CZ137299A3 - Retrovirová vektorová částice, její použití a molekula DNA - Google Patents

Description

Tento vynález se týká retrovirových vektorových částic a rekombinantních DNA molekul kódujících RNA genomy retrovirových vektorů. Zejména se týká retrovirových vektorů schopných přenášet genetický materiál do nedělících se nebo pomalu se dělících buněk.

w Dosavadní stav techniky

Značný zájem o vývoj retrovirových vektorových systémů založených na bázi lentivirů, malé podskupiny retrovirů, trvá již nějakou dobu. Tento zájem vychází především z představy, že by se vektory odvozené z HIV mohly využít k cílení anti-HIV terapeutických genů do buněk citlivých k infekci virem HIV, a dále z předpokladu, že vzhledem k tomu, že lentiviry jsou schopné infikovat nedělící se buňky (Lewis a Emerman 1993 J. Virol. 68, 510), vektorové systémy odvozené z těchto virů by byly schopné transdukovat nedělící se buňky (např. Vile a Russel 1995 Brit.Med.Bull. 51,12). Vektorové systémy odvozené z HIV byly sestrojeny (Buchschacher a Panganiban 1992 J. Virol. 66,2731) a byly použity na transdukci CD4+ buněk a nedělících se buněk (Naldini et al, 1996 Science 272,263). Účinnost přenosu genů však obecně není tak vysoká jako u srovnatelných vektorových systému odvozených z myších retrovirů.

Dosud sestrojené HlV-odvozené vektory se v transdukované buňce integrují ve formě proviru, který má na koncích HIV LTR repetice. To omezuje použití těchto vektorů, neboť pokud není použit interní promotor, LTR oblasti musí sloužit jako signály pro expresi

• ·

- 2 • ·· ·· ··

jakéhokoli genu vloženého do vektoru. Použití vnitřních promotorů má značné nevýhody (viz níže). LTR oblasti z HIV a dalších lentivirů mají své, virově specifické požadavky pro genovou expresi. HIV LTR je například neaktivní v nepřítomnosti virového Tat proteinu (Cullen 1995 AIDS 9,S19). Je proto žádoucí modifikovat LTR oblasti takovým způsobem, aby se změnily požadavky pro genovou expresi. Konkrétně to znamená, že pro některé aplikace genové terapie budou zapotřebí tkáňově specifické elementy regulace genové exprese nebo regulační elementy reagující na vnější signály. V myších retrovirech je tohoto účelu často dosaženo jednoduše tím, že se v U3 oblasti MLV LTR výmění enhanceru-podobné elementy za enhancery, které reagují na požadované signály. U virů jako je HIV toto není možné, neboť v úsecích U3 a R v LTR oblastech jsou sekvence, známé jako IST a TAR, které mohou inhibovat genovou expresi a mohou nebo nemusí reagovat na Tat protein, jsou-li do U3 oblasti vloženy heterologní, případně tkáňově specifické, regulační sekvence (Cullen 1995 AIDS 9, S19; Alonso et al, 1994 J. Virol. 68, 6505; Ratnasabapathy et al, 1990, AIDS 4, 2061; Sengupta et al, 1990, PNAS 87, 7492; Parkin et al, 1988 EMBO J. 7, 2831). I v případě, že by signální elementy na Tat protein reagovaly, nutnost dodávat Tat není žádoucí, protože to by dále komplikovalo systém a Tat má i některé vlastnosti onkoproteinů (Vogel et al, 1988 Nátuře 335, 606). Celkem vzato, tyto úvahy znamenají, že z HIV a jiných lentivirových vektorů musí být odstraněna R oblast, má-li se dosáhnout účinné exprese z nelentivirových sekvencí v LTR.

Již dříve jsme popsali v přihlášce PCT/GB96/01230 postup jak nahradit oblasti U3 a R v genomech retrovirových vektorů. Zjištění, že oblasti R mohou být nahraženy bylo překvapující, neboť do té doby se věřilo, že tyto oblasti jsou specifické pro virus, který poskytuje reversní transkriptasu pro přeměnu virového RNA genomu na předintegrovanou formu provirové DNA. Přihláška PCT/GB96/01230 konkrétně popisuje retrovirové vektory pro přenos terapeutických genů, jejichž exprese

- 3 • · · · · ···· · ··· <

·· ·· v cílových buňkách je závislá na HIV. Vnášení genů do nedělících se nebo pomalu se dělících buněk nebylo předmětem přihlášky a aplikace vynálezu na vektory odvozené z HIV nebo jakýchkoli jiných lentivirů nebyla zmíněna. Obecný postup popsaný v přihlášce

PCT/GB96/01230 poskytuje nyní způsob přípravy HlV-odvozeného vektoru, v němž jsou U3 enhancer a R oblasti nahraženy libovolnými sekvencemi za podmínky, že v R oblasti jsou zahrnuty vhodné signály pro polyadenylaci a terminaci transkripce.

io Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje v jednom aspektu retrovirovou vektorovou částici odvozenou z prvního retroviru, uvedenou retrovirovou vektorovou částici schopnou infikovat a transdukovat nedělící se savčí cílové buňky, uvedenou retrovirovou vektorovou částici obsahující balitelný RNA genom, který je, ve formě DNA proviru, schopen inzerce do genomu cílové buňky, uvedený RNA genom obsahující sekvence, které v DNA proviru poskytují:

a) nelentivirový element regulace exprese, umístěný v 5'dlouhé koncové repetici (LTR) proviru namísto promotorového elementu prvního retroviru; a

b) vybraný gen nebo geny pod transkripční kontrolou nelentivirového elementu regulace exprese v a), vybraný gen nebo geny umístěné mezi LTR oblastmi.

