CN102807609A - 一种预防和/或治疗疼痛的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防和/或治疗疼痛的多肽及其应用。该多肽是a)-c)中任一所示的多肽:a)氨基酸序列如序列表中序列1第10-24位氨基酸残基所示的多肽;b)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽;c)对a)或b)所示的多肽进行如下突变得到的具有1)-3)中至少一种作用的衍生多肽:将序列表中序列1的氨基酸残基中除第17位、第18位及第20位之外的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加;所述1)-3)为:1)预防和/或治疗疼痛;2)降低神经元细胞膜上瞬时受体电位香草酸亚型1含量;3)抑制瞬时受体电位香草酸亚型1膜转运功能。该多肽可用于预防和/或治疗疼痛。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防和/或治疗疼痛的多肽及其应用。
背景技术
正常状态下,伤害性刺激作用于机体引起的生理性痛可作为一种警告,引起机体产生一系列保护反应,以避免或减小伤害。然而在炎症和神经损伤等病理状态下,痛觉传递的效能可发生长时程增强,进而引发痛觉超敏(痛觉敏化)(hypersensitivity),临床表现即为长期剧烈的慢性痛[1]。慢性病理性痛是临床上最常见的症状之一,除了引起机体的强烈不适,它更会对罹患人群的精神和心理产生不利的影响,而且已被看作为一种严重影响人们的日常工作、生活及生存质量的神经精神疾病。因此,对于慢性痛的研究和治疗有着重要的社会意义。然而由于慢性病理性痛的病因复杂,分子机制和病理生理过程未被完全了解,故而尚缺乏有效而特异的治疗手段。所以研究及阐明其发生、发展的分子机制,有助于为临床治疗疼痛提供新的思路和解决办法。
组织损伤及迁延不愈的炎症(如骨性关节炎、胰腺炎等)引起的炎症痛是一种最常见的慢性病理性痛。同其它类型的病理性痛一样,它的发病机制也被认为是外周(伤害性感受神经元)敏化和中枢(脊髓背角神经元)敏化[2]。当发生炎症时,产生于外周的炎性介质作用于伤害性感受器(nociceptor)上的相应受体,通过一系列的细胞内机制,一方面使感受器对伤害性刺激的感受增强,另一方面降低感受器的感受阈值,使得正常情况下的非伤害性刺激也可激活伤害性感受器,最终使外周传入信息增强,这一过程也被称为“外周敏化”。持续的外周敏化可进一步引起脊髓背角神经元的兴奋性增加(中枢敏化)。最终,整个痛觉传导通路突触传递效能增强,引发炎性痛觉超敏(或称炎性痛觉敏化)。
从分子水平分析,外周和中枢敏化实际上就是痛觉传导通路神经元内相关受体和通道发生敏化的过程,而存在于伤害性感受神经元内介导热痛觉感受的瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid1,TRPV1,也称辣椒素受体,vanilloid receptor1,VR1)的发现和成功克隆极大地推动了炎性痛觉敏化的机制研究。
TRPV1是辣椒素的特异性受体,是一种高表达于外周伤害性感受中小直径神经元中的非选择性阳离子通道。它可被多种刺激激活(辣椒素类化合物,>43℃的热刺激,氢离子等)[3]。在生理状态下,TRPV1是介导机体感受伤害性热刺激(>43℃)的主要受体[4];而在炎症状态下,TRPV1不仅可直接感受外环境的伤害性热刺激和炎症组织产生的氢离子的刺激,还可在多种外周炎性介质(如缓激肽、前列腺素E2、NGF及ATP等)的作用下发生敏化,而TRPV1的敏化更会增强其对热刺激和酸性刺激痛觉感受的传入,进而作为外周敏化的一个中心成份参与炎性热痛觉敏化的发生和维持[5]。同时,在TRPV1基因敲除的小鼠上发现,TRPV1基因的敲除极大程度地抑制了炎性热痛觉敏化的发生[4]。因此TRPV1的敏化被认为是介导炎性热痛觉敏化发生的关键步骤,研究其敏化发生的分子机制,为开发相应的TRPV1抑制药物提供重要的实验依据,已成为科学领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗疼痛的多肽及其应用。
本发明所提供的预防和/或治疗疼痛的多肽,是a)-d)中任一所示的多肽:
a)氨基酸序列如序列表中序列1第10-24位氨基酸残基所示的多肽;
b)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽;
