codées par les cadres de lecture, ouverts identifiés ci-dessus et les protéines codées par les polynucléotides proposés dans le Listage des Séquences.

Autres po1ynucléotides et polypeptides de ChAdl57

Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide de 1'invention comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de la fibre ; un polypeptide de 1'hexon et un polypeptide de la gu fibre ; un polypeptide du pent on- et un polypeptide de .la fibre ; ou un polypeptide de i'hexon, un polypeptide du penton et un polypeptide de la fibre de l'invention ; et peut en outre comprendre des polynucleotides adénoviraux supplémentaires, de manière adaptée des 3Q polynucleotides de ChAdl57. Ainsi, de manière adaptée,

BE2017/5910 le polynucléotide selon 1'invention comprend un ou plusieurs des suivants :

(a) une séquence répétée inversée terminale en 5' (ITR) adénovirale ;

5	(b)	une région El	.A adénovirale, ou un fragiï	ont de
	ce!le-ci	sélectionné	parmi les régions El A 21	3 OR
	E1AJ243R	7
	(C)	une région	E1B ou IX adénovirale,	ou un
	fragment	de celle-c.	i. sélectionné dans le	groupe)
10	constitué	des régions	E1B_19K, E1B__55K et IX ;

(d) une région E2B adénovirale ; ou un fragment de celle-ci sélectionné deins le groupe constitué des régions E2B pTP, E2B__polymérase et E2B IVa2 ;

(e) une région L1 adénovirale, ou un fragment de 15 celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué des protéines L1_13.6K, L1__52K et L1 pilla ;

(f) une région adénovirale L2 ou une région L2 comprenant un polynucléotide codant pour la protéine penton de l'invention, ou. un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L2_pe-nton, de la protéine L2__pVII, de la protéine L2_y et de la protéine L2 pX ;

(g) une région adénovirale L.3 ou une région L3 comprenant un polynucléotide codant pour la protéine hexon de l'invention, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment. codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine 30 L3 pVI, de la protéine L3 hexon et de la protéine L 3_prot é a s e ;

BE2017/5910 (h) une région E2A adénovirale ;

(i) une région L4 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L4_100k, de la protéine L4_33K, de la protéine L4_22K et de la protéine L4_VIII ;

(j) une région E3 adénovirale, ou un fragment de celle-ci sélectionné dans le groupe constitué de ORF1 d'E3, ORF2 d'E3, ORF3 d'E3, ORF4 d'E3, ORF5 d'E3, ORF6 d'E3, ORF7 d'E3, ORF8 d'E3, et ORF9 d'E3 ;

(k) une région L5 adénovirale ou une région L5 comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide de la fibre L5_fibre de l'invention ;

(l) une région E4 adénovirale (par exemple d'Ad5), ou un fragment de celle-ci sélectionné dans le groupe constitué de ORF7 d'E4, ORF6 d'E4, ORF4 d'E4, ORF3 d'E4, ORF2 d'E4, et ORF1 d'E4 ; en particulier de ORF6 de ladite région E4 ;

(m) une région 3'-ITR adénovirale ; et/ou (n) une région d'ARN adénoviral VAI ou VAII, de préférence une région d'ARN adénoviral VAI ou VAII d'un adénovirus autre que ChAdl57, de manière davantage préférée d'Ad5.

Définitions

De manière adaptée, les polynucléotides ou polypeptides de l'invention sont isolés. Un polynucléotide « isolé » est un polynucléotide qui est extrait de son environnement original. Par exemple, un polynucléotide présent naturellement est isolé s'il est séparé de tout ou partie des matières co-existantes

BE2017/5910 dans le système naturel. On considère qu'un polynucléotide est isolé si, par exemple, il est cloné dans un vecteur qui ne fait pas partie de son environnement naturel ou s'il est compris dans un ADNc.

De manière adaptée, les polynucléotides de l'invention sont recombinants. Recombinant signifie que le polynucléotide est le produit d'au moins l'une des étapes de clonage, de restriction ou de ligature, ou autres procédures qui aboutissent à un polynucléotide qui est distinct d'un polynucléotide que l'on rencontre dans la nature. Un adénovirus recombinant est un adénovirus comprenant un polynucléotide recombinant. Un vecteur recombinant est un vecteur comprenant un polynucléotide recombinant. Un « virus recombinant » comprend la progéniture du virus recombinant original. Un « vecteur recombinant » comprend des réplicats du vecteur recombinant original. Un « polynucléotide recombinant » comprend les réplicats du polynucléotide recombinant original.

De manière adaptée, la séquence polypeptidique de la présente invention contient au moins une modification par rapport à une séquence native. De manière adaptée, les séquences polynucléotidiques de la présente invention contiennent au moins une modification par rapport à une séquence native. Par exemple, un polynucléotide introduit par des techniques de génie génétique dans un plasmide ou un vecteur dérivé d'une espèce différente (et souvent d'un genre, d'une sous-famille ou d'une famille différents) est un polynucléotide hétérologue. Un promoteur extrait de sa séquence codante native et fonctionnellement lié à une

BE2017/5910 séquence codante avec laquelle on ne le retrouve pas naturellement lié est un promoteur hétérologue. Un site de recombinaison spécifique qui a été cloné dans un génome d'un virus ou d'un vecteur viral, dans lequel le génome du virus ne le contient pas naturellement, est un site de recombinaison hétérologue. Une séquence d'acide nucléique hétérologue comprend également une séquence naturellement retrouvée dans un génome adénoviral, mais située au niveau d'une position non native à l'intérieur du vecteur adénoviral.

Typiquement, « hétérologue » signifie dérivé d'une entité génotypiquement distincte de celle du reste de l'entité avec laquelle est réalisée la comparaison. Une séquence d'acide nucléique hétérologue fait référence à une séquence d'acide nucléique qui n'est pas isolée de, dérivée de, ou basée sur une séquence d'acide nucléique naturelle du vecteur adénoviral. Une séquence protéique hétérologue fait référence à toute séquence protéique qui n'est pas isolée de, dérivée de, ou basée sur une séquence protéique naturelle du vecteur adénoviral. « Naturelle » signifie une séquence rencontrée dans la nature et pas synthétiquement préparée ou modifiée. Une séquence est « dérivée » d'une source lorsqu'elle est isolée d'une source mais modifiée (par exemple, par délétion, substitution (mutation), insertion, ou autre modification) de manière adaptée de façon à ne pas perturber la fonction normale du gène source.

Un « dérivé fonctionnel » d'un polypeptide fait de manière adaptée référence à une version modifiée d'un polypeptide, par exemple, dans laquelle un ou plusieurs acides aminés du polypeptide peuvent être délétés,

BE2017/5910 insérés, modifiés et/ou substitués. Un dérivé d'une protéine de capside adénovirale non modifiée est considéré fonctionnel si, par exemple :

un adénovirus comprenant le dérivé d'une protéine de capside à l'intérieur de sa capside conserve sensiblement la même séroprévalence ou une séroprévalence inférieure par rapport à un adénovirus comprenant la protéine de capside non modifiée, et/ou (b) un adénovirus comprenant le dérivé d'une protéine de capside à

1'intérieur de sa capside conserve sensiblement la même infectivité de la cellule hôte ou une infectivité de la cellule hôte supérieure par rapport à un adénovirus comprenant la protéine de capside non modifiée, et/ou (c) un adénovirus comprenant le dérivé d'une protéine de capside à l'intérieur de sa capside conserve sensiblement la même immunogénicité ou une immunogénicité supérieure par rapport à un adénovirus comprenant la protéine de capside non modifiée, et/ou (d) un adénovirus comprenant le dérivé d'une protéine de capside à l'intérieur de sa capside conserve sensiblement le même niveau, ou un niveau supérieur, de productivité de transgènes comparé à un adénovirus comprenant la protéine de capside non modifiée.

Les propriétés (a) à (d) ci-dessus peuvent de manière adaptée être mesurées en utilisant les procédés décrits dans la section Exemples ci-après.

De manière adaptée, le polypeptide, le vecteur ou l'adénovirus recombinant a une faible séroprévalence dans la population humaine. « Faible séroprévalence »

BE2017/5910 peut signifier avoir un niveau d'anticorps neutralisant préexistant réduit comparé à 1'adénovirus humain 5 (Ad5). De manière similaire ou en variante, « faible

séroprévalence »	peut	signifier	une	séroprévalence
inférieure	à	environ	20	O θ r	une	séroprévalence
inférieure	à	environ	15	o θ r	une	séroprévalence
inférieure	à	environ	10	o θ r	une	séroprévalence
inférieure	à environ 5 %	, une	séropréval	ence inférieure

à environ 4 %, une séroprévalence inférieure à environ 3 %, une séroprévalence inférieure à environ 2 %, une séroprévalence inférieure à environ 1 %, ou une absence de séroprévalence détectable. La séroprévalence peut être mesurée comme le pourcentage d'individus ayant un titre de neutralisation cliniquement pertinent (défini comme un titre de neutralisation de 50 % > 200) en utilisant les procédés décrits dans Aste-Amézaga et al., Hum. Gene Ther. (2004) 15(3) : 293-304.

Les termes polypeptide, peptide et protéine sont utilisés de manière interchangeable dans le présent document.

Le terme « simien » est typiquement entendu comme comprenant les primates non humains, par exemple les singes de 1'Ancien Monde, les singes du Nouveau Monde, les grands singes et les gibbons. Simien peut en particulier faire référence à des grands singes non humains tels que les chimpanzés (Pan troglodyte) , les bonobos (Pan paniscus) et les gorilles (genre Gorilla). Les simiens autres que les grands singes peuvent inclure les macaques rhésus (Macaca mulatta).

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Comparaison de séquences

Pour des fins de comparaison de deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques étroitement proches, le « % d'identité » entre une première séquence et une seconde séquence peut être calculé en utilisant un programme d'alignement, tel que BLAST® (disponible à l'adresse suivante blast.ncbi.nlm.nih.gov, dernier accès 09 mars 2015) en utilisant les paramètres standard. Le pourcentage d'identité est le nombre de résidus identiques divisé par le nombre de résidus dans la séquence de référence, multiplié par 100. Les valeurs de pourcentage d'identité auxquelles il est fait référence ci-dessus et dans les revendications sont des pourcentages calculés par cette méthodologie. Une variante de définition du pourcentage d'identité est le nombre de résidus identiques divisés par le nombre de résidus alignés, multiplié par 100. Des méthodes alternatives comprennent l'utilisation d'une méthode des trous (gaps) dans laquelle des trous dans l'alignement, par exemple des délétions dans une séquence par rapport à l'autre séquence, sont pris en compte par un score de trous ou un coût de trous dans le paramètre de score. Pour plus d'informations, voir la fiche technique de BLAST® disponible à l'adresse suivante ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pd f, dernier accès le 09 mars 2015.

Les séquences qui conservent la fonctionnalité du polynucléotide ou d'un polypeptide codé ainsi sont susceptibles de présenter une plus grande identité. On considère que les séquences polypeptidiques ou

BE2017/5910 sont les séquences si elles leur longueur totale. « différence » entre à une insertion, une d'un résidu acide aminé la seconde séquence, comparé à la

Deux séquences polypeptidiques une, deux ou plus de ces différences insertions délétions séquence qui est séquence de 100 %) à polynucléotidiques aux, autres polynucléotidiques, 100 % sur

Une référence substitution position de séquence. contenir aminés. Les une seconde (identité de résultent en réduit. Par d'une longueur dans la seconde séquence de 88,9 d'une longueur de dans la seconde séquence de 88,2 d'une longueur de 7 dans la seconde séquence de séquences résidus acides les première partagent une identité et seconde séquences identité de 66,7 %).

séquences polypeptidiques un pourcentage exemple, si les de 9 acides aminés, séquence résulte en %. Si les séquences acides aminés, séquence résultent %. Si les séquences acides aminés, séquence résultent

57,1 %. Si les polypeptidiques sont aminés et partagent et seconde mêmes que, ou identiques polypeptidiques ou partagent une identité de des séquences fait délétion ou une unique à une première peuvent d'acides ou substitutions dans autrement identique une première séquence d'identité de séquence séquences identiques sont une substitution une identité de identiques sont deux substitutions en une identité de identiques sont trois substitutions en une identité de première et seconde d'une longueur de 9 résidus identiques, polypeptidiques % (les première partagent une les première et seconde sont d'une longueur de 17 séquences supérieure à 66 polypeptidiques Si

BE2017/5910 résidus acides aminés et partagent 16 résidus identiques, les première et seconde séquences polypeptidiques partagent une identité (les première et seconde séquences polypeptidiques partagent une identité de 94,1 %) seconde séquences polypeptidiques de 7 résidus acides aminés identiques, les première polypeptidiques partagent une

Si sont et et les première et d'une longueur partagent 3 résidus seconde identité (les première et seconde séquences partagent une identité de 42,9 %) .

Alternativement, pour les fins d'une première séquence polypeptidique une seconde séquence polypeptidique nombre d'ajouts, de substitutions de séquences polypeptidiques de comparaison de référence à comparaison, le et/ou de délétions apportés à la seconde séquence première séquence pour produire la peut être vérifié. Une addition est l'addition d'un résidu premier polypeptide (y de l'une ou l'autre premier polypeptide).

acide aminé dans la séquence du compris une addition au niveau des extrémités terminales du substitution d'un résidu du premier polypeptide différent. Une délétion

Une substitution est acide aminé dans par un résidu est la délétion la la séquence acide aminé d'un résidu acide aminé de la séquence du premier polypeptide (y compris une délétion au niveau de l'une ou l'autre des extrémités terminales du premier polypeptide).

Pour les fins de comparaison d'une première séquence polynucléotidique de référence à une seconde séquence polynucléotidique de comparaison, le nombre d'additions, de substitutions et/ou de délétions

BE2017/5910 apportées à la première séquence pour produire la seconde séquence peut être vérifié. Une addition est l'addition d'un résidu nucléotidique dans la séquence du premier polynucléotide (y compris une addition au niveau de l'une ou l'autre des extrémités terminales du premier polypeptide). Une substitution est la substitution d'un résidu nucléotidique dans la séquence du premier polynucléotide avec un résidu nucléotidique différent. Une délétion est la délétion d'un résidu nucléotidique de la séquence du premier polynucléotide (y compris une délétion au niveau de l'une ou l'autre des extrémités terminales du premier polynucléotide).

De manière adaptée, les substitutions dans les séquences de la présente invention peuvent être des substitutions conservatives. Une substitution conservative comprend la substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant une propriété chimique similaire à l'acide aminé qui est substitué (voir, par exemple, Stryer et al., Biochemistry, 5th Edition 2002, pages 44-49). De préférence, la substitution conservative est une substitution sélectionnée dans le groupe constitué de : (i) une substitution d'un acide aminé basique par un autre acide aminé basique différent ; (ii) une substitution d'un acide aminé acide par un autre acide aminé acide différent ; (iii) une substitution d'un acide aminé aromatique par un autre acide aminé aromatique différent ; (iv) une substitution d'un acide aminé aliphatique non polaire par un autre acide aminé aliphatique non polaire différent ; et (v) une substitution d'un acide aminé non chargé, polaire par un autre acide aminé non chargé,

BE2017/5910 polaire différent. Un acide aminé basique est de préférence sélectionné dans le groupe constitué de l'arginine, de 1'histidine, et de la lysine. Un acide aminé acide est de préférence 1'aspartate ou le glutamate. Un acide aminé aromatique est de préférence sélectionné dans le groupe constitué de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane. Un acide aminé aliphatique non polaire est de préférence sélectionné dans le groupe constitué de la glycine, de l'alanine, de la valine, de la leucine, de la méthionine et de 1'isoleucine. Un acide aminé non chargé, polaire est de préférence sélectionné dans le groupe constitué de la sérine, de la thréonine, de la cystéine, de la proline, de l'asparagine et de la glutamine. Contrairement à une substitution d'acide aminé conservative, une substitution d'acide aminé non conservative est l'échange d'un acide aminé par tout autre acide aminé qui ne tombe pas dans les substitutions conservatives (i) à (v) soulignées cidessus .

Vecteurs et adénovirus recombinants

Les séquences de ChAdl57 de l'invention sont utiles en tant qu'agents thérapeutiques et dans la construction d'une variété de systèmes de vecteurs, d'adénovirus recombinants et de cellules hôtes. De manière appropriée, le terme « vecteur » fait référence à un acide nucléique qui a été sensiblement modifié (par exemple, un gène ou une région fonctionnelle qui a été délété et/ou inactivé) par rapport à une séquence de type sauvage et/ou incorpore une séquence

BE2017/5910 hétérologue, en d'autres termes, un acide nucléique obtenu d'une source différente (également dénommé un « insert »), et répliquant et/ou exprimant la séquence polynucléotidique insérée, quand il est introduit dans une cellule (par exemple, une cellule hôte). Par exemple, 1'insert peut être la totalité ou partie des séquences de ChAdl57 décrites dans le présent document. En outre ou en variante, un vecteur de ChAdl57 peut être un adénovirus ChAdl57 comprenant une ou plusieurs délétions ou inactivations de gènes viraux, par exemple El ou autre gène viral ou région fonctionnelle décrit ici. Un tel ChAdl57, qui peut ou non comprendre une séquence hétérologue, est souvent dénommé « squelette » et peut être utilisé tel quel ou comme point de départ à des modifications supplémentaires du vecteur.