V jiném aspektu poskytuje vynález rekombinantní DNA 25 molekulu, kódující balitelný RNA genom pro retrovirovou vektorovou částici zde popsanou, funkčně spojenou s promotorem. Vybraný gen nebo geny mohou být v rekombinantní DNA molekule přítomny, nebo mohou být nepřítomny a v tomto případě obsahuje rekombinantní DNA molekula místo pro inzerci, např. rozpoznávací místo pro restrikční

3o enzym, do kterého lze vybraný gen nebo geny vnést.

« · ··

V dalším aspektu vynález poskytuje systém na produkci retrovirových vektorových částic zahrnující hostitelskou buňku transfekovanou nebo transdukovanou rekombinantní DNA molekulou jak je zde popsáno, uvedený systém schopný produkovat retrovirové vektorové částice jak je zde popsáno.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje systém na produkci retrovirových vektorových částic zahrnující soubor sekvencí nukleových kyselin, jež kódují složky retrovirové vektorové částice jak je zde popsáno.

V ještě dalších aspektech vynález poskytuje použití retrovirových vektorových částic zde popsaných ke genové terapii a k přípravě farmaceutického prostředku pro použití v genové terapii; a způsob provedení genové terapie na cílové buňce, spočívající v infekci a transdukci cílové buňky s použitím retrovirové vektorové částice jak je zde popsáno. Vynález dále poskytuje transdukované cílové buňky vzešlé z těchto použití a postupů. Vynález tedy poskytuje systém přenosu genů pro použití v medicíně.

To, že vektorová částice podle vynálezu „vychází z“ prvního retroviru znamená, že je odvozena z tohoto retroviru. Kostra genomu vektorové částice je tvořena komponentami tohoto retroviru. Vektorová částice jako celek obsahuje nezbytné vektorové složky, jež jsou kompatibilní s RNA genomem, včetně systémů reversní transkripce a integrace. Obvykle zahrnují proteiny gag a pol odvozené z prvního retroviru.

Je výhodné, když první retrovirus je lentivirus, což dává schopnost infikovat a transdukovat nedělící se buňky. V průběhu procesu infekce vytvářejí lentiviry v cytoplasmě cílové buňky předintegrační komplex, který obsahuje integrasu, korové proteiny a provirovou DNA. Komplex je v cílové buňce schopen procházet přes jadernou membránu s využitím signálních sekvencí v proteinech. Jiné retroviry buď postrádají tyto proteiny, nebo mají proteiny bez • · • ·

- 5 • 4 44 ► · · · » · · · • · · 4 4 4 • · ·· 44 příslušných signálních sekvencí. Lze proto očekávat, že je principiálně možné vnést schopnost infikovat nedělící se buňky do retrovirů jiných, než lentiviry.

Příklady lentivirů zahrnují HIV, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV a visna virus. Z nich jsou v současnosti nejlépe probádané HIV a SIV. Pro genovou terapii by však bylo výhodné použít lentivirus nevyvolávající imunodeficienci, neboť s viry imunodeficience jsou nevyhnutelně spojeny otázky bezpečnosti a předsudky.

Nelentivirový element regulace exprese bude zpravidla io promotor, což je termín zahrnující známé promotory, z části nebo v úplnosti, které mohou působit konstitutivně nebo mohou být regulované, tj. indukovatelné jen za určitých podmínek, např. v přítomnosti regulačního proteinu. To umožňuje, aby exprese vybraného genu nebo genů byla omezena, např. na určité typy buněk nebo na buňky, které dostávají konkrétní signál zvnějšku (exogenní signál). Například indukovatelnost genu těžkým kovem může být dosažena použitím částí metalothioneinového promotoru. Regulace exprese steroidním hormonem je další užitečný přístup. Případně lze použít regulační elementy specifické pro genovou expresi v mozku, v kmenových buňkách nebo elementy pro nádorově specifickou expresi.

Nelentivirový promotor může nahradit promotorovou funkci 5' LTR oblasti lentivirů, která je závislá na lentivirovém proteinu. Pro HIV to znamená, že 5' LTR již nebude reagovat na HIV specifický protein Tat. Tat působí prostřednictvím TAR sekvence v oblasti R; v

HlV-odvozeném vektoru podle vynálezu proto nejsou přítomny funkční TAR sekvence, aby se zabránilo snížení translace způsobené TAR strukturou. Enhancerové sekvence obsažené v HIV U3 oblastech jsou s výhodou rovněž vyřazeny. Přímočarý způsob jak získat požadované vektorové LTR oblasti tedy spočívá v nahrazení lentivirových oblastí

R a co možná nejvíce z oblastí U3, ale při zachování nezbytných

- 6 « 4 4 4 4

4 4 4 4 ·

4» · ♦ ♦ ·

44444 4 444 444

4 · ·

44 ·* lentivirových sekvencí jako je krátká sekvence v U3 oblasti, jež je nutná pro integraci.