c)对a)所示的多肽进行如下突变得到的具有1)-3)中至少一种作用的衍生多肽:将序列表中序列1的第10-24位氨基酸残基中除序列1的第17位(苏氨酸)、第18位(脯氨酸)及第20位(赖氨酸)之外的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加;
d)对b)所示的多肽进行如下突变得到的具有所述1)-3)中至少一种作用的衍生多肽:将序列表中序列1的氨基酸残基中除第17位(苏氨酸)、第18位(脯氨酸)及第20位(赖氨酸)之外的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加;
所述1)-3)为:
1)预防和/或治疗疼痛;
2)降低神经元细胞膜上瞬时受体电位香草酸亚型1含量;
3)抑制瞬时受体电位香草酸亚型1膜转运功能。
其中,序列表的序列1由24个氨基酸残基组成,序列1的第1-9位氨基酸残基组成具有穿透细胞膜作用的区域,该区域可以被具有相同作用的其它序列替换;序列1的第10-24位氨基酸残基构成可以竞争性抑制细胞内细胞周期素依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase5,Cdk5)对驱动蛋白KIF13B的第506位苏氨酸(Thr-506)磷酸化的区域,其中,序列1的第17-20位氨基酸残基是活性中心,序列1的第17位苏氨酸为Cdk5的磷酸化位点(即拮抗内源性Thr-506磷酸化的位点),第18位的脯氨酸为Cdk5识别第17位苏氨酸所必需的,第20位的赖氨酸也为Cdk5行使磷酸化功能所必需的。
其中,b)所示的多肽是对a)所示的多肽进行如下突变得到的具有所述1)-3)中至少一种作用的多肽:在a)所示的多肽的氨基端添加序列1的第1-9位的9个氨基酸残基。在实际应用中,也可以对a)所示的多肽进行如下突变得到具有所述1)-3)中至少一种作用的多肽:保证序列表中序列1的第17-20位TPQK这四个氨基酸残基不变,将序列1的第10-16位氨基酸残基进行一个以上的缺失,将序列1的第21-24位氨基酸残基进行一个以上的添加;或者保证序列表中序列1的第17-20位TPQK这四个氨基酸残基不变,将序列1的第10-16位氨基酸残基进行一个以上的添加,将序列1的第21-24位氨基酸残基进行一个以上的缺失。
编码上述任一所述多肽的核酸分子(DNA或RNA)也属于本发明的保护范围。所述核酸分子具体可为上述任一所述多肽的编码基因。含有上述任一所述多肽的编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述任一所述多肽和/或编码所述多肽的核酸分子在制备预防和/或治疗疼痛的产品中的应用以及以上述任一所述多肽和/或编码所述多肽的核酸分子为活性成分的预防和/或治疗疼痛的产品也属于本发明的保护范围。
以上述任一所述多肽和/或编码所述多肽的核酸分子为活性成分制成的降低神经元细胞膜上TRPV1含量的产品和/或抑制TRPV1膜转运功能的产品也属于本发明的保护范围。
所述预防和/或治疗疼痛可体现为缓解痛觉敏化。所述缓解痛觉敏化具体可为缓解炎性痛觉敏化,如缓解炎性热痛觉敏化。
所述神经元具体可为背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元。
上述产品具体可为药物。
需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。
本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
发明人在大量实验研究的基础上,发现细胞周期素依赖性激酶5(Cdk5)能够磷酸化驱动蛋白KIF13B的第506位的苏氨酸(Thr-506),而该位点的磷酸化又是瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)与驱动蛋白KIF13B结合所必需的。据此机制,发明人选取了包括Thr-506在内的一段含15个氨基酸残基的驱动蛋白KIF13B的氨基酸序列[即上述a)所示的多肽的氨基酸序列],该序列包含了Cdk5的磷酸化底物序列“TPQK”,并于此序列的N端添加了一段可以引导其穿透细胞膜的含有9个氨基酸残基的HIV-TAT蛋白序列,构成了可穿膜的融合肽TAT-T506[即上述b)所示的多肽]。
