ES2685605T3

ES2685605T3 - Moléculas de virus TT reorganizadas para su uso en diagnóstico, prevención y tratamiento del cáncer y autoinmunidad

Info

Publication number: ES2685605T3
Application number: ES11737889.3T
Authority: ES
Inventors: Ethel-Michele De Villiers; Harald Zur Hausen
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2018-10-10
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: AU2011269260B2; EP2585477B1; EP2585477A1; WO2011160848A8; AU2011269260A1; CA2802964C; JP2016103996A; DK2585477T3; PL2585477T3; PT2585477T; JP6235903B2; WO2011160848A1; SI2585477T1; CA2802964A1; JP2013538044A

Abstract

Un poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado que comprende A) una secuencia de nucleótidos que muestra al menos un 70 % de identidad respecto de una secuencia de nucleótidos que se selecciona entre las secuencias de nucleótidos mostradas en la figura 6 y un poli(ácido nucleico) que codifica un polipéptido que contiene un motivo de firma de una proteína de mamífero que está asociada con cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, en el que el poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado se selecciona entre el grupo de moléculas de μVTT que consiste en zpr4.20 mostrada en la figura 11B, zpr9.6 mostrada en la figura 12B y zpr12.24 mostrada en la figura 13B; o B) (a) una secuencia de nucleótidos que se selecciona entre las secuencias de nucleótidos mostradas en la figura 6; (b) una secuencia de nucleótidos que muestra al menos un 70 % de identidad respecto de una secuencia de nucleótidos de (a) y dicho poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado es capaz de replicarse de manera autónoma tras transfectarlo en células 293TT; (c) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos RVPKVSLHTA VKGQFGLGTG RAM, RVPKVSLHTA VKGQFGLGTG RAM, RVPEVSLHTA VKGQFGLGTG RAM, GAEGEFTHRS QGAIRARDWP GHG, GAEGEFTHRS QGAIRARDWP GYG, GAVGEFTHRS QGAIRARDWP GYG y GAGGEFTHRS QGAIRARDWP GYG mostradas en la figura 14 y dicho poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado es capaz de replicarse de manera autónoma tras su transfección en células 293TT, en el que dicha secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c) o (d) está unida a un poli(ácido nucleico) que codifica un polipéptido que contiene un motivo de firma de una proteína de mamífero que está asociada con cáncer o una enfermedad autoinmunitaria mediante un enlace fosfodiéster, el motivo de firma es de al menos 10 aa y el grado de identidad de este motivo de firma respecto de un motivo correspondiente en una proteína de mamífero es de al menos el 80 %, pero no es idéntico a dicho motivo correspondiente, en el que dicho motivo correspondiente se selecciona entre el grupo que consiste en (1) opsina seleccionada entre las secuencias de aminoácido IYNSFHRGFALG y RLELQKRLPW LELNEKAVE; (2) protamina 1 seleccionada entre las secuencias de aminoácidos ARYRRRSRSRSRSRYGRRRRRSRSRRRRSRRRRR, ARYRCCRSKSRSRCRRRRRRCRRRRRRCCRRRRR, y ARYRCCRSPSRSRCRRRRRRFYRRRRRCHRRRRR; (3) protamina 2 seleccionada entre las secuencias de aminoácidos HTRRRRSCRRRRRRACRHRRHRRGCRRIRRRRRCR, RRRSRSCRRRRRRSCRYRRRPRRGCRSRRRRRCRR, HRRRRSCRRRRRHSCRHRRRHRRGCRRSRRRRRCR, y RRRHRSCRRRRRRSCRHRRRHRRGCRTRRRRCRRY; (4) galanina que tiene las secuencias de aminoácidos de ATLGLGSPVKEKRGWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLTGKRELEPEDEARPGSFDRPL SESNIVRTIIEFLSFLHLKEAGALDRLPGLPAAASSEDLERS; (5) firma de repetición de tipo plexina/semaforina/integrina que tiene las secuencias de aminoácidos de RCSQVGVTSCSECLLARDPVGCGWCSSEGRCTRGERCDERRGSRQNWSSGPSSQCQ (6) gastrina que tiene la secuencia de aminoácidos de VAGEDSDGCYVQLPRSR; (7) colagenasa que tiene la secuencia de aminoácidos de MSRLAELYLLGDSIKGRHDNLWLAAAEMLSYYAPEGKSELGIDICQAKLELAAKV1PYLYEC SGPAAIRSQDLTDGQAASACDILRNKEKDFHQVKYTGKTPVADDGNTRVEVGVFVSEEDYKR YSAFASKEVKAQFGRVTDNGGMYLEGNPSDAGNQVRFIAYEEAKLNADLSIGNLEHEYTHYL DGRFDTYGTFSRNLEESHIVWWEEGFAEYVHYKQGGVPYQAAPELIGQGSKLYLSDVFTTTE EGYAELFAGSHDTDRIYRWGYLAVRFMLETNHNRDYESLLYHSRYGNSFAFYAYLVKLLGYM YNNEFGIWNNEFGIW; (8) repetición de hélice de colágeno que tiene la secuencia de aminoácidos de GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPAGAPGPPGPPGEPGPPGPPGPPGPPGPPGAPGAPGP; (9) proteína específica masculina de esperma que tiene la secuencia de aminoácidos de VGGPCGPCGPCGGPCCGSCCSPCGGPCGPCGPCGPCGPCCGGCGPC GPCGPCCGTTEKYCGL; (10) firma de metaloproteasa colagenasa microbiana (M9) que tiene la secuencia de aminoácidos de GLETLVEFLRAGYYVRFYN; (11) firma de proteína MIC1 de micronema que tiene la secuencia de aminoácidos de TYISTKLDVAVGSCHK; (12) firma de regulador autoinmunitario (AIRE) que tiene la secuencia de aminoácidos de DFWRVLFKDYNLERY; (13) gliadina que tiene la secuencia de aminoácidos de PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL; (14) firma de receptor Y2 de neuropéptido que tiene la secuencia de AFLSAFRCEQRLDAIHS; (15) aerolisina que tiene la secuencia de aminoácidos de WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ; (16) orexina que tiene la secuencia de aminoácidos de MNLPSAKVSWAAYTLLLLLLLLPPALLSLGVDAQPLPDCCRQKTCSC RLYELLHGAGNHAAGILTLGKRRPGPPGLQGRLQRLLQASGNHAAGILT MGRRAGAELEPRLCPGRRCLAAAASALAPRGRSRV; (17) receptor GIP que tiene la secuencia de aminoácidos de PRLGPYlGDQTLTLWNQALAA; (18) prion que tiene la secuencia de aminoácidos de SNGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ; (19) neurotensina que tiene la secuencia de aminoácidos de METSSPWPPRPSP; (20) firma de la familia de receptor nuclear huérfano (receptor nuclear A4) que tiene la secuencia de aminoácidos de PVNLLNALVRAHVDSTP; (21) firma de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDN) que tiene la secuencia de aminoácidos de PLLFLLEEYKNYLDAAN; (22) calcitonina que tiene la secuencia de aminoácidos de KCYDRMQQLPPYEGEGPY; (23) receptor de tipo I de leucotrieno B4 seleccionada entre las secuencias de aminoácidos SRRLRVRRFHRRRRTGR y GRRLQARRFRRSRRTGR; (24) autoantígeno 1 de síndrome de Sjögren/esclerodermia (Autoantígeno p27) que tiene la secuencia de aminoácidos de EISKKMAELLLKGATMLDEHCPKCGTPLFRLKDGKVFCPICE; (25) vasopresina que tiene la secuencia de aminoácidos de RAGGRRRGRRTGSPSEGARV; (26) firma de receptor 2 de hormona concentradora de melanina que tiene la secuencia de aminoácidos de LVQPFRLTRWRTRYKTIRIN; (27) firma del receptor EP1 de prostanoide que tiene la secuencia de aminoácidos de ISLGPPGGWRQALLAGL; (28) ciclincinasa que tiene la secuencia de aminoácidos de EWRSLGVQQSLGWVH; (29) firma de receptor activado por proliferador de peroxisomas (receptor nuclear 1C) que tiene la secuencia de aminoácidos de KTETDASLHPLLQ; (30) firma de receptor M1 muscarínico que tiene la secuencia de aminoácidos de KMPMVDPEAQAPTKQPPK; (31) firma de receptor de tipo B2 de ácido gamma-aminobutírico (GABA) metabotrópico que tiene la secuencia de aminoácidos de LAPGAWGWARGAPRPPPSS; (32) firma de arginina desaminasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SELSRGRGGPRCMSMPLVR; (33) repetición de factor de crecimiento opioide que tiene la secuencia de aminoácidos de SPSETPGPRPAGPARDEPAE; (34) firma de molécula de adhesión CD36 que tiene la secuencia de aminoácidos de WIFDVQNPDEVAKNSSKIKVKQR; (35) firma de proteína protelipídica de mielina (PLP) que tiene la secuencia de aminoácidos de GVVLGAIIGGVLGVVLLLVLLLYLV; y (36) chlamidiaom que tiene la secuencia de aminoácidos de CGSYVPSCSKPCG.

Description

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DESCRIPCION

Moléculas de virus TT reorganizadas para su uso en diagnóstico, prevención y tratamiento del cáncer y autoinmunidad

La presente invención se refiere a moléculas reorganizadas de (a) una secuencia de virus TT específica y (b) a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que muestra homología con proteínas de mamífero asociadas con el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria que son capaces de replicarse de manera autónoma.

La familia Anelloviridae incluye torque teno virus (VTT), TT-midivirus (TTMDV) y TT-minivirus (TTMV), originándose la mayoría en muestras de origen humano (Nishizawa y col., 1997; Takahashi y col., 2000; Ninomiya y col., 2007; Okamoto, 2009; Biagini y de Micco, 2010). La pluralidad de esta familia de virus de ADNmc se refleja no solo en la secuencia de ADN, sino también en el tamaño y la organización del genoma.

Se han efectuado múltiples intentos para encontrar un sistema in vitro adecuado para la replicación y propagación de virus TT. Se han demostrado formas replicativas de su ADN en células de médula ósea y en el hígado (Kanda y col., 1999; Okamoto y col., 2000a, c, d). La sangre periférica actúa como reservorio para los virus TT (Okamoto y col., 2000b) y parece ser que la replicación in vivo se produce preferentemente en células mononucleares activadas (Maggi y col., 2001b; Mariscal y col., 2002; Maggi y col., 2010). Aunque se ha investigado la transcripción in vitro en una diversidad de líneas celulares (Kamahora y col., 2000; Kamada y col., 2004; Kakkola y col., 2007; 2009; Qiu y col., 2005; Müller y col., 2008), ha sido difícil lograr la replicación a largo plazo que dé lugar a la producción del virus (Leppik y col., 2007).

La presencia de una serie de moléculas subvíricas de TT reorganizadas intragenómicas en muestras de suero y la transcripción in vitro de una molécula subvírica que suponía únicamente el 10 % del genoma completo, dio lugar a la discusión de si los virus TT podrían compartir similitudes con la familia de plantivirus Geminiviridae (Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009).

Los geminivirus tanto mono como bipartidos se asocian con satélites de ADN monocatenarios para formar complejos inductores de enfermedades (Saunders y col., 2000; Stanley, 2004; Nawaz-ul-Rehman y Fauquet, 2009; Jeske 2009; Paprotka y col., 2010; Patil y col., 2010).

Las infecciones se producen en los primeros días de vida, infectándose un 100 % de los bebés antes de cumplir un año de edad. Sin embargo, sigue sin estar clara la vía primaria de infección (Kazi y col., 2000; Peng y col., 2002; Ninomiya y col., 2008). La naturaleza ubicua de las infecciones por VTT ha dificultado los esfuerzos para asociarla con la patogénesis de enfermedades (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009; Okamoto, 2009). Se ha comunicado una posible asociación etiológica con enfermedades del hígado (revisado en Okamoto, 2009), el tracto respiratorio (Biagini y col., 2003; Maggi y col., 2003a,b; Pifferi y col., 2005), neoplasias malignas hematopoyéticas (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2002; 2009; Shiramizu y col., 2002; Garbuglia y col., 2003; zur Hausen y de Villiers, 2005) y enfermedades autoinmunitarias (Sospedra y col., 2005; Maggi y col., 2001a; 2007; de Villiers y col., 2009). Durante los últimos años, se han compilado algunos datos que son indicativos de una asociación de la infección con virus TT con tumores malignos humanos. Una tasa elevada de carga de virus TT se ha observado en una biopsia de bazo de un paciente con linfoma de Hodgkin (24 genotipos individuales de VTT). Del mismo modo, Del mismo modo, otros informes describen una mayor tasa de prevalencia de VTT en el cáncer colorrectal y de esófago y en cánceres malignos hematopoyéticos, en comparación con tejido no tumoral del mismo paciente o de otros pacientes. Sin embargo, la ubicuidad de estas infecciones hizo que una interpretación de estos resultados fuera bastante difícil y no permitió relacionar estas observaciones con el desarrollo de tumores.

El documento WO 2008/138619 desvela moléculas subvíricas de virus TT reorganizadas y de replicación autónoma que se asocian con el cáncer.

Jelcic y col. (2004) desvela un poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado que comprende la secuencia detth25.

Sospedra (2005) desvela un genoma completo de un poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado y sugiere que el genoma completo del virus TT está asociado con enfermedades autoinmunitarias.

El documento WO 00/46407 desvela un vector basado en VTT, en el que se inserta un gen de interés dentro del genoma completo de un virus TT.

Durante los experimentos que dieron como resultado la presente invención, se han aislado más de 200 genomas de virus TT. Los aislados que se agrupan en el género Alphatorquevirus (aproximadamente 3,8 kb de tamaño) comparten una homología de secuencia de ADN en la organización de su genoma. Una serie corta (71 pb) de la región intergénica está altamente conservada entre todos los aislados de VTT humanos (Peng y col., 2002) y se usa ampliamente para demostrar la infección por virus TT. Se analizaron muestras de un amplio espectro de enfermedades respecto de la presencia de ADN de torque teno virus aplicando amplificación por la PCR de esta región conservada (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009; Sospedra y col., 2005; de Villiers y Gunst, resultados no publicados). La identificación de tipos de virus TT individuales, sin embargo, requiere de la amplificación de genomas de longitud completa. Hasta ahora, se han aislado 93 genomas de longitud completa de VTT (aproximadamente 3,8 kb) de muestras humanas (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009;

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presentes experimentos). Estos incluyeron muestras obtenidas de individuos sanos, pacientes con leucemia y linfoma, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y enfermedad renal. La presente descripción describe la replicación y transcripción in vitro de 12 aislados tras la transfección inicial del ADN genómico y seguido de la propagación del virus usando células infectadas congeladas o partículas purificadas. Se clonaron y caracterizaron moléculas subvíricas reorganizadas de pTTY (microTTV) que aparecieron en los pases tempranos. Estas también se propagaron de manera independiente en cultivo celular, dando como resultado nuevas estructuras similares a partículas que son capaces de infectar a células 293TT sin virus.

La ubicuidad de los torque teno virus, junto con la ausencia de sistemas de cultivo in vitro adecuados, ha dificultado el progreso en la investigación de este grupo de virus. La multitud y heterogeneidad de tipos (Biagini y de Micco, 2010; Okamoto, 2009), así como su presencia ubicua en células hematopoyéticas (Takahashi y col., 2002; Kanda y col., 1999; Zhong y col., 2002), se han añadido al retraso en la recogida de información acerca de si estos virus están implicados en la patogénesis de cualquier enfermedad. Se aisló un espectro de tipos de VTT (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009; presente divulgación). Con frecuencia se han aislado genomas de longitud completa de una serie de tipos de VTT de una muestra individual, dependiendo de la composición de los cebadores usados para la amplificación por la PCR de larga distancia. La distribución dispersa de los nuevos aislados de la presente divulgación en un árbol filogenético del género Alphatorquevirus (figura 18) indica su heterogeneidad, independientemente del origen. Se ha observado con frecuencia la variación en la organización del genoma que resulta de diferencias en la identidad de secuencia por todo el genoma entre aislados del mismo tipo y ha suscitado preguntas acerca de la funcionalidad de estos genes modificados.

En el pasado, se ha intentado propagar genomas de VTT en una serie de líneas celulares y en monocitos de sangre periférica en diversas condiciones de cultivo in vitro. Se logró un éxito moderado con aislados individuales en estirpes celulares de linfoma de Hodgkin y en células 293T. Sin embargo, la replicación fue lenta y se produjo a bajos niveles (Leppik y col., 2007; Leppik y de Villiers, datos no publicados). Para los estudios de la presente divulgación, se modificó por ingeniería genética la estirpe de células de riñón embrionario humano 293TT para que expresase altos niveles del antígeno T grande de SV-40 (Buck y col., 2005). La transfección de genomas de VTT en estas células dio como resultado la replicación del ADN vírico y la producción de partículas viroides con un tamaño de aproximadamente 30 nm (figura 22). Las estructuras de estas partículas viroides difieren de aquellas publicadas previamente como partículas de VTT (itoh y col., 2000). Esto es posiblemente a consecuencia del aislamiento de esta última de heces.

En la actualidad no pueden explicarse las diferencias en el nivel de replicación de ADN observadas entre aislados de VTT. La información filogenética no proporciona una respuesta. Cabe destacar que 6 aislados (VTT-HD14, VTT- HD15 y VTT-HD16) que se originaron a partir de biopsias cerebrales de pacientes con esclerosis múltiple se replicaron mucho menos en el sistema de la presente divulgación. La producción de virus (figura 22) o la propagación del virus (figuras 19 y 21) no parecieron estar influenciadas, a pesar de los diversos niveles de replicación de ADN o de las modificaciones en la organización del genoma, que incluyeron ORF1 modificadas. Sin embargo, los niveles de transcripción parecían estar influenciados y se detectó una menor cantidad de los transcritos comunes descritos para otros tipos de VTT en los cuatro aislados de VTT-14 que en los cultivos de VTT-HD15a y VTT-HD16a. Los transcritos comunicados previamente (Leppik y col., 2007; Kakkola y col., 2009) se aislaron de todos los cultivos infectados. De forma interesante, no se identificó ningún transcrito que codificase la proteína ORF1 de longitud completa (que se sospecha que desempeña un papel importante en la codificación de la cápside vírica, aunque aún no se ha demostrado) de cualquiera de los tipos de vTT-HD estudiados, a pesar del aislamiento de partículas viroides que portan el genoma de longitud completa de todos los cultivos infectados. Se identificó una serie de secuencias de supuestas proteínas que pueden ser el resultado de productos de fusión de cualesquiera dos o tres genes. Las estrategias de traducción que se sabe que usan los virus, tales como el rastreo ribosomal (leaky scanning), el reinicio y cambio de vía traduccional (ribosomal shunting) (Ryabova y col., 2006) podrían estar implicadas en este caso. La codificación dual en fases de lectura alternativas es un mecanismo adicional que podría estar implicado (Kovacs y col., 2010). De forma interesante, también se aislaron transcritos de la región de control. En este caso, se identificaron dos grupos de transcritos. Un grupo implicado en transcritos que abarcan al menos parte de la región intergénica y que se extienden al resto del genoma, abarcando los genes conocidos. El segundo grupo consistía en transcritos de longitudes diversas y sin capacidad de codificación reconocible. Se ha propuesto que la naturaleza de la región intergénica de VTT con su alto contenido en GC puede tener un papel en el bloqueo de la replicación dependiente de la transcripción (Belotserkovskii y col., 2010).

Una observación muy destacable en el presente estudio es la formación de moléculas subvíricas de manera temprana durante el ciclo de replicación de la mayoría de aislados obtenidos. Se distinguieron dos grupos de moléculas subvíricas. Con bastante frecuencia, se produjo la formación de múltiples moléculas de ADN subvíricas de diversos tamaños y de manera extensa en cultivos infectados por VTT-HD20a, VTT-HD3a y VTT-HD1a. Se ha demostrado la presencia de partículas subvíricas reorganizadas similares en muestras de suero (Leppik y col., 2007). La transfección en células L428 (estirpe celular de linfoma de Hodgkin) de un pequeño número de genomas subvíricos originarios de suero dio como resultado una replicación y transcripción limitada durante unos pocos días (de Villiers y col., 2009). Los datos mostrados en la presente divulgación indican un papel como partículas interferentes defectuosas durante la replicación in vitro del genoma de longitud completa. La replicación del genoma de longitud completa se reduce mientras que simultáneamente aumentan los niveles de moléculas subvíricas (figura 19b). Se han mostrado moléculas subvíricas similares de manera ocasional e inconsistente en cultivos de los otros 9 aislados, pero no tuvieron influencia en la replicación del genoma de longitud completa. Esta diferencia asimismo resalta no solo la diversidad entre tipos de VTT, sino también que este fenómeno no es el resultado de un artefacto

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de la PCR. También se ha informado de moléculas interferentes defectuosas similares en Geminivirus, donde se acumulan durante una replicación inadecuada (Jeske, 2009).

El segundo grupo de moléculas subvíricas jVTT se desprendió durante la replicación de los aislados de VTT VTT- HD14b, VTT-HD14c, VTT-HD14a y VTT-HD14e, VTT-HD15a, VTT-HD16a, VTT-HD1a, VTT-HD23b, VTT-HD23d y VTT-HD23a, y se mantuvo constante en cuanto a su tamaño y composición durante la propagación, según se evidenció tras la clonación y secuenciación. Su producción en el caso de los últimos 4 aislados parecía estar influenciada por las condiciones de cultivo. De forma interesante, la molécula subvirica |jVTT-HD1 en el cultivo infectado por VTT-HD1a fue detectable en el cultivo infectado incluso después de la pérdida del genoma de longitud completa parental detectable (figura 19c). Se aislaron dos moléculas, jVTT-HD23.1 (409 bases) y jVTT-HD23.2 (642 bases) de los 3 cultivos infectados por VTT-HD23. jVTT-HD23.2 está formada por la molécula jVTT-HD23.1 más una duplicación de 306 nt de la molécula más pequeña. Las moléculas subvíricas (jVTT-HD14) que se aislaron de los 4 cultivos de VTT-HD14 fueron idénticas en cuanto a su secuencia y aparecieron de manera muy temprana tras la transfección inicial del genoma parental.

La producción de estas moléculas más pequeñas no parecía estar influenciada por la variación en la estructura del genoma entre aislados del mismo tipo de VTT. Todas las moléculas subvíricas estaban compuestas por partes del tipo de VTT parental, aunque las regiones genómicas implicadas, difirieron. Todas se amplificaron mediante PCR de larga distancia usando los mismos cebadores consecutivos que para la amplificación del genoma parental. Se ha observado previamente la replicación episómica de una molécula subvírica de VTT aislada de una muestra de suero a lo largo de un periodo de 23 días (de Villiers y col., 2009). Se ha demostrado la presencia de ARN subvírico multimérico durante este proceso. Las moléculas subvíricas comunicadas en la presente divulgación son capaces de replicarse de manera autónoma, pueden propagarse in vitro (figura 21) y parecen estar relacionadas con pequeñas estructuras proteicas observadas en estos cultivos por microscopía electrónica (figura 22). Se desconoce si se transmiten como parte de un virus TT infeccioso o si se inducen únicamente tras la infección por el virus parental y después se transmiten infectando de manera autónoma otras células. Se han asociado ADN subvíricos similares con el complejo de enfermedad por geminivirus (Stanley, 2004). Los satélites p potencian los fenotipos de síntomas en plantas. Comparten una red de interacciones proteicas con los geminivirus y dependen de ellos para la trans- replicación, la encapsidación y la transmisión del vector. La única secuencia compartida entre los satélites p y los geminivirus se encuentra en el origen de replicación corto (Nawaz-ul-Rehman y Fauquet, 2009; Patil y Fauquet, 2010; Paprotka y col., 2010). Esto contrasta con las moléculas subvíricas de VTT (jVTT) que comparten secuencias prácticamente idénticas con el genoma parental. El efecto citopático observado durante la propagación in vitro de las moléculas subvíricas de VTT de la presente invención aporta indicios acerca de su posible papel como componente inductor de enfermedad de algunos torque teno virus. Se han identificado motivos de firma de proteínas implicadas en enfermedades autoinmunitarias mediante análisis in silico de supuestas proteínas expresadas por estas moléculas subvíricas, así como de transcritos de virus aislados de los cultivos infectados por VTT. La observación de un ADN que codifica una proteína que contiene un motivo de firma de una proteína de mamífero asociada con el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria relacionada con la región altamente conservada de 71 pb del virus TT (HCR) es la base de la siguiente conclusión: Las fases abiertas de lectura reorganizadas de VTT y jVTT codifican epítopos antigénicos que imitan a secuencias de proteínas celulares que son atacadas en el cáncer o en enfermedades autoinmunitarias. Su secuencia compartida pero no idéntica debería provocar una respuesta inmunitaria contra estos epítopos también presentes en tejido normal.

Un nuevo papel para los virus TT en el cáncer humano y la autoinmunidad

La sorprendente observación de ADN de células hospedadoras asociado a una forma aparentemente de cadena sencilla de la HCR del virus TT, es la base para la siguiente conclusión: todavía no se ha demostrado que secuencias víricas de TT estén integradas en el ADN celular de cadena doble, continuando dentro de los cromosomas de la célula hospedadora. Por lo tanto, el hallazgo opuesto de ADN de la célula hospedadora, relacionado en un estado de cadena sencilla a la HCR de VTT, debería tener una importancia biológica. Los datos actuales indican su persistencia a largo plazo como episomas en líneas celulares de cáncer humano, lo que apunta a un papel de esa persistencia en la proliferación celular. Dos aspectos parecen requerir una consideración específica: un posible papel de estos recombinantes en el cáncer y en la autoinmunidad.

Una posibilidad es la integración aleatoria de secuencias de la célula hospedadora en episomas de VTT. Esto puede suceder después de un desplazamiento de la cadena en el curso de una replicación de ADN aberrante o después de una transcripción inversa del ARN celular. En el caso de una integración aleatoria, una mayor cantidad de recombinantes debe ser inocua e inofensiva para las células que son portadoras de estos recombinantes. Una propiedad que favorece el crecimiento de los transcritos de la HCR de VTT, así como la integración y la transcripción de los genes de la célula hospedadora que estimulan el crecimiento, su modificación en el proceso de integración o su alteración por la HCR de VTT, darán lugar, sin embargo, a consecuencias proliferativas. Estos episomas deben adquirir propiedades inmortalizantes y, bajo ciertas condiciones, propiedades transformadoras. En combinación con modificaciones adicionales del genoma de la célula hospedadora, pueden dirigir el crecimiento maligno. Este modo de acción revela una semejanza distante con la inserción de oncogenes celulares en genomas retrovirales.

El concepto de oncogén de VTT

Las consideraciones anteriores se resumen en la Fig. 4. Obviamente, la recombinación entre la región reguladora de VTT y los ácidos nucleicos celulares debe ser un proceso relativamente frecuente, ya que tales recombinantes se

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encuentran en la mayoría de las líneas celulares analizadas hasta el momento. También debe contribuir a la proliferación celular, de lo contrario la persistencia regular de tales moléculas, en parte durante décadas de proliferación continua, sería difícil de explicar. Se supone que este tipo de recombinación es un proceso aleatorio, que implica diferentes tipos de genes celulares. La función codificante de la HCR de VTT y/o la captación de genes que dirige la proliferación celular, o que bloquea la función de antagonistas de proliferación, o la inhibición de la diferenciación celular, deberían dar lugar a una acumulación de células que contienen estos tipos de recombinantes. Se prevé que esto, en combinación con eventos mutacionales o recombinantes adicionales de las células que albergan tales recombinantes de ácido nucleico de células hospedadoras de VTT, proporciona una ventaja selectiva para las células que son portadoras de este tipo de episomas. La presencia de estos últimos representaría un factor de riesgo principal para la conversión a cancerígeno. En este sentido, esas recombinaciones deben tener una importancia general para diferentes tipos de cánceres humanos, aunque se espera para tipos de cánceres individuales un cierto grado de especificidad para un conjunto limitado de genes.

Las implicaciones de este modelo son profundas. Alcanzan desde la prevención del cáncer, la detección temprana, hasta la terapia del cáncer. El papel importante de las infecciones con VTT y de la persistencia de HCR de VTT se destaca en la información disponible. La prevención de estas infecciones debe reducir el riesgo de desarrollar los recombinantes descritos. El diagnóstico de recombinantes específicos contribuirá probablemente a la evaluación del riesgo de cáncer. Se esperan profundas implicaciones en la terapia del cáncer: la HCR de VTT surge como el principal determinante de la persistencia y el mantenimiento de los episomas de una sola hebra. Puesto que esta región parece formar parte de un marco de lectura abierto, debería ser vulnerable frente a ARNs o ADNs pequeños de interferencia. Por lo tanto, ofrece una diana adecuada para futuras deliberaciones terapéuticas.

Otros dos aspectos merecen un examen: ciertos paralelos que parecen existir en la carcinogénesis retroviral en roedor y pollo, y el uso de sistemas de vectores basados en VTT de replicación autónoma para la terapia génica. La mutagénesis por inserción, la captación y la modificación de genes que estimulan el crecimiento celular que los convierte en oncogenes, se han analizado frecuentemente en sistemas animales. Esto, por lo tanto, todavía no se ha descrito para los cánceres humanos. ¿Los virus TT reemplazan este nicho en las células de humanos y otros primates? ¿Compite el VTT con éxito con infecciones por retrovirus para hacerse cargo de su papel en especies específicas? La persistencia episómica del ADN de cadena sencilla surge, sin embargo, como una notable diferencia en la carcinogénesis inducida por retrovirus.

Las moléculas de ADN subvirales con replicación autónoma de aproximadamente 400 bases, originarias de VTT, se han descrito antes. Es tentador especular que ellas o recombinantes específicos de células hospedadoras de VTT puedan representar sistemas de vectores óptimos para futuros enfoques en la terapia génica y para la construcción de cromosomas artificiales.

El concepto de autoinmunidad del ADN de células hospedadoras de VTT recombinantes

La existencia de recombinantes de ácido nucleico de células hospedadoras de VTT también permite un enfoque novedoso de aspectos de enfermedades autoinmunes y otras enfermedades crónicas (potencialmente, incluso afecciones como la arteriosclerosis y la enfermedad de Alzheimer). La modificación o la alteración de proteínas celulares pueden proceder de eventos por inserción de genes celulares en el ADN de una sola cadena o sobre las diferentes HCRs, ejercida por elementos de VTT (Fig. 5). Podrían proporcionar una explicación conveniente para las reacciones autoinmunes, incluso para las locales, al igual que en la esclerosis múltiple (MS, del inglés “multiple sclerosis”) o la enfermedad de Crohn. En los dos últimos casos, en particular, la reactivación de otras infecciones locales (potencialmente virus de tipo herpes) proporcionaría un estímulo para una amplificación local y la actividad génica de los respectivos recombinantes de ácido nucleico de células hospedadoras de VTT. En la MS, esto podría explicar episodios recurrentes de la progresión de la enfermedad. Un modelo del concepto de autoinmunidad se representa en la Figura 5.

Del mismo modo, se han identificado moléculas de virus TT reordenadas, de 719, 642, y 621 bases que se replican de manera autónoma después de la transfección de líneas celulares específicas. La composición de sus ADNs y el proceder de genotipos de VTT completos específicos, se muestra en la Figura 6. Aquí los reordenamientos dan como resultado nuevos marcos de lectura abiertos, en parte con epítopos relacionados con los de la diabetes juvenil y la artritis reumatoide.

Conclusión

Los modelos de la presente invención para un papel de los recombinantes de ácido nucleico de células hospedadoras de VTT, se basan en la demostración de las moléculas quiméricas de cadena sencilla entre la HCR de VTT y el ADN de la célula hospedadora y moléculas de VTT reordenadas con replicación autónoma de pesos moleculares sustancialmente reducidos. Ambos, el concepto de oncogén de VTT y el concepto de autoinmunidad de VTT, ofrecerán sin duda nuevos enfoques para la prevención, el diagnóstico y, en particular, para la terapia de estas afecciones y mejorarán el pronóstico de los pacientes respectivos.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el

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mismo significado que entienden comúnmente los expertos normales en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se puede emplear cualquier procedimiento y material, similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en la práctica o al someter a ensayo la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.

Por "motivo de firma de una proteína de mamífero que esté asociada con una enfermedad autoinmunitaria" se entiende una secuencia de aminoácidos que muestre una identidad sorprendente con n motivo que pueda encontrarse en cualquiera de las proteínas listadas en la tabla 1. Preferentemente, la longitud del motivo de firma es de al menos 5 aa, preferentemente al menos 10 aa, más preferentemente al menos 20 aa y lo más preferentemente, al menos 30 aa y/o el grado de identidad de este motivo de firma respecto de un motivo correspondiente en una proteína de mamífero es de al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %.

Por "anticuerpo" se entiende una proteína de la familia de las inmunoglobulinas que es capaz de combinarse, interactuar o de otro modo asociarse con un antígeno. El término "antígeno" se usa en el presente documento en su sentido más amplio para hacer referencia a una sustancia que es capaz de reaccionar y/o inducir una reacción inmunitaria. Típicamente, pero no necesariamente, los antígenos son extraños para el animal hospedador en el que producen reacciones inmunitarias.

Por "epítopo" se entiende la parte de una molécula antigénica contra la que se dirige una respuesta inmunitaria particular. Típicamente, en un animal, los antígenos presentan varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Por lo tanto, los términos "epítopo" y "determinante antigénico" significan una secuencia de aminoácidos que es inmunorreactiva. En general, un epítopo consiste en 4 y más normalmente 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos contiguos. Sin embargo, ha de quedar claro que un epítopo no necesita estar compuesto por una secuencia de aminoácidos contigua. La secuencia inmunorreactiva puede estar separada por un enlazador, que no es una parte funcional del epítopo. El enlazador no es necesariamente una secuencia de aminoácidos, sino que puede ser cualquier molécula que permita la formación del epítopo deseado.

La expresión "muestra biológica" tal y como se emplea en esta memoria se refiere a una muestra que se puede extraer, sin tratar, tratada, diluida o concentrada a partir de un animal. Muestra biológica se refiere a cualquier muestra biológica (tejido o fluido) que contiene un poli(ácido nucleico) de VTT de la invención y se refiere más particularmente a muestras de suero sanguíneo, muestras de plasma, muestras de biopsias, muestras de líquido cefalorraquídeo, etc..

Por "vehículo" se entiende cualquier sustancia de peso molecular normalmente alto a la que una sustancia no inmunogénica o poco inmunogénica (por ejemplo, un hapteno) está ligada de forma natural o artificial para mejo-rar su inmunogenicidad.

El término "diagnosis" se emplea en esta memoria en su sentido más amplio para incluir la detección de un antígeno reactivo con una molécula que se une a un antígeno de una subinmunoglobulina. También se incluye dentro de su alcance, el análisis de mecanismos de trastornos. De acuerdo con ello, el término "diagnosis" incluye el uso de anticuerpos monoclonales para fines de investigación, como herramientas para detectar y comprender los mecanismos asociados con una enfermedad o afección de interés. También incluye el uso diagnóstico del poli(ácido nucleico) de VTT de la invención para la detección de ARN homólogo o complementario transcrito a partir de tales moléculas. El término "inmunogenicidad" se emplea en esta memoria en su sentido más amplio para incluir la propiedad de provocar una respuesta inmune dentro de un organismo. La inmunogenicidad depende normalmente en parte del tamaño de la sustancia en cuestión, y en parte de en qué grado es no similar a las moléculas hospedadoras. Se considera generalmente que las proteínas altamente conservadas tienden a tener una inmunogenicidad más bien baja.

El término "paciente" se refiere a pacientes de origen humano o de otro mamífero, e incluye a cualquier individuo que se desea examinar o tratar usando los procedimientos divulgados en la presente memoria. Sin embargo, se entenderá que "paciente" no implica que los síntomas estén presentes. Mamíferos adecuados que están comprendidos dentro del alcance de la invención incluyen, pero no se limitan a, primates, animales de granja (por ejemplo, ovejas, vacas, caballos, burros, cerdos), animales de ensayo de laboratorio (por ejemplo, conejos, ratones, ratas, cobayas, hámsteres), animales de compañía (por ejemplo, gatos, perros) y animales silvestres cautivos (por ejemplo, zorros, ciervos, dingos).

Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende una carga sólida o líquida, diluyente o sustancia encapsulante que se puede utilizar de manera segura en cualquier tipo de administración.

La expresión "enfermedad o afección relacionada" se emplea en esta memoria para referirse a una enfermedad o una afección que se relaciona anatómica, fisiológica, patológica y/o sintomáticamente con una enfermedad o afección de referencia. Por ejemplo, las enfermedades o afecciones pueden estar relacionadas entre sí mediante una afección a localizaciones anatómicas similares (por ejemplo, que afectan al mismo órgano o parte del cuerpo), que afectan a diferentes órganos o partes del cuerpo con función fisiológica similar (por ejemplo, el esófago, el duodeno y el colon que se basan en el peristaltismo para mover los alimentos desde un extremo del canal alimentario a otro), por tener patologías similares o solapantes (por ejemplo, lesión o ruptura de un tejido, apoptosis, necrosis) o por tener síntomas similares o solapantes (es decir, respuesta alérgica, inflamación, linfocitosis). Por lo tanto, por ejemplo, un antígeno asociado con una colitis ulcerosa también se puede asociar con una perforación del colon, ya que esa enfermedad afecta al mismo órgano (es decir, el colon).

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El término "tratar" se emplea en esta memoria en su sentido más amplio para incluir tanto un tratamiento terapéutico como profiláctico (es decir, preventivo), diseñado para mejorar la enfermedad o la afección.

El término "episoma" se emplea en esta memoria para referirse a una porción de material genético que puede existir de forma independiente del cuerpo principal del material genético (cromosoma) algunas veces o de manera continua y replicarse de manera autónoma, mientras que otras veces es capaz de integrarse en el cromosoma. Ejemplos de episomas incluyen secuencias de inserción, transposones y el VTT de la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1: amplificación con PCR de un fragmento de 71 bases que contiene la región de VTT altamente conservada (HCR) en 4 líneas celulares diferentes, L1236 (línea de linfoma de Hodgkin negativa para EBV), HSB-2 (línea de leucemia linfoblástica aguda), KR e IGL (líneas celulares de melanoma) y ADN de placenta

Figura 2: ADN enrollado que permanece en el material sobrenadante de las células L1236 después de una precipitación y recogida del ADN de peso molecular elevado y digestión con ARNasa Dos bandas son visibles en la región entre las bandas de 4,3 y 6,6 bases.

Figura 3: PCR larga dirigida hacia afuera, usando cebadores de la región HCR de VTT de 71 bases en ADN de HSB-2

Dos bandas son visibles en regiones correspondientes a 4,5 a 7 kb. Además, las bandas surgen en la región correspondiente a 0,4 a 0,7 kb.

Figura 4: Representación esquemática del concepto de oncogén de VTT

La parte izquierda representa la organización genómica de los genomas de VTT de tipo silvestre. La parte derecha prevé la integración del ADN de la célula hospedadora en los plásmidos de cadena sencilla.

Figura 5: Representación esquemática del concepto de autoinmunidad del ADN de células hospedadoras de VTT. Los genes modificados de las células hospedadoras deben codificar epítopos antigénicos inmunorreactivos.

Figura 6: Amplificación con PCR de la región altamente conservada (HCR) de 71 bases a partir del ADN de 4 líneas celulares diferentes. Las flechas apuntan a los dos sitios con variaciones en las secuencias de nucleótidos.

Figura 7:

(A) El ADN con replicación partir de la cual se obtiene.

11A + B.

(B) El ADN con replicación partir de la cual se obtiene.

12A + B.

(C) El ADN con replicación partir de la cual se obtiene.

13A + B.

Figura 8: Tres secuencias ejemplares de ADN quimérico de VTT / célula hospedadora truncada procedentes de biopsias cerebrales de pacientes con esclerosis múltiple

(A) Secuencias celulares quiméricas obtenidas a partir del cromosoma 1 con algunas homologías con secuencias de priones y de tumor de Wilms y el extremo 3' del seudogén de leucemia linfoide mieloide 3 (MLL3). Secuencia de ADN humano del clon RP11-14N7 en el cromosoma 1. Contiene un extremo 3' de un seudogén de leucemia linfoide mieloide 3 o un linaje mixto (MLL3), un seudogén del receptor de siete hélices transmembranales, el extremo 5' de un gen novedoso.

(B) Secuencias celulares quiméricas obtenidas a partir del cromosoma 16. Homologías con el factor de transcripción 3 (TF 3C), firmas proteicas para receptores de quimiocinas y receptor de leucotrienos B4.

(C) Secuencias celulares quiméricas obtenidas a partir del cromosoma 10, secuencia truncada de la miosina, reactividad descrita en pacientes con esclerosis múltiple y aquellos con artritis reumatoide (la secuencia contiene ambos cebadores completos delantero y posterior).

Figura 9: Tres secuencias ejemplares de ADN quimérico de VTT / célula hospedadora truncada procedentes de líneas celulares obtenidas a partir de pacientes con la enfermedad de Hodgkin o leucemia

(A) Secuencias del cromosoma 1 con parte de transgelina 2, el gen IGSF9 para miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas 9, el gen SLAM9.

(B) Secuencias de proteínas traducidas con homología sustancial con los oncogenes v-myb (oncogén vírico de la mieloblastosis aviar), pero también con c-myb. Esta secuencia se amplificó con el cebador directo en ambos extremos.

autónoma de 719 bases de VTT (derecha) y la secuencia de VTT completa a . La composición de nucleótidos de ambas moléculas se encuentra en la Figura

autónoma de 621 bases de VTT (derecha) y la secuencia de ADN completa a . La composición de nucleótidos de ambas moléculas se encuentra en la Figura

autónoma de 642 bases de VTT (derecha) y la secuencia de ADN completa a . La composición de nucleótidos de ambas moléculas se encuentra en la Figura

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(C) Obtenida a partir del cromosoma 10. Homología elevada con la proteína "Deleted in malignant 1 Protein" (DMBT), un gen supresor tumoral identificado. Esta secuencia se amplificó con el cebador directo en ambos extremos.

Figura 10: Secuencias de cebadores utilizadas en las reacciones descritas en los Ejemplos, obtenidas a partir de la HCR de 71 bases.

Figura 11:

(A) Secuencia completa de VTT a partir de la cual se ha obtenido el ADN de 719 bases que se replica autónomamente.

(B) Secuencia completa del ADN de TTV de 719 bases que se replica autónomamente.

Figura 12:

(A) Secuencia completa de VTT (tth25) a partir de la cual se ha obtenido el ADN de 621 bases que se replica autónomamente.

(B) Secuencia completa del ADN de TTV de 621 bases que se replica autónomamente.

Figura 13:

(A) Secuencia completa de VTT (ttrh215) a partir de la cual se ha obtenido el ADN de 642 bases que se replica autónomamente.

(B) Secuencia completa del ADN de TTV de 642 bases que se replica autónomamente.

Figura 14: Marcos de lectura abierta (ORFs) que se encuentran dentro de la secuencia de nucleótidos de 71 nt zyb2.1.pep, zyb9.1.pep y zkb69.1.pep están empezando en el primer triplete, zyb2.3.pep, zyb9.3.pep, zkb5.3.pep y zkb69.3.pep están empezando a partir del tercer triplete. Esta región se transcribe activamente.

Figura 15: Digestión de ADN monocatenario mediante la nucleasa de judía de mungo (MBN). Los carriles 2 y 3 muestran que el ADN amplificado puede ser digerido mediante un pretratamiento con MBN. Los carriles 5 y 6 muestran que ADN plasmídico tratado previamente de la misma manera, no es digerido por MBN.

Figura 16: Presentación esquemática del ORF1 de una serie de aislados de VTT-HD El ORF1 se dividió en uno a varios ORF más pequeños o se fusionó a otros ORF.

Figura 17: Transcritos aislados durante la replicación in vitro de aislados de VTT-HD

El marcaje de transcritos individuales indica "aislado 5'- o 3'-race (s - monocatenario).no". Los números de aislado de VTT (1-12) indicados con el genoma esquemático respectivo y el número de VTT-HD. * - transcritos que se aislaron con más frecuencia.

Figura 18: Árbol filogenético que muestra las especies de VTT y aislados del género Alphatoquevirus. así como todos los tipos de VTT-HD, los tipos de VTT-HD propagados en cultivos celulares in vitro se encuentran rodeados con un círculo.

Figura 19: Propagación de genomas de VTT-HD de longitud completa en células 293TT Ejemplos de propagación de

(A) VTT-HD14b, VTT-HD14c, VTT-HD14a y VTT-HD14e (carriles 1-4), VTT-HD15a (carril 5) y VTT-HD16a (carril 16) tras la amplificación por PCR anidada;

(B) VTT-HD20a (carril 7), VTT-HD3a (carril 8), VTT-HD1a (carril 9), VTT-HD23b, VTT-HD23d y VTT-HD23a (carriles 10-12) tras una sola amplificación por PCR. a, b y c - ejemplos de propagaciones, aproximadamente 7 días después de la infección. b-1, b-2 y b-3 indican la variabilidad observada cuando se propaga el mismo pase.

(C) Muestreo diario de cultivos de CTT-HD14e (PCR anidada) y VTT-HD23b. M - marcador de tamaño del ADN; * - indica moléculas subvíricas de diferentes cultivos.

Figura 20: Presentación esquemática de VTT-HD de longitud completa con sus respectivas moléculas de uVTT- HD Los números indican los ORF en el genoma del ADN.

Figura 21: Propagación independiente de uVTT-HD uVTT-HD15 se replicó con más fuerza tras la transfección inicial, pero se redujo con el paso del tiempo (*-indica amplificación por PCR anidada). uVTT-HD1 y uVTT- HD23.2 se replicaron de manera creciente tras las etapas iniciales de propagación. Moléculas de uVTT-HD23.2 formadas durante la replicación de uVTT-HD23.1.

Figura 22:

(A) Partículas viroides parcialmente purificadas. Las partículas se lisaron y el contenido se separó en gel de agarosa.

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(B) Partículas de mVTT parcialmente purificadas. Las partículas se lisaron y el contenido de ADN se separó en gel de agarosa.

3-VTT-HD14a, 5 - pVTT-14, 6 - VTT-HD16a, 8 - VTT-HD3a, 9 - pVTT-HD1, 12 - VTT-HD23a, 12a - pVTT- HD12.1, 12b - pVTT-HD12.2

En el presente documento se divulga un poli(ácido nucleico) de virus TT que comprende (o consiste en)

(a) una secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 6;

(b) una secuencia de nucleótidos que muestra al menos un 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o al menos un 98 % de identidad respecto de una secuencia de nucleótidos de (a) y es capaz de replicarse de manera autónoma;

(c) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos zyb2.1.pep, zyb9.1.pep, zkb69.1.pep, zyb2.3.pep, zyb9.3.pep, zkb5.3.pep y zkb69.3.pep mostradas en la figura 14 y dicho poli(ácido nucleico) de virus TT es capaz de replicarse de manera autónoma tras su transfección en células 293TT,

en la que dicha secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c) o (d) está unida a un poli(ácido nucleico) que codifica una proteína que contiene un motivo de firma de una proteína que está asociada con el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria mediante un enlace fosfodiéster.

La proteína es una proteína de mamífero. Se prefiere particularmente que la proteína de mamífero sea una proteína humana. También se divulgan en el presente documento fragmentos de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente que son capaces de replicarse de manera autónoma. El experto en la técnica puede obtener fragmentos que sigan teniendo la actividad biológica de la molécula de longitud completa sin experimentación innecesaria.

El experto en la técnica puede determinar fácilmente qué secuencias de ácidos nucleicos están relacionadas con la secuencia de nucleótidos de la Figura 6 o qué fragmentos todavía son capaces de replicarse de forma autónoma mediante el uso de ensayos convencionales o los ensayos descritos en los ejemplos, a continuación.

El término "poli(ácido nucleico)" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla o de cadena doble. Un poli(ácido nucleico) puede consistir en desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados, o se puede haber adaptado para fines terapéuticos. Preferentemente, el poli(ácido nucleico) del virus TT es un ADN de cadena sencilla.

Preferentemente, el poli(ácido nucleico) del virus TT de la invención está presente en forma de un episoma extracromosómico.

La proteína de mamífero asociada con el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria o el alérgeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria es una proteína mostrada en la tabla 1.

Tabla 1

(A) Ejemplos de motivos de firma identificados en supuestas proteínas resultantes de transcritos y genomas

de longitud completa de VTT-HD

Protamina 1+2

Receptor B4 de leucotrienos

AIRE (Regulador autoinmunitario)

Gliadina Neuropéptido Y

CHLAMIDIAOM3 - Chlamidia mol. mimicry - enfermedad cardíaca Rica en arginina (re. Sospedra y col., 2005 - mimicry molecular en MS) Opsina Ciclina cinasa

Proxisoma (diabetes, receptor de esteroides)

Vasopresina

Factor BDNF (factor neurotrófico derivado de cerebro) prepro-orexina

Repetición de hélice de colágeno Receptor GIP Neurotensina Prion

antígeno CD36 (deficiencia de resistencia a insulina, arterioesclerosis) Calcitonina

Prostanoide

Receptor de GABA (principal neurotransmisor inhibidor en el cerebro)

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Arginina desaminasa

Opioide, receptor de factor de crecimiento

Galanina

Plexina/semaforina

NURR (receptor de hormona nuclear huérfano de rata) Factor neurotrófico derivado de cerebro (BDN) Colagenasa + endostatina Aerolisina

Proteolípido de mielina Serotonina

Receptor muscarínico

Receptor de hormona concentradora de melanina

Autoantígeno p27 de síndrome de Sjogren/esclerodermia

Firma de repetición de tipo plexina/semaforina/integrina

Proteína específica masculina

Gastrina

Colágeno

Colagenasa metaloproteasa

(B) alineamientos de secuencias de aa

DomainSweep emplea una serie de procedimientos de búsqueda para efectuar búsquedas en las siguientes bases de datos de familias de proteínas:

BLOCKS

PFAMA

PRINTS

PRODOM

PROSITE

SMART

SUPERFAMILY

TIGRFAMS

OPSINA

gbCsCt38.4ikn.2.154

OPSINRH3RH4_3: dominio 1 de 1, de 46 a 56: puntuación 8,4, E = 5,1

*->iynsFhrGfAlg<- * y sFhrG+A

gbCsCt3S.4 46 -YESFHRGHAAF 56

zc55s.B4.l8dek.281

OPSINRH3RH4_3: dominio 1 de 1, de 19 a 29: puntuación 8,4, E = 5,1

*->iynsFhrGf Alg<-‘‘ y sFhrG+A

zc55s.B4.1 19 -YESFHRGHAAF 29

rheu.cd.215rev.1.736

OPSINRH3RH4_7: dominio 1 de 1, de 665 a 683: puntuación 7,8, E = 5,3

1 ->RlELqKRlRWLe lr.£Kave<-*

Rt +q-f-RlPW+- + + +

rheu.Cd.21 665 RFGVQQRLPWVHSSQETQS 683

OPSINRH3RH4_7: dominio 1 de 1, de 23 a 41: puntuación 8,2, E = 4,4

* ->RIELqKRl P WLe 1 r.E Kave<- *

R+ +q+Rl?M+ + + +

zc3rll.B4. 23 RFRVQQRLPWVHSSQETQS 41

gc; OPSINRH3RH4

gx; PR00577

gn; COMPUESTO(7)

ga; ll-SEP-1996; ACTUALIZADO 07-JUN-1999 gt; Firma de Opsina RH3/RH4

gp; PRINTS; PR00237 GPCRRHODOPSN; PR00247 GPCRCAMP; PR00248 GPCRMGR gp; PRINTS; PR00249 GPCRSECRETIN; PR00250 GPCRSTE2; PR00899 GPCRSTE3 gp; PRINTS; PR00251 BACTRLOPSIN

gp; PRINTS; PR00238 OPSIN; PR00574 OPSINBLUE; PR00575 OPSINREDGRN

gp; PRINTS;PR00576 OPSINRH1RH2; PR00578 OPSINLTRLEYE; PR01244 PEROPSIN

gp; PRINTS; PR00666 PINOPSIN; PR00579 RHODOPSIN; PR00239 RHODOPSNTAIL

gp; PRINTS; PR00667 RPERETINALR

gp; INTERPRO; IPR000856

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gd; Las opsinas, las moléculas absorbedoras de luz que median la visión [1,2], son

gd; proteínas integrales de membrana que pertenecen a una superfamilia de receptores gd; acoplados a proteína G (GPCR). Los ligandos activadores de los diferentes miembros gd; de la superfamilia varían ampliamente en cuanto a su estructura y carácter, aunque gd; las proteínas parecen tener fielmente conservado un armazón estructural básico, que gd; se cree que consiste en 7 hélices transmembrana (TM). Aunque las secuencias de gd; estas proteínas son muy diversas, reflejando hasta cierto punto esta gran variedad de

gd; ligandos activadores, sin embargo, se han identificado motivos en las regiones TM que

gd; son característicos de prácticamente toda la superfamilia [3,4]. gd; Entre las excepciones se encuentran los receptores olfatorios, que se agrupan en una

gd; superfamilia, que carece de coincidencias significativas con los dominios 2, 4 y 6. De

gd; forma interesante, las opsinas también parecen emerger como crecientemente gd; atípicas de la superfamilia, agrupándose con más fuerza, en los análisis filogenéticos, gd; con los receptores olfatorios [4].

gd; Los pigmentos visuales comprenden una apoproteína (opsina), unida covalentemente gd; al cromóforo cis-terminal 11. El enlace covalente es en forma de una base de Schiff

gd; protonada entre el resto retinal y uno de lisina ubicado en el dominio 7 TM. La visión

gd; se efectúa mediante la absorción de un fotón por el cromóforo, que se isomeriza en la gd; forma todo trans, que promueve un cambio conformacional en la proteína. gd; A diferencia de la rodopsina de vertebrados, que se encuentra en los bastones, los

gd; fotorreceptores de insectos se encuentran en los omatidios, que comprende los ojos

gd; compuestos. Cada ojo de drosófila tiene 800 omatidios, cada uno de los cuales gd; contiene 8 células fotorreceptoras (denominadas R1-R8): R1-R6 son células externas, gd; mientras que R7 y R8 son células internas. Las opsinas RH3 y RH4 son sensibles a la gd; luz UV [5-7]. OPSINRH3RH4 es una huella de 7 elementos que proporciona una firma gd; para las opsinas RH3 y RH4. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 5

gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de secciones conservadas dentro de

gd; cada bucle o las regiones N y C-terminales, centrándose en aquellas áreas del

gd; alineamiento que caracterizan a las opsinas RH3/RH4 pero que las distinguen del

5

gd;

c;

il,

it,

id

bb

fe

fl

ft;

fd

resto de la superfamilia similar a rodopsina - los motivos 1 y 2 se encuentran en el extremo N-terminal; el motivo 3 abarca el primer bucle externo; el motivo 4 se encuentra en el segundo bucle externo; el motivo 5 abarca la mitad C-terminal del dominio 5 TM; el motivo 6 se encuentra en el tercer bucle citoplásmico; y el motivo 7 se encuentra en el extremo C-terminal. Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola interacción en OWL28.1, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de inicio.

OPSINRH3RH43

12

Motivo III de opsina RH3/RH4 -1 ; • IFNSFHRGFAIY ; ■ IYNSFHRGFALG ; • IYNSFHRGFALG j : IYNSFHQGYALG ; IYNSFHQGYALG

OFS4_: _DROME 109 52

OPS4~: 'drops 112 54

OPS4’: 'drovi 115 54

OPS3‘: DROME 115 54

OPS3’: 'drops 114 54

; : OPSINRH3RH43 J : 12

Motivo III de opsina RH3/RH4 - 2 ; ■ IYNSFHRGFALG ; : IYNSFHQGYALG ; ■ IYNSFHRGFALG ; : IYNSFHQGYALG ; ■ IFNSFHRGFAIY j : IYNSFHTGFATG j IYNSFNTGFATG ; : IYNSFNTGFALG

OPS4_DROVI: 115 54

0FS3_DR0ME: 115 54

OPS4 DROPS: 112 54

OPS3_DROPS: 114 54

OPS4 DROME: 109 52

061474: 105 54

061473: 106 54

OFSV APIME: 105 54

fe

fl

ft,

fd

; r OFSINRH3RH47 ; : 19

Motivo Vil de opsina RH3/RH4 - 2 j ■ RMELQKRCPWLAIDEKAPE ; ■ RMELQKRCPWLALNEKAPE ; : RMELQKRCPWLGVNEKSGE ; ■ RME LQKRCPWLAIS EKAPE ; : RLELQKRCPWLGVNEKSGE ; • RLELQKRLPWLELQEKPVA j : RLELQKRLPWLELQEKPIE ; ■ RLELQKRLPWLELQEKPIS

imagen1

OFS4 DROVI: 346 62

OPS3 DROME: 346 62

OPS4_DROPS: 343 62

OPS3 DROPS: 345 62

OPS4 DROME: 342 62

061474: 336 62

061473: 337 62

OPSV APIME: 336 62

RICA EN ARG

PERFILES DE PROSITE

RICA EN ARG Región rica en arginina

NLS BP Lo nuclear bipartito

PFSCAN usando la secuencia gbCsCt38.2ikn.1.726 y perfil(es) PRFDIR:prosite.prf,

Parámetros de línea de comandos usados:

-CUTLEV=-1

Puntuación: Raw seq-f seq-t prf-f prf-t Nombre Descripción

30,1607: 170 4 - 67 1- 2 RICA EN ARG Región rica en arginina

4,0000: 4 10 - 26 1- 17 NLS BP Lo nuclear bipartito

4,0000: 4 32 - 46 1- 17 NLS_BP Lo nuclear bipartito

5,0000: 5 52 - 66 1- 17 NLS BP Lo nuclear bipartito

PFSCAN usando la secuencia gbDhD143.4rp.1.765

y perfil(es) PRFDIR:prosite.prf, 15 de octubre de 2010 15:31 Parámetros de línea de comandos usados:

-CUTLEV=-1

Puntuación: Raw seq-f seq-t prf-f prf-t Nombre Descripción

33,0880: 187 9 - - 73 1 - 2 ARG RICH Región rica en arginina

PFSCAN usando la secuencia zpr5.B4.12dk.209 Parámetros de línea de comandos usados: -CUTLEV=-1

: Puntuación Raw seq-f seq-t 30,1607 170 4 - 67 prf-f 1 - prf-t 2 Nombre RICA EN ARG Descripción Región rica en arginina

5: PFSCAN usando la secuencia zc55s.B4.18dek.117 y perfil(es) PRFDIR:prosite.prf, Parámetros de línea de comandos usados: -CUTLEV=-1

: Puntuación Raw seq-f seq-t 18,7959 104 4 - 85 prf-f 1 - prf-t 2 Nombre RICA EN ARG Descripción Región rica en arginina

10: PFSCAN usando la secuencia zc37.B9.2de.p1 Parámetros de línea de comandos usados: -CUTLEV=-1

: Puntuación Raw seq-f seq-t 24,3061 136 7 - 86 prf-f 1 - prf-t 2 Nombre ARG_RICH Descripción Región rica en arginina

15: PROTAMINA 1 Y PROTAMINA 2 BLKPROB Versión 5/21/00.1

Base de datos=/gcg/husar/gcgdata/gcgblimps/blocksplus.dat Búsqueda=gbCsCt38.2ikn.1.726 Longitud: Tamaño=726 aminoácidos

Familia

IPB000221 Protamina P1

HSP1_CHICK|P15340 1 IPB000492 Protamina 2, PRM2

HSP2_PIG|P19757 55

Valor de E

Hebra Bloques combinado 1 1 de 1 1.3e-09

ARYRRSRTRSRSPRSRRRRRRSGRRRSPRRRRRY

1 1 de 2 2.2e-09

HTRRRRSCRRRRRRACRHRRHRRGCRR1RRRRRCR

Búsqueda=gbDhDi43.4xp. 1,765

Familia

IPB000221 Protamina P1 HSP1 DIDMA|P35305 1 IPB000492 Protamina 2, HSP2_CALJA|Q28337 69

Longitud: 7 65

Valor de E

Hebra Bloques combinado

1 1 de 1 1.2e-ll

ARYRRRSRSRSRSRYGRRRRRSRSRRRRSRRRRR

PRM2 1 1 de 2 2.8e-10

RRRSRSCRRRRRRSCRYRRRPRRGCRSRRRRRCRR

Búsqueda=rheu.ef.242.746

Familia

IPB000492 Protamina 2, PRM2

HSP2 CALJA|Q28337 69 IPB000221 Protamina P1

HSPl_DIDMA|P35305 1

Longitud: 746

Valor de E

Hebra Bloques

1 1 de 2

RRRSRSCRRRRRRSCRYRRRPRRGCRSRRRRRCRR

1 1 de 1

ARYRRRSRSRSRSRYGRRRRRSRSRRRRSRRRRR

combinado

1.4e-08

1,5e-07

Búsqueda=uro705rev.1 a. 74

IPB000221 Protamina P1

HSP1_DIDMA|P35305 1 IPB000492 Protamina 2, PRM2

HSP2_CALJA|Q28337 69

Búsqueda=zpr5. B4.12dk IPB000221 Protamina P1

HSP1 CHICK|P15340 1

IPB0004 92 Protamina 2, PRM2

HSP2 PIG|P19757 55

Longitud: 74

1/1 bloques Valor de E combinado= 2,8e-12

ARYRRRSRSRSRSRYGRRRRRSRSRRRRSRRRRR 1/2 bloques Valor de E combinado= 2,3e-10

RRRSRSCRRRRRRSCRYRRRPRRGCRSRRRRRCRR

Longitud: 209

1 1 de 1 4.1e-10

ARYRRSRTRSRSPRSRRRRRRSGRRRSPRRRRRY

1 1 de 2 7.1e-10

HTRRRRSCRRRRRRACRHRRHRRGCRRIRRRRRCR

5

10

Búsqueda=zc55s.B4.18dek.117 Longitud: 117

Familia

IPB000492 Protamina 2,

Q91V94|Q91V94_MESAU63 IPB000221 Protamina P1 HSP1_MOUSE|P02319 1

Búsqueda=zc37.B9.2de.p1

Familia

IPB000492 Protamina 2,

HSP2 ERYPA|Q9GKM0 69 IPB000221 Protamina P1 HSPl_CAVPO|P35304 1

Secuencias presentadas como ejemplos:

Genomas de longitud completa (VTT) de:

gbCsCt38.2ikn.1.726 (VTT-HD15, ORF1=726aa) gbDhDi43.4rp.1.765 (VTT-HD16, ORF1=765aa) rheu.ef.242.746 (VTT-HD19, ORF1=746aa) uro705rev.1a.74 (VTT-HD18, ORF1a=74aa)

Genoma de longitud completa (pVTT) de:

zpr5.B4.12dk (pVTT-HD15. ORF=208aa)

Transcritos (de -):

zc55s.B4.18dek.117 (VTT-HD15, ORF=117aa) zc37.B9.2de.p1 (VTT-HD20, ORF=109aa)

GALANINA:

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Hebra

Valor de E combinado

imagen2

Hebra Bloques

PRM2 1 1 de 2

RRRHRSCRRRRRRSCRHRRRHRRGCRTRRRRCRRY

1 1 de 1

ARYRCCRSPSRSRCRRRRRRFYRRRRRCHRRRRR

Valor de E combinado 2.8e-05

0,0001

Archivo HMM: smart.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi33.33ik.1c.417

galanina: dominio 1 de 1, de 264 a 367: puntuación -22,9, E = 6,5

*->atlGLgsPvkekrGWtLnsAGYLLGPHAidnHRsFsdKhGLtgKREL t L P + r + s LCP ■+ + +4-G+ + KR +

gbDhDi33.3 264 STHELPDPDRHPRMLQV-SDPTKLGPKT—AFHKWDWRRGMLSKRSI 307

e..pEdearpGs fdrplses.nivrtiiefLsfLhLkeaGaLdrLpglPa ++ Ed ++-i-pl+ +tn L -i- L+ L +

gbDhDÍ33.3 308 KrvQEDSTDDEYVAGPLPRKrNKFDTRVQGPPTPEKESYTLLQALQESGQ 357

aasseDlers<-* ssaD a++

gbDhD133.3 15B ESSSEDGEQA 367 gbDfDg33.48ikn.1b.179

galanina: dominio 1 de 1, de 26 a 129: puntuación -21,0, E = 3,9

gbDfDg33.4

*->atIGLgs Pvke krGWtLnsAGYLLGPHAidnHRsFsdKhGLtgKREL t L P + r + s LCP + ++ +4-C-+ -+KR +

26 STHELFDPDRHPFtMLQV-SDPT^LGPKTV--FHKMDMRRC-MLÍ:KRS3 69

gbDfDg33,4

e..pEdearpGsfdrplses.nivrtiiefLsfLhLkeaGaLdrLpglFa ++ Ed H + Hpli- ++n t + L+ L +

70 KrvQEDS TDDEYVAGPLPRKr NKFDTRVQGPPTPEKESYEUjQALQESGC 119

gbDfDg33.4

aasseDl ers<-

e++

120 ESSSEDQECA

129

Archivo HMM: smart.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi33.32ikn.1.648

galanina: dominio 1 de 1, de 495 a 598: puntuación -24,5, E = 9,7

*->atID LgsPvkekrGWt LnsAGYLLGPHftidnHRsFsdKbGLtgKREL t L P + r +5 LGP t ++ + -HG+ +KR +

gbDhDi33.3 49b 5TH EL P D P DRHPRMLQV- S DPT KLGPKT V— FHKWDWRRGHLSKRSI 338

gbDhDi3o, 3

, epEdearpGs. fdrplseS . nivrtiieCLsELhLkeaGaLdrT.pgl Pa ++ + G +++pl+ ++n L + L+ L t

539 kRVQGDS T DGE yVAG F L P RKr NKFDTRVQG F FTPEBCESYTLLQALQESGQ 588

gbDhDi3j.3

aasseDlers-í J üatfD e++ 589 EESSEDQEQñ

598

gbDfDg33.45ikn.1b.210

galanina: dominio 1 de 1, de 57 a 160: puntuación -23,1, E = 6,8

* - > a t lGLgs Pvke k rGWt Ln s AiGY LLG PHAidnHRs EsdlítiGL t gKREL t L P + r + S t£P + ++ +G4- -kER +

El STHELPDP DRH PRMLQV-$DPT KLG PKTV — FHKWDWGRGMLSKRS1 100

gbDtDg33,a

gbDLDgüi.a

«, , pEdoaEpGsfd^pl&es . nii.vrtii«fLsfLhLkeaGaLdrLpglPa ++ Ed t-n-pl+ -t+n L + L+ L f

101 K rvQElJ SL'D L YVAtl PLFRKrH KF D'L'RVQG P PT PE K. E5 Y TLLQMjQEüCrj 150

qb D £ Dq 3 3. a

aas^eUlozESí- sseD e++ 1EL ESSSEDQEQA

160

FIRMAS DE REPETICIÓN DE TIPO PLEXINA/SEMAFORINA/INTEGRINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 ----------------------------------------------------------------------

Archivo HMM: smart.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi33.32ikn.1.648

psinew7: dominio 1 de 1, de 341 a 394: puntuación -16,8, E = 3,9

*->rCsgyigv, . * (.flCftf-Dl lardpyg.............CgWCsaagrCtrg.ecC

C& + + + +t+ s C+l + 4- p + C W + +CL ++ + +

gbTíhrji 33-3 341 WCSEKSSkldTTKSKCILRDFFLWamygyCDWW-----KCTGVíSAW 364

derrgn rqnvja sgpooqCp^ - *

+ +r+ + Cp

gílDh[)133.3 335 TDMRI---AT----TCP

10 Interpro: IPR003659 Plexina/semaforina/integrina

: Pasar el ratón para mostrar la definición de elementos. Hacer clic para mostrar datos originales

: 1 100 200 300 400 500 600

SN00423

10

15

20

25

IPR003659; IPR016201; (Similar a plexina) coincidencias 1383 proteínas NombreCorto Plexina-lilce NombreCompleto firmas de repetición de tipo plexina/semaforina/integrina SMART: SM00423 PSI ▼ Children IPR016201 Pliegue de tipo plexina (coincidencias 619 proteínas) AEncontrada en IPR012013 subunidad beta-4 de integrina (coincidencias 9 proteínas)

IPR020707 Tirosina-proteína cinasa, receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (coincidencias 82 proteínas)

IPR020739 Tirosina-proteína cinasa, receptor MSP (coincidencias 18 proteínas) Resumen Este es un dominio que se ha encontrado en plexinas, semaforinas e integrinas. La plexina está implicada en el desarrollo de tejidos neurales y epiteliales; las semaforinas inducen el colapso y la parálisis de los conos de crecimiento neuronal; y las integrinas pueden mediar las funciones adhesivas o migratorias de las células epiteliales. Ejemplos

Archivo HMM: smart.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi33.31ikn.1.712

psinew7: dominio 1 de 1, de 341 a 378: puntuación -14,4, E = 2,3

*->rCsqygv,..tsCseCllardpygCgWCssegrCtrgerCderrgsr Cs +++ +t+ s C+1++ p W +++++Cd

gbDhDi33.3 341 WCSEKSSkldTTKSKCILRDFP---LWA--------------MAYGHCD-372

qnws 3gp 3 s qCp<-* ví+ +C+

gbDhDi33.3 373 —WVV---KCT 378

GASTRINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi33.32ikn.1.648

GASTRINR_8: dominio 1 de 1, de 541 a 559:

*-> vaGE Ds DGCyvq..LPRsRC-* v G+ DG yv ++LPR R

gbDhDÍ33.3 541 VQGDSTDGEYVAgpLPRKR 559

gc; GASTRINR

gx; PRO0527 gn; COMPUESTO(9)

qa; 03-JUN-1996; ACTUALIZADO 10-JUN-1999

gt; Firma de receptor de gastrina

gp; PRINTS; PRO1822 CCYSTOKININR; PR00524 CCYSTOKNINAR

gp; INTERPRO; IPR000314

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

Las gastrinas y las colecistocininas (CCK) son péptidos de origen natural que comparten una gd; secuencia C-terminal común, GWMDF; toda la actividad biológica reside en esta región gd; [6]. El principal papel fisiológico de la gastrina es estimular la secreción de ácido en el gd; estómago; también tiene efectos tróficos en la mucosa gástrica [6]. La gastrina se gd; produce a partir de un solo transcrito génico y se encuentra predominantemente en el gd; estómago e intestino, pero también en los nervios vagales. El receptor CCKB tiene una gd; amplia distribución en el SNC y se ha relacionado con la patogénesis de los ataques de gd; pánico-ansiedad causados por péptidos relacionados con CCK [6]. Tiene una distribución gd; más limitada en la periferia, donde se encuentra en el músculo liso y las glándulas gd; secretorias.

gd; GASTRINR es una huella de 9 elementos que proporciona una firma para los receptores gd; de gastrina (CCKB). La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 5 secuencias: los gd; motivos se representaron a partir de secciones conservadas dentro de cada bucle o las gd; regiones N y C-terminales, centrándose en aquellas áreas del alineamiento que gd; caracterizan a los receptores de gastrina, pero que los distinguen del resto de la gd; superfamilia similar a rodopsina - los motivos 1 y 2 se encuentran en el extremo N- gd; terminal; el motivo 3 abarca el primer bucle externo; el motivo 4 abarca el segundo bucle gd; citoplásmico; los motivos 5 y 6 abarcan el segundo bucle externo; los motivos 7 y 8 gd; abarcan el tercer bucle citoplásmico; y el motivo 9 se encuentra en el extremo C-terminal. gd; Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones en OWL28.0, punto en gd; el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 7 secuencias. También se gd; encontraron varias coincidencias parciales, todas las cuales eran fragmentos de gastrina gd; o miembros de la familia de receptor de tipo A de colecistocinina.

fc; GASTRINR8 fl; 17

ft; Motivo VIII de receptor de gastrina - 2 fd; LAGEDGDGCYVQLPRSR fd; VAGEONDGCYVQLPRSR fd; LAGEDGDGCYVQl.PRSR fd; AVGEDSDGCYVQLPRSR fd; LAGEDGDGCYVQLPRSR fd; LTGEDSDGCYVQLPRSR fd; VAGEDSDGCCVQLPRSR

GASRRABIT: 288 31

GASR_PRANA: 289 30

GñSR BOVIN: 290 31

GASRHUMAN: 285 26

GA3R CANFA: 289 29

GASR_MOUSE: 291 32

GASR RAT: 290 31

COLAGENASA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 ----------------------------------------------------------------------------------------------------

Archivo HMM: pfam.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.736

Peptidase_M9: dominio 1 de 1, de 125 a 412: puntuación -152,5, E = 7,5

rheu.ef.24

rheu.ef.2 4 rheu.ef.241.736

Peptidase_M9: dominio 1 de 1, de 125 a 412: puntuación -152,5, E = 7,5

*->msrlaelyllGdsiKgrhDnlWLaaaenlsYyApegkselgidicqa 1 ly r n W + +e 1+ g + +

125 --TLRILYDEF---TRFMNFWTVSNEDLDLCRYVGCKLIF--FKHP 163

klclaakVlPy..lyeCsgpaa.irsqdltdgqaAsaCdilrnkekdfhq + + + ++++ +++aa+i 4 ++ +1 h+

164 TVDFIVQINTQppFLDTHLTAAsIHPGIMMLSKRRILIPSLKTRPSRKHR 213

vkyt.Gkt pvaDDgntrvevgvfvseedykrYSafaSKEVkaqFgrvtdNG v+ V ++ d ( tS fa t +

214 VVVR--------VGAPRLFQDKWYPQSDLCDTVIpLSIFA-----------------------TACD 248

GmYLEGNPsdagNqvrF..iAYEeaklnadlsigKlehEYthY...LDgR

+Y G P + v+F+ + + k + + s N+e + thY+++L +

249 LQYPFGSPLTENPCVNFqiLGPHYKKHL-SISSTNDETNKTHYesnLFNK 257

fdtYGtFsrnleeshivWWeEGfAEYvhYkqgGvPyqaApeligqgskly +Y tF ++ + e G+ v v + + + ++g +

298 TELYNTFQTIAQ----LKETGRTSGVNPNWTSVQNTTPLNQAGNN---A 339

IsdvftTTeeGyAElFAGShDtdRIyRWGYLA.vrf.....mletnHnr

++ + t++ G + di ++++rf++ -i- + +1 n +

34 0 QNSRDTWY--K----GNTYNDNTSKLAEITrQRFksatisALP-NYPT 380

dvesllvhsRyGnsfaf yaylvkllgymYrmefgiw-c-*

+ +4-1 ++ +G y+ ++ +g Y g+ +

331 IMSTDLYEYHSG---IYSSIFLSAGRSYFETTGAY 412

rheu,ef.24

rheu.ef,24

rheu.ef.2 4

rheu.ef.24

*->msrlaelyllGdsiKgrhDnlWLaaaemlsYyApegkselgidicqa i ly r n W + +e 1+ g+ +

125 —TLRILYDEF----TRFMNFWTVSNEDLDLCRYVGCKLI F—FKHP 163

klelaakVIPy,.lyeCsgpaa.irsqdltdgqañsaCdilrnkekdfhq + + + ++++ +++aa+i + ++ +1 h+

164 TVDFIVQINTQppFLDTHLTñAsIH PGIMMT.SKRRT LTPSLKTRPSRKHR 213

vkytGktFVaDDgntrveVgvfvseedykrYSafaSKEVkaqFgrvtdNG v+ v ++ + d + +s fa t +

214 VVVR---VGAPRLFQDKWYPQSDLCDTVLLSIFA-----------TACD 248

GmYLEGNPsdagNqvrF.,iAYEeaklnadlsigNlehEYthY...LDgR +Y G P + v+F+ + + k ++s N+e + thY+++L +

249 LQYPFGSPLTENPCVNFqiLGPHYKKHL-SISSTNDETNKTHYesnLFNK 291

fdtYGtFsrnleeshivWWeEGfAEYvhYkqgGvPyqaApeligqgskly +Y tF ++ + e G+ v v ++ + ++g +

298 TELYNTFQTIAQ----LKETGRTSGVNPNWTSVQNTTPLNQAGNN---A 339

IsdvftTTeeGyAElFAGShDtdRIyRWGYLA.vrf......mletnHnr

+ + + t++ G + d I -t t- + 4rf + + + ++1 n +

340 QNSRDTWY--K-----GNTYNDNISKLAEITrQRFksatisALP-NYPT 3B0

dvesllvhsRyGnsfafyaylvkllgymYnnefgiw<-*

+ ++1 ++ +g y+ ++ +g Y g++

381 IMSTDLYEYHSG---IYSSIFLSAGRSYFETTGAY 412

#=GF ID: Peptidasa M9

#=GF AC: PF01752.9

#=GF DE: Colagenasa

#=GF AU: Bateman A

#=GF SE: SWISS-PROT

#=GF RM: 7582017

#=GF RT: Molecular analysis of an extracellular protease gene from Vibrio

#=GF RT: parahaemolyticus.