Je zřejmé, že retrovirová vektorová částice podle vynálezu bude muset mít, aby mohla fungovat jako vektor, systém reversní transkripce (kompatibilní reversní transkriptasu a vazebná místa primerů) a systém integrace (kompatibilní integrasu a integrační místa), umožňující konverzi na provirus a integraci dvouřetězcové DNA do genomu hostitelské buňky. Navíc bude muset genom vektoru obsahovat balicí signál. Tyto systémy a signály jsou detailněji popsány io níže v Příkladech a obecně pocházejí z prvního retroviru, z něhož je vektor odvozen. Je rovněž zřejmé, že i když je vektor podle vynálezu odvozen z konkrétního prvního retroviru, může jít o retrovirus geneticky nebo jinak (např. specifickým výběrem balicího buněčného systému) upravený. Úseky prvního retrovirového genomu, které nejsou nezbytné například z hlediska schopnosti obalení, reversní transkripce a integrace, mohou být vyřazeny. Vektorový systém může být rovněž pozměněn, například použitím různých genů env, aby se změnil rozsah hostitelů a buněčných typů podléhajících infekci nebo transdukci vektorem.

Může být výhodné zahrnout další elementy retroviru, z něhož je vektor odvozen. V případě HIV by se to mohlo týkat funkčního proteinu rev a sekvencí RRE, což by v cílové buňce umožnilo účinný export RRE-obsahujících RNA transkriptů vektorového genomu z jádra do cytoplasmy.

Vybraný gen nebo geny regulované promotorem v 5'LTR oblasti proviru jsou voleny podle žádaného efektu, jehož má být dosaženo. Pro účely genové terapie půjde nejméně o jeden terapeutický gen, kódující genový produkt, který je aktivní proti stavu, který má být léčen, nebo kterému se má zabránit. Navíc, vybraný gen může též působit jako markér tím, že bude kódovat detegovatelný produkt. Terapeutické geny mohou například kódovat antisense-RNA, ribozym,

- 7 44444 4 negativně transdominantní mutantu cílového proteinu, toxin, podmíněný toxin, antigen, který indukuje protilátky nebo pomáhající buňky T nebo cytotoxické buňky T, jednořetězcovou protilátku, nebo nádorový supresorový protein.

Vybraný gen nebo geny mezi LTR oblastmi provirové DNA jsou pod transkripční kontrolou promotoru v 5' LTR, ale jinak nejsou funkčně spojeny s žádným jiným promotorem vektoru. K expresi vybraného genu nebo genů tedy dochází v rámci jedné transkripční jednotky. Jak však bude diskutováno níže, v genomu vektoru mohou io být další transkripční jednotky. Tyto by však neměly zasahovat do funkce transkripční jednotce obsahující vybraný gen nebo geny.

Pokud jsou pod transkripční kontrolou 5'LTR promotoru dva nebo více genů, může být použito vnitřní vazebné místo pro ribosom (tzv. IRES, interna! ribosome entry site) např. z RNA picornaviru, čímž je umožněna samostatná translace obou genů z jediného transkriptu. Retroviry s takovýmito IRES sekvencemi byly již jinými autory zkonstruovány.

Pod kontrolou jiného promotoru může být přítomen další gen nebo geny. Takovýto gen může kódovat například selekční markér, nebo další terapeuticky účinné agens, jež může být některým z terapeutických agens výše uvedených. Exprese tohoto genu může být konstitutivní; v případě selekčního markéru to může být užitečné pro selekci úspěšně transfekovaných balicích buněk nebo balicích buněk,které produkují obzvláště vysoké titry retrovirových vektorových částic. Selekční markér může být též užitečný pro selekci buněk, jež byly úspěšně infikovány retrovirovým vektorem a provirus se integroval do jejich vlastního genomu.

Jeden ze způsobů provedení genové terapie spočívá v odebrání buněk pacientovi, infekci extrahovaných buněk retrovirovým vektorem a zpětném navrácení buněk pacientovi. Před zpětným zavedením buněk pacientovi lze pomocí selekčního markéru získat frakci buněk • · • « • · « • · · ·

- 8 ·· ·· obohacenou o buňky, jež byly infikované nebo transdukované, nebo přímo pozitivně selektovat infikované nebo transdukované buňky. Takovýto postup může zvýšit vyhlídky na úspěch terapie. Selekční markéry mohou být například geny pro resistenci vůči lékům, geny pro metabolické enzymy, nebo jakékoli další selekční markéry známé v oboru.

Avšak je zřejmé, že při mnohých aplikacích retrovirových vektorů v genové terapii není selekce na expresi markerového genu možná nebo není nutná. Exprese selekčního markéru, která je výhodná v in vitro pokusech, by v situaci in vivo mohla být škodlivá z důvodů nepatřičné indukce cytotoxických lymfocytů T (CTL buněk) namířených proti cizí markerové bílkovině. Je též možné, že pro in vivo aplikace budou výhodnější vektory bez jakýchkoli interních promotorů. Přítomnost interních promotorů může například ovlivnit_transdukční titry dosažitelné z balicí buněčné linie a stabilitu integrovaného vektoru. Pro použití in vivo tak mohou být výhodné vektory s jednou transkripční jednotkou, která může být dvoucistronová nebo polycistronová a může kódovat jeden nebo dva nebo více terapeutických genů.

Je zřejmé, že termín „gen“ je zde užíván volně a zahrnuje jakoukoli nukleovou kyselinu kódující žádaný polypeptid. Geny vnášené do buněk vektorem podle vynálezu budou zpravidla cDNA molekuly.

Pro účely genové terapie je žádoucí, aby genom retrovirového vektoru nekódoval žádné zbytečné polypeptidy, to znamená žádné polypeptidy, které nejsou potřebné k dosažení účinku, pro který byl vektor konstruován. V každém případě má být retrovirový vektor replikačně defektní. Proto je nutné z genomu vektoru vyřadit oblasti kódující v plné délce gag-pol nebo env, nebo s výhodou obě tyto oblasti. To sleduje dvojí cíl: vyhnout se nežádoucí imunitní odpovědi

- 9 • · · namířené proti cizím virovým proteinům a snížení možnosti vzniku replikačně kompetentního retroviru rekombinací.