细胞实验证明,TAT-T506能够抑制瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)膜转运功能,降低DRG神经元细胞膜上瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)的含量。大鼠炎症痛模型实验证明,TAT-T506可缓解炎性热痛觉敏化,可用于预防和/或治疗疼痛。
附图说明
图1为体外激酶实验结果。
图2为体外pull-down实验结果。
图3为在表达GFP融合蛋白的TRPV1-CHO细胞中进行的免疫共沉淀实验。
图4为TAT-T506及对照肽TAT-T506A的序列。
图5为采用细胞表面蛋白生物素标记法检测TAT-T506对原代培养的DRG神经元细胞膜上TRPV1的含量的影响。
图6为蛛网膜下腔预注射TAT-T506对CFA诱导的大鼠热痛觉敏化程度的影响。
图7为蛛网膜下腔注射TAT-T506不影响大鼠的基础热敏感性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中采用的数据处理和统计学检验如下:
实验结果采用GraphPad Prism5.01版软件分析,以平均值±标准误(Mean±SEM)表示。图5所示实验中两组比较使用配对t检验。行为学实验结果采用双因素方差分析(two-way ANOVA),并用Bonferroni posttests进行检验。以p<0.05作为在统计学上有显著性差异的标准。Western blot结果采用Quantity One(Bio-Rad)图像分析软件进行光密度测量。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的TAT-T506溶液、TAT-T506A溶液均用无菌生理盐水作为溶剂配制。
实施例1、可穿膜融合肽TAT-T506的功能实验
1、TAT-T506的设计
炎性介质引起TRPV1敏化主要通过以下几种机制:降低TRPV1的热激活阈值;增加伤害性感受神经元细胞膜上功能性TRPV1的数量;抑制通道的失敏、增加通道的活动性。此外,长期的炎性刺激还可以增加TRPV1在神经元内的总含量,继而维持较高水平的定位于胞膜上的功能性受体的数量[6]。然而炎性介质并不能直接作用于TRPV1,而是通过与伤害性感受神经元外周末稍上各自的受体结合,激活下游的信号转导通路,间接作用并敏化TRPV1。在这些下游的信号转导分子中,蛋白激酶是非常重要的一员。蛋白激酶可通过直接磷酸化TRPV1和/或通过磷酸化TRPV1的其它作用蛋白而直接和/或间接地调节TRPV1的通道功能。
细胞周期素依赖性激酶5(cyclin-dependentkinase5,Cdk5)是神经系统中一个非常重要的蛋白激酶,它通过磷酸化不同的底物发挥多种生理和病理功能[7]。近年发现,伤害性感受神经元内Cdk5激酶活性的高低可影响生物体对热刺激的敏感性,并且Cdk5的激活在外周炎症引起的热痛觉敏化的发生中发挥着重要的作用[8,9]。Pareek等人发现,Cdk5的特异性抑制剂roscovitine可以显著抑制原代培养的DRG神经元中TRPV1通道的功能[10]。这些结果提示Cdk5可能会参与对TRPV1通道功能的调控。
本课题组的研究表明,有活性的Cdk5可促进TRPV1在细胞膜的定位。进一步的研究提示,Cdk5可促进TRPV1合成后向细胞表面的运输,其机制之一是Cdk5可促进TRPV1与驱动蛋白KIF13B的结合(驱动蛋白是细胞内负责蛋白合成后向胞浆及胞膜转运的一种动力蛋白)。Cdk5能够磷酸化KIF13B的第506位的苏氨酸(Thr-506),而这一位点的磷酸化对于TRPV1与KIF13B的结合又是必需的。当发生炎症时,炎性刺激引起的Cdk5的激活可以通过上述机制增加伤害性感受神经元内TRPV1向细胞膜(包括外周神经末稍)的转运,继而增加定位于细胞膜上的功能受体的数量,参与炎性热痛觉敏化的发生乃至维持。在此基础上,本发明设计并合成了一段可以干扰Cdk5对KIF13B的Thr-506磷酸化的可穿膜融合肽TAT-T506。
其中,如下实验证实Cdk5对KIF13B的Thr-506的磷酸化是TRPV1与KIF13B结合的必要条件:
首先,发明人采用体外激酶实验的方法检测Cdk5是否可以磷酸化KIF13B的Thr-506。