#=GF RA: Lee CY, Su SC, Liaw RB;

#=GF RL: Microbiology 1995;141:2569-2576.

#=GF RM: 8282691

#=GF RT: Purification and characterization of Clostridium perfringens

#=GF RT: 120-kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the

#=GF RT: corresponding gene.

#=GF RA: Matsushita O, Yoshihara K, Katayama S, Minami J, Okabe A;

#=GF RL: J Bacteriol 1994;176:149-156.

#=GF DR: INTERPRO; IPR013510;

#=GF DR: MEROPS; M9;

#=GF CC: Esta familia de enzimas degradan los colágenos.

5

10

REPETICION DE HELICE DE COLAGENO

BLKPROB Versión 5/21/00.1

Base de datos=/gcg/husar/gcgdata/gcgblimps/blocksplus.dat

Steven Henikoff y Jorja G. Henikoff, Protein Family Classification Based on Searching a Database of Blocks, Genomics 19:97-107 (1994).

Cada resultado numerado consiste en uno o más bloques de PROSITE o PRINTS

gbDhDi33.35ikn.2.128.pep

Valor de E

Familia Hebra Bloques combinado

IPB008161 Repetición de hélice de colágeno 1 1 de 1 0,0077

>IPB008161 1/1 bloques Valor de E combinado= 0,0077: Repetición de hélice de colágeno

Bloque Marco Ubicación (aa) Valor de E de bloque

IPB008161 o 49-91 0,007

alineamientos comunicados:

<-> GAFGPPGLPGPKGPRGPAGIEGKPGRLGEDNRPGPPGPPGVRG

Otros IPB008161

016787|016787_CAEEL143

I

lllll II I

I I

I

gbDhDi33.35ikn.2.1 49

GPPRPPPGLDQLNPEGPAGPGGPPAILPALPAPADPEPfiPRRG

Búsqueda=rheu.ef. 241,148 Longitud: 148 Tipo: P

>IPB008161 1/1 bloques Valor de E combinado= 0,0075: Repetición de hélice de colágeno Bloque Marco Ubicación (aa) Valor de E de bloque IPB008161 0 67-109 0,0068

Otros alineamientos comunicados:

IPB008161 <->

Q9L470_STAEP 1076 GKFñEPGKPñEFGKPAEPGTPAEPGKFAEPGTPAEPGKPñEFG

II III III III III I

rheu.ef.241.143 67 HLATTLGRPPRPGPPGGPRTPQIRnLPALPAPQGEPGDRATWR

Búsqueda=rheu.ef.238rev.l48 2774.sreformat Longitud: 148

>IPB008161 1/1 bloques Valor de E combinado= 0,0075: Repetición de hélice de colágeno

Bloque Marco Ubicación (aa) Valor de E de bloque

IPB008161 0 67-109 0,0068

Otros alineamientos comunicados:

IPE008161 <->

Q9L1 70 _STAEP 1076

rheu,ef,238rev,L48 67

GHFAEFGKPAE PGKPñEFGT PAE PG K PAE FGT PAE PGKPAE PG

.........................II III III I

HLAT TLGRP PR PG P PGG P RTPQ1 Kn L. PA L PA PQGE PGDRA TWR

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: pfam.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.148

Colágeno: dominio 1 de 1, de 73 a 133: puntuación -74,8, E = 3,5

*->GppGppGppGppGppGppCppGpaGapGppGppGe.pGpPCppCppG G+p +pGppG p p + p + ++G+pG++ +G+ G++ * G

rheu.ef.24 73 GRPPRPGPPGGPRTPQIRNLPALPAPQGEPGDRATwRGASGADAAGG 119

ppGppGapGapGpp<-*

G-r+Gá+G

rheu.ef.24 120 DGGERGADGGDPGD 133

rheu.ef,238rev.148

Colágeno Repetición de tripe hélice de colágeno (20 copias)

Colágeno: dominio 1 de 1, de 73 a 133: puntuación -74,8, E = 3,5

*->GppGppGppGppGppGppGppGpaGapGppGppGe.pGpPGppGppG G+p +pGppG p p + P + ++G+pG++ +G+ G++ + G

rheu.ef.23 73 GRPPRFGPPGGPRTPQIRNLPALPAPQGEPGDRATwRGASGADAAGG 119

ppGppGapGapGpp-í - *

G++Ga+G

rheu.ef.23 120 DGGERGADGGDPGD 133

#=GF ID Colágeno

#=GF AC PF01391.10

#=GF DE Repetición de tripe hélice de colágeno (20 copias)

#=GF AU Bateman A, Eddy SR #=GF SE Swissprot #=GF TP Repetición

#=GF BM hmmbuild -F --prior PRIORHMM ls.ann SEED.ann

#=GF BM hmmcalibrate —seed 0 HMM_ls

#=GF BM hmmbuild -f -F —prior PRIORHMM fs.ann SEED.ann

#=GF BM hmmcalibrate —seed 0 HMM fs

#=GF AM byscore

#=GF RM 8240831

#=GF RT #=GF RA #=GF RL #=GF DR #=GF DR #=GF DR #=GF DC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC #=GF CC

New members of the collagen superfamily Mayne R, Brewton RG;

Curr Opin Cell Biol 1993;5:883-890.

INTERPRO; IPR008160;

SCOP; 1a9a; fa;

MIM; 240400;

El escorbuto se asocia con los colágenos.

Los miembros de esta familia pertenecen a la superfamilia de colágeno [1]. En general, los colágenos son proteínas estructurales extracelulares implicadas en la formación de la estructura del tejido conectivo. El alineamiento contiene 20 copias de la repetición de G-X-Y que forma una triple hélice. La primera posición de la repetición es glicina, las posiciones segunda y tercera pueden ser cualquier resto, pero frecuentemente son prolina e hidroxiprolina. Los colágenos se modifican postraduccionalmente mediante prolina hidroxilasa para formar los restos de hidroxiprolina. La hidroxilación defectuosa es la causa del escorbuto. Algunos miembros de la superfamilia del colágeno no están implicados en la estructura del tejido conectivo, sino que comparte la misma estructura de triple hélice.

5

10

15

20

PROTEÍNA ESPECÍFICA MASCULINA DE ESPERMA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: pfam.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi33.34ik.2.128

MSSP: dominio 1 de 1, de 59 a 116: puntuación -9,5, E = 8,9

*->vgGPCgpCGPCggpcCGscc3PCg.gpCgPCgpCGpCGPccggCGPC P gp GP g+p+ P ++p P p CG ++ g

gbDhDi33.3 59 QLNPEGPAGPGGPPAIL---PALpAPADPE-PAPRCGGRADGGAAA 100

GpCGPCOGttekyeGl<T-'

G t + l

gbDhDÍ33.3 101 GAAADADHTGYEEGDL 116 #=GF ID MSSP

#=GF AC PF03940.5

#=GF DE Proteína específica masculina de esperma

Esta familia de proteínas de Drosophila está tipificada por el motivo repetitivo C-G-P.

FIRMA DE METALOPROTEASA COLAGENASA MICROBIANA (M9)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: gbDhDi43.4rp.1.765

MICOLLPTASA_1: dominio 1 de 1, de 311 a 328: puntuación 5,3, E = 5,7

*->gl etOvef lRAGYYvr

ler r■r HA Y f++

gbChDi43.4 311 TLEN-ILYTRASYWNSFHA 228

MICOLLPTASA

gx; PR00931

gn; COMPUESTO(5)

ga; 09-SEP-1998; ACTUALIZADO 07-JUN-1999

gt;

gp;

gr;

gd;

Firma de metaloproteasa colagenasa microbiana (M9)

PRINTS; PR00756 ALADIPTASE; PR00791 PEPDIPTASEA; PR00730 THERMOLYSIN PRINTS; PR00787 NEUTRALPTASE; PR00782 LSHMANOLYSIN; PR00997 FRAGILYSIN PRINTS; PR00786 NEPRILYSIN; PR00765 CRBOXYPTASEA; PR00932 AMINOIPTASE PRINTS; PR00789 OSIALOPTASE; PR00933 BLYTICPTASE; PR00934 XHISDIPTASE PRINTS; PR00919 THERMOPTASE; PR00998 CRBOXYPTASET; PR00768 DEUTEROLYSIN PRINTS; PRO0999 FUNGALYSIN; PR01000 SREBPS2PTASE INTERPRO; IPR002169 PROSITE; PS00142 PROTEASA DE CINC PFAM; PF00099

1. RAWLINGS, N.D. Y BARRETT, A.J.

Evolutionary families of metallopeptidases.

METHODS ENZYMOL. 248 183-228 (1995).

2. RAWLINGS, N.D. Y BARRETT, A.J.

MEROPS - Base de datos de peptidasas
http://www.bi.bbsrc.ac.uk/merops/merops.htm

3. RAWLINGS, N.D. Y BARRETT, A.J.

Familia M9 - Clan MA - Colagenasa microbiana
http://www.bi.bbsrc.ac.uk/merops/famcards/m9.htm

4. BARRETT, A.J., RAWLINGS, N.D. ANDWOESSNER, J.F.

Vibrio collagenase.

EN HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, ACADEMIC PRESS, 1998, PP.1096-1098.

5. BARRETT, A.J., RAWLINGS, N.D. Y WOESSNER, J.F.

Clostridium collagenases.

EN HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, ACADEMIC PRESS, 1998, PP.1098-1102.

6. MATSUSHITA, O., YOSHIHARA, K., KATAYAMA, S., MINAMI, J. Y OKABE, A.

Purification and characterization of Clostridium perfringens 120-kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the corresponding gene.

J.BACTERIOL. 176 149-156 (1994).

Las metaloproteasas son las más diversas de los cuatro tipos principales de proteasas, habiéndose identificado hasta ahora más de 30 familias [1]. De estas, aproximadamente la mitad contienen el motivo HEXXH, que se ha demostrado en estudios cristalográficos que forma parte del sitio de unión a metales [1]. El motivo HEXXH es relativamente común, pero puede definirse de manera más rigurosa para metaloproteasas como abXHEbbHbc, donde a suele ser valina o treonina y forma parte del sustituto S1' en termolisina y neprilisina, b es un resto no cargado y c un resto hidrófobo. En este sitio nunca hay prolina, posiblemente debido a que podría romper la estructura helicoidal adoptada por este motivo en las metaloproteasas [1].

Las metaloproteasas pueden dividirse en cinco grupos basándose en sus restos de unión a metales: los tres primeros contienen el motivo HEXXH, los otros dos, no [1]. En el primer grupo, un ácido glutámico completa el sitio activo - estos se denominan HEXXH+E: todas las familias en este grupo muestran cierta relación de secuencia y se han asignado al clan MA [1]. El segundo grupo, que tiene una tercera histidina como resto de unión a metal adicional, se denomina HEXXH+H y se agrupa en el clan MB basándose en su interrelación [1]. En el tercer grupo, los restos adicionales de unión a metal no están identificados. El cuarto grupo es diverso - se conocen los restos de unión a metales pero no forman el motivo HEXXH. Finalmente, el quinto grupo comprende las demás familias en las que los restos de unión a metales aún se desconocen [1,2]. Se han identificado colagenasas microbianas de bacterias de los géneros tanto Vibrio como Clostridium. Son metalopeptidasas que contienen cinc que pertenecen a la familia de proteasa M25, que forman parte del clan MA [1,3]. La colagenasa se usa durante el ataque bacteriano para degradar la barrera de

gd; colágeno del hospedador durante la invasión. Las bacterias del género Vibrio no son patógenas y

gd; en ocasiones se usan en hospitales para eliminar tejido muerto de heridas y úlceras [4]. Clostrium

gd; histolyticum es un patógeno que provoca la gangrena gaseosa; sin embargo, la colagenasa gd; aislada se ha usado para tratar las úlceras por presión [5]. La escisión del colágeno se produce

gd; en los enlaces Xaa+Gly en las colagenasas de bacterias del género Vibrio y en Yaa+Gly en las

gd; de Clostridium [4,5].

gd; El análisis de la estructura primaria del producto génico de Clostridium perfringiens ha revelado gd; que la enzima se produce con una serie de 86 restos que contienen una supuesta secuencia de

gd; señal [6]. Dentro de esta serie se encuentra PLGP, una secuencia de aminoácidos típica de

gd; sustratos de colagenasa.

gd; Por lo tanto, esta secuencia puede estar implicada en el auto-procesamiento de la gd; colagenasa [6].

gd; MICOLLPTASA es una huella de 5 elementos que proporciona una firma para metalopeptidasas

gd; de cinc de colagenasa microbianas (M9). La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 4

gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan

gd; virtualmente la longitud de alineamiento completa - el motivo 4 incluye la región codificada por el

gd; patrón PROSITE de PROTEASA DE CINC (PS00142), que describe el sitio activo de HEXXH; y

gd; el motivo 5 contiene el glutamato del sitio activo. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron

gd; dos interacciones en 0WL31.1, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que

gd; comprendía 8 secuencias.

tp; COLA CLOPE 054108 COLA VIBAL Q46085

tp; COLA_VIBPA

sn; Códigos que implican 4 elementos

st; 086030

tt; COLA CLOPE PRECURSOR DE COLAGENASA MICROBIANA (EC 3.4.24.3) (120 KD

COLAGENASA) - CLOSTRIDIUM

tt; 054108 SUPUESTA PROTEASA SECRETADA - STREPTOMYCES COELICOLOR.

tt; COLA VIBAL PRECURSOR DE COLAGENASA MICROBIANA (EC 3.4.24.3) -VIBRIO

ALGINOLYTICUS.

tt; Q46085 PRECURSOR DE COLAGENASA -CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM.

tt; COLA VIBPA PRECURSOR DE COLAGENASA MICROBIANA (EC 3.4.24.3) -VIBRIO

PARAHAEMOLYTICUS.

tt; 086030 COLAGENASA -VIBRIO CHOLERAE.

ic; MICOLLPTASE1

il; 19

it; Motivo I de colagenasa microbiana -1

id;: GIPTLVEFLRAGYYLGFYN COLA CLOPE 159 159

id;: ELETLFLYLRAGYYAEFYN COLA VIBAL 144 144

id;: VLENLGEFVRAAYYVRYNA COLA VIBPA 97 97

id;: RLENYGEFIRAAYYVRYNA AF080248 97 97

bb;

Firma de proteína MIC1 de micronema

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.242.746

MIC1MICRNEME_5: dominio 1 de 1, de 448 a 463: puntuación 6,6, E = 4,4

*->TyiStkLdVaVGSCHk<-*

T t + L Va GSC

rheu.ef.24 448 TKADTQLIVAGGSCKA 463

gc;: MIC1MICRNEME

gx;: PR01744

gn;: COMPUESTO(7)

ga;: 03-JUL-2002

gt; Firma de proteína MIC1 de micronema

gr; 1. SIBLEY, L.D., MORDUE, D. Y HOWE, K.

gr; Experimental approaches to understanding virulence in toxoplasmosis.

gr; IMMUNOBIOL. 201 210-224 (1999).

gr; 2. CARRUTHERS, V.B.

gr; Armed and dangerous: Toxoplasma gondii uses an arsenal of secretory proteins

gr; to infect host cells.

gr; PARASITOL.INT. 48 1-10 (1999).

gr; 3. FOURMAUX, M.N., ACHBAROU, A., MERCEREAU-PDIJALON, O., BIDERRE, C., gr; BRICHE, I., LOYENS, A., ODBERG-FERRAGUT, C., CAMUS, D. Y DUBREMETZ, J.F. gr; The MIC1 microneme protein of Toxoplasma gondii contains a duplicated gr; receptor-like domain and binds to host cell surface.

gr; MOL.BIOCHEM.PARASITOL. 20 201-210 (1996).

gr; 4. LOURENCO, E.V., PEREIRA, S.R., FACA, V.M., COELHO-CASTELO, A.A., MINEO, J.R., ROQUE-

gr; BARREIRA, M.C., GREENE, L.J. Y PANUNTO-CASTELO, A.

gr; Toxoplasma gondii micronemal protein MIC1 is a lactose-binding lectin.

gr; GLYCOBIOL. 11 541-547 (2001).

gr; 5. KELLER, N., NAGULESWARAN, A., CANNAS, A., VONLAUFEN, N., BIENZ, M., BJORKMAN, C., gr; BOHNE, W. Y HEMPHILL, A.

gr; Identification of a Neospora caninum microneme protein (NcMIC1) which interacts with sulphated host cell

gr; surface glycosaminoglycans.

gr; INFECT.IMMUN. 70 187-198 (2002).

gd; Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular obligado del género gd; Apicomplexa, con un modo de vida complejo que implica diversos hospedadores gd; [1]. Tiene dos fases de crecimiento: una fase intestinal en hospedadores felinos y gd; una fase extraintestinal en otros mamíferos. Los ovocistos de gatos infectados se gd; desarrollan en taquizoitos y en última instancia, bradizoitos y zoocistos en el

gd; hospedador extraintestinal [1]. La transmisión del parásito se produce por el

gd; contacto con gatos infectados o carne cruda/poco cocinada; en individuos gd; inmunocomprometidos, puede provocar toxoplasmosis grave y en ocasiones letal. gd; La infección aguda en humanos sanos también puede causar en ocasiones daño gd; tisular [1].

gd; El protozoo utiliza una serie de proteínas secretoras y antigénicas para invadir gd; un hospedador y obtener acceso al ambiente intracelular [2]. Estas se originan

gd; en distintos orgánulos en la célula de T. gondii denominados micronemas,

gd; roptrias y gránulos densos. También se liberan en momentos específicos gd; durante la invasión para asegurar que las proteínas se sitúan en sus destinos gd; diana correctos [2].

gd; MIC1, una proteína secretada del micronema, es un residuo de 456 restos

gd; implicado en el reconocimiento de la célula hospedadora por el parásito [3]. La

gd; proteína se libera desde el polo apical de T. gondii durante la infección y se une a

gd; receptores específicos del hospedador [4]. Estudios recientes han demostrado que gd; Mic1 es una lectina de unión a lactosa y la utiliza para mejorar su unión a células

gd; endoteliales del hospedador [4]. Un homólogo de Mic1 encontrado en Neospora

gd; caninum interactúa con glucosaminoglucanos sulfatados de la superficie de la gd; célula hospedadora [5]. MIC1MICRNEMA es una huella de 7 elementos que gd; proporciona una firma para las proteínas micronema MIC1. La huella se obtuvo de gd; un alineamiento inicial de 2 secuencias: los motivos se representaron a partir de

gd; regiones conservadas que abarcan la parte C-terminal del alineamiento (~380

gd; aminoácidos). Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola interacción en bb; SPTR40_20f, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de inicio. ic; MIC1MICRNEME5

il; 16

it; motivo V de proteína MIC1 de micronema -1

id; TFISTKLDVAVGSCHS 00033-3 341 133

id; TYSSPQLHVSVGSCHK Q8WRS0 344 138

FIRMA DE REGULADOR AUTOINMUNITARIO (AIRE)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.736

AIREGULATOR_4: dominio 1 de 1, de 138 a 152: puntuación 6,4, E = 9,2

*->DFWRvLFKDYnLERY<-*

FW v D L RY

rheu.ef.24 138 NFWTVSNEDLDLCRY 152 rheu.ef.234rev.628

AIREGULATOR_4: dominio 1 de 1, de 30 a 44: puntuación 6,4, E = 9,2 *->DFWR.vLFKD¥nLERY<-*

FW v D L RY

rhcu.ef.23 30 NFWTVSNEDLDLCRY 44

5 rheu.cd.215rev.1.736

AIREGULATOR_4: dominio 1 de 1. de 138 a 152: puntuación 6,4. E = 9,2 *-> DFWRvLFKDYnLERY <-*

FW v D L RY

rheu.cd.21 138 NFWTVSNEDLDLCRY 152

gc; AIREGULATOR

gx; PR01711

gn; COMPUESTO(8)

ga; 13-MAR-2002

gt; Firma de regulador autoinmunitario (AIRE)

gr; 1. The Finnish-German APECED Consortium.

gr; An autoimmune disease, APECED, caused by mutations in a novel gene featuring two PHD-type zinc-finger gr; domains.

gr; NAT.GENET. 17 399-403 (1997).

gr; 2. MITTAZ, L., ROSSIER, C., HEINO, M., PETERSON, P., KROHN, K.J.E., GOS, A., MORRIS, M.A.,

gr; KUDOH, J., SHIMIZU, N., ANTONARAKIS, S.E. Y SCOT, H.S.

gr; Isolation and chatacterisation of the mouse Aire gene.

gr; BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN. 255 483-490 (1999).

gr; 3. PETERSON, H.M., KUDOH, J., NAGAMINE, K., LAGERSTEDT, A., OVOD, V.,

gr; RANKI, A., RANTALA, I., NIEMINEN, M., TUUKKANEN, J., SCOTT, H.S., ANTONARAKIS, S.E., SHIMIZU, gr; N. Y KROHN, K.

gr; Autoimmune regulator is expressed in the cells regulating immune gr; tolerance in thymous medulla.

gr; BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN. 257 821-825 (1999).

gr; 4. KUMAR, P.G., LALORAYA, M., WANG, C.Y., RUAN, Q.G., SEMIROMI, A.D., KAO.K.J. Y SHE, J.X.

gr; The autoimmune regulator (AIRE) is a DNA-binding protein. J.BIOL.CHEM. 276 41357-41364 (2001).

gr; AIRE (REgulador AutoInmunitario) es la proteína predicha responsable

gr; de una enfermedad de herencia autosómica recesiva denominada

gd; APECED. APECED, también denominado síndrome poliglandular

gd; autoinmunitario de tipo I (APS 1) es la única enfermedad autoinmunitaria

gd; descrita con un origen monogénico demostrado, localizándose fuera de la

gd; región del complejo mayor de histocompatibilidad. Se caracteriza por la

gd; presencia de dos de las tres entidades clínicas principales, candidiasis

gd; mucocutánea crónica, hipoparatiroidismo y enfermedad de Addison. Otros

gd; fenotipos mediados inmunológicamente, incluyendo diabetes mellitus

gd; insulinodependiente (IDDM), insuficiencia gonadal, gastritis crónica,

gd; vitíligo, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipoplasia del esmalte y

gd; alopecia también pueden estar presentes. Inmunológicamente, los

gd; pacientes con APECED tienen respuestas

5

gd; de linfocitos T defectuosas contra antígenos de Candida y síntomas clínicos tanto dentro gd; como fuera del sistema endocrino, principalmente a consecuencia de la autoinmunidad gd; contra autoantígenos específicos de órganos [1,2].

gd; AIRE tiene motivos que sugieren una proteína reguladora transcripcional. Porta dos dedos

gd; de cinc de tipo homodominio de planta (PHD). Un supuesto dominio de unión a ADN,

denominado SAND, así como cuatro motivos LXXLL de unión a receptor nuclear, un gd; dominio LXXLL invertido y una variante de este último (FXXLL), sugieren que esta gd; proteína funciona como coactivador de la transcripción. Además, un dominio N-terminal de gd; 100 aminoácidos altamente conservado en AIRE muestra una similitud significativa con el gd; dominio de tinción homogénea (HSR) de las proteínas Sp100 y Spl40, que se ha gd; demostrado que funciona como dominio de dimerización en varias proteínas relacionadas gd; con Sp-100 [2-4].

gd; AIRE tiene una ubicación subcelular dual. No solo se expresa en múltiples tejidos gd; inmunológicamente relevantes, tales como el timo, bazo, ganglios linfáticos y médula gd; ósea, sino que también se ha detectado en varios tejidos distintos, tales como riñón,

gd; testículos, glándulas suprarrenales, hígado y ovario, lo que sugiere que las proteínas

gd; APECED también podrían tener una función fuera del sistema inmunitario. gd; Sin embargo, AIRE no se expresa en los órganos diana de la destrucción autoinmunitaria. gd; A nivel subcelular, puede encontrarse AIRE en el núcleo celular con un patrón moteado en gd; dominios que se asemejan a cuerpos nucleares de leucemia promielocítica, también gd; conocidos como ND10, puntos nucleares o dominios oncogénicos potenciales asociados gd; con las proteínas nucleares homólogas de AIRE, Sp100, Spl40 y Lysp100. La localización gd; nuclear de AIRE, en concordancia con sus dominios de proteína predichos, sugiere que gd; podría regular los mecanismos implicados en la inducción y el mantenimiento de la gd; tolerancia inmunitaria [3,4].

gd; AIREGULATOR es una huella de 8 elementos que proporciona una firma para los gd; reguladores autoinmunitarios AIRE. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 6 gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan

gd; en gran medida las porciones N-terminales y centrales del alineamiento, centrándose en

gd; aquellas secciones que caracterizan a los autorreguladores pero que los distinguen de los gd; que poseen dominios SAND y PHD. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos gd; interacciones en SPTR39_17f, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que gd; comprendía 14 secuencias.

fc; AIREGULATOR4

fl; 15

ft; Motivo IV de regulador autoinmunitario (AIRE) -1

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW0 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9Z0E3 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLX0 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW9 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW8 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW7 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW6 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW5 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW4 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW3 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW2 77 18

fd: DFWRILFKDYNLERY Q9JLW1 77 18

fd: DFWRVLFKDYNLERY AIRE HUMANA 76 18

fd: DFWRVLFKDYNLERY 075745 76 18

GLIADINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.736

GLIADIN_7: dominio 1 de 1, de 688 a 708: puntuación 17,7, E = 0,056

*->Pqaq3svqPqqLPqE'eEiRnL<-* qaqGsvq q L q E R. L

rheu.ef.24 688 TQAQSSVQEQLLLQLREQRVL 708 rheu.ef.234rev.628

GLIADIN_7: dominio 1 de 1, de 580 a 600: puntuación 17,7, E = 0,056

* - > PqaqGs v qPqqL Pq Fe Ei Rr L < - * qaqssvq q L q E R L

Eheu.cf.23 580 TtQAQGS VQEQ L LLQlREfi RVL 600

rheu.cd.215rev.1.736

GLIADINA_7: dominio 1 de 1, de 688 a 708: puntuación 18,3, E = 0,037 *->PqaqGsvqPqqLPqFeEÍRnL<-* qaqGsvq q L q E R L

rheu.cd.21 688 TQñQGSVQDQLLLQLREQRVL 708

5 GLIADIN_7: dominio 1 de 1, de 46 a 66: puntuación 18,3, E = 0,037

*->PqaqGsvqPqqLPqFeEiRnL<-i qaqGsvq q L q E R L

zc3rll.B4. 46 TQAQGSVQDQLLLQLREQRVL 66

gc;

gx;

gn;

ga;

gt;

gp;

gr;

gd;

c;

fl;

ft;

GLIADINA

PR00209

COMPUESTO(9)

21-OCT-1992; ACTUALIZADO 19-JUN-1999 Firma de la familia de alfa/beta gliadina

PRINTS; PR00208 GLIADGLUTEN; PR00211 GLUTELIN; PR00210 GLUTENIN INTERPRO; IPR001376

1. SHEWRY, P. Y MORGAN, M.

Gluten - proteins that put the springiness into bread and are implicated in food intolerance syndromes such as.coeliac disease.

EN PROTEIN POWER AFRC NEWS SUPPLEMENT (1992).

2. OKITA T.W., CHEESBROUGH V. Y REEVES C.D.

Evolution and heterogeneity of the alpha-type, beta-type, and gamma-type gliadin DNA sequences.

J.BIOL.CHEM. 260(13) 8203-8213 (1985).

3. RAFALSKI J.A.

Structure of wheat gamma-gliadin genes.

GENE 43(3) 221-229 (1986).

El gluten es la proteína componente de la harina de trigo. Consta de numerosas proteínas, que son de 2 tipos diferentes, responsables de diferentes propiedades físicas de la masa [1]: las glutelinas, que son responsables principalmente de la elasticidad y las gliadinas, que contribuyen a la extensibilidad.

Las gliadinas en sí son de diferentes tipos (por ejemplo, alfa/beta o gamma) y, al igual que las glutelinas, contienen secuencias repetitivas [2] que forman estructuras helicoidales sueltas, pero normalmente se asocian con regiones no repetitivas más extensas, que son compactas y globulares [3].

GLIADINA es una huella de 9 elementos que proporciona una firma para las alfa/beta gliadinas. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 5 secuencias: los motivos 2 y 3 codifican las repeticiones en tándem ricas en Gln/Pro. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones en OWL18.0, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 14 secuencias. También se encontraron varias coincidencias parciales: 3 de estas son fragmentos de alfa/beta gliadina:

tanto GDA1 WHEAT como B22364 carecen de la parte C-terminal de la secuencia que porta los 2 últimos motivos y GDA8 WHEAT carece de la parte N-terminal de la secuencia que porta los 3 primeros motivos.

Además de los fragmentos de alfa/beta gliadina, se identificó una serie de otras coincidencias parciales: estas incluyen gamma-gliadinas, gluteninas de bajo peso molecular, aveninas, secalinas y así sucesivamente. La mayoría de estas no logran emparejarse o al menos se emparejan mal, con los motivos que codifican las repeticiones en tándem - evidentemente, se caracterizan por sus propias firmas distintivas en esta región. La huella proporciona, por lo tanto, una discriminación razonable entre las gliadinas de tipo alfa/beta y las de tipo gamma y proteínas relacionadas.