Retrovirová vektorová částice podle vynálezu bude rovněž schopná infikovat a transdukovat pomalu se dělící buňky, které by nelentiviry jako je MLV nebyly schopné účinně infikovat a transdukovat. Pomalu se dělící buňky se dělí jednou za zhruba tři až čtyři dny. Savčí nedělící se a pomalu se dělící buňky zahrnují mozkové buňky, kmenové buňky, terminálně diferenciované makrofágy, plicní epitelové buňky a různé další typy buněk. Rovněž mezi ně patři některé nádorové buňky. I když nádory obsahují rychle se dělící buňky, některé nádorové buňky, zejména ve středu nádoru, se nedělí často.

Zde popsané rekombinantní DNA molekuly kódující vektorový genom, jsou s výhodou připojeny k vysoce účinnému promotoru, jako je promotor CMV (cytomegalovirus). Jsou známy i jiné vysoce účinné promotory. Takovýto promotor umožňuje vysokou hladinu exprese vektorové RNA v hostitelské buňce, jež produkuje retrovirové vektorové částice.

Vhodné hostitelské nebo produkční buňky, jež se dají použít ve

2o vynálezu, jsou dobře známé v oboru. Mnohé retroviry již byly rozloženy na replikačně defektní genomy a balicí složky. Tatáž technologie je použitelná pro retroviry, kde se tak ještě nestalo. Produkční buňka kóduje virové složky, nekódované vektorovým genomem, jako jsou proteiny gag, pol a env. Geny gag, pol a env mohou být vneseny do produkční buňky a v ní stabilně integrovány do buněčného genomu za vzniku tzv. balicí buněčné linie. Retrovirový vektorový genom je pak vpraven do balicí buněnčné linie pomocí transfekce nebo transdukce, čímž vznikne stabilní buněčná linie, jež obsahuje všechny DNA sekvence, potřebné k tvorbě retrovirové vektorové částice. Jiný přístup spočívá v tom, že se různé DNA sekvence nutné pro tvorbu retrovirové vektorové částice, např. kódující sekvence env, gag-pol

- 10 a defektní retrovirový genom, vnesou do buňky současně pomocí trojité přechodné transfekce (Landau a Littman 1992 J. Viroi. 66, 5110; Soneoka et al, 1995).

Strategie podle vynálezu má několik výhod vedle těch, jež byly již popsány. Předně, využití 5' LTR jakožto regulačního elementu pro expresi terapeutické transkripční jednotky umožňuje, aby tento vektorový genom působil v transdukované buňce jako jedna transkripční jednotka nejen pro produkci, ale také pro expresi. Tím se lze vyhnout potřebě použít vnitřní promotory mezi LTR oblastmi. io Nepředvídatelnost výsledku plynoucího z umístění dalších promotorů do retrovirové LTR transkripční jednotky je dobře dokumentovaná (Bowtell et al, 1988 J. Virol. 62,2464; Correll et al, 1994 Blood 84, 1812; Emerman a Temin, 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al, 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al, 1989 PNAS 86, 3519;

Hatzoglou et al, 1991 J. Biol. Chem. 266,8416; Hatzoglou et al, 1988 J. Biol. Chem 263, 17798; Li et al, 1992 Hum. Gen. Ther. 3, 381; McLachlin et al, 1993 Virol. 195, 1; Overell et al, 1988 Mol. Cell. Biol. 8, 1803; Scharfman et al, 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al, 1994 Gene Ther. 1, 307; Xu et al, 1989 Virol. 171, 331; Yee et al, 1987 PNAS 84,

5197). Zdá se, že svou roli hrají relativní poloha a orientace obou promotorů, vlastnosti promotorů a exprimovaných genů a použité selekční postupy. Přítomnost vnitřních promotorů může ovlivnit jak hodnotu transdukčních titrů dosažitelných z balicí buněčné linie, tak i stabilitu integrovaného vektoru. Ztráta genové exprese po transdukci může být způsobena jak delecemi v proviru, tak umlčením promotoru prostřednictvím reversibilních epigenetických mechanismů. Kromě toho, z údajů získaných pokusy v tkáňových kulturách často nelze usuzovat na chování vektorů in vivo. Z těchto úvah plyne, že slibné vektory pro genovou terapii pravděpodobně budou jednoduché retrovirové vektory obsahující jediný LTR promotor (Correll et al, 1994 Blood 84, 1812). Kromě toho bude též možné, s rozvojem dvoucistronových vektorů majících pouze jeden promotor (Adam et al,

- 11 • ··« ·**· ·»· « ··« · ·· · . · « » · ·«·· · ··· ··· • · · · · · · ··· ·· ·· · «· ··

1991 J. Virol. 65, 4985), vytvořit vektory s jednou transkripční jednotkou, jež by kódovaly dva nebo více terapeutických genů a tím byly přiměřeně účinnější.