Cdk5是脯氨酸导向的丝/苏氨酸激酶,它有自己特有的磷酸化底物序列(S/TPXK/H/R):除了丝/苏氨酸其后+1位的脯氨酸是必需的,还需要其后+3位有一个碱性氨基酸残基(K/H/R),而+2位的“X”则可以为任意氨基酸[11,12]。在驱动蛋白KIF13B的FHA结构域中,存在一个典型的Cdk5磷酸化底物序列“TPQK”(序列表中序列1的第17-20位氨基酸残基,序列3的第52-55位氨基酸残基,序列4的第506-509位氨基酸残基),这段序列在人类、大鼠和小鼠中都高度保守。
提取大鼠DRG组织总蛋白,之后使用Cdk5抗体(C-8,Santa Cruz Biotechnology)进行免疫沉淀。同时,分别诱导并纯化两个原核表达蛋白:野生型带His6标签的KIF13B的FHA结构域His6-FHA(其中的FHA的氨基酸序列如序列表中的序列3所示)和突变型His6-FHAT506A(其中的FHAT506A是将序列3的第52位的苏氨酸替换为丙氨酸得到的突变蛋白)。将免疫沉淀物经0.1%Triton X-100/1×TBS清洗4次及激酶反应缓冲液(20mM Tri s,pH7.5,20mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,0.1mM二硫苏糖醇)清洗2次后,将免疫沉淀物与上述任一原核表达蛋白在添加了5μCi[γ-32P]ATP的35μl激酶反应缓冲液中30℃反应30min,之后经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色及放射自显影。结果如图1所示,表明Cdk5能够直接磷酸化KIF13B的FHA结构域,而将该结构域内的Thr-506突变为不可被磷酸化的丙氨酸(T506A)则阻断了Cdk5对FHA结构域的磷酸化,表明Cdk5能够磷酸化KIF13B的Thr-506。
接下来,发明人分别采用体外pull-down的方法和在真核细胞中进行的免疫共沉淀实验研究了Cdk5对KIF13B的Thr-506的磷酸化是否会影响TRPV1与KIF13B的结合。
体外pull-down实验如下:将上述野生型His6-FHA和突变型His6-FHAT506A分别加入到TRPV1-CHO细胞(将TRPV1基因转染CHO细胞得到的稳定表达TRPV1的转基因CHO细胞)裂解液中,之后用TRPV1抗体进行免疫共沉淀,并用His6抗体检测。结果显示,TRPV1与His6-FHA之间的相互作用被T506A突变明显抑制了(图2)。图2中,Vehicle表示溶剂对照,IB:His6表示用His6抗体检测的结果,IgG表示各组使用的TRPV1抗体的量,TRPV1表示用TRPV1抗体检测的结果,即各组使用TRPV1抗体经免疫沉淀得到的TRPV1的量,Input表示各组加入的原核表达蛋白的量。
在真核细胞中进行的免疫共沉淀实验如下:在TRPV1-CHO细胞中分别外源表达了下述蛋白:GFP(绿色荧光蛋白)、GFP-motor、GFP-motor FHA(其中,motor FHA的氨基酸序列如序列表中的序列4所示)、GFP-motor FHAT506A(其中,motor FHAT506A是将序列4的第506位的苏氨酸替换为丙氨酸得到的突变蛋白)、GFP-motor FHAT506D(其中motor FHAT506D是将序列4的第506位的苏氨酸替换为天冬氨酸得到的突变蛋白),其中T506D突变(Thr-506突变为天冬氨酸)是一个模拟磷酸化的突变,之后用TRPV1抗体进行免疫共沉淀,并用GFP抗体检测。结果如图3所示,TRPV1能够免疫沉淀GFP-motorFHA,却不能沉淀GFP-motor FHAT506A,这与体外pull-down的结果一致,提示Thr-506的磷酸化对于TRPV1与KIF13B-motor FHA结构域的结合是必需的。模拟磷酸化的突变T506D保持了GFP-motor FHA与TRPV1结合的特性,但是并没有增加GFP-motor FHA与TRPV1形成的复合物的数量,可见Thr-506的磷酸化也许并不是介导KIF13B-motorFHA结构域与TRPV1结合的充分条件,也许还有其它的机制参与二者的结合。此外,TRPV1与GFP-motor不发生免疫沉淀,间接证明了TRPV1其实是与KIF13B的FHA结构域发生结合。
图3中,IB:GFP表示用GFP抗体检测的结果,IgG表示各组使用的TRPV1抗体的量,TRPV1表示用TRPV1抗体检测的结果,即各组使用TRPV1抗体经免疫沉淀得到的TRPV1的量,Input表示对细胞裂解液进行的直接western blot检测的结果,即表示各组细胞表达的GFP融合蛋白的量,β-actin为内参照。
为了进一步在体研究Thr-506磷酸化对TRPV1功能的影响,针对Thr-506位点设计并构建了可干扰其磷酸化的可穿膜融合肽——TAT-T506。
迄今,许多具有细胞膜穿透能力的多肽已被发现,这些肽的序列一般在30个氨基酸残基之内,可以通过与待转运分子共价连接或是静电吸引而将待转运分子导入细胞内甚至是细胞核内。其转导效率高,可转导较大的分子(如多肽、蛋白质及核酸等大分子),并且对细胞无损伤,在多肽及基因治疗中有着广泛地应用前景[13]。其中,HIV(人类免疫缺陷病毒)TAT蛋白的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)中的9个氨基酸残基(RKKRRQRRR)序列是研究和应用最多的穿膜肽序列[13]。
发明人将KIF13B-FHA结构域中以Thr-506为中心前后各7个(共15个)氨基酸残基的序列(序列表中序列1的第10-24位氨基酸残基序列)共价连接到HIV-TAT蛋白中的“RKKRRQRRR”序列(此序列为序列表中序列1的第1-9位氨基酸残基序列)之后,构成具有穿膜能力的融合肽(TAT-T506,序列表中序列1所示的氨基酸序列)。作为对照肽,Thr-506被丙氨酸所取代(TAT-T506A)(图4)。
2、TAT-T506的制备
TAT-T506的序列是序列表中的序列1,对照肽TAT-T506A的序列是序列表中的序列2。
TAT-T506和TAT-T506A均采用固相多肽合成法(Fmoc法)由羧基端向氨基端方向合成。合成的多肽采用高效液相色谱进行纯化得到纯度为≥98%的TAT-T506和TAT-T506A。纯化的TAT-T506和TAT-T506A经质谱鉴定,TAT-T506的氨基酸序列如序列表中序列1所示;TAT-T506A的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3、TAT-T506的功能
3.1TAT-T506抑制原代培养的DRG神经元中TRPV1在细胞膜上的定位
既然Thr-506的磷酸化对于KIF13B与TRPV1的结合是必需的,那么如果阻断它的磷酸化是否也会抑制TRPV1的膜转运?于是在原代培养的DRG神经元中加入TAT-T506干扰内源性KIF13B中Thr-506的磷酸化,并采用生物素标记细胞表面蛋白的方法检测细胞膜上TRPV1的含量。结果如图5所示,10μMTAT-T506作用神经元3小时明显减少了细胞膜上TRPV1的含量(降至对照组的78.7±3.4%,p=0.0081,n=4)。图5中,Surface表示细胞膜上的蛋白,Total表示细胞的总蛋白,TRPV1表示用TRPV1抗体进行检测的结果,N-cadherin表示使用N-cadherin抗体检测的结果,用以作为细胞膜上蛋白含量的内参照,β-actin表示细胞总蛋白的内参照。统计结果显示为细胞膜上的TRPV1含量与细胞膜上N-cadherin含量的比值并以对照组(TAT-T506A)为100%进行的标准化。**p<0.01,n=4,双侧配对t检验。Error bar代表标准误。
其中,该实验中实验方法如下:
A原代DRG神经元的培养
A1主要试剂和溶液的配制
Dulbecco缓冲液(1L):0.2g KCl,0.2g KH2PO4,8.0g NaCl,2.89g Na2HPO4·12H2O溶于900ml ddH2O中,溶解完全后调pH值至7.2-7.4,定容至1L。
0.25%胰酶(100ml):称取0.25g胰酶(Sigma-Aldrich)溶于80ml Dulbecco缓冲液中,定容至100ml,0.22μm微孔小滤器过滤除菌。
DMEM培养液:称取DMEM固体培养基(Gibco)13.48g溶于800ml ddH2O中,加入3.7g NaHCO3并调pH值至7.2,定容至1L,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,4℃保存。临用前配制成含10%FBS(Hyclone,USA)的完全培养基。
Neurobasal(Gibco):4℃保存,临用前按50:1的比例加入B27无血清培养液添加剂(Gibco)。
Poly-D-lysine(Sigma-Aldrich):0.5mg/ml,可回收利用。
A2原代DRG神经元的培养
出生后0-3天的SD大鼠消毒后断头,并立即剪开背侧皮肤分离出脊椎置于预冷的无血清DMEM中,用剪刀将锥孔从腹侧沿正中剪开,用镊子将脊髓剥除干净,用游丝镊仔细分离出DRG,剪去纤维,置于DMEM中,待所有的DRG均分离后(一只大鼠可以分离大约40个DRG),吸去皿中的DMEM,加入0.25%胰酶1ml,37℃,150rpm消化35min,然后用末端经过高温抛光的巴斯德吸管用力吹打组织,加入500μl FBS终止消化;500rpm离心3min,小心吸去上清,加入适量的接种液(含10%FBS的DMEM),轻悬细胞后按1×105个DRG神经元/ml的密度,将2ml细胞悬液接种于Poly-D-lysine处理过的培养皿(35mm)中,15min后,待神经元贴壁换为含2%B27、100ng/ml小鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor)(Promega)、1×GlutaMAX-I(Gibco),100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Neurobasal培养基;18-24h后加入5μMAra-C(cytosine arabinoside,Sigma-Aldrich)。以后每3天以含5μM Ara-C的前述Neurobasal培养基半量换液。神经元培养至第7天用10μM TAT-T506或10μMTAT-T506A处理3小时并按照如下方法进行生物素标记细胞表面蛋白实验。
B、生物素标记细胞表面蛋白的检测方法
B1主要试剂和溶液的配制
PBS(1L):NaCl8g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KCl0.2g,KH2PO40.2g,调pH至7.4-7.6。
中和液:含100mM甘氨酸的PBS(pH7.4-7.6)
TBS(1L):NaCl8g,KCl0.2g,Tri s3g溶于800ml ddH2O,用盐酸调pH值至7.4-7.6,定容至1L。
细胞裂解液和Washing buffer:1%Triton X-100/0.1%SDS/1×TBS
B2生物素标记细胞表面蛋白及其纯化
采用EZ Link Sulfo-NHS-LC-biotin标记试剂盒(Pierce,CAT#21335)和UltraLink(R)Immobilized NeutrAvidinTM Protein Plus(Pierce,CAT#53151)。
1)平衡瓶装生物素至室温,每1mg溶于1ml PBS中,生物素溶液浓度为1mg/ml;
2)用PBS轻洗细胞3次,加入适量的上述生物素溶液(覆盖皿底),4℃1h;
3)小心弃去生物素溶液,用预冷的中和液轻洗细胞3次,中和残留的未与蛋白结合的生物素;
4)加入适量细胞裂解液裂解细胞,冰上15min,刮下细胞,4℃12,000g×4min离心,取上清,即为总蛋白提取物;
5)BCA蛋白定量;
6)每1.5ml EP管中加入80-100μg细胞总蛋白,并加入20μl亲和素珠子(预先用PBS清洗3次),4℃混悬过夜;
7)4℃4,000g×1min离心,washing buffer轻洗珠子6次;
8)弃净上清,加入10-15μl2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液,100℃变性5min,SDS-PAGE电泳;
9)转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗TRPV1抗体(P-19,Santa CruzBiotechnology)4℃孵育过夜、1×TBST洗膜5min×3次、HRP标记兔抗羊二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司,ZB-2306,1:1000稀释)室温孵育1h、1×TBST洗膜后,应用化学发光试剂(ECL,Santa Cruz Biotechnology)暗室胶片曝光。
3.2蛛网膜下腔注射TAT-T506能够缓解大鼠的炎性热痛觉敏化
前面在细胞水平上的研究得出以下结论:在基础状态下,Cdk5即可通过促进TRPV1与驱动蛋白KIF13B的结合而促进TRPV1向细胞表面(包括神经末稍)的转运,进而调控细胞膜(包括神经末稍)上TRPV1的数量,而Cdk5对KIF13B中Thr-506的磷酸化则在这一调控过程中发挥着至关重要的作用。因为DRG中Cdk5的激酶活性在外周炎症发生后可被大大激活[9],那么Cdk5对TRPV1的这一正性调控机制是否会参与炎症状态下TRPV1在DRG神经元细胞膜(包括外周神经末稍)的分布增多(引起TRPV1敏化的方式之一)而介导的炎性热痛觉敏化的发生过程呢?接下来,发明人在完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎症痛大鼠模型中选择通过干预Thr-506的磷酸化进而干扰Cdk5对TRPV1的调控的方法来对这一问题进行了研究。具体是采用蛛网膜下腔注射TAT-T506的方法来观察其对大鼠痛行为的影响。