GLIADIN7

21

Motivo VII de gliadina - 2

5

10

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL GDA9 WHEAT 259 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL GDA6 WHEAT 246 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL Q41509 239 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL Q41531 241 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL GDA0 WHEAT 238 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFAEIRNL GDA7 WHEAT 263 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFAEIRNL Q41546 263 6

fd: PQAQGSFQPQQLPQFEEIRNL GDA2 WHEAT 243 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL Q41632 246 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL Q41530 240 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFAEIRNL Q41529 263 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFAEIRNL GDA5 WHEAT 269 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFAEIRNL Q41545 268 6

fd: PQTQGSVQPQQLPQFEEIRNL Q41528 239 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL GDA4 WHEAT 249 6

fd: PQAQGSVQPQQLPQFQEIRNL GDA3 WHEAT 232 6

FIRMA DE RECEPTOR Y2 DE NEUROPEPTIDO

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.736

NRPEPTIDEY2R_9: dominio 1 de 1, de 664 a 677: puntuación 8,9, E = 3,1

~ *->AFLsAFRCEqRLDAiHs<-*

sAFR qR+ +Hs

irheu.ef.24 664 --SAFRVQQRVPWVHS 677

rheu.ef.234rev.628

NRPEPTIDEY2R_9: dominio 1 de 1, de 556 a 569: puntuación 8,9, E = 3,1

*->AFLsAFRCEqRLDAiHs<-* sAFR qR+ +Hs

rheu.ef.23 556 --SAFRVQQRVPWVHS 569

NRPEPTIDEY2R 9: dominio 1 de 1, de 22 a 35: puntuación 7,2, E = 6,3

*->AFLsAFRCEqRLDAiHsC-* s FR qRL +Hs

zc3rll.S4. 22 --SRFRVQQRLPWVHS 35

gc; NRPEPTIDEY2R

gx; PRO1014 gn; gn; COMPUESTO(11)

ga; 30-NOV-1998; ACTUALIZADO 07-JUN-1999 gt; Firma de receptor Y2 de neuropéptido

gp; PRINTS; PR01012 NRPEPTIDEYR; PR01013 NRPEPTIDEY1R; PR01015 NRPEPTIDEY4R

gp; PRINTS; PR01016 NRPEPTIDEY5R; PR01017 NRPEPTIDEY6R

gp; INTERPRO; IPR001358

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; G protein-coupled receptor fingerprints.

gr; 7TM, VOLUMEN 2, EDS. G.VRIEND Y B.BYWATER (1993).

gr; 3. BIRNBAUMER, L.

gr; G proteins in signal transduction.

gr; ANNU.REV.PHARMACOL.TOXICOL. 30 675-705 (1990).

gr; 4. CASEY, P.J. Y GILMAN, A.G.

gr; G protein involvement in receptor-effector coupling.

gr; J.BIOL.CHEM. 263(6) 2577-2580 (1988).

gr; 5. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Design of a discriminating fingerprint for G protein-coupled receptors. gr; PROTEIN ENG. 6(2) 167-176 (1993). gr; 6. WATSON, S. Y ARKINSTALL, S.

gr; Neuropeptide Y.

gr; EN THE G PROTEIN-LINKED RECEPTOR FACTSBOOK, ACADEMIC PRESS, 1994, gd; PP.194-198 Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia gd; de proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos procesos gd; autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable diversidad a nivel de gd; secuencia, que puede usarse como base para separarlas en distintos grupos. Se usa el gd; término clan para describir las GPCR, ya que abarcan un grupo de familias para las que

gd; hay indicaciones de relación evolutiva, pero entre las cuales no hay una similitud

gd; estadísticamente significativa en su secuencia [1,2]. Los miembros del clan conocidos en gd; la actualidad incluyen las GPCR similares a rodopsina, las GPCR similares a secretina,

gd; los receptores de AMPc, los receptores de feromonas de emparejamiento fúngico y la

gd; familia de receptor de glutamato metabotrópico.

gd; Las GPCR similares a rodopsina representan por sí mismas una familia de proteínas gd; ampliamente diseminada que incluye receptores de hormonas, neurotransmisores y de gd; luz, todos los cuales transducen señales extracelulares mediante su interacción con gd; proteínas de unión a nucleótidos guanina (G). Aunque sus ligandos activadores varían gd; ampliamente en su estructura y carácter, las secuencias de aminoácidos de los gd; receptores son muy similares y se cree que adoptan un armazón estructural común que gd; comprende 7 hélices transmembrana (TM) [3-5].

gd; El neuropéptido Y [NPY] es uno de los péptidos más abundantes en el cerebro de gd; mamíferos, e induce una serie de efectos en el comportamiento (por ejemplo,

gd; estimulación de la ingesta de comida, ansiedad, facilitación del aprendizaje y la memoria

gd; y regulación de los sistemas cardiovascular y neuroendocrino) [6]. En la periferia, NPY

gd; estimula la contracción del músculo liso vascular y modula la secreción de hormonas. Se

gd; ha relacionado a NPY con la fisiopatología de la hipertensión, la insuficiencia cardíaca

gd; congestiva, los trastornos afectivos y la regulación del apetito [6]. Se han caracterizado

gd; varios receptores Y de neuropéptido Y farmacológicamente distintos, denominados NPY

gd; Y1-Y6. Hay presencia de altas densidades de receptores Y2 en el hipocampo de ratas y

gd; también se encuentran a altos niveles en las capas superficiales del córtex, ciertos

gd; núcleos talámicos, el septo lateral y el núcleo olfatorio anterior; se encuentran niveles

gd; menores en el striatum [6]. Los receptores se encuentran a altos niveles en el músculo

gd; liso (por ejemplo, conductos deferentes e intestino), los túbulos proximales del riñón y en

gd; estirpes celulares [6]. Se cree que tienen una ubicación predominantemente presináptica

gd; y están implicados en la inhibición de la adenililo ciclasa y de los canales de calcio

gd; dependientes de voltaje mediante una proteína G sensible a la toxina tosferínica,

gd; probablemente de la clase GO/Gi [6]. NRPEPTIDEY2R es una huella de 11 elementos

gd; que proporciona una firma para receptores de neuropéptido Y2. La huella se obtuvo de

gd; un alineamiento inicial de 2 secuencias: los motivos se representaron a partir de

gd; secciones conservadas dentro de cada bucle o las regiones TM, centrándose en aquellas

gd; áreas del alineamiento que caracterizan los receptores Y2, pero que lo distinguen del

gd; resto de la familia de neuropéptido Y - los motivos 1-3 abarcan el extremo N-terminal,

gd; desembocando en el dominio 1 TM; los motivos 4 y 5 abarcan el extremo C-terminal del

gd; dominio 4 TM y el segundo bucle externo; los motivos 6 y 7 abarcan el extremo C- gd; terminal del dominio 5 TM y el tercer bucle citoplásmico; el motivo 8 abarca el extremo C-

gd; terminal del dominio 6 TM y el tercer bucle externo; y los motivos 9-11 se encuentran en

gd; el extremo C-terminal. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones gd; en OWL30.2, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 5

gd; secuencias. También se encontraron dos coincidencias parciales: OAU83458 es un

gd; fragmento de receptor de neuropéptido Y2 ovino que coincide con los motivos 4-6; gd; yAF054870 es un fragmento de receptor de neuropéptido Y2 de rata que coincide con los gd; motivos 5 y 6. fc; NRPEPTIDEY2R9 fl; 17

ft; Motivo IX del receptor de neuropéptido Y2 - 2

5

10

15

fd;: AFLSAFRCEQRLDAIHS NY2R HUMAN 335 29

fd;: AFLSAFRCEQRLDAIHS NY2R BOVIN 338 29

fd;: AFLSAFRCEQRLDAIHS NY2R MOUSE 339 29

fd;: AFLSAFRCEQRLDAIHS NY2R PIG 337 29

AEROLISINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.736

AEROLYSINA_7: dominio 1 dej, de 602 a 621: puntuación 3,4, E = 9,3

*->wDKRYiFGEvKWWDWnWtiq<-*

-t-D +Y+ Ev W W

rheu.ef.24 602 VDPKYVTPEVTWHSWDIRRG 621

rheu.ef.234rev.628

AEROLYSINA 7: dominio 1 de 1, de 494 a 513: puntuación 3,4, E = 9,3

*->wDKRYiFGEvKWWDWnWtiq<-*

+D + Y+ Ev W W

rheu.ef.23 494 VDPKYVTPEVTWHSWDIRRG 513

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: uro742rev.109r

AEROLYSINA_7: dominio 1 de 1, de 65 a 84: puntuación 3,6, E = 8,6

*->wDKRYiPGEvKWWDWnWtiq<-*

+ G K W WnW-r +

uro742rev. 65 FAWVLASGTAKCWSWNWSfiR 84

AEROLYSIN_7: dominio 1 de 1, de 65 a 84: puntuación 3,6, E = 8,6

"" *->wDKRYi PGEvKWWDWnWtiq<-*

+ G K W WnW+ +

zc37.B9.2d 65 FAWVLASGTAKCWSWNWSAR 8 4

gc; AEROLISINA

gx; PR00754

gn; COMPUESTO(9)

ga; 25-AUG-1997; ACTUALIZADO 06-JUN-1999 gt; Firma de aerolisina

gp; INTERPRO; IPR001776

gp; PROSITE; PS00274

gp; AEROLYSIN PFAM; PF01117 Aerolysin

gr; 1. PARKER, M.W., BUCKLEY, J.T., POSTMA, J.P., TUCKER, A.D., LEONARD, K., gr; PATTUS, F. Y TSERNOGLOU, D.

gr; Structure of the aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-

gr; channel states.

gr; NATURE 367 292-295 (1994).

gd; La aerolisina es responsable de la patogenicidad de Aeromonas hydrophila, una gd; bacteria asociada con enfermedades diarreicas e infecciones de heridas profundas gd; [1]. En común con otras toxinas microbianas, la proteína cambia en un proceso gd; multi-etapa desde una forma hidrosoluble hasta producir un canal transmembrana gd; que destruye a las células sensibles, rompiendo sus barreras de permeabilidad [1]. gd; Se ha determinado la estructura de la proaerolisina con una resolución de 2,8A y gd; demuestra que la protoxina adopta un nuevo plegamiento [1]. Las imágenes del gd; oligómero de aerolisina obtenidas por microscopía electrónica han ayudado a gd; construir un modelo de la proteína y a esbozar un mecanismo mediante el cual gd; podría insertarse en las bicapas lipídicas para formar canales de iones [1]. gd; AEROLYSINA es una huella de 9 elementos que proporciona una firma para las gd; aerolisinas. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 10 secuencias: los gd; motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan gd; prácticamente la longitud completa del alineamiento. Para alcanzar la convergencia gd; se necesitó una sola interacción en OWL29.4, sin identificar secuencias adicionales gd; más allá del conjunto de inicio. Se encontró una sola coincidencia parcial, gd; CLOALPTOX, una alfa-toxina relacionada de Clostridium septicum que coincide gd; con los motivos 4 y 6.

5

10

15

20

25

fc: AEROLYSIN7

fl;: 20

ft;: Motivo VII de aerolisina - 2

fd: WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ AERA AERHY 382 21

fd: WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ Q44063 382 21

fd: WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ AER3 AERHY 382 21

fd: WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ AER5 AERHY 382 21

fd: WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ AER4 AERHY 382 21

fd: WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ P94128 382 21

fd: WDKRYLPGEMKWWDWNWAIQ AERA AERTR 382 21

fd: WDKRYLPGEMKWWDWNWAIQ 085370 382 21

fd: VDKRYIPGEVKWWDWNWTIS AERA AERSA 383 21

fd: VDKRYIPGEVKWWDWNWTIS AERA AERSO 382

OREXINA:

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: pfam.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.148

Orexina: dominio 1 de 1, de 10 a 122: puntuación -38,9, E = 4,1

*->mnlPsaKvsWAavtlLLLLLLLPPAlLslGvdAqPLPDCCRqKtCsC + v A LL + PP + G + + C R C

rheu.ef.24 10 RKVLLQTVRAAKKARRLLGMWQPPVHNVPGIERNWYESCFRSHAAVC 56

rheu.ef.24

RLYELLHGAGnHAAGiLtLGK.RRPGPPGLqGRLqRLLqAsGnHAAGiLt + + G nH A tLGt t- RPGPPG G i

57 GCGDFV-GHINHLAT —TLGRpPRPGPPG------------GPRTPQI— 89

mGRRAGAElePrlCPGRRClaAaAsalAPrGrsrv<- R A ++P+ PG R As G+ +

rheu.ef.24 90 —RNLPALPAPQGEPGDRATWRGASGADAAGGDGG

rheu.ef.238rev.148

Orexina: dominio 1 de 1, de 10 a 122: puntuación -38,9, E = 4,1 *->mnlPsaKvsWAavtlLLLLLLLPPAlLslGvdAqPLPDCCRqtítCsC + v A LL + PP +G++ C R C

122

rheu.ef.23

10

RKVLLQTVRAAKKARRLLGMWQPPVHNVPGTERNWYESCFRSHAAVC 56

rheu.ef.23

57

RLYELLHGAGnHAAGiLtLGK.RRPGPPGLqGRLqRLLqAsGnHAAGiLt + + G nH A tLG++ RPGPPG G i

GCGDFV-GHINHLAT —TLGRpPRPGPPG-----------GPRTPQI— 89

rheu.ef.2 3

mGRRAGAElePrlCPGRRClañaAsalAPrGrsrv<-* R A M P i PG R As Gil

90 --RNLPALPAPQGEPGDRATWRGASGADAAGGDGG

122

#=GF ID Orexina

#=GF AC PF02072.7

#=GF DE Prepro-orexina

#=GF AU Mian N, Bateman A

#=GF SE IPR001704

#=GF TP Familia

OREX HUMAN/1-131

MNLPSTKVSWAAVTLLLLLLLLPPALLSSGAAAQPLPDCCRQKTCSCRLYELLHGAGNHAAGILTLGKRRSGPPGLQGRLQRLL

ASGNHAAGILTMGRRAGAEPAPRPCLGRRCSAPAAASVAPGGQSGI

RECEPTOR GIP

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM:

prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.148

GIPRECEPTOR_7: dominio 1 de 1, de 76 a 97: puntuación 7,9, E = 3,7 1 ->Pr I Ci?Y I fidqt LtLwnq. ALAA<-*

Pr + C? G + t+- 4+n +AL A

rheu.ef.24 76 PRFGFPGG PRT PQI RNLp AL PA 97

rheu.ef.238rev

5 GIPRECEPTOR_7: dominio 1 de 1, de 76 a 97: puntuación 7,9, E = 3,7

*->Pr1G PYlGdqt LtLwnq,ALAA<-* Ptr+GP G +t+ ++n +AL A

rheu.ef-23 76 P RPG P Pt¡ G ? RT P KNLpAL P A 97

GIPRECEPTOR

gx; PR01129

gn; COMPUESTO(11)

ga; 22-MAY-1999

gt; Firma de precursor de receptor de polipéptido inhibidor gástrico

gp; PRINTS; PR00237 GPCRRHODOPSN; PR00247 GPCRCAMP; PR00248 GPCRMGR

gp; PRINTS; PR0024 9 GPCRSECRETIN; PR00250 GPCRSTE2; PR00899 GPCRSTE3

gp; PRINTS; PR00251 BACTRLOPSIN

gp; INTERPRO; IPR001749

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ISHIHARA T., NAKAMURA S., KAZIRO, Y., TAKAHASHI, T., TAKAHASHI, K. Y gr; NAGATA, S.

gr; Molecular cloning and expression of a cDNA encoding the secretin receptor gr; EMBO J. 10 1635-1641 (1991).

gr; 3. LIN, H.Y., HARRIS, T.L., FLANNERY, M.S., ARUFFO, A., KAJI, E.H., gr; GORN, A., KOLAKOWSKI, L.F., LODISH, H.F. Y GOLDRING, S.R. gr; Expression cloning of adenylate cyclase-coupled calcitonin receptor gr; SCIENCE 254 1022-1024 (1991).

gr; 4. JUEPPNER, H., ABOU-SAMRA, A.-B., FREEMAN, M., KONG, X.F.,

gr;

gd

ter

gd

bb

fc ;

fi ;

ft;

fd ;

SCHIPANI, E., RICHARDS, J., KOLALOWSKI, L.F., HOCK, J., POTTS, J.T., KRONENBERG, H.M. Y SEGRE, G.E.

A G protein linked receptor for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related peptide.

SCIENCE 254 1024-1026 (1991).

5. ISHIHARA, T., SHIGEMOTO, R., MORI, K., TAKAHASHI, K. Y NAGATA, S.

Functional expression and tissue distribution of a novel receptor for vasoactive intestinal polypeptide. NEURON 8(4) 811-819 (1992).

6. VOLZ, A., GOKE, R., LANKAT-BUTTGEREIT, B., FEHMANN, H.C., BODE, H.P. Y GOKE, B.

Molecular cloning, functional expression, and signal transduction of the GIP-receptor cloned from a human insulinoma.

FEBS LETT. 373(1) 23-9 (1995).

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia de proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos procesos autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable diversidad a nivel de secuencia, que puede usarse como base para separarlas en distintos grupos. Se usa el término clan para describir las GPCR, ya que abarcan un grupo de familias para las que hay indicaciones de relación evolutiva, pero entre las cuales no hay una similitud estadísticamente significativa en su secuencia [1].

Los miembros del clan conocidos en la actualidad incluyen las GPCR similares a rodopsina, las GPCR similares a secretina, los receptores de AMPc, los receptores de feromonas de emparejamiento fúngico y la familia de receptor de glutamato metabotrópico.

Los GPCR similares a secretina incluyen secretina [2], calcitonina [3], hormona paratiroidea/péptidos relacionados con la hormona paratiroidea [4] y péptido intestinal vasoactivo [5], todos los cuales activan la adenililo ciclasa y la vía de fosfatidilo-inositol-calcio. Las secuencias de aminoácidos de los receptores contienen altas proporciones de restos hidrófobos agrupados en 7 dominios, de un modo que recuerda a las rodopsinas y otros receptores que se cree que interactúan con las proteínas G. Sin embargo, aunque se ha propuesto que esto se debe a una estructura en 3D similar, no hay una similitud de secuencia significativa entre estas familias: por lo tanto, los receptores similares a secretina portan su firma de "7TM" única.

El polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) desempeñan un papel importante en la regulación de la secreción de insulina postprandial y la expresión del gen de proinsulina de las células beta pancreáticas [6]. El receptor de GIP humano codifica una proteína de 7TM que es similar al receptor del péptido 1 similar a glucagón humano (GLP-1). Se espera que la comprensión de la regulación del receptor de GIP y de la transducción de señales arroje luz sobre la incapacidad de la hormona para ejercer su acción biológica en las células B pancreáticas en la diabetes mellitus de tipo II. GIPRECEPTOR es una huella de 11 elementos que proporciona una firma para receptores de polipéptido inhibidor gástrico. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 3 secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan la longitud completa del alineamiento, centrándose en aquellas secciones que caracterizan los receptores de polipéptido inhibidor gástrico, pero lo distinguen del resto de la superfamilia similar a secretina - los motivos 1-6 abarcan el dominio N- terminal; el motivo 7 se encuentra en el bucle entre los dominios 2 y 3 TM; el motivo 8 abarca el bucle entre los dominios 3 y 4 TM; el motivo 9 abarca la parte C-terminal del dominio 6 TM y

el bucle entre los dominios 4 y 5 TM; y los motivos 10 y 11 se encuentran en el extremo C- terminal. Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola interacción en SPTR37 9f, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de inicio. También se encontraron dos coincidencias parciales, receptores de secretina y glucagón, que coinciden con los motivos 1, 8 y 9.

GIPRECEPTOR7

21

Motivo VII de precursor de receptor de polipéptido inhibidor gástrico -1 PTLGPYPGDRTLTLRNQALAA GIPR_MESAU 192 56

PPLGPYTGNQTPTLWNQALAA GIPR_RAT 192 56 56

PRPGPYLGDQALALWNQALAA GIPR HUMAN 195

PRION

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Distribuido libremente bajo la licencia pública general GNU (GPL) Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.148

PRION_2: dominio 1 de 1, de 68 a 89: puntuación 5,4, E = 8,6

*">gngggsrypgqGSPf5GNRlí Ppcj<-*

rhsu.ef. 24

£6

+ íH-p +G PGG R P LATTLCRP PRPGPPGGFRTPQT

89

rheu.ef.238rev.148

PRION_2: dominio 1 de 1, de 68 a 89: puntuación 5,4, E = 8,6

+ ->sngggs rypgqGS PGCNRY Ppq<-*

+ r+p +G PGG R P

rheu.ef.23 68 LATTLGRPPRFGPPGGPRTPQI 39

gc; PRION

gx; PR00341

gn; COMPUESTO(8)

ga; 19-OCT-1992; ACTUALIZADO 07-JUN-1999

gt; Firma de proteína prion

gp; INTERPRO; IPR000817

gp; PROSITE; PS00291 PRION_1; PS00706 PRION_2

gp; PFAM; PF00377 prion

gr; 1. STAHL, N. Y PRUSINER, S.B.

gr; Prions and prion proteins.

gr; FASEB J. 5 2799-2807 (1991).

gr; 2. BRUNORI, M., CHIARA SILVESTRINI, M. Y POCCHIARI, M.

gr; The scrapie agent and the prion hypothesis.

gr; TRENDS BIOCHEM.SCI. 13 309-313 (1988).

gr; 3. PRUSINER, S.B.

gr; Scrapie prions.

gr; ANNU.REV.MICROBIOL. 43 345-374 (1989).

gd; La proteína prion (PrP) es una glucoproteína pequeña encontrada en alta cantidad en el gd; cerebros de animales infectados con ciertas enfermedades neurológicas degenerativas, gd; tales como el tembleque de las ovejas y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) y las gd; demencias humanas, la enfermedad de Creutfeldt-Jacob (CJD) y el síndrome de

gd; Gerstmann-Straussler (GSS). PrP se codifica en el genoma del hospedador y se expresa en

gd; células tanto normales como infectadas. Durante la infección, sin embargo, las moléculas gd; de PrP se alteran y polimerizan, produciendo fibrillas de proteína PrP modificada.

gd; Se han encontrado moléculas de PrP en la superficie externa de las membranas

gd; plasmáticas de células nerviosas, a las que se anclan a través de un glucolípido unido

gd; covalentemente, lo que sugiere un papel como receptor de membrana. PrP también se

gd; expresa en otros tejidos, lo que indica que puede tener diferentes funciones, dependiendo gd; de su ubicación.

gd; Las secuencias primarias de las PrP de diferentes fuentes son altamente similares: todas gd; portan un dominio N-terminal que contiene múltiples repeticiones en tándem de un

gd; octapéptido rico en Pro/Gly; sitios de glucosilación unidos a Asn; un enlace disulfuro

gd; esencial; y 3 segmentos hidrófobos. Estas secuencias muestran cierta similitud con una gd; glucoproteína de pollo, que se cree que es una molécula inductora de actividad de receptor gd; de acetilcolina (ARIA). Se ha sugerido que los cambios en la región de repetición del

gd; octapéptido pueden indicar una predisposición a enfermedades, pero no se sabe a ciencia

gd; cierta si la repetición puede usarse de manera significativa como huella para indicar gd; susceptibilidad.

gd; PRION es una huella de 8 elementos que proporciona una firma para las proteínas prion. La

gd; huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 5 secuencias: los motivos se representaron a

gd; partir de regiones conservadas que abarcan prácticamente la longitud completa del gd; alineamiento, incluyendo los 3 dominios hidrófobos y las repeticiones de octapéptido

gd; (WGQPHGGG). Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones en

gd; OWL18.0, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 9 gd; secuencias. También se encontraron varias coincidencias parciales: estas incluyen un

gd; fragmento (PRIO_RAT) que carece de parte de la secuencia que porta el primer motivo y el gd; homólogo de PrP encontrado en pollos - este se empareja bien con solo 2 de los 3 motivos

gd; hidrófobos (1 y 5) y una de las otras regiones conservadas (6), pero tiene una firma N-

gd; terminal basada en una repetición de sextapéptido (YPHNPG) en lugar del octapéptido gd; característico de PrP.

5

c;: PRION2

fl;: 22

ft;: Motivo II de proteína prion - 2

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO COLGU 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO MACFA 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CEREL 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO ODOHE 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO GORGO 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO PANTR 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO HUMAN 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ 046648 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO SHEEP 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CALJA 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO BOVIN 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRP2 BOVIN 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO ATEPA 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO SAISC 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO PREFR 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO PONPY 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ 075942 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CAPHI 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNLYPPQ PRIO CEBAP 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CAMDR 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO FELCA 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPSQ PRP1 TRAST 34 9

fd: WNTGGSRYPGQSSPGGNRYPPQ PRIO RABIT 32 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRP2 TRAST 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO PIG 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CANFA 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CRIGR 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CRIMI 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ Q15216 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO RAT 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO CERAE 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO MUSPF 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO MUSVI 34 9

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO MESAU 31 8

fd: WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ PRIO MOUSE 31 8

fd: NTGGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ 046593 34 9

fd: SGGSNRYPGQPGSPGGNRYPGW PRIO TRIVU 37 12

bb;

NEUROTENSINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.ef.241.148

NEUROTENSN2R_1: dominio 1 de 1, de 68 a 80: puntuación 6,8, E = 8,7

*->mEtsspwPPRPsp<-*

+■ t + PPR.P p

rheu.ef.24 68 LATTLGRPFRPGP 80

rheu.ef.238rev.148

NEUROTENSN2R_1: dominio 1 de 1, de 68 a 80: puntuación 6,8, E = 8,7

*->mEtsspwPPRPsp<-*

+ t h-pprp p

rheu.ef.23 68 LATTLGRPPRPGP 80

c; NEUROTENSN2R

gx; PR01481

gn; COMPUESTO(6)

ga; 12-MAR-2001

gt; Firma de receptor de tipo 2 de neurotensina

gp; PRINTS; PR00237 GPCRRHODOPSN; PR00247 GPCRCAMP; PR00248 GPCEIMGR gp; PRINTS; PR00249 GPCRSECRETIN; PR00250 GPCRSTE2; PR00899 GPCRSTE3 gp; PRINTS; PR00251 BACTRLOPSIN

gp; PRINTS; PR01479 NEUROTENSINR; PR01480 NEUROTENSN1R

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gd; Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia de

gd; proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos

gd; procesos autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable

gd; diversidad a nivel de secuencia, que puede usarse como base para separarlas en

gd; distintos grupos. Se usa el término clan para describir las GPCR, ya que abarcan

gd; un grupo de familias para las que hay indicaciones de relación evolutiva, pero

gd; entre las cuales no hay una similitud estadísticamente significativa en su secuencia

gd; [1,2]. Los miembros del clan conocidos en la actualidad incluyen las GPCR

gd; similares a rodopsina, las GPCR similares a secretina, los receptores de AMPc, los

gd; receptores de feromonas de emparejamiento fúngico y la familia de receptor de

gd; glutamato metabotrópico.

gd; Las GPCR similares a rodopsina representan por sí mismas una familia de gd; proteínas ampliamente diseminada que incluye receptores de hormonas, gd; neurotransmisores y de luz, todos los cuales transducen señales extracelulares gd; mediante su interacción con proteínas de unión a nucleótidos guanina (G). Aunque gd; sus ligandos activadores varían ampliamente en su estructura y carácter, las gd; secuencias de aminoácidos de los receptores son muy similares y se cree que gd; adoptan un armazón estructural común que comprende 7 hélices transmembrana gd; (TM) [3-5].

gd; La neurotensina es un transmisor peptídico de 13 restos, que comparte una gd; similitud significativa en sus 6 aminoácidos C-terminales con varios neuropéptidos gd; diferentes, incluyendo la neuromedina N. Esta región es responsable de la gd; actividad biológica, teniendo la porción N-terminal un papel modulador. La gd; neurotensina se distribuye por el sistema nervioso central, con niveles máximos en gd; el hipotálamo, la amígdala y el núcleo accumbens. Induce una serie de efectos, gd; incluyendo: analgesia, hipotermia y aumento de la actividad locomotora. También gd; está implicada en la regulación de las vías de dopamina. En la periferia, la gd; neurotensina se encuentra en células endocrinas del intestino delgado, donde gd; ocasiona secreción y contracción del músculo liso [6].

gd; La existencia de 2 subtipos de receptor de neurotensina, con diferentes afinidades gd; por la neurotensina y diferentes sensibilidades al antihistamínico levocabastina, se gd; demostró originariamente mediante estudios de unión en el cerebro de roedores. gd; Desde entonces, se han clonado dos receptores de neurotensina (NT1 y NT2) con gd; dichas propiedades y se ha descubierto que son miembros de la familia de gd; receptores acoplados a proteína G [7].

gd; El receptor NT2 se clonó de cerebros de rata, ratón y ser humano basándose en gd; su similitud con el receptor NT1. Se observó que el receptor es un receptor de baja gd; afinidad sensible a la levocabastina para neurotensina. A diferencia del receptor de gd; alta afinidad, NT1, NT2 es insensible al trifosfato de guanosina y tiene baja gd; sensibilidad por los iones sodio [7], Los mayores niveles de expresión del receptor gd; se encuentran en el cerebro, en regiones que incluyen: el sistema olfatorio, las gd; cortezas cerebral y cerebelar, el hipocampo y el núcleo hipotalámico. La gd; distribución es distinta a la del receptor NT1, expresándose ambos subtipos solo gd; en unas pocas áreas (banda diagonal de Broca, núcleo septal medial y núcleo gd; supraquiasmático) [7]. También se ha encontrado el receptor a niveles menores en gd; el riñón, útero, corazón y pulmón [8]. La activación del receptor NT2 por agonistas gd; no peptídicos sugiere que el receptor puede acoplarse a fosfolipasa C, fosfolipasa gd; A2 y MAP cinasa. Sin embargo, una respuesta funcional a la neurotensina es débil gd; [9] o está ausente y parece ser que la neurotensina actúa como antagonista del gd; receptor [8]. También se ha sugerido que una sustancia distinta de la neurotensina gd; puede actuar como ligando natural para este receptor [8]. gd; NEUROTENSN2R es una huella de 6 elementos que proporciona una firma para gd; los receptores de tipo 2 de neurotensina. La huella se obtuvo de un alineamiento gd; inicial de 3 secuencias: los motivos se representaron a partir de secciones gd; conservadas dentro del extremo N-terminal y las regiones de bucle, centrándose gd; en aquellas áreas del alineamiento que caracterizan los receptores de tipo 2 de gd; neurotensina, pero que los distinguen del resto de la familia de receptores de gd; neurotensina - los motivos 1 y 2 abarcan el extremo N-terminal; los motivos 3 y 4 gd; abarcan el segundo bucle externo; y los motivos 5 y 6 abarcan el tercer bucle gd; citoplásmico. Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola interacción en bb; SPTR39 15f, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de inicio.

fc; NEUROTENSN2R1 fl; 13

ft; Motivo I de receptor de tipo 2 de neurotensina -1

fd;: METSSPWPPRPSP NTR2 RAT 1 1

fd;: METSSLWPPRPSP NTR2 MOUSE 1 1

fd;: METSSPRPPRPSS NTR2 HUMAN 1 1

FIRMA DE LA FAMILIA DE RECEPTOR NUCLEAR HUÉRFANO (RECEPTOR NUCLEAR A4)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: uro742rev.1,780

NUCLEARECPTR_5: dominio 1 de 1, de 326 a 341: puntuación 7,2, E = 5 *-> PvnLlnaLVRAhvDSt P<-*

4 4 r-.44VFLfch4D+

uro142rev. 326 -TFITNSMVRAHTDAOk 341

gc; NUCLEARECPTR

gx; PRO 128 4 gn; COMPUESTO(11) ga; 16-FEB-2000

gt; Firma de la familia de receptor nuclear huérfano (receptor nuclear A4)

gp; PRINTS; PR00398 STRDHORMONER; PR00047 STROIDFINGER

gp; PRINTS; PR01285 HMRNUCRECPTR; PR01286 NORNUCRECPTR; PR01287 NURRNUCRCPTR

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gd; Los receptores de esteroides o de hormonas nucleares (NR) forman una superfamilia

gd; importante de reguladores de la transcripción que están implicados en funciones fisiológicas

gd; ampliamente diversas, incluyendo el control del desarrollo embrionario, la diferenciación celular

gd; y la homeostasia [1]. Los miembros de la superfamilia incluyen los receptores de hormonas

gd; esteroideas y los receptores para hormonas tiroideas, retinoides,

gd; 1,25-dihidroxi-vitamina D3 y varios ligandos diferentes. Las proteínas funcionan como

gd; moléculas diméricas en los núcleos para regular la transcripción de genes diana de una

gd; manera sensible al ligando [2,3]. Además de los dominios de unión a ligando C-terminales,

gd; estos receptores nucleares contienen un dedo de cinc N-terminal altamente conservado que

gd; media la unión específica a secuencias de ADN diana, denominados elementos sensibles a

gd; ligando. En ausencia de ligando, se cree que los recetores de hormonas esteroideas se

gd; asocian débilmente con componentes nucleares; la unión a hormonas aumenta en gran medida

gd; la afinidad del receptor.

gd; Los NR son extremadamente importantes en investigación médica, estando implicado un gran gd; número de estos en enfermedades tales como cáncer, diabetes, síndromes de resistencia a gd; hormonas, etc. [1]. Aunque varios NR actúan como factores de transcripción inducibles por

5

gd; ligando, muchos aún no tienen un ligando definido y por consiguiente, se les denomina

gd; receptores "huérfanos". Durante la última década, se han descrito más de 300 NR, muchos de

gd; los cuales se encuentran huérfanos, que no pueden nombrarse fácilmente debido a las

gd; confusiones de nomenclatura actual en la bibliografía. Sin embargo, recientemente se ha

gd; introducido un nuevo sistema en un intento de racionalizar el conjunto de nombres cada vez

gd; más complejo usado para describir a miembros de superfamilias [1].

gd; Los nuevos miembros de la superfamilia de receptores de esferoides, denominados

gd; NOR-1 (receptor huérfano derivado de neuronas) [4], Nurrl (factor 1 relacionado con Nur)

gd; [5] y NGFI-B [6] se han identificado a partir de células neuronales del cerebro anterior que

gd; sufren apoptosis, de la corteza cerebral y de pulmón, ganglios cervicales superiores y tejido

gd; suprarrenal, respectivamente. La proteína NOR-1 se une al elemento de respuesta a B1a, que

gd; se ha identificado como la secuencia diana de la familia Nur77, lo que sugiere que tres

gd; miembros de la familia Nur77 pueden transactivar genes diana comunes en diferentes

gd; situaciones [4]. El sarcoma de Ewing se caracteriza por traslocaciones cromosómicas que

gd; implican a la proteína NOR [7].

gd; NUCLEARECPTR es una huella de 11 elementos que proporciona una firma para la

gd; familia de receptores nucleares huérfanos. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de

gd; 11 secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan

gd; prácticamente la longitud completa del alineamiento, centrándose en aquellas secciones que

gd; caracterizan a miembros de la familia de receptores nucleares, pero que los distingue del resto

gd; de la superfamilia de receptores de hormonas esteroideas - los motivos 1-3 se encuentran en

gd; N-terminal respecto del dominio de dedo de cinc; los motivos 4 y 5 se encuentran entre los

gd; dedos de cinc y el supuesto dominio de unión a ligando; los motivos 6 y 7 codifican los

gd; extremos N y C-terminales del dominio de unión a ligando; y los motivos 8-11 se encuentran en

gd; el extremo C-terminal. Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola interacción en

gd; SPTR37_10f, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de inicio. Se

gd; encontraron varias coincidencias parciales, pareciendo ser todas ellas homólogos truncados en

gd; N o C-terminal.

fc; NUCLEARECPTR5

fl; 17

ft; Motivo V de la familia de receptor nuclear huérfano -1

fd: PANLLTSLVRAHLDSGP NR41 HUMAN 361 6

fd: PANLLTSLVRAHLDSGP NR4l CANFA 361 6

fd: PVSLISALVRAHVDSNP NR42 RAT 361 10

fd: PVSLISALVRAHVDSNP R4 2 MOUSE 361 10

fd: PVSLISALVRAHVDSNP NR4 2-HUMAN 361 10

fd: PTNLLTSLIRAHLDSGP NR41 RAT 360 6

fd: PTNLLTSLIRAHLDSGP NR4l MOUSE 364 6

fd: PVDLINSLVRAHIDSIP NR42 XENLA 340 6

fd: PVCMMNALVRALTDSTP 097726 412 15

fd: PICMMNALVRALTDSTP NR43 HUMAN 395 15

fd: PICMMNALVRALTDATP NR43 RAT 397 15

FACTOR NEUROTROFICO DERIVADO DE CEREBRO (BDN)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: uro742rev.1.780

BDNFACTOR_3: dominio 1 de 2, de 496 a 512: puntuación 3,1, E = 42 *-> PLLFLLtltYKn Y LüAAn<- *

PL LL Y YL4-

uro7¿2rev. 496 PLWALLNGYVDYLETQI 512

BDNFACTOR_3: dominio 2 de 2, de 690 a 706: puntuación 7,7, E = 5,7 *->PLLíLLE£YKnYLDAAn<-*

PLLFL EY+ AA

uro742rev. a 90 ELLFLPSF. YQRE DGAAE ^06

gc; BDNFACTOR

gx; PR01912

gn; COMPUESTO(5)

ga; 29-AUG-2008

gt; Firma de factor neurotrófico derivado de cerebro

gp; PRINTS; PR00268 NGF; PR01913 NGFBETA; PR01914 NEUROTROPHN3

gp; PRINTS; PR01915 NEUROTROPHN4; PR01916 NEUROTROPHN6

gp; PDB; 1BND; 1B8M

gp; SCOP; 1BND; 1B8M

gp; CATH; 1BND; 1B8M

gp; MIM; 113505

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gd; Durante el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados, muchas neuronas se vuelven gd; redundantes (debido a que han muerto, no han logado conectarse a células diana, etc.) y se gd; eliminan. Al mismo tiempo, las neuronas en desarrollo proyectan recrecimientos axónicos que gd; entran en contacto con sus células diana [1]. Dichas células controlan su grado de inervación gd; (el número de conexiones axónicas) mediante la secreción de diversos factores neurotróficos gd; que son esenciales para la supervivencia neuronal. Uno de estos es el factor de crecimiento gd; nervioso (NGF), que está implicado en la supervivencia de ciertas clases de neuronas gd; embrionarias (por ejemplo, neuronas simpáticas periféricas) [1]. NGF se encuentra gd; principalmente fuera del sistema nervioso central (SNC), pero pueden encontrarse pequeñas gd; cantidades residuales en tejidos del SNC de adultos, aunque se desconoce el papel fisiológico gd; de esto [1]; también se ha encontrado en varios venenos de serpiente [2,3]. Las proteínas gd; similares a NGF incluyen el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y las neurotrofinas gd; 3 a 7, todas las cuales han demostrado actividades de supervivencia y recrecimiento gd; neuronal.