Druhá výhoda odstranění signálů exprese HIV uvnitř oblastí U3 a R je vtom, že aktivita těchto regulačních elementů podléhá řadě vnějších vlivů. Je známo, že HIV promotor může být aktivován různými činiteli, jako jsou UV, stres, jiné viry atd (Peterlin 1992 v Human Retroviruses, Cullen ed., IRL Press), takže regulace transkripčního stavu vektorového genomu je obtížná. Odstranění těchto sekvencí io zajistí větší míru regulovatelnosti terapeutického genu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje obecné schéma vektorů podle vynálezu;

Obrázek 2 ukazuje generalizovaný HlV-odvozený vektorový genom podle vynálezu;

Obrázek 3 ukazuje HlV-odvozený vektorový genom popsaný v Příkladu 1;

Obrázek 4 ukazuje detailněji strukturu 3'LTR oblasti vektoru z Obrázku 3;

Obrázek 5 ukazuje schematický diagram balicích složek;

Obrázek 6 dále ukazuje princip vektorů podle vynálezu.

Hlavní rysy vynálezu ukazuje Obrázek 1. Vektorový systém je označen jako LLD (tj. lentivirový LTR-deletovaný) vektor. Obsahuje molekulu DNA, ve které promotor CMV nebo jiný vysoce účinný promotor řídí expresi vektorové RNA v produkční buňce. Tato strategie je analogická jako u HIT vektorového systému (Soneoka et al, 1995 Nucl. Acids Res. 23, 628). Produkční buňka bude konstruována tak, aby produkovala kompatibilní lentivirové strukturní

- 12 ΦΦ φ» · ·* ·* φ · φ φ φφφφ φφφ φφφφ φφφφ φ φφφ φ φφφφ φ ·Φ· ··· φ φ φ · · · * • Φ φφ φ ·· ·* proteiny a enzymy. Bude to proto tzv. pomocná buňka neboli balicí buňka pro vektor. Produkční DNA může mít podobu autonomního plasmidu, který se buď replikuje nebo nereplikuje, nebo může být tato DNA integrovaná do genomu produkční buňky. Všechny tyto strategie jsou známé v oboru (Soneoka et al, 1995 Nucl. Acids Res. 23, 628;

Miller a Rossman 1989 BioTech. 7, 980; Miller 1990 Hum. Gene Ther.

1, 5). Produkční DNA, produkující genom vektoru, obsahuje alespoň tyto sousedící komponenty: vysoce účinný promotor; R oblast nelentivirového původu, která pochází buď z jiného retroviru nebo je io plně synthetická; celou nebo část lentivirové oblasti U5, která obsahuje sekvence potřebné k integraci za účasti lentivirové integrasy a sekvence nutné pro účinnou reversní transkripci; balicí signály, které jsou rozpoznávány balicími komponentami produkční buňky; vnitřní oblast, která může obsahovat geny, včetně terapeutických nebo reportérových genů nebo selekčních markérů, s příslušnými elementy pro regulaci jejich exprese (kromě toho může vnitřní oblast obsahovat složky systémů zajišťujících účinný sestřih a transport RNA); lentivirové vazebné místo pro primer pro druhý řetězec; krátkou sekvenci 30 - 100 nukleotidů z lentivirové U3 oblasti, která je nutná pro účinnou integraci lentivirovou integrasou; heterologní promotor, který může zajišťovat tkáňově specifickou genovou expresi nebo regulaci prostřednictvím exogenního signálu, a tak umožňuje vhodnou expresi terapeutického genu; oblast R, identickou s první R oblastí, se signály terminace transkripce a polyadenylace, které jsou potřebné pro vytvoření vektorové RNA s koncovými R oblastmi. Tato produkční DNA produkuje molekulu RNA, jež je obalena lentivirovým balicím systémem. Výsledné vektorové částice budou tuto RNA přenášet do citlivé buňky, RNA bude přeměněna na DNA pomocí lentivirové reversní transkriptasy a poté integrována do buněčného genomu účinkem lentivirové integrasy. Ve výsledném proviru bude CMV promotor produkční DNA nahražen krátkou lentivirovou sekvencí z konce lentivirové U3 oblasti a heterologním promotorem, který může

- 13 44 •

4·· •

4 4 4 4

4444

4

44

4 4 · • · · · podmiňovat tkáňově specifickou nebo regulovanou genovou expresi. Vzhledem ktomu, že lentivirová R oblast je zcela nahražena, v integrovaném vektorovém genomu nejsou přítomny žádné inhibující TAR sekvence.

Obrázek 2. Příklad: HlV-odvozený LLD vektor.

Horní index H = HlV-odvozená sekvence (může být jakýkoli lentivirus).

Horní index M = MLV-odvozená sekvence, ψ = balicí místo (včetně gag oblasti).

io PBS = vazebné místo primeru pro druhý řetězec.

VNITŘNÍ = oblast obsahující geny, selekční markéry, další promotory nebo systémy transportu RNA, jako jsou HIV RRE a Rev kódující sekvence).

Obrázek 3. Genom NIT vektoru (inzerty 3789 bp + kostra vektoru 2929 bp = 6718 bp):

HCMV promotor (-521 až -1) z pRV109.

HIV sekvence (552 až 1144; 5861 až 6403; 7621 až 9085) z HXB2.

Genotyp: gag-; pol-; env-; rev+; RRE; vif-; vpu-; vpr-; tat-; nef-.

Mutace:

• tři bodové mutace k odstranění ATG kodonů (790,834,894) (@) • posunová mutace inzercí dvou baží (831) (*) • delece mezi Ndel (6403) a Bgill (7621) (Δ)

Mnohočetné klonovací místo (X): Xhol-Sall-Clal-EcoRV-EcoRIPstl-Smal-BamHl-Spel ; podtržená místa jsou unikátní.

··· ·· ·· ♦ ·* ·♦

Maximální velikost inzertu, který lze vložit do mnohočetného klonovacího místa: 5997 bp.