Un vecteur peut être toute molécule d'acide nucléique appropriée y compris de l'ADN nu, un plasmide, un virus, un cosmide, un vecteur phage tel qu'un vecteur lambda, un chromosome artificiel tel qu'un BAC (chromosome bactérien artificiel), ou un épisome. En variante, un vecteur peut être une unité de transcription et/ou d'expression pour la transcription ou l'expression in vitro acellulaire, par exemple un système T7 compatible. Les vecteurs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec d'autres séquences adénovirales ou fragments, ou en combinaison avec des éléments provenant de séquences non adénovirales. Les séquences de ChAdl57 sont également utiles dans des vecteurs de délivrance antisens, des vecteurs de thérapie génique, ou des vecteurs de vaccin. Ainsi, l'invention concerne également des vecteurs de

BE2017/5910

délivrance	de	gènes, et	des cellules	hôtes	qui
contiennent	les	séquences de	ChAdl57.
Le terme	adénovirus	« compétent	pour	la

réplication » fait référence à un adénovirus qui peut se répliquer dans une cellule hôte en l'absence de toute protéine auxiliaire recombinante comprise dans la cellule. De manière adaptée, un adénovirus « compétent pour la réplication » comprend les gènes précoces essentiels suivants, intacts ou fonctionnels : EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et E4. Les adénovirus de type sauvage isolés d'un animal particulier seront compétents pour la réplication dans cet animal.

Le terme adénovirus « incompétent pour la réplication » ou « déficient pour la réplication » fait référence à un adénovirus qui est incapable de réplication parce qu'il a été modifié pour comprendre au moins une délétion fonctionnelle (ou mutation « perte de fonction »), en d'autres termes une délétion ou une mutation qui détériore la fonction d'un gène sans la supprimer complètement, par exemple, l'introduction de codons stop artificiels, la délétion ou la mutation de sites actifs ou de domaines d'interaction, la mutation ou la délétion d'une séquence de régulation d'un gène, etc. ou un retrait complet d'un gène codant pour un produit génique qui est essentiel pour la réplication virale, par exemple un ou plusieurs gènes adénoviraux sélectionnés parmi

EIA, E1B,	E2A,	E2B, E3 et	E4 (par exemple	ORF1	d'E3,
ORF2	d'E3,	ORF3	d'E3, ORF4	d'E3,	ORF5 d'E3,	ORF6	d'E3,
ORF7	d'E3,	ORF8	d'E3, ORF9	d'E3,	ORF7 d'E4,	ORF6	d'E4,
ORF4	d'E4,	ORF3	d'E4, ORF2	d'E4	et/ou ORF1	d'E4	) . De

BE2017/5910 manière particulièrement adaptée, El et facultativement

E3 et/ou E4 sont délétées. En cas de délétion, la région génique délétée susmentionnée ne sera, de manière adaptée, pas prise en considération dans l'alignement lors de la détermination du pourcentage d'identité relativement à une autre séquence.

La présente invention concerne des vecteurs tels que des adénovirus recombinants qui délivrent une protéine, de manière adaptée une protéine hétérologue, aux cellules, pour des fins thérapeutiques ou vaccinales. Un vecteur peut comprendre tout élément génétique comprenant de l'ADN nu, un phage, un transposon, un cosmide, un épisome, un plasmide, ou un virus. De tels vecteurs contiennent de l'ADN de ChAdl57 tel que décrit ici et un minigène. Par « minigène » (ou « cassette d'expression ») on entend la combinaison d'un gène hétérologue sélectionné (transgène) et des autres éléments régulateurs nécessaires pour diriger la traduction, la transcription et/ou l'expression du produit génique dans une cellule hôte.

Typiquement, un vecteur adénoviral dérivé de ChAdl57 est conçu de manière à ce que le minigène se trouve dans une molécule d'acide nucléique qui contient d'autres séquences adénovirales dans la région native d'un gène adénoviral choisi. Le minigène peut être inséré dans une région génique existante pour perturber la fonction de cette région, si souhaité. En variante, le minigène peut être inséré dans le site d'un gène adénoviral partiellement ou totalement délété.

Par exemple, le minigène peut se situer sur le site d'une mutation, d'une insertion ou d'une délétion, qui rend

BE2017/5910 non fonctionnel au moins un gène d'une région génomique sélectionnée dans le groupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et E4. Le terme « rend non fonctionnel » signifie qu'une quantité suffisante de la région génique est supprimée ou autrement perturbée, de manière à ce que la région génique ne soit plus capable de produire des produits fonctionnels d'expression génique. Si souhaité, la totalité de la région génique peut être retirée (et de manière appropriée remplacée par le minigène).

Par exemple, pour un vecteur de production utile pour la génération d'un virus recombinant, le vecteur peut contenir le minigène et soit l'extrémité 5' du génome adénoviral soit l'extrémité 3' du génome adénoviral, ou à la fois l'extrémité 5' et l'extrémité 3' du génome adénoviral. L'extrémité 5' du génome adénoviral contient les éléments cis en 5' nécessaires pour l'empaquetage et la réplication ; en d'autres termes, les séquences ITR en 5' (qui fonctionnent comme les origines de réplication) et les domaines amplificateurs d'empaquetage en

5' natifs (qui contiennent les séquences nécessaires pour

1'empaquetage des génomes d'Ad linéaires et des éléments amplificateurs pour le promoteur El).

L'extrémité 3' du génome adénoviral contient les éléments cis en 3' (y compris les ITR) nécessaires pour l'empaquetage et 1'encapsidation. De manière adaptée, un adénovirus recombinant contient les éléments cis adénoviraux en 5' et en 3' et le minigène (contenant de manière appropriée un transgène) se trouve entre les séquences adénovirales en 5' et en 3' . Un vecteur

BE2017/5910 adénoviral basé sur ChAdl57 peut également contenir d'autres séquences adénovirales.

De manière adaptée, les vecteurs basés sur ChAdl57 contiennent un ou plusieurs éléments adénoviraux dérivés du génome adénoviral de ChAdl57 de l'invention. Dans un mode de réalisation, les vecteurs contiennent des ITR adénovirales de ChAdl57 et d'autres séquences supplémentaires du même sérotype d'adénovirus. Dans un autre mode de réalisation, les vecteurs contiennent des séquences adénovirales qui sont dérivées d'un sérotype adénoviral différent de celui qui fournit les ITRs.

Tel que ceci est défini dans le présent document, un adénovirus pseudotypé fait référence un adénovirus dans lequel les protéines de capside de

1'adénovirus proviennent d'un adénovirus différent de

1'adénovirus qui fournit les ITRs.

De	plus,	des adénovirus	chimères ou	hybrides
peuvent	être	construits	en utilisant les	adénovirus
décrits	dans	le présent	document en util	isant des
techniques connues des	hommes	du métier	(voir par
exemple,	US 7,	291,498).
Les	ITR	et toute	autre	séquence adénovirale
présente	dans	le vecteur de	la présente	invention
peuvent	être	obtenues à	partir	d'un grand	nombre de

sources.

Une variété de souches adénovirales sont disponibles auprès de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginie, ou disponible sur demande auprès d'une variété de sources commerciales et institutionnelles. De plus, les séquences d'un grand nombre de souches sont disponibles d'une variété de bases de données comprenant, par exemple, PubMed et

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GenBank. Des vecteurs adénoviraux homologues préparés à partir d'autres adénovirus de chimpanzé ou humains sont décrits dans la littérature publiée (par exemple, US 5,240,846). Les séquences d'ADN d'un certain nombre de types d'adénovirus sont disponibles auprès de la GenBank, y compris le type Ad5 (numéro d'accès GenBank M73370). Les séquences adénovirales peuvent être obtenues de tout sérotype d'adénovirus connu, par exemple les sérotypes 2, 3, 4, 7, 12 et 40, et comprenant en outre l'un quelconque des types humains actuellement identifiés. De manière similaire, les adénovirus connus pour infecter les animaux non humains (par exemple, les singes) peuvent également être utilisés dans les constructions de vecteur de cette invention (par exemple, US 6,083,716). Les séquences virales, les virus assistants (si nécessaire), et les particules virales recombinantes, et d'autres composants de vecteurs et séquences utilisés dans la construction des vecteurs décrits dans le présent document sont obtenus tel que décrit ci-dessous.

Production de séquence, de vecteur et d¹adénovirus

Les séquences de l'invention peuvent être produites par tout moyen approprié, y compris par production recombinante, par synthèse chimique, ou d'autres moyens de synthèse. Des techniques de production adaptées sont bien connues des hommes du métier. En variante, des peptides peuvent également être synthétisés par des procédés de synthèse de peptides en phase solide bien connus.

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Les plasmides adénoviraux (ou autres vecteurs) peuvent être utilisés pour produire des vecteurs adénoviraux. Dans un mode de réalisation, les vecteurs adénoviraux sont des particules adénovirales qui sont incompétentes pour la réplication. Dans un mode de réalisation, les particules adénovirales sont rendues incompétentes pour la réplication par des délétions dans les gènes E1A et/ou E1B, en particulier les gènes E1A et E1B. En variante, les adénovirus sont rendus incompétents pour la réplication par d'autres moyens en conservant facultativement les gènes E1A et/ou E1B. De manière similaire, dans certains modes de réalisation, la réduction d'une réponse immunitaire au vecteur peut être réalisée par délétions dans les gènes E2B et/ou de l'ADN polymérase. Les vecteurs adénoviraux peuvent également contenir d'autres mutations dans le génome adénoviral, par exemple, des mutations ou délétions thermosensibles dans d'autres gènes. Dans d'autres modes de réalisation, il est souhaitable de conserver une région E1A et/ou E1B intacte dans les vecteurs adénoviraux. Une telle région El intacte peut se trouver à son emplacement natif dans le génome adénoviral ou être placée dans le site d'une délétion dans le génome adénoviral natif (par exemple, dans la région E3) .

Dans la construction de vecteurs adénoviraux pour la délivrance d'un gène à une cellule de mammifère (par exemple humaine), il est possible d'utiliser dans les vecteurs toute une gamme de séquences d'acide nucléique d'adénovirus modifiées. Par exemple, la totalité ou une partie du gène adénoviral E3 précoce retardé peut être

BE2017/5910 éliminée de la séquence adénovirale qui forme une partie du virus recombinant. La fonction d'E3 ne serait pas nécessaire à la fonction et à la production de la particule virale recombinante. Des vecteurs adénoviraux peuvent également être construits avec une délétion au moins de la région ORF6 du gène E4, et de manière davantage souhaitable en raison de la redondance de la fonction de cette région, de la totalité de la région d'E4. Encore un autre vecteur de l'invention contient une délétion du gène E2A précoce retardé. Des délétions peuvent également être pratiquées dans l'un quelconque des gènes tardifs L1 à L5 du génome de 1'adénovirus. De manière similaire, des délétions dans les gènes intermédiaires IX et IVa2 peuvent s'avérer utiles pour certaines fins. D'autres délétions peuvent être apportées dans les autres gènes adénoviraux structuraux ou non structuraux. Les délétions abordées ci-dessus peuvent être utilisées individuellement, en d'autres termes, une séquence d'adénovirus destinée à être utilisée selon la présente description peut contenir des délétions uniquement dans une seule région. En variante, les délétions de gènes entiers ou de parties de ceux-ci efficaces pour détruire leur activité biologique peuvent être utilisées en toute combinaison. Par exemple, dans un exemple de vecteur, la séquence adénovirale peut avoir des délétions des gènes El et du gène E4, ou des gènes El, E2a et E3, ou des gènes El et E3, ou des gènes El, E2A et E4, avec ou sans délétions d'E3, et ainsi de suite. L'un quelconque ou plusieurs des gènes E peut de manière appropriée être remplacé par un gène E (ou un ou plusieurs cadres de lecture

BE2017/5910 ouvert des gènes E) provenant d'une souche d'adénovirus différente. De manière particulièrement appropriée, les gènes El et E3 de ChAdl57 sont délétés et le gène ChAdl57E4 est remplacé par E4Ad5orf6. Tel que ceci est abordé ci-dessus, ces délétions et/ou substitutions peuvent être utilisées en combinaison avec d'autres mutations, telles que des mutations thermosensibles, pour obtenir un résultat souhaité.

Un vecteur adénoviral ne possédant pas une ou plusieurs séquences adénovirales essentielles (par exemple, EIA, E1B, E2A, E2B, ORF6 d'E4, Ll, L2, L3, L4 et L5) , peut être cultivé en présence des produits géniques adénoviraux manquants qui sont nécessaires pour l'infectivité virale et la propagation d'une particule adénovirale. Ces fonctions auxiliaires peuvent être fournies par culture du vecteur adénoviral en présence de l'une des constructions auxiliaires ou plus (par exemple, un plasmide ou un virus) ou une cellule hôte d'empaquetage.

Complémentation de vecteurs incompétents pour la réplication

Pour générer des adénovirus recombinants présentant une délétion dans l'un quelconque des gènes décrits ci-dessus, la fonction de la région génique délétée, si elle est essentielle pour la réplication et l'infectivité du virus, doit être fournie au virus recombinant par un virus assistant ou une lignée cellulaire assistante, en d'autres termes, une lignée cellulaire de complémentation ou d'empaquetage.

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Virus assistants

Selon le contenu en gène adénoviral des vecteurs viraux utilisés pour porter le minigène, un adénovirus assistant ou un fragment de virus ne se répliquant pas peut être utilisé pour fournir suffisamment de séquences géniques d'adénovirus nécessaires pour produire une contenant le contiennent sélectionnées particule virale minigène. Des les non vecteur adénoviral cellulaire transfecté assistant contient adaptée, document.

adaptée, recombinante infectieuse virus assistants utiles séquences présentes et/ou non d'empaquetage dans géniques d'adénovirus dans la construction de exprimées par la lignée laquelle le vecteur est

Dans un mode de réalisation, le virus est des la ou

Un cellulaire défectueux pour la réplication et gènes adénoviraux outre, de manière les tel utilisé séquences décrites dans le virus assistant est, de en combinaison avec une exprimant El

Un virus assistant un gène rapporteur. Un (et peut facultativement facultativement présent manière lignée en outre contenir certain nombre de ces gènes rapporteurs sont connus dans l'art et bien décrits dans le présent document. La présence d'un gène rapporteur sur le virus assistant qui est différent du transgène sur le vecteur adénoviral permet que le vecteur adénoviral contrôlés.

séparation et le virus assistant soient indépendamment

Ce rapporteur est utilisé pour permettre la entre le virus recombinant obtenu et le virus assistant après la purification.

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Lignées cellulaires de complémentation

Dans un grand nombre de circonstances, une lignée cellulaire exprimant le ou les gènes manquants qui sont essentiels à la réplication et à l'infectivité du virus, par exemple El humain, peut être utilisée pour transcomplémenter un vecteur adénoviral de chimpanzé. Ceci est particulièrement avantageux parce que, en raison de la diversité entre les séquences adénovirales de chimpanzé de l'invention et les séquences adénovirales humaines rencontrées dans les cellules d'empaquetage actuellement disponibles, l'utilisation des cellules humaines contenant El actuelles empêche la génération d'adénovirus compétents pour la réplication durant le processus de réplication et de production.

En variante, si souhaité, il est possible d'utiliser les séquences proposées dans la présente invention pour générer une cellule ou une lignée cellulaire d'empaquetage qui exprime, au minimum, le gène El de ChAdl57 ou d'un autre adénovirus (par exemple un adénovirus humain, par exemple, hAd5 El, ou un autre ChAd El) sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur pour l'expression dans une lignée cellulaire parente sélectionnée. Des promoteurs inductibles ou constitutifs peuvent être utilisés pour cette fin. Des exemples de ces promoteurs sont décrits en détails ailleurs dans ce document. Une cellule parente est sélectionnée pour la génération d'une nouvelle lignée cellulaire exprimant tout gène de ChAdl57 souhaité. De manière non restrictive, une telle lignée cellulaire parente peut être la lignée HeLa (n° d'accès ATCC CCL

2], A549 [n d'accès ATCC CCL 185],

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HEK293, KB [CCL 17], Detroit [par exemple, Detroit 510, CCL 72] et WI-38 [CCL 75], entre autres. Ces lignées cellulaires sont disponibles auprès de la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginie 20110-2209.