先将30μg TAT-T506或TAT-T506A注射入SD大鼠的蛛网膜下腔,之后30min时,向大鼠左侧足底注射100μl25%CFA诱导炎症,并于炎症发生1h,2h,6h,1d时,利用辐射热刺激仪测定大鼠的热刺激缩足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)。其中,蛛网膜下腔注射30μg TAT-T506的大鼠为TAT-T506处理组,共19只大鼠;蛛网膜下腔注射30μg TAT-T506A的大鼠为TAT-T506A处理组,共20只大鼠。
结果如图6显示,TAT-T506A处理组的大鼠(在图6中表示为“TAT-T506A(20)”)在CFA注射后发生了明显的热痛觉敏化,而在TAT-T506处理组的大鼠(在图6中表示为“TAT-T506(19)”)中,CFA引起的热痛觉敏化则被相应缓解(组间差异###p=0.0008)。在炎症发生1h和2h时,TAT-T506预处理能显著延长大鼠的热刺激缩足潜伏期(炎症发生1h:TAT-T506预处理的大鼠的PWL为7.6±0.6s;TAT-T506A预处理的大鼠的PWL为4.9±0.5s;**p<0.01。炎症发生2h:TAT-T506预处理的大鼠的PWL为8.0±0.7s;TAT-T506A预处理的大鼠的PWL为5.0±0.4s;***p<0.001。
然后,又以无菌生理盐水为对照确定了TAT-T506A没有镇痛或是促进痛觉敏化的作用:在SD大鼠左侧足底注射100μl25%CFA诱导炎症之前30min时向蛛网膜下腔注射30μg TAT-T506A或者是相同体积的无菌生理盐水,并于炎症发生1h,2h,6h和1d时测定大鼠的PWL。结果表明两种处理大鼠在CFA注射后表现出相同程度的热痛觉敏化(PWL组间无显著性差异,p=0.6469。其中,注射TAT-T506A的大鼠6只,注射无菌生理盐水的大鼠5只),说明对照肽(TAT-T506A)本身没有镇痛或是促进痛觉敏化的作用。发明人还观察了蛛网膜下腔注射TAT-T506对大鼠的基础痛行为是否有影响。将30μg TAT-T506或TAT-T506A注射入大鼠的蛛网膜下腔,并于注射后1.5h,2.5h,6.5h和1d时测定大鼠的PWL。结果如图7所示,与对照肽(TAT-T506A)处理相比,蛛网膜下腔注射TAT-T506并没有影响大鼠的基础热敏感性(basal heatsensitivity,即基础状态下对伤害性热刺激的反应性)(PWL组间无显著性差异,p=0.3716。其中TAT-T506处理组为11只大鼠,TAT-T506A处理组为8只大鼠)。上述统计均采用双因素方差分析方法来计算两组间的整体差异,并采用Bonferroniposttests对同一时间点上的组间差异进行检验。
具体的实验方法如下:
健康雄性SD大鼠由北京大学医学部实验动物科学部提供,体重200-250g,自然照明,自由饮水和进食。所有动物实验都遵照北京大学实验动物福利伦理审查委员会的要求进行。
A1蛛网膜下腔插管手术
SD大鼠经10%水合氯醛(300mg/kg,i.p.)麻醉,背部剪毛,消毒。触及T12、T13脊椎棘突交界(腰髓膨大,腰髓L3-L4水平)和髂棘(腰椎骨L4水平),分别划横线做标记,测量两线间距离,即为进管长度(对250g大鼠而言,约3.5-4.0cm)。在髂棘水平正中线纵向划开皮肤,用一长约5cm的不锈钢管作为外套管(外径0.9mm,前端打磨成斜面,可容PE-10管通过),在L4和L5脊椎骨间隙垂直刺入椎管(此时动物的尾巴或后肢会出现轻微抽动),改变不锈钢管方向指向头端,将PE-10管(提前用75%酒精浸泡消毒,无菌生理盐水冲洗)通过外套管送入蛛网膜下腔至腰髓L3-L4水平,拔除钢管,褥式缝合,局部固定PE-10管。颈后皮肤剪小口,使PE-10管另一端经皮下由此穿出,约外露0.5-1cm左右,缝合固定于颈后皮肤上。最后缝合背部皮肤切口。术后i.p.注射青霉素1万单位以预防感染。
A2蛛网膜下腔给药及炎症痛模型建立
大鼠手术后恢复4天,于术后第5天测定基础痛阈(即基础状态下的PWL),并且随机分为两组。于蛛网膜下腔分别给予两种肽各30μl(1μg/μl)(图6),或者是分别给予30μl TAT-T506A(1μg/μl)或30μl无菌生理盐水(溶剂对照),30min后于左侧足底注射100μl25%CFA(完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂按体积比1:3混匀即成为25%CFA)建立炎症痛模型,并于模型建立后1h,2h,6h和1d时测量大鼠的PWL。在图7所示的实验中,待大鼠分组后,于蛛网膜下腔分别给予两种肽各30μl(1μg/μl),并于蛛网膜下腔给药后1.5h,2.5h,6.5h和1d时测量大鼠的PWL。
A3大鼠辐射热刺激缩足潜伏期的测定
通过测量辐射热刺激缩足潜伏期(PWL)反映大鼠对热刺激的敏感性。进行测试前将大鼠置于玻璃板上,盖以透明的有机玻璃罩(18cm×8cm×8cm),使大鼠适应环境15min,待大鼠的梳理和探究活动基本消失后,开始测试。测试时,将辐射热灯的焦点对准大鼠脚掌中心部位,开启辐射热灯并开始计时,视大鼠出现迅速缩足现象为阳性反应,大鼠出现阳性反应时立即关闭辐射热灯并停止计时。调整辐射热的强度使大鼠基础状态的PWL在10-15s,如果大鼠刺激30s仍未出现阳性反应,关闭辐射热灯,停止计时以避免烫伤。每只大鼠重复测量5次,每次测试间隔10min,去除一个最高值和一个最低值,剩余三个值的平均值为其辐射热刺激缩足潜伏期。
引用文献:
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Claims (10)
1.a)-d)中任一所示的多肽:
a)氨基酸序列如序列表中序列1第10-24位氨基酸残基所示的多肽;
b)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽;
c)对a)所示的多肽进行如下突变得到的具有1)-3)中至少一种作用的衍生多肽:将序列表中序列1的第10-24位氨基酸残基中除序列1的第17位、第18位及第20位之外的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加;
d)对b)所示的多肽进行如下突变得到的具有所述1)-3)中至少一种作用的衍生多肽:将序列表中序列1的氨基酸残基中除第17位、第18位及第20位之外的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加;
所述1)-3)为:
1)预防和/或治疗疼痛;
2)降低神经元细胞膜上瞬时受体电位香草酸亚型1含量;
3)抑制瞬时受体电位香草酸亚型1膜转运功能。
2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
4.权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备预防和/或治疗疼痛的产品中的应用。
5.一种预防和/或治疗疼痛的产品,其活性成分为权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子。
6.根据权利要求4所述的应用或权利要求5所述的产品,其特征在于:所述预防和/或治疗疼痛体现为缓解痛觉敏化。
7.根据权利要求6所述的应用或产品,其特征在于:所述缓解痛觉敏化为缓解炎性痛觉敏化。
8.根据权利要求7所述的应用或产品,其特征在于:所述缓解炎性痛觉敏化体现为缓解炎性热痛觉敏化。
9.e)或f)所示的应用:
e)权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备降低神经元细胞膜上瞬时受体电位香草酸亚型1含量的产品中的应用;
f)权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备抑制瞬时受体电位香草酸亚型1膜转运功能的产品中的应用。
10.g)或h)所示的产品:
g)以权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子为活性成分制成的降低神经元细胞膜上瞬时受体电位香草酸亚型1含量的产品;
h)以权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子为活性成分制成的抑制瞬时受体电位香草酸亚型1膜转运功能的产品。
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