Kostra: pBluescriptKS+.

⁵ Obrázek 5. Schematický nákres složek balicího systému.

pRV664 kóduje HIV-1 HXB2 gag-pol (637-5748) a obsahuje element RRE (7720-8054); kostru tvoří pCI-neo (PROMEGA).

pRV438 obsahuje rev a env z HXB2 (5955-8902) v pSA91, což je plasmid pro savčí expresi s CMV promotorem.

io pSYngp 160mn (poskytl B.Seed) je plasmid exprese pro HIV-1

MN obal (env), ve kterém bylo optimalizováno užití kodonů pro savčí buňky.

pRV67 je plasmid pro expresi VSV G v pSA91.

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1

HlV-odvozeny LLD vektor s MLV U3 promotorem a MLV R oblastmi.

Obecnou strukturu HIV LLD vektorového systému ukazuje Obr.2.

Obr. 3 a 4 ukazují strukturu z Příkladu 1. Konstrukce vektoru z příkladu je v dalším rozvedena. Minimální požadavky HIV reversní transkripce jsou vazebné místo pro primer (PBS) umožňující iniciaci syntézy negativního řetězce DNA, polypurinový trakt (PPT) pro iniciaci syntézy pozitivního řetězce DNA a dále identické 5'a 3' R sekvence, jež umožňují první přeskok templátu. Ve vektoru proto musí být PBS a PPT z HIV-1 a do obou LTR oblastí je třeba zahrnout R úseky z MLV. Jelikož pro reversní transkripci by mohla být důležitá

- 15 • · · · ······ • · · · · ·· ·· · sekundární struktura uvnitř 5' U5 oblasti, tato U5 oblast v 5'LTR je převzata z HIV-1. Pro U5 oblast v 3'LTR byla použita U5 z HIV-1, aby byla zajištěna správná terminace transkripce na rozhraní R-U5. Mohly by však být použity jakékoli terminační signály. Aby se dosáhlo účinné integrace, bylo na 5'-konec U3 úseku 3' LTR oblasti zařazeno 30 nukleotidů z 5'-konce HIV-1 U3 oblasti.

K tomu, aby se U3 element MLV ocitl po reversní transkripci v 5'LTR, musí být přítomen v 3'LTR virové RNA. Celý úsek U3 z MLV, kromě 30 bp na jeho 5'konci, proto nahradil U3 oblast viru HIV-1. io 3' LTR oblast vektoru je navržena tak, že obsahuje několik výhodných restrikčních míst, aby MLV U3 segment mohl být snadno nahražen jinými heterologními promotory (Obr. 4). Heterologní promotory se získají PCR amplifikací, přičemž na konci jednoho primerů je restrikční místo Stul a na konci druhého primerů restrikční místo Narl, která budou využita při výměně MLV U3 oblasti. Na 5' konci promotorových kazet mohou být použity, kromě Stul, také Nhel a Aflll. Restrikční místo Narl (GGCGCC) se nachází na rozhraní mezi promotorem a úsekem R, takže místo počátku transkripce z heterologního promotoru bude zachováno. Sekvence v MLV U3

2o mezi místy Xbal a Narl obsahuje základní promotorové elementy včetně TATA boxu, GC boxu a CAAT boxu. MLV enhancer proto může být nahražen jakýmkoli jiným enhancerem jako Stul (nebo Nhel nebo Aflll) - Xbal kazeta.

Je známo, že pro účinné balení virové částice postačuje 353 nukleotidů v genu gag (Srinivasakumar et al, 1996 CSH Retrovirus Meeting abstrakt). Těchto 353 nukleotidů gag sekvence odpovídá sekvenci od pozice 790 do 1144, uvnitř které byly mutací v polohách 790, 834, 894 odstraněny tři iniciační kodony ATG. Mimoto se za sekvencemi gag, po směru exprese, nachází mnohočetné klonovací místo.

• · · * • · · ·· • · φ ·

- 16 • ·* ·· · • ··« • Φ Φ · ··· ···

Κ účinnému exportu RNA molekul kódovaných HIV genomem jsou potřebné protein rev a element RRE. Tyto odpovídají sekvencím HIV-1 (HXB2) 5861 až 6403 a 7621 až 9085, a jsou zahrnuty do LLD vektoru. Tat kódující sekvence není ve vektoru přítomná.

Detaily konstrukce produkční DNA:

A. 5' struktura (všechny koordináty HIV-1 jsou podle HXB z Los

Alamos Sequence Database a sekvence MoMLV jsou podle Shinnick et al 1981 Nátuře 293, 543) io 5'polovina vektoru obsahuje hybridní 5' LTR (CMV promotor MLV R - HIV-1 U5), HIV-1 PBS a HIV-1 balicí signál. Tato struktura se sestaví pomocí rekombinační PCR. Jeden z templátů pro PCR, pHIVdge2, je HIV-1 provirová DNA, která má v místě Clal (831) mutaci vytvořenou doplněním kohezních konců po štěpení Clal a následnou religací a deletovaný úsek mezi Ndel (6403) a Bglll (7621). Rozhraní mezi MLV R a HIV-1 U5 je vytvořeno dvěma primárními PCR reakcemi (s použitím párů primerů NIT1 a NIT2; NÍT3 a NIT4) a sekundární PCR reakcí (při použití primerů NIT1 a NIT4). PCR produkt je vložen jako inzert do plasmidu pBluescriptKS+ (STRATAGENE) mezi restrikční místa Kpnl a Xhol (rekombinantní produkt A1). Mutace tří ATG kodonů v oblasti gag je dosaženo přítomností mutovaných kodonů v primerech.