gd; Originariamente purificado a partir de cerebro de cerdo [4], la neurotrofina BDNF se expresa gd; en una serie de tejidos y tipos celulares en el SNC y la periferia. Ejerce sus efectos uniéndose gd; al receptor de tirosina cinasa neurotrófico de tipo 2 (NTRK2; también denominado TrkB) y al gd; receptor de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad, p75NTR. Aunque este último gd; receptor media las funciones promotoras de la supervivencia de las neurotrofinas, se ha gd; demostrado que la activación de p75NTR por BDNf promueve la apoptosis e inhibe el gd; crecimiento axonal [5].

gd; El BDNF es un regulador clave de la plasticidad sináptica y desempeña un papel importante gd; en el aprendizaje y la memoria [6]. Diversos indicios sugieren que también está implicado en gd; el control de la ingesta de alimento y el peso corporal [7]. Una serie gd; de estudios clínicos ha demostrado una asociación entre los niveles aberrantes de BDNF y gd; trastornos y patologías, tales como depresión, epilepsia, trastorno bipolar, enfermedad de gd; Parkinson y enfermedad de Alzheimer [8].

gd; BDNFACTOR es una huella de 5 elementos que proporciona una firma para el factor gd; neurotrófico derivado de cerebro. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 33 gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan gd; prácticamente la longitud completa del alineamiento - el motivo 1 incluye parte de la secuencia gd; de señal. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron tres interacciones en SPTR55 38f, gd; punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 47 secuencias. También gd; se encontró una sola coincidencia parcial de humano, Q6YNR1 HUMAN, una variante de gd; corte y empalme de BDNF humano que no coincide con los motivos 4 y 5. fc; BDNFACTOR3 fl; 17

ft; Motivo III de factor de crecimiento neurotrófico derivado de cerebro - 3

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A2AII2 MOUSE 115 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8CCH9 MOUSE 107 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q6YNR3 HUMAN 113 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q6YNR2 HUMAN 120 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q598Q1 HUMAN 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q541P3 MOUSE 107 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF URSML 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF URSAR 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF SPECI 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF SELTH 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF RAT 107 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF PROLO 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF PIG 110 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF PANTR 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF MOUSE 107 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF HUMAN 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF FELCA 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF CANFA 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF BOVIN 108 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF AILME 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF AILFU 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A7LA92 HUMAN 187 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A7LA85 HUMAN 134 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF CAVPO 113 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF HORSE 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8VHH4 MOUSE 107 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q6DN19 HUMAN 105 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF LIPVE 106 31

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF CHICK 104 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8AV78 NIPNI 104 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q4JHT7 POEGU 104 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A4L7M3 BOMOR 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q63ZM5 XENLA 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A3FPG9 XENTR 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8QG75 9SAUR 104 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8QG76 9SAUR 104 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A4L7M4 9SALA 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A4L7M5 SALSL 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN A2ICR4 AMBME 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8QG77 9SALA 105 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q6NZ01 DANRE 128 47

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q9YH42 DANRE 128 47

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8JGW4 PAROL 127 48

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q06B76 DICLA 127 48

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF CYPCA 128 47

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN Q8QG74 9SAUR 104 30

fd: PLLFLLEEYKNYLDAAN BDNF XIPMA 127 48

CALCITONINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: uro742rev.154

CALCHONINR_2: dominio 1 de 1, de 91 a 108: puntuación 6,0, E = 9,4 *->kCYDRmqqLPpYeGEGpY<-*

R+ LP+Y GEGp

uro742rev. 91 TPVRRLLPLPSYPGEGPQ 108

CALCITONINR_2: dominio 1 de 1, de 72 a 89: puntuación 6,0, E = 9,4 *->kCYDRmqqLPpYeGEGpY<-*

R+ LP+Y GEGp

zc37.B9.2d 72 TPVRRLLPLPSYPGEGPQ 89

gc; CALCITONINR

gx; PR00361

gn; COMPUESTO(6)

ga; 15-ABR-I995; ACTUALIZADO 06-JUN-1999 gt; Firma de receptor de calcitonina

gp; PRINTS; PR01350 CTRFAMILY; PR01351 CGRPRECEPTOR

gp; INTERPRO; IPR001688

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ISHIHARA T., NAKAMURA S., KAZIRO, Y., TAKAHASHI, T., TAKAHASHI, gr; K. Y NAGATA, S.

gr; Molecular cloning and expression of a cDNA encoding the secretin receptor. gr; EMBO J. 10 1635-1641 (1991).

gr; 3. LIN, H.Y., HARRIS, T.L., FLANNERY, M.S., ARUFFO, A., KAJI, E.H., GORN, A., gr; KOLAKOWSKI, L.F., LODISH, H.F. Y GOLDRING, S.R. gr; Expression cloning of adenylate cyclase-coupled calcitonin receptor. gr; SCIENCE 254 1022-1024 (1991).

gr; 4. JUEPPNER, H., ABOU-SAMRA, A.-B., FREEMAN, M., KONG, X.F., SCHIPANI, E., RICHARDS,

gr; J., KOLALOWSKI, L.F., HOCK, J., POTTS, J.T., KRONENBERG, H.M. Y SEGRE, G.E.

gr; A G protein linked receptor for parathyroid hormone and parathyroid

gr; hormone-related peptide.

gr; SCIENCE 254 1024-1026 (1991).

gr; 5. ISHIHARA, T., SHIGEMOTO, R., MORI, K., TAKAHASHI, K. Y NAGATA, S.

gr; Functional expression and tissue distribution of a novel receptor for

gr; vasoactive intestinal polypeptide.

gr; NEURON 8(4) 811-819 (1992).

gr; 6. WATSON, S. Y ARKINSTALL, S.

gr; Calcitonin.

gr; EN THE G PROTEIN-LINKED RECEPTOR FACTSBOOK, ACADEMIC PRESS, 1994, PP.74-76.

gr; 7. NJUKI, F., NICHOLL, C.G., HOWARD, A., MAK, J.C., BARNES, P.J., gr; GIRGIS, S.I. Y LEGON, S.A.

gr;

gr; A new calcitonin-receptor-like sequence in rat pulmonary blood vessels. CLIN.SCI. 85(4) 385-388 gr; (1993).

gd; Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia de gd; proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos procesos gd; autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable diversidad a nivel de gd; secuencia, que puede usarse como base para separarlas en distintos grupos. Se usa

gd; el término clan para describir las GPCR, ya que abarcan un grupo de familias para las

gd; que hay indicaciones de relación evolutiva, pero entre las cuales no hay una similitud gd; estadísticamente significativa en su secuencia [1]. Los miembros del clan conocidos

gd; en la actualidad incluyen las GPCR similares a rodopsina, las GPCR similares a

gd; secretina, los receptores de AMPc, los receptores de feromonas de emparejamiento gd; fúngico y la familia de receptor de glutamato metabotrópico. gd; Los GPCr similares a secretina incluyen secretina [2], calcitonina [3], hormona gd; paratiroidea/péptidos relacionados con la hormona paratiroidea [4] y péptido intestinal

gd; vasoactivo [5], todos los cuales activan la adenililo ciclasa y la vía de fosfatidilo-

gd; inositol-calcio. Las secuencias de aminoácidos de los receptores contienen altas gd; proporciones de restos hidrófobos agrupados en 7 dominios, de un modo que gd; recuerda a las rodopsinas y otros receptores que se cree que interactúan con las gd; proteínas G. Sin embargo, aunque se ha propuesto que esto se debe a una estructura gd; en 3D similar, no hay una identidad de secuencia significativa entre estas familias: por gd; lo tanto, los receptores similares a secretina portan su firma de "7TM" única. gd; El papel fisiológico principal de la calcitonina es inhibir la resorción ósea, gd; ocasionando por tanto una reducción en el Ca++ plasmático [6]. Además, mejora la

gd; excreción de iones en el riñón, previene la absorción de iones en el intestino e inhibe

gd; la secreción en células endocrinas (por ejemplo, páncreas y pituitaria). En el SNC, se gd; ha comunicado que la calcitonina es analgésica y que suprime la alimentación y la gd; secreción de ácidos gástricos. Se usa para tratar la enfermedad de Paget del hueso. gd; Los receptores de calcitonina se encuentran principalmente en los osteoclastos o en

gd; estirpes celulares inmortales procedentes de estas células. Se encuentra en

gd; cantidades menores en el cerebro (por ejemplo, en los tejidos hipotalámicos y gd; pituitarios) y en tejidos periféricos (por ejemplo, testículos, riñón, hígado y linfocitos).

gd; También se ha descrito en estirpes celulares de cáncer de pulmón y de mama. La vía

gd; de señalización predominante es la activación de la adenililo ciclasa mediante G, pero gd; también se ha descrito que la calcitonina tiene acciones tanto estimuladoras como gd; inhibidoras en la vía del fosfoinosítido.

gd; CALCITONINR es una huella de 6 elementos que proporciona una firma para los gd; receptores de calcitonina. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 6 gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de secciones conservadas dentro de gd; cada bucle o las regiones TM, centrándose en aquellas áreas del alineamiento que

gd; caracterizan los receptores de calcitonina, pero que los distinguen del resto de la

gd; familia similar a secretina - los motivos 1-3 se representaron a partir de la región N- gd; terminal que da lugar al primer dominio TM; el motivo 4 se encuentra en el extremo C-

gd; terminal del segundo dominio TM después de la región de bucle; el motivo 5 es N-

gd; terminal respecto de la séptima región TM; y el motivo 6 se representó a partir del gd; extremo C-terminal. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones

gd; en OWL25.2, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 9

gd; secuencias. También se encontró una sola coincidencia parcial de humano, RNCLR, gd; un nuevo receptor similar a calcitonina de los vasos sanguíneos pulmonares de rata gd; [7].

fc; CALCITONINR2

fl; 18

ft; Motivo II de receptor de calcitonina - 2

fd: KCYDRIQQLPPYEGEGPY CALR RAT 54 1

fd: KCYDRMEQLPPYQGEGPY CALR RABIT 54 1

fd: KCYDRMQQLPAYQGEGPY CALR HUMAN 54 1

fd: KCYDRIHQLPSYEGEGLY CALR MOUSE 54 1

fd: RCYDRMQQLPPYEGEGPY CALR CAVPO 54 1

fd: RCYDRMQKLPPYQGEGLY CALR PIG 55 1

RECEPTOR DE TIPO 1 DE LEUCOTRIENO B4

BLKPROB Versión 5/21/00.1

Base de datos=/gcg/husar/gcgdata/gcgblimps/blocksplus.dat

En caso de que use BLOCKS en su investigación, sírvase de citar:

5

10

15

20

25

30

35

Steven Henikoff y Jorja G. Henikoff, Protein Family Classification Based on Searching a Database

of Blocks, Genomics 19:97-107 (1994).

Cada resultado numerado consiste en uno o más bloques de un grupo PROSITE o PRINTS encontrado en la secuencia de búsqueda. Se selecciona para su análisis un conjunto de los bloques de mayor puntuación que se encuentran en el orden correcto y separados por distancias comparables a la base de datos BLOCKS. En caso de que este conjunto incluya múltiples bloques, se anota la probabilidad de que los bloques de menor puntuación soporten al bloque de mayor puntuación. Se muestran los mapas de los bloques de la base de datos y la secuencia de búsqueda:

< indica que se ha truncado la secuencia para que quepa en la página : indica la distancia mínima entre bloques en la base de datos . indica la distancia máxima entre bloques en la base de datos Los mapas se alinean con el bloque de mayor puntuación. Se muestra el alineamiento de la secuencia de búsqueda con la secuencia más próxima a esta en la base de datos BLOCKS. Las mayúsculas en la secuencia de búsqueda indican al menos una aparición del resto en esa columna del bloque.

Búsqueda=uro705rev.1a.74 Longitud: 74 Tipo: P C

Tamaño=74 aminoácidos

Bloques buscados=29068

Alineamientos efectuados= 2896529

Valor de corte combinado esperado para coincidencias= 0

Valor de corte esperado de bloque para repeticiones/otros= 0

Familia Hebra

IPB003983 Señal de receptor de tipo 1 de leucotrieno B4 1

Bloques Valor de E combinado 1 de 6 0,0042

>IPB003983 1/6 bloques Valor de E combinado= 0,0042: Firma de receptor de tipo 1 de leucotrieno B4 Bloque Marco Ubicación (aa) Valor de E de bloque

IPB003983C 0 25-41 0. 0046

Otros alineamientos comunicados:

|— 141 aminoácidos—|

IPB003983 AAA::::BBi:::::::::::::::::::::::::CCC:::DDD:::::::::.EEEFF uro705rev.la.74_12 ::::CCC

IPB003983C <->C (202,207):24

Q9WTK1IQ9WTK1CAVPO207 SRRLRVRRFHRRRRTGR

"" I I I I I I I I I I I

uro70Srev.la.74 12 25 lRRrRpRRplRRRRrGR

rheu.cd.215rev.1.736

>IPB003983 1/6 bloques Valor de E combinado= 0,0094: Firma de receptor de tipo 1 de leucotrieno B4 Bloque Marco Ubicación (aa) Valor de E de bloque

IPB003983C 0 28-44 0,0096

Otros alineamientos comunicados: | 141 aminoácidos |

IPBÜ03 983: AAA:::

rheu.cd.215rev.1.7

IPB00398 3C: <->c

LT4R1 RATIQ9R0Q2: 206

rheu.cd.215rev.1.7: 28

BB::::::::::::::::

(202,207):27 GRRLQARRFRRSRRTGR II I I I I I II I rRRrpARRFRaRRRvrR

zpr5.B4.12dk.209 Longitud: 209 Tipo: P

Familia Hebra

IPB003983 Señal 1 de receptor de tipo 1 de leucotrieno B4

CCC:

CCC

Bloques 1 de 6

: DDD

Valor de E

combinado

0,0078

EEEFF

zpr5.B4.12dk

>IPB003983 1/6 bloques Valor de E combinado= 0,0078: Firma de receptor de tipo 1 de leucotrieno B4 Bloque Marco Ubicación (aa) Valor de E bloque

IPB003983C 0 32-48 0,0081

Otros alineamientos comunicados:

|—141 aminoácidos—|

IPB003983 AAA::::BBi::::;:::::::;:: zpr5.B4.12dk•209 ^

IPB003983C <->C (202,207):31

Q9WTK1. |Q9WTKl_CAVPO207 SRRLRVRRFFiRRRRTGR

II..........................

zpr5.B4.12 d k. 2 09_2 32 rRRpRrRRvRRRRRwrR

imagen3

: DDD

.EEEFF

5

10

15

AUTOANTÍGENO 1 DE SÍNDROME DE SJOGREN/ESCLERODERMIA (AUTOANTÍGENO P27)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: pfam.hrn'm

Archivo de secuencia: rheu.cd.211rev.164

Auto_anti-p27: dominio 1 de 1, de 117 a 156: puntuación -12,1, E = 4,6

*->ei.skkmaelLlkGatMLdehCpkCGtPLFrlKdGkvfCPiCe<-*

+ ++ +++ 1 + L++ + kC + +r + Gk fC +Ce

rheu.cd.21 117 HT-AVKGQFGLGTGRALGKALKKCAFAGLR-RKGKCFCKVCE 156

#=GF ID Auto anti-p27

#=GF AC PF06677.4

#=GF DE Autoantígeno 1 de síndrome de Sjogren/esclerodermia (Autoantígeno p27)

#=GF AU Moxon SJ

#=GF SE Pfam-B 21881 (compilación 10.0)

#=GF TP Familia #=GF RN [1]

#=GF RM 9486406

#=GF RT cDNA cloning of a novel autoantigen targeted by a minor subset #=GF RT of anti-centromere antibodies.

#=GF RA Muro Y, Yamada T, Himeno M, Sugimoto K;

#=GF RL Clin Exp Immunol 1998;111:372-376.

#=GF DR INTERPRO; IPR009563;

#=GF CC Esta familia consiste en varias secuencias de autoantígeno 1 de #=GF CC síndrome de Sjogren/esclerodermia (Autoantígeno p27). Se cree que la #=GF CC potencial asociación de anti-p27 con anticuerpos anti-centrómero #=GF CC sugiere que el autoantígeno p27 puede desempeñar un papel en la #=GF CC mitosis [1].

VASOPRESINA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: uro742rp.l32

VASOPRSNV2R_6: dominio 1 de 1, de 7 a 26: puntuación 7,4, E = 9,1

*->RaGgrRrGrRtGsPsEGArv<-*■

R rRrG t s sE A

uro742rp.1 7 RNASRRRGSSTASTSEEASL 26

VASOPRSNV2R_6: dominio 1 de 1, de 7 a 26: puntuación 7,4, E = 9,1

*->RaGgrRrGrRtGsPsEGArv<-*

R rRrG t s sE A

ze37.B9.10 7 RNASRRRGSSTASTSEEASL 26

VASOPRSNV1 BR_4: dominio 1 de 1, de 130 a 149: puntuación 3,0, E = 7,1

*->TQAgRverrGWRTWDksSsS<-*

Q +■ +e R WD++

zc3Ss.B2.9 130 AQDWAEEYTACRYWDRPPRT 149

gc; VASOPRSNV2R

gx; PR00898

gn; COMPUESTO(8)

ga; 15-APR-1998; ACTUALIZADO 07-JUN-1999 gt; Firma de receptor V2 de vasopresina

gp; PRINTS; PR00237 GPCRRHODOPSN; PR00247 GPCRCAMP; PR00248 GPCRMGR

gp; PRINTS; PR00249 GPCRSECRETIN; PR00250 GPCRSTE2; PR00899 GPCRSTE3

gp; PRINTS; PR00251 BACTRLOPSIN PRINTS; PR00896 VASOPRESSINR

gp; PRINTS; PR00752 VASOPRSNV1AR; PR00897 VASOPRSNV1BR; PR00665 OXYTOCINR

gp; INTERPRO; IPR000161

gp; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; G protein-coupled receptor fingerprints.

gr; 7TM, VOLUMEN 2, EDS. G.VRIEND Y B.BYWATER (1993).

gr; 3. BIRNBAUMER, L.

gr; G proteins in signal transduction.

gr; ANNU.REV.PHARMACOL.TOXICOL. 30 675-705 (1990).

gr; 4. CASEY, P.J. Y GILMAN, A.G.

gr; G protein involvement in receptor-effector coupling.

gr; J.BIOL.CHEM. 263(6) 2577-2580 (1988).

gr; 5. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Design of a discriminating fingerprint for G protein-coupled receptors. gr; PROTEIN ENG. 6(2) 167-176 (1993). gr; 6. WATSON, S. Y ARKINSTALL, S. gr; Vasopressin and oxytocin.

gr; EN THE G PROTEIN-LINKED RECEPTOR FACTSBOOK, ACADEMIC PRESS, 1994, PP.284-291.

gr; Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia de gd; proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos gd; procesos autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable gd; diversidad a nivel de secuencia, que puede usarse como base para separarlas en gd; distintos grupos. Se usa el término clan para describir las GPCR, ya que abarcan

gd; entre las cuales no hay una similitud estadísticamente significativa en su gd; secuencia [1,2]. Los miembros del clan conocidos en la actualidad incluyen las gd; GPCR similares a rodopsina, las GPCR similares a secretina, los receptores de gd; AMPc, los receptores de feromonas de emparejamiento fúngico y la familia de gd; receptor de glutamato metabotrópico.

gd; Las GPCR similares a rodopsina representan por sí mismas una familia de proteínas gd; ampliamente diseminada que incluye receptores de hormonas, neurotransmisores y gd; de luz, todos los cuales transducen señales extracelulares mediante su interacción

gd; con proteínas de unión a nucleótidos guanina (G). Aunque sus ligandos activadores

gd; varían ampliamente en su estructura y carácter, las secuencias de aminoácidos de gd; los receptores son muy similares y se cree que adoptan un armazón estructural gd; común que comprende 7 hélices transmembrana (TM) [3-5]. gd; La vasopresina y la oxitocina son miembros de la familia de hormonas gd; neurohipofisarias encontradas en todas las especies de mamífero [6]. Están gd; presentes a altos niveles en la pituitaria posterior. La vasopresina tiene un papel

gd; esencial en el control del contenido de agua en el organismo, actuando en el riñón

gd; para aumentar la absorción de agua y sodio [6]. A concentraciones mayores, la gd; vasopresina estimula la contracción del músculo liso vascular, estimula la gd; degradación del glucógeno en el hígado, induce la activación de plaquetas y gd; desencadena la liberación de corticotrofina de la pituitaria anterior [6]. La vasopresina gd; y sus análogos se usan en la práctica clínica para tratar la diabetes insípida [6]. gd; El receptor V2 se encuentra a altos niveles en los epitelios osmorreguladores del gd; tracto urinario terminal, donde estimula la reabsorción de agua [6]. También se gd; encuentra presente a niveles menores en el endotelio y los vasos sanguíneos de gd; algunas especies, donde induce vasodilatación [6]. En el SNC, se encuentran sitios gd; de unión en el subículo, con niveles menores en el caudado-putamen y en las islas

gd; de Calleja [6]. El receptor está implicado en una vía efectora que forma AMPc

gd; mediante la activación de G [6].

gd; VASOPRSNV2R es una huella de 8 elementos que proporciona una firma para gd; receptores de vasopresina V2. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 4 gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de secciones cortas conservadas gd; que abarcan la longitud completa del alineamiento, centrándose en aquellas regiones gd; que caracterizan a los receptores V2 de vasopresina pero que los distinguen del gd; resto de la familia de vasopresina - los motivos 1 y 2 se encuentran en el extremo N- gd; terminal; el motivo 3 abarca el primer bucle citoplasmático; el motivo 4 abarca el gd; segundo bucle citoplásmico; los motivos 5 y 6 abarcan el tercer bucle citoplásmico; y

gd; los motivos 7 y 8 se encuentran en el extremo C-terminal. Para alcanzar la

gd; convergencia se necesitó una sola interacción en OWL30.1, sin identificar secuencias gd; adicionales más allá del conjunto de inicio. fc; VASOPRSNV2R6 fl; 20

ft; Motivo VI de receptor V2 de vasopresina - 2

fd: RAGRRRRGHRTGSPSEGAHV 088721 243 2

fd: RAGRRRRGRRTGSPSEGAHV V2R RAT 243 2

fd: RAGGHRGGRRAGSPREGARV V2R PIG 242 2

fd: RPGGRRRGRRTGSPGEGAHV V2R HUMAN 243 2

fd: RAGGCRGGHRTGSPSEGARV 077808 242 2

fd: RAGGPRRGCRPGSPAEGARV 2R BOVIN 242 2

gc; VASOPRSNV1BR

gx; PR00897

gn; COMPUESTO(9)

ga; 15-APR-1998; ACTUALIZADO 07-JUN-1999

gt; Firma de receptor V1B de vasopresina

gp; PRINTS; PR00237 GPCRRHODOPSN; PR00247 GPCRCAMP; PR00248 GPCRMGR gp; PRINTS; PR00249 GPCRSECRETIN; PR00250 GPCRSTE2; PR00899 GPCRSTE3 gp; PRINTS; PRO0251 BACTRLOPSIN

gp; PRINTS; PR00896 VASOPRESSINR

gp; PRINTS; PR00752 VASOPRSNV1AR; PR00898 VASOPRSNV2R; PR00665 OXYTOCINR

gp; INTERPRO; IPR000628

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; G protein-coupled receptor fingerprints.

gr; 7TM, VOLUMEN 2, EDS. G.VRIEND Y B.BYWATER (1993).

gr; 3. BIRNBAUMER, L.

gr; G proteins in signal transduction.

gr; ANNU.REV.PHARMACOL.TOXICOL. 30 675-705 (1990).

gr; 4. CASEY, P.J. Y GILMAN, A.G.

gr; G protein involvement in receptor-effector coupling.

gr; J.BIOL.CHEM. 263(6) 2577-2580 (1988).

gr; 5. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Design of a discriminating fingerprint for G protein-coupled receptors. gr; PROTEIN ENG. 6(2) 167-176 (1993).

gr; 6. WATSON, S. Y ARKINSTALL, S.

gr; Vasopressin and oxytocin.

gd; VASOPRSNV1BR es una huella de 9 elementos que proporciona una firma para receptores

gd; de vasopresina V1B. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 3 secuencias: los

gd; motivos se representaron a partir de secciones cortas conservadas que abarcan la longitud

gd; completa del alineamiento, centrándose en aquellas regiones que caracterizan a los

gd; receptores V1B de vasopresina pero que los distinguen del resto de la familia de

gd; vasopresina - el motivo 1 se encuentra en el extremo N-terminal; el motivo 2 se encuentra

gd; en el segundo bucle citoplásmico; el motivo 3 se encuentra en el segundo bucle externo; los

gd; motivos 4 y 5 abarcan el tercer bucle citoplásmico; el motivo 6 se encuentra en el tercer

gd; bucle externo; y los motivos 7-9 se encuentran en el dominio C-terminal. Para alcanzar la

gd; convergencia se necesitó una sola interacción en OWL30.1, sin identificar secuencias

gd; adicionales más allá del conjunto de inicio.

fc; VASOPRSNV1BR4

fl; 20

ft; Motivo IV de receptor V1B de vasopresina - 2

fd; TQAWRVGGGGWRTWDRPSPS V1BR_HUMAN 234 48

fd; TQAGREERRGWRTWDKSSSS V1BR_RAT 234 48

FIRMA DE RECEPTOR 2 DE HORMONA CONCENTRADORA DE MELANINA HMMER 2.3.2 (Oct 2003) Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of Medicine Distribuido libremente bajo la licencia pública general GNU (GPL)

Archivo HMM: prints.hmm

5 Archivo de secuencia: uro742rp.133

MCH2RECEPTOR_5: dominio 1 de 1, de 69 a 86: puntuación 5,9, E = 7,1

*->LvqPFRLtrWRtRYKtiRin<-*

PF +t+WRt + + n

uro7 42rp.1 69 —RPFCITKWRTSFLFFKNN 86

gc; MCH2RECEPTOR

gx; PR01784

gn; COMPUESTO(9)

ga; 25-SEP-2002

gt; Firma de receptor 2 de hormona concentradora de melanina

gp; PRINTS; PR01507 MCH1RECEPTOR; PR01783 MCHRECEPTOR

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; G protein-coupled receptor fingerprints.

gr; 7TM, VOLUMEN 2, EDS. G.VRIEND Y B.BYWATER (1993).

gr; 3. BIRNBAUMER, L.

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gr; ANNU.REV.PHARMACOL.TOXICOL. 30 675-705 (1990).

gr; 4. CASEY, P.J. Y GILMAN, A.G.

gr; G protein involvement in receptor-effector coupling.

gr; J.BIOL.CHEM. 263(6) 2577-2580 (1988).

gr; 5. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; 6. CHAMBERS, J., AMES, R.S., BERGSMA, D., MUIR, A., FITZGERALD, L.R., gr; HERVIEU, G., DYTKO, G.M., FOLEY, J.J., MARTIN, J., LIU, W.S., PARK, J., ELLIS, gr; C., GANGULY, S., KONCHAR, S., CLUDERAY, J., LESLIE, R., WILSON, S. AND gr; SARAU, H.M.

gr; Melanin-concentrating hormone is the cognate ligand for the orphan G gr; protein-coupled receptor SLC-1. gr; NATURE 400 261-265 (1999).

gr; 7. SAITO, Y., NOTHACKER, H.-P., WANG, Z., LIN, S.H.S., LESLIE, F. Y gr; CIVELLI, O.

gr; Molecular characterization of the melanin-concentrating-hormone receptor. NATURE 400 265-269 gr; (1999).

gr; 8. SAITO, Y., NOTHACKER, H.-P. Y CIVELLI, O.

gr; Melanin-concentrating hormone receptor: an orphan receptor fits the key. gr; TRENDS ENDOCRINOL.METAB. 11(8) 299-303 (2000).

gr; 9. HILL, J., DUCKWORTH, M., MURDOCK, P., RENNIE, G., SABIDO-DAVID, C., AMES, gr; R.S., SZEKERES, P., WILSON, S., BERGSMA, D.J., GLOGER, I.S., LEVY, D.S., gr; CHAMBERS, J.K. Y MUIR, A.I.

gr; Molecular cloning and functional characterization of MCH2, a novel human MCH gr; receptor.

gr; J.BIOL.CHEM. 276(23) 20125-20129 (2001).

gd; Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia de gd; proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos procesos gd; autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable diversidad a nivel de gd; secuencia, que puede usarse como base para separarlas en distintos grupos. Se usa el gd; término clan para describir las GPCR, ya que abarcan un grupo de familias para las que gd; hay indicaciones de relación evolutiva, pero entre las cuales no hay una similitud gd; estadísticamente significativa en su secuencia [1,2]. Los miembros del clan conocidos gd; en la actualidad incluyen las GPCR similares a rodopsina, las GPCR similares a gd; secretina, los receptores de AMPc, los receptores de feromonas de emparejamiento gd; fúngico y la familia de receptor de glutamato metabotrópico.

gd; Las GPCr similares a rodopsina representan por sí mismas una familia de proteínas gd; ampliamente diseminada que incluye receptores de hormonas, neurotransmisores y de gd; luz, todos los cuales transducen señales extracelulares mediante su interacción con gd; proteínas de unión a nucleótidos guanina (G). Aunque sus ligandos activadores varían gd; ampliamente en su estructura y carácter, las secuencias de aminoácidos de los gd; receptores son muy similares y se cree que adoptan un armazón estructural común que gd; comprende 7 hélices transmembrana (TM) [3-5]. La hormona concentradora de gd; melanina (MCH) es un péptido cíclico identificado originalmente en peces teleósteos gd; [6,7]. En peces, la MCH se libera de la pituitaria y provoca el aclaramiento de las células gd; pigmentarias de la piel mediante la agregación de pigmentos [6,8]. En mamíferos, MCH gd; se expresa principalmente en el hipotálamo y funciona como neurotransmisor en el gd; control de una serie de funciones [8]. Se cree que un papel principal de la MCH se gd; encuentra en la regulación de la alimentación: la inyección de MCH en cerebros de rata gd; estimula la alimentación; la expresión de MCH se regula positivamente en el hipotálamo gd; de ratones obesos y sometidos a ayuno; y los ratones que carecen de MCH son gd; delgados y comen menos [6]. MCH y la hormona estimulante de alfa-melanocitos (alfa- gd; MSH) tienen efectos antagonistas en una serie de funciones fisiológicas. La alfa-MSH gd; oscurece la pigmentación en peces y reduce la alimentación en mamíferos, mientras gd; que MCH aumenta la alimentación [6,8].

gd; Dos receptores acoplados a proteína G, MCH1 y MCH2, se han identificado gd; recientemente como receptores para la hormona.

gd; El perfil de expresión de MCH2 es similar al de MCH1, encontrándose los niveles gd; máximos en el cerebro. Sin embargo, la expresión de MCH2 es significativamente gd; menor que la de MCH1 en la pituitaria, el hipotálamo, el locus cerúleo, el bulbo raquídeo gd; y el cerebelo [9]. La unión de MCH al receptor provoca un aumento en el calcio gd; intracelular insensible a la toxina tosferínica, lo que sugiere su acoplamiento a proteínas gd; Gq [9].

gd; MCH2RECEPTOR es una huella de 9 elementos que proporciona una firma para el gd; receptor 2 de hormona concentradora de melanina. La huella se obtuvo de un gd; alineamiento inicial de 5 secuencias: los motivos se representaron a partir de secciones gd; conservadas en los extremos N y C-terminales y las regiones de bucle, centrándose en gd; aquellas áreas del alineamiento que caracterizan a los receptores MCH2, pero que lo gd; distinguen del resto de la familia de receptores MCH - los motivos 1 y 2 abarcan el gd; extremo N-terminal; el motivo 3 codifica el primer bucle citoplásmico; el motivo 4 se gd; encuentra en el primer bucle externo; el motivo 5 abarca el segundo bucle citoplásmico, gd; desembocando en el dominio 4 TM; el motivo 6 se encuentra en el segundo bucle gd; externo; el motivo 7 abarca el tercer bucle citoplasmático; el motivo 8 está ubicado en el gd; extremo N-terminal del dominio 7 TM; y el motivo 9 codifica el extremo C-terminal. Para gd; alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones en SPTR40 22f, punto en el gd; cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 6 secuencias.

fc; MCH2RECEPTOR5 fl; 20

ft; Motivo V de receptor 2 de hormona concentradora de melanina - 2

fd;: LVQPFRLTSWRTRYKTIRIN Q8MJ88 135 29

fd;: LVQPFRLTRWRTRYKTIRIN Q969V1 135 29

fd;: LVQPFRLTRWRTRYKTIRIN Q9BXA8 135 29

fd;: LVQPFRLTSWRTRYKTIRIN Q8SQ54 135 29

fd;: LVQPFRLTSWRTRYKTIRIN Q8MIN7 135 29

fd;: LVQPFRLTSWRTRYKTIRIN Q8MIP5 135 29

FIRMA DEL RECEPTOR EP1 DE PROSTANOIDE

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 --------------------------------------------------------------------------

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: uro742rev.107r

PRSTNOIDEP1R_4: dominio 1 de 1, de 1 a 18: puntuación 8,4, E = 4,7 * ->iaLGPpGGWRqAL.LAGL<- *

++LGP GG R- L iAG

uro712rev. 1 MGLGPSGGNRKTLfIAGK 18

PRSTNOIDEP1R_4: dominio 1 de 1, de 1 a 18: puntuación 8,4, E = 4,7 ~ *->isLGPpGGWRqAL.LAGL<-*

++LGP GG R+ L +AG

ZG37.B8.10 1 MGLGPSGGNRKTLfIñGK 18

10

gc; PRSTNOIDEP1R

gx; PR00580

gn; COMPUESTO(7)

ga; 25-SEP-1996; ACTUALIZADO 07-JUN-1999 gt; Firma del receptor EP1 de prostanoide

gp; PRINTS; PR00428 PROSTAGLNDNR; PR00581 PRSTNOIDEP2R; PR00582 PRSTNOIDEP3R gp; PRINTS; PR00583 PRSTNOIDE31R; PR00584 PRSTNOIDE32R; PR00585 PRSTNOIDE33R gp; PRINTS; PR00586 PRSTNOIDEP4R; PR00854 PRSTNOIDDPR; PR00855 PRSTNOIDFPR gp; PRINTS; PR00856 PRSTNOIDIPR gp; INTERPRO; IPR000708

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; G protein-coupled receptor fingerprints.

gr; 7TM, VOLUMEN 2, EDS. G.VRIEND Y B.BYWATER (1993).

gr; 3. BIRNBAUMER, L.

gr; G proteins in signal transduction.

gr; ANNU.REV.PHARMACOL.TOXICOL. 30 675-705 (1990).

gr; 4. CASEY, P.J. Y GILMAN, A.G.

gr; G protein involvement in receptor-effector coupling.

gr; J.BIOL.CHEM. 263(6) 2577-2580 (1988).

gr; 5. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Design of a discriminating fingerprint for G protein-coupled receptors. PROTEIN ENG. 6(2) 167-176 gr; (1993).

gr; 6. WATSON, S. Y ARKINSTALL, S.

gr; Prostanoids.

gr; EN THE G PROTEIN-LINKED RECEPTOR FACTSBOOK, ACADEMIC PRESS, 1994, gd; PP.239-251. Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta gd; familia de proteínas que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos gd; procesos autocrinos, paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable diversidad gd; a nivel de secuencia, que puede usarse como base para separarlas en distintos gd; grupos. Se usa el término clan para describir las GPCR, ya que abarcan un grupo de gd; familias para las que hay indicaciones de relación evolutiva, pero entre las cuales no gd; hay una similitud estadísticamente significativa en su secuencia [1,2]. Los miembros gd; del clan conocidos en la actualidad incluyen las GPCR similares a rodopsina, las gd; GPCR similares a secretina, los receptores de AMPc, los receptores de feromonas de gd; emparejamiento fúngico y la familia de receptor de glutamato metabotrópico. gd; Las GPCR similares a rodopsina representan por sí mismas una familia de proteínas gd; ampliamente diseminada que incluye receptores de hormonas, neurotransmisores y de gd; luz, todos los cuales transducen señales extracelulares mediante su interacción con gd; proteínas de unión a nucleótidos guanina (G). Aunque sus ligandos activadores varían gd; ampliamente en su estructura y carácter, las secuencias de aminoácidos de los gd; receptores son muy similares y se cree que adoptan un armazón estructural común gd; que comprende 7 hélices transmembrana (TM) [3-5].