De telles lignées cellulaires exprimant El sont utiles dans la génération de vecteurs adénoviraux recombinants avec El délété. En outre, ou en variante, des lignées cellulaires qui expriment un ou plusieurs produits géniques adénoviraux, par exemple, EIA, E1B, E2A, E3 et/ou E4, peuvent être construites en utilisant sensiblement les mêmes procédures que celles utilisées dans la génération de vecteurs viraux recombinants. Ces lignées cellulaires peuvent être utilisées pour transcomplémenter les vecteurs adénoviraux portant des délétions dans les gènes essentiels qui codent pour ces produits, ou pour fournir des fonctions d'aide nécessaires pour empaqueter un virus dépendant d'un virus assistant (par exemple, un virus adéno-associé) . La préparation d'une cellule hôte requiert des techniques telles que l'assemblage de séquences d'ADN sélectionnées.

Dans une autre variante, les produits géniques adénoviraux essentiels sont fournis en trans par le vecteur adénoviral et/ou le virus assistant. Dans un tel cas, une cellule hôte adaptée peut être sélectionnée dans un organisme biologique quelconque, y compris les cellules procaryotes (par exemple bactériennes), et les cellules eucaryotes, y compris, les cellules d'insectes, les cellules de levure et les cellules de mammifère.

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Les cellules hôtes peuvent être sélectionnées parmi toute espèce de mammifère, y compris, de manière non restrictive, des cellules telles que les cellules A549, WEHI, 3T3, 10'1'1/2, HEK 293 ou Per.C6 (les deux exprimant l'El adénoviral fonctionnel) [Fallaux, FJ et al., (1998), Hum Gene Ther, 9 : 1909-1917], Saos, C2C12, des cellules L, HT1080, HepG2 et des fibroblastes primaires, des hépatocytes et des myoblastes dérivés de mammifères y compris d'un être humain, du singe, de la souris, du rat, du lapin, et du hamster.

Une lignée cellulaire de complémentation particulièrement appropriée est la lignée cellulaire Procell92. La lignée cellulaire Procell92 est basée sur les cellules HEK 293 qui expriment les gènes El adénoviraux, transfectés avec le répresseur Tet sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase 1 (PGK) humaine, et le gène de résistance à G418 (Vitelli et al. PLOS One (2013) 8 (e55435) : 1-9). Procell92.S est adaptée pour la croissance dans des conditions de suspension et est utile pour la production de vecteurs adénoviraux exprimant des protéines toxiques (www.okairos.com/e/inners.php?m=00084, dernier accès le 13 avril 2015) .

Assemblage d'une particule virale et transfection d'une lignée cellulaire

Généralement, lors de la délivrance du vecteur comprenant le minigène par transfection, le vecteur est délivré en une quantité d'environ 5 pg à environ 100 pg d'ADN, et de préférence d'environ 10 à environ 50 pg d'ADN à environ 1 x 10⁴ cellules à environ 1 x 10¹³

BE2017/5910 cellules, et de préférence environ 10⁵ cellules.

Cependant, les quantités relatives d'ADN vecteur par rapport aux cellules hôtes peuvent être ajustées, en prenant en considération des facteurs tels que le vecteur souhaité, le procédé de délivrance et les cellules hôtes choisies.

L'introduction dans la cellule hôte du vecteur peut être réalisée par tout moyen connu dans l'art, y compris par transfection, et infection. Un ou plusieurs des gènes adénoviraux peuvent être stablement intégrés dans le génome de la cellule hôte, stablement exprimés comme des épisomes, ou exprimés de manière transitoire. Les produits géniques peuvent tous être exprimés de manière transitoire, sur un épisome ou stablement intégrés, ou certains des produits géniques peuvent être exprimés stablement alors que d'autres sont exprimés de manière transitoire.

L'introduction de vecteurs dans la cellule hôte peut aussi être réalisée à l'aide de techniques connues des hommes du métier. De manière adaptée, des techniques de transfection ordinaires sont utilisées, par exemple, la transfection au CaPC ou l'électroporation.

L'assemblage des séquences d'ADN sélectionnées de 1'adénovirus (ainsi que du transgène et des autres éléments du vecteur) dans différents plasmides intermédiaires, et l'utilisation du plasmide et des vecteurs pour produire une particule virale recombinante sont tous obtenus en utilisant des techniques classiques. Ces techniques comprennent des techniques classiques de clonage d'ADNc, l'utilisation

BE2017/5910 de séquences oligonucléotidiques se chevauchant sur les génomes d'adénovirus, la réaction de polymérisation en chaîne, et tout procédé approprié qui produit la séquence nucléotidique souhaitée. Des techniques standard de transfection et de co-transfection sont utilisées, par exemple, des techniques de précipitation au CaPC. D'autres procédés conventionnels utilisés comprennent la recombinaison homologue des génomes viraux, l'étalement sur plaque de virus dans une couche d'agar, des procédés de mesures de la génération du signal, et équivalents.

Par exemple, après la construction et l'assemblage du vecteur viral contenant le minigène souhaité, le vecteur est transfecté in vitro en présence d'un virus assistant dans la lignée cellulaire d'empaquetage. La recombinaison homologue se produit entre les séquences de l'assistant et du vecteur, ce qui permet que les séquences du transgène adénoviral dans le vecteur soient répliquées et empaquetées dans les capsides des virions, résultant en les particules virales recombinantes de vecteur. Les adénovirus recombinants résultants sont utiles pour transférer un transgène sélectionné à une cellule sélectionnée. Dans des expériences in vivo avec le virus recombinant cultivé dans les lignées cellulaires d'empaquetage, les vecteurs adénoviraux recombinants avec El délété de cette invention mettent en évidence une utilité dans le transfert d'un transgène à une cellule de mammifère non simienne, de préférence humaine.

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Transgènes

Le transgène est une séquence d'acide nucléique, hétérologue aux séquences de vecteur flanquant le transgène, qui code pour une protéine d'intérêt. La séquence codante d'acide nucléique est fonctionnellement liée aux composants régulateurs d'une manière qui permet la transcription, la traduction et/ou l'expression du transgène dans une cellule hôte.

La composition de la séquence du transgène va dépendre de l'utilisation à laquelle le vecteur résultant sera consacré. Par exemple, le transgène peut être un transgène thérapeutique ou un transgène immunogène. En variante, une séquence de transgène peut comprendre une séquence rapporteur, qui sous l'effet de l'expression produit un signal détectable. Ces séquences rapporteurs comprennent, de manière non restrictive, des séquences d'ADN codant pour la ßlactamase, la ß-galactosidase (LacZ), la phosphatase alcaline, la thymidine kinase, la protéine fluorescente verte (GFP), la chloramphénicol acétyltransférase (CAT), la luciférase, les protéines liées à la membrane comprenant, par exemple, CD2, CD4, CD8, la protéine hémagglutinine du virus de la grippe, et autres bien connues dans la technique, contre lesquelles des anticorps à grande affinité existent ou peuvent être produits par des moyens classiques, et des protéines de fusion comprenant une protéine liée à la membrane et fusionnée de manière appropriée à un domaine tag d'antigène provenant, entre autres, de 1'hémagglutinine ou de Myc. Ces séquences codantes, lorsqu'elles sont associées à des éléments de régulation qui dirigent

BE2017/5910 leur expression, fournissent des signaux détectables par des moyens classiques, y compris des essais enzymatiques, radiographiques, colorimétriques, de fluorescence ou spectroscopiques autres, le tri cellulaire par FACS (fluorescent activating cell sorting assays) et les dosages immunologiques, y compris un dosage immunoenzymatique (ELISA), un dosage radioimmunologique (RIA) et l'immunohistochimie.

Dans un mode de réalisation, le transgène est une séquence non marqueur codant pour un produit qui est utile en biologie et en médecine, tel qu'un transgène thérapeutique ou un transgène immunogène comme des protéines, de l'ARN, des enzymes, ou des ARN catalytiques. Des molécules d'ARN souhaitables comprennent l'ARNt, l'ARNdb, l'ARN ribosomique, des ARN catalytiques, et des ARN antisens. Un exemple d'une séquence d'ARN utile est une séquence qui éteint l'expression d'une séquence d'acide nucléique ciblée chez l'animal traité.

Le transgène peut être utilisé pour le traitement, par exemple, de déficiences génétiques, en tant que produit thérapeutique ou vaccin contre le cancer, pour l'induction d'une réponse immunitaire, et/ou à des fins de vaccination prophylactique. Tel qu'il est utilisé dans le présent document, l'induction d'une réponse immunitaire fait référence à la capacité d'une protéine à induire une réponse des lymphocytes T et/ou une réponse immunitaire humorale à la protéine.

Le terme prophylaxie signifie la fourniture d'un médicament à l'avance, ce qui peut être avant l'exposition à un pathogène (prophylaxie préexposition)

BE2017/5910 ou avant le développement des symptômes d'une maladie (prophylaxie post-exposition). Les termes traitement et thérapie sont utilisés de manière interchangeable et ils signifient l'administration de médicament pendant la maladie.

Par le terme maladie, on entend un trouble d'une structure ou fonction chez un sujet, notamment un trouble qui produit des symptômes spécifiques ou qui affecte un endroit spécifique et n'est pas simplement un résultat direct d'une blessure physique.

Éléments de régulation

Outre le transgène, le vecteur comprend également les éléments de contrôle classiques qui sont liés de manière fonctionnelle au transgène d'une manière qui permet sa transcription, sa traduction et/ou son expression dans une cellule transfectée avec le vecteur plasmidique ou infectée avec le virus produit par l'invention. Telle qu'elle est utilisée dans le présent document, l'expression séquences « liées de manière fonctionnelle » comprend à la fois des séquences de contrôle de l'expression qui sont contiguës au gène d'intérêt et des séquences de contrôle de l'expression qui agissent en trans ou à distance pour contrôler le gène d'intérêt.

Les séquences de contrôle de l'expression comprennent des séquences d'initiation de la transcription, de terminaison, promoteurs et d'amplification appropriées ; des signaux de traitement de l'ARN efficaces tels que des signaux d'épissage et de polyadénylation (polyA) y compris le polyA de la

BE2017/5910 bêta-globine de lapin ; des séquences qui stabilisent l'ARNm cytoplasmique ; des séquences qui amplifient l'efficacité de traduction (par exemple, la séquence consensus de Kozak) ; des séquences qui améliorent la stabilité des protéines ; et si souhaité, des séquences qui améliorent la sécrétion du produit codé. Entre autres séquences, des introns chimères peuvent être utilisés.

Dans certains modes de réalisation, l'élément de régulation post-transcriptionnel du virus de l'hépatite de la marmotte (WPRE) (Zuffrey et al. (1999) J Virol ; 73(4) : 2886-9) peut être fonctionnellement lié au transgène. Un exemple de WPRE est proposé dans SEQ ID NO : 26.

Un « promoteur » est une séquence nucléotidique qui permet la liaison de l'ARN polymérase et dirige la transcription d'un gène. Typiquement, un promoteur se trouve dans la région non codante en 5' d'un gène, à proximité du site de début de la transcription du gène. Les éléments de la séquence à l'intérieur du promoteur qui fonctionnent dans 1'initiation de la transcription sont souvent caractérisés par les séquences nucléotidiques consensus. Des exemples de promoteurs comprennent, de manière non restrictive, les promoteurs des bactéries, de la levure, des plantes, les virus, et des mammifères (y compris des êtres humains). Un grand nombre de séquences de contrôle de l'expression, y compris des promoteurs qui sont internes, natifs, constitutifs, inductibles et/ou spécifiques du tissu, sont connus dans l'art et peuvent être utilisés.

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Des exemples de promoteurs constitutifs comprennent, de manière non restrictive, le promoteur du TBG, le promoteur LTR du virus rétroviral du sarcome de Rous (facultativement avec l'amplificateur), le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (facultativement avec l'amplificateur du CMV, voir, par exemple, Boshart et al., Cell, 41 : 521-530 (1985)), le promoteur CASI, le promoteur du SV40, le promoteur de la dihydrofolate réductase, le promoteur de la ß-actine, le promoteur de la phosphoglycérol kinase (PGK), et le promoteur EFla ( Invitrogen) .

Dans certains modes de réalisation, le promoteur est un promoteur CASI (voir, par exemple, W02012/115980) . Le promoteur CASI est un promoteur synthétique qui contient une partie du promoteur du CMV, une partie du promoteur de la bêta-actine de poulet, et une partie de l'amplificateur UBC. Dans certains modes de réalisation, le promoteur CASI peut inclure une séquence d'acide nucléique ayant une identité de séquence d'au moins environ 90 %, d'au moins environ 95 %, d'au moins environ 96 %, d'au moins environ 97 %, d'au moins environ 98 %, d'au moins environ 99 %, ou plus, avec SEQ ID NO : 12. Dans certains modes de réalisation, le promoteur comprend ou est constitué d'une séquence d'acide nucléique de SEQ ID NO : 12.

Les promoteurs inductibles permettent la régulation de l'expression génique et peuvent être régulés par des composés fournis de manière exogène, des facteurs environnementaux tels que la température, ou la présence d'un état physiologique spécifique, par exemple, une phase aiguë, un état de différenciation

BE2017/5910 particulier de la cellule, ou dans des cellules se répliquant uniquement. Les promoteurs inductibles et les systèmes inductibles sont disponibles auprès d'une variété de sources commerciales, y compris, de manière non restrictive, Invitrogen, Clontech et Ariad. Un grand nombre d'autres systèmes ont été décrits et peuvent être facilement sélectionnés par un homme du métier. Par exemple, des promoteurs inductibles comprennent le promoteur de la métallothionéine (MT) de mouton inductible par le zinc et le promoteur du virus de la tumeur mammaire murine (MMTV) inductible par la dexaméthasone (Dex).

D'autres systèmes inductibles comprennent le système du promoteur de la polymérase T7 (W098/10088) ; le promoteur d'insecte inductible par

1'ecdysone (No et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93 : 3346-3351 (1996)), le système répressible par la tétracycline (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89 : 5547-5551 (1992)), le système inductible par la tétracycline (Gossen et al., Science, 378 : 1766-1769 (1995), voir également Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol, 2 : 512-518 (1998)). D'autres systèmes comprennent le dimère FK506, VP16 ou p65 utilisant le castradiol, la diphénol murislérone, le système inductible par RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15 : 239-243 (1997) et Wang et al., Gene Ther., 4 : 432-441 (1997)) et le système inductible par la rapamycine (Magari et al., J. Clin. Invest., 100 : 2865-2872 (1997)). L'efficacité de certains promoteurs inductibles augmente dans le temps. Dans ces cas, il est possible d'augmenter l'efficacité de ces systèmes

BE2017/5910 par insertion de multiples répresseurs en tandem, par exemple, TetR lié à un TetR par un 1RES.

Dans certains modes de réalisation, le promoteur est un promoteur du hCMV amplifié, tel que proposé dans

SEQ ID NO : 42.

Dans un autre mode de réalisation, le promoteur natif pour le transgène sera utilisé.

Le promoteur natif peut être préféré lorsque 1 ' on souhaite que

1'expression du transgène imite l'expression native. Le promoteur natif peut être utilisé lorsque l'expression du transgène doit être régulée temporairement ou à un certain stade du développement, ou de manière spécifique du tissu, ou en réponse à des stimuli transcriptionnels. Dans un autre mode de réalisation, d'autres éléments de contrôle de l'expression natifs, tels que des éléments amplificateurs, des sites de polyadénylation ou des séquences consensus

Kozak peuvent également être utilisés pour imiter l'expression native.

Le transgène peut être lié de manière opérationnelle à un promoteur spécifique du tissu. Par exemple, si l'expression dans un muscle squelettique est souhaitée, un promoteur actif dans le muscle doit être utilisé. Ceux-ci comprennent les promoteurs des gènes codant pour la ß-actine squelettique, la chaîne légère de la myosine 2A, la dystrophine, la créatine kinase musculaire, ainsi que des promoteurs musculaires synthétiques ayant des activités supérieures à celles de promoteurs naturels (voir Li et al., Nat. Biotech., 17 : 241-245 (1999)). Des exemples de promoteurs spécifiques des tissus sont connus pour le foie

BE2017/5910 (albumine, Miyatake et al., J. Virol., 71 : 5124-32 (1997) ; le promoteur principal du virus de l'hépatite

B, Sandig et al., Gene Ther., 3 : 1002-9 (1996) ;

1' alpha-fœtoprotéine (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7 : 1503-14 (1996)), 1'ostéocalcine osseuse (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24 : 185-96 (1997)) ;

la sialoprotéine osseuse (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11 : 654-64 (1996)), les lymphocytes (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161 : 1063-8 (1998) ; la chaîne lourde des immunoglobulines ; la chaîne des récepteurs des lymphocytes T) , neuronal tel que le promoteur de l'énolase spécifique des neurones (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol, 13 : 503-15 (1993)), le gène de la chaîne légère des neurofilaments (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88 : 5611-5 (1991)), et le gène vgf spécifique des neurones (Piccioli et al., Neuron, 15 : 373-84 (1995)), entre autres.

Facultativement, les vecteurs portant des transgènes codant pour des produits immunogènes ou thérapeutiquement utiles peuvent également comprendre des marqueurs sélectifs ou des gènes rapporteurs qui peuvent comprendre des séquences codant pour la résistance à la généticine, à 1'hygromicine ou à la puromycine, entre autres. Ces rapporteurs ou gènes marqueurs sélectifs (de préférence situés hors du génome viral à empaqueter dans une particule virale) peuvent être utilisés pour signaler la présence des plasmides dans les cellules bactériennes, par exemple la résistance à l'ampicilline. D'autres composants du vecteur peuvent comprendre une origine de réplication.

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Ces vecteurs sont générés à l'aide des techniques et des séquences proposées dans le présent document, conjointement à des techniques connues des hommes du métier. Ces techniques comprennent des techniques classiques de clonage de l'ADNc telles que celles décrites dans les textes, l'utilisation de séquences oligonucléotidiques se chevauchant sur des génomes adénoviraux, la réaction de polymérisation en chaîne, et tout procédé approprié qui fournit la séquence nucléotidique souhaitée.

Produits thérapeutiques et prophylaxie

Les vecteurs recombinants basés sur ChAdl57 sont utiles pour le transfert de gène à un mammifère humain ou non simien in vitro, ex vivo, et in vivo.

Les vecteurs adénoviraux recombinants décrits dans le présent document peuvent être utilisés comme des vecteurs d'expression pour la production des produits codés par les transgènes hétérologues in vitro. Par exemple, 1'adénovirus recombinant incompétent pour la réplication contenant un transgène peut être transfecté dans une lignée cellulaire de complémentation telle que décrite ci-dessus.

Un vecteur adénoviral recombinant dérivé de ChAdl57 fournit un véhicule de transfert de gène efficace qui peut délivrer un transgène sélectionné à une cellule hôte sélectionnée in vivo ou ex vivo même lorsque l'organisme a des anticorps neutralisation contre un ou plusieurs sérotypes adénoviraux. Dans un mode de réalisation, le vecteur et les cellules sont mélangées ex vivo ; les cellules infectées sont

BE2017/5910 cultivées en utilisant des méthodologies classiques ; et les cellules transduites sont réinjectées dans le patient. Ces techniques sont particulièrement bien adaptées à la délivrance de gènes pour des fins thérapeutiques et pour l'immunisation, y compris l'induction d'une immunité protectrice.

Transgènes immunogènes

Les vecteurs recombinants ChAdl57 peuvent aussi être administrés dans des compositions immunogènes. Une composition immunogène telle que décrite dans le présent document est une composition comprenant un ou plusieurs vecteurs recombinants ChAdl457 capables d'induire une réponse immunitaire, par exemple une réponse humorale (par exemple des anticorps) et/ou à médiation cellulaire (par exemple, des lymphocytes T cytotoxiques), contre un produit de transgène délivré par le vecteur après la délivrance à un mammifère, de manière appropriée un être humain. Un adénovirus recombinant peut comprendre (de manière appropriée dans l'une quelconque de ses délétions géniques) un gène codant pour un immunogène souhaité et peut par conséquent être utilisé dans un vaccin. Les adénovirus recombinants peuvent être utilisés comme des vaccins prophylactiques ou thérapeutiques contre tout pathogène pour lequel l'antigène (les antigènes) critique(s) pour l'induction d'une réponse immunitaire et capable(s) de limiter la diffusion du pathogène a (ont) été identifié(s) et pour lequel (lesquels) l'ADNc est disponible.

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Par le terme immunogène, on entend un polypeptide qui est capable d'éliciter une réponse immunitaire. De manière adaptée, l'immunogène est un antigène qui comprend au moins un épitope des lymphocytes B ou T. La réponse immunitaire élicitée peut être une lymphocytes B spécifique d'un antigène, qui réponse des produit des anticorps neutralisants.

La réponse immunitaire élicitée peut être une réponse des lymphocytes T spécifique d'un antigène, qui peut être une réponse systémique et/ou locale. La réponse des lymphocytes T spécifique d'un antigène comprend une réponse des lymphocytes

T CD4+, par exemple une réponse impliquant les lymphocytes T CD4+ exprimant une pluralité de cytokines, par exemple, l'IFNy, le TNFa et/ou l'IL2.

En variante, ou en outre, la réponse des lymphocytes spécifique d'un antigène comprend une réponse des lymphocytes T CD8+, par exemple une réponse impliquant les lymphocytes T CD8+ exprimant une pluralité de cytokines, par exemple, 1'IFNy, le TNFa et/ou l'IL2.

Le terme immuniser signifie par conséquent

1'administration d'un immunogène (ou d'un polynucléotide codant pour l'immunogène tel qu'approprié au contexte), pour éliciter une réponse immunitaire.

De tels vaccins ou d'autres compositions immunogènes peuvent être formulées dans un véhicule de délivrance adapté. Généralement, les doses des compositions immunogènes sont dans la plage définie ciaprès dans la section « Procédé de délivrance et dosage ». Les niveaux d'immunité du gène sélectionné peuvent être surveillés pour déterminer si des boosts

BE2017/5910 sont nécessaires ou non. Après une évaluation des titres d'anticorps dans le sérum, facultativement des immunisations de boost peuvent être souhaitées.

Facultativement, un vaccin ou une composition immunogène de l'invention peut être formulé pour contenir d'autres composants, y compris, par exemple, des adjuvants, des agents stabilisants, des agents d'ajustement du pH, des conservateurs et équivalents. Des exemples d'adjuvants sont proposés ci-dessous sous « Adjuvants ». Un tel adjuvant peut être administré avec un premier vaccin à ADN codant pour un antigène pour améliorer la réponse immunitaire spécifique de l'antigène comparé à la réponse immunitaire générée lors de la sensibilisation avec un vaccin à ADN codant pour l'antigène uniquement. En variante, un tel adjuvant peut être administré avec un antigène polypeptidique qui est administré dans un régime d'administration impliquant les vecteurs ChAdl57 de l'invention (tel que décrit ci-dessous sous « Régime d'administration »).

Les adénovirus recombinants sont administrés en une quantité immunogène, en d'autres termes, une quantité d'adénovirus recombinant qui est efficace dans une voie d'administration pour transfecter les cellules cibles souhaitées et fournir des niveaux d'expression suffisants du gène choisi pour induire une réponse immunitaire. Lorsque l'immunité protectrice est fournie, les adénovirus recombinants sont considérés comme des compositions vaccinales utiles dans la prévention d'une infection et/ou d'une maladie récurrente.

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On s'attend à ce que les vecteurs recombinants décrits dans le présent document soient très efficaces pour induire les lymphocytes T cytolytiques et des anticorps dirigés contre la protéine antigénique hétérologue insérée, exprimée par le vecteur.

Les immunogènes exprimés par les vecteurs de l'invention qui sont utiles pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre d'autres agents pathogènes comprennent, par exemple, des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou une cellule cancéreuse ou d'une cellule tumorale. Par exemple, les immunogènes peuvent être sélectionnés parmi une variété de familles virales. Par exemple les familles virales contre lesquelles une réponse immunitaire serait souhaitable comprennent les Lyssavirus tels que les virus de la rage, les virus respiratoires tels que le virus respiratoire syncytial (VRS) et d'autres paramyxovirus tels que le métapneumovirus humain, le hMPV et les virus parainfluenza (PIV).

Les antigènes de la rage appropriés qui sont utiles en tant qu'immunogènes pour immuniser un être humain ou un animal non humain peuvent être sélectionnés parmi la glycoprotéine virale de la rage (G), l'ARN polymérase (L), la protéine matricielle (Μ), la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P) . Le terme « protéine G » ou « glycoprotéine » ou « polypeptide de la protéine G » ou « polypeptide de la glycoprotéine » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides

BE2017/5910 aminés d'un polypeptide de glycoprotéine de la rage. Le terme « protéine L » ou « protéine d'ARN polymérase » ou « polypeptide de protéine L » ou « polypeptide de protéine d'ARN polymérase » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de protéine d'ARN polymérase de la rage. Le terme « protéine Μ » ou « protéine matricielle » ou « polypeptide de protéine Μ » ou « polypeptide de protéine matricielle » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de protéine matricielle de la rage. Le terme « protéine N » ou « nucléoprotéine » ou « polypeptide de protéine N » ou « polypeptide de nucléoprotéine » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de nucléoprotéine de la rage. Le terme « protéine P » ou « phosphoprotéine » ou « polypeptide de protéine P » ou « polypeptide de phosphoprotéine » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de phosphoprotéine de la rage.

Les antigènes appropriés du VRS qui sont utiles en tant qu'immunogènes pour immuniser un être humain ou un animal non humain peuvent être sélectionnés parmi : la protéine de fusion (F), la protéine de fixation (G), la protéine matricielle (M2) et la nucléoprotéine (N) . Le terme « protéine F » ou « protéine de fusion » ou « polypeptide de protéine F » ou « polypeptide de protéine de fusion » fait référence à un polypeptide ou

BE2017/5910 une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de protéine de fusion du VRS. De manière similaire, le terme « protéine G » ou « polypeptide de protéine G » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de protéine de fixation du VRS. Le terme « protéine Μ » ou « protéine matricielle » ou « polypeptide de protéine Μ » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'une protéine matricielle du VRS et peut inclure l'un ou l'autre ou les deux des produits géniques M2-1 (qui peut être écrit dans le présent document M2.1) et M2-2. De manière similaire, le terme « protéine N » ou « protéine de nucléocapside » ou « polypeptide de protéine N » fait référence à un polypeptide ou une protéine ayant tout ou partie d'une séquence d'acides aminés d'une nucléoprotéine du VRS.

Deux groupes de souches de VRS humains ont été décrits, les groupes A et B, principalement basés sur des différences d'antigénicité de la glycoprotéine G. Un grand nombre de souches du VRS ont été isolées jusqu'à présent, toutes étant appropriées dans le contexte des antigènes des combinaisons immunogènes décrites dans le présent document. Des exemples de souches indiquées par les numéros d'accès GenBank et/ou EMBL peuvent être rencontrés dans la demande US publiée numéro 2010/0203071 (W02008114149), qui est intégrée au présent document à titre de référence pour les fins de description des séquences d'acide nucléique et polypeptidiques des protéines F et G du VRS appropriées

BE2017/5910 pour leur utilisation dans la présente invention. Dans un mode de réalisation, La protéine F du VRS peut être un ectodomaine d'une protéine F du VRS (FATM).

Des exemples d'acides nucléiques des protéines Μ et N et de séquences protéiques peuvent être trouvés, par exemple, dans la demande US publiée numéro 2014/0141042 (WO2012/089833) , qui est intégrée au présent document à des fins de description des séquences d'acide nucléique et polypeptidiques des protéines Μ et N du VRS appropriées pour leur utilisation dans la présente invention.

De manière adaptée, pour son utilisation dans la présente invention, un acide nucléique code pour un antigène F du VRS et pour les antigènes Μ et N du VRS. Plus spécifiquement, l'acide nucléique code pour un antigène FATM du VRS et pour les antigènes M2-1 et N du VRS, dans lequel un site d'auto-clivage est induit entre l'antigène FATM du VRS et M2-1 du VRS et un lieur flexible est inclus entre les antigènes M2-1 et N du VRS. Dans un mode de réalisation, un acide nucléique approprié code pour le polypeptide représenté par SEQ ID NO : 37

Dans un mode de réalisation, l'immunogène peut provenir d'un rétrovirus, par exemple d'un lentivirus tel que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Dans un tel mode de réalisation, les immunogènes peuvent provenir du VIH-1 ou du VIH-2.

Le génome du VIH code pour un certain nombre de protéines différentes, chacune d'entre elles pouvant être immunogène dans sa totalité ou sous la forme d'un fragment lorsqu'elle est exprimée par les vecteurs de

BE2017/5910 la présente invention. Les protéines d'enveloppe comprennent la gpl20, la gp41 et la gpl60 du précurseur Env, par exemple. Les protéines autres que des protéines d'enveloppe du VIH comprennent, par exemple, des protéines structurales internes telles que les produits des gènes gag et pol et autres protéines non structurales telles que Rev, Nef, Vif et Tat. Dans un mode de réalisation, le vecteur de l'invention code pour un ou plusieurs polypeptides comprenant le Gag du VIH.

Le gène Gag est traduit sous la forme d'une polyprotéine précurseur qui est clivée par la protéase pour donner des produits qui comprennent la protéine matricielle (pl7), la capside (p24), la nucléocapside (p9) , p6 et deux peptides espaceurs, p2 et pl, tous étant des exemples de fragments de Gag.

Le gène Gag donne lieu à la protéine précurseur Gag de 55 kilodaltons (kD), également dénommé p55, qui est exprimée à partir de l'ARNm viral non épissé. Durant la traduction, l'extrémité N terminale de p55 est myristoylée, déclenchant son association avec l'aspect cytoplasmique des membranes cellulaires. La polyprotéine Gag associée à la membrane recrute deux copies de l'ARN génomique viral conjointement à d'autres protéines virales et cellulaires, ce qui déclenche le bourgeonnement de la particule virale de la surface d'une cellule infectée. Après le bourgeonnement, p55 est clivée avec la protéase codée par le virus (un produit du gène pol) durant le processus de maturation virale en quatre protéines plus petites désignées MA (matrice [pl7]), CA (capside

BE2017/5910 [p24]), NC (nucléocapside [p9]), et p6, toutes étant des exemples de fragments de Gag. Dans un mode de réalisation, les vecteurs de la présente invention comprennent le polypeptide Gag de SEQ ID NO : 16.

Adj uvants

Un « adjuvant », tel qu'utilisé dans le présent document, fait référence à une composition qui améliore la réponse immunitaire à un immunogène. Des exemples de ces adjuvants comprennent, de manière non restrictive, des adjuvants inorganiques (par exemple, des sels de métaux inorganiques tels que le phosphate d'aluminium ou l'hydroxyde d'aluminium), des adjuvants organiques (par exemple, les saponines, telles que QS21, ou le squalène), des adjuvants à base d'huile (par exemple, l'adjuvant complet de Freund et l'adjuvant incomplet de Freund), les cytokines (par exemple, IL-lß, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, et IFN-γ), des adjuvants particulaires (par exemple, des complexes de stimulation immunitaire (ISCOMS), des liposomes, ou des microsphères biodégradables), des virosomes, des adjuvants bactériens (par exemple, le monophosphoryl lipide A, par exemple le monophosphoryl lipide A 3-déO-acylé (3D-MPL), ou des muramyl peptides), des adjuvants synthétiques (par exemple, des copolymères séquencés non ioniques, des analogues du muramyl peptide, ou le lipide A synthétique), des adjuvants de polynucléotides synthétiques (par exemple la polyarginine ou la polylysine) et des oligonucléotides de stimulation immunitaire contenant des dinucléotides CpG non méthylés (« CpG »).

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Un adjuvant approprié est le monophosphoryl lipide A (MPL), en particulier le monophosphoryl lipide A 3dé-O-acylé (3D-MPL). Chimiquement, il est souvent fourni sous la forme d'un monophosphoryl lipide A 3-deO-acylé avec 4, 5, ou 6 chaînes acylées. Il peut être purifié et préparé par les procédés enseignés dans GB 2122204B, cette référence décrivant également la préparation du diphosphoryl lipide A, et des variantes

3-O-désacylées de celui-ci. D'autres lipopolysaccharides purifiés et synthétiques ont été décrits (brevet US n° 6005099 et EP 0729473B1 ; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4) : 392-6 ; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1) : 1416 ; et EP 0549 074 Bl) .

Les saponines sont également des adjuvants appropriés (voir Lacaille-Dubois, Μ and Wagner H, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386 (1996)). Par exemple, la saponine Quil A (provenant de l'écorce de bois de Panama, Quillaja saponaria Molina, un arbre d'Amérique du Sud), et des fractions de celle-ci, sont décrites dans le brevet US n° 5057540 et dans Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 : 1-55 ; et dans EP 0362279 B1. Les fractions purifiées de Quil A sont également connues comme des immunostimulants, par exemple QS21 et QS17 ; des procédés pour leur production sont décrits dans le brevet US n° 5057540 et EP 0362279 Bl. QS7 (une fraction non hémolytique de Quil-A) est également décrite dans ces références. L'utilisation de QS21 est en outre décrite dans Kensil et al. (1991, J. Immunology, 146 : 431-437). Des

BE2017/5910 combinaisons de QS21 et de polysorbate ou de cyclodextrine sont également connues (W099/10008). Des systèmes d'adjuvants particulaires comprenant des fractions de QuilA, par exemple QS21 et QS7, sont décrits dans WO96/33739 and WO96/11711.

Un autre adjuvant est un oligonucléotide immunostimulateur contenant les dinucléotides CpG non méthylés (« CpG ») (Krieg, Nature 374 : 546 (1995)). CpG est une abréviation de motifs de dinucléotide cytosine-guanosine présents dans l'ADN. CpG est connu comme un adjuvant lorsqu'il est administré par les voies systémiques et muqueuses (WO96/02555, EP 468520, Davis et al., J.Immunol, 1998, 160 : 870-876 ; McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161 : 4463-6). CpG, lorsqu'il est formulé dans des vaccins, peut être administré dans une solution libre conjointement à un antigène libre (WO96/02555) ou conjugué de façon covalente à un antigène (WO98/16247), ou formulé avec un vecteur tel que

1'hydroxyde d'aluminium (BrazolotMillan et al.,

Proc.

Natl. Acad. Sei.,

USA,

1998, 95 :

Des adj uvants tels que ceux décrits ci-dessus peuvent être formulés conjointement à des vecteurs, tels que des liposomes, des émulsions huile-dans-1'eau, et/ou des sels de métaux (y compris des sels d'aluminium tels que

1'hydroxyde d'aluminium).

Par exemple, le 3D-MPL peut être formulé avec de l'hydroxyde d'aluminium (EP 0689454) ou des émulsions huile-dans-1'eau (WO95/17210) ; QS21 peut être formulé avec des liposomes contenant du cholestérol (WO96/33739), des émulsions huile-dans-1' eau

BE2017/5910 (WO95/17210) de l'alun (WO98/15287) ; CpG peut être formulé avec de l'alun (Brazolot-Millan, supra) ou avec d'autres vecteurs cationiques.

Des combinaisons d'adjuvants peuvent être utilisées dans la présente invention, en particulier une combinaison de monophosphoryl lipide A et d'un dérivé de saponine (voir, par exemple, W094/00153 ; WO95/17210 ; WO96/33739 ; WO98/56414 ; WO99/12565 ; WO99/11241), plus particulièrement la combinaison de QS21 et de 3D-MPL telle que décrite dans W094/00153, ou une composition où QS21 est désactivé dans des liposomes contenant du cholestérol (DQ) tel que ceci est décrit dans WO96/33739. En variante, une combinaison de CpG plus une saponine telle que QS21 est un adjuvant approprié pour son utilisation dans la présente invention. Une puissante formulation adjuvante contenant QS21, le 3D-MPL et du tocophérol dans une émulsion huile-dans-1'eau est décrite dans WO95/17210 et constitue une autre formulation destinée à être utilisée dans la présente invention. Des adjuvants de saponine peuvent être formulés dans un liposome et combinés à un oligonucléotide immunostimulateur. Ainsi, des systèmes d'adjuvants adaptés comprennent, par exemple, une combinaison de monophosphoryl lipide A, de préférence de 3D-MPL, conjointement à un sel d'aluminium (par exemple, tel que ceci est décrit dans WO00/23105). Un autre exemple d'adjuvant comprend QS21 et/ou le MPL et/ou le CpG. QS21 peut être éteint dans des liposomes contenant du cholestérol tel que décrit dans WO96/33739.

BE2017/5910

D'autres adjuvants appropries comprennent les alkyl glucosaminide phosphates (AGP) tels que ceux décrits dans WO9850399 ou dans le brevet US n° 6,303,347 (des procédés de préparation d'AGP sont également décrits), ou des sels pharmaceutiquement acceptables d'AGP tels que décrits dans le brevet n° US 6,764,840. Certains AGP sont des agonistes de TLR4, et certains sont des antagonistes de TLR4. Les deux sont qu adj uvants.

62656, qui est publié sous à titre de référence à des séquences de chaînes la chaîne invariante à un un système d'expression et on augmente la réponse Lgène, s'il est administré équence, dans un mode de le transgène immunogène chaîne invariante dans un nant.

supposes etre utiles en tant

On a découvert (W02007/ US 2011/0293704 et incorporé fins de description des invariantes) que la fusion de antigène qui est composé par utilisé pour la vaccinati immunitaire contre ledit ant: avec un adénovirus. En cons réalisation de l'invention, peut être co-exprimé avec la vecteur viral ChAdl57 recombi

Dans un autre mode de réalisation, concerne l'utilisation de la capside (facultativement une particule virale

1'invention de ChAdl57 intacte ou recombinante ou une capside vide est utilisée) pour induire une réponse à effet immunomodulateur, ou pour améliorer ou adjuvanter une réponse des lymphocytes T cytotoxiques contre un autre agent actif par délivrance d'une capside de ChAdl57 à un sujet. La capside de ChAdl57 peut être administrée seule ou dans un régime combiné avec un agent actif pour améliorer la réponse immunitaire contre celle-ci. De manière avantageuse,

BE2017/5910 l'effet souhaité peut être réalisé sans infecter l'hôte avec un adénovirus.

Régimes d'administration

Communément, les vecteurs adénoviraux recombinants ChAdl57 seront utilisés pour la délivrance de molécules thérapeutiques ou immunogènes (telles que les protéines). On comprendra facilement pour les deux applications, que les vecteurs adénoviraux recombinants de l'invention sont particulièrement bien adaptés pour être utilisés dans des régimes impliquant la délivrance répétée de vecteurs adénoviraux recombinants. Ces régimes impliquent typiquement la délivrance d'une série de vecteurs viraux dans lesquels les capsides virales sont alternées. Les capsides virales peuvent être changées pour chaque administration subséquente, ou après un nombre présélectionné d'administrations d'une capside de sérotype particulier (par exemple, une, deux, trois, quatre ou plus) . Ainsi, un régime peut impliquer la délivrance d'un adénovirus recombinant avec une première capside, la délivrance d'un adénovirus recombinant avec une deuxième capside, et la délivrance d'un adénovirus recombinant avec une troisième capside. Une variété d'autres régimes qui utilisent les capsides adénovirales de l'invention seules, en combinaison les unes avec les autres, ou en combinaison avec d'autres adénovirus (qui ne présentent de préférence pas de réactivité croisée immunologique), seront évidents aux hommes du métier. Facultativement, un tel régime peut impliquer l'administration d'un adénovirus recombinant avec des capsides d'autres

BE2017/5910 adénovirus de primate non humain, adénovirus humains, ou séquences artificielles telles que décrites dans le document.

Les vecteurs adénoviraux de l'invention sont particulièrement bien adaptés pour les régimes thérapeutiques dans lesquels de multiples délivrances de transgènes médiées par des adénovirus sont souhaitées, par exemple, dans des régimes impliquant la re-délivrance du même transgène ou dans des régimes de combinaison impliquant la délivrance d'autres transgènes.

Ces régimes peuvent impliquer l'administration d'un vecteur adénoviral

ChAdl57, suivie par la ré-administration avec un vecteur d'un adénovirus du même sérotype. Des régimes particulièrement souhaitables peuvent impliquer l'administration d'un vecteur adénoviral ChAdl57, dans lequel la source des séquences de capside adénovirale du vecteur administré dans la première administration est différente de la source des séquences de capside adénovirale du vecteur viral utilisé dans une ou plusieurs des administrations subséquentes. Par exemple, un régime thérapeutique implique l'administration d'un vecteur de ChAdl57 et l'administration répétée avec un ou plusieurs vecteurs adénoviraux modifiés de sérotypes identiques ou différents.

Dans un autre exemple, un régime thérapeutique implique l'administration d'un vecteur adénoviral suivie par l'administration répétée avec un vecteur ChAdl57 de l'invention dont la capside est différente de la capside dans le premier vecteur adénoviral administré, et facultativement

1'administration

BE2017/5910 ultérieure avec un autre vecteur qui est identique ou, de préférence, différent de la source de la capside adénovirale du vecteur dans les étapes d'administration préalables. Ces régimes ne se limitent pas à l'administration de vecteurs adénoviraux construits à l'aide des séquences de ChAdl57. En revanche, ces régimes peuvent facilement utiliser d'autres séquences adénovirales, y compris, de manière non restrictive, d'autres séquences adénovirales comprenant des séquences adénovirales de primate non humain, ou des séquences adénovirales humaines, en combinaison avec les vecteurs ChAdl57.

Dans un autre exemple, un régime thérapeutique peut impliquer une délivrance simultanée (par exemple une co-administration) ou séquentielle (par exemple une primo-immunisation-rappel) de (i) un ou plusieurs vecteurs adénoviraux ChAdl57 et (ii) un composant supplémentaire tel que des vecteurs non adénoviraux, des vecteurs non viraux, et/ou une variété de composés ou molécules thérapeutiquement utiles tels que des protéines antigéniques facultativement simultanément administrés avec l'adjuvant. Des exemples de coadministration comprennent une co-administration homolatérale et une co-administration controlatérale (davantage décrite ci-dessous dans la section « Procédés de délivrance et dosage »).

Des vecteurs non adénoviraux adaptés destinés à être utilisés dans une délivrance simultanée ou en particulier séquentielle (par exemple primoimmunisation-rappel) avec un ou plusieurs vecteurs adénoviraux ChAdl57 comprennent un ou plusieurs

BE2017/5910 vecteurs poxviraux. De manière adaptée, le vecteur poxviral appartient la sous-famille des chordopoxvirinae, de manière plus adaptée à un genre dans ladite sous-famille sélectionné dans le groupe constitué des orthopox, parapox, yatapox, avipox (de manière adaptée canarypox (ALVAC) ou fowlpox (FPV)) et molluscipox. De manière encore plus adaptée , le vecteur poxviral appartient aux orthopox et est sélectionné dans le groupe constitué du virus de la vaccine, du

NYVAC (dérivé de la souche Copenhague de du virus modifié de la vaccine Ankara (MVA), du virus cowpox et du virus monkeypox.

Idéalement, le vecteur poxviral est le MVA.

Administration « simultanée » fait de manière adaptée référence à la même réponse immunitaire en cours. De préférence les deux composants sont administrés en même temps (par exemple une administration simultanée de 1'ADN cependant, un composant doit être administré quelques minutes après (par exemple, lors de la même consultation médicale ou après quelques heures. On fait également référence à une telle administration comme à une co-administration.

Dans certains modes de réalisation, la coadministration peut faire référence à l'administration d'un vecteur adénoviral, d'un adjuvant et d'un composant protéique. Dans d'autres modes de réalisation, la co-administration fait référence à l'administration d'un vecteur adénoviral et d'un autre vecteur viral, par exemple un second vecteur adénoviral ou un poxvirus tel que le MVA. Dans d'autres modes de réalisation, la

BE2017/5910 co-administration fait référence à l'administration d'un vecteur adénoviral et d'un composant protéique, qui est facultativement adjuvanté.

Un régime de primo-immunisation boost peut être utilisé. Primo-immunisation-boost fait référence à deux réponses immunitaires séparées :

(i) une primo-immunisation initiale du système immunitaire suivie par (ii) une immunisation secondaire ou boost du système immunitaire plusieurs semaines ou mois après l'établissement de la réponse immunitaire primaire.

Un tel régime peut impliquer l'administration d'un vecteur ChAdl57 recombinant pour sensibiliser le système immunitaire avant une seconde administration de boost avec un antigène traditionnel, tel qu'une protéine (facultativement co-administrée avec l'adjuvant), ou un virus recombinant portant les séquences codant pour un tel antigène (par exemple, WO00/11140). En variante, un système d'immunisation peut impliquer l'administration d'un vecteur ChAdl57 recombinant pour stimuler une réponse immunitaire à un vecteur (viral ou à base d'ADN) codant pour un antigène Dans une autre variante, un régime d'immunisation implique l'administration d'une protéine suivie par un boost avec un vecteur ChAdl57 recombinant codant pour l'antigène. Dans un exemple, le régime de primoimmunisation-boost peut fournir une réponse immunitaire protectrice contre le virus, les bactéries ou autre organisme duquel l'antigène provient. Dans un autre mode de réalisation, le régime de primo-injection-boost fournit un effet thérapeutique qui peut être mesuré en

BE2017/5910 utilisant des essais classiques de détection de la présence de l'affection pour laquelle la thérapie est administrée.

De préférence, une composition de boost est administrée environ 2 à environ 27 semaines après l'administration de la composition de primoimmunisation au sujet. L'administration de la composition de boost est réalisée en utilisant une quantité efficace d'une composition de boost contenant ou capable de délivrer le même antigène que, ou un antigène différent de, celui administré par le vaccin de primo-immunisation. La composition de boost peut être composée d'un vecteur viral recombinant dérivé de la même source virale ou d'une autre source. En variante, la composition de boost peut être une composition contenant le même antigène que celui codé dans le vaccin de primo-immunisation, mais sous la forme d'une protéine, la composition induisant une réponse immunitaire chez l'hôte. Les principales exigences de la composition de boost sont que l'antigène de la composition soit le même antigène, ou un antigène présentant une réactivité croisée, que celui codé par la composition de sensibilisation.

Une faible réactivité croisée entre des anticorps neutralisant contre ChAdl57 et certains autres vecteurs adénoviraux, par exemple ChAdl55, est bénéfique dans des contextes dans lesquels de multiples administrations de vecteurs sont requises. Les multiples administrations peuvent être utilisées pour les fins de la délivrance séparée de différents transgènes (par exemple, codant pour des immunogènes

BE2017/5910 associés à différentes indications médicales) ou la délivrance des mêmes transgènes ou de transgènes similaires (par exemple, dans un régime de primoimmunisation-boost pour faire augmenter la réponse immunitaire contre une indication médicale

Par conséquent, l'invention concerne un vecteur adénoviral recombinant de l'invention codant pour un transgène, pour son administration à un sujet qui a été préalablement exposé à un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou le dérivé fonctionnel de celle-ci, tel que décrit dans le présent document (par exemple, ne comprend pas de fibre, d'hexon ou de penton de ChAdl57 tel que décrit dans le présent document, par exemple un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55, notamment un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55). En particulier, l'invention concerne un vecteur adénoviral recombinant de l'invention codant pour un transgène pour son administration à un sujet qui a déjà reçu un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de

ChAdl57, ou le dérivé fonctionnel de celle-ci, tel que décrit dans le présent document (par exemple, ne comprend pas de fibre, d'hexon ou de penton de ChAdl57 tel que décrit dans le présent document, par exemple un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55, notamment un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55). De manière adaptée, le

BE2017/5910 vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57 est un vecteur qui présente une faible réactivité croisée avec ChAdl57. Dans un mode de réalisation, le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57 code pour un transgène dirigé contre une indication ou des indications médicales différentes par rapport au vecteur adénoviral recombinant du transgène de l'invention. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57 code pour un transgène dirigé contre la même ou les mêmes indications médicales que le vecteur adénoviral recombinant du transgène de l'invention (par exemple, le même transgène).

L'invention concerne en outre un vecteur adénoviral recombinant de l'invention codant pour un transgène pour son administration à un sujet qui peut être (en d'autres termes, qui est destiné à être ou dont on s'attend à ce qu'il soit) ensuite exposé à un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci, tel que décrit dans le présent document (par exemple, ne comprend pas de fibre, d'hexon ou de penton de ChAdl57 tel que décrit dans le présent document, par exemple un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55, notamment un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55) . En particulier, l'invention concerne un vecteur adénoviral recombinant de l'invention codant pour un transgène pour l'administration à un sujet qui peut ensuite

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recevoir	un	vecteur adénoviral recombinant	qui ne
comprend	pas	de fibre	de	ChAdl57,	ou	de	dérivé
fonctionnel de	celle-ci,	tel	que décrit	dans	le	présent
document	(par	exemple,	ne	comprend	pas	de	fibre,
d'hexon	ou de	penton de	ChAdl57 tel que	décrit	dans le

exemple un vecteur adénoviral présent document, par recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de

ChAdl55, notamment un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55). De manière adaptée, le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57 est un vecteur qui présente une faible réactivité croisée avec ChAdl57. Dans un mode de réalisation, le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de

ChAdl57 code pour un transgène dirigé contre une indication ou des indications médicales différentes par rapport au vecteur adénoviral recombinant du transgène de l'invention. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57 code pour un transgène dirigé contre la même ou les mêmes indications médicales que le vecteur adénoviral du transgène de l'invention (par exemple, le même transgène) .

La présente invention concerne par conséquent un procédé destiné à éliciter une réponse immunitaire chez un sujet, ledit procédé comprenant :

(a) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant de l'invention codant pour un premier transgène ; et (b) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de

BE2017/5910

ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci comme décrit dans le présent document, le vecteur codant pour un second transgène ;

dans lequel les étapes (a) et (b) peuvent être entreprises dans l'un ou l'autre ordre et les premier et second transgènes peuvent être identiques ou différents.

Les premier et second transgènes coderont typiquement pour des immunogènes qui sont utiles pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel que des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale. Les premier et second transgènes peuvent coder pour les mêmes immunogènes ou pour des immunogènes différents. Lorsqu'ils codent pour des immunogènes différents, ceux-ci peuvent être dirigés contre le même pathogène ou la même cellule cancéreuse ou la même cellule tumorale ou un pathogène ou une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale différente.

Par conséquent, l'invention concerne également un procédé de prophylaxie ou de traitement d'un sujet, ledit procédé comprenant :

(a) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant de l'invention codant pour un premier transgène codant pour un immunogène qui est utile pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel que des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés

BE2017/5910 humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale ; et (b) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de

ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci comme décrit dans le présent document, le vecteur codant pour un second transgène codant pour un immunogène qui sera utile pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel que des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale ;

dans lequel peuvent être entreprises dans l'un ou l'autre ordre.

Le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de

ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci comme décrit dans le présent document, ne comprend, de manière adaptée, pas de fibre de ChAdl57, d'hexon de ChAdl57 ou de ne comprend pas de fibre ou de fibre de ChAdl57 fibre de ChAdl57, par exemple, de ChAdl57, d'hexon de ChAdl57 ou de dérivés fonctionnels de ceux-ci ayant une identité d'au moins 98 % avec ceux-ci.

Le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci tel que décrit dans le présent document peut être un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55, notamment un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55.

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Tel que ceci a été mentionné, un vecteur adénoviral recombinant de l'invention peut être utilisé pour la délivrance de molécules thérapeutiques ou immunogènes conjointement à un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55. Le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 comprendra une fibre, un penton et/ou un hexon selon SEQ ID NO : 7, 9 et 11, en particulier une fibre, un penton et un hexon selon SEQ ID NO : 7, 9 et 11.

Par le terme faible réactivité croisée, on entend que l'immunisation avec un premier vecteur n'entraîne pas de réponse notable des anticorps neutralisants contre un second vecteur, en d'autres termes n'a pas un impact considérable sur la puissance immunologique du second vecteur. Les réponses des anticorps neutralisants peuvent être déterminées avec des procédés analogues à ceux de l'exemple 7 proposé dans le présent document. De manière souhaitable, l'immunisation avec un premier vecteur élicite deux fois un titre de neutralisation qui est en moyenne inférieur à 50 % du niveau provoqué par l'immunisation avec le second vecteur, par exemple inférieur à 75 %, de manière adaptée inférieur à 90 %.

Par le terme « sujet », on entend tout animal, de manière adaptée un mammifère, et en particulier un être humain.

Procédé de délivrance et dosage

Le vecteur peut être préparé pour l'administration par mise en suspension ou dissolution dans un vecteur

BE2017/5910 pharmaceutiquement ou physiologiquement acceptable tel qu'une solution saline isotonique ; une solution de sels isotoniques ou autres formulations qui seront évidentes aux hommes du métier. Le vecteur adapté sera évident aux hommes du métier et dépendra en grande partie de la voie d'administration. Les compositions décrites dans le présent document peuvent être administrées à un mammifère dans une formulation à libération prolongée en utilisant un polymère biocompatible biodégradable, ou par délivrance sur site à l'aide de micelles, de gels et de liposomes.

Dans certains modes de réalisation,

1'adénovirus recombinant de l'invention est administré à un sujet par injection intramusculaire, par administration intravaginale, par injection intraveineuse, par injection intrapéritonéale, par injection sous-cutanée, par administration épicutanée, par administration intradermique, par administration nasale, par administration rectale ou par administration orale.

L'administration sublinguale peut également présenter un intérêt.

Si le régime thérapeutique implique la coadministration d'un ou de plusieurs vecteurs adénoviraux ChAdl57 et d'un autre composant, chacun formulé dans des compositions différentes, ils sont de manière favorable administrés co-localement au niveau ou à proximité du même site. Par exemple, les composants peuvent être administrés (par exemple, via une voie d'administration sélectionnée parmi la voie intramusculaire, transdermique, intradermique, souscutanée) au même côté ou à la même extrémité

BE2017/5910 (administration « co-latérale ») ou à des côtés opposés ou des extrémités opposées (administration « controlatérale »).

Les dosages du vecteur viral dépendront principalement de facteurs tels que l'affection traitée, l'âge, le poids et la santé du patient, et peuvent ainsi varier selon les patients. Par exemple, une dose du vecteur viral thérapeutiquement efficace vétérinaire ou pour un être humain adulte contient généralement

10⁵ x 10¹⁵ particules virales, par exemple de

1,5

2,5 un

10⁸

10⁸,

X 10¹⁰,

X 10¹¹, vecteur x 10¹² (par exemple, x 10⁸, 2,5 x 10⁸,

10⁹, 1,5 x

10⁹, 2,5 X

10⁹, 5 X 10⁹, 1 X 10¹⁰,

2,5 X 10¹⁰,

X 10 ⁿ, 1

X 10¹²

10¹⁰,

X 10¹¹ 1,5 X 10¹¹, viral être administré peut

X 10⁷ varie plaque

X 10

2,5 X à une dose qui

typiquement de 1 x 105	à	1 x	101°	unités formant
s (UFP), par exemple	1	x	105	UFP,	2,5	x 105 UFP,
5 UFP, 1 x 106 UFP, 2,	5	x	106	UFP,	5 x	106 UFPó 1
UFP, 2,5 x 107 UFP,	5	X	107	UFP,	1	x 108 UFP,
108 UFP, 5 x 108 UFP,	1	X	109	UFP,	2,5	x 109 UFP,

Les

X 10¹⁰ UFP.

doses varieront en x 10⁹ UFP, ou fonction de la taille de l'animal et de la voie d'administration.

Par exemple, une dose humaine ou vétérinaire adaptée (pour un animal d'environ 80 kg) pour une injection intramusculaire se trouve dans la plage d'environ

10⁹ à environ 5 x 10¹² particules par ml, pour un site unique. Facultativement, de multiples sites d'administration peuvent être utilisés.

Dans un autre exemple, une dose vétérinaire ou humaine appropriée peut se trouver dans la plage d'environ

BE2017/5910

X 10¹¹ à environ 1 x 10¹⁵ particules pour une formulation orale.

Le vecteur viral peut être quantifié par analyse par PCR quantitative (Q-PCR) , par exemple avec des amorces et une sonde conçues sur la région du promoteur du CMV en utilisant en tant que courbe d'étalonnage une dilution en série d'ADN plasmidique contenant le génome du vecteur avec la cassette d'expression comprenant le promoteur du HCMV. Le nombre de copies dans l'échantillon de test est déterminé par le procédé d'analyse en lignes parallèles. Des variantes de procédés pour la quantification des particules de vecteur peuvent être un procédé de CLHP analytique ou un procédé spectrophotométrique basé sur A260 nm.

Une quantité d'un acide nucléique efficace sur le plan immunologique peut de manière appropriée se situer entre 1 ng et

100 mg.

Par exemple, une quantité appropriée peut être de pg à 100 mg. Une quantité appropriée de

1'acide nucléique particulier (par exemple, du vecteur) peut être facilement déterminée par un homme du métier.

Des exemples de quantités efficaces d'un composant acide nucléique peuvent se situer entre 1 ng et 100 pg, par exemple entre 1 ng et 1 pg (par exemple, 100 ng1 pg) , ou entre 1 pg et 100 pg, par exemple 10 ng, 150 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, ou 1 pg. Des quantités efficaces d'un acide nucléique peuvent aussi comprendre de 1 pg à 500 pg, par exemple entre 1 pg et 200 pg, par exemple entre 110 et 100 pg, par exemple 1 pg, 2 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 50 pg, 75 pg, 100 pg, 150 pg, ou 200 pg. En variante, un

BE2017/5910 exemple de quantité efficace d'un acide nucléique peut se situer entre 100 pg et 1 mg, par exemple de 100 pg à 500 pg, par exemple, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg ou 1 mg.

Généralement, une dose humaine sera un volume compris entre 0,1 ml et 2 ml. Ainsi, la composition décrite dans le présent document peut être formulée en un volume, par exemple de 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 ou 2,0 ml de dose humaine par composant immunogène individuel ou combiné.

Un homme du métier peut ajuster ces doses, en fonction de la voie d'administration et de l'application thérapeutique ou vaccinale pour laquelle le vecteur recombinant est utilisé. Les niveaux de l'expression du transgène, ou pour un adjuvant, le niveau d'anticorps circulant, peuvent être surveillés pour déterminer la fréquence d'administration de la dose.

Si une ou plusieurs étapes de sensibilisation et/ou de rappel sont utilisées, cette étape peut comprendre une dose unique qui est administrée sur une base horaire, quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle, ou annuelle. Par exemple, les mammifères peuvent recevoir une ou deux doses contenant d'environ 10 pg à environ 50 pg de plasmide dans un vecteur. La quantité ou le site de délivrance est de manière souhaitable sélectionné(e) en se basant sur l'identité et l'affection du mammifère.

Les niveaux thérapeutiques de, ou le niveau de réponse immunitaire contre, la protéine codée par le

BE2017/5910 transgène sélectionné peuvent être surveillés pour déterminer le besoin, le cas échéant, de rappels. Après une évaluation de la réponse des cellules T CD8+, ou facultativement, des titres d'anticorps, dans le sérum, facultativement des immunisations de rappel peuvent être souhaitées. Facultativement, les vecteurs adénoviraux recombinants ChAdl57 peuvent être délivrés en une seule administration ou dans différents régimes combinés, par exemple, en combinaison avec un régime ou un cours de traitement impliquant d'autres ingrédients actifs ou dans un régime comprenant une primoimmunisation et un rappel.

La présente invention va maintenant être décrite plus en détails au moyen des exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLES

Exemple 1 : isolement de ChAdl57 et construction de vecteur

On a isolé 29 types différents d'adénovirus de chimpanzé de type sauvage à partir de jeunes chimpanzés sains hébergés dans des installations européennes à l'aide de procédures standard tel que décrit dans Colloca et. al. Sei Transi Med. 2012 Jan 4 ; 4(115) : 115ra2 et W02010/086189, qui est ainsi intégré au présent document à titre de référence pour les fins de description des techniques d'isolement et de caractérisation d'adénovirus.

On a ensuite rassemblé les 29 virus de type sauvage en un pool ; on a cloné le génome viral du pool par recombinaison homologue dans des cellules BJ5183

BE2017/5910 d'E. coli en utilisant une navette BAC, pour créer une minibanque de vecteurs portant la délétion de la région El. On a transfecté la minibanque de vecteurs ΔΕ1 dans une lignée cellulaire Procell 92 ; on a repiqué les vecteurs sauvés en série pour 16 passages d'infection. Au passage 16, on a préparé 1'ADN viral du vecteur amplifié et on l'a cloné par recombinaison homologue dans des cellules E. coli BJ5183 en utilisant une navette plasmidique. On a identifié l'espèce de vecteur prévalente comme le vecteur ChAdl57AEl et on l'a ensuite modifié pour qu'il comprenne les modifications supplémentaires suivantes du squelette de vecteur :

a) délétion de la région E4 (de la pb 34413 à la pb 37127) du virus ΔΕ1 ;

b) insertion de E4orf6 dérivé d'Ad5 humain.

1.1 : Génération de la minibanque de ΔΕ1

On a utilisé le pool de 29 virus de types sauvage pour obtenir un génome viral groupé. On a cloné le génome viral groupé dans un vecteur BAC par recombinaison homologue dans une souche d'E. coli BJ5183 co-transformée avec un ADN viral groupé et la navette BAC du sous-groupe C (#1365) (SEQ ID NO : 14) .

Tel que ceci est présenté sur le schéma de la figure 2, la navette du sous-groupe C est un vecteur BAC dédié au clonage de ChAd appartenant à l'espèce C et contient par conséquent le gène pIX et des fragments d'ADN dérivés des extrémités droite et gauche (y compris les ITRs droite et gauche) des virus ChAd de l'espèce C.

La navette BAC de l'espèce C contient également une cassette RpsL-Kana insérée entre l'extrémité gauche

BE2017/5910 et le gène pIX. En outre, une cassette de sélection Amp-LacZ-SacB, flanquée des sites de restrictions IScel, est présente entre le gène pIX et l'extrémité droite du génome viral. En particulier, la navette BAC comprend les éléments suivants : ITR gauche : pb 27 à 139, cassette hCMV(tetO) RpsL-Kana : pb 493 à 3396, gène pIX : pb 3508 à 3972, sites de restriction IScel : pg 3990 et 7481, une cassette de sélection Amp-LacZ-SacB : pb 4000 à 7471, ITR droite : pb 7805 à 7917. hCMV(tetO) est proposé dans SEQ ID NO : 37.

Les cellules BJ5183 ont été co-transformées par électroporation avec le pool d'ADN viraux purifiés et avec le vecteur navette BAC de sous-groupe C digéré par l'enzyme de restriction IScel avant de les purifier du gel. La recombinaison homologue qui survient entre le gène pIX et les séquences ITR droites (présentes au niveau des extrémités de l'ADN linéarisé de la navette BAC de l'espèce C) et des séquences homologues présentes dans l'ADN viral groupé a conduit à l'insertion des différents ADN génomiques dans le vecteur navette BAC. En même temps, on a délété les régions virales sEl et on les a substituées par la cassette RpsL-Kana, générant BAC/minibanqueAEl/ TetO hCMV RpsL-Kana.

1.2 : Amplification de la minibanque de ΔΕ1 dans la lignée cellulaire Procell 92 et clonage du vecteur ChAdl57AEl

La minibanque de ΔΕ1 a été digérée par Pmel et utilisée pour transfecter la lignée cellulaire d'empaquetage Procell 92, de manière à sauver la banque

BE2017/5910 de différents virus en vrac. Dix jours après la transfection, on a récolté les cellules et on a soumis le lysat cellulaire à trois cycles de congélation (70 °C) et décongélation ( + 37 °C), on l'a clarifié par centrifugation à 2 000 tr/min puis on l'a utilisé pour infecter des cellules fraîches. On a réalisé 16 passages en série d'amplification de virus, de manière à sélectionner l'espèce virale pour l'efficacité de propagation dans des cellules Procell92. On a purifié le (s) virus au passage 16 par deux centrifugations en gradient de CsCl et on a extrait l'ADN viral puis on l'a cloné par recombinaison homologue dans des cellules E. coli BJ5183 en utilisant une navette plasmidique. De manière plus détaillée, on a co-transformé les cellules BJ5183 avec de l'ADN viral purifié et la navette plasmidique de sous-groupe C (SEQ ID NO : 38). Tel que ceci est présenté sur le diagramme de la figure 3, la navette plasmidique du sous-groupe C est un vecteur plasmidique dédié au clonage de ChAd appartenant à l'espèce C et contient par conséquent les fragments d'ADN dérivés des extrémités droite et gauche (y compris les ITRs droite et gauche) des virus ChAd de l'espèce C.

La recombinaison homologue entre les séquences d'ADN des ITRs gauche et droite présentes au niveau des extrémités de la navette plasmidique de sous-groupe C (digérés avec PshAI/Ndel/Xbal) et les ADN génomiques viraux ont permis son insertion dans le vecteur plasmidique. On a amplifié 30 clones différents et on les a analysés par analyse de restriction ; on a identifié 9 espèces différentes. Dix-neuf clones/30 ont

BE2017/5910 présenté le même profil de restriction et représentaient l'espèce prédominante ; on a sélectionné l'un de ces clones et on l'a identifié comme pChAd!57AEl TetO hCMV RpsL-Kana#1551 (SEQ ID NO : 15).

1.3 : Construction de ChAdl57 ΔΕΙ/TetO hCMV GAG#1557

On a cloné la cassette GAG (séquence polynucléotidique de GAG SEQ ID NO : 16) dans un vecteur pré-adéno accepteur linéarisé via recombinaison homologue dans E. coli par exploitation de l'homologie existant entre le promoteur HCMV et les séquences polyA de BGH (SEQ ID NO : 39) .

On a clivé le plasmide pARS CV32TetOhCMV GAG avec Spel et SphI pour exciser le fragment de 2,44 Kb contenant le promoteur du HCMV avec tetO, HIV-GAG et la séquence polyA de BGH.

On a cloné le fragment HIV-GAG de 2,44 kB par recombinaison homologue dans le vecteur accepteur pChAdl57 ΔΕΙ/TetO hCMV RpsL-Kana (#1551) (digéré par SnabI) portant la cassette de sélection RpsL-Kana sous le contrôle du HCMV et de BGHpA. La construction obtenue était le vecteur pChAdl57 ΔΕΙ/TetO hCMV GAG#1557 (SEQ ID NO : 17) .

La structure du plasmide portant le GAG de ChAdl57 est rapportée sur la figure 4.

1.4 : Construction de ChAdl57 ΔΕ1Ε4 Ad5E4orf6/TetO hCMV

RpsL-Kana#1594

On a ensuite modifié le vecteur ChAdl57AEl pour qu'il porte les modifications suivantes dans le squelette :

BE2017/5910

a) délétion de la région E4 (de la pb 34413 à la pb 37127) du virus ΔΕ1 ;

b) insertion de E4orf6 dérivé d'Ad5 humain.

On a introduit une délétion de la région E4 allant du nucléotide 34413 au 37127 (coordonnées de la séquence du vecteur ΔΕ1) dans le squelette du vecteur par remplacement de la région native E4 avec la séquence codante d'E4orf6 d'Ad5 en utilisant une stratégie impliquant plusieurs étapes de clonage et de recombinaison homologue dans E. coli. On a complètement délété la région codante d'E4 alors que l'on a conservé le promoteur natif d'E4 et le signal de polyadénylation À cette fin, on a construit un vecteur navette pour permettre l'insertion d'Ad5orf6 par remplacement de la région E4 native de ChAdl57 par recombinaison homologue dans E. coli BJ5183 tel que détaillé ci-dessous.

- Construction de pARS SpeciesC Ad5E4orf6-l : on a obtenu de l'ADN contenant Ad5orf6 par PCR en utilisant l'ADN d'Ad5 en tant que matrice, avec les oligonucléotides : 5'ATACGGACTAGTGGAGAAGTACTCGCCTACATG-3' (SEQ ID NO : 18) et 5'-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3' (SEQ ID NO : 19). Le fragment de PCR a été digéré par BglII et Spel puis on l'a cloné dans la navette pARS Species C RLD-EGFP digérée par BglII et Spel, générant le plasmide pARS Species C Ad5orf6-1.

- Construction de pARS Species C Ad5E4orf6-2 :

On a amplifié un fragment d'ADN de 144 pb contenant le polyA d'E4 de fibre (de pb 34269 à pb 34412 du vecteur ChAdl57AEl) par PCR en utilisant en tant que matrice le plasmide pChAd!57 ΔΕΙ/TetO hCMV

BE2017/5910

RpsL-Kana (#1551) avec les oligonucléotides suivants : 5'-ATTCAGTGTACAGGCGCGCCAAAGCATGACACTGATGTTCATTTC-3 ' (SEQ ID NO : 20) et 5'ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3' (SEQ ID NO : 21). Le fragment de PCR a été digéré par BsrGI et Spel puis on l'a cloné dans pARS SubGroupC Ad5orf6-1 digéré avec BsrGI et Spel, générant le plasmide pARS SpeciesC

Ad5orf6-2 (SEQ ID NO : 40) .

On a alors utilisé le plasmide pARS SpeciesC

Ad5orf6-2 obtenu pour remplacer E4 par Ad5orf6 dans squelette de ChAdl57. À cette fin, le plasmide pChAdl57AEl TetO hCMV RpsLKana#1551 a été digéré avec Pad et co-transformé dans des cellules BJ5183 avec le plasmide pARS SpeciesC Ad5orf6-2 digéré par BamHI/AscI, pour obtenir le plasmide préadéno pChAdl57 AElE4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1594) (SEQ ID NO : 22) .

1.5 : Construction de ChAdl57AElE4 Ad5E4orf6/TetO hCMV RG#1559.

On a cloné la cassette d'expression de la glycoprotéine virale de la rage (RG) (séquence polynucléotidique de la glycoprotéine de la rage SEQ ID NO : 23) dans un vecteur pré-adéno accepteur linéarisé par recombinaison homologue dans E. coli par exploitation de l'homologie existante entre le promoteur de HCMV et les séquences polyA du BGH.

On a clivé le plasmide pvjTetOhCMV-bghpolyA_RG avec Spel et AsiSI pour exciser le fragment de 2,59 Kb contenant le promoteur du HCMV avec tetO, RG et la séquence polyA de BGH.

BE2017/5910

Qn a cloné le fragment R?	3 de	2,59 kB obtenu par
recombinaison homologue dans	le	vecteur accepteur
pChAdlS? AE'	LE4_Ad5E 4 orf6/TetO	hCMV	RpsL-Kana ( #1594)
portant la	cassette de sélec	:tion: :	RpsL-Kana sous le
contrôle du	HCMV et de BGH]	gA. C	>n a linéarisé le
plasmide ac	jcepteur préAd avec	1'endonucléase de
restriction	SnaBI. La constrt	iction	obtenue était le

vecteur pChAdl57 AElE4_Ad5E4orf6/TetO hCMV -RG# 155 9 (SEQ ID NO : 24).

0 La structure du plasmide portant le RG de ChAdl57 est rapportée sur la .figure 6.

Exemp1e 2 : Production de vecteur

On a évalué la productivité de ChAd'157 en comparaison à ChAdl9 et ChAdlSS dans la lignée cellulaire Procell92.

2,1 : Production de vecteurs comprenant le transgène Gag du VIH

2Q- On a sauvé ChAdl57/GAG, ChAdl.9/GAG, ChAdlS5/GÂG (les vecteurs ChAdl-57, ChAdl9 et ChAdlSS exprimant un transgène Gag du VIH) et on les a amplifiés dans Procell 92 ; on a utilisé les lysats pour infecter un flacon T25 de Procell 92 cultivé en monocouche avec chaque vecteur. On a utilise une multiplicité d'infection (MOI) de 300 pv/çellule et on a réalisé les infections en présence de tétracycline parce que ChAdl9/'GAG ne possédait pas le contrôle transcriptionnel médié par .1’insertion de 1’opérateur

TetO dans le promoteur du hCMV. On a récolté les cellules infectées lorsqu'un effet cytopathique complet

B E2017/5910 était évident. (48 heures après l'infection pour ChAdl57/GAG et ChAdl55/GAG et 5 jours après l'infection pour ChAdl9/GAGj ; les virus ont été libérés des cellules infectées par trois cycles de § congéiatio.n/décongélat.iön (-70 °C à 37 °C) puis on a clarifié le. lysât par centrifugation. On a quantifié .les lysats clarifiés par analyse par PCR quantitative avec des amorces et une sonde complémentaires de la région du promoteur o1igonue1é ot idique s so ni du

CMV.

Les les suivantes :

séquence

CMVfor

5'

CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA“3' (SEQ ID

NO :

CMViev 5'~GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3' (SEQ ID

NO ;

sonde CMVFAM-TAMRA 5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT

3' (SEQ séquence 7900 ABI Prism d’Applied Biosystem).

Les titres volumétriques obtenus (pv/ml) mesurés sur des lysats clarifiés et la productivité spécifique exprimée, en particules virales par cellule (pv/cellule) sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Productivité du vecteur GAG.

Vecteur	Productivité volumétrique (pv/ntl)	pv totales	Productivité spécifique des cellules (pv/cellule)
ChAdl 5 7/GAG	4, 61Ε1Ό9	2,30E+10	7,68E+03
ChAdl55/GAG	5,42E+09	2,71E+10	9,04E+03
ChAdl9/GAG	4,80E+08	2,4ÖEL09	8,00Ε4Ό2

2.2 : Production de vecteurs comprenant un transgène RG

BE2017/5910 évaluer la productivité des cellules Procell de vecteurs de vaccins RG dans

9.2 cultivées en suspension.

ChAdl55/RG en

ChAdl57/RG

L’expé r i en c e eompa r ait parallèle par infection de Procell cellulaire de 5 x 1Q⁵ cellules/ml.

multiplicité d'infection récolté les cellules l'infection ; le infectées par trois puis on a clarifié a 1 o r s gu a n t i f ié 1 e s virus et

On à une densité a utilisé une (MOI..) de 300 pv/cellule. On a infectées 4 jours après a été libéré des cellules cycles de congélation/décongélation le lysât par centrifugation. On a l.ysat-s clarifiés par

QPCR tel que r a pp ort é c i-de s s u s.

La productivité volumétrique et la spécifique des cellules sont données dans ci-dessous.

productivité le tableau 2 tableau 2 : Productivité du vecteur RG.

Vecteur	Productivité volumétrique (pv/ml)	pv totales	Productivité spécifique des cellules (pv/cellule)
ChAdl57/RG	9,39E+09	4,6.9E+L1	1,88E+04
ChAdlS5/RG	1,41E+10	7,04E+11	2,81E+04

E x empl e _3_: _n i v c a u x d' exp r e s s i o n__d es trans g ènes

3.1 : N iveau d'ex pres s ion du. t ransgène Gag du VIH

On a comparé les niveaux d'expression dans des expériences parallèles par infection de cellules HeLa avec, les vecteurs ChAdl9, ChAdlSS et ChAdlS? comprenant un transgène Gag du VIH.

100

BE2017/5910

On a ensemencé des cellules HeLa dans des boîtes de: 35 mm et on les a infectées avec les virus purifiés ChAdl-9/GAG, ChAdl-57/GAG et ChAd3.55/GAG en utilisant une MOI “ 250 pv/cellule. On a récolté les surnageants de cellules HeLa infectées 48 heures après l'infection, et on a quantifié la production de la protéine GAG du VIH sécrétée à l'aide d'un kit ELISA disponible dans le commerce (HIV~1 p24 ELISA Kit, PerkinElmer Life Science.) . On a réalisé la quantification selon les 10 instructions du fabricant en utilisant une courbe d'étalonnage de l’antigène p24 du VIH-1.

Les résultats, exprimés en pg/ml de ia protéine GAG, sont illustrés dans la figure 7.

1.5 3.2 : Niveau d· expression du transgène RG

On a également: réalisé une analyse par western blot pour évaluer 1'expression de la glycoprotéine de la rage fournie par le vecteur ChAdl57/RG en comparaison avec le vecteur ChAdl-55/RG. À cette fin, on 2Q a ensemencé des cellules HeLa dans des boîtes de 35 mm et on lés a infectées avec les virus purifiés ChAdl5.7'/RG et ChAdl55/RG en utilisant une MOI == 250 pv/cellule. On. a récolte les lysats cellulaires 48 heures après 1’infection et on a évalué le niveau 25 d'expression des transgènes par SDS-PAGE réductricesuivie d'une analyse, par western blot.

On a chargé des quantités équivalentes d'extraits protéiques sur des gels SDS réducteurs ; après la séparation par électrophorèse, on a transféré les 30 protéines sur une membrane de nitrocellulose pour les sondci avec un anti-GP polyclonal de 'apin (cat. No.

BE2017/5910

101

RBVGP11-S «Diagnostic, dilué à 1/1000} . Après l'incubation avec l'anticorps primaire, on a lavé la membrane et on l'a mise à incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP).

Finalement, on a développé les essais par chimiluminescence en utilisant des réactifs de détection pour chimiluminescence améliorée (ECL) (W3252282 PIERCE). Les résultats de western blot sont présentés sur la figure 8.

Une bande d'environ 57 kD indiquée par la flèche a été révélée par l'anticorps polyclonal anti-GP, qui correspond au poids attendu de la glycoprotéine de la rage,

Le résultat met en évidence que le niveau 15 d'expression du vecteur ChAdl57 apparaît comparable à celui fourni par CtAd155.

Exemple 4 j_évaluation de la puissance immunologique par des expériences d'immunisation chez les souris .4.1 1 I.mmuriogénicité de..... vecteurs _______comprenant le transgène Gag du VIH

On a évalué l'immunogénicité du vecteur

ChAdl57/GAG en parallèle avec ChAdl55/GAG et ChAdl9/GAG chez des souris BALB/c (6 par groupe) . On a réalisé 25 l'expérience par injection de 10 ? particules virales par voie intramusculaire. On a mesuré la réponse des lymphocytes T 3 semaines après 1'immunisation par ELXSpot {enzyme-linked immuno spot') ant i- int erf êron~v (IFN-y) en utilisant un épitope des lymphocytes T CD8 + 30 spécifiques de GAG cartographié chez des .souris BALB/c.

Les résultats obtenus sont, rapportés sur la figure 9,

BE2017/5910 exprimés sous la -forme de cellules sécrétant de .1'IFNy (SCF) par .million de splénocytes.

Chaque point représente la réponse d'une seule souris, et la ligne correspond à la moyenne géométrique de chaque groupe de dose. La fréquence de souris positives au peptide immunodominant CD8 est présentée sur l'axe des X.

4.2. .immunogénicité de vecteurs comprenant le transgène

RG

On a évalué le pouvoir iiïmiunologique de ChÀdl57./RG et. ChAdl55/RG chez des souris BALB/c. On a injecté les deux vecteurs par voie intramusculaire avec des doses de 10⁷ et 10^e pv. On a isolé les splénocytes de souris immunisés sept, semaines après la vaccination et on les a analysés par ÉLISpot anti-IFNY (figure 10), en utilisant des pools de peptide de RG en tant qu’antigène.

Les niveaux de la réponse immunitaire étaient 20 réduits, en phase avec une dose réduite, comme attendu..

En outre, le vecteur ChAdlSSRG a induit une réponse des lymphocytes T supérieure à ChAdl57 RG,- bien qu'elles n'étaient pas significativement différentes (figure 10).

Exemple 5 : évaluâtion de 1'infectivité · L Infectivité de vecteurs comprenant le transgène Gag du VIH

On a évalué 1’infectivité- de virus purifiés dans des cellules Pro.cell 92 adhérentes en utilisant un anticorps contre la proteine hexon de 1'adénovirus pour visualiser des cellules infectées par

Ί03

B E2017/5910 immunocytochimique, 1/anticorps contre la protéine hexon reconnaît cette fin, on a des cellules Procel.192 dans de s [j laque s à puits à une et on les a infectées: en double avec les vecteurs

ChAdl57/GAG et ChAdl55/GAG et en utilisant une MOI pv/celiule

Quarante-huit heure s après l'infection, on a méthan0:1 froid puis on fixé les

1e s a marque e s

1' mis les cellules marquées à incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort et la détection a été réalisée en utilisant, un kit disponible dans le commerce VECTOR NOVARED Substrate Kit (SKM800) .

La détection est réalisée lorsque le marqueur, l'enzyme peroxydase de raifort, réagit avec le substrat de DAB, résultant en un produit marron. On a alors quantifié les cellules marron foncé marquées par microscopie 2Q optique et on a calculé le titre infectieux. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.

Virus	Pv/ml	Ifu/ml	R (pv/ifu)
ChAdl55 GAG	1,32E+11	l,58E+09	84
ChAdl57 GAG	1,17 ELU	1,23E+09	95
ChAdl 9 GAG	4, 46E+10	3,86E108	116

nus l'infectivité des virus

ChAdl55 et ChAdl57 était comparable et supérieure à celle de

ChAdl9.

BE2017/5910

5.2 Infectivité de. vécteurs gomprenant le t ransgéne RG On a évalué l'infectivité des virus purifiés

ChAdl57/RG et ChAdl55/RG dans des cellules Procell 92 adhérentes par irnmunocoloration de 1'hexon tel que 5 rapporté ci-dessus. Les résultats: sont présentés dans le tableau ci ~ de s s ou s.

Virus	Pv/ml	Xfu/ml	R (pv/ifu)
ChAdl55/RG	4,2377.1	4,067+09	104
ChAdl57/RG	1, 97E+.11	1,467+09	133

Le résultat a mis en évidence que l'infectivité des virus ChAdlSS et ChAdl57 était comparable.

h Exemple;_6 : évaluation_de la neutralisation croisée entre les vecteurs de ChAdl55 et ChAdl57

6.1 Test in vivo afin de déterminer si les vecteurs de GhAdlSS et ChAdl57 sont de sérotypes différents

On a évalué la neutralisation croisée entre les vecteurs ChAdlSS et ChAdl57 chez des souris BALB/c (6 par groupe) . Oh a pré-immunise lés souris deux fois à la semaine 0 et à la semaine 3 avec 10^s pv de ChAdlSS et ChAdl57 exprimant RG ou. on leur a administré un leurre vaccinal composé de solution saline. Trois 25 semaines plus tard, on a immunisé toutes les souris avec LO⁹ pv de ChAdl57 codant pour gag du VIH.

Groupes	n	Pré- immunisation 2 X sO et s3	dose (pv)	Immunisation s 6	dose (pv)
: 1	6	PBS		ChAdl57-GAG	109
.2	6	ChAdl55“RG		ChAdl57-GAG	10»

105

B E2017/5910

3

6

ChAdl57-RG

1W

ChAdl57~GÀG-

On a mesuré les titres de neutralisation envers les vecteurs de pré “immun is at ion dans le sérum à la 5 semaine 5 (2 semaines après la seconde injection} par un dosage de neutralisâtion in vitro (figure 11). Finalement, on a testé la réponse des lymphocytes T contre gag sur les splénocytes 3 semaines après 1'immunisation par ELISpot anti-IENy, en utilisant un j;q épitope des lymphocytes T CD 8 + spécifiques de GAG .cartographié chez les souris BALB/c (figure 12) . Les doses de vecteurs utilisées pour la pré-immunisation ont été capables d'éliciter de .bonnes activités de neutralisation contre les deux vecteurs Ad, bien j, $ qu'avec une certaine variabilité. Les anticorps neutralisants anti~ChAdl55 ne présentent pas de réaction croisée contre ChAdl57 et inversement (figure il). En outre, la réponse des lymphocytes T spécifiques de Gag à ChAdl57 n’a pas été affectée par Ici pré··2Q immunité anti~GhAdl55, confirmant l'absence de neutralisation croisée (figure 12).

Prises conjointement, ces données suggèrent que les virus ChAdlSS et ChAdl57 sont des adénovirus de sérotypes différents.

106

BE2017/5910

Claims (71)

1. REVENDICATIONS

   1. Polynucléotide isolé, dans lequel le polynucléotide code pour un polypeptide sélectionné dans le groupe constitué de :

   (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, et (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
2. 2. Polynucléotide recombinant comprenant un polynucléotide sélectionné dans le groupe constitué de :

   (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, et (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
3. 3. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide sélectionné dans le groupe constitué de :

   (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, et (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides

   107

   BE2017/5910 aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
4. 4. Adénovirus recombinant comprenant au moins un polynucléotide ou un polypeptide sélectionné dans le groupe constitué de :

   (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, et (d) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
5. 5. Composition comprenant au moins l'un de ce qui suit :

   (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente

   108

   BE2017/5910

   une identité d'au moins 99, 8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1,

   (d) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (e) un vecteur selon la revendication 3, et (f) un adénovirus recombinant selon la revendication 4, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
6. 6. Cellule comprenant au moins l'un de ce qui suit :

   (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (d) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1,

   109

   BE2017/5910 (e) un vecteur selon la revendication 3, et (f) un adénovirus recombinant selon la revendication 4.
7. 7. Polypeptide adénoviral isolé sélectionné dans le groupe constitué de :

   (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, et (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
8. 8. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le polynucléotide code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 99,8 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
9. 9. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le polynucléotide code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1.
10. 10. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 9, dans lequel le polynucléotide a une séquence selon SEQ ID NO : 2.

    110

    BE2017/5910
11. 11. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :

    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui

    présente une identité d'au moins 60 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 60 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
12. 12. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 11, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :

    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, dans lequel

    111

    BE2017/5910

    le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 98 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides

    aminés selon SEQ ID NO : 5 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 98 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
13. 13. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :

    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui

    présente une identité d'au moins 98 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ;

    ou

    112

    BE2017/5910 (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 98 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
14. 14. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 13, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :

    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 98 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ;

    ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, dans lequel le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 98 % sur toute sa longueur avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
15. 15. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des

    BE2017/5910 revendications 11 à 14, dans lequel le polynucléotide comprend une séquence selon SEQ ID NO : 4.
16. 16. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, dans lequel le polynucléotide comprend une séquence selon SEQ ID NO : 6.
17. 17. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le polynucléotide

    comprend au moins l'un de ce qui suit : (a) une extrémité 5' adénovirale, de préférence une séquence répétée inversée terminale en 5' (ITR)

    adénovirale ;

    (b) une région E1A adénovirale, ou un fragment de celle-ci sélectionné parmi les régions EIA 280R et EIA 243R r (c) une région E1B ou IX adénovirale, ou un fragment

    de celles-ci sélectionné dans le groupe constitué des régions E1B_19K, E1B_55K ou IX ;

    (d) une région E2b adénovirale ; ou un fragment de celle-ci sélectionné dans le groupe constitué des régions E2B_pTP, E2B_polymérase et E2B_IVa2 ;

    (e) une région L1 adénovirale, ou un fragment de

    celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué des protéines Ll_13.6k, L1_52K et Ll_IIIa ;

    (f) une région L2 adénovirale, ou un fragment de

    celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la

    protéine L2 penton selon la revendication 3, des

    protéines L2_pVII, L2_V, et L2_pX ;

    114

    BE2017/5910 (g) une région L3 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L3_pVI, de la protéine L3_hexon selon la revendication 2 et de L3_protéase ;

    (h) une région E2A adénovirale ;

    (i) une région L4 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L4_100k, de la protéine L4_33k et de la protéine L4_VIII ;

    (j) une région E3 adénovirale, ou un fragment de celle-ci sélectionné dans le groupe constitué de ORF1 d'E3, ORF2 d'E3, ORF3 d'E3, ORF4 d'E3, ORF5 d'E3, ORF6 d'E3, ORF7 d'E3, ORF8 d'E3, et ORF9 d'E3 ;

    (k) une région L5 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour la protéine fibre L5_fibre selon la revendication 1 ;

    (l) une région E4 adénovirale, ou un fragment de celle-ci sélectionné dans le groupe constitué de ORF7 d'E4, ORF6 d'E4, ORF4 d'E4, ORF3 d'E4, ORF2 d'E4, et ORF1 d'E4 ;

    (m) une extrémité 3 ' adénovirale ; de préférence une séquence répétée inversée terminale en 3' (ITR) adénovirale ; et/ou (n) une région d'ARN adénoviral VAI ou VAII, de préférence une région d'ARN adénoviral VAI ou VAII d'un adénovirus autre que ChAdl57, de manière davantage préférée d'Ad5.
18. 18. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 17, dans

    115

    BE2017/5910 lequel le polynucléotide comprend au moins l'un de ce qui suit :

    (a) une extrémité 5' adénovirale, de préférence une séquence répétée inversée terminale en 5' (ITR) adénovirale ;

    (e) une région Ll adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine Ll_13.6k, L1_52K et Ll_IIIa ;

    (f) une région L2 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L2_penton selon la revendication 3, des protéines L2_pVII, L2_V, et L2_pX ;

    (g) une région L3 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L3_pVI, la protéine hexon L3_hexon selon la revendication 2 et L3_protéase ;

    (i) une région L4 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale sélectionnée dans le groupe constitué de la protéine L4_100k, de la protéine L4_33k et de la protéine L4_VIII ;

    (k) une région L5 adénovirale, ou un fragment de celle-ci, ledit fragment codant pour la protéine fibre L5_fibre selon la revendication 1 ;

    (m) une extrémité 3'-adénovirale ; de préférence une séquence répétée inversée terminale en 3 ' adénovirale.

    116

    BE2017/5910
19. 19. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le polynucléotide comprend une région d'ARN adénoviral VAI ou VAII.
20. 20. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 19, dans lequel la région d'ARN adénoviral VAI ou VAII provient d'un adénovirus autre que ChAdl57.
21. 21. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 20, dans lequel la région d'ARN VAI ou VAII provient d'Ad5.
22. 22. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le polynucléotide comprend ou est constitué d'un polynucléotide qui présente une identité d'au moins sa longueur avec une séquence de référence qui est constituée essentiellement de SEQ ID NO : 15 ou 22.
23. 23. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 22, dans lequel le polynucléotide comprend ou est constitué d'un polynucléotide qui présente une identité d'au moins 99 % sur toute sa longueur avec la séquence de référence.
24. 24. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 23, dans lequel le polynucléotide comprend ou est constitué d'un polynucléotide qui présente une identité d'au moins

    99,5 % sur toute sa longueur avec la séquence de référence.
25. 25. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des

    117

    BE2017/5910 revendications 22 à 24, dans lequel le polynucléotide comprend ou est constitué d'un polynucléotide qui est identique sur toute sa longueur à la séquence de référence.
26. 26. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 25, dans lequel la séquence de référence est SEQ ID NO : 15.
27. 27. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 25, dans lequel la séquence de référence est SEQ ID NO : 22.
28. 28. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le polynucléotide

    comprend une mutation ou une délétion qui rend non fonctionnel au moins un gène d'une région génomique sélectionnée dans le groupe constitué de E1A, E1B, E2A,

    E2B, E3 et E4.
29. 29. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 28, dans lequel le polynucléotide ne possède pas au moins un gène d'une région génomique sélectionnée dans le groupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et/ou E4.
30. 30. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une ou l'autre de la revendication 28 ou 29, dans lequel les régions génomiques sont E1A et/ou E1B.
31. 31. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le polynucléotide comprend une délétion de la région génomique El.

    118

    BE2017/5910
32. 32. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 31, dans lequel l'adénovirus recombinant est compétent pour la réplication.
33. 33. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 32, dans lequel l'adénovirus recombinant est incompétent pour la réplication.
34. 34. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 33, dans lequel l'adénovirus recombinant comprend une séquence acide nucléique codant pour une protéine, dans lequel la séquence d'acide nucléique est fonctionnellement liée à une ou plusieurs séquences qui dirigent l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte.
35. 35. Adénovirus selon la revendication 34, dans lequel la protéine est une protéine antigénique ou un fragment de celle-ci.
36. 36. Adénovirus selon la revendication 35, dans lequel la protéine et une protéine hétérologue ou un fragment de celle-ci.
37. 37. Adénovirus selon la revendication 36, dans lequel la protéine est dérivée d'un virus.
38. 38. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 34 à 37, dans lequel les unes ou plusieurs séquences qui dirigent l'expression dudit produit dans une cellule hôte incluent une séquence sélectionnée parmi une ou plusieurs du groupe constitué des : séquences d'initiation de la transcription, de terminaison de la transcription, promoteur et amplificateur.
39. 39. Adénovirus selon la revendication 38, dans lequel les une ou plusieurs séquences qui dirigent

    119

    BE2017/5910 l'expression dudit produit dans une cellule hôte comprennent une séquence promoteur.
40. 40. Adénovirus selon la revendication 39, dans lequel la séquence promoteur est sélectionnée dans le groupe constitué d'un promoteur interne, d'un promoteur natif, du promoteur des LTR du VRS, du promoteur du CMV, du promoteur du SV40, du promoteur de la dihydrofdate réductase, du promoteur de la ß-actine, du promoteur PGK, du promoteur EFla et du promoteur CASI.
41. 41. Adénovirus selon la revendication 39, dans lequel la séquence promoteur est un promoteur du hCMV amplifié, tel que proposé dans SEQ ID NO : 42.
42. 42. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 41, dans lequel 1'adénovirus a une séroprévalence inférieure à 10 % chez les sujets humains et de préférence pas de séroprévalence chez les sujets humains.
43. 43. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 42, dans lequel 1'adénovirus est capable d'infecter une cellule de mammifère.
44. 44. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 et 8 à 43, comprenant un adjuvant sélectionné parmi la liste constituée : des adjuvants inorganiques (par exemple, des sels de métaux inorganiques tels que le phosphate d'aluminium ou 1'hydroxyde d'aluminium), des adjuvants organiques (par exemple, les saponines, telles que QS21, ou le squalène), des adjuvants à base d'huile (par exemple, l'adjuvant complet de Freund et l'adjuvant incomplet de Freund), les cytokines (par exemple, IL-lß, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, et IFN-γ) des adjuvants particulaires

    120

    BE2017/5910 (par exemple, des complexes de stimulation immunitaire (ISCOMS), des liposomes, ou des microsphères biodégradables), des virosomes, des adjuvants bactériens (par exemple, le monophosphoryl lipide A, par exemple le monophosphoryl lipide A 3-dé-O-acylé (3D-MPL), ou les muramyl peptides), des adjuvants synthétiques (par exemple, des copolymères séquencés non ioniques, des analogues du muramyl peptide, ou le lipide A synthétique), des adjuvants de polynucléotides synthétiques (par exemple la polyarginine ou la polylysine) et des oligonucléotides de stimulation immunitaire contenant des dinucléotides CpG non méthylés (« CpG »).
45. 45. Composition selon la revendication 44, dans laquelle l'adjuvant est un 3D-MPL et/ou QS21
46. 46. Cellule selon l'une quelconque des revendications 6 et 8 à 31, dans laquelle la cellule est une cellule hôte qui exprime au moins un gène adénoviral sélectionné dans le groupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3, E4, Ll, L2, L3, L4 et L5.
47. 47. Cellule selon la revendication 45, dans laquelle la cellule hôte est cultivée en suspension.
48. 48. Polynucléotide polypeptide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 47, pour son utilisation en tant que médicament.
49. 49. Polynucléotide polypeptide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 48, pour son utilisation en tant que vaccin.
50. 50. Utilisation du polynucléotide, polypeptide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une

    121

    BE2017/5910 quelconque des revendications 1 à 47 pour le traitement ou la prophylaxie d'une maladie.
51. 51. Procédé d'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet, comprenant l'administration du polynucléotide, du polypeptide, du vecteur, de 1'adénovirus, de la composition ou de la cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 47 au sujet.
52. 52. Polynucléotide isolé comprenant ou constitué d'une séquence selon SEQ ID NO : 2.
53. 53. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43, codant pour un transgène pour l'administration à un sujet qui a été préalablement exposé à un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci, tel que ceci est décrit dans le présent document.
54. 54. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 53, dans lequel le sujet a été préalablement exposé à un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55
55. 55. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 54, dans lequel le sujet a été préalablement exposé à un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55.
56. 56. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 54 ou 55, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 code pour un transgène destiné à une indication ou des indications médicales différentes du vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un transgène.

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57. 57. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 54 ou 55, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 code pour un transgène destiné à la même ou aux mêmes indications médicales que le vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un transgène.
58. 58. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 54 ou 55, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 code pour le même transgène que le vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un transgène.
59. 59. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 53 à 58, dans lequel les transgènes codent pour un immunogène qui est utile pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel que des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale.
60. 60. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43, codant pour un transgène pour l'administration à un sujet qui peut ensuite être exposé à un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou le dérivé fonctionnel de celle-ci, tel que ceci est décrit dans le présent document.
61. 61. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 60, dans lequel le sujet peut ensuite être

    123

    BE2017/5910 exposé à un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55.
62. 62. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 61, dans lequel le sujet peut ensuite être exposé à un vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et un penton de ChAdl55.
63. 63. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 61 ou 62, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 code pour un transgène destiné à une indication ou des indications médicales différentes du vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un transgène.
64. 64. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 61 ou 62, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 code pour un transgène destiné à la même indication ou aux mêmes indications médicales que le vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un transgène.
65. 65. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 61 ou 62, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant comprenant une fibre, un hexon et/ou un penton de ChAdl55 code pour le même transgène que le vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un transgène.
66. 66. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 60 à 65, dans lequel les transgènes codent pour un immunogène qui est utile pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel que des bactéries, des champignons, des

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    BE2017/5910 microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale.
67. 67. Procédé destiné à éliciter une réponse immunitaire chez un sujet, ledit procédé comprenant :

    (a) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un premier transgène ; et (b) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, le vecteur codant pour un second transgène ;

    dans lequel les étapes (a) et (b) peuvent être entreprises dans l'un ou l'autre ordre et les premier et second transgènes peuvent être identiques ou différents.
68. 68. Procédé de prophylaxie ou de traitement d'un sujet, ledit procédé comprenant :

    (a) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 43 codant pour un premier transgène codant pour un immunogène qui est utile pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel qu'une bactérie, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale ; et (b) l'administration au sujet d'un vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci comme

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    BE2017/5910 décrit dans le présent document, le vecteur codant pour un second transgène codant pour un immunogène qui est utile pour immuniser un être humain ou un animal non humain contre un pathogène tel que des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale ;

    dans lequel les étapes (a) et (b) peuvent être entreprises dans l'un ou l'autre ordre.
69. 69. Vecteur adénoviral recombinant ou procédé selon l'une quelconque des revendications 53 à 68, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57, ou de dérivé fonctionnel de celle-ci tel que décrit dans le présent document présente une faible réactivité croisée avec le vecteur adénoviral recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 ou 8 à 43.
70. 70. Vecteur adénoviral recombinant ou procédé selon la revendication 69, dans lequel l'immunisation avec un premier vecteur élicite un titre de neutralisation qui est en moyenne inférieur à 50 % du niveau provoqué par l'immunisation avec le second vecteur.
71. 71. Vecteur adénoviral recombinant ou procédé selon l'une quelconque des revendications 53 à 70, dans lequel le vecteur adénoviral recombinant qui ne comprend pas de fibre de ChAdl57 ne comprend pas de fibre de ChAdl57, d'hexon de ChAdl57 ou de fibre de ChAdl57 ou de dérivés fonctionnels de ceux-ci ayant une identité d'au moins 98 % avec celle-ci.

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