NIT1: 5'-ccgggtacccgtattcccaataaagcctcttgctgtttgca-3' (SEQ ID NO:1)

NIT2: 5'-ctacgatctaattctcccccgcttaatactgacgctctcgcacctatctc-3' (SEQ

ID NO: 2)

NIT3: 5'gcgggggagaattagatcgtagggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatat aaattaaaacatatagtttggg-3' (SEQ ID NO: 3)

NIT4: 5'-gaattctcgaggcgtgctgtgcttttttctatc-3' (SEQ ID NO: 4)

- 17 • fc • ·· • fc • fc · • fcfc • · · · « · · fcfc • fcfc • fc · • fc • fcfc fc fcfc • fcfc • · • fc ♦·

Fragment CMV promotor - MLV R je amplifikován PCR reakcí z plasmidu pRV109 (Soneoka et al, 1995) s použitím primerů NIT5 a NIT6 tak, aby na obou koncích obsahoval Kpnl místa; tento fragment je vložen do rekombinantního produktu A1 za vzniku rekombinantu A2.

NIT5: 5'-gtaggtacccgttacataacttacggtaaatg-3' (SEQ ID NO: 5)

NIT6: 5'-agaggctttattgggaatacg-3' (SEQ ID NO: 6) ίο B, 3' struktura

3'polovina vektorového genomu zahrnuje HIV-1 oblast kódující rev, RRE, PPT, 36 bp 5'konce HIV-1 U3 oblasti a celou MLV LTR oblast, kromě 30 bp na 5'-konci. Sekvence (5861-6000) jsou amplifikovány PCR reakcí z plasmidu pHIVdge2 (s primery NIT7 a NIT8) a poté subklonovány do pSP64 (PROMEGA) mezi BamHI a Sací místa (rekombinantní produkt B1).

NIT7: 5'-cacggatccactagttggaagcatccaggaagtcagc-3' (SEQ ID NO: 7) NIT8: 5'-ctctgactgttctgatgagc-3' (SEQ ID NO:8)

Sacl-Sacl fragment (6000-6403 a 7621-9572) z pHIVdge2 je vložen do výše uvedeného rekombinantu B1 za vzniku rekombinantního produktu B2. Nakonec se sestrojí HIV-1 - MLV hybridní LTR pomocí dvou primárních PCR reakcí (primery NIT9 a NIT10 na templátu pHIVdge2; primery NIT11 aNIT12 na templátu pLXSN /přírůstkové číslo, accession number M28248; Miller et al, 1989/) a jedné sekundární PCR reakce (s primery NIT9 a NIT12). PCR

- 18 • *· • A • ·

A · · • · A » • · · · · ♦ ♦ A *

AA ·

Α· AA • A A · • · · A • « · · · ·

A A

A· ·· produkt je pak vložen mezi Xhol a EcoRI místa rekombinantu B2 za vzniku rekombinantního produktu B3.

NIT 9: 5'-gagcagcatctcgagacctgg-3' (SEQ ID NO: 9)

NIT10: 5'-tggcgttacttaagctagcaggcctgtcttctttgggagtgttttagc-3' (SEQ ID NO: 10)

NIT11: 5'-cccaaagaagacaggcctgctagcttaagtaacgccatttttcc-3' (SEQ ID NO: 11)

NIT12: 5'-cctgaattccgcggaatgaaagacccccgctgacg-3' (SEQ ID NO: 12)

C. Úplný vektor

Dvě poloviny vektoru jsou zkombinovány inzercí fragmentu Spel-Sacll z rekombinantního produktu B3 do rekombinantního produktu A2. Výsledný produkt C1 obsahuje mnohočetné klonovací místo: Xhol-Sall-Clal-HindllI-EcoRV-EcoRl-Pstl-Smal-BamHl-Spel (podtržená místa jsou ve vektoru unikátní). Tento plasmid byl označen pLLD1 a retrovirový vektor, který je jím produkován má označení LLD1.

Do rekombinantu C1 byl mezi místa Sall a BamHI vložen gen

2o pro β-galaktosidasu, vyjmutý jako fragment Xhol-BamHI z pSP72lacZ, za vzniku pLLD1-lacZ. Tento plasmid byl použit k transfekci buněk 293T spolu s plasmidem poskytujícím složky gag a pol viru HIV (pRV664, Obr. 5) a dále buď s plasmidem exprimujícím gp160 viru HIV (pRV438 nebo pSynp160mn, Obr. 5) nebo s plasmidem exprimujícím protein VSVG (pRV67, Obr. 5). Jakékoli plasmidy kódující tyto stejné proteiny by vyhovovaly stejně dobře. Výsledný virus, takto produkovaný, transdukuje lacZ gen do CD4+ Hela buněk v případě viru obsahujícím gp160, a do Hela buněk CD4- v případě viru nesoucím protein VSVG. Mimoto virus nesoucí VSVG vnáší lacZ do post- 19 . · · « » * *♦»· · ··· ··’

·..· : .· ·· mitotických neuronů. Ve všech případech je exprese genu lacZ vysoká, jak vyplynulo z barvení Xgal, a přitom nezávislá na Tat.

PŘÍKLAD 2

Další LLD vektory.