gd; Los prostanoides (prostaglandinas (PG) y tromboxanos (TX)) median una gran

gd; variedad de acciones y desempeñan papeles fisiológicos importantes en los sistemas

gd; cardiovascular e inmunitario y en la sensación de dolor en los sistemas periféricos [6].

gd; PGI2 y TXA2 tienen acciones opuestas, que implican la interacción de las plaquetas

gd; con el endotelio vascular, mientras que PGE2, PGI2 y PGD2 son potentes

gd; vasodilatadores y potencian la acción de diversas autacoides para inducir la

gd; extravasación del plasma y la sensación de dolor. Hasta la fecha, se han obtenido

gd; pruebas de al menos 5 clases de receptores de prostanoides. Sin embargo, la

gd; identificación de subtipos y su distribución se ve dificultada por la expresión de más de

gd; un receptor en un tejido, junto con la escasa disponibilidad de agonistas y

gd; antagonistas disponibles.

gd; Los receptores EP1 median la contracción de los músculos lisos gastrointestinales en gd; diversas especies y la relajación de los músculos lisos de las vías respiratorias y gd; uterinos, especialmente en roedores [6]. Los receptores activan la vía de fosfoinosítido gd; mediante una proteína G insensible a la toxina tosferínica, probablemente de la clase gd; Gq/Gll [6].

gd; PRSTNOIDEP1R es una huella de 7 elementos que proporciona una forma para los gd; receptores EP1 de prostanoides. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 2 gd; secuencias; los motivos se representaron a partir de secciones conservadas dentro de gd; cada bucle o las regiones N y C-terminales, centrándose en aquellas áreas del gd; alineamiento que caracterizan a los receptores EP1 de prostanoides, pero que los gd; distinguen del resto de la superfamilia similar a rodopsina - el motivo 1 se encuentra gd; en el extremo N-terminal; el motivo 2 abarca el primer bucle citoplasmático; el motivo 3 gd; abarca el primer bucle externo; el motivo 4 se encuentra en el segundo bucle externo; gd; el motivo 5 se encuentra en el tercer bucle citoplásmico; y los motivos 6 y 7 abarcan el gd; extremo C-terminal. Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola interacción en gd; OWL28.2, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de inicio. gd;

fc; PRSTNOIDEP1R4 fl; 17

ft; Motivo IV de receptor EP1 de prostanoides - 2

fd;: ISLGPRGGWRQALLAGL PE2l MOUSE 192 73

fd;: ISLGPPGGWRQALLAGL PE21 RAT 192 73

fd;: IGLGPPGGWRQALLAGL PE2l HUMAN 190 73

CICLINCINASA

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.cd.215rev.1..736

5 CYCLINKINASE_3: dominio 1 de 1, de 662 a 676: puntuación 9,3, E = 3,1

*->EWRslGvqqslGWvh<-*

E í- Gvqq 1 Wvh

rheu.cd.21 662 ESSRFGVQQRLPWVH 676

gc; CICLINCINASA

gx; PR00296

gn; COMPUESTO(4)

ga; 07-OCT-1994; ACTUALIZADO 07-JUN-1999

gt; Firma de subunidad reguladora de cinasa dependiente de ciclina

gp; INTERPRO; IPR000789

gp; PROSITE; PS00944 CKS_1; PS00945 CKS_2

gp; PFAM; PF01111 CKS

gr; 1. BRIZUELA, L., DRAETTA, G. Y BEACH, D.

gr; pl3sucl acts in the fission yeast cell division cycle as a component of the

gr; p34cdc2 protein kinase.

gr; EMBO J. 6 3507-3514 (1987).

gr; 2. PARGE, H.E., ARVAI, A.S., MURTARI, D.J., REED, S.I. Y TAINER, J.A.

gr; Human CksHs2 atomic structure: a role for its hexameric assembly in cell

gr; cycle control.

gr; SCIENCE 262 387-395 (1993).

gr; 3. TANG, Y. Y REED, S.I.

gr; The Cdk-associated protein Cksl functions both in G1 and G2 in

gr; Saccharomyces cerevisiae.

gr; GENES DEV. 7 822-832 (1993).

gd; En eucariotas, las proteína cinasas dependientes de ciclina interactúan con las ciclinas para gd; regular la progresión del ciclo celular y son necesarias para los estadios G1 y G2 de la división gd; celular [1]. Las proteínas se unen a una subunidad reguladora (subunidad reguladora de cinasa gd; dependiente de ciclina o CKS), que es esencial para su función [2]. Las subunidades reguladoras gd; existen en forma de hexámeros, formados por el ensamblaje simétrico de 3 homodímeros gd; entrelazados, creando una estructura infrecuente de barril beta de 12 hebras [2]. A través del gd; centro del barril se encuentra un túnel con un diámetro de 12A, revestido por 6 pares de hélices gd; expuestas [3]. Puede modelarse la unión de seis unidades de cinasa a la estructura hexamérica, gd; que por tanto puede actuar como interconexión para la multimerización de proteínas cinasas gd; dependientes de ciclina [2,3].

gd; CICLINCINASA es una huella de 4 elementos que proporciona una firma para gd; subunidades reguladoras de cinasa dependiente de ciclina. La huella se obtuvo de gd; un alineamiento inicial de 4 secuencias: los motivos se representaron a partir de gd; regiones conservadas que abarcan prácticamente la longitud completa del gd; alineamiento, los motivos 1,2 y 4, que abarcan las regiones codificadas por los gd; patrones CKS 1 (PS00944) y CKS_2 (PS00945) de PROSITE. Para alcanzar la gd; convergencia, se necesitaron dos interacciones en OWL24.0, punto en el cual se gd; identificó un conjunto auténtico que comprendía 5 secuencias. fc; CYCLINKINASE3 fl; 15

ft;: Motivo III de subunidad reguladora de cinasa dependiente de ciclina -2

fd: EWRRLGVQQSLGWVH CKS2 XENLA 42 7

fd: EWRNLGVQQSQGWVH CKS1 HUMAN 42 7

fd: EWRRLGVQQSLGWVH CKS2 HUMAN 42 7

fd: EWRRLGVQQSLGWVH CKS2 MOUSE 42 7

fd: EWRSIGVQQSHGWIH CKS1 PATVU 42 7

fd: EWRSIGVQQSRGWIH CKSl DROME 41 7

fd: EWRGLGVQQSQGWVH CKSl PHYPO 42 7

fd: EWRQLGVQQSQGWVH CKS1 LEIME 67 7

fd: EWRAIGVQQSRGWVH O23249 40 7

fd: EWRGLGITQSLGWQH O60191 73 16

fd: EWRGLGITQSLGWEM CKS1 SCHPO 69 16

fd: EWRGLGITQSLGWEH CKSl YEAST 73 16

fd: EWRSLGIQQSPGWMH CKSl CAEEL 44 7

FIRMA DE RECEPTOR ACTIVADO POR PROLIFERADOR DE PEROXISMAS (RECEPTOR NUCLEAR 1C)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.cd.215rev.1.736

PROXISOMEPAR_7: dominio 1 de 1, de 721 a 733: puntuación 8,0, E = 5,7 *->KtEtdasLHPLLq<-*

K + sLiHPLL

rheu.cd.21 721 KVQAGHSLHPLLS 733

gc; PROXISOMEPAR

gx; PR01288

gn; COMPUESTO(7)

ga; 19-FEB-2000

gt; Firma de receptor activado por proliferador de peroxismas (receptor nuclear 1C)

gp; PRINTS; PR00398 STRDHORMONER; PR00047 STROIDFINGER

gp; PRINTS; PR01289 PROXISOMPAAR; PR01290 PROXISOMPABR; PR01291 PROXISOMPAGR

gr; 1. NUCLEAR RECEPTORS NOMENCLATURE COMMITTEE

gr; A unified nomenclatura system for the nuclear receptor superfamily.

gr; CELL 97 161-163 (1999).

gr; 3. DE VOS, P., SCHMITT, J., VERHOEVEN, G. Y STUNNENBERG, G. gr; Human androgen receptor expressed in HeLa cells activates transcription gr; in vitro.

gr; NUCLEIC ACIDS RES. 22(7) 1161-1166 (1994).

gr; 4. KREY, G., KELLER, H., MAHFOUDI, A., MEDIN, J., OZATO, K., DREYER, C. gr; Y WAHLI, W.

gr; Xenopus peroxisome proliferator activated receptors: genomic organization,

gr; response element recognition, heterodimer formation with retinoid X receptor

gr; and activation by fatty acids.

gr; J.STEROID BIOCHEM.MOL.BIOL. 47 65-73 (1993).

gr; 5. DREYER, C., KREY, G., KELLER, H., GIVEL, F., HELFTENBEIN, G.

gr; Y WAHLI, W.

gr; Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of gr; nuclear hormone receptors. gr; CELL 68 879-887 (1992).

gd; Los receptores de esteroides o de hormonas nucleares (NR) forman una superfamilia gd; importante de reguladores de la transcripción que están implicados en funciones fisiológicas gd; ampliamente diversas, incluyendo el control del desarrollo embrionario, la diferenciación gd; celular y la homeostasia [1]. Los miembros de la superfamilia incluyen los receptores de gd; hormonas esteroideas y los receptores para hormonas tiroideas, retinoides, 1,25-dihidroxi- gd; vitamina D3 y varios ligandos diferentes. Las proteínas funcionan como moléculas diméricas gd; en los núcleos para regular la transcripción de genes diana de una manera sensible al gd; ligando [2,3]. Además de los dominios de unión a ligando C-terminales, estos receptores gd; nucleares contienen un dedo de cinc N-terminal altamente conservado que media la unión gd; específica a secuencias de ADN diana, denominados elementos sensibles a ligando. En gd; ausencia de ligando, se cree que los recetores de hormonas esteroideas se asocian gd; débilmente con componentes nucleares; la unión a hormonas aumenta en gran medida la gd; afinidad del receptor.

gd; Los NR son extremadamente importantes en investigación médica, estando implicado un gd; gran número de estos en enfermedades tales como cáncer, diabetes, síndromes de gd; resistencia a hormonas, etc. [1]. Aunque varios NR actúan como factores de transcripción gd; inducibles por ligando, muchos aún no tienen un ligando definido y por consiguiente, se les gd; denomina receptores "huérfanos". Durante la última década, se han descrito más de 300 gd; NR, muchos de los cuales se encuentran huérfanos, que no pueden nombrarse fácilmente gd; debido a las confusiones de nomenclatura actual en la bibliografía. Sin embargo, gd; recientemente se ha introducido un nuevo sistema en un intento de racionalizar el conjunto gd; de nombres cada vez más complejo usado para describir a miembros de superfamilias [1]. gd; Los receptores activados por proliferador de peroxisomas (PPAR) son factores de gd; transcripción activados por ligando que pertenecen a la superfamilia de receptores de gd; hormonas nucleares. Se han aislado tres ADNc que codifican PPAR de Xenopus laevis: gd; xPPAR alfa, beta y gamma [4]. Los tres xPPAR parecen estar activados tanto por gd; proliferadores de peroxisomas sintéticos como por ácidos grasos de origen natural, lo que gd; sugiere un modo de acción común para todos los miembros de esta subfamilia de gd; receptores [4]. Además, la multiplicidad de los receptores sugiere la existencia de vías de gd; señalización celular hasta ahora desconocidas para xenobióticos y supuestos ligandos gd; endógenos [5].

gd; PROXISOMEPAR es una huella de 7 elementos que proporciona una firma para receptores gd; activados por proliferador de peroxisomas. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de gd; 11 secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan gd; prácticamente la longitud completa del alineamiento, centrándose en aquellas secciones gd; que caracterizan a la familia PPAR, pero que los distingue del resto de la superfamilia de gd; receptores de hormonas esteroides - los motivos 1 y 2 se encuentran en C-terminal gd; respecto del dominio de dedo de cinc; y los motivos 3-7 abarcan el supuesto dominio de gd; unión a ligando. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron tres interacciones en gd; SPTR37_10f, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 19 gd; secuencias. También se encontró una sola coincidencia parcial de humano, el receptor gd; activado por proliferador de peroxisomas beta de Xenopus, PPAS XENLA, que no llega a gd; coincidir con el primer motivo.

fc; PROXISOMEPAR7 fl; 13

ft; Motivo VII de receptor activado por proliferador de peroxisomas - 3

fd: KTETDMSLHPLLQ 018924 486 16

fd: KTETDMSLHPLLQ Q15832 486 16

fd: KTETDMSLHPLLQ PPAT HUMAN 456 16

fd: KTETDMSLHPLLQ 062807 485 16

fd: KTETDMSLHPLLQ 018971 486 16

fd: KTETDMSLHPLLQ PPAT RABIT 456 16

fd: KTETDMSLHPLLQ 077815 485 16

fd: KTETDMSLHPLLQ 088275 456 16

fd: KTETDMSLHPLLQ PPAT MOUSE 456 16

fd: KTETDMSLHPLLQ Q15180 487 16

fd: KTEADMCLHPLLQ PPAT XENLA 458 16

fd: KTETDAALHPLLQ PPAR XENLA 455 16

fd: KTESDAALHPLLQ PPAR HUMAN 449 16

fd: KTESDAALHPLLQ PPAR RAT 449 16

fd: KTESDAALHPLLQ PPAR MOUSE 449 16

fd: KTETETSLHPLLQ PPAS HUMAN 422 16

fd: KTESDAALHPLLQ PPAR CAVPO 448 15

fd: KTESETLLHPLLQ PPAS MOUSE 421 16

fd: KTESETLLHPLLQ Q62879 421 16

FIRMA DE RECEPTOR ML MUSCARÍNICO

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 Archivo HMM: prints, hmm

Archivo de secuencia: rheu.cd.215rev.1.736

MUSCRINICM1R_4: dominio 1 de 2, de 161 a 177: puntuación 0,9, E = 98 *-> KmPmv DpEAqAP t Kq P P k<-*

K P vD q t qPP

rheu.cd.21 161 KHPTVDFMVQINT-QPPF 177

gc; MUSCRINICM1R

gx; PR00538

gn; COMPUESTO(6)

ga; 01-JUN-1996; ACTUALIZADO 07-JUN-1999 gt; Firma de receptor Ml muscarínico

gp; PRINTS; PR00243 MUSCARINICR; PR00539 MUSCRINICM2R; PR00540 MUSCRINICM3R

gp; PRINTS; PR00541 MUSCRINICM4R; PR00542 MUSCRINICM5R

gp; INTERPRO; IPR002228

gr; 1. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; Fingerprinting G protein-coupled receptors.

gr; PROTEIN ENG. 7(2) 195-203 (1994).

gr; 2. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; G protein-coupled receptor fingerprints.

gr; 7TM, VOLUMEN 2, EDS. G.VRIEND Y B.BYWATER (1993).

gr; 3. BIRNBAUMER, L.

gr; G proteins in signal transduction.

gr; ANNU.REV.PHARMACOL.TOXICOL. 30 675-705 (1990).

gr; 4. CASEY, P.J. Y GILMAN, A.G.

gr; G protein involvement in receptor-effector coupling.

gr; J.BIOL.CHEM. 263(6) 2577-2580 (1988).

gr; 5. ATTWOOD, T.K. Y FINDLAY, J.B.C.

gr; 6. KERLAVAGE, A.R., FRASER, C.M., CHUNG, F-Z. Y VENTER, J.C.

gr; Molecular structure and evolution of adrenergic and cholinergic receptors.

gr; PROTEINS 1 287-301 (1986).

gr; 7. WATSON, S. Y ARKINSTALL, S.

gr; Acetylcholine

gr; EN THE G PROTEIN-LINKED RECEPTOR FACTSBOOK, ACADEMIC PRESS, 1994, PP.7-18.

gd; Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) constituyen una vasta familia de proteínas gd; que abarca una gran variedad de funciones (incluyendo diversos procesos autocrinos, gd; paracrinos y endocrinos). Muestran una considerable diversidad a nivel de secuencia, que gd; puede usarse como base para separarlas en distintos grupos. Se usa el término clan para gd; describir las GPCR, ya que abarcan un grupo de familias para las que hay indicaciones de gd; relación evolutiva, pero entre las cuales no hay una similitud estadísticamente significativa gd; en su secuencia [1,2]. Los miembros del clan conocidos en la actualidad incluyen las gd; GPCR similares a rodopsina, las GPCR similares a secretina, los receptores de AMPc, los gd; receptores de feromonas de emparejamiento fúngico y la familia de receptor de glutamato gd; metabotrópico.

gd; Los receptores muscarínicos de acetilcolina, presentes en el sistema nervioso central, las gd; neuronas motoras de la médula espinal y los preganglios autónomos, modulan una serie gd; de funciones fisiológicas, incluyendo las contracciones del músculo liso de las vías gd; respiratorias, el ojo e intestinal; la frecuencia cardíaca; y las secreciones glandulares. Los gd; receptores median la atenuación de la adenilato ciclasa, la activación de canales de calcio gd; y potasio y la renovación del fosfatidil inositol [6]. Esta diversidad puede ser el resultado gd; de la aparición de múltiples subtipos de receptor (de los cuales, en la actualidad se gd; conocen 5, denominados Ml a M5), que se han clasificado basándose en las diferencias gd; observadas en la unión de ligandos a receptores en membranas de diversos tejidos. gd; El receptor Ml se encuentra a altos niveles en células neuronales del SNC; es gd; particularmente abundante en la corteza cerebral y el hipocampo [7]. Su distribución se gd; solapa en gran medida con la de los subtipos M3 y M4. En la periferia, los receptores Ml gd; se encuentran en los ganglios autónomos y ciertas glándulas secretoras y también se gd; encuentran en líneas celulares. No se ha descrito ningún agonista auténticamente gd; selectivo [7].

gd; MUSCRINICM1R es una huella de 6 elementos que proporciona una forma para los

gd; receptores Ml muscarínicos. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 4

gd; alineamiento que caracterizan a los receptores Ml, pero que los distinguen del resto de

gd; la familia de receptores muscarínicos - el motivo 1 se encuentra en el extremo N-

gd; terminal; los motivos 2-5 abarcan el tercer bucle citoplásmico; y el motivo 6 se encuentra

gd; en el extremo C-terminal. Para alcanzar la convergencia se necesitó una sola

gd; interacción en OWL28.0, sin identificar secuencias adicionales más allá del conjunto de

gd; inicio.

fc; MUSCRINICM1R4 fl; 18

ft;: Motivo IV de receptor Ml muscarínico -2

fd;: KMPMVDPEAQAPTKQPPR ACMl HUMAN 303 3

fd;: KMPMVDPEAQAPTKQPPK ACM1 MOUSE 303 3

fd;: KMPMVDSEAQAPTKQPPK ACMl RAT 303 3

fd;: KMPMVDPEAQAPTKQPPR ACM1 MACMU 303 3

fd;: KMPMVDPEAQAPAKQPPR ACM1 PIG 303 3

FIRMA DE RECEPTOR DE TIPO B2 DE ÁCIDO GAMMA-AMINOBUTÍRICO METABOTRÓPICO (GABA) transcrito zc35s.B3.3e.172:

GABAB2RECPTR_1: dominio 1 de 1, de 111 a 129: puntuación 5,9, E = 6,4 *->LfiPGfiWGWaRGAPRPPPss<-^

+ P w + P+PPPs-r-

zc35s.B3.3 111 VGFEQWLFPERKPKPPPSA 129

gc;: GABAB2RECPTR

gx;: PR01178

gn;: COMPUESTO(13)

ga;: 18-SEP-1999

gt; Firma de receptor de tipo b2 de ácido gamma-aminobutírico metabotrópico

gp; PRINTS; PR00237 GPCRRHODOPSN; PR00247 GPCRCAMP; PR00249 GPCRSECRETIN

gp; PRINTS; PR00250 GPCRSTE2; PR00899 GPCRSTE3; PR00251 BACTRLOPSIN

gp; RINTS; PR00592 CASENSINGR; PR00593 MTABOTROPICR

gp; PRINTS; PR01176 GABABRECEPTR; PR01177 GABAB1RECPTR

gp; INTERPRO; IPR002457

gr; 1. KAUPMANN, K., HUGGEL, K., HEID, J., FLOR, P.J., BISCHOFF, S., MICKEL, S.J.,

gr; MCMASTER, G., ANGST, C., BITTIGER, H., FROESTL, W. Y BETTLER, B.

gr; Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to metabotropic

gr; glutamate receptors.

gr; NATURE 386 239-246 (1997).

gr; 2. KAUPMANN, K., SCHULER, V., MOSBACHER., J, BISCHOFF, S., BITTIGER, H., HEID, J., gr; FROESTL, W., LEONHARD, S., PFAFF, T., KARSCHIN, A. Y BETTLER, B.

gr; Human gamma-aminobutyric acid type B receptors are differentiaMy expressed and regulate inwardly gr; rectifying K+ channels.

gr; PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A. 95(25) 14991-14996 (1998),

gr; 3. WHITE, J.H., WISE, A., MAIN, M.J., GREEN, A., FRASER, N.J., DISNEY, G.H., BARNES, A.A., gr; EMSON, P., FOORD, S.M. Y MARSHALL, F.H.

gr; Heterodimerization is required for the formation of a functional GABA(B) gr; receptor.

gr; NATURE 396 679-82 (1998).

gd; GABA (ácido gamma-aminobutírico) es el principal neurotransmisor inhibidor en el

gd; cerebro y señaliza a través de sistemas receptores ionotrópicos

gd; (GABA(A)/GABA(C)) y metabotrópicos (GABA(B)) [1]. Se han clonado receptores

gd; GABA(B) y los experimentos de marcaje de fotoafinidad sugieren que

gd; corresponden a dos formas de receptor altamente conservadas en el sistema

gd; nervioso de vertebrados [1].

gd; Los receptores GABA(B) están implicados en el refinado de la transmisión sináptica gd; inhibidora [2]. Los receptores presinápticos inhiben la liberación de neurotransmisores gd; regulando negativamente los canales de Ca2+ activados por alto voltaje, mientras que gd; los receptores prosinápticos reducen la excitabilidad neuronal activando una gd; prominente conductancia hacia dentro rectificadora de K+ (Kir) que subyace a los gd; potenciales postsinápticos inhibidores [2]. Los receptores GABA(B) se acoplan gd; negativamente a la adenililo ciclasa y muestran similitud de secuencia con los gd; receptores metabotrópicos para el neurotransmisor excitante, L-glutamato. gd; Se ha identificado un nuevo subtipo del receptor GABA(B) (GABA(B)R2) mediante gd; búsquedas exhaustivas en la base de datos EST [3]. La exploración con dos híbridos gd; de levadura ha demostrado que el nuevo subtipo forma heterodímeros con gd; GABA(B)R1 mediante una interacción en sus colas C-terminales intracelulares [3]. Al gd; expresar GABA(B)R2 en células HEK293T, GABA(B)R1 se glucosila terminalmente y gd; se expresa en la superficie celular. La expresión conjunta de los receptores produce un gd; receptor GABA(B) completamente funcional en la superficie celular; este receptor se gd; une a GABA con un equivalente de alta afinidad al del receptor endógeno del cerebro gd; [3]. Dichos resultados indican que, in vivo, los receptores GABA(B) funcionales del gd; cerebro pueden ser heterodímeros de GABA(B)R1 y GABA(B)R2. gd; GABAB2RECPTR es una huella de 13 elementos que proporciona una firma para los gd; receptores GABA(B) de tipo 2. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 2 gd; secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que gd; abarcan prácticamente la longitud completa del alineamiento, centrándose en aquellas gd; secciones que caracterizan los receptores de tipo 2, pero que los distinguen del resto gd; de la familia de receptores GABA(B). Para alcanzar la convergencia se necesitó una gd; sola interacción en SPTR37 10f, sin identificar secuencias adicionales más allá del gd; conjunto de inicio.

fc; GABAB2RECPTR1 fl; 19

ft; Motivo I de receptor GABAB2 -1

fd; LAPGAWGWARGAPRPPPSS 075899 35 35

fd; LAPGAWGWTRGAPRPPPSS 088871 34 34

FIRMA DE ARGININA DESIMINASA

ARGDEIMINASE_6: dominio 1 de 1, de 57 a 75: puntuación 8,0, E = 6,8 *-> seLsrGrcgprcmsmplvRí-* s L+rG g pr s p-r +

ac35s,B3.3 57 SPLGRGAGEPRRTSTPVAA 75

gc;

gx;

gn;

ga;

gt;

gp;

gr;

gd;

bb;

c;

fl;

ft;

ARGDEIMINASE

PRO 14 66 COMPUESTO(6)

08-JAN-2001

Firma de arginina desiminasa bacteriana

PRINTS; PRO0102 OTCASE PFAM; PF02726 Arg deiminasa INTERPRO; IPR003876

1. BROWN, D.M., UPCROFT, J.A., EDWARDS, M.R. Y UPCROFT, P.

Anaerobic bacterial metabolism in the ancient eukaryote Giardia duodenalis.

INT.J.PARASITOL. 28 149-64 (1998).

2. HARASAWA, R., KOSHIMIZU, K., KITAGAWA, M., ASADA, K. Y KATO, I.

Nucleotide sequence of the arginine deiminase gene of Mycoplasma hominis. MICROBIOL.IMMUNOL. 36 661-665 (1992).

3. KANAOKA, M., KAWANAKA, C., NEGORO, T., FUKITA, Y., TAYA, K. Y AGUI, H.

Cloning and expression of the antitumor glycoprotein gene of Streptococcus pyogenes Su in Escherichia coli.

AGRIC.BIOL.CHEM. 51 2641-2648 (1987).

4. DEGNAN, B.A., PALMER, J.M., ROBSON, T., JONES, C.E., FISCHER, M., GLANVILLE, M., MELLOR, G.D., DIAMOND, A.G., KEHOE, M.A. Y GOODACRE, J.A.

Inhibition of human peripheral blood mononuclear cell proliferation by Streptococcus pyogenes cell extract is associated with arginine deiminase activity.

INFECT.IMMUN. 66 3050-3058 (1998).

La vía de arginina dihidrolasa (AD) se encuentra en muchos procariotas y algunos de los eucariotas primitivos, siendo un ejemplo de estos últimos Giardia [1]. La vía anaeróbica de tres enzimas degrada la L-arginina para formar 1 mol de ATP, dióxido de carbono y amoniaco. En las bacterias más simples, la primera enzima, arginina desiminasa, puede suponer hasta un 10 % de la proteína celular total [1].

La arginina desiminasa cataliza la conversión de la L-arginina en L-citrulina y amoniaco. Además de producir energía mediante ATP, el amoniaco también sirve para proteger a la bacteria contra el daño por ácidos y la citrulina generada puede usarse en otras vías biosintéticas [2]. También se ha demostrado que una glucoproteína ácida estreptocócica (SAGP) funciona como arginina desiminasa [3].

Recientemente, se ha descubierto otra función de esta enzima [4]. Tiene un potente efecto antitumoral y puede inhibir la proliferación de células mononucleares de sangre periférica estimulada por antígenos, superantígenos o mitógeno [4].

Otra función de la proteína puede ser inhibir la proliferación celular mediante la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis. Por lo tanto, se ha barajado la hipótesis de que podría usarse arginina desiminasa recombinante como nuevo agente antitumoral [4]. ARGDEIMINASE es una huella de 6 elementos que proporciona una firma para la familia de proteínas de arginina desiminasa bacterianas. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 4 secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan la longitud completa del alineamiento (~430 aminoácidos). Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones en SPTR37_10f, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 13 secuencias. También se encontraron tres coincidencias parciales: P75475 y P75474 son arginina desiminasas de Mycoplasma pneumoniae que coinciden con los tres primeros y los tres últimos motivos, respectivamente; una Q48294 es una arginina desiminasa de Halobacterium salinarium que coincide con los motivos 2 y 6.

ARGDEIMINASE6

19

Motivo VI de arginina desiminasa bacteriana - 2

5

10

fd: SELSRGRGGPRCMSMPLIR 051896 388 8

fd: SELSRGRGGPRCMSMPLIR Q46254 392 8

fd: SELVRGRGGPRCMSMPFER SAGP STRPY 389 8

fd: SELSRGRGGPRCMSMSLVR 051781 389 8

fd: GELSRGRGGPRCMSMPLYR 086131 391 8

fd: SELSRGRGGPRCMSMPLVR 053088 388 8

fd: SELGRGRGGGHCMTCPIVR ARCA PSEAE 394 8

fd: NQLSLGMGNARCMSMPLSR ARCA MYCHO 385 8

fd: SELGRGRGGGHCMTCPIWR 031017 387 8

fd: NQLSLGMGNARCMSMPLSR ARCA MYCAR 386 8

fd: GELGRGRGGGHCMTCPIVR ARCA PSEPU 397 8

fd: SELGTGRGGPRCMSCPAAR 005585 381 8

fd: SELSRGPSGPLEMVCSLWR ARCA MYCPN 419 8

REPETICION DE FACTOR DE CRECIMIENTO OPIOIDE

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: pfam.hmm

Archivo de secuencia: zc37.B9.2de.p2

OGFr III: dominio 1 de 1, de 186 a 207: puntuación 8,2, E = 3,6

*->sPcEtPC?rPA,.G?arDEPAE<-*

+ tP ? FA +G?+ r 4-P E

zc37,B3.2d 186 RAASTPVPTPAlrG PTKQDPGE 207

#=: =GE ID

#=: =GF AC

#=: =GF DE

#=: =GF PI

#=: =GF AU

#=: =GF SE

#=: =GF GA

#=: =GF TC

#=: =GF NC

#=: =GF TP

#=: =GF BM

#=: =GF BM

#=: =GF BM

#=: =GF BM

#=: =GF AM

#=: =GF RN

#=: =GF RM

#=: =GF RT

#=: =GF RA

#=: =GF RL

#=: =GF DR

#=: =GF CC

#=: =GF CC

OGFr_MI

PF04680.5

Repetición de factor de crecimiento opioide

OGFr_repeat;

Waterfield DI, Finn RD Pfam-B_4529 (compilación 7.5)

33,30 0,00; 25,00 25,00;

40,70 0,30; 28,20 35,60;

30,90 18,10; 17,10 16,10;

Repetición

hmmbuild -FHMM_ls.ann SEED.ann hmmcalibrate —seed 0 HMM_ls hmmbuild -f -FHMM fs.ann SEED.ann hmmcalibrate —seed 0 HMM_fs globalfirst [1]

11890982

The biology of the opioid growth factor receptor (OGFr).

Zagon IS, Verderame MF, McLaughlin PJ;

Brain Res Brain Res Rev 2002;38:351-376.

INTERPRO; IPR006770;

Repetición rica en prolina encontrada únicamente en el receptor de factor de crecimiento opioide [1].

FIRMA DE MOLECULA DE ADHESION CD36

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HMM: prints.hmm

Archivo de secuencia: zc3rN.B4.10d.p1

CD36ANTIGEN_3: dominio 1 de 1, de 11 a 29: puntuación 6,3, E = 7,7 *->WiEDvqnPd,evakri3ski kvkqFK-* vq P+í; sp+ +v4qR

zcjrli . 134 . 11 --NVQDPEE-QNESSRFRVQQR 29

gc; CD36ANTIGEN

gx; PR01610

gn; COMPUESTO(13)

ga; 23-DEC-2001

gt; Firma de molécula de adhesión CD36

gp ; PRINTS : PRO1609 CD36FAMILY: PR01611 LIMPII gp; MIM ; 173510

gr; 1. OKUMURA, T. Y JAMIESON, G.A.

gr; Platelet glycocalicin. Orientation of glycoproteins on the human platelet surface. gr; J.BIOL.CHEM. 251 5944-5949 (1976).

gr; 2. NICHOLSON, A.C., FEBBRAIO, M., HAN, J., SILVERSTEIN, R.L. Y HAJJAR, gr; D.P.

gr; CD36 in atherosclerosis. The role of a class B macrophage scavenger receptor.

gr; ANN.N.Y.ACAD.SCI. 902 128-131 (2000).

gr; 3. SILVERSTEIN, R.L. Y FEBBRAIO, M.

gr; CD36 and atherosclerosis.

gr; CURR.OPIN.LIPIDOL. 11 483-491 (2000).

gr; 4. SAVILL, J., HOGG, N., REN, Y. Y HASLETT, C.

gr; Thrombospondin cooperates with CD36 and the vitronectin receptor in macrophage

gr; recognition of neutrophils undergoing apoptosis.

gr; J.CLIN.INVEST. 90 1513-1522 (1989).

gr; 5. TANDON, NN., KRALISZ, U. Y JAMIESON, GA.

gr; Identification of glycoprotein IV (CD36) as a primary receptor for platelet-collagen gr; adhesion.

gr; J.BIOL.CHEM. 264 7576-7583 (1989).

gr; 6. MCGREGOR, J.L., CATIMEL, B., PARMENTIER, S., CLEZARDIN, P., gr; DECHAVANNE, M. Y LEUNG, L.L.

gr; Rapid purification and partial characterization of human platelet glycoprotein IIIb. gr; Interaction with thrombospondin and its role in platelet aggregation. gr; J.BIOL.CHEM. 264 501-506 (1989).

gr; 7. BARNWELL, J.W., ASCH, A.S., NACHMAN, R.L., YAMAYA, M., AIKAWA, M. E gr; INGRAVALLO, P.

gr; A human 88-KD membrane glycoprotein (CD36) functions in vitro as a receptor for

gr; a cytoadherence ligand on Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.

gr; J.CLIN.INVEST. 84 765-772 (1989).

gr; 8. BULL, H.A., BRICKELL, P.M. Y DOWD, P.M.

gr; Src-related protein tyrosine kinases are physically associated with the surface gr; antigen CD36 in human dermal microvascular endothelial cells. gr; FEBS LETT. 351 41-44 (1994).

gr; 9. MIYAOKA, K., KUWASAKO, T., HIRANO, K., NOZAKI, S., YAMASHITA, S. gr; Y MATSUZAWA, Y.

gr; CD36 deficiency associated with insulin resistance. gr; LANCET 357 686-687 (2001).

gr; CD36 es una glucoproteína transmembrana altamente glucosilada de 88 kda [1]

gr; expresada por monocitos, macrófagos, plaquetas, células endoteliales microvasculares

gd; y el tejido adiposo [2], Es un receptor multifuncional que se une a LDL oxidadas

gd; (OxLDL), ácidos grasos de cadena larga, fosfolípidos aniónicos, células apoptóticas,

gd; trombospondina (TSP), colágeno y eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum [2].

gd; CD36 tiene numerosas funciones celulares. Es un receptor depurador de tipo B,

gd; que desempeña un papel importante en la captación de OxLDL por los macrófagos

gd; [3]. Después, los macrófagos ricos en lípidos se diferencian en células espumosas

gd; y contribuyen a la formación de lesiones ateroescleróticas [3]. Además, CD36 de

gd; macrófagos, junto con TSP y la integrina alfa beta3, puede fagocitar a los

gd; neutrófilos apoptóticos [4]. Además, la proteína es uno de los receptores de

gd; colágeno en la adhesión y agregación plaquetaria [5,6]. CD36 también puede

gd; mediar la citoadherencia de eritrocitos infectados por Plasodium falciparum al

gd; endotelio de vénulas poscapilares de diferentes órganos [7]. Además, el CD36

gd; citoplásmico desempeña un papel importante en la transducción de señales,

gd; interactuando con las tirosina cinasas de la familia Src [8]. La deficiencia de CD36

gd; en las poblaciones asiática y africana se ha asociado con resistencia a la insulina

gd; [9].

gd; CD36 es una huella de 13 elementos que proporciona una firma para las gd; moléculas de adhesión CD36. La huella se obtuvo de un alineamiento gd; inicial de 4 secuencias, centrándose en aquellas secciones que gd; caracterizan a las moléculas de adhesión a CD36 pero que las distinguen gd; del resto de la familia de CD36: el motivo 1 abarca el primer supuesto gd; dominio N-terminal TM; los motivos 2-12 se encuentran en el dominio gd; extracelular; y el motivo 13 abarca el segundo supuesto dominio C- gd; terminal TM. Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos gd; interacciones en SPTR40_18f, punto en el cual se identificó un conjunto gd; auténtico que comprendía 6 secuencias.

bb;

fc: CD36ANTIGEN3

fl;: 23

ft;: Motivo III de molécula de adhesión a CD36 -2

fd: WVFDVQNPEEVAKNSSKIKVIQR CD36 RAT 65 18

fd: WIFDVQNPDDVAKNSSKIKVKQR CD36 MOUSE 65 18

fd: WIFDVQNPDEVTVNSSKIKVKQR D36 BOVIN 65 18

fd: WIFDVQNPQEVMMNSSNIQVKQR D36 HUMAN 65 18

fd: WIFDVQNPDEVAVNSSKIKVKQR D36 MESAU 65 18

fd: WIFDVQNPEEVAKNSSKIKVKQR 035754 66 18

FIRMA DE PROTEÍNA PROTELIPÍDICA DE MIELINA (PLP)

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

Archivo HHM: prints.hm

Archivo de secuencia: zc312.B11.20d.trrev4 8009.sreformat

5 MYELINPO_5: dominio 1 de 1, de 70 a 91: puntuación -0,1, E = 9,3

* > GWIGAilGGvLGvVLUvtlIViv = * *

IG ilGGvC VL l + +1 *

K312.B11.70 "MLGRIIGGVGCVLLELXGLGVR 91

gc; MYELINPLP

gx; PR00214

gn; COMPUESTO (7)

ga; 11-JUL-1994; ACTUALIZADO 07-JUN-1999

gt; firma de proteína protelipídica de mielina (PLP) gp; INTERPRO; IPR001614

gp; PROSITE: PS00575 MYELIN_PLP_1: PS01004 MYELIN_PLP_2

gp; BLOCKS; BL00575

gp; PFAM: PF01275 Myelin_PLP

gr; 1. SAKAMOTO, Y., KITAMURA, K., YOSHIMURA, K., NISHIJIMA, T. Y UYEMURA, K. gr; Complete amino acid sequence of PO protein in bovine peripheral nerve gr; myelin.

gr; J.BIOL.CHEM. 262 4208-4214 (1987).

gr; 2. SHAW, S.Y., LAURSEN, R.A. Y LEES, M.B.

gr; Identification of thiol groups and a disulfide crosslink site in bovine myelin

gr; proteolipid protein.

gr; FEBS LETT. 250 306-310 (1989).

gr; 3. DIEHL, H.H., SCHAICH, M., BUDZINSKI, R.M. Y STOFFEL, W.

gr; Individual exons encode the integral membrane domains of human myelin

gr; proteolipid protein.

gr; PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A. 83 9807-9811 (1986).

gd; La vaina de mielina es una membrana multicapa, única en el sistema nervioso, que

gd; funciona como aislante para aumentar en gran medida la velocidad de la conducción

gd; de impulsos axonales [1]. La proteína proteolipídica de mielina (PLP) es la principal

gd; proteína encontrada en la vaina de los nervios del sistema nervioso central [2].

gd; Traspasa 4 veces la membrana [3] y se cree que está implicada en l formación o el

gd; mantenimiento de la estructura multilamelar. La proteína contiene varios restos de

gd; cisteína, algunos implicados en la formación de enlaces disulfuro, estando otros

gd; palmitoilados [2]. Las mutaciones en PLP dan como resultado trastornos neurológicos,

gd; tales como la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher en seres humanos, 'jimpy' en

gd; ratones y 'perro temblador' en perros.

gd; MYELINPLP es una huella de 7 elementos que proporciona una firma para las

gd; proteínas proteolipídicas de mielina. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de

gd; 4 secuencias: los motivos 1,2, 5 y 7 codifican los 4 dominios transmembrana (TM) - el

gd; motivo 4 incluye la región codificada por el patrón MYELIN_ PLP_1 (PS00575) de

gd; PROSITE, que está ubicada entre los segmentos segundo y tercero TM y contiene 2

gd; restos de Cys que están palmitoilados; el motivo 7 incluye parte de la región

gd; codificada por el patrón MyELIN_PLP_2 (PS01004) de PROSITE. Para alcanzar la

gd; convergencia, se necesitaron dos interacciones en OWL23.2, punto en el cual se gd; identificó un conjunto auténtico que comprendía 9 secuencias. También se gd; encontraron varias coincidencias parciales, todas las cuales son mutantes de gd; eliminación o fragmentos de PLP de mielina.

gd; Una actualización en SPTR37_9f identificó un auténtico grupo de 8 secuencias y 9 gd; coincidencias parciales.

CHLAMIDIAOM

HMMER 2.3.2 (Oct 2003)

5 __________________________________________________________

HMMfile: prints.hmm

Archivo de secuencia: rheu.cd.212rp.365 22305.sreformat_______

CHLAMIDIAOM3_3: dominio 1 de 1, de 88 a 100: puntuación 4,6, E= 9,7 ■'-■'CgsYvPlCskpcGí-'

C+Y-Uk . G

rtxu L'd 21 as CTGYIL FCAKYTG 100

gr;

bb

gd

3. BACHMAIER, K., NEU, N., DE LA MAZA, L.M., PAL, S., HESSEL, A. Y PENNINGER, J.M.

Chlamydia infections and heart desease linked through antigenic mimicry SCIENCE 283 1335-1339 (1999).

La proteína rica en tres cisteínas (que también se cree que es una lipoproteína) forma la matriz extracelular de la membrana externa de Chlamydia [1]. Están implicadas en la integridad estructural esencial de la fase tanto de cuerpo elemental (EB) como de cuerpo reticulado (RB).

Ya que estas bacterias carecen de la capa de peptidoglucano común para la mayoría de microbios gramnegativos, dichas proteínas son muy importantes en la patogenicidad del organismo.

La mayor de estas es la proteína principal de la membrana externa (MOMP) y supone aproximadamente un 60 % de la proteína total de la membrana [2], oMP2 es la segunda más grande, con una masa molecular de S8kDa, mientras que la proteína OMP3 tiene ~15kDa [1]. Se cree que MCMP desencadena la respuesta inmunitaria más fuerte y recientemente se ha relacionado con la enfermedad cardíaca por su similitud de secuencia con una alfa miosina específica de músculo cardíaco murino [3].

La familia OMP3 desempeña un papel estructural en la membrana externa durante la etapa EB de la célula de Chlamydia y diferentes variantes biológicas muestran un pequeño, aunque muy significativo, cambio a nivel de carga del péptido [1]. Los miembros de esta familia incluyen C. trachomatis, C.pneumoniae y C.psittaci.

gd

CHLAMIDIAOM3 es una huella de 3 elementos que proporciona una firma para la familia de proteína 3 de la membrana externa rica en cisteína (OMP3) de Chlamydia. La huella se obtuvo de un alineamiento inicial de 3 secuencias: los motivos se representaron a partir de regiones conservadas que abarcan la longitud completa del alineamiento (~90 aminoácidos). Para alcanzar la convergencia, se necesitaron dos interacciones en SPTR37_10f, punto en el cual se identificó un conjunto auténtico que comprendía 8 secuencias.

La presente invención también se refiere a un cebador oligonucleotídico que comprende o consiste en parte de un 10 poli(ácido nucleico) como se ha definido anteriormente, siendo dicho cebador capaz de actuar como cebador para secuenciar de manera específica o amplificar de manera específica el poli(ácido nucleico) de HCR de virus TT de la invención y las secuencias de ADN celular (del hospedador).

El término "cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótido de ADN capaz de actuar como punto de inicio para la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico que se 15 va a copiar. La longitud y la secuencia del cebador ha de ser tal que permita el cebado de la síntesis de los productos de extensión. Preferentemente, el cebador tiene aproximadamente 5-50 nucleótidos. La longitud y

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secuencia específicas dependerán de la complejidad de las dianas de ADN o ARN necesarias, así como las condiciones de uso del cebador, tales como la temperatura y la fuerza iónica.

El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que coincidir exactamente con la secuencia de molde para garantizar una amplificación adecuada se ha documentado ampliamente en la bibliografía. El procedimiento de amplificación usado puede ser reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o amplificación mediante Qp replicasa o cualquier otro procedimiento adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico usando extensión de cebadores. Durante la amplificación, pueden marcarse de manera conveniente los productos amplificados usando cebadores marcados o incorporando nucleótidos marcados.

Los marcadores pueden ser isotópicos (32P, 35S, etc.) o no isotópicos (biotina, digoxigenina, etc.). La reacción de amplificación se repite entre 20 y 70 veces, ventajosamente entre 25 y 45 veces.

Puede usarse cualquiera de una serie de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente la información genética vírica y determinar el ORF traduciendo la secuencia de la muestra en la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las reacciones de amplificación ilustrativas incluyen las basadas en técnicas desarrolladas por Sanger o Maxam y Gilbert. También se contempla que puedan utilizarse una serie de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se llevan a cabo los presentes ensayos, incluyendo secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo: la publicación PCT WO 94/16101). Será evidente para un experto en la materia que, por ejemplo, la aparición de solo dos o tres bases de nucleótidos ha de determinarse en la reacción de secuenciación.

Preferentemente, estos cebadores tienen de 5 a 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente, de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos. Los más preferidos son cebadores que tienen una longitud de al menos 13 bases. Preferentemente, un cebador desvelado en el presente documento tiene una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la tabla 2.

Tabla 2

Cebadores usados para generar genomas de VTT-HD completos y genomas subvíricos de pVTT-HD mediante amplificación por PCR de larga distancia

VTT: Cebador Número de nucleótidos Secuencia

VTT-jt34f (n.° de ref. AB064607): jt34f-1s 223-247 5’-GGCCGGGCCA TGGGCAAGGC TCTTA-3’

: jt34f-2as 195-222 5’-AGTCAAGG GG CAATTCGGGC TCGGGACT-3’

: jt34f-5s 205-222 5’-CAATTCGGGC TCGGGACT-3’

: jt34f-6as 186-204 5'-ACACACCGCA GTCAAGGGG-3'

: jt34f-7s 205-223 5’-CAATTCGGGC TCGGGACTG-3’

: jt34f-8as 181-204 5’-AGTTTACACA CCGCAGTCAA GGGG-3’

VTT-HD1 (n.° de ref. AJ620222): th25-1s 126-156 5-CCGCAGCGAG AACGCCACGG AGGGAGATCC T-3'

: tth25-2as 95-125 5 '-ACTTCCGAAT GGCTGAGTTT TCCACGCCCG T-3'

VTT-HD3 (n.° de ref. AJ620231): tth8-1s 133-164 5' -AGAGGAGCCACGGCAGGGGA TCCGAACGTC CT-3'

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(continuación)

VTT: Cebador Número de nucleótidos Secuencia

: tth8-2as 102-132 5 '-CTT ACCGACT CAAAAACGAC GGGCAGGCGC C

VTT-HD4 (n.° de ref. AJ620226): tth4-1s 129-156 5 '-CAGCGAGAAC GCCACGGAGG GAGATCCT- 3'

: tth4-2as 101-128 5’-GAATGGCTGA GTTTTCCACG CCCGTCCG-3’

VTT-t3pb (n.° de ref. AF247138): t3pb-1s 209-226 5-CAATTCGGGC ACGGGACT-3' *

: t3pb-2as 185-208 5'-AGTTTACACA CCGAAGTCAA GGGG-3'

* A - La secuencia de VTT-t3pb tiene una T en esta posición

La presente invención también se refiere a una sonda oligonucleotídica que comprende o consiste en parte de un poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado como se ha definido anteriormente, siendo dicha sonda capaz de actuar como sonda de hibridación para la detección específica de un ácido nucleico de VTT de acuerdo con la invención.

El término "sonda" se refiere a oligonucleótidos específicos de secuencia monocatenarios que tienen una secuencia que es complementaria a la secuencia diana del poli(ácido nucleico) de VTT que se va a detectar.

Preferentemente, estas sondas tienen de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente, de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos. Las más preferidas son sondas que tienen una longitud de al menos 13 bases.

La sonda puede estar marcada o unida a un soporte sólido.

La expresión "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato al que pueda acoplarse a una sonda oligonucleotídica, a condición de que conserve sus características de hibridación y a condición de que el nivel de fondo de hibridación permanezca bajo. Normalmente, el sustrato sólido será una placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo, nilón o nitrocelulosa) o una microesfera (perla). Antes de la aplicación a la membrana o de la fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico para facilitar su fijación o mejorar la eficacia de la hibridación. Dichas modificaciones pueden abarcar la adición de colas de homopolímero, acoplamiento con diferentes grupos reactivos, tales como grupos alifáticos, grupos NH2, grupos Sh, grupos carboxílicos o acoplamiento con biotina o haptenos.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, usados como cebadores o sondas, también pueden contener o consistir en análogos de nucleótidos, tales como fosforotioatos, alquilfosforotioatos o ácidos nucleicos peptídicos o pueden contener agentes intercalantes. Estas modificaciones necesitarán adaptaciones respecto de las condiciones en las que debería usarse el oligonucleótido para obtener la especificidad y sensibilidad necesaria. Sin embargo, los eventuales resultados serán esencialmente los mismos a los obtenidos con los oligonucleótidos no modificados.

Puede ser ventajosa la introducción de estas modificaciones para influenciar positivamente características tales como la cinética de hibridación, la reversibilidad de la formación de híbridos, estabilidad biológica de las moléculas de oligonucleótido, etc. Los poli(ácidos nucleicos) de la invención pueden estar comprendidos en una composición de cualquier tipo. Dicha composición puede ser para uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico.

En el presente documento también se desvelan variantes de secuencia de los poli(ácidos nucleicos) seleccionados de cualquiera de las secuencias de nucleótidos con dichas variantes que contienen eliminaciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos, especialmente inserciones o eliminaciones de 1 o más codones, principalmente en las extremidades de los oligonucleótidos (3' o 5') o sustituciones de algunos nucleótidos no esenciales por otros (incluyendo nucleótidos modificados y/o inosina).

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Las secuencias de poli(ácido nucleico) de VTT reorganizadas de acuerdo con la presente invención que son similares a las secuencias mostradas en la figura 1 pueden caracterizarse y aislarse de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, tales como amplificación mediante cebadores específicos de secuencia, hibridación con sondas específicas de secuencia en condiciones más o menos rigurosas, determinación de secuencia de la información genética de VTT, etc.

La presente invención también se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un poli(ácido nucleico) de VTT reorganizado de la invención como se ha definido anteriormente, ligado funcionalmente a elementos de control de la transcripción y traducción procarióticos, eucarióticos o víricos.

El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial, un fago o un virus o un animal transgénico no humano. Particularmente útiles para el desarrollo de vacunas pueden ser moléculas recombinantes de virus TT, BCG o vectores adenovíricos, así como virus recombinantes de la viruela aviar.

La expresión "expresado de forma recombinante" empleada en el contexto de la presente invención, se refiere al hecho de que los polipéptidos de la presente invención se producen mediante procedimientos de expresión recombinantes ya sea en procariotas o eucariotas inferiores o superiores, como se describe más detalladamente a continuación.

La expresión "eucariota inferior" se refiere a células hospedadoras tales como levaduras, hongos y similares. Los eucariotas inferiores son por lo general (pero no necesariamente) unicelulares. Eucariotas inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies dentro de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluiveromyces, Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), Hansenula (por ejemplo, Hansenula polymorph), Schwanomyces, Schizosaccharomyces, Yarowia, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbegensis and K. lactis son los hospedadores de levadura empleados más comúnmente, y son hospedadores fúngicos convenientes.

La expresión "eucariota superior" se refiere a células hospedadoras obtenidas a partir de animales superiores, tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Células hospedadoras eucariotas superiores preferidas actualmente se obtienen a partir de células de hámster chino (por ejemplo, CHO), mono (por ejemplo, COS y células Vero), riñón de hámster bebé (BHK), riñón de cerdo (PK15), células de riñón de conejo 13 (RK13), la línea celular de osteosarcoma humano 143 B, la línea celular humana HeLa y líneas celulares de hepatoma humano tales como Hep G2, y líneas celulares de insecto (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las células hospedadoras se pueden proporcionar en cultivos en suspensión o en matraz, cultivos de tejidos, cultivos de órganos y similares. Como alternativa, las células hospedadoras también pueden ser animales transgénicos no humanos.

El término "procariotas" se refiere a hospedadores tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. También estos hospedadores se contemplan dentro de la presente invención.

La expresión "célula hospedadora" se refiere a células que se pueden haber utilizado o se han usado como receptores para un vector recombinante u otro polinucleótido de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que se ha transfectado.

Se entiende que la progenie de una única célula parental puede que no sea necesariamente completamente idéntica en la morfología o en el complemento de ADN genómico o total, a la parental original, debido a una mutación o recombinación natural, accidental o deliberada.

El término "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como a una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos dentro de una célula, es decir, es capaz de una replicación bajo su propio control.

El término "vector" es un replicón que comprende además secuencias que proporcionan una replicación y/o una expresión de un marco de lectura abierto deseado.

La expresión "elemento de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme y terminadores; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores, sitios de corte y empalme, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. La expresión "elementos de control" se entiende que incluye, como mínimo, todos los componen-tes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder que gobiernan la secreción.

El término "promotor" es una secuencia de nucleótidos que se compone de secuencias de consenso que permiten la unión de la ARN polimerasa con el molde de ADN, de manera que esa producción de ARNm se inicia en el sitio normal de iniciación de la transcripción para los genes estructurales adyacentes.

La expresión "ligado funcionalmente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de este modo están en una relación que les permite actuar de la manera pretendida. Una secuencia de control "ligada funcionalmente" a una secuencia codificante, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante

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se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El segmento del ADN de VTT reorganizado que codifica la secuencia deseada insertada en la secuencia del vector, se puede fijar a una secuencia señal. Dicha secuencia señal puede ser la que proviene de una fuente no VTT, pero las estructuras artificiales particularmente preferidas de acuerdo con la presente invención, contienen secuencias señal que aparecen en el genoma de VTT antes de los respectivos puntos de inicio de las proteínas.

Los eucariotas superiores se pueden transformar con vectores, o pueden estar infectados con un virus recombina-te, por ejemplo, un virus vaccinia recombinante. Las técnicas y los vectores para la inserción de ADN extraño en virus vaccinia son bien conocidos en la técnica, y utilizan, por ejemplo, la recombinación homóloga. Una amplia variedad de secuencias promotoras víricas, posiblemente secuencias terminadoras y secuencias de adición de poli(A), posiblemente secuencias potenciadoras y posiblemente secuencias de amplificación, todas necesarias para la expresión en mamíferos, están disponibles en la técnica. El virus vaccinia es particularmente preferido ya que el virus vaccinia detiene la expresión de las proteínas de células hospedadoras. Para una vacunación de los seres humanos, la viruela aviar y el virus Ankara modificado (AMV) son vectores particularmente útiles.

También se conocen vectores de transferencia de expresión de insectos obtenidos a partir del baculovirus, virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV), que es un vector de expresión vírica independiente auxiliar. Los vectores de expresión obtenidos a partir de este sistema normalmente utilizan el potente promotor del gen de polihedrina vírica para dirigir la expresión de genes heterólogos. Diferentes vectores así como procedimientos para la introducción de ADN heterólogo en el sitio deseado de baculovirus están disponibles para el experto en la técnica, para la expresión de baculovirus. También diferentes señales para una modificación posterior a la traducción, reconocidas por células de insectos, son conocidas en la técnica.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora tal y como se ha definido anteriormente, transformada con un vector recombinante como se ha definido anteriormente.

La presente invención también se refiere a un kit diagnóstico para su uso en determinar la presencia de un poli(ácido nucleico) de virus TT de la invención, comprendiendo dicho kit un cebador y/o una sonda de la invención.

Como alternativa, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la detección de un poli(ácido nucleico) de VTT reorganizado de acuerdo con la invención presente en una muestra biológica, que comprende: (a) opcionalmente extraer una muestra de poli(ácido nucleico), (b) amplificar el poli(ácido nucleico) como se ha descrito anteriormente con al menos un cebador como se ha definido anteriormente, opcionalmente un cebador marcado y (c) detectar los poli(ácidos nucleicos) amplificados.

La expresión "poli(ácido nucleico)" también puede citarse como hebra de analito y corresponde a una molécula de poli(ácido nucleico) mono o bicatenaria.

El término "marcado" se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados. Esto puede incluir el uso de nucleótidos marcados incorporados durante la etapa de polimerasa de la amplificación o cebadores marcados o mediante cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la materia.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la detección de un poli(ácido nucleico) de VTT reorganizado de acuerdo con la invención presente en una muestra biológica, que comprende: (a) opcionalmente extraer una muestra de poli(ácido nucleico), (b) hibridar el poli(ácido nucleico) como se ha descrito anteriormente con al menos una sonda como se ha definido anteriormente y (c) detectar los poli(ácidos nucleicos) hibridados.

Las condiciones de hibridación y lavado deben entenderse como rigurosas y son generlamente conocidas en la técnica (por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Sin embargo, según la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deben hibridarse a su temperatura adecuada para lograr una especificidad suficiente.

Según la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deben hibridarse de manera rigurosa a su temperatura adecuada para lograr una especificidad suficiente. Sin embargo, mediante una ligera modificación de las sondas de ADN, ya sea añadiendo o eliminando uno o unos pocos nucleótidos en sus extremos (3' o 5') o sustituyendo algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no esenciales para discriminar entre tipos) por otros (incluyendo nucleótidos modificados o inosina) puede hacerse que estas sondas o variantes de las mismas hibriden específicamente en las mismas condiciones de hibridación (es decir, la misma temperatura y la misma solución de hibridación). Asimismo, el cambio de la cantidad (concentración) de sonda usada puede ser beneficioso para obtener resultados de hibridación más específicos. Cabe destacar en este concepto, que las sondas de la misma longitud, independientemente de su contenido de GC, hibridarán específicamente aproximadamente a la misma temperatura en las soluciones TMACI.

Los procedimientos de ensayo adecuados a efectos de la presente invención para detectar híbridos entre las sondas oligonucleotídicas y las secuencias de poli(ácido nucleico) en una muestra pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo conocidos en la técnica, tales como el formato de transferencia por puntos convencional, hibridación de tipo sándwich o hibridación inversa. Por ejemplo, la detección puede lograrse usando un formato de transferencia por puntos, uniéndose la muestra amplificada sin marcar a una membrana, incorporándose la membrana con al menos una sonda marcada en condiciones de hibridación y lavado adecuadas y controlándose la presencia de sonda unida.

Un procedimiento alternativo y preferido es un formato de transferencia por puntos "inversa", en la que la secuencia amplificada contiene un marcador. En este formato, las sondas oligonucleotídicas no marcadas se unen a un soporte

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sólido y se exponen a la muestra marcada en condiciones de hibridación y lavado posterior rigurosas adecuadas. Cabe destacar que también puede usarse otro procedimiento de ensayo que se base en la formación de un híbrido entre los poli(ácidos nucleicos) de la muestra y las sondas oligonucleotídicas de acuerdo con la presente invención.

Finalmente, en el presente documento se desvela un proceso para la replicación y propagación in vitro torque teno virus (VTT), preferentemente un VTT reorganizado de acuerdo con la presente invención, que comprende las siguientes etapas:

(a) transfectar ADN de VTT linealizado en células 293TT que expresan altos niveles del antígeno T grande SV40, preferentemente al menos niveles como los comunicados en Buck y col. (2004);

(b) recoger las células y aislar las células que muestran la presencia de ADN de VTT;

(c) cultivar las células obtenidas en la etapa (b) durante al menos tres días, preferentemente al menos una semana o más, dependiendo de las condiciones experimentales y el tipo de VTT concreto; y

(d) recoger las células de la etapa (c).

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

(A) Aislamiento y caracterización de virus TT

El aislamiento de los aislados de virus TT VTT-HD3a (tth8, n.° de referencia AJ620231) y VTT-HD1a (tth25, n.° de ref. AJ620222) se ha descrito con anterioridad (Jelcic y col., 2004). Se clonaron las secuencias genómicas de longitud completa de VTT-HD3a y VTT-HD1a en el vector pUC18 usando las enzimas de restricción Sail (Leppik y col., 2007) y EcoRI, respectivamente. Se identificaron secuencias de VTT adicionales en muestras humanas mediante amplificación de ADN anidada usando los cebadores NG472/NG352 y NG473/NG351 como se ha descrito con anterioridad (Peng y col., 2002; Leppik y col., 2007). La disponibilidad limitada de ADN para una serie de muestras de biopsia y suero requirió antes de la amplificación el uso de amplificación de círculo rodante con un kit TempliPhi (GE Healthcare). Se clonaron y secuenciaron todos los productos amplificados (Leppik y col., 2007). Posteriormente, las muestras que portaban ADN de virus TT se sometieron a amplificación PCR de larga distancia usando la enzima Taq de TaKaRa LA (TAKARA BIO INC., Japón) y los cebadores respectivos que se habían diseñado basándose en las secuencias de ADN de VTT identificadas inicialmente. Estos cebadores consecutivos incluyeron las siguientes combinaciones: tth25-1s y tth25-2as, jt34f-1s y jt34f-2as, jt34f-7s y jt34f-8as, jt34f-5s y jt34f- 6as, tth4-1s y tth4-2as, t3pb-1s y t3pb-2as, así como tth8-1s y tth-2as (tabla 2). La amplificación por PCR larga se llevó a cabo usando una reacción de aterrizaje por etapas como se ha descrito anteriormente (Leppik y col., 2007) con la excepción de combinaciones de cebadores t3pb-1/2, jt34f-5/6 y tth4. Las condiciones de la PCR para la amplificación por PCR con los cebadores t3pb-1/2 y jt34f-5/6 fueron una desnaturalización inicial a 94°C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 30 s, hibridación a 65°C durante 1 min y elongación a 72°C durante 4 min con una elongación final a 72°C durante 10 min. Las condiciones de la PCR para la amplificación con los cebadores tth4 fueron similares, salvo por que la hibridación se llevó a cabo a 68°C. Todos los amplicones obtenidos en el intervalo de 3,8 kb se eluyeron y purificaron tras la electroforesis en gel, se clonaron en el vector pCR2.1 (TA- Cloning-Kit, Invitrogen) y se propagaron en células competentes NovaBlue Singles (Merck Chemicals, R. U.). Todos los genomas de longitud completa se secuenciaron a lo largo de ambas hebras. Se obtuvo un total de 53 genomas de longitud completa.

(B) Análisis de secuencia y filogenia

Las secuencias de ADN se compararon con secuencias de VTT en todos los bancos de datos usando el paquete informático HUSAR (Jelcic y col., 2004). El ICTV clasificó recientemente los virus TT en la familia Anelloviridae basándose en la secuencia de ADN del marco abierto de lectura 1 grande (ORF1) (Biagini y de Micco, 2010). La caracterización de los genomas de los aislados obtenidos reveló la reorganización de secuencias en la región ORF1. Los genomas de longitud completa del género Alfatorque virus y los aislados se sometieron, por tanto, a análisis filogenéticos como se ha descrito anteriormente (Jelcic y col., 2004). El árbol filogenético (figura 4) se presentó usando el programa Treeview de la University of Glasgow. Los ORF traducidos se analizaron respecto de proteínas homólogas y dominios funcionales usando ProtSweep (del Val y col., 2004).

(C) Cultivo celular y transfección

Se mantuvo la estirpe celular de riñón embrionario humano 293TT (Buck y col. 2004) en DMEM complementado con suero de ternero fetal al 10 %, Glutamax al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % (ambos de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y 400 jg/ml de higromicina B (Roche Diagnostics, Mannheim). El ADN de virus linealizado (2 |jg por pocillo en placas de 6 pocillos) se transfectó el células cultivadas sin higromicina B usando el reactivo Lipofectamine (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante (Fei y col., 2005). El medio de cultivo (2 ml) se complementó con 800 jl de Opti-MEM antes de la incubación durante 4 horas a 37°C. Los cultivos transfectados se incubaron posteriormente con medio fresco que contenía higromicina B y se propagaron cuando se alcanzó la confluencia. Se transfectaron los genomas de longitud completa de 12 aislados de VTT, se mantuvieron y se recogieron en paralelo

en todos los instantes. Los genomas de virus TT incluyeron VTT-HD14a, VTT-HD14b, VTT-HD14c, VTT-HD14e, VTT-HD15a, VTT-HD16a, VTT-HD20a, VTT-HD3a, VTT-HD1a, VTT-HD23a, VTT-HD23b y VTT-HD23d (tabla 3).

Tabla 3

Genomas de TT de longitud completa (3,8 kb)

Genomas subvíricos

tth25: HD1a

tth3: HD1b

tth9: HD1c

tth16: HD1d

tth17: HD1e

tth26: HD1f

tth27: HD1g

tth31: HD1h

tth5: HD2a

tth14: HD2b

tth29: HD2c

tth8: HD3a

tth7: HD3b

tth13: HD3c

tth19: HD3d

tth22g4: HD3e

tth23: HD3f

tth4: HD4

tth10: HD5a

tth11g2: HD5b

tth18: HD5c

tth21: HD5d

tth6: HD6a

tth20: HD6b

tt32c2: HD7

Ü32b8: HD8

sle1957: HD9

sle1931: HD10a

sle1932: HD10b

sle2045: HD10c

s1e2037: HD11

sle2065: HD12a

sle2057: HD12b

SI&2058: HD12c

sle2061: HD12d

sle2072: HD12e

gB20,33: HD13a

gB20.58: HD13b

gB21.51: HD13c

gbDhDÍ33.32: HD14a

gbCuCv33.2: HD14b

gbDhDi33.31: HD14C

gbDhD¡33.33: HD14d

gbDhDi33.35: HD14e

gbDhDi32.36: HD14f

¿¿TTV-HD1 - zpr9.B1.6 (621nt)

P.TTV-HD14.1 - zpr4.B5.20 (719nt) /¿TTV-HD14.2- zpr4.B6.125 (1224ni}

(continuación)

Genomas de TT de longitud completa (3,8 kb)

gbDfDg33.45 HD14g gbDfDg33.48 HD14h gbDfDg33.49 HD14Í

gbCsCt38.1: HD15b

gbCsCt38.2: HD15a

gbCsCt38.4: HD15c

gbCsCt38.6: HD15d

gbCsCt43.2: HD16a

gbCsCt43.1: ■ HD16b

gbCsCt43.3: HD16C

gbCsCt43.5: HD16d

gbCsCt43.6: HD16e

gbCuCv43.1: HD16f

gbCuCv43.4: HD16g

gbDhDi43.1: HD16h

gbDhD¡43.4: HD16Í

gbDhDi43.6: HD16j

gbDhD¡43.7: HD16k

gbDhDi43.22 HD16I

uro702: HD17

uro 703: HD18a

uro705: HD18b

rheu242: HD19

uro960: HD20a

uro742: HD20b

uro745: HD20c

uro746: HD20d

uro953: HD20e

uro958: HD20f

rheu111: HD21

rheu112: HD22

rheu215: HD23a

rheu210: HD23b

rheu211: HD23c

rheu212: HD23d

rheu213: HD23e

rheu214: HD23f

rheu231: HD24b

rbeu232: HD24a

rbeu234: HD24c

rheu236: HD24d

rbeu238: HD24e

rheu241: HD24f

Genomas subvíricos

¿iTTV-HD15-zpr5.B4.12 (913nt)

¿iTTV-HD23.1 -zpr12.B2.22 (401nt) ¿iTTV-HD23.2 - zpr12.B5.24 (642nt)

El ADN de virus se liberó del vector antes de la transfección. Los controles incluyeron transfección solo con vector y células transfectadas con 1 x TE. Las células transfectadas y el medio de cultivo se congelaron a -80°C y se tomaron muestras para la extracción de ADN y ARN en cada punto de tiempo durante la propagación. El ADN se extrajo con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y el ARN usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Se controló la 5 replicación del ADN de virus y se demostró mediante amplificación por PCR larga como se ha descrito anteriormente. Todos los experimentos de transfección se llevaron a cabo 3 veces a intervalos de 6 semanas entre

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las transfecciones primarias. Las células congeladas o las preparaciones de virus purificadas se pasaron entre 4 a 6 veces.

(D) Propagación de virus, purificación y microscopía electrónica

Se recogieron las células transfectadas de los matraces mediante agitación, seguido de centrifugación durante 10 min a 200 g. Los sedimentos celulares se resuspendieron en DPBS-Mg (Invitrogen) y se separaron en gradientes de Optiprep a etapas del 27-33-39 % (Sigma, St. Louis, MO) durante 3,5 h a 234.000 g (Buck y col., 2005). Los gradientes se fraccionaron y exploraron respecto de la presencia de ADN de virus mediante electroforesis en gel de alícuotas lisadas. Las alícuotas se lisaron con proteinasa K, EDTA 0,25 mM y SDS al 0,5 % durante 10 min a 56°C inmediatamente antes de cargarlas en el gel. El sobrenadante de las células resuspendidas se filtró, como altenativa, a través de un filtro de 0,22 pm. Las alícuotas de fracciones de gradiente, así como los sobrenadantes filtrados, se congelaron a -80°C para su uso como inóculo. Las alícuotas filtradas se sedimentaron. Los sedimentos se sometieron a tinción negativa y se visualizaron mediante microscopía electrónica. Los genomas de pVTT subvíricos se transfectaron en 293TT del mismo modo que los genomas de longitud completa. Los cultivos se propagaron a lo largo de varias semanas. Las células se retiraron parcialmente raspando una parte de las monocapas de células, mientras que se permitía el recrecimiento de las demás células. Las células retiradas se sedimentaron y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm antes de su visualización por microscopía electrónica. Los sedimentos celulares se trataron como se ha descrito anteriormente antes de la centrifugación y separación mediante gradientes de Optiprep. Se lisaron alícuotas y se visualizó el ADN después de la electroforesis en gel.

(E) Análisis de transcripción

Se analizaron transcritos de genomas de longitud completa de VTT-HD usando dos estrategias diferentes. Los productos de RACE 5' y 3' se generaron a partir de ADNc tanto mono como bicatenario. Los ADNc monocatenarios preparados para 5'-RACE y 3'- RACE se sintetizaron, respectivamente, a partir de 1 pg de ARN total purificado en una mezcla de reacción de 10 pl usando el kit de amplificación de ADNc SMART-er™RACE (Clontech n.° de cat. 634923) en el que el ARN se retrotranscribe mediante la retrotranscriptasa SMARTScribe™ a 42°C durante 90 min. Se usó el cebador A de 3'RACE-CDS para la síntesis del ADNc preparado para 3'RACE, mientras que se usaron el cebador A de 5'RACE-CDS y el oligonucleótido SMARTer IIA para la síntesis del ADNc preparado para 5'-RACE. El ADNc bicatenario se sintetizó de manera concomitante. En este caso, el ADNc monocatenario de longitud completa se sintetizó inicialmente usando el kit de síntesis de ADNc por PCR SMARTer™ (Clontech, n.° de cat. 634925) según el protocolo del fabricante. El ARN total purificado (1 pg) se transcribió usando la retrotranscriptasa SMARTScribe™ y los cebadores 3'SMART CDS PrimerllA y el oligonucleótido SMARTer IIA. Estos cebadores contienen en ambos casos una serie de nucleótidos no de molde, creando de este modo un molde extendido. La amplificación de la segunda hebra de ADNc se obtuvo mediante amplificación por PCR de larga distancia (LD PCR) con el cebador IIA de 5'PCR y la mezcla de polimerasa Advantage 2 (Clontech n.° de cat. 639201). La amplificación por PCR se llevó a cabo del siguiente modo: 15 s a 95°C, 30 s a 65°C y 3 min a 68°C por ciclo y variando el número de ciclos para determinar las condiciones óptimas.

La amplificación por PCR 5' y 3'-RACE se llevó a cabo usando ADNc preparado para 5'-RACE o preparado para 3'- RACE, respectivamente o molde de ADNc bicatenario en ambos casos. La RACE-PCR se llevó a cabo usando mezcla de polimerasa Advantage 2, una mezcla universal de cebador A (UPM) del kit de amplificación de ADNc SMARTer™RACE y cebadores directos e inversos que se ajustan a los respectivos tipos de VTT (tabla 4).

Tabla 4

Posiciones de nucleótidos de los cebadores usados para la amplificación por PCR en RACE

VTT: cebador Número de nucleótidos transcrito

VTT-HD14b: 1-f1 716-743 +

: 1-f3 2886-2912 +

: 1-r1 757-730 +

: 1-r2 3521-3492 +

VTT-HD14c: 2-f1 716-743 +

: 2-f2 3054-3082 +

: 2-r3 2912-2885 +

VTT-HD14a: 3-f1 717-744 +

: 3-f2 2890-2917 +

: 3-f3 3496-3521 +

(continuación)

VTT: cebador Número de nucleótidos transcrito

: 3-r1 745-720 -

: 3-r2 2914-2887 +

VTT-HD14e: 4-f1 2887-2914 +

: 4-f2 3494-3519 +

: 4-f3 3053-3080 +

: 4-r1 757-730 +

: 4-r2 2911-2884 +

VTT-HD15a: 5-f1 125-149 +

: 5-f2 2807-2834 +

: 5-f3 3388-3415 +

: 5-r1 224-197 +

: 5-r2 3014-2987 +

: 5-r3 3425-3398 -

VTT-HD16a: 6-f1 100-127 +

: 6-f2 3145-3172 -

: 6-f3 3564-3591 -

: 6-r1 3204-3182 +

: 6-r2 3443-3418 -

VTT-HD20a: 7-f1 314-341 +

: 7-f2 3025-3052 +

: 7-r1 227-200 +

: 7-r2 743-716 +

: 7-r3 3332-3305 -

VTT-HD23b: 10-f1 113-139 -

: 10-f3 3121-3148 +

VTT-HD23d: 11-f1 126-148 +

: 11-f2 354-381 +

: 11-f3 3397-3422 -

: 11-r1 226-199 +

: 11-r2 3653-3626 +

: 11-r3 3327-3302 +

VTT-HD23a: 12-f1 126-148 +

: 12-f2 354-381 +

: 12-r2 3177-3150 +

: 12-r3 3326-3301 +

Las condiciones de amplificación fueron: 29 ciclos de 30 s a 94°C, hibridación durante 30 s a 68°C y elongación durante 3 min a 72°C, con una extensión final durante 15 min a 72°C. Todos los productos se analizaron mediante electroforesis en gel, se purificaron después de la elución del gel, se clonaron en el vector pCR2.1 (Invitrogen, n.° de 5 cat. K2020-40) y se secuenciaron. Se llevaron a cabo dos controles adicionales para controlar la amplificación no específica. En un control, la amplificación se llevó a cabo usando únicamente un cebador específico para VTT y en el segundo usando el cebador UPM solo. No se detectaron productos en cualquiera de estos.

Ejemplo 2

Demostración de la persistencia del ADN de VTT en células procedentes de líneas de cultivo de tejidos 10 obtenidas a partir de tumores malignos

Las líneas celulares obtenidas a partir de tumores malignos poseen una ventaja sobre el material de una biopsia de

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tumor primario. Comúnmente representan preparaciones puras de células de cáncer, mientras que los mate-riales primarios generalmente están contaminados por células mesenquimatosas normales, por células del sistema hematopoyético y células epiteliales normales. Por otra parte, un inconveniente de las líneas de cultivo de tejidos puede surgir de la selección de clones específicos que crecen en condiciones de cultivo de tejidos y la adquisición de modificaciones genéticas secundarias durante el curso de un cultivo a largo plazo. Además, los sueros de ternera fetal pueden suponer un riesgo debido a la introducción de virus del ganado que sobreviven después de procedimientos de inactivación del suero (por ejemplo, poliomavirus bovino); véase la tabla 5 que resume estas ventajas/inconvenientes.

Tabla 5

Análisis de biopsias de tumores primarios frente a líneas celulares establecidas para secuencias relacionadas con el VTT

Biopsias: Líneas celulares

Ventaja: Inconveniente Ventaja Inconveniente

Materiales auténticos: Contaminadas por mezcla por adición de células normales Preparaciones puras de células de cáncer Selección de clones específicos adaptados a las condiciones de cultivo de tejidos

: Búsqueda complicada de secuencias de vTt por la presencia uniforme de VTT en la sangre periférica Disponibilidad limitada Disponibles en cantidades ilimitadas Cambios genéticos secundarios durante el cultivo a largo plazo El uso de suero de ternera fetal plantea el riesgo de contaminaciones con virus de ganado

Los intentos de encontrar ADN de VTT en materiales tumorales primarios humanos adolece de un inconveniente: la pluralidad de genotipos de VTT en el material humano. Esto hace que sea prácticamente imposible identificar un genotipo específico como un agente etiológico para un tipo de cáncer humano. Por estos motivos, se iniciaron estudios de la persistencia de secuencias de ADN de VTT en células obtenidas a partir de líneas de cultivo de tejidos de cáncer. Hasta ahora, los resultados han sido extremadamente sorprendentes: los cebadores para la PCR usados para descubrir regiones del marco de lectura abierto de VTT han sido del todo infructuosos. Sin embargo, otras combinaciones de cebadores, que descubrían exclusivamente una región reguladora corta, rica en GC del genoma VTT de aproximadamente 71 bases, detectaron esa secuencia en un mayor número de líneas celulares (Figura 1). Esta región reguladora está muy conservada entre diferentes genotipos de VTT y no está presente en la base de datos del genoma humano.

En una primera serie de experimentos, la misma secuencia fue descubierta en una serie de líneas celulares adicionales. Estas incluyen las siguientes líneas:

• MCF7 (línea de cáncer de mama);

• HAK-1, KMH-2, L1236 (todas líneas de linfoma de Hodgkin negativas para el virus Epstein-Barr);

• Y69 (linfoma B negativa para el virus Epstein-Barr)

• HSB-2 (leucemia linfocítica aguda);

• P3HR-1 (linfoma de Burkitt positiva para el virus Epstein-Barr);

• BJAB (linfoma de Burkitt negativa para el virus Epstein-Barr);

• Ng (linfoblastos B inmortalizados con EBV de un paciente con esclerosis múltiple).

Además de estas 9 líneas positivas, dos líneas celulares de melanoma (IGL y KR, Fig. 1) y ADN de la placenta humana eran negativos en los experimentos iniciales. Curiosamente, después de la eliminación del ADN enrollado de las células L1236 y el tratamiento con ARNasa de la solución restante, además del ADN mitocondrial, se convirtieron en bandas visibles dos bandas débiles de tamaño similar entre las posiciones 4,3-6,6 kb (marcador del tamaño del ADN de cadena doble) en los geles de agarosa (Fig. 2). Un análisis de estas secuencias reveló de nuevo la presencia de la región reguladora de VTT. La nucleasa de semilla de Mungo, que digiere selectivamente el ADN de cadena sencilla, suprimió completamente las bandas que contenían ADN celular procedentes de cuatro biopsias de esclerosis múltiple, en contraste con el ADN de cadena doble de control, lo que subraya la naturaleza de una sola hebra del primero. Estudios similares se están realizando actualmente para aislados de ADN tumoral.

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Análisis de secuencias de ADN de VTT quimérico/células hospedadoras truncadas

Inicialmente, todos los intentos fallaron para el uso de cebadores con orientación hacia fuera que comenzaban dentro de la región reguladora, con el fin de encontrar ADN del virus TT flanqueante, que rodeaba esta región. Invariablemente, sin embargo, el ADN celular humano se pudo demostrar en los respectivos clones (Fig. 3).

Los genes humanos en esos clones y sus disposiciones dentro del ADN episómico de una sola hebra, controlados obviamente por la región de 71 bases de VTT, están siendo analizados actualmente. Los datos disponibles indican una variación sustancial en la captación de genes de células hospedadoras comúnmente truncadas. Su posible conversión en oncogenes estimulantes del crecimiento o en funciones que interfieren con genes supresosres tumorales, requiere pruebas funcionales que se están investigando actualmente. Lo mismo explica las secuencias de virus VTT reorganizadas. Algunos de los datos disponibles se presentan en las Figuras 7, 8, 9 y 11 a 13.

Ejemplo 4

Identificación y caracterización de genomas de VTT

La amplificación de la región rica en GC conservada corta de los virus TT en suero y muestras de biopsia dio lugar a la identificación de ADN de VTT en la mayoría de casos. La posterior amplificación del genoma completo es necesaria para identificar tipos específicos de VTT ya que muchos comparten homología de ADN exacta en los 71 pb amplificados que se encuentran en la región de control, pero difieren en hasta un 60-80 % en la identidad de secuencia en el resto de sus genomas. Se diseñó una serie de combinaciones de cebadores consecutivos en secuencias obtenidas durante el transcurso de las investigaciones (tabla 2). La amplificación por PCR de larga distancia se llevó a cabo en muestras positivas a ADN de VTT. Se clonaron y secuenciaron amplicones en el intervalo de 3 a 4 kb. Las muestras positivas para ADN de VTT se originaron de sujetos sanos, así como de pacientes con leucemia, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad renal. Se ha descrito previamente parte de estos datos (Leppik y col., 2007; Sospedra y col., 2005; de Villiers y col., 2009).

Se caracterizó un total de 53 genomas de ADN de longitud completa. Se identificaron hasta 12 aislados de longitud completa tras secuenciar 19 genomas de una sola biopsia. La organización del genoma de diferentes aislados de un tipo de VTT varió a pesar de la baja diversidad de nucleótidos (en el intervalo del 1 - 4 %). Aunque estaba implicado principalmente el marco de lectura abierto OFR1, también se observaron diferencias dentro de la región no codificante y otros genes. Estos datos confirmaron observaciones más tempranas (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009). Las modificaciones en el ORF1 incluyeron codones de parada prematura que daban lugar a ORF más pequeños individuales en esta región, una diversidad de secuencia considerable en la región hipervariable (Nishizawa y col., 1999; Jelcic y col., 2004) o la ausencia de un codón de parada, que daba como resultado un ORF1 más grande que el presente en el prototipo (figura 16). La clasificación oficial de la familia Anelloviridae se basa en comparaciones de las secuencias de ADN del ORF1 (Biagini y de Micco, 2010). Debido a las modificaciones en el ORF1 en los aislados obtenidos, se incluyeron las secuencias genómicas de longitud completa en los análisis filogenéticos aquí presentados. El objetivo de este análisis fue tener una visión panorámica de los aislados de VTT-HD en relación con las especies de vTt establecidas (figura 18). Todos los aislados previos también se incluyen en este árbol (Jelcic y col., 2004; Leppik y col., 2007; de Villiers y col., 2009).

Ejemplo 5

Replicación in vitro de VTT-HD

Se ha informado repetidamente en el pasado de intentos para asociar la infección por torque teno virus con la patogénesis de una enfermedad específica. Se han analizado muestras de una gran variedad de enfermedades. Las investigaciones in vitro se vieron dificultadas por los intentos negativos para identificar un sistema de cultivo celular en el que estos virus pueden propagarse fácilmente a lo largo de periodos de tiempo más largos. Las partículas víricas se caracterizaron inicialmente con la ayuda de gradientes de densidad y agregados de inmunoglobulina (revisado en Okamoto, 2009) y posteriormente se visualizaron a partir de sueros y heces (Itoh y col., 2000). Los torque teno virus se producen principalmente en células del sistema hematopoyético (Okamoto, 2009). Los primeros aislados se obtuvieron del bazo de un paciente con linfoma de Hodgkin (Jelcic y col., 2004). Por lo tanto, se usó la línea celular L428 en los intentos iniciales para demostrar la replicación y la transcripción in vitro de VTT-HD3a. Se logró la replicación del genoma de longitud completa durante hasta 7 días después de la transfección del ADN vírico linealizado (Leppik y col., 2007). Para prolongar este periodo de replicación, se transfectaron genomas de VTT de longitud completa en la estirpe celular de riñón embrionario humano 293TT que se había modificado por ingeniería genética para expresar altos niveles del antígeno T grande de SV40 (Buck y col., 2004). En segundo lugar, se decidió incluir 12 aislados de longitud completa en este estudio para determinar si 1) las variaciones en el ORF1 podrían influenciar la replicación y la formación de partículas víricas, 2) los tipos divergentes de VTT varían en su modo de replicación. Se tomó un cuidado extremo para propagar los 12 aislados en paralelo para excluir las variaciones en la medida de lo posible, lo que puede producirse durante la manipulación.

Se seleccionaron los siguientes aislados para la transfección y la propagación: VTT-HD3a (Leppik y col., 2007) y VTT-HD1a (Jelcic y col., 2004). VTT-HD1a es el más estrechamente relacionado con la especie VTT3 (hel32) y VTT- HD3a a la especie VTT12 (ct44f) (figura 4). VTT-HD16a (relacionado con la especie VTT22), VTT-HD15a

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(relacionado con la especie VTT12), VTT-HD14a, VTT-HD14b, VTT-HD14c y VTT-HD14e (relacionados con la especie VTT29) se aislaron de biopsias cerebrales de pacientes con esclerosis múltiple. VTT-HD20a (relacionado con la especie VTT13-) se originó de tejido renal y vTT-HD23a, VTT-HD23b y VTT-HD23d (relacionados con la especie VTT3) se amplificaron de suero extraído de pacientes con artritis reumatoide. Las secuencias de VTT- HD14a, VTT-HD14b, VTT-HD14c y VTT-HD14e varían entre un 1-2 % en sus genomas de longitud completa. El prototipo es VTT-HD14a con un ORF1 intacto de 648 aminoácidos (aa) de tamaño. El ORF1 de VTT-HD14b tiene un tamaño de 660aa compartiendo identidad solo 554aa con ORF1 de VTT-HD14a, mientras que el resto de los ORF indican fusión al ORF4 (según de Schmidt y Noteborn, 2009). Del mismo modo, VTT-HD14c ORF1 tiene 712aa y constituye el ORF1 (primeros 645aa) fusionado al ORF5. El ORF1 de VTT-HD14e se interrumpe, dando como resultado 2 ORF de 467aa y 179aa de tamaño. Los genomas de VTT-HD23b, VTT-HD23d y VTT-HD23a varían tan solo en un 1-3 % de identidad de secuencia, pero sus genes de ORF1 difieren del siguiente modo: VTT-HD23a ORF1 como prototipo tiene un tamaño de 736aa, la secuencia de ADN del ORF1 de VTT-HD23b varía respecto de la de VTT-HD23a en la región hipervariable en un 18,4 % (34,2 % de los aminoácidos). Las secuencias de ADN de VTT-HD23b y VTT-HD23d difieren tan solo en un 1 % en su identidad general, pero el ORF1 de VTT-HD23d está interrumpido, dando como resultado 2 ORF de 307aa y 365aa de tamaño (figura 16).

Las transfecciones se efectuaron en células 293TT semiconfluentes. La naturaleza de esta estirpe celular, con sus múltiples células redondeadas unidas a la monocapa, no permite una identificación de corte clara de los efectos citopáticos. Las células se pasaron cuando alcanzaron la confluencia o cuando las células comenzaron a desprenderse de la superficie. Se agitaron los matraces para desprender todas las células. Se centrifugaron las células y se congelaron las alícuotas, así como se usaron para la extracción de ADN y ARN y los análisis por microscopía electrónica. Las células infectadas congeladas se usaron inicialmente para volver a infectar nuevos cultivos de 293TT, ya que la reinfección fracasaba si las células se habían tripsinizado en el momento de la recogida. La replicación vírica se llevó a cabo llevando a cabo una PCR de larga distancia en ADN extraído de células infectadas. Los periodos entre la reinfección y la recogida de las células varió entre 3 a 7 días, dependiendo de la densidad del cultivo. No se observaron diferencias morfológicas evidentes entre los cultivos de diferentes aislados de VTT. La reinfección durante el transcurso de un experimento se llevó a cabo varias veces usando alícuotas de células congeladas. No se ha descrito con anterioridad la propagación de virus TT in vitro. La digestión con enzimas de restricción se llevó a cabo en ADN celular obtenido de las muestras transfectadas inicialmente para eliminar cualquier ADN vírico generado por bacterias residuales. Los resultados de la amplificación por PCR larga indicaron la replicación de novo de ADN vírico. Los ejemplos de estos amplicones de ADN de vTt usando ADN celular infectado como molde se representan en la figura 19.

La amplificación por PCR de larga distancia de las moléculas de ADN de longitud completa indicó diferencias considerables entre los cultivos. Se necesitaron segundas rondas de amplificación (usando los mismos cebadores que en la primera ronda) en todos los cultivos infectados con aislados de biopsias cerebrales, es decir, VTT-HD16a, HD15a y los 4 aislados individuales de VTT-HD14 (figura 19A), a pesar de su divergencia (45-50 % de homología de nucleótidos) según los análisis filogenéticos (figura 18). Las modificaciones en el ORF1 no parecían tener influencia en la amplificación o la propagación, según se visualizó en la amplificación del ADN de longitud completa (Fig. 21A a-c). Se observaron amplicones de ADN adicionales de diversos tamaños en los cultivos infectados por HD15a. La aparición de estas moléculas aumentó durante la posterior propagación con una reducción concomitante en el genoma de longitud completa (figura 21A a-c carril 5). Los presentes inventores habían comunicado moléculas subvíricas de una naturaleza similar en muestras de suero humano (Leppik y col., 2007). En ocasiones también se observaron amplicones similares de diversos tamaños en cultivos infectados por VTT-HD16a (carril 6) y raramente en cultivos de VTT-HD14 (carriles 1-4).

Se observaron grandes diferencias en el comportamiento de los otros 6 aislados. Esta variación también fue evidente entre experimentos y pases (figura 19B b1, b2, b3) reflejando una alta sensibilidad aparente para modificaciones muy leves en las condiciones de cultivo. El genoma de longitud completa de replicación inicial (3,8 kb) se perdió durante la propagación (figura 19B a-c) en la aparición con amplicones subgenómicos prominentes con diversos tamaños en células infectadas por VTT-HD20a, VTT-HD3a y VTT-HD1a (carriles 7-9, figura 19B). Las cantidades de ADN de entrada usadas para la amplificación por PCR de larga distancia, así como de amplicones cargados en los geles fueron iguales para todos los cultivos. El alto nivel de amplicones de ADN de los aislados VTT-HD23b, VTT-HD23d y VTT-HD23a después de una sola ronda de PCR de larga distancia puede indicar, por lo tanto, un potencial de replicación más fuerte durante los pases tempranos.

Debido a las diferencias observadas entre los dos grupos de aislados, se investigó si podían observarse variaciones durante el muestreo en serie. Se propagaron pases equivalentes de VTT-HD14e y VTT-HD23b en paralelo y se tomaron muestras a diario. La amplificación de larga distancia indicó una replicación constante de VTT-HD14e (visible tras dos rondas de amplificación de ADN) lo que contrasta con la replicación decreciente de VTT-HD23b (visible después de una sola ronda de amplificación de ADN) que se perdió tras 10 días en cultivo (figura 19C). Estos cultivos no se pasaron y no se percibieron diferencias morfológicas entre cultivos.

Ejemplo 6

Formación, replicación y caracterización in vitro de moléculas subvíricas de fjVTT

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La apariencia de amplicones de ADN más pequeños de un tamaño constante en los cultivos de los aislados de VTT- HD14b, VTT-HD14c, VTT-HD14d y VTT-HD14e, así como VTT-HD1a y los 3 aislados de VTT-HD23, ya se percibió poco después de la transfección y se mantuvo durante los pases (figura 19A y B). Se clonaron y se caracterizaron. Estas moléculas de ADN subvírico (|jVTT-HD14, 719 bases de tamaño) de VTT-HD14b y los 3 aislados de VTT- HD14 fueron idénticas en su secuencia de ADN y representaron moléculas subgenómicas reorganizadas que se originan del genoma de VTT-HD14 parental (figura 20A). Del mismo modo, se originó una molécula de ADN subvírico reorganizada (jVTT-HD1, 621 bases) a partir del genoma de VTT-HD1a (figura 20B). De forma interesante, la replicación de jVTT-HD1 se mantuvo durante los pases, a pesar de la desaparición del genoma de VTT-HD1a de longitud completa. Esta presencia o ausencia de las moléculas subvíricas en los cultivos de VTT- HD23 indica una posible influencia de las condiciones de cultivo. En este caso, estas moléculas tenían un tamaño que varió entre 400 a 900 bases con un nivel aumentado de 642 y 401 moléculas de base. La caracterización de las moléculas clonadas indicó un proceso de maduración evolutivamente evidente como un segmento de la molécula subvírica de 401 bases (jVTT-HD23.1) que se duplicó en el ADN subvírico de 642 bases (jVTT-HD23.2; figura 20C). Estaban presentes múltiples versiones de este segmento en las moléculas más grandes. Los genomas subvíricos que se originan a partir de los cultivos de VTT-HD23b, VTT-HD23d así como VTT-HD23a, tenían una secuencia de ADN idéntica. La transfección de estas moléculas subvíricas reorganizadas en células 293TT dio como resultado la replicación de sus genomas (figura 21) y se visualizó tras la amplificación por la PCR. De forma interesante, la jVTT respectiva reaccionó exactamente del mismo modo que los genomas parentales, es decir, la replicación del ADN genómico inicial de jVTT-HD15 fue fuerte, pero posteriormente se visualizó únicamente después de la amplificación por PCR anidada (figura 21). Fueron visibles estructuras similares a proteínas con un tamaño de 10 nm mediante microscopía electrónica después de la filtración (0,22 jm) del medio de cultivo de estos cultivos celulares (figura 22).

Ejemplo 7

Purificación de partículas viroides (genomas completos y yVTT)

Se iniciaron intentos de purificar partículas de virus tras la segunda ronda de reinfecciones. Los extractos celulares en bruto se centrifugaron en gradientes de Optiprep de etapas al 27-33-39 % (Buck y col., 2005). Se lisaron alícuotas de las fracciones de gradiente antes de la separación por electroforesis en gel. Las fracciones de gradiente que indicaron ADN de virus se congelaron a -80°C y se usaron para reinfecciones adicionales. Fueron claramente visibles dos bandas de ADN al nivel de 2 kb y 1,0 kb del marcador de tamaño de ADN bicatenario (figura 8A). Los tamaños exactos de estas moléculas de ADN no pudieron determinarse ya que no hay disponibles marcadores de ADN bicatenario adecuados. Además, las suspensiones celulares se filtraron a través de un filtro de 0,22 jm antes de la centrifugación de gradiente. La tinción negativa de estas muestras indicó partículas viroides con un tamaño de aproximadamente 30 nm (figura 8). De manera similar, se observaron estructuras de proteína (aproximadamente 10 nm de tamaño) después de la filtración del medio de cultivo tras la propagación de los genomas de jVTT-HD (figura 22). Estos filtrados se lisaron y el ADN se separó en geles de agarosa (figura 22).

Ejemplo 8

Transcripción in vitro

Se han comunicado patrones de transcripción detallados de VTT para los aislados VTT-P1C1 (Müller y col., 2008), VTT-HEL32 (Qiu y col., 2005; Kakkola y col., 2009) y VTT-HD3a (Leppik y col., 2007). Se han comunicado con anterioridad tres especies principales de ARNm (1,0, 1,2 y 3,0 kb) en células de médula ósea (Okamoto y col., 2000a) y en células COS1 (Kamahora y col., 2000). Las predicciones de uso de codones de iniciación de acuerdo con las reglas de Kozak (Jelcic y col., 2004) en combinación con el uso de sitios aceptores y donadores de corte y empalme alternativo (Leppik y col., 2007) indicó el ambiente de mecanismos no conservados durante la transcripción de torque teno virus. La transcripción de los aislados se investigó usando ADN tanto mono como bicatenario como moldes para el mapeo 3' y 5'RACE. El ADNc bicatenario reduce la posibilidad de formación de híbridos no específicos. Además, se seleccionaron cebadores (directos e inversos) que estaban ubicados en las regiones intergénicas, en lugar de los cebadores específicos de genes comúnmente usados. Esto se llevó a cabo con la intención de abarcar la expresión de cualquier gen no predicho en el genoma de VTT. Se extrajo el ARN de todos los cultivos en el día 7 después de la transfección. El aRn de las transfecciones de control con solo vector se incluyó para controlar la amplificación de falsos positivos. Los análisis de transcripción se repitieron para controlar un punto de tiempo adecuado para recoger el ARNm mediante la extracción de ARN 48 después de la transfección en el caso del aislado VTT-HD14e. Los patrones de transcripción observados no diferían entre el día 2 y el día 7. Todos los resultados obtenidos en los análisis de transcripción se presentan en la figura 17.

Se aislaron transcritos abundantes a partir de cultivos infectados con VTT-HD23. Sus patrones de transcripción, así como los de VTT-HD20a, VTT-HD15a, VTT-HD16a fueron en general similares a los patrones de transcripción descritos previamente (revisado en Kakkola y col., 2009). Una excepción es la ausencia de un transcrito del ORF1 de longitud completa de todos los aislados. Esto es sorprendente, en vista del hecho de que las partículas viroides se producen de manera concomitante. Los transcritos que abarcan secciones del gen del oRF1 (ya sean los extremos 5' o 3') y que podrían codificar proteínas más pequeñas, estaban presentes (ejemplos en la figura 17). Los análisis in silico de supuestas proteínas revelaron información adicional de la que se había comunicado hasta la

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fecha. Los ejemplos son (fusiones) de corte y empalme entre el OFR2 u ORF2a con el ORF1 o con el ORF5 en VTT- HD16a (6.3s.2, 6.3s.3, 6.3s.9), El corte y empalme entre ORF1 y ORF5 es otra posibilidad (6.3.7). También pueden expresarse transcritos cortos que abarcan la región de ORF2 en VTT-HD20a en forma de una proteína ORF1 más pequeña (7.3.5, 7.3.4, 7.5.13) (figura 17). Además, se obtuvieron transcritos usando cebadores (directos o inversos) ubicados en la región de control. Se efectuaron dos observaciones. Los cebadores inversos dieron como resultado transcritos de corte y empalme o sin corte y empalme que abarcaban regiones extendidas del genoma (12.5.19, 12.5.20, 12.5.21, 5.5s.16, 5.5s.17, 5.5s.18, 5.5s.19) o transcritos de diversas longitudes que no tenían capacidad codificante (5.5s.12, 5.5s.13, 5.5s.14, 5.5s.15, 11.5.7, 11.5.8, 11.5.9). La amplificación con cebadores directos en esta región dio como resultado otros transcritos cortos no codificantes o transcritos de corte y empalme con capacidad codificante incluso tan distantes como la ORF5 (4.3.4, 3.3.1,3.3.2) (figura 17).

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Claims

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1. Un poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado que comprende

A) una secuencia de nucleótidos que muestra al menos un 70 % de identidad respecto de una secuencia de nucleótidos que se selecciona entre las secuencias de nucleótidos mostradas en la figura 6 y un poli(ácido nucleico) que codifica un polipéptido que contiene un motivo de firma de una proteína de mamífero que está asociada con cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, en el que el poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado se selecciona entre el grupo de moléculas de pVTT que consiste en zpr4.20 mostrada en la figura 11B, zpr9.6 mostrada en la figura 12B y zpr12.24 mostrada en la figura 13B;

o

B)

(a) una secuencia de nucleótidos que se selecciona entre las secuencias de nucleótidos mostradas en la figura 6;

(b) una secuencia de nucleótidos que muestra al menos un 70 % de identidad respecto de una secuencia de nucleótidos de (a) y dicho poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado es capaz de replicarse de manera autónoma tras transfectarlo en células 293TT;

(c) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos RVPKVSLHTA VKGQFGLGTG RAM, RVPKVSLHTA VKGQFGLGTG RAM, RVPEVSLHTA VKGQFGLGTG RAM, GAEGEFTHRS QGAIRARDWP GHG, GAEGEFTHRS QGAIRARDWP GYG, GAVGEFTHRS QGAIRARDWP GYG y GAGGEFTHRS QGAIRARDWP GYG mostradas en la figura 14

y dicho poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado es capaz de replicarse de manera autónoma tras su transfección en células 293TT, en el que dicha secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c) o (d) está unida a un poli(ácido nucleico) que codifica un polipéptido que contiene un motivo de firma de una proteína de mamífero que está asociada con cáncer o una enfermedad autoinmunitaria mediante un enlace fosfodiéster, el motivo de firma es de al menos 10 aa y el grado de identidad de este motivo de firma respecto de un motivo correspondiente en una proteína de mamífero es de al menos el 80 %, pero no es idéntico a dicho motivo correspondiente, en el que dicho motivo correspondiente se selecciona entre el grupo que consiste en

secuencias

secuencias

de

de

aminoácidos

y

aminoácidos

(1) opsina seleccionada entre las secuencias de aminoácido IYNSFHRGFALG y RLELQKRLPW LELNEKAVE;

(2) protamina 1 seleccionada entre las

ARYRRRSRSRSRSRYGRRRRRSRSRRRRSRRRRR,

ARYRCCRSKSRSRCRRRRRRCRRRRRRCCRRRRR,

ARYRCCRSPSRSRCRRRRRRFYRRRRRCHRRRRR;

(3) protamina 2 seleccionada entre las

HTRRRRSCRRRRRRACRHRRHRRGCRRIRRRRRCR, RRRSRSCRRRRRRSCRYRRRPRRGCRSRRRRRCRR,

HRRRRSCRRRRRHSCRHRRRHRRGCRRSRRRRRCR, y

RRRHRSCRRRRRRSCRHRRRHRRGCRTRRRRCRRY;

(4) galanina que tiene las secuencias de aminoácidos de ATLGLGSPVKEKRGWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLTGKRELEPEDEARPGSFDRPL SESNIVRTIIEFLSFLHLKEAGALDRLPGLPAAASSEDLERS;

(5) firma de repetición de tipo plexina/semaforina/integrina que tiene las secuencias de aminoácidos de RCSQVGVTSCSECLLARDPVGCGWCSSEGRCTRGERCDERRGSRQNWSSGPSSQCQ

(6) gastrina que tiene la secuencia de aminoácidos de VAGEDSDGCYVQLPRSR;

(7) colagenasa que tiene la secuencia de aminoácidos de MSRLAELYLLGDSIKGRHDNLWLAAAEMLSYYAPEGKSELGIDICQAKLELAAKV1PYLYEC SGPAAIRSQDLTDGQAASACDILRNKEKDFHQVKYTGKTPVADDGNTRVEVGVFVSEEDYKR YSAFASKEVKAQFGRVTDNGGMYLEGNPSDAGNQVRFIAYEEAKLNADLSIGNLEHEYTHYL DGRFDTYGTFSRNLEESHIVWWEEGFAEYVHYKQGGVPYQAAPELIGQGSKLYLSDVFTTTE EGYAELFAGSHDTDRIYRWGYLAVRFMLETNHNRDYESLLYHSRYGNSFAFYAYLVKLLGYM YNNEFGIWNNEFGIW;

(8) repetición de hélice de colágeno que tiene la secuencia de aminoácidos de GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPAGAPGPPGPPGEPGPPGPPGPPGPPGPPGAPGAPGP;

(9) proteína específica masculina de esperma que tiene la secuencia de aminoácidos de VGGPCGPCGPCGGPCCGSCCSPCGGPCGPCGPCGPCGPCCGGCGPC GPCGPCCGTTEKYCGL;

(10) firma de metaloproteasa colagenasa microbiana (M9) que tiene la secuencia de aminoácidos de GLETLVEFLRAGYYVRFYN;

(11) firma de proteína MIC1 de micronema que tiene la secuencia de aminoácidos de TYISTKLDVAVGSCHK;

(12) firma de regulador autoinmunitario (AIRE) que tiene la secuencia de aminoácidos de DFWRVLFKDYNLERY;

(13) gliadina que tiene la secuencia de aminoácidos de PQAQGSVQPQQLPQFEEIRNL;

(14) firma de receptor Y2 de neuropéptido que tiene la secuencia de AFLSAFRCEQRLDAIHS;

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(15) aerolisina que tiene la secuencia de aminoácidos de WDKRYIPGEVKWWDWNWTIQ;

(16) orexina que tiene la secuencia de aminoácidos de

MNLPSAKVSWAAYTLLLLLLLLPPALLSLGVDAQPLPDCCRQKTCSC RLYELLHGAGNHAAGILTLGKRRPGPPGLQGRLQRLLQASGNHAAGILT MGRRAGAELEPRLCPGRRCLAAAASALAPRGRSRV;

(17) receptor GIP que tiene la secuencia de aminoácidos de PRLGPYlGDQTLTLWNQALAA;

(18) prion que tiene la secuencia de aminoácidos de SNGGSRYPGQGSPGGNRYPPQ;

(19) neurotensina que tiene la secuencia de aminoácidos de METSSPWPPRPSP;

(20) firma de la familia de receptor nuclear huérfano (receptor nuclear A4) que tiene la secuencia de aminoácidos de PVNLLNALVRAHVDSTP;

(21) firma de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDN) que tiene la secuencia de aminoácidos de PLLFLLEEYKNYLDAAN;

(22) calcitonina que tiene la secuencia de aminoácidos de KCYDRMQQLPPYEGEGPY;

(23) receptor de tipo I de leucotrieno B4 seleccionada entre las secuencias de aminoácidos SRRLRVRRFHRRRRTGR y GRRLQARRFRRSRRTGR;

(24) autoantígeno 1 de síndrome de Sjogren/esclerodermia (Autoantígeno p27) que tiene la secuencia de aminoácidos de EISKKMAELLLKGATMLDEHCPKCGTPLFRLKDGKVFCPICE;

(25) vasopresina que tiene la secuencia de aminoácidos de RAGGRRRGRRTGSPSEGARV;

(26) firma de receptor 2 de hormona concentradora de melanina que tiene la secuencia de aminoácidos de LVQPFRLTRWRTRYKTIRIN;

(27) firma del receptor EP1 de prostanoide que tiene la secuencia de aminoácidos de ISLGPPGGWRQALLAGL;

(28) ciclincinasa que tiene la secuencia de aminoácidos de EWRSLGVQQSLGWVH;

(29) firma de receptor activado por proliferador de peroxisomas (receptor nuclear 1C) que tiene la secuencia de aminoácidos de KTETDASlHplLq;

(30) firma de receptor M1 muscarínico que tiene la secuencia de aminoácidos de KMPMVDPEAQAPTKQPPK;

(31) firma de receptor de tipo B2 de ácido gamma-aminobutírico (GABA) metabotrópico que tiene la secuencia de aminoácidos de LAPGAWGWARGAPRPPPSS;

(32) firma de arginina desaminasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SELSRGRGGPRCMSMPLVR;

(33) repetición de factor de crecimiento opioide que tiene la secuencia de aminoácidos de SPSETPGPRPAGPARDEPAE;

(34) firma de molécula de adhesión CD36 que tiene la secuencia de aminoácidos de WIFDVQNPDEVAKNSSKIKVKQR;

(35) firma de proteína protelipídica de mielina (PLP) que tiene la secuencia de aminoácidos de GVVLGAIIGGVLGVVLLLVLLLYLV; y

(36) chlamidiaom que tiene la secuencia de aminoácidos de CGSYVPSCSKPCG.
2. El poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado de la reivindicación 1, que está presente como un episoma mono o bicatenario extracromosómico.
3. El poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado de la reivindicación 1 o 2 que es un ADN monocatenario.
4. Un cebador oligonucleotídico mostrado en la figura 10 y que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en CAGCGAGAACGCCACGGAGG GAGATCCT; CGGACGGGCGTGGAAAACTCAGCCATTC;

CGGACTGGCCGGGCTAT; y AGCCCGAATTGCCCCTTGA.
5. Un vector de expresión que comprende un poli(ácido nucleico) de virus TT reorganizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unido operativamente a elementos de control de la transcripción y la traducción procarióticos, eucarióticos o víricos.
6. El vector de expresión de la reivindicación 5 que es un cromosoma artificial.
7. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 o 6.
8. Un procedimiento de detección de un poli(ácido nucleico) de VTT reorganizado de la reivindicación 1 en una muestra biológica, que comprende: (a) opcionalmente extraer una muestra de poli(ácido nucleico), (b) hibridar el poli(ácido nucleico) comprendido en dicha muestra con al menos una sonda que hibrida específicamente con el poli(ácido nucleico) de la reivindicación 1, en el que dicha sonda comprende una parte del poli(ácido nucleico) de acuerdo con la reivindicación 1, estando dicha sonda opcionalmente marcada y (c) detectar el poli(ácido nucleico) hibridado.