Systémy podobné systému, který byl popsán v Příkladu 1 lze vytvořit z jiných lentivirů. Tyto systémy obcházejí použití viru HIV, který je pro systém přenosu genů vnímán jako riskantní. Konstrukce vektorů by například mohly využít sekvenční informace z FIV (Talbott et al, 1989 PNAS 86, 5743), EIAV (Payne et al, 1994 J. Gen. Virol. 75, io 425), Visna viru (Sonigo et al, 1985 Cell 42, 369; Querat et al, 1990 Virology 175, 434), BIV (Garvey et al, 1990 Virology 175, 391) a SIV (databáze sekvencí v Los Alamos).

Zastupuje:

- 20 • flfl • fl · • flflfl • flfl flflfl • flfl flfl ·· fl • flfl • · · flfl flfl • · flfl fl·· ttfl • flfl • flfl fl flflfl fl • fl • flfl ··

Claims (5)

1 až 10 při přípravě farmaceutického prostředku pro použití v genové terapii.

·· ·· · ·· ··

18. Způsob provedení genové terapie na cílové buňce, který zahrnuje infekci a transdukci cílové buňky retrovirovou vektorovou částicí podle kteréhokoli z nároků 1 až 10.

1. Retrovirová vektorová částice odvozená z prvního retrovirů, kde uvedená retrovirová vektorová částice je schopná infikovat

5 a transdukovat nedělící se savčí cílové buňky, uvedená retrovirová vektorová částice obsahuje balitelný RNA genom, který je ve formě DNA proviru možno vnést do genomu cílové buňky, a uvedený RNA genom obsahuje sekvence, které v DNA proviru poskytují:

a) nelentivirový element regulace exprese umístěný v 5'dlouhé io koncové repetici (LTR) proviru namísto promotorového elementu prvního retrovirů; a

b) vybraný gen nebo geny pod transkripční kontrolou nelentivirového elementu regulace exprese v a), kde vybraný gen nebo geny jsou umístěné mezi LTR oblastmi.

2. Retrovirová vektorová částice podle nároku 1, kde první retrovirus je lentivirus, ve kterém jsou nepřítomné jedna nebo více lentivirových sekvencí, jež normálně v DNA proviru poskytují 5'promotorovou funkci závislou na lentivirovém proteinu.

3. Retrovirová vektorová částice podle nároku 1 nebo nároku 2, kde lentivirus, z nějž je vektor odvozen, je HIV a kde jsou nepřítomné funkční sekvence TAR.

25

4. Retrovirová vektorová částice podle nároku 3, kde vektorový genom dále obsahuje funkční rev a RRE sekvence, což umožňuje export RNA transkriptů genomu, obsahujících RRE, z jádra do cytoplasmy cílové buňky.

• · · • · · · · ·

- 21 • · · • · ·

999 999 • · • · · 9

5. Retrovirová vektorová částice podle kteréhokoli z nároků 2 až 4, kde lentivirové R oblasti jsou nahraženy nelentivirovými R oblastmi.

6. Retrovirová vektorová částice podle kteréhokoli z nároků 1 až 5,

5 kde nelentivirový element regulace exprese je regulovaný promotor, ’ který je indukovatelný nelentivirovým regulačním faktorem.

7. Retrovirová vektorová částice podle nároku 6, kde regulovaný promotor je indukovatelný nevirovým regulačním faktorem.

8. Retrovirová vektorová částice podle nároku 1, kde element regulace exprese obsahuje MLV LTR promotor.

9. Retrovirová vektorová částice podle kteréhokoli z nároků 1 až 8,

15 kde nelentivirový element regulace exprese obsahuje nelentivirové retrovirové oblasti U3 a R, nebo jejich funkční části.

10. Retrovirová vektorová částice podle kteréhokoli z nároků 2 až 9, kde RNA genom obsahuje první nelentivirovou oblast R, část

2o lentivirové oblasti U5 dostačující pro integraci a reversní transkripci, vazebné místo primeru pro reversní transkripci prvního řetězce, balicí signál, vnitřní oblast obsahující alespoň jeden vybraný gen, vazebné místo primeru pro reversní transkripci druhého řetězce, krátkou sekvenci lentivirové oblasti U3 dostačující pro integraci, nelentivirový

25 promotor, a druhou oblast R, v podstatě identickou s první R oblastí.

• · ·

- 22 ·«· · · · · * ·· · • · · · · ···· · ··· ··· • · · · · · · ····· ·· · · · · ·

11. Rekombinantní DNA molekula kódující balitelný RNA genom pro retrovirovou vektorovou částici podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, funkčně připojený k promotoru.

5

12. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 11, kde promotor je vysoce účinný promotor.

13. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 11 nebo nároku 12, kde vybraný gen je nepřítomen a rekombinantní molekula má inzerční io místo, do kterého lze vložit vybraný gen nebo geny.

14. Systém na produkci retrovirových vektorových částic, zahrnující hostitelskou buňku transfekovanou nebo transdukovanou rekombinantní DNA molekulou podle kteréhokoli z nároků 11 až 13,

15 uvedený systém schopný produkovat retrovirové vektorové částice podle kteréhokoli z nároků 1 až 10.

15. Systém na produkci retrovirových vektorových částic, zahrnující soubor sekvencí nukieových kyselin, jež kódují složky retrovirové

20 vektorové částice podle kteréhokoli z nároků 1 až 10.

16. Použití retrovirové vektorové částice podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 při genové terapii pro infekci a transdukci cílové buňky.

25

17. Použití retrovirové vektorové částice podle kteréhokoli z nároků

5 19. Cílové buňky získané z použití nebo způsobu podle kteréhokoli z nároků 16 až 18.

Zastupuje: