KR20200079497A - 제제 - Google Patents

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KR20200079497A
KR20200079497A KR1020207012309A KR20207012309A KR20200079497A KR 20200079497 A KR20200079497 A KR 20200079497A KR 1020207012309 A KR1020207012309 A KR 1020207012309A KR 20207012309 A KR20207012309 A KR 20207012309A KR 20200079497 A KR20200079497 A KR 20200079497A
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rna
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KR1020207012309A
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크리스티 엠. 우드
노아 폴 가드너
루치 루드라프라사드 샤
스티븐 에스. 스컬리
람지 머줍
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인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 생물학적 활성제의 전달을 위한 개선된 특성을 갖는 지질 나노입자-기반 조성물, 조작된 세포, 및 작용제의 전달 방법을 제공한다.

Description

제제
본 출원은 2017년 9월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/566,240호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
생물학적 활성제, 특히 RNA, mRNA, 및 가이드 RNA의 전달을 위한 개선된 특성을 갖는 지질 나노입자("LNP") 조성물이 본원에 제공된다. LNP 조성물은 세포막을 가로질러 RNA 작용제의 전달을 용이하게 하고, 특정 구체예에서, 이들은 유전자 편집을 위한 성분 및 조성물을 살아있는 세포에 주입한다.
세포에 전달하기에 특히 어려운 생물학적 활성제는 단백질, 핵산계 약물, 및 이의 유도체를 포함한다. CRISPR/Cas9 시스템 성분의 전달을 위한 것과 같은 유망한 유전자 편집 기술을 세포에 전달하기 위한 조성물이 특히 관심사이다.
생체 내 세포에서 유전자를 편집하기 위한 다수의 성분 및 시스템이 현재 존재하며, 질병 치료를 위한 큰 잠재력을 제공한다. CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 세포에서 리보핵산단백질 복합체로서 활성이다. RNA-지시된 뉴클레이스는 세포에서 DNA 서열에 결합하고 절단을 지시한다. 이러한 위치-특이적 뉴클레이스 활성은 세포 자체의 자연적 과정을 통해 유전자 편집을 용이하게 한다. 예를 들어, 세포는 비상동 말단 연결(non-homologous end joining, "NHEJ")으로 알려진 오류가 발생하기 쉬운 복구 과정으로써 이중-가닥 DNA 절단(double-stranded DNA break, DSB)에 반응한다. NHEJ 동안, 뉴클레오타이드는 세포에 의해 DNA 말단에서 첨가되거나 제거되어 절단된 서열로부터 변경된 서열을 생성할 수 있다. 다른 상황에서, 세포는 상동성-지시 복구(homology-directed repair, "HDR") 또는 상동 재조합(homologous recombination, "HR") 메커니즘에 의해 DSB를 복구하고, 여기서 내인성 또는 외인성 주형이 절단의 직접 복구에 사용될 수 있다. 이들 편집 기술 중 몇 가지는 단일-가닥 절단(single-stranded break, SSB) 또는 DSB 복구를 위한 세포 메커니즘을 이용한다.
CRISPR/Cas의 단백질 및 핵산 성분을 세포, 예컨대 환자의 세포에 전달하기 위한 조성물이 필요하다. 특히, CRISPR 단백질 성분을 인코딩하는 mRNA를 전달하고, CRISPR 가이드 RNA를 전달하기 위한 조성물이 특히 관심사이다. RNA 성분을 안정화하고 전달할 수 있는 시험관내 및 생체내 전달을 위한 유용한 특성을 갖는 조성물이 또한 특히 관심사이다.
본 발명자들은 본원에서 특히 CRISPR/Cas 유전자 편집 성분의 전달을 위한 유용한 특성을 갖는 지질 나노입자-기반 조성물을 제공한다.
특정 구체예에서, LNP 조성물은 RNA 성분; 및 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분은 다음을 포함한다: (1) 약 50-60 mol-% 아민 지질; (2) 약 8-10 mol-% 중성 지질; 및 (3) 약 2.5-4 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 6이다. 추가적인 구체예에서, LNP 조성물은 (1) RNA 성분; (2) 약 50-60 mol-% 아민 지질; (3) 약 27-39.5 mol-% 헬퍼 지질; (4) 약 8-10 mol-% 중성 지질; 및 (5) 약 2.5-4 mol-% PEG 지질을 포함하고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 5-7이다.
다른 구체예에서, LNP 조성물은 RNA 성분; 및 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분은 다음을 포함한다: (1) 약 50-60 mol-% 아민 지질; (2) 약 5-15 mol-% 중성 지질; 및 (3) 약 2.5-4 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10이다. 추가적인 구체예에서, LNP 조성물은 (1) 약 40-60 mol-% 아민 지질; (2) 약 5-15 mol-% 중성 지질; 및 (3) 약 2.5-4 mol-% PEG 지질을 포함하는 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 6이다. 또 다른 구체예에서, LNP 조성물은 (1) 약 50-60 mol-% 아민 지질; (2) 약 5-15 mol-% 중성 지질; 및 (3) 약 1.5-10 mol-% PEG 지질을 포함하는 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 6이다.
일부 구체예에서, LNP 조성물은 RNA 성분; 및 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분은 다음을 포함한다: (1) 약 40-60 mol-% 아민 지질; (2) 약 0-5 mol-% 중성 지질, 예를 들어, 인지질; 및 (3) 약 1.5-10 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 RNA 성분; 및 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분은 다음을 포함한다: (1) 약 40-60 mol-% 아민 지질; (2) 약 1 mol-% 미만의 중성 지질, 예를 들어, 인지질; 및 (3) 약 1.5-10 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10이다. 특정 구체예에서, LNP 조성물에는 중성 지질이 본질적으로 없다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 RNA 성분; 및 지질 성분을 포함하고, 여기서 지질 성분은 다음을 포함한다: (1) 약 40-60 mol-% 아민 지질; 및 (2) 약 1.5-10 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10이고, 여기서 LNP 조성물에는 중성 지질, 예를 들어, 인지질이 없다. 특정 구체예에서, LNP 조성물에는 중성 인지질이 없거나 본질적으로 없다. 특정 구체예에서, LNP 조성물에는 중성 지질, 예를 들어, 인지질이 없거나 본질적으로 없다.
특정 구체예에서, RNA 성분은 mRNA, 예컨대 RNA-유도 DNA-결합제(예를 들어, Cas 뉴클레이스 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스)를 포함한다. 특정 구체예에서, RNA 성분은 gRNA를 포함한다.
도 1은 1 mpk(도 1A) 또는 0.5 mpk(도 1B)의 단일 용량으로 나타난 LNP 조성물 중의 CRISPR/Cas 유전자 편집 성분 Cas9 mRNA 및 gRNA의 전달 후 마우스 간에서 달성된 TTR 유전자 편집의 백분율을 나타낸다.
도 2는 Cas9 mRNA 및 gRNA를 포함하는 LNP 조성물에 대한 입자 분포 데이터를 나타낸다.
도 3은 조성물에 대한 로그 미분 몰질량(도 3A) 및 평균 분자량 측정치(도 3B)을 비교하는 LNP 조성물의 물리화학적 특성을 나타낸다.
도 4는 도 3의 LNP 조성물을 분석하여, 도 4A에서 다분산도 계산을 나타내고 도 4B에서 Burchard-Stockmeyer 분석을 나타낸다.
도 5는 래트에서 단일 용량 투여 후 혈청 TTR 녹다운, 간에서의 유전자 편집, 및 사이토카인 MCP-1 수준에 대하여 PEG 지질 농도가 증가된 LNP 조성물의 효과를 평가한 실험 결과를 제공한다. 도 5A는 혈청 TTR 수준을 그래프로 나타내며; 도 5B는 간 샘플에서의 편집 퍼센트를 그래프로 나타내며; 도 5C는 pg/mL로 MCP-1 수준을 제공한다.
도 6은 LNP 조성물이 다양한 PEG 지질을 사용한 유전자 편집에 대해 효능을 유지함을 나타낸다 (혈청 TTR 수준에 의해 측정됨 (도 6A 및 6B) 및 편집 퍼센트 (도 6C).
도 7은 지질 A 유사체가 마우스에서 단일 용량 투여 후 간 편집 %에 의해 측정된 바와 같이 LNP 조성물에서 유전자 편집 카르고를 효과적으로 전달함을 나타낸다.
도 8은 일차 시노 간세포에서 다양한 LNP 조성물을 사용한 편집 퍼센트의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 9A 및 도 9B는 gRNA 대 mRNA의 비율이 변하는 경우 혈청 TTR 및 편집 퍼센트 결과를 나타내고, 도 9C 및 도 9D는 Cas9 mRNA의 양이 일정하게 유지되고 gRNA가 마우스에서 단일 용량 투여 후 변하는 경우 간에서의 혈청 TTR 및 편집 퍼센트 결과를 나타낸다.
도 10A 및 도 10B는 중성 지질을 포함하는 및 포함하지 않는 LNP 조성물의 투여 후 혈청 TTR 및 간 편집 결과를 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 세포로의 전달을 위한 CRISPR/Cas 성분 RNA("카르고")를 포함하는 RNA의 지질 나노입자(LNP) 조성물의 구체예 및 이의 사용 방법을 제공한다. LNP 조성물은 이전의 전달 기술과 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있다. LNP 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 RNA 성분 및 지질 성분을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, RNA 성분은 Cas 뉴클레이스, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 포함한다. 특정 구체예에서, 카르고 또는 RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 유전자 편집 방법 및 조작된 세포 제조 방법이 또한 제공된다.
CRISPR/Cas 카르고
LNP 제제를 통해 전달된 CRISPR/Cas 카르고는 관심 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)과 같은 단백질, 및 RNA-유도 DNA-결합제, 또는 Cas 뉴클레이스를 발현시키기 위한 mRNA가 포함된다. Cas9 단백질의 세포에서의 발현을 허용하는 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예를 들어 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는 LNP 조성물이 제공된다. 또한, 카르고는 하나 이상의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 복구 또는 재조합을 위한 주형 핵산이 조성물에 포함될 수 있거나 주형 핵산이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
"mRNA"는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 (즉, 리보솜 및 아미노-아실화 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 작용할 수 있는) 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 골격을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, mRNA 포스페이트-당 골격의 당은 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기, 또는 이들의 조합으로 본질적으로 구성된다. 일반적으로, mRNA는 상당한 양의 티미딘 잔기를 포함하지 않는다 (예를 들어, 0 잔기 또는 30, 20, 10, 5, 4, 3, 또는 2 미만 티미딘 잔기; 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 티미딘 함량). mRNA는 이의 우리딘 위치의 일부 또는 전부에서 변형된 우리딘을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas 뉴클레이스 시스템
개시된 제제의 한 성분은 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-유도 DNA-결합제를 인코딩하는 mRNA이다.
본원에서 사용된 "RNA-유도 DNA 결합제"는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체, 또는 그러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하고, 여기서 DNA 결합 활성은 서열-특이적이고 RNA의 서열에 의존한다. 예시적인 RNA-유도 DNA 결합제는 Cas 클리베이스/닉케이스 및 이의 불활성화 형태("dCas DNA 결합제")를 포함한다. 본원에서 사용된 "Cas 뉴클레이스"는 Cas 클리베이스(cleavase), Cas 닉케이스(nickase), 및 dCas DNA 결합제를 포함한다. Cas 클리베이스/닉케이스 및 dCas DNA 결합제는 타입 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10, Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛, 타입 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛, 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 포함한다. 본원에서 사용된 "클래스 2 Cas 뉴클레이스"는 RNA-유도 DNA 결합 활성을 갖는 단일-사슬 폴리펩타이드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 RNA-유도 DNA 클리베이스 또는 닉케이스 활성을 추가로 갖는 클래스 2 Cas 클리베이스/닉케이스(예를 들어, H840A, D10A, 또는 N863A 변이체), 및 클리베이스/닉케이스 활성이 불활성화되는 클래스 2 dCas DNA 결합제를 포함한다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9 (예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0) (예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1) (예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질은, Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015), Cas9에 상동성이며, RuvC-유사 뉴클레이스 도메인을 포함한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전체가 참조로 포함된다. 예를 들어, Zetsche, 표 S1 및 S3을 참조하라. 예를 들어, Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)를 참조하라.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 클래스 2 Cas 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 이중-가닥 엔도뉴클레이스 활성으로도 지칭될 수 있는 클리베이스 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 Cas 뉴클레이스, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 포함한다 (이는, 예를 들어, 타입 II, V, 또는 VI의 Cas 뉴클레이스일 수 있다). 클래스 2 Cas 뉴클레이스는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, 및 C2c3 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cas9 뉴클레이스의 예는 S. 피오게네스, S. 아우레우스, 및 다른 원핵생물(예를 들어, 다음 단락의 목록 참조)의 타입 II CRISPR 시스템, 및 이의 변형된 (예를 들어, 조작된 또는 돌연변이) 버전을 포함한다. 예를 들어, U.S. 2016/0312198 A1; U.S. 2016/0312199 A1을 참조하라. Cas 뉴클레이스의 다른 예는 타입 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체 또는 이의 Cas10, Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛; 및 타입 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 또는 이의 Cas3 서브유닛을 포함한다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 타입-IIA, 타입-IIB, 또는 타입-IIC 시스템으로부터 유래할 수 있다. 다양한 CRISPR 시스템 및 Cas 뉴클레이스에 대한 논의에 대해서는, 예를 들어, Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)를 참조하라.
Cas 뉴클레이스가 유도될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 종, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 월리넬라 석시노제네스(Wolinella succinogenes), 서터렐라 와드스워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 네이세리아 메닝티디스(Neisseria meningitidis), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 석시노젠(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴럼 러브럼(Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토미세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토미세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리시클로바실루스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도미코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시시리컴(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 미크로실라 마리나(Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종, 크로코스페라 왓소니(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 미크로시스티스 에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네초코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라박티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹토르 베크시(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에오비스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박테르 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스토크 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비아 종(Lyngbya sp.), 미크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박테르 라리(Campylobacter lari), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 아시다미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다.
일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 스트렙토코쿠스 써모필루스의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 네이세리아 메닝티디스의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 스타필로코쿠스 아우레우스의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 프란시셀라 노비시다의 Cpf1 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 아시다미노코쿠스 종의 Cpf1 뉴클레이스이다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 라크노스피라세 박테리움 ND2006의 Cpf1 뉴클레이스이다. 추가의 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 라크노스피라세 박테리움(Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리움(Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium), 스미텔라(Smithella), 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 에우박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 또는 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae)의 Cpf1 뉴클레이스이다. 특정 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 아시다미노코쿠스 또는 라크노스피라세의 Cpf1 뉴클레이스이다.
야생형 Cas9는 두 가지 뉴클레이스 도메인: RuvC 및 HNH를 갖는다. RuvC 도메인은 비표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 구체예에서, Cas9 뉴클레이스는 하나 초과의 RuvC 도메인 및/또는 하나 초과의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Cas9 뉴클레이스는 야생형 Cas9이다. 일부 구체예에서, Cas9는 표적 DNA에서 이중 가닥 파괴를 유도할 수 있다. 특정 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 dsDNA를 절단할 수 있거나, dsDNA의 한 가닥을 절단할 수 있거나, 또는 DNA 클리베이스 또는 닉케이스 활성을 갖지 않을 수 있다. 예시적인 Cas9 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 3으로 제공된다. 개시 및 종결 코돈을 포함하는 예시적인 Cas9 mRNA ORF 서열은 서열 식별 번호: 4로 제공된다. 융합 단백질에 포함시키기에 적합한 예시적인 Cas9 mRNA 코딩 서열은 서열 식별 번호: 10으로 제공된다.
일부 구체예에서, 키메라 Cas 뉴클레이스가 사용되는데, 여기서 단백질의 한 도메인 또는 영역이 다른 단백질의 일부에 의해 대체된다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스 도메인은 Fok1과 같은 다른 뉴클레이스의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 변형된 뉴클레이스일 수 있다.
다른 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 타입-I CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 타입-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분일 수 있다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 타입-III CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 단일-가닥 닉케이스 활성을 가지는데, 즉, 하나의 DNA 가닥을 절단하여 "닉(nick)"으로도 알려진 단일-가닥 절단을 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 Cas 닉케이스를 포함한다. 닉케이스는 dsDNA에서 닉을 생성하는, 즉, 한 가닥을 절단하지만 DNA 이중 나선의 다른 가닥을 절단하지 않는 효소이다. 일부 구체예에서, Cas 닉케이스는 엔도뉴클레이스 활성 자리가, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 불활성화된 Cas 뉴클레이스(예를 들어, 위에서 논의된 Cas 뉴클레이스)의 버전이다. Cas 닉케이스 및 예시적인 촉매 도메인 변경의 논의에 대해 예를 들어, 미국 특허 제8,889,356호를 참조하라. 일부 구체예에서, Cas 닉케이스 예컨대 Cas9 닉케이스는 불활성화 RuvC 또는 HNH 도메인을 갖는다. 예시적인 Cas9 닉케이스 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 6으로 제공된다. 개시 및 종결 코돈을 포함하는 예시적인 Cas9 닉케이스 mRNA ORF 서열은 서열 식별 번호: 7로 제공된다. 융합 단백질에 포함시키기에 적합한 예시적인 Cas9 닉케이스 mRNA 코딩 서열은 서열 식별 번호: 11로 제공된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 하나의 기능성 뉴클레이스 도메인만을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레이스 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결손되도록 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 활성이 감소된 RuvC 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 구체예에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 구체예에서, 활성이 감소된 HNH 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 구체예에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다.
일부 구체예에서, Cas 단백질 뉴클레이스 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레이스 활성을 감소시키거나 변경시키기 위해 치환된다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인 중의 예시적인 아미노산 치환은 (S. 피오게네스 Cas9 단백질에 기초한) D10A를 포함한다. 예를 들어, Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771을 참조하라. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레이스 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레이스 도메인 중의 예시적인 아미노산 치환은 (S. 피오게네스 Cas9 단백질에 기초한) E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A를 포함한다. 예를 들어, Zetsche et al. (2015)를 참조하라. 추가의 예시적인 아미노산 치환은 (프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1 (FnCpf1) 서열 (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)에 기초한) D917A, E1006A, 및 D1255A를 포함한다.
일부 구체예에서, 닉케이스를 인코딩하는 mRNA는 각각 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 상보적인 한 쌍의 가이드 RNA와 조합하여 제공된다. 이 구체예에서, 가이드 RNA는 닉케이스를 표적 서열로 안내하고 표적 서열의 반대 가닥에 닉을 생성하여 DSB를 도입한다 (즉, 이중 닉킹). 일부 구체예에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선하고 비표적(off-target) 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 닉케이스는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하기 위해 DNA의 반대편 가닥을 표적으로 하는 두 개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용된다. 일부 구체예에서, 닉케이스는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하기 위해 근접하게 선택되는 두 개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제에는 클리베이스 및 닉케이스 활성이 결여되어 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드를 포함한다. dCas 폴리펩타이드는 DNA-결합 활성을 가지면서도 촉매 (클리베이스/닉케이스) 활성이 본질적으로 결여되어 있다. 일부 구체예에서, dCas 폴리펩타이드는 dCas9 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 클리베이스 및 닉케이스 활성이 결여된 RNA-유도 DNA-결합제 또는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드는 엔도뉴클레이스 활성 자리가, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 불활성화된 Cas 뉴클레이스(예를 들어, 위에서 논의된 Cas 뉴클레이스)의 버전이다. 예를 들어, U.S. 2014/0186958 A1; U.S. 2015/0166980 A1을 참조하라. 예시적인 dCas9 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 8로 제공된다. 개시 및 종결 코돈을 포함하는 예시적인 Cas9 mRNA ORF 서열은 서열 식별 번호: 9로 제공된다. 융합 단백질에 포함시키기에 적합한 예시적인 Cas9 mRNA 코딩 서열은 서열 식별 번호: 12로 제공된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 하나 이상의 이종 기능성 도메인을 포함한다 (예를 들어, 융합 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다).
일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 세포의 핵으로 RNA-유도 DNA-결합제의 수송을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능성 도메인은 핵 위치 신호(nuclear localization signal, NLS)일 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 1-10 개의 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 1-5 개의 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 하나의 NLS와 융합될 수 있다. 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 RNA-유도 DNA-결합제 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 이는 또한 RNA-유도 DNA 결합제 서열 내에 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 하나 초과의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 2, 3, 4, 또는 5 개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 두 개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정 구체예에서, 두 개의 NLS은 동일하거나 (예를 들어, 두 개의 SV40 NLS) 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 카르복시 말단에서 연결된 두 개의 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 두 개의 NLS와 융합될 수 있으며, 하나는 N-말단에, 하나는 C-말단에 연결된다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 3 개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 NLS와 융합되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, NLS는 예를 들어, SV40 NLS, PKKKRKV 또는 PKKKRRV와 같은 단일부분 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, NLS는 핵플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK과 같은 이부분 서열일 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 PKKKRKV NLS는 RNA-유도 DNA-결합제의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커가 융합 자리에 임의로 포함된다.
일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-유도 DNA 결합제의 세포내 반감기를 변경시킬 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-유도 DNA-결합제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-유도 DNA-결합제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 단백질 분해를 위한 신호 펩타이드로서 작용할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 분해는, 예를 들어, 프로테아솜, 리소좀 프로테이스, 또는 칼페인 프로테이스와 같은 단백질분해 효소에 의해 매개될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA-결합제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴-유사 단백질(UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비제한적 예는 소형 유비퀴틴-유사 변형제(SUMO), 유비퀴틴 교차-반응성 단백질(UCRP, 인터페론-자극 유전자-15(ISG15)로도 알려짐), 유비퀴틴-관련 변형제-1(URM1), 뉴런-전구체-세포-발현 발달 하향조절된 단백질-8(NEDD8, S. 세레비시아에서 Rub1로도 지칭됨), 인간 백혈구 항원 F-관련(FAT10), 자가포식-8(ATG8) 및 -12(ATG12), Fau 유비퀴틴-유사 단백질(FUB1), 막-고정 UBL(MUB), 유비퀴틴 폴드-변형제 -1(UFM1), 및 유비퀴틴-유사 단백질-5(UBL5)를 포함한다.
일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비제한적 예는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그, 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비제한적 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire,), 청록색 형광 단백질(예를 들어, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질(mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수있다. 비제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 티오레독신(TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 비오틴 카르복실 담체 단백질(BCCP), 폴리-His, 및 칼모둘린을 포함한다. 비제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타치온-S-트랜스퍼레이스(GST), 홀스래디쉬 퍼옥시데이스(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이스(CAT), 베타-갈락토시데이스, 베타-글루쿠로니데이스, 루시퍼레이스, 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가적인 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-유도 DNA-결합제를 특정 소기관, 세포 유형, 조직, 또는 기관에 표적화할 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-유도 DNA-결합제를 미토콘드리아에 표적화할 수 있다.
추가의 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 이펙터 도메인일 수 있다. RNA-유도 DNA-결합제가 이의 표적 서열에 지시될 경우, 예를 들어, Cas 뉴클레이스가 gRNA에 의해 표적 서열에 지시될 경우, 이펙터 도메인은 표적 서열을 변형시키거나 이에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구체예에서, 이펙터 도메인은 핵산 결합 도메인, 뉴클레이스 도메인(예를 들어, 비-Cas 뉴클레이스 도메인), 후성유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 뉴클레이스, 예컨대 FokI 뉴클레이스이다. 예를 들어, 미국 특허 제9,023,649호를 참조하라. 일부 구체예에서, 이종 기능성 도메인은 전사 활성화제 또는 억제제이다. 예를 들어, Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression," Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., "RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors," Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., "CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes," Cell 154:442-51 (2013)을 참조하라. 이와 같이, RNA-유도 DNA-결합제는 본질적으로 가이드 RNA를 사용하여 원하는 표적 서열에 결합하도록 지시될 수 있는 전사 인자가 된다. 특정 구체예에서, DNA 변형 도메인은 메틸화 도메인, 예컨대 탈메틸화 또는 메틸트랜스퍼레이스 도메인이다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 DNA 변형 도메인, 예컨대 염기-편집 도메인이다. 특정 구체예에서, DNA 변형 도메인은 DNA에 특정 변형을 도입하는 핵산 편집 도메인, 예컨대 디아미네이스 도메인이다. 예를 들어, WO 2015/089406; U.S. 2016/0304846을 참조하라. WO 2015/089406 및 U.S. 2016/0304846에 기재된 핵산 편집 도메인, 디아미네이스 도메인, 및 Cas9 변이체는 본원에 참조로 포함된다.
뉴클레이스는 가이드 RNA("gRNA")와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레이스는 gRNA에 의해 표적 서열에 지시될 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스 시스템에서, gRNA는 뉴클레이스 및 표적 서열과 상호작용하여, 표적 서열에 대한 결합을 지시한다. 일부 구체예에서, gRNA는 표적화된 절단에 대한 특이성을 제공하고, 뉴클레이스는 보편적이며, 상이한 gRNA와 짝을 이루어 상이한 표적 서열을 절단할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 상기 나열된 유형, 오쏘로그, 및 예시적인 종의 gRNA 스캐폴드 구조와 쌍을 이룰 수 있다.
가이드 RNA (gRNA)
본 발명의 일부 구체예에서, LNP 제제를 위한 카르고는 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. gRNA는 Cas 뉴클레이스 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 표적 핵산 분자 상의 표적 서열로 안내할 수 있다. 일부 구체예에서, gRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 결합하여 절단의 특이성을 제공한다. 일부 구체예에서, gRNA 및 Cas 뉴클레이스는 리보핵산단백질(RNP), 예를 들어, LNP 조성물에 의해 전달될 수 있는 CRISPR/Cas9 복합체와 같은 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, CRISPR/Cas 복합체는 타입-II CRISPR/Cas9 복합체일 수 있다. 일부 구체예에서, CRISPR/Cas 복합체는 타입-V CRISPR/Cas 복합체, 예컨대 Cpf1/가이드 RNA 복합체일 수 있다. Cas 뉴클레이스 및 동족(cognate) gRNA는 쌍을 이룰 수 있다. 각각의 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 쌍을 이루는 gRNA 스캐폴드 구조는 특정 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다.
"가이드 RNA", "gRNA", 및 간단히 "가이드 "는 crRNA(CRISPR RNA로도 알려져 있음), 또는 crRNA 및 trRNA의 조합(tracrRNA로도 알려져 있음)을 지칭하도록 상호 교환적으로 본원에서 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA, sgRNA)로서 또는 두 개의 개별 RNA 분자(이중 가이드 RNA, dgRNA)에서 연관될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 자연-발생 서열, 또는 자연-발생 서열과 비교하여 변형 또는 변이를 갖는 trRNA 서열일 수 있다.
본원에 사용된 "가이드 서열"은 표적 서열에 상보적이고 RNA-유도 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형(예를 들어, 절단)을 위해 가이드 RNA를 표적 서열에 안내하는 기능을 하는 가이드 RNA 내의 서열을 지칭한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열," 또는 "스페이서 서열"로 지칭될 수 있다. 가이드 서열은, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 (즉, Spy Cas9) 및 관련 Cas9 호모로그/오쏘로그의 경우에 길이가 20 염기쌍 길이일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열이, 예를 들어, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24-, 또는 25-뉴클레오타이드 길이로 가이드로서 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 유전자에 또는 염색체 상에 있으며, 예를 들어, 가이드 서열에 상보적이다. 일부 구체예에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구체예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 불일치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4 개의 불일치를 포함할 수 있으며, 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20 개 또는 그 이상의 염기쌍이다. 일부 구체예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1-4 개의 불일치를 포함할 수 있으며 여기서 가이드 서열은 적어도 17, 18, 19, 20 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3, 또는 4 개의 불일치를 포함할 수 있으며 여기서 가이드 서열은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
Cas 단백질에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이므로, Cas 단백질에 대한 표적 서열은 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥(즉, 주어진 서열 및 서열의 역 보체)를 모두 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 상보적"인 것으로 언급되는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA가 표적 서열의 역 보체에 결합하도록 지시할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 일부 구체예에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 보체에 결합하는 경우, 가이드 서열에서 T에 대한 U의 치환을 제외하고는 가이드 서열은 표적 서열(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오타이드와 동일하다.
표적화 서열의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템 및 성분에 의존할 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터의 상이한 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 다양한 최적화 표적화 서열 길이를 갖는다. 따라서, 표적화 서열은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 50 초과의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적화 서열 길이는 자연-발생 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 서열보다 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 뉴클레오타이드 더 길거나 더 짧다. 특정 구체예에서, Cas 뉴클레이스 및 gRNA 스캐폴드는 동일한 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 것이다. 일부 구체예에서, 표적화 서열은 18-24 개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적화 서열은 19-21 개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적화 서열은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
일부 구체예에서, sgRNA는 Cas9 단백질에 의한 RNA-유도 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cas9 sgRNA"이다. 일부 구체예에서, sgRNA는 Cpf1 단백질에 의한 RNA-유도 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cpf1 sgRNA"이다. 특정 구체예에서, gRNA는 Cas9 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA-유도 DNA 절단을 매개하기에 충분한 crRNA 및 tracr RNA를 포함한다. 특정 구체예에서, gRNA는 Cpf1 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA-유도 DNA 절단을 매개하기에 충분한 crRNA를 포함한다. Zetsche 2015를 참조하라.
본 발명의 특정 구체예는 또한 본원에 기재된 gRNA를 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 발현 카세트를 제공한다. "가이드 RNA 핵산"은 가이드 RNA (예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA) 및 가이드 RNA 발현 카세트를 지칭하기 위해 사용되며, 이는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산이다.
일부 구체예에서, 핵산은 DNA 분자일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 crRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, crRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 자연-발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 전부 또는 일부가 측면에 있는 표적화 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 tracr RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, crRNA 및 tracr RNA는 둘의 별개의 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 구체예에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구체예에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산의 반대 가닥에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 구체예에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 sgRNA를 인코딩한다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 Cas9 뉴클레이스 sgRNA를 인코딩한다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 Cpf1 뉴클레이스 sgRNA를 인코딩한다.
가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 조절 제어 서열, 예컨대 프로모터, 3' UTR, 또는 5' UTR에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 한 예에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들어, tRNALys3, 또는 tRNA 키메라일 수 있다. Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628을 참조하라. 특정 구체예에서, 프로모터는 RNA 폴리머레이스 III(Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비제한적 예는 또한 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 변형된 핵산이다. 특정 구체예에서, gRNA 핵산은 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 핵산의 통합을 안정화 및 방지하기 위한 5' 말단 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 각 가닥에서 5' 말단 변형을 갖는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 구체예에서, gRNA 핵산은 5' 말단 변형으로서 역전된 디데옥시-T 또는 역전된 무염기 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, gRNA 핵산은 비오틴, 데스티오비오텐-TEG, 디곡시제닌, 및 예를 들어 FAM, ROX, TAMRA, 및 AlexaFluor를 포함하는 형광 마커와 같은 표지를 포함한다.
특정 구체예에서, 하나 초과의 gRNA 핵산, 예컨대 gRNA가 CRISPR/Cas 뉴클레이스 시스템와 함께 사용될 수 있다. 각각의 gRNA 핵산은 상이한 표적화 서열을 포함할 수 있어, CRISPR/Cas 시스템이 하나 초과의 표적 서열을 절단한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 gRNA는 CRISPR/Cas 복합체 내에서 활성 또는 안정성과 같은 동일하거나 상이한 특성을 가질 수 있다. 하나 초과의 gRNA가 사용되는 경우, 각각의 gRNA는 동일하거나 상이한 gRNA 핵산에서 인코딩될 수있다. 하나 초과의 gRNA의 발현 유도에 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
변형된 RNA
특정 구체예에서, LNP 조성물은 변형된 RNA를 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 gRNA 또는 mRNA에 존재할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA 또는 mRNA는 표준(canonical) A, G, C, 및 U 잔기 대신 또는 이에 추가하여 사용되는 하나 이상의 비자연 및/또는 자연 발생 성분 또는 구성의 존재를 기재하기 위해 "변형된" RNA로 지칭된다. 일부 구체예에서, 변형된 RNA는 여기서 "변형된"으로 지칭되는 비표준(non-canonical) 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로써 합성된다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 골격 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당의 성분, 예를 들어, 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 당 변형); (iii) 포스페이트 모이어티를 "데포스포(dephospho)" 링커로 대규모 대체 (예시적인 골격 변형); (iv) 비표준 핵염기를 포함하여 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체 (예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형 (예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 컨쥬게이션의 제거, 변형 또는 대체 (그러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적인 당 변형). 특정 구체예는 mRNA, gRNA, 또는 핵산에 대한 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 구체예는 mRNA, gRNA, 또는 핵산에 대한 3' 말단 변형을 포함한다. 변형된 RNA는 5' 말단 및 3' 말단 변형을 포함할 수 있다. 변형된 RNA는 비-말단 위치에서 하나 이상의 변형된 잔기를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, gRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 특정 구체예에서, mRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 제2 서열에 대한 제1 서열의 정렬이 그 전체에서 제2 서열의 위치의 X% 이상이 제1 서열에 일치함을 나타내는 경우, 제1 서열은 제2 서열에 "적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함하는" 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 서열 AAG와 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는데, 그 이유는 정렬이 제2 서열의 세 위치 모두에 일치한다는 점에서 100% 동일성을 제공하기 때문이다. RNA와 DNA 간의 차이(일반적으로 티미딘으로 우리딘의 교환 또는 그 반대) 및 변형된 우리딘과 같은 뉴클레오사이드 유사체의 존재는 관련 뉴클레오타이드(예컨대 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘)가 동일한 보체를 갖는 한 폴리뉴클레오타이드 간의 동일성 또는 상보성 차이에 기여하지 않는다 (예를 들어, 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘 모두에 대해 아데노신; 또 다른 예는 사이토신 및 5-메틸사이토신이며, 두 가지 모두 보체로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 갖는다). 따라서, 예를 들어, X가 임의의 변형된 우리딘, 예컨대 슈도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 또는 5-메톡시우리딘인 서열 5'-AXG는 둘 모두가 동일한 서열(5'-CAU)에 대해 완벽하게 상보적이라는 점에서 AUG에 100% 동일한 것으로 간주된다. 예시적인 정렬 알고리즘은 당해 분야에 공지인 Smith-Waterman 및 Needleman-Wunsch 알고리즘이다. 당업자는 정렬될 주어진 서열의 쌍; 일반적으로 유사한 길이 및 아미노산에 대해 >50% 또는 뉴클레오타이드에 대해 >75% 예상되는 동일성의 서열에 대해 어떤 알고리즘 및 파라미터의 설정의 선택이 적합할지 이해할 것이고, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI에 의해 주어진 Needleman-Wunsch 알고리즘 인터페이스의 기본 설정을 갖는 Needleman-Wunsch 알고리즘이 일반적으로 적합하다.
mRNA
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제제는 본원에 기재된 Cas 뉴클레이스, 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구체예에서, Cas 뉴클레이스 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다. 일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF는 "변형된 RNA-유도 DNA 결합제 ORF" 또는 간단히 "변형된 ORF"이고, 이는 ORF가 다음 방식 중 하나 이상에서 변형됨을 나타내기 위한 약칭으로 사용된다: (1) 변형된 ORF는 최소 우리딘 함량 내지 최소 우리딘 함량의 150% 범위의 우리딘 함량을 갖는다; (2) 변형된 ORF는 최소 우리딘 디뉴클레오타이드 함량 내지 최소 우리딘 디뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 우리딘 디뉴클레오타이드 함량을 갖는다; (3) 변형된 ORF는 서열 식별 번호: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는다; (4) 변형된 ORF는 코돈의 적어도 75%가 주어진 아미노산에 대한 최소 우리딘 코돈(들), 예를 들어 가장 적은 우리딘을 갖는 코돈(들) (최소 우리딘 코돈이 2 우리딘을 갖는 페닐알라닌에 대한 코돈을 제외하고 보통 0 또는 1)인 코돈의 세트로 구성된다; 또는 (5) 변형된 ORF는 적어도 하나의 변형된 우리딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 ORF는 상기 방식 중 적어도 둘, 셋, 또는 넷에서 변형된다. 일부 구체예에서, 변형된 ORF는 적어도 하나의 변형된 우리딘을 포함하고 상기 (1)-(4) 중 적어도 하나, 둘, 셋 또는 모두에서 변형된다.
"변형된 우리딘"은 본원에서 우리딘과 동일한 수소 결합 수용체 및 우리딘과 하나 이상의 구조적 차이를 갖는 티미딘 이외의 뉴클레오사이드를 지칭하도록 사용된다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 치환된 우리딘, 즉, 하나 이상의 비-양성자 치환기(예를 들어, 메톡시와 같은 알콕시)가 양성자를 대신하는 우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 치환된 슈도우리딘, 즉, 하나 이상의 비-양성자 치환기(예를 들어, 메틸과 같은 알킬)가 양성자를 대신하는 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 치환된 우리딘, 슈도우리딘, 또는 치환된 슈도우리딘 중 임의의 것이다.
본원에서 사용된 "우리딘 위치"는 우리딘 또는 변형된 우리딘이 차지한 폴리뉴클레오타이드에서의 위치를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "우리딘 위치의 100%가 변형된 우리딘"인 폴리뉴클레오타이드는 동일한 서열의 통상적인 RNA(모든 염기가 표준 A, U, C, 또는 G 염기인 경우)에서 우리딘일 모든 위치에서 변형된 우리딘을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 안의 또는 본 개시에 수반하는 서열 표 또는 서열 목록의 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 U는 우리딘 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
표 1. 최소 우리딘 코돈
아미노산 최소 우리딘 코돈
A 알라닌 GCA 또는 GCC 또는 GCG
G 글라이신 GGA 또는 GGC 또는 GGG
V 발린 GUC 또는 GUA 또는 GUG
D 아스파트산 GAC
E 글루탐산 GAA 또는 GAG
I 이소류신 AUC 또는 AUA 또는 AUG
T 트레오닌 ACA 또는 ACC 또는 ACG
N 아스파라긴 AAC
K 라이신 AAG 또는 AAA
S 세린 AGC
R 아르기닌 AGA 또는 AGG
L 류신 CUG 또는 CUA 또는 CUC
P 프롤린 CCG 또는 CCA 또는 CCC
H 히스티딘 CAC 또는 CAA 또는 CAG
Q 글루타민 CAG 또는 CAA
F 페닐알라닌 UUC
Y 티로신 UAC
C 시스테인 UGC
W 트립토판 UGG
M 메티오닌 AUG
임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 코돈이 최소 우리딘 코돈의 표에 나열된 코돈인 코돈의 세트로 구성될 수 있다. 임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 서열 식별 번호: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 서열 식별 번호: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 최소 우리딘 함량 내지 최소 우리딘 함량의 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102%, 또는 101% 범위인 우리딘 함량을 가질 수 있다.
임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 최소 디뉴클레오타이드 우리딘 함량 내지 최소 디뉴클레오타이드 우리딘 함량의 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102%, 또는 101% 범위인 우리딘 디뉴클레오타이드 함량을 가질 수 있다.
임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 적어도 하나의, 복수의, 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5 위치에서, 예를 들어 할로겐, 메틸, 또는 에틸로 변형된 우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 1 위치에서, 예를 들어 할로겐, 메틸, 또는 에틸로 변형된 슈도우리딘이다. 변형된 우리딘은, 예를 들어 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-아이오도우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 적어도 우리딘 위치의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%가 변형된 우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 변형된 우리딘, 예를 들어, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 슈도우리딘, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-메톡시우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-아이오도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-메톡시우리딘이고, 나머지는 N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 mRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-아이오도우리딘이고, 나머지는 N1-메틸 슈도우리딘이다.
임의의 상기 구체예에서, 변형된 ORF는 감소된 우리딘 디뉴클레오타이드 함량, 예컨대 가능한 가장 낮은 우리딘 디뉴클레오타이드(UU) 함량을 포함할 수 있고, 예를 들어 (a) 모든 위치에서 (위에 논의된 바와 같은) 최소 우리딘 코돈을 사용하고 (b) 주어진 ORF와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 ORF이다. 우리딘 디뉴클레오타이드(UU) 함량은 ORF에서 UU 디뉴클레오타이드의 열거로서 또는 우리딘 디뉴클레오타이드의 우리딘에 의해 점유되는 위치의 백분율로서 비율 기준으로 절대적인 용어로 표현될 수 있다 (예를 들어, 5 위치 중 2가 우리딘 디뉴클레오타이드의 우리딘에 의해 점유되기 때문에 AUUAU가 40%의 우리딘 디뉴클레오타이드 함량을 가질 것이다). 변형된 우리딘 잔기는 최소 우리딘 디뉴클레오타이드 함량을 평가할 목적에 대해 우리딘과 동등한 것으로 간주된다.
일부 구체예에서, mRNA는 발현된 포유동물 mRNA, 예컨대 구성적으로 발현된 mRNA로부터의 적어도 하나의 UTR을 포함한다. mRNA는 건강한 성체 포유동물의 적어도 하나의 조직에서 지속적으로 전사되는 경우 포유동물에서 구성적으로 발현되는 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, mRNA는 발현된 포유동물 RNA, 예컨대 구성적으로 발현된 포유동물 mRNA로부터의 5' UTR, 3' UTR, 또는 5' 및 3' UTR을 포함한다. 액틴 mRNA는 구성적으로 발현된 mRNA의 예이다.
일부 구체예에서, mRNA는 하이드록시스테로이드 17-베타 데하이드로게네이스 4(HSD17B4 또는 HSD)로부터의 적어도 하나의 UTR, 예를 들어, HSD로부터의 5' UTR을 포함한다. 일부 구체예에서, mRNA는 글로빈 mRNA, 예를 들어, 인간 알파 글로빈(HBA) mRNA, 인간 베타 글로빈(HBB) mRNA, 또는 제노푸스 레비스(Xenopus laevis) 베타 글로빈(XBG) mRNA로부터의 적어도 하나의 UTR을 포함한다. 일부 구체예에서, mRNA는 글로빈 mRNA, 예컨대 HBA, HBB, 또는 XBG로부터의 5' UTR, 3' UTR, 또는 5' 및 3' UTR을 포함한다. 일부 구체예에서, mRNA는 소 성장 호르몬, 거대세포바이러스(CMV), 마우스 Hba-a1, HSD, 알부민 유전자, HBA, HBB, 또는 XBG로부터의 5' UTR을 포함한다. 일부 구체예에서, mRNA는 소 성장 호르몬, 거대세포바이러스, 마우스 Hba-a1, HSD, 알부민 유전자, HBA, HBB, 또는 XBG로부터의 3' UTR을 포함한다. 일부 구체예에서, mRNA는 소 성장 호르몬, 거대세포바이러스, 마우스 Hba-a1, HSD, 알부민 유전자, HBA, HBB, XBG, 열 충격 단백질 90(Hsp90), 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게네이스(GAPDH), 베타-액틴, 알파-튜불린, 종양 단백질(p53), 또는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)로부터의 5' 및 3' UTR을 포함한다.
일부 구체예에서, mRNA는 동일한 공급원, 예를 들어, 구성적으로 발현되는 mRNA 예컨대 액틴, 알부민, 또는 글로빈 예컨대 HBA, HBB, 또는 XBG로부터 유래한 5' 및 3' UTR을 포함한다.
일부 구체예에서, mRNA는 5' UTR을 포함하지 않으며, 예를 들어, 5' 캡과 개시 코돈 사이에 추가적인 뉴클레오타이드가 없다. 일부 구체예에서, mRNA는 5' 캡과 개시 코돈 사이에 코작 서열(하기 설명됨)을 포함하지만, 임의의 추가적인 5' UTR을 갖지 않는다. 일부 구체예에서, mRNA는 3' UTR를 포함하지 않으며, 예를 들어, 종결 코돈과 폴리-A 테일 사이에 추가적인 뉴클레오타이드가 없다.
일부 구체예에서, mRNA는 코작 서열을 포함한다. 코작 서열은 번역 개시 및 mRNA로부터 번역된 폴리펩타이드의 전체 수율에 영향을 미칠 수 있다. 코작 서열은 개시 코돈으로서 기능할 수 있는 메티오닌 코돈을 포함한다. 최소 코작 서열은 NNNRUGN이고 여기서 다음 중 적어도 하나가 참이다: 첫 번째 N은 A 또는 G이고 두 번재 N은 G이다. 뉴클레오타이드 서열의 맥락에서, R은 퓨린(A 또는 G)을 의미한다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 RNNRUGN, NNNRUGG, RNNRUGG, RNNAUGN, NNNAUGG, 또는 RNNAUGG이다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 소문자 위치에 0 개의 불일치 또는 1 또는 2 개의 불일치를 갖는 rccRUGg이다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 소문자 위치에 0 개의 불일치 또는 1 또는 2 개의 불일치를 갖는 rccAUGg이다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 소문자 위치에 0 개의 불일치 또는 1, 2 또는 3 개의 불일치를 갖는 gccRccAUGG이다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 소문자 위치에 0 개의 불일치 또는 1, 2, 3 또는 4 개의 불일치를 갖는 gccAccAUG이다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 GCCACCAUG이다. 일부 구체예에서, 코작 서열은 소문자 위치에서 0 개의 불일치 또는 1, 2, 3 또는 4 개의 불일치를 갖는 gccgccRccAUGG이다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 43에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 43의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 44에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 44의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 56에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 56의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 57에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 57의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 58의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 59에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 59의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 60에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 60의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, RNA-유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA는 서열 식별 번호: 61에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 임의로 서열 식별 번호: 61의 ORF(즉, 서열 식별 번호: 4)는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환된다.
일부 구체예에서, mRNA는 서열 식별 번호: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나의 대안적인 ORF를 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 식별 번호 43, 44, 또는 56-61의 임의로 치환된 서열과의 동일성 정도는 95%이다. 일부 구체예에서, 서열 식별 번호 43, 44, 또는 56-61의 임의로 치환된 서열과의 동일성 정도는 98%이다. 일부 구체예에서, 서열 식별 번호 43, 44, 또는 56-61의 임의로 치환된 서열과의 동일성 정도는 99%이다. 일부 구체예에서, 서열 식별 번호 43, 44, 또는 56-61의 임의로 치환된 서열과의 동일성 정도는 100%이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 mRNA는 5' 캡, 예컨대 Cap0, Cap1, 또는 Cap2를 포함한다. 5' 캡은 일반적으로, 5'-트리포스페이트를 통해 mRNA의 5'-투-3' 사슬의 제1 뉴클레오타이드의 5' 위치, 즉, 제1 캡-근위 뉴클레오타이드에 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오타이드이다 (이는 예를 들어 ARCA에 대하여 아래 논의된 바와 같이 추가로 변형될 수 있다). Cap0에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오타이드의 리보스는 모두 2'-하이드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 제1 및 제2 전사된 뉴클레오타이드의 리보스는 각각 2'-메톡시 및 2'-하이드록실을 포함한다. Cap2에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오타이드의 리보스는 모두 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115를 참조하라. 인간 mRNA와 같은 포유동물 mRNA를 포함하는 대부분의 내인성 고등 진핵 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap0 및 Cap1 및 Cap2와 상이한 다른 캡 구조는 IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천성 면역계의 성분에 의해 "비-자기"로 인식됨으로 인해 인간과 같은 포유동물에서 면역원성일 수 있으며, 이는 타입 I 인터페론을 포함하여 상승된 사이토카인 수준을 야기할 수 있다. IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천성 면역계의 성분은 또한, mRNA의 번역을 잠재적으로 억제하는 Cap1 또는 Cap2 이외의 캡과 mRNA의 결합에 대해 eIF4E와 경쟁할 수 있다.
캡은 공동-전사적으로 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA(안티-리버스 캡 유사체; Thermo Fisher Scientific Cat. No. AM8045)는 구아닌 리보뉴클레오타이드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트리포스페이트를 포함하는 캡 유사체이며 이는 개시에서 전사물에 시험관내 혼입될 수 있다. ARCA는 첫 번째 캡-근위 뉴클레오타이드의 2' 위치가 하이드록실인 Cap0 캡을 야기한다. 예를 들어, Stepinski et al., (2001) "Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG," RNA 7: 1486-1495를 참조하라. ARCA 구조는 아래에 나타난다.
Figure pct00001
CleanCapTM AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies Cat. No. N-7113) 또는 CleanCapTM GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies Cat. No. N-7133)가 Cap1 구조를 공동-전사적으로 제공하기 위해 사용될 수 있다. CleanCapTM AG 및 CleanCapTM GG의 3'-O-메틸화 버전은 또한 각각 Cat. Nos. N-7413 및 N-7433으로서 TriLink Biotechnologies로부터 입수 가능하다. CleanCapTM AG 구조는 아래에 나타난다.
Figure pct00002
대안으로, 캡은 후-전사적으로 RNA에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 상업적으로 입수 가능하고 (New England Biolabs Cat. No. M2080S) D1 서브유닛에 의해 제공되는 RNA 트리포스파테이스 및 구아닐릴트랜스퍼레이스 활성, 및 D12 서브유닛에 의해 제공되는 구아닌 메틸트랜스퍼레이스를 갖는다. 그와 같이, 이는 7-메틸구아닌을 RNA에 첨가하여, S-아데노실 메티오닌 및 GTP의 존재에서 Cap0을 제공할 수 있다. 예를 들어, Guo, P. and Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. and Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479를 참조하라.
일부 구체예에서, mRNA는 폴리-아데닐화(폴리-A) 테일을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-A 테일은 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 아데닌, 임의로 최대 300 개의 아데닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-A 테일은 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예에서, 폴리-A 테일은 폴리-A 테일 내의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드 "앵커"로써 "중단된다". 폴리-A 테일은 적어도 8개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 또한 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "비-아데닌 뉴클레오타이드"는 아데닌을 포함하지 않는 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드를 지칭한다. 구아닌, 타이민, 및 사이토신 뉴클레오타이드는 예시적인 비-아데닌 뉴클레오타이드이다. 따라서, 본원에 기재된 mRNA 상의 폴리-A 테일은 RNA-유도 DNA-결합제 또는 관심 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드에 3' 위치한 연속 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, mRNA 상의 폴리-A 테일은 RNA-유도 DNA-결합제 또는 관심 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드에 대해 3' 위치의 비-연속 아데닌 뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 비-아데닌 뉴클레오타이드는 아데닌 뉴클레오타이드를 규칙적으로 또는 불규칙적인 간격으로 중단시킨다.
일부 구체예에서, mRNA는 폴리-아데닐화(폴리-A) 테일을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-A 테일은 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 개의 아데닌, 임의로 최대 300 개의 아데닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-A 테일은 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예에서, 폴리-A 테일은 폴리-A 테일 내의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드 "앵커"로써 "중단된다". 폴리-A 테일은 적어도 8개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 또한 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "비-아데닌 뉴클레오타이드"는 아데닌을 포함하지 않는 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드를 지칭한다. 구아닌, 타이민, 및 사이토신 뉴클레오타이드는 예시적인 비-아데닌 뉴클레오타이드이다. 따라서, 본원에 기재된 mRNA 상의 폴리-A 테일은 RNA-유도 DNA-결합제 또는 관심 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드에 3' 위치한 연속 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, mRNA 상의 폴리-A 테일은 RNA-유도 DNA-결합제 또는 관심 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드에 대해 3' 위치의 비-연속 아데닌 뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 비-아데닌 뉴클레오타이드는 아데닌 뉴클레오타이드를 규칙적으로 또는 불규칙적인 간격으로 중단시킨다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 연속 아데닌 뉴클레오타이드를 중단시키도록 위치하여 폴리(A) 결합 단백질이 연속 아데닌 뉴클레오타이드의 스트레치에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드(들)는 적어도 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8-50 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8-100 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치한다. 일부 구체예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 있으며 적어도 8 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드가 이어진다.
폴리-A 테일은 연속 아데닌 뉴클레오타이드의 한 서열에 이어서 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드, 임으로 이어서 추가의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리-A 테일은 하나의 비-아데닌 뉴클레오타이드 또는 2-10 비-아데닌 뉴클레오타이드의 하나의 연속 스트레치를 포함하거나 함유한다. 일부 구체예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드(들)는 적어도 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치한다. 일부 예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8-50 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 연속 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치한다.
일부 구체예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 구아닌, 사이토신, 또는 타이민이다. 일부 예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 사이토신 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 타이민 뉴클레오타이드이다. 일부 예에서, 하나 초과의 비-아데닌 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 a) 구아닌 및 타이민 뉴클레오타이드; b) 구아닌 및 사이토신 뉴클레오타이드; c) 타이민 및 사이토신 뉴클레오타이드; 또는 d) 구아닌, 타이민 및 사이토신 뉴클레오타이드로부터 선택될 수 있다. 비-아데닌 뉴클레오타이드를 포함하는 예시적인 폴리-A 테일은 서열 식별 번호: 62로 제공된다.
일부 구체예에서, mRNA는 정제된다. 일부 구체예에서, mRNA는 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전, 알코올 침전, 또는 동등한 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 것)을 사용하여 정제된다. 일부 구체예에서, mRNA는 크로마토그래피-기반 방법, 예컨대 HPLC-기반 방법 또는 동등한 방법(예를 들어, 본원에 기재된 것)을 사용하여 정제된다. 일부 구체예에서, mRNA는 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전) 및 HPLC-기반 방법 모두를 사용하여 정제된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 gRNA는 본원에 개시된 mRNA와 조합하여 제공된다. 일부 구체예에서, gRNA는 mRNA와 별개의 분자로서 제공된다. 일부 구체예에서, gRNA는 본원에 개시된 mRNA의 일부, 예컨대 UTR의 일부로서 제공된다.
화학적으로 변형된 gRNA
일부 구체예에서, gRNA는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA는 표준 A, G, C, 및 U 잔기 대신 또는 이에 추가하여 사용되는 하나 이상의 비자연 및/또는 자연 발생 성분 또는 구성의 존재를 설명하기 위해 "변형된" gRNA 또는 "화학적으로 변형된" gRNA로 지칭된다. 일부 구체예에서, 변형된 gRNA는 비표준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로써 합성되며, 여기서 "변형된"으로 지칭된다. 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 골격 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당의 성분, 예를 들어, 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 당 변형); (iii) 포스페이트 모이어티를 "데포스포(dephospho)" 링커로 대규모 대체 (예시적인 골격 변형); (iv) 비표준 핵염기를 포함하여 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체 (예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형 (예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 컨쥬게이션의 제거, 변형 또는 대체 (그러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적인 당 변형).
일부 구체예에서, gRNA는 일부 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5 위치에서, 예를 들어 할로겐 또는 C1-C6 알콕시로 변형된 우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 1 위치에서, 예를 들어 C1-C6 알킬로 변형된 슈도우리딘이다. 변형된 우리딘은, 예를 들어 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 구체예에서 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘이다. 일부 구체예에서 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-아이오도우리딘의 조합이다. 일부 구체예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 적어도 우리딘 위치의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%가 변형된 우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 변형된 우리딘, 예를 들어, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 슈도우리딘, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-메톡시우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-아이오도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-메톡시우리딘이고, 나머지는 N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 gRNA에서 우리딘 위치의 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, 또는 90-100%가 5-아이오도우리딘이고, 나머지는 N1-메틸 슈도우리딘이다.
상기 열거된 것과 같은 화학적 변형은 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(집합적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 gRNA를 제공하도록 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되며, 예를 들어, 모든 염기는 변형된 포스페이트 기, 예컨대 포스포로티오에이트 기를 갖는다. 특정 구체예에서, gRNA 분자의 포스페이트 기의 전부 또는 실질적으로 전부가 포스포로티오에이트 기로 대체된다. 일부 구체예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
일부 구체예에서, gRNA는 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 gRNA 중의 위치의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다.
비변형 핵산은, 예를 들어 세포내 뉴클레이스 또는 혈청에서 발견되는 것에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레이스는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본원에 기재된 gRNA는, 예를 들어 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레이스에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체 내 및 생체 외 모두에서 세포의 집단으로 도입될 때 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론, 및 세포 사멸의 유도를 포함하는, 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
골격 변형의 일부 구체예에서, 변형된 잔기의 포스페이트 기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체하여 변형될 수 있다. 또한, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 본원에 기재된 바와 같이 변형된 포스페이트 기로의 비변형 포스페이트 모이어티의 대규모 대체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 비하전 링커 또는 비대칭 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 야기하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 예는, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로젠 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 비변형 포스페이트 기의 인 원자는 비카이랄이다. 그러나, 비-가교 산소 중 하나를 상기 원자 또는 원자의 그룹 중 하나로 대체하는 것이 인 원자를 카이랄이 되게 할 수 있다. 입체발생 인 원자는 "R" 배열(여기서 Rp) 또는 "S" 배열(여기서 Sp)을 보유할 수 있다. 골격은 가교 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결시키는 산소)를 질소(가교된 포스포로아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌포스포네이트)로 대체하여 변형될 수 있다. 대체는 어느 하나의 연결 산소 또는 연결 산소 둘 모두에서 일어날 수 있다.
포스페이트 기는 특정 골격 변형에서 비-인 함유 연결기에 의해 대체될 수 있다. 일부 구체예에서, 하전된 포스페이트 기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다. 포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 제한 없이, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
주형 핵산
본원에 개시된 조성물 및 방법은 주형 핵산을 포함할 수 있다. 주형은 Cas 뉴클레이스에 대한 표적 자리에서 또는 그 근처에서 핵산 서열을 변경 또는 삽입시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 주형을 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 단일 주형이 제공될 수 있다. 다른 구체예에서, 편집이 둘 이상의 표적 자리에서 일어날 수 있도록 둘 이상의 주형이 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 단일 유전자, 또는 세포에서 두 가지의 상이한 유전자를 편집하기 위해 상이한 주형이 제공될 수 있다.
일부 구체예에서, 주형은 상동 재조합에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상동 재조합은 주형 서열 또는 주형 서열의 일부를 표적 핵산 분자로 통합시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 주형은 상동성-지시 복구(homology-directed repair)에서 사용될 수 있으며, 이는 핵산의 절단 자리에서 DNA 가닥 침입을 포함한다. 일부 구체예에서, 상동성-지시 복구는 편집된 표적 핵산 분자에서 주형 서열 포함을 야기할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 주형은 비-상동 말단 연결에 의해 매개되는 유전자 편집에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 서열은 절단 자리 근처의 핵산 서열과 유사성이 없다. 일부 구체예에서, 주형 또는 주형 서열의 일부가 혼입된다. 일부 구체예에서, 주형은 측면 역전된 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 주형은 각각 절단 자리의 상류 및 하류에 위치한 서열에 상보적인 제1 상동성 팔(arm) 및 제2 상동성 팔(제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 주형이 두 개의 상동성 팔을 포함하는 경우, 각 팔은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있고, 상동성 팔 사이의 서열은 상동성 팔 사이의 표적 서열과 실질적으로 유사하거나 동일할 수 있고, 또는 완전히 무관할 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 상의 제1 뉴클레오타이드 서열과 절단 자리의 상류 서열 사이, 주형 상의 제2 뉴클레오타이드 서열과 절단 자리의 하류 서열 사이의 상보성의 정도 또는 동일성 퍼센트는, 예를 들어 주형과 표적 핵산 분자 사이의 고충실성(high-fidelity) 상동 재조합과 같은 상동 재조합을 허용할 수 있다. 일부 구체예에서, 상보성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 상보성의 정도는 약 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 상보성의 정도는 적어도 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 상보성의 정도는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 동일성 퍼센트는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 동일성 퍼센트는 약 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 동일성 퍼센트는 적어도 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 동일성 퍼센트는 100%일 수 있다.
일부 구체예에서, 주형 서열은 표적 세포의 내인성 서열에 상응하거나 이를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이는 또한 대안으로 표적 세포의 외인성 서열에 상응하거나 이를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "내인성 서열"은 세포에 고유한 서열을 지칭한다. 용어 "외인성 서열"은 세포에 고유하지 않은 서열, 또는 세포의 게놈에서의 고유 위치가 상이한 위치에 있는 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 내인성 서열은 세포의 게놈 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 내인성 서열은 염색체 또는 염색체 외 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 내인성 서열은 세포의 플라스미드 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 서열은 절단 자리에서 또는 그 근처에서 세포의 내인성 서열의 일부와 실질적으로 동일할 수 있지만, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변화를 포함한다. 일부 구체예에서, 절단된 표적 핵산 분자를 주형으로 편집하는 것은 표적 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 발현된 단백질에서 하나 이상의 아미노산 변화를 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 표적 유전자로부터 발현된 RNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 표적 유전자의 발현 수준을 변경시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 표적 유전자의 발현 증가 또는 감소를 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 유전자 넉다운을 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 유전자 넉아웃을 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 복원된 유전자 기능을 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 절단된 표적 핵산 분자를 주형으로 편집하는 것은 표적 핵산 분자, 예컨대 DNA의 엑손 서열, 인트론 서열, 조절 서열, 전사 제어 서열, 번역 제어 서열, 스플라이싱 자리, 또는 비-코딩 서열 변화를 야기할 수 있다.
다른 구체예에서, 주형 서열은 외인성 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 서열은 외인성 프로모터 서열에 작동 가능하에 연결된 단백질 또는 RNA 코딩 서열을 포함할 수 있어서, 외인성 서열의 표적 핵산 분자 내로의 통합 시, 세포는 통합 서열에 의해 인코딩된 단백질 또는 RNA를 발현할 수 있다. 다른 구체예에서, 외인성 서열의 표적 핵산 분자 내로의 통합 시, 통합 서열의 발현은 내인성 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 서열은 단백질 또는 단백질의 일부를 인코딩하는 cDNA 서열을 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 외인성 서열은 엑손 서열, 인트론 서열, 조절 서열, 전사 제어 서열, 번역 제어 서열, 스플라이싱 자리, 또는 비-코딩 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 서열의 통합은 복원된 유전자 기능을 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 서열의 통합은 유전자 넉인을 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 서열의 통합은 유전자 넉아웃을 야기할 수 있다.
주형은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 주형은 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 이상 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 주형은 단일-가닥 핵산일 수 있다. 주형은 이중-가닥 또는 부분 이중-가닥 핵산일 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 가닥 주형은 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 주형은 표적 서열을 포함하는 표적 핵산 분자의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열(즉, "상동성 팔")을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 주형은 표적 핵산 분자상의 절단 자리의 상류 또는 하류에 위치한 서열에 상보적인 상동성 팔을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 주형은 측면 역전-말단 반복(invert-terminal repeat, ITR) 서열을 포함하는 ssDNA 또는 dsDNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 주형은 벡터, 플라스미드, 미니서클, 나노서클, 또는 PCR 생성물로서 제공된다.
핵산의 정제
일부 구체예에서, 핵산은 정제된다. 일부 구체예에서, 핵산은 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전, 알코올 침전, 또는 동등한 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 것)을 사용하여 정제된다. 일부 구체예에서, 핵산은 크로마토그래피-기반 방법, 예컨대 HPLC-기반 방법 또는 동등한 방법(예를 들어, 본원에 기재된 것)을 사용하여 정제된다. 일부 구체예에서, 핵산은 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전) 및 HPLC-기반 방법 모두를 사용하여 정제된다.
표적 서열
일부 구체예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표적 핵산 분자상의 표적 서열에 지시되고 이를 절단할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 Cas 뉴클레이스에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 특정 구체예에서, Cas 뉴클레이스에 대한 표적 서열은 뉴클레이스의 동족 PAM 서열 근처에 위치한다. 일부 구체예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 gRNA에 의해 표적 핵산 분자의 표적 서열에 지시될 수 있으며, 여기서 gRNA는 클래스 2 Cas 단백질과 혼성화되고 표적 서열을 절단한다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 혼성화되고 동족 PAM에 인접하거나 이를 포함하는 표적 서열을 절단한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 표적화 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 가이드 RNA에 혼성화되는 상응하는 표적 서열의 일부 사이의 상보성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 가이드 RNA에 혼성화되는 상응하는 표적 서열의 일부 사이의 동일성 퍼센트는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적의 상동성 영역은 동족 PAM 서열에 인접한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 표적화 서열과 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 표적화 서열과 비교하여 적어도 하나의 불일치, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.
표적 서열의 길이는 사용된 뉴클레이스 시스템에 의존할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템에 대한 가이드 RNA의 표적화 서열은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 50 초과의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있고 표적 서열은 상응하는 길이이며, 임의로 PAM 서열에 인접한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 15-24 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 17-21 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 20 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 닉케이스가 사용될 때, 표적 서열은 DNA 분자의 반대 가닥을 절단하는 한 쌍의 닉케이스에 의해 인식되는 한 쌍의 표적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 DNA 분자의 동일한 가닥을 절단하는 한 쌍의 닉케이스에 의해 인식되는 한 쌍의 표적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 하나 이상의 Cas 뉴클레이스에 의해 인식되는 한 쌍의 표적 서열의 일부를 포함할 수 있다.
표적 핵산 분자는 세포에 내인성 또는 외인성인 임의의 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 핵산 분자는 세포로부터의 또는 세포 안의 에피솜 DNA, 플라스미드, 게놈 DNA, 바이러스 게놈, 미토콘드리아 DNA, 또는 염색체 DNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 핵산 분자의 표적 서열은 인간 세포를 포함하는 세포로부터의 또는 세포 안의 게놈 서열일 수 있다.
추가의 구체예에서, 표적 서열은 바이러스 서열일 수 있다. 추가의 구체예에서, 표적 서열은 병원체 서열일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적 서열은 합성된 서열일 수 있다. 추가의 구체예에서, 표적 서열은 염색체 서열일 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 서열은 전위 접합(translocation junction), 예를 들어, 암과 관련된 전위를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 진핵생물 염색체, 예컨대 인간 염색체상에 있을 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 서열은 간 세포에서 발현된다는 점에서 간-특이적 서열이다.
일부 구체예에서, 표적 서열은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 인트론 서열, 조절 서열, 유전자의 전사 제어 서열, 유전자의 번역 제어 서열, 스플라이싱 자리 또는 유전자 사이의 비-코딩 서열에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자는 단백질 코딩 유전자일 수 있다. 다른 구체예에서, 유전자는 비-코딩 RNA 유전자일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 질병-관련 유전자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 게놈 중의 비유전자 기능성 자리, 예를 들어 염색질 조직화의 양태를 제어하는 자리, 예컨대 스캐폴드 자리 또는 유전자자리 제어 영역에 위치할 수 있다.
클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 포함하는 구체예에서, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, "PAM")에 인접할 수 있다. 일부 구체예에서, PAM은 표적 서열의 3' 말단의 1, 2, 3, 또는 4, 뉴클레오타이드에 인접하거나 그 안에 있을 수 있다. PAM의 길이 및 서열은 사용된 Cas 단백질에 의존할 수 있다. 예를 들어, PAM은 Ran et al., Nature, 520: 186-191 (2015)의 도 1, 및 Zetsche 2015의 도 S5에 개시된 것을 포함하여, 특정 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그에 대한 컨센서스 또는 특정 PAM 서열로부터 선택될 수 있으며, 각각의 관련 개시는 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예에서, PAM은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 비제한적인 예시적인 PAM 서열은 NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN, 및 NNNNGATT를 포함한다 (여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드로 정의되고, W는 A 또는 T로 정의된다). 일부 구체예에서, PAM 서열은 NGG일 수 있다. 일부 구체예에서, PAM 서열은 NGGNG일 수 있다. 일부 구체예에서, PAM 서열은 TTN일 수 있다. 일부 구체예에서, PAM 서열은 NNAAAAW일 수 있다.
지질 제제
CRISPR/Cas 카르고를 포함하여 RNA에 대한 LNP 제제의 다양한 구체예가 본원에 개시된다. 그러한 LNP 제제는 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질과 함께 "아민 지질"을 포함한다. 일부 구체예에서, 그러한 LNP 제제는 헬퍼 지질 및 PEG 지질과 함께 "아민 지질"을 포함한다. 일부 구체예에서, LNP 제제는 1 퍼센트 미만의 중성 인지질을 포함한다. 일부 구체예에서, LNP 제제는 0.5 퍼센트 미만의 중성 인지질을 포함한다. "지질 나노입자"는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 관련된 복수의 (즉 하나 초과의) 지질 분자를 포함하는 입자를 의미한다.
아민 지질
생물학적 활성제의 전달을 위한 LNP 조성물은 "아민 지질"을 포함하며, 이는 지질 A의 아세탈 유사체를 포함하여, 지질 A 또는 이의 등가물로 정의된다.
일부 구체예에서, 아민 지질은 지질 A이고, 이는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸) 프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트이고, 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 지칭된다. 지질 A는 다음과 같이 나타날 수 있다:
Figure pct00003
.
지질 A는 WO2015/095340(예를 들어, pp. 84-86)에 따라 합성될 수 있다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A와 동등하다.
특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A의 유사체이다. 특정 구체예에서, 지질 A 유사체는 지질 A의 아세탈 유사체이다. 특정 LNP 조성물에서, 아세탈 유사체는 C4-C12 아세탈 유사체이다. 일부 구체예에서, 아세탈 유사체는 C5-C12 아세탈 유사체이다. 추가적인 구체예에서, 아세탈 유사체는 C5-C10 아세탈 유사체이다. 추가의 구체예에서, 아세탈 유사체는 C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11, 및 C12 아세탈 유사체로부터 선택된다.
본원에 기재된 LNP에서 사용하기에 적합한 아민 지질은 생체 내에서 생분해성이고 RNA와 같은 생물학적 활성제를 세포에 전달하기에 적합하다. 아민 지질은 낮은 독성을 갖는다 (예를 들어, 10 mg/kg 이상의 RNA 카르고의 양으로 부작용 없이 동물 모델에서 허용된다). 특정 구체예에서, 아민 지질을 포함하는 LNP는 적어도 75%의 아민 지질이 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10 일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 아민 지질을 포함하는 LNP는 적어도 50%의 mRNA 또는 gRNA가 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10 일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 아민 지질을 포함하는 LNP는 적어도 50%의 LNP가, 예를 들어 지질(예를 들어, 아민 지질), RNA(예를 들어, mRNA), 또는 다른 성분을 측정함으로써 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10 일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, LNP의 지질-캡슐화 대 유리 지질, RNA, 또는 핵산 성분이 측정된다.
지질 제거(clearance)는 문헌에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier")를 참조하라. 예를 들어, Maier에서, 루시퍼레이스-표적화 siRNA를 포함하는 LNP-siRNA 시스템이 측부 꼬리 정맥을 통한 정맥 일시 주사에 의해 0.3 mg/kg으로 6 내지 8 주령 C57Bl/6 마우스 수컷에게 투여되었다. 혈액, 간, 및 비장 샘플이 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 및 168 시간에 수집되었다. 조직 수집 전에 마우스에 식염수를 관류하고 혈액 샘플을 처리하여 혈장을 수득했다. 모든 샘플은 LC-MS에 의해 처리 및 분석되었다. 또한, Maier는 LNP-siRNA 제제의 투여 후 독성 평가를 위한 절차를 설명한다. 예를 들어, 루시퍼레이스-표적화 siRNA는 0, 1, 3, 5, 및 10 mg/kg(5 동물/그룹)로 단일 정맥 일시 주사를 통해 5 mL/kg의 용량 부피로 수컷 Sprague-Dawley 래트에게 투여되었다. 24 시간 후, 약 1 mL의 혈액을 의식이 있는 동물의 경정맥으로부터 수득하고 혈청을 단리했다. 투여 후 72 시간에, 모든 동물을 부검을 위해 안락사시켰다. 임상 징후, 체중, 혈청 화학, 장기 중량 및 조직병리의 평가를 수행했다. 비록 Maier가 siRNA-LNP 제제를 평가하는 방법을 설명하기는 하지만, 이러한 방법은 본 발명의 LNP 조성물 투여의 제거, 약동학, 및 독성을 평가하기 위해 적용될 수 있다.
아민 지질은 증가된 제거율(clearance rate)을 야기할 수 있다. 일부 구체예에서, 제거율은 지질 제거율이고, 예를 들어 지질이 혈액, 혈청, 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 구체예에서, 제거율은 RNA 제거율이고, 예를 들어 mRNA 또는 gRNA가 혈액, 혈청, 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 구체예에서, 제거율은 LNP가 혈액, 혈청, 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 구체예에서, 제거율은 LNP가 조직, 예컨대 간 조직 또는 비장 조직으로부터 제거되는 속도이다. 특정 구체예에서, 높은 제거율은 실질적인 부작용 없이 안전성 프로파일을 유발한다. 아민 지질은 순환 및 조직에서 LNP 축적을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 순환 및 조직에서 LNP 축적의 감소는 실질적인 부작용 없이 안전성 프로파일을 유발한다.
본 발명의 아민 지질은 이들이 존재하는 매질의 pH에 따라 이온화 가능하다 (예를 들어, 염을 형성할 수 있다). 예를 들어, 약간 산성인 매질에서, 아민 지질은 양성자화되어 양전하를 가질 수 있다. 반대로, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약간 염기성인 매질에서, 아민 지질은 양성자화되어 전하를 갖지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 적어도 약 10의 pH에서 양성자화될 수 있다.
아민 지질이 주로 양성자화되는 pH는 이의 고유의 pKa와 관련된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.5 내지 약 6.6 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.6 내지 약 6.4 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.8 내지 약 6.2 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.8 내지 약 6.5 범위의 pKa를 가질 수 있다. 아민 지질의 pKa는, 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 갖는 양이온성 지질이 예를 들어 간으로의 생체 내 카르고의 전달에 효과적인 것으로 밝혀졌으므로, LNP 제제화에서 중요한 고려사항이 될 수 있다. 또한, 약 5.3 내지 약 6.4 범위의 pKa를 갖는 양이온성 지질이, 예를 들어 종양으로의 생체 내 전달에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, WO 2014/136086을 참조하라.
추가적인 지질
본 발명의 지질 조성물에서 사용하기에 적합한 "중성 지질"은, 예를 들어 다양한 중성, 비하전 또는 양쪽이온성 지질을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 5-헵타데실벤젠-1,3-디올(레소르시놀), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜 콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디리놀레오일포스파티딜콜린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)일 수 있다. 다른 구체예에서, 중성 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)일 수 있다.
"헬퍼 지질"은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레소르시놀을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레소르시놀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
PEG 지질은 나노입자가 생체 내 (예를 들어, 혈액에서) 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경하는 스텔스(stealth) 지질이다. PEG 지질은, 예를 들어 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제제 과정을 보조할 수 있다. 본원에 사용된 PEG 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 전형적으로, PEG 지질은 지질 모이어티 및 PEG에 기반한 고분자 모이어티를 포함한다.
일부 구체예에서, 지질 모이어티는 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화 탄소 원자를 독립적으로 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기를 포함하는 것을 포함하여, 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유래할 수 있고, 여기서 사슬은 예를 들어 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 알킬 사슬 길이는 약 C10 내지 C20를 포함한다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬 기를 추가로 포함할 수 있다. 사슬 길이는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 고분자를 의미한다. 한 구체예에서, PEG 모이어티는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 고분자이다. 특정 구체예에서, PEG 모이어티는 대안적이고, PEG 모이어티는 예를 들어 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시, 또는 아릴 기에 의해 치환될 수 있다. 한 구체예에서, PEG 모이어티는 PEG 공중합체, 예컨대 PEG-폴리우레탄 또는 PEG-폴리프로필렌을 포함한다 (예를 들어, J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)를 참조하라); 대안적으로, PEG 모이어티는 PEG 공중합체를 포함하지 않으며, 예를 들어, 이는 PEG 단일중합체일 수 있다. 한 구체예에서, PEG는 약 130 내지 약 50,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 30,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 20,000, 하위구체예에서 약 150 내지 약 15,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 10,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 6,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 5,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 4,000, 하위구체예에서, 약 150 내지 약 3,000, 하위구체예에서, 약 300 내지 약 3,000, 하위구체예에서, 약 1,000 내지 약 3,000, 및 하위구체예에서, 약 1,500 내지 약 2,500의 분자량을 갖는다.
특정 구체예에서, (예를 들어, 지질 모이어티 또는 지질, 예컨대 스텔스 지질과 접합된) PEG는 "PEG 2000"로도 명명되는 "PEG-2K"이며 이는 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG-2K는 본원에서 하기 화학식 (I)로 나타나며, 여기서 n은 45이고, 이는 수평균 중합도가 약 45 서브유닛을 포함함을 의미한다
Figure pct00004
. 그러나, 예를 들어, 수평균 중합도가 약 23 서브유닛(n=23), 및/또는 68 서브유닛(n=68)을 포함하는 것을 포함하여 당해 분야에 공지인 다른 PEG 구체예가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, n은 약 30 내지 약 60 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, n은 약 35 내지 약 55 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, n은 약 40 내지 약 50 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, n은 약 42 내지 약 48 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, n은 45일 수 있다. 일부 구체예에서, R은 H, 치환된 알킬, 및 비치환 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, R은 비치환 알킬일 수 있다. 일부 구체예에서, R은 메틸일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, PEG 지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG) (NOF, Tokyo, Japan의 카탈로그 # GM-020), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤 (PEG-DSPE) (카탈로그 # DSPE-020CN, NOF, Tokyo, Japan), PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, 및 PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복스아미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB (3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DMG) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA의 cat. #880150P), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSPE) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA의 cat. #880120C), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG2k-DSG; GS-020, NOF Tokyo, Japan), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트 (PEG2k-DMA), 및 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSA)로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 WO2016/010840에서 단락 [00240] 내지 [00244]에 개시된 화합물 S027일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
LNP 제제
본 발명의 구체예는 제제 중 성분 지질의 각각의 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 30 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 40 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 45 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 50 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 55 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 50 mol-% 내지 약 55 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 50 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 아민 지질의 mol-%는 약 55 mol-%일 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 배치의 아민 지질 mol-%는 표적 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 일부 구체예에서, LNP 배치의 아민 지질 mol-%는 표적 mol-%의 ±4 mol-%, ±3 mol-%, ±2 mol-%, ±1.5 mol-%, ±1 mol-%, ±0.5 mol-%, 또는 ±0.25 mol-%일 것이다. 모든 mol-% 수는 LNP 조성물의 지질 성분의 분율로서 주어진다. 특정 구체예에서, 아민 지질 mol-% 의 LNP 인터-로트 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 5 mol-% 내지 약 15 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 7 mol-% 내지 약 12 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 0 mol-% 내지 약 5 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 0 mol-% 내지 약 10 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 5 mol-% 내지 약 10 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 8 mol-% 내지 약 10 mol-%일 수 있다.
한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 5 mol-%, 약 6 mol-%, 약 7 mol-%, 약 8 mol-%, 약 9 mol-%, 약 10 mol-%, 약 11 mol-%, 약 12 mol-%, 약 13 mol-%, 약 14 mol-%, 또는 약 15 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 9 mol-%일 수 있다.
한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 1 mol-% 내지 약 5 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질의 mol-%는 약 0.1 mol-% 내지 약 1 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 인지질과 같은 중성 지질의 mol-%는 약 0.1 mol-%, 약 0.2 mol-%, 약 0.5 mol-%, 1 mol-%, 약 1.5 mol-%, 약 2 mol-%, 약 2.5 mol-%, 약 3 mol-%, 약 3.5 mol-%, 약 4 mol-%, 약 4.5 mol-%, 또는 약 5 mol-%일 수 있다.
한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 1 mol-% 미만일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 0.5 mol-% 미만일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질의 mol-%는 약 0 mol-%, 약 0.1 mol-%, 약 0.2 mol-%, 약 0.3 mol-%, 약 0.4 mol-%, 약 0.5 mol-%, 약 0.6 mol-%, 약 0.7 mol-%, 약 0.8 mol-%, 약 0.9 mol-%, 또는 약 1 mol-%일 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 제제에는 중성 지질이 없다 (즉, 0 mol-% 중성 지질). 일부 구체예에서, 본원에 개시된 제제에는 중성 지질이 본질적으로 없다 (즉, 약 0 mol-% 중성 지질). 일부 구체예에서, 본원에 개시된 제제에는 중성 인지질이 없다 (즉, 0 mol-% 중성 인지질). 일부 구체예에서, 본원에 개시된 제제에는 중성 인지질이 본질적으로 없다 (즉, 약 0 mol-% 중성 인지질).
일부 구체예에서, LNP 배치의 중성 지질 mol-%는 표적 중성 지질 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구체예에서, LNP 인터-로트 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 20 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 25 mol-% 내지 약 55 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 25 mol-% 내지 약 50 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 25 mol-% 내지 약 40 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 30 mol-% 내지 약 50 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 30 mol-% 내지 약 40 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 아민 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질 농도를 기준으로 조정되어 지질 성분을 100 mol-%로 만든다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 아민 지질 및 PEG 지질 농도를 기준으로 조정되어 지질 성분을 100 mol-%로 만든다. 한 구체예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 아민 지질 및 PEG 지질 농도를 기준으로 조정되어 지질 성분을 적어도 99 mol-%로 만든다. 일부 구체예에서, LNP 배치의 헬퍼 mol-%는 표적 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구체예에서, LNP 인터-로트 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 1 mol-% 내지 약 10 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 2 mol-% 내지 약 10 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 2 mol-% 내지 약 8 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 2 mol-% 내지 약 4 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 2.5 mol-% 내지 약 4 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 3 mol-%일 수 있다. 한 구체예에서, PEG 지질의 mol-%는 약 2.5 mol-%일 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 배치의 PEG 지질 mol-%는 표적 PEG 지질 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구체예에서, LNP 인터-로트 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
특정 구체예에서, 카르고는 RNA-유도 DNA-결합제를 인코딩하는 mRNA(예를 들어 Cas 뉴클레이스, 클래스 2 Cas 뉴클레이스, 또는 Cas9), 및 gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산, 또는 mRNA 및 gRNA의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 지질 A 또는 이의 등가물을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 아민 지질은 지질 A이다. 일부 양태에서, 아민 지질은 지질 A 등가물, 예를 들어 지질 A의 유사체이다. 특정 양태에서, 아민 지질은 지질 A의 아세탈 유사체이다. 다양한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함한다. 특정 구체예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 특정 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 지질 A, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 DMG를 포함하는 PEG 지질을 포함한다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A, 및 지질 A의 아세탈 유사체를 포함하는 지질 A의 등가물로부터 선택된다. 추가적인 구체예에서, LNP 조성물은 지질 A, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
다양한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함한다. 다양한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 인지질, 및 PEG 지질을 포함한다. 다양한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질로 구성된 지질 성분을 포함한다. 다양한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함한다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 중성 인지질과 같은 중성 지질을 포함하지 않는다. 다양한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질로 구성된 지질 성분을 포함한다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DAPC, DMPC, DOPC, DOPE, 및 DSPE 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DPPC이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DAPC이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DMPC이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DOPC이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DOPE이다. 특정 구체예에서, 중성 지질은 DSPE이다. 특정 구체예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 특정 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 지질 A, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 지질 A, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질로 구성된 지질 성분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 콜레스테롤, 및 PEG 지질로 구성된 지질 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 DMG를 포함하는 PEG 지질을 포함한다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A, 및 지질 A의 아세탈 유사체를 포함하는 지질 A의 등가물로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A의 C5-C12 또는 C4-C12 아세탈 유사체이다. 추가적인 구체예에서, LNP 조성물은 지질 A, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
본 발명의 구체예는 아민 지질의 양으로 하전된 아민 기(N) 및 캡슐화될 핵산의 음으로 하전된 포스페이트 기(P) 사이의 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 또한 제공한다. 이는 식 N/P에 의해 수학적으로 표현될 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 핵산 성분을 포함할 수 있고, 여기서 N/P 비율은 약 3 내지 10이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 핵산 성분을 포함할 수 있고, 여기서 N/P 비율은 약 3 내지 10이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 헬퍼 지질을 포함하는 지질 성분; 및 RNA 성분을 포함할 수 있고, 여기서 N/P 비율은 약 3 내지 10이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 RNA 성분을 포함할 수 있고, 여기서 N/P 비율은 약 3 내지 10이다. 한 구체예에서, N/P 비율은 약 5 내지 7일 수 있다. 한 구체예에서, N/P 비율은 약 3 내지 7일 수 있다. 한 구체예에서, N/P 비율은 약 4.5 내지 8일 수 있다. 한 구체예에서, N/P 비율은 약 6일 수 있다. 한 구체예에서, N/P 비율은 6 ± 1일 수 있다. 한 구체예에서, N/P 비율은 6 ± 0.5일 수 있다. 일부 구체예에서, N/P 비율은 표적 N/P 비율의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구체예에서, LNP 인터-로트 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일부 구체예에서, 핵산 성분, 예를 들어 RNA 성분은 mRNA, 예컨대 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. RNA 성분은임의로 추가적인 핵산 및/또는 단백질, 예를 들어 RNP 카르고와 함께 RNA를 포함한다. 한 구체예에서, RNA는 Cas9 mRNA를 포함한다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 gRNA 핵산, 예컨대 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, RNA 성분은 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 일부 구체예에서, RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다.
특정 구체예에서, LNP 조성물은 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 특정 LNP 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 추가적인 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다.
일부 구체예에서, LNP 조성물은 gRNA를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, gRNA, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, gRNA, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. gRNA를 포함하는 특정 LNP 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. gRNA를 포함하는 추가의 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다.
한 구체예에서, LNP 조성물은 sgRNA를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 Cas9 sgRNA를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 Cpf1 sgRNA를 포함할 수 있다. sgRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함한다. sgRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질을 포함한다. sgRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. sgRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. sgRNA를 포함하는 추가적인 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다.
특정 구체예에서, LNP 조성물은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA일 수 있는 gRNA를 포함한다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, gRNA, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 PEG 지질로 구성된 지질 성분; 및 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, 및 gRNA로 구성된 핵산 성분을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 아민 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG 지질로 구성된 지질 성분; 및 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, 및 gRNA로 구성된 핵산 성분을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 특정 조성물은 약 1 mol-% 미만의 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질을 포함한다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 특정 조성물은 약 0.5 mol-% 미만의 중성 지질, 예를 들어 중성 인지질을 포함한다. 특정 조성물에서, LNP는 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질을 포함하지 않는다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 추가적인 구체예에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 구체예에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다.
특정 구체예에서, LNP 조성물은 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas mRNA 및 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 약 25:1 내지 약 1:25의 gRNA 대 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비율을 포함한다. 특정 구체예에서, LNP 제제는 약 10:1 내지 약 1:10의 gRNA 대 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비율을 포함한다. 특정 구체예에서, LNP 제제는 약 8:1 내지 약 1:8의 gRNA 대 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비율을 포함한다. 본원에서 측정된 비율은 중량 기준이다. 일부 구체예에서, LNP 제제는 약 5:1 내지 약 1:5의 gRNA 대 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas mRNA의 비율을 포함한다. 일부 구체예에서, 비율 범위는 약 3:1 내지 1:3, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:2, 약 3:1 내지 1:1, 약 3:1, 약 2:1 내지 1:1이다. 일부 구체예에서, gRNA 대 mRNA 비율은 약 3:1 또는 약 2:1이다. 일부 구체예에서 gRNA 대 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스의 비율은 약 1:1이다. 비율은 약 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25일 수 있다.
본원에 개시된 LNP 조성물은 주형 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, 예컨대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA와 공동-제제화될 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 핵산은 가이드 RNA와 공동-제제화될 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 핵산은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA 둘 모두와 공동-제제화될 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 핵산은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 또는 가이드 RNA와 별도로 제제화될 수 있다. 주형 핵산은 LNP 조성물과 함께 또는 별도로 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 핵산은 원하는 복구 메커니즘에 따라 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. 주형은 표적 DNA, 또는 표적 DNA에 인접한 서열에 대한 상동성 영역을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, LNP는 수성 RNA 용액을 유기 용매계 지질 용액, 예를 들어, 100% 에탄올과 혼합하여 형성된다. 적합한 용액 또는 용매는 물, PBS, Tris 버퍼, NaCl, 시트레이트 버퍼, 에탄올, 클로로포름, 디에틸에테르, 사이클로헥산, 테트라하이드로퓨란, 메탄올, 이소프로판올을 포함하거나 함유할 수 있다. 예를 들어, LNP의 생체 내 투여를 위한 약제학적으로 허용되는 버퍼가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 버퍼는 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 6.5 이상으로 유지하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 버퍼는 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 7.0 이상으로 유지하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 조성물은 약 7.2 내지 약 7.7 범위의 pH를 갖는다. 추가적인 구체예에서, 조성물은 약 7.3 내지 약 7.7 범위 또는 약 7.4 내지 약 7.6 범위의 pH를 갖는다. 추가의 구체예에서, 조성물은 약 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 또는 7.7의 pH를 갖는다. 조성물의 pH는 마이크로 pH 프로브로 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 동결보호제(cryoprotectant )가 조성물에 포함된다. 동결보호제의 비제한적 예는 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, DMSO, 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 예시적인 조성물은 예를 들어, 수크로스와 같은 최대 10% 동결보호제를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10% 동결보호제를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10% 수크로스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 버퍼를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 버퍼는 포스페이트 버퍼(PBS), Tris 버퍼, 시트레이트 버퍼, 또는 이들의 혼합을 포함할 수 있다. 특정한 예시적인 구체예에서, 버퍼는 NaCl을 포함한다. 특정 구체예에서, NaCl이 생략된다. NaCl의 예시적인 양은 약 20 mM 내지 약 45 mM 범위일 수 있다. NaCl의 예시적인 양은 약 40 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, NaCl의 양은 약 45 mM이다. 일부 구체예에서, 버퍼는 Tris 버퍼이다. Tris의 예시적인 양은 약 20 mM 내지 약 60 mM 범위일 수 있다. Tris의 예시적인 양은 약 40 mM 내지 약 60 mM 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, Tris의 양은 약 50 mM이다. 일부 구체예에서, 버퍼는 NaCl 및 Tris를 포함한다. LNP 조성물의 특정한 예시적인 구체예는 Tris 버퍼 중에 5% 수크로스 및 45 mM NaCl을 함유한다. 다른 예시적인 구체예에서, 조성물은 약 5% w/v의 양의 수크로스, 약 45 mM NaCl, 및 pH 7.5의 약 50 mM Tris를 함유한다. 염, 버퍼, 및 동결보호제 양은 전체 제제의 삼투질농도(osmolality)가 유지되도록 변할 수 있다. 예를 들어, 최종 삼투질농도는 450 mOsm/L 미만에서 유지될 수 있다. 추가의 구체예에서, 삼투질농도는 350 내지 250 mOsm/L이다. 특정 구체예는 300 +/- 20 mOsm/L의 최종 삼투질농도를 갖는다.
일부 구체예에서, 미세유체 혼합, T-혼합, 또는 교차-혼합이 사용된다. 특정 양태에서, 유량, 접합 크기, 접합 기하구조, 접합 형태, 관 직경, 용액, 및/또는 RNA 및 지질 농도가 변할 수 있다. LNP 또는 LNP 조성물은 예를 들어 투석, 접선 유동 여과, 또는 크로마토그래피를 통해 농축 또는 정제될 수 있다. LNP는 예를 들어 현탁액, 유탁액(emulsion), 또는 동결건조 분말로서 보관될 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 2-8℃에서 보관되고, 특정 양태에서, LNP 조성물은 실온에서 보관된다. 추가적인 구체예에서, LNP 조성물은 예를 들어 -20℃ 또는 -80℃에서 냉동 보관된다. 다른 구체예에서, LNP 조성물은 약 0℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도에서 보관된다. 냉동된 LNP 조성물은, 예를 들어 얼음에서, 실온에서 또는 25℃에서 사용 전에 해동될 수 있다.
LNP는 예를 들어 미소구체(단층 및 다층 막소포(unilamellar and multilamellar vesicles), 예를 들어, "리포솜" 포함- 일부 구체예에서, 실질적으로 구형인 층상 지질 이중층- 보다 특정한 구체예에서, 예를 들어 상당 부분의 RNA 분자를 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있음), 유탁액 중의 분산상, 미셀, 또는 현탁액 중의 내부상일 수 있다.
또한, LNP 조성물은 치료적 유효 용량에서 생체 내 세포독성 수준으로 축적되지 않는다는 점에서 생분해성이다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 치료 용량 수준에서 실질적인 부작용을 유발하는 선천성 면역 반응을 야기하지 않는다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 LNP 조성물은 치료 용량 수준에서 독성을 야기하지 않는다.
일부 구체예에서, pdi는 약 0.005 내지 약 0.75 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0.01 내지 약 0.5 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0 내지 약 0.4 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0 내지 약 0.35 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0 내지 약 0.35 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0 내지 약 0.3 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0 내지 약 0.25 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0 내지 약 0.2 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, pdi는 약 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 또는 0.4 미만일 수 있다.
본원에 개시된 LNP는 약 1 내지 약 250 nm의 크기(예를 들어, Z-평균 직경)를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 10 내지 약 200 nm의 크기를 갖는다. 추가의 구체예에서, LNP는 약 20 내지 약 150nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 50 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 50 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 50 내지 약 120 nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 60 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 75 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 75 내지 약 120 nm의 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, LNP는 약 75 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 언급된 모든 크기는 Malvern Zetasizer에서 동적 광산란에 의해 측정된 완전히 형성된 나노입자의 평균 크기(직경)이다. 나노입자 샘플은 계수율이 대략 200-400 kcp가 되도록 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중 평균(Z-평균 직경)으로 나타난다.
일부 구체예에서, LNP는 약 50% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 50% 내지 약 70% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 70% 내지 약 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
일부 구체예에서, LNP는 약 1.00E+05 g/mol 내지 약 1.00E+10 g/mol 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 5.00E+05 g/mol 내지 약 7.00E+07 g/mol 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 1.00E+06 g/mol 내지 약 1.00E+10 g/mol 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 1.00E+07 g/mol 내지 약 1.00E+09 g/mol 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 구체예에서, LNP는 약 5.00E+06 g/mol 내지 약 5.00E+09 g/mol 범위의 평균 분자량으로 형성된다.
일부 구체예에서, 다분산도(Mw/Mn; 중량평균 몰질량(Mw) 대 수평균 몰질량(Mn)의 비율)은 약 1.000 내지 약 2.000 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, Mw/Mn은 약 1.00 내지 약 1.500 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, Mw/Mn은 약 1.020 내지 약 1.400 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, Mw/Mn은 약 1.010 내지 약 1.100 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, Mw/Mn은 약 1.100 내지 약 1.350 범위일 수 있다.
세포 조작 방법; 조작된 세포
본원에 개시된 LNP 조성물은 생체내 및 시험관내 모두에서 유전자 편집을 통한 세포 조작 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 세포를 본원에 기재된 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 대상, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간에서 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 기관, 예컨대 간, 예컨대 포유동물 간, 예컨대 인간 간에 있다. 일부 구체예에서, 세포는 간 세포(liver cell), 예컨대 포유동물 간 세포, 예컨대 인간 간 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 간세포(hepatocyte), 예컨대 포유동물 간세포, 예컨대 인간 간세포이다. 일부 구체예에서, 간 세포는 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 인간 간 세포는 간 동양 내피세포(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 간 세포는 쿠퍼(Kupffer) 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 간 세포는 간 성상 세포(hepatic stellate cell)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 간 세포는 종양 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 간 세포는 간 줄기 세포일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 세포는 ApoE-결합 수용체를 포함한다. 일부 구체예에서, 간세포(hepatocyte)와 같은 간의 세포(liver cell)는 제자리에 있다(in situ). 일부 구체예에서, 간세포와 같은 간 세포는 예를 들어 배양, 예컨대 일차 배양에서 단리된다. 본원에 개시된 용도에 상응하는 방법이 또한 제공되고, 이는 본원에 개시된 LNP 조성물을 대상에게 투여하는 것 또는 상기 기재된 것과 같은 세포를 본원에 개시된 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 조작된 세포, 예를 들어 이전 단락의 세포 유형 중 임의의 하나로부터 유리한 조작된 세포가 제공된다. 그러한 조작된 세포는 본원에 기재된 방법에 따라 생성된다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 대상 내의 조직 또는 기관, 예를 들어 간 내에 존재한다.
본원에 기재된 일부 방법 및 세포에서, 세포는 표적 서열에서 뉴클레오타이드의 변형, 예를 들어 삽입 또는 결실 ("인델(indel)") 또는 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4 또는 5 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 다른 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 틀이동(frameshift) 돌연변이를 야기하는 인델을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 주형 핵산, 예를 들어 임의의 본원에 기재된 주형 핵산의 혼입에서 기인한 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 조작된 세포를 포함하는 세포의 집단, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 따라 조작된 세포를 포함하는 세포의 집단이 제공된다. 일부 구체예에서, 집단은 시험관내 배양된 조작된 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 집단은 대상 내의 조직 또는 기관, 예를 들어 간 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 집단 내의 세포의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 그 이상이 조작된다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 인델의 검출에 의해 정의된 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 편집 효율(또는 "편집 퍼센트")을 야기한다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 삽입, 결실, 치환 또는 다른 방식에 의한 서열 변화 검출에 의해 정의된 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% DNA 변형 효율을 야기한다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 세포 집단에서 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20 내지 약 100%, 약 20 내지 약 80%, 약 40 내지 약 100%, 또는 약 40 내지 약 80%의 편집 효율 수준 또는 DNA 변형 효율 수준을 야기한다.
본원에 기대된 방법 및 세포 중 일부에서, 집단 내의 세포는 표적 서열에서 변형, 예를 들어 인델 또는 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4 또는 5 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 다른 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 틀이동 돌연변이를 야기한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 틀이동 돌연변이를 야기하는 인델을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상의 집단 중의 조작된 세포가 틀이동 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 표적 서열에서 1 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 주형 핵산, 예를 들어 임의의 본원에 기재된 주형 핵산의 혼입에서 기인한 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환 중 하나 이상을 포함한다.
유전자 편집 방법
본원에 개시된 LNP 조성물은 생체내 및 시험관내 유전자 편집에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 LNP 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 LNP 조성물은 세포와 접촉할 수 있다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 치료적 유효량의 조성물이 이를 필요로 하는 대상의 세포와 접촉할 수 있다. 한 구체예에서, 유전자 조작된 세포는 세포를 본원에 기재된 LNP 조성물과 접촉시켜 생성될 수 있다. 다양한 구체예에서, 방법은 상기 제시된 바와 같이 주형 핵산을 세포 또는 대상에게 도입하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LNP 조성물을 간 장애(disorder)와 관련된 세포에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 간 장애를 치료하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 간 세포(hepatic cell)를 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 간세포(hepatocyte)를 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 ApoE 결합 세포를 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 LNP 조성물은 세포, 예컨대 ApoE 결합 세포에 투여될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 주형 핵산이 또한 세포에 도입된다. 특정 예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스 및 sgRNA를 포함하는 LNP 조성물은 세포, 예컨대 ApoE 결합 세포에 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA, gRNA, 및 주형을 포함하는 LNP 조성물은 세포에 투여될 수 있다. 특정 예에서, Cas 뉴클레이스 및 sgRNA를 포함하는 LNP 조성물은 간 세포에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 간 세포는 대상 안에 있다.
특정 구체예에서, 대상은 단일 용량의 LNP 조성물을 받을 수 있다. 다른 예에서, 대상은 다중 용량의 LNP 조성물을 받을 수 있다. 일부 구체예에서, LNP 조성물은 2-5 회 투여된다. 하나 초과의 용량이 투여되는 경우, 용량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28 일 간격으로; 약 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월 간격으로; 또는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 간격으로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 편집은 LNP 조성물의 재투여 시 개선된다.
한 구체예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP 조성물은 gRNA를 포함하는 조성물의 투여와 별도로 세포에 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 LNP 조성물은 주형 핵산의 세포로의 투여와 별도로 세포에 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP 조성물은 세포에 투여되고, 이어서 세포로의 gRNA를 포함하는 LNP 조성물 및 이후 주형의 연속 투여가 이어질 수 있다. Cas 뉴클레이스를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP 조성물이 gRNA를 포함하는 LNP 조성물 전에 투여되는 구체예에서, 투여는 약 4, 6, 8, 12, 또는 24 시간; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 간격일 수 있다.
한 구체예에서, LNP 조성물은 유전자 넉아웃을 야기하도록 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, LNP 조성물은 세포의 집단에서 유전자 넉다운을 야기하도록 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, LNP 조성물은 유전자 교정을 야기하도록 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, LNP 조성물은 유전자 삽입을 야기하도록 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있다.
한 구체예에서, LNP 조성물의 투여는 지속적인 반응을 야기하는 유전자 편집을 야기할 수 있다. 예를 들어, 투여는 하루, 한 달, 일 년 또는 그 이상의 반응 지속기간을 야기할 수 있다. 본원에서 사용된 "반응 지속기간"은, 본원에 개시된 LNP 조성물을 사용하여 세포가 편집된 후, 결과적인 변형이 LNP 조성물의 투여 후 특정 기간 동안 여전히 존재함을 의미한다. 변형은 표적 단백질 수준을 측정하여 검출될 수 있다. 변형은 표적 DNA를 검출하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 반응 기간은 적어도 1 주일 수 있다. 다른 구체예에서, 반응 기간은 적어도 2 주일 수 있다. 한 구체예에서, 반응 기간은 적어도 1 개월일 수 있다. 일부 구체예에서, 반응 기간은 적어도 2 개월일 수 있다. 한 구체예에서, 반응 기간은 적어도 4 개월일 수 있다. 한 구체예에서, 반응 기간은 적어도 6 개월일 수 있다. 특정 구체예에서, 반응 기간은 약 26 주일 수 있다. 일부 구체예에서, 반응 기간은 적어도 1 년일 수 있다. 일부 구체예에서, 반응 기간은 적어도 5 년일 수 있다. 일부 구체예에서, 반응 기간은 적어도 10 년일 수 있다. 일부 구체예에서, 지속적인 반응은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, 또는 24 개월 후에, 표적 단백질 수준 측정 또는 표적 DNA 검출에 의해 검출 가능하다. 일부 구체예에서, 지속적인 반응은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 년 후에, 표적 단백질 수준 측정 또는 표적 DNA 검출에 의해 검출 가능하다.
LNP 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있다. LNP 조성물은 혈류, 조직, 근육, 또는 내부 기관으로 직접 투여될 수 있다. 투여는 전신, 예를 들어 주사 또는 주입일 수 있다. 투여는 국소적일 수 있다. 투여에 적합한 수단은 정맥내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 망막하, 유리체내, 전실내, 근육내, 활막내, 피내 및 피하를 포함한다. 투여에 적합한 장치는 바늘(미세바늘 포함) 주입기, 무-바늘 주입기, 삼투 펌프, 및 주입 기술을 포함한다.
LNP 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 공동으로 제제로서 투여될 것이지만 반드시 그런 것은 아니다. 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분, 다른 지질 성분(들) 및 생물학적 활성제를 포함한다. 부형제는 기능성 (예를 들어 약물 방출 속도 제어) 및/또는 비-기능성 (예를 들어 가공 보조제 또는 희석제) 특징을 제제에 부여할 수 있다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 제형의 성질과 같은 인자에 크게 의존할 것이다.
비경구 제제는 전형적으로 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다. 제제가 수성인 경우, 부형제, 예컨대 당 (글루코스, 만니톨, 소르비톨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음) 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 3 내지 9의 pH), 그러나, 일부 적용의 경우, 이들은 무균 비수성 용액과 함께 또는 무균, 무발열원 물(pyrogen-free water)(WFI)과 같은 적합한 비히클과 함께 사용될 건조된 형태로서 더욱 적합하게 제제화될 수 있다.
비록 본 발명이 예시된 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명을 이러한 실시예로 제한하도록 의도되지 않음이 이해된다. 반대로, 본 발명은 모든 대안, 변형, 및 구체적인 특징의 균등물을 포함한 균등물을 포함하도록 의도되며, 이는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명에 포함될 수 있다.
전술한 일반적인 설명 및 상세한 설명뿐만 아니라, 다음의 실시예는 단지 예시적이고 설명적인 것이며 교시를 제한하지 않는다. 본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 어떠한 방식으로든 원하는 발명 대상(subject matter)을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참조로 포함된 임의의 문헌이 본 명세서에 정의된 임의의 용어와 상충하는 경우, 본 명세서가 우선한다. 달리 명시되지 않는 한, 출원에 주어진 모든 범위는 종점을 포함한다.
본 출원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "조성물"에 대한 언급은 복수의 조성물을 포함하고 "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다. "또는"의 사용은 포괄적이며 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 측정된 값 및 측정 가능한 값은 유효 숫자 및 측정과 관련된 오차를 고려하여 근사값으로 이해된다. 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차를 의미하며, 이는 값이 측정되는 또는 결정되는 방법에 부분적으로 의존한다. 범위 앞 또는 값의 목록 앞의 "약"과 같은 수식어의 사용은, 범위의 각각의 종점 또는 목록 내의 각각의 값을 수식한다. "약"은 값 또는 종점을 또한 포함한다. 예를 들어, "약 50-55"는 "약 50 내지 약 55"를 포함한다. 또한, "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하다(contain)", "함유하다(contains)", "함유하는(containing)", "포함하다(include)", "포함하다(includes), 및 "포함하는(including)의 사용은 제한적이지 않다.
상기 명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성요소를 "포함하는"을 언급하는 본 명세서의 구체예는 본 명세서의 구체예 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는" 것으로 또한 고려되고; 다양한 구성요소로 "구성되는"을 언급하는 본 명세서의 구체예는 언급된 구성요소를 "포함하는" 또는 "본질적으로 구성되는" 것으로 또한 고려되고; "약" 다양한 구성요소를 언급하는 본 명세서의 구체예는 언급된 구성요소"에서"인 것으로 또한 고려되고; 다양한 구성요소로 "본질적으로 구성되는"을 언급하는 본 명세서의 구체예는 언급된 구성요소로 "구성되는" 또는 이를 "포함하는"으로 또한 고려된다 (이러한 상호교환성은 청구범위에서 이들 용어의 사용에는 적용되지 않는다).
실시예
실시예 1 - 마우스에서의 생체 내 편집을 위한 LNP 조성물
다양한 LNP 조성물의 소규모 제제를 제조하여 특성을 조사했다. 마우스에서의 간 편집 퍼센트에 대한 분석에서, 마우스 TTR 서열을 표적으로 하는 Cas9 mRNA 및 화학적으로 변형된 sgRNA를 하기 표 2에 기재된 바와 같이 다양한 PEG mol-%, 지질 A mol-%, 및 N:P 비율을 갖는 LNP로 제제화했다.
표 2. LNP 조성물.
LNP # 지질 A mol-% PEG-DMG mol-% N:P 비율
(다양) 45 2, 2.5, 3, 4, 5 4.5
(다양) 45 2, 2.5, 3, 4, 5 6
(다양) 50 2, 2.5, 3, 4, 5 4.5
(다양) 50 2, 2.5, 3, 4, 5 6
(다양) 55 2, 2.5, 3, 4, 5 4.5
(다양) 55 2, 2.5, 3, 4, 5 6
도 1에서, LNP 제제는 "% CL; N:P"로 표지된 지질 A mol-% 및 N:P 비율에 기초하여 X-축에서 식별된다. 도 1의 범례에 나타난 바와 같이, 2, 2.5, 3, 4, 또는 5 mol-%의 PEG-2k-DMG 농도는 (1) 45 mol-% 지질 A; 4.5 N:P ("45; 4.5"); (2) 45 mol-% 지질 A; 6 N:P ("45; 6"); (3) 50 mol-% 지질 A; 4.5 N:P ("50; 4.5"); (4) 50 mol-% 지질 A; 6 N:P ("50; 6"); (5) 55 mol-% 지질 A; 4.5 N:P ("55; 4.5"); 및 (6) 55 mol-% 지질 A; 6 N:P ("55; 6")로써 제제화되었다. DSPC mol-%를 9 mol-%로 일정하게 유지하고 콜레스테롤 mol-%를 첨가하여 각 제제 지질 성분의 잔부를 100 mol-%로 만들었다. 30 제제 각각을 아래에 기재된 바와 같이 제제화하고, 단일 용량으로 kg당 1 mg 또는 kg당 0.5 mg 용량의 총 RNA(각각 도 1A 및 도 1B)로 투여했다.
LNP 제제 - NanoAssemblr
지질 나노입자 성분을 상기 제시된 지질 성분 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. RNA 카르고를 25 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.0에 용해시켜, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카르고 농도가 되었다. LNP는 약 4.5 또는 약 6의 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비, 중량으로 1:1의 mRNA 대 gRNA의 비율로 제제화되었다.
LNP는 제조사의 프로토콜에 따라 Precision Nanosystems NanoAssemblrTM Benchtop Instrument를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 형성되었다. 차등 유량을 사용하여 혼합하는 동안 수성 대 유기 용매의 2:1 비율을 유지시켰다. 혼합 후, LNP를 수집하고, 물에 희석하고 (대략 1:1 v/v), 실온에서 1 시간 동안 유지하고, 최종 버퍼 교환 전에 물로 추가로 희석했다 (대략 1:1 v/v). 50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% (w/v) 수크로스, pH 7.5 (TSS)로의 최종 버퍼 교환이 PD-10 탈염 컬럼 (GE)으로 완료되었다. 필요한 경우, 제제를 Amicon 100 kDa 원심분리 필터(Millipore)로 원심분리하여 농축시켰다. 이후 생성된 혼합물을 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과했다. 최종 LNP를 추가의 사용까지 -80 ℃에서 보관했다.
제제 분석
동적 광산란("DLS")이 본 발명의 다분산 지수("pdi") 및 LNP의 크기를 특징규명하기 위해 사용된다. DLS는 샘플이 광원에 노출되어 발생하는 빛의 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정된 PDI는 집단에서의 입자 크기(대략 평균 입자 크기)의 분포를 나타내며, 완전하게 균일한 집단은 0의 PDI를 갖는다.
전기영동 광산란이 지정된 pH에서 LNP의 표면 전하를 특징분석하기 위해 사용된다. 표면 전하 또는 제타 전위는 LNP 현탁액 중 입자 사이의 정전기적 반발/인력의 크기의 척도이다.
비대칭-유량 필드 흐름 분별 - 다중-각도 광산란(Assymetric-Flow Field Flow Fractionation - Multi-Angle Light Scattering, AF4-MALS)은 수력학적 반경(hydrodynamic radius)에 의해 제제에서 입자를 분리한 다음 분별된 입자의 분자량, 수력학적 반경(hydrodynamic radii) 및 제곱평균제곱근 반경(root mean square radii)을 측정하기 위해 사용된다. 이는 분자량 및 크기 분포 및 이차 특성, 예컨대 Burchard-Stockmeyer 플롯 (입자의 내부 코어 밀도를 암시하는 시간 경과에 따른 제곱평균제곱근("rms") 직경 대 수력학적 반경의 비율) 및 rms 형태 플롯(결과적인 선형 적합의 기울기가 압축 대 신장의 정도를 제공하는 rms 반경의 로그 대 분자량의 로그)을 평가하는 능력을 허용한다.
나노입자 추적 분석(NTA, Malvern Nanosight)이 제제 입자 크기 분포 및 입자 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. LNP 샘플을 적절하게 희석하여 현미경 슬라이드에 주입한다. 입자가 시야를 통해 천천히 주입될 때 카메라가 산란된 빛을 기록한다. 영상이 캡쳐된 후, 나노입자 추적 분석은 픽셀을 추적하고 확산 계수를 계산하여 영상을 처리한다. 이러한 확산 계수는 입자의 수력학적 반경으로 변환될 수 있다. 기기는 또한 분석에서 계산된 개별 입자의 수를 계수하여 입자 농도를 제공한다.
동결-전자 현미경("cryo-EM")을 사용하여 LNP의 입자 크기, 형태, 및 구조적 특징을 결정할 수 있다.
LNP의 지질 조성물 분석은 액체 크로마토그래피에 이어서 하전 에어로졸 검출(LC-CAD)로부터 결정될 수 있다. 이러한 분석은 실제 지질 함량 대 이론적 지질 함량의 비교를 제공할 수 있다.
LNP 제제는 평균 입자 크기, 다분산 지수(pdi), 총 RNA 함량, RNA의 캡슐화 효율, 및 제타 전위에 대해 분석되었다. LNP 제제는 지질 분석, AF4-MALS, NTA, 및/또는 동결-EM에 의해 추가로 특징규명될 수 있다. 평균 입자 크기 및 다분산도는 Malvern Zetasizer DLS 기기를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정된다. LNP 샘플을 DLS로 측정하기 전에 PBS에서 30X 희석했다. 평균 입자 크기의 강도-기반 측정인 Z-평균 직경이 수평균 직경 및 pdi와 함께 보고되었다. LNP의 제타 전위를 측정하기 위해 Malvern Zetasizer 기기가 또한 사용된다. 샘플을 측정 전에 0.1X PBS, pH 7.4에서 1:17로 희석한다 (50 μL가 800 μL로).
총 RNA 농도 및 유리 RNA를 결정하기 위해 형광-기반 분석 (Ribogreen® ThermoFisher Scientific)을 사용한다. 캡슐화 효율은 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로서 계산된다. LNP 샘플을 0.2% Triton-X 100를 함유하는 1x TE 버퍼로 적절하게 희석하여 총 RNA를 결정하거나 또는 1x TE 버퍼로 유리 RNA를 결정한다. 제제를 제조하기 위해 사용된 출발 RNA 용액을 이용하고 1x TE 버퍼 +/- 0.2% Triton-X 100에서 희석하여 표준 곡선을 제조했다. 이후 (제조사의 지침에 따라) 희석된 RiboGreen® 염료를 표준 및 샘플 각각에 첨가하고 빛이 없는 상태에서 대략 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. SpectraMax M5 Microplate Reader (Molecular Devices)는 여기, 자동 차단 및 방출 파장이 각각 488 nm, 515 nm, 및 525 nm으로 설정되어 샘플을 판독하도록 사용된다. 총 RNA 및 유리 RNA는 적절한 표준 곡선으로부터 결정된다.
캡슐화 효율은 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로서 계산된다. DNA-기반 또는 핵산-함유 카르고 성분의 캡슐화 효율을 결정하기 위해 동일한 절차가 사용될 수 있다. 단일-가닥 DNA에 대해 Oligreen Dye가 사용될 수 있고, 이중-가닥 DNA에 대해 Picogreen Dye가 사용될 수 있다.
AF4-MALS는 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 이러한 계산으로부터의 이차 통계를 보기 위해 사용된다. LNP는 적절하게 희석되고 HPLC 오토샘플러를 사용하여 AF4 분리 채널로 주입되고 여기서 초점을 맞춘 다음 채널을 가로지르는 십자 흐름에서 지수 구배(exponential gradient)로 용리된다. 모든 유체는 HPLC 펌프 및 Wyatt Eclipse 기기에 의해 추진된다. AF4 채널로부터 용리되는 입자는 UV 검출기, 다중-각도 광산란 검출기, 준-탄성 광산란 검출기(quasi-elastic light scattering detector) 및 시차 굴절률 검출기(differential refractive index detector)를 통해 흐른다. 원시 데이터는 Debeye 모델을 사용하여 가공되어 검출기 신호로부터 분자량 및 rms 반경을 결정한다.
LNP 중의 지질 성분은 하전 에어로졸 검출기(CAD)에 연결된 HPLC에 의해 정량적으로 분석된다. 4 지질 성분의 크로마토그래피 분리가 역상 HPLC에 의해 달성된다. CAD는 모든 비-휘발성 화합물을 탐지하는 파괴적인 질량-기반 검출기이며 신호는 분석물 구조에 관계없이 일관된다.
Cas9 mRNA 및 gRNA 카르고
Cas9 mRNA 카르고를 시험관내 전사에 의해 제조했다. 1X NLS를 포함하는 캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA(서열 식별 번호:48)를 선형화 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성했다. T7 프로모터 및 100 nt 폴리(A/T) 영역을 포함하는 플라스미드 DNA를 다음 조건: 200 ng/μL 플라스미드, 2 U/μL XbaI(NEB), 및 1x 반응 버퍼에서 37 ℃에서 2 시간 동안 XbaI와 함께 인큐베이션하여 선형화했다. 반응물을 65 ℃에서 20 분 동안 가열하여 XbaI를 불활성화시켰다. 선형화 플라스미드를 실리카 맥시 스핀 컬럼(Epoch Life Sciences)을 사용하여 효소 및 버퍼 염으로부터 정제하고 아가로스 겔로 분석하여 선형화를 확인했다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응을 다음 조건에서 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션했다: 50 ng/μL 선형화 플라스미드; 각각 2 mM의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP (Trilink); 10 mM ARCA (Trilink); 5 U/μL T7 RNA 폴리머레이스 (NEB); 1 U/μL 뮤린 알엔에이스(RNase) 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 대장균 피로포스파테이스 (NEB); 및 1x 반응 버퍼. 4 시간 인큐베이션 후, TURBO 디엔에이스(DNase)(ThermoFisher)를 0.01 U/μL의 최종 농도로 첨가하고, 반응물을 추가 30 분 동안 인큐베이션하여 DNA 주형을 제거했다. Cas9 mRNA를 제조사의 프로토콜(ThermoFisher)에 따라 MegaClear Transcription Clean-up 키트를 사용하여 효소 및 뉴클레오타이드로부터 정제했다. 대안적으로, Cas9 mRNA를 LiCl 침전 방법으로 정제했다.
이 실시예에서 sgRNA는 화학적으로 합성되어 상업적 공급업체로부터 공급받았다. sg282 서열은 하기 제공되고, 하기 제시된 바와 같이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결을 갖는다 (m = 2'-OMe; * = 포스포로티오에이트):
mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU. (서열 식별 번호:42).
LNP
최종 LNP는 상기 제공된 분석 방법에 따라 캡슐화 효율, 다분산 지수, 및 평균 입자 크기를 결정하도록 특징규명되었다.
LNP를 마우스에게 투여하고 (1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 단일 용량) 아래에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위해 게놈DNA를 단리했다.
생체내 LNP 전달
6 내지 10 범위 주령의 CD-1 암컷 마우스를 각 연구에서 사용했다. 그룹 평균 중량을 기준으로 투여 용액을 제조하기 위해 동물을 칭량하고 체중에 따라 그룹화했다. LNP를 측면 꼬리 정맥을 통해 동물당 0.2 mL의 부피(체중 킬로그램당 대략 10 mL)로 투여했다. 동물은 부작용에 대해 투약 후 대략 6 시간에 관찰되었다. 투여 후 24 시간에 체중을 측정하고, 이소플루란 마취에서 심장 천자를 통한 실혈에 의해 다양한 시점에 동물을 안락사시켰다. 혈액을 혈청 분리기 튜브 또는 본원에 기재된 바와 같이 혈장용 완충된 소듐 시트레이트를 포함하는 튜브에 수집했다. 생체내 편집을 포함하는 연구를 위해, DNA 추출 및 분석을 위해 각 동물의 중엽 또는 세 개의 독립적인 엽(예를 들어, 우측 중엽, 좌측 중엽, 및 좌측 측엽)으로부터 간 조직을 수집했다.
마우스의 코호트를 차세대 시퀀싱(NGS) 및 혈청 TTR 수준에 의해 간 편집에 대해 측정했다 (데이터는 나타나지 않음).
트랜스티레틴 (TTR) ELISA 분석
지시된 바와 같이 혈액을 수집하고 혈청을 단리했다. 마우스 프리알부민 (Transthyretin) ELISA 키트 (Aviva Systems Biology, Cat. OKIA00111)를 사용하여 총 마우스 TTR 혈청 수준을 결정했다. 제조사의 프로토콜에 따라 래트 특이적 ELISA 키트(Aviva Systems Biology 카탈로그 번호 OKIA00159)를 사용하여 래트 TTR 혈청 수준을 측정했다. 간단히, 혈청을 10,000-배의 최종 희석까지 키트 샘플 희석제로 연속 희석했다. 이후 이러한 희석된 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가한 다음 지시에 따라 분석을 수행했다.
NGS 시퀀싱
간단히 말해서, 게놈 안의 표적 위체에서 편집 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 게놈 DNA를 단리하고 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하기 위해 딥 시퀀싱을 이용했다.
PCR 프라이머를 표적 자리(예를 들어, TTR) 주위에 설계하고, 관심 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열은 하기에 제공된다. 추가적인 PCR을 제조사의 프로토콜(Illumina)에 따라 수행하여 시퀀싱에 필요한 화학물질(chemistry)을 추가했다. 앰플리콘은 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱되었다. 낮은 품질 점수를 갖는 것을 제거한 후 리드(read)를 인간 참조 게놈 (예를 들어, hg38)에 대해 정렬시켰다. 리드를 포함하는 결과 파일을 참조 게놈(BAM 파일)에 매핑하고, 여기서 관심 표적 영역과 중첩되는 리드가 선택되고 야생형 리드의 수 대 삽입, 치환, 또는 결실을 포함하는 리드의 수르 계산했다.
편집 백분율(예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 퍼센트")은 야생형을 포함하여 서열 리드의 총 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 서열 리드의 총 수로 정의된다.
도 1은 NGS에 의해 측정된 마우스 간에서의 편집 백분율을 나타낸다. 도 1A에 나타난 바와 같이, kg당 1 mg RNA이 투여될 때, 생체내 편집 백분율은 약 20% 내지 60% 이상의 간 편집 범위이다. kg당 0.5 mg 용량, 도 1B에서, 약 10% 내지 60% 간 편집이 관찰되었다. 이러한 마우스 생체내 테스트에서, 모든 조성물은 각 LNP 조성물에 대해 NGS에 의해 측정된 표적 자리에서 활성 CRISPR/Cas 뉴클레이스 활성의 증거와 함께, 간 세포에 효과적으로 Cas9 mRNA 및 gRNA를 전달했다. 5% PEG 지질을 포함하는 LNP는 더 낮은 캡슐화 (데이터는 나타나지 않음), 및 다소 감소된 효능을 갖는다.
실시예 2 - LNP 조성물 분석
LNP의 분석적 특징규명은 증가하는 양의 지질 A 및 PEG-지질로 제제화된 LNP에서 개선된 물리화학적 파라미터를 나타낸다. 2 mol-% 또는 3 mol-% PEG 지질(PEG2k-DMG)을 포함하는 조성물이 하기 표 3에 제공된다.
LNP898 LNP897 LNP966 LNP969
CL/콜레스테롤/DSPC/PEG(이론적 mol-%) 45/44/9/2 45/43/9/3 50/38/9/3 55/33/9/3
mRNA Cas9 서열 식별 번호:48 Cas9
서열 식별 번호:48		 Cas9 U-dep
서열 식별 번호:43		 Cas9 U-dep
서열 식별 번호:43
gRNA G502서열 식별 번호:70 G502
서열 식별 번호:70		 G534
서열 식별 번호:72		 G534
서열 식별 번호:72
N/P 4.5 4.5 6.0 6.0
LNP 제제 - 십자 흐름(Cross Flow)
에탄올 중의 지질을 2 부피의 RNA 용액 및 1 부피의 물과 충돌 제트 혼합(impinging jet mixing)하여 LNP를 형성했다. 에탄올 중의 지질은 2 부피의 RNA 용액과의 혼합 십자가(mixing cross)를 통해 혼합된다. 물의 제4 스트림이 인라인 티(inline tee)를 통해 십자의 출구 흐름과 혼합된다. (WO2016010840 도 2 참조.) LNP를 1 시간 동안 실온에서 유지한 다음, 물로 추가로 희석시켰다 (대략 1:1 v/v). 희석된 LNP를 평판 시트 카트리지 (Sartorius, 100kD MWCO)에서 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 사용하여 농축한 다음 50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% (w/v) 수크로스, pH 7.5 (TSS)로의 정용여과(diafiltration)에 의해 버퍼 교환했다. 대안으로, TSS로의 최종 버퍼 교환을 PD-10 탈염 컬럼(GE)으로 완료했다. 필요한 경우, 제제를 Amicon 100 kDa 원심분리 필터(Millipore)로 원심분리하여 농축시켰다. 이후 생성된 혼합물을 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과했다. 최종 LNP를 추가의 사용까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관했다.
캡핑되고 폴리-아데닐화된 Cas9 U-고갈(Cas9 Udep) mRNA가 서열 식별 번호:43을 포함함을 제외하고, Cas9 mRNA 및 sgRNA를 실시예 1에서와 같이 제조했다. Sg282는 실시예 1에 기재되고, sg534("G534")에 대한 서열이 아래에 제공된다:
mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열 식별 번호:72)
LNP 제제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석되엇다.
평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율의 분석이 표 4에 나타난다. LNP 조성물의 이론적 지질 농도에 추가하여, 지질 분석은 하기 표 5에 나타난 바와 같이 실제 mol-% 지질 수준을 입증했다.
LNP
ID # 		N/P Z-평균
(nm)		 PDI 수 평균 (nm) RNA 농도 (mg/mL) 캡슐화 (%)
LNP898 4.5 87.91 0.030 71.33 1.53 98
LNP897 4.5 74.05 0.036 58.55 1.43 98
LNP966 6.0 82.78 0.010 67.86 2.12 98
LNP969 6.0 92.97 0.042 75.52 2.09 97
LNP
ID # 		지질 비율
(지질 A/콜레스테롤/
DSPC/PEG)
(이론 및 실제)		 지질 A mg/mL
(이론 및 실제)		 콜레스테롤 mg/mL
(이론 및 실제)		 DSPC mg/mL
(이론 및 실제)		 PEG mg/mL
(이론 및 실제)
LNP898 45/44/9/2
46.1/42.6/9.2/2		 18.0
18.3		 8.0
7.7		 3.3
3.4		 2.3
2.4
LNP897 45/43/9/3
44.8/42.9/9.2/3.1		 18.0
17.8		 7.8
7.7		 3.3
3.4		 3.5
3.6
LNP966 50/38/9/350.0/38.0/8.8/3.1 33.4
35.6		 11.5
12.3		 5.6
5.8		 5.8
6.5
LNP969 55/33/9/354.8/33.2/8.8/3.2 33.4
31.6		 9.1
8.7		 5.1
4.7		 5.3
5.4
물리화학적 특성을 추가로 분석하기 위해, LNP897, LNP898, LNP966, 및 LNP969가 비대칭-유량 필드 흐름 분별 - 다중-각도 광산란(AF4-MALS) 분석을 거쳤다. AF4-MALS 기기는 입자 크기 및 분자량 분포를 측정하고, 입자 형태 및 밀도에 대한 정보를 제공한다.
LNP는 HPLC 오토샘플러를 사용하여 AF4 분리 채널로 주입되고 여기서 초점을 맞춘 다음 채널을 가로지르는 십자 흐름에서 지수 구배(exponential gradient)로 용리된다. 모든 유체는 HPLC 펌프 및 Wyatt Eclipse 기기에 의해 추진된다. AF4 채널로부터 용리되는 입자는 UV 검출기, Wyatt Heleos II 다중-각도 광산란 검출기, 준-탄성 광산란 검출기 및 Wyatt Optilab T-rEX 시차 굴절률 검출기를 통해 흐른다. 원시 데이터는 Debeye 모델을 사용하여 Wyatt Astra 7 소프트웨어에서 가공되어 검출기 신호로부터 분자량 및 rms 반경을 결정한다.
LNP에 대한 로그 미분 몰질량 플롯은 도 2A와 같이 제공된다. 간단히 말해서, X-축은 몰질량(g/mol)을 나타내고, Y-축은 미분 수 분율을 나타낸다. 로그 미분 몰질량 플롯은 특정 제제에 대해 측정된 상이한 분자량의 분포를 나타낸다. 이는 제제 내 분자량의 전체 분포뿐만 아니라 분자량의 모드에 대한 데이터를 제공하며, 이는 평균 분자량보다 더 우수한 입자 이질성의 그림을 제공한다.
상이한 LNP 제제의 이질성은 상이한 몰질량 모멘트를 측정하고 무게평균 몰질량(Mw) 대 수평균 몰질량(Mn)의 비율을 계산하여 Mw/Mn의 다분산도를 제공하여 결정된다. 이들 상이한 제제에 대한 다분산도의 그래프가 도 2B에 제공된다.
데이터는 도 2A에 나타나는 바와 같이 N/P 6.0에서 3 mol-% PEG, 및 50 및 55 mol-% 지질 A를 갖는 더 조밀한 입자 분포를 나타낸다. 이는 도 2B에 나타나는 바와 같이 조밀한 다분산도에 반영된다
실시예 3 - AF4 MALS 데이터 - 추가적 제제
LNP의 분석적 특징규명은 증가하는 양의 지질 A로 제제화된 LNP에서 개선된 물리화학적 파라미터를 나타낸다. 45 mol-%, 50 mol-%, 또는 55 mol-% 지질 A를 두 가지 상이한 gRNA와 함께 포함하는 조성물이 하기 표 6에 제공된다.
LNP1021 LNP1022 LNP1023 LNP1024 LNP1025
CL/콜레스테롤/DSPC/PEG(이론적 mol-%) 50/38/9/3 55/33/9/3 45/43/9/3 50/38/9/3 55/33/9/3
mRNA Cas9 Udep
서열 식별 번호:43		 Cas9 Udep
서열 식별 번호:43		 Cas9 Udep
서열 식별 번호:43		 Cas9 Udep
서열 식별 번호:43		 Cas9 Udep
서열 식별 번호:43
gRNA G502
서열 식별 번호:70		 G502
서열 식별 번호:70		 G502
서열 식별 번호:70		 G509
서열 식별 번호:71		 G509
서열 식별 번호:71
N/P 6.0 6.0 4.5 6.0 6.0
LNP는 실시예 2에 기재된 바와 같이 형성되었다.
Cas9 mRNA 및 sgRNA를 위에 기재된 바와 같이 제조했다.
LNP 조성물은 실시예 1에 기재된 바와 같이 캡슐화 효율, 다분산 지수, 및 평균 입자 크기를 결정하기 위해 특징규명되었다.
평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율의 분석이 표 7에 나타난다. LNP 조성물의 이론적 지질 농도에 추가하여, 지질 분석은 하기 표 8에 나타난 바와 같이 실제 mol-% 지질 수준을 입증했다.
LNP
ID # 		N/P Z-평균
(nm)		 PDI 수 평균 (nm) RNA 농도 (mg/mL) 캡슐화 (%)
LNP1021 6.0 83.18 0.027 67.15 1.63 98
LNP1022 6.0 94.08 0.005 78.28 1.60 97
LNP1023 4.5 74.01 0.017 61.11 1.61 97
LNP1024 6.0 85.37 0.002 70.42 1.59 97
LNP1025 6.0 94.47 0.018 77.71 1.60 98
LNP
ID # 		지질 비율
(지질 A/콜레스테롤/
DSPC/PEG)
(이론 및 실제)		 지질 A mg/mL
(이론 및 실제)		 콜레스테롤 mg/mL
(이론 및 실제)		 DSPC mg/mL
(이론 및 실제)		 PEG mg/mL
(이론 및 실제)
LNP1021 50/38/9/3
50.9/37.4/8.6/3.1		 23.6
21.6		 8.1
7.2		 3.9
3.4		 4.1
3.8
LNP1022 55/33/9/3
55.2/33.0/8.7/3.1		 23.6
20.4		 6.4
5.5		 3.6
3.0		 3.7
3.4
LNP1023 45/43/9/345.9/42.4/8.6/3.1 17.7
15.3		 7.7
6.4		 3.3
2.7		 3.4
3.0
LNP1024 50/38/9/350.5/37.9/8.5/3.0 23.6
22.4		 8.1
7.6		 3.9
3.5		 4.1
3.9
LNP1024 55/33/9/3
55.5/33.1/8.5/3.0		 23.6
21.3		 6.4
5.8		 3.6
3.0		 3.7
3.4
물리화학적 특성을 추가로 분석하기 위해, LNP1021, LNP1022, LNP1023, LNP1024 및 LNP1025가 비대칭-유량 필드 흐름 분별 - 다중-각도 광산란(AF4-MALS) 분석을 거쳤다. AF4-MALS 기기는 입자 크기 및 분자량 분포를 측정하고, 입자 형태 및 밀도에 대한 정보를 제공한다.
LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 AF4-MALS에서 실행되었다.
LNP에 대한 로그 미분 몰질량 플롯은 도 3A와 같이 제공된다. 간단히 말해서, X-축은 몰질량(g/mol)을 나타내고, Y-축은 미분 수 분율을 나타낸다. 로그 미분 몰질량 플롯은 특정 제제에 대해 계산된 상이한 분자량의 분포를 나타낸다. 이는 제제 내 분자량의 전체 분포뿐만 아니라 분자량의 모드에 대한 데이터를 제공하며, 이는 평균 분자량보다 더 우수한 입자 이질성의 그림을 제공한다.
평균 분자량은 도 3B에 플로팅된다. 평균 분자량은 전체 분포의 평균이지만 분포의 형상에 대한 정보는 제공하지 않는다. LNP1022 및 LNP1025는 동일한 평균 분자량을 갖지만 LNP1022가 약간 더 넓은 분포를 갖는다.
상이한 LNP 제제의 이질성은 상이한 몰질량 모멘트를 보고 무게평균 몰질량(Mw) 대 수평균 몰질량(Mn)의 비율을 계산하여 Mw/Mn의 다분산도를 제공하여 계산된다. 이들 상이한 제제에 대한 다분산도의 그래프가 도 4A에 제공된다.
또한, LNP 제제의 Burchard-Stockmeyer 플롯이 도 4B에 제공된다. Burchard-Stockmeyer 플롯은 AF4 채널로부터의 제제의 용출에 대한 rms 반경 대 수력학적 반경의 비율을 나타낸다. 이는 지질 나노입자의 내부 밀도에 관한 정보를 제공한다. 도 4B는 LNP1021, LNP1022 및 LNP1023이 이러한 측정에서 상이한 프로파일을 가짐을 나타낸다.
실시예 4 - 증가된 PEG 지질은 감소된 사이토카인 반응으로 효능을 유지함
다른 연구에서, PEG DMG 지질을 2 mol-% 또는 3 mol-%의 PEG 지질을 포함하는 LNP 제제에서 비교했다. 2 mol-%, 또는 3 mol-%, PEG DMG를 포함하는 조성물이 하기 표 9에 제공된다.
LNP809 LNP810
CL/콜레스테롤/DSPC/PEG(이론적 mol-%) 45/44/9/2 45/43/9/3
mRNA Cas9서열 식별 번호:48 Cas9
서열 식별 번호:48
gRNA G390서열 식별 번호:69 G390
서열 식별 번호:69
N/P 4.5 4.5
LNP는 실시예 2에 기재된 공정에 의해 형성되었다.
Cas9 mRNA 및 sgRNA는 하기 제공된 sg390 ("G390")의 서열과 함께 실시예 1에서와 같이 제조되었다:
mG*mC*mC*GAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열 식별 번호:69).
LNP 제제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석되었다.
평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율의 분석이 표 10에 나타난다. LNP 조성물의 이론적 지질 농도에 추가하여, 지질 분석은 하기 표 11:에 나타난 바와 같이 실제 mol-% 지질 수준을 입증했다.
LNP
ID # 		N/P Z-평균
(nm)		 PDI 수 평균 (nm) RNA 농도 (mg/mL) 캡슐화 (%)
LNP809 4.5 89.85 0.060 72.10 2.45 97
LNP810 4.5 75.26 0.025 61.17 2.14 97
LNP
ID # 		지질 비율
(지질 A/콜레스테롤/
DSPC/PEG)
(이론 및 실제)		 지질 A mg/mL
(이론 및 실제)		 콜레스테롤 mg/mL
(이론 및 실제)		 DSPC mg/mL
(이론 및 실제)		 PEG mg/mL
(이론 및 실제)
LNP809 45/44/9/2
45.7/43.3/9.0/2.1		 28.6
30.5		 12.7
13.1		 5.3
5.6		 3.7
4.0
LNP810 45/43/9/3
45.0/42.3/9.7/3.0		 25.2
24.7		 10.9
10.5		 4.7
4.9		 4.9
4.7
래트 혈청 사이토카인을 MCP-1, IL-6, TNF-알파 및 IFN-감마를 분석하는 Luminex 자기 비드 다중 분석(Millipore Sigma, 카탈로그 번호 RECYTMAG-65K의 Milliplex MAP 자기 비드 분석)을 사용하여 평가했다. 분석 비드를 BioRad BioPlex-200에서 판독하고 BioPlex Manager Software 버전 6.1과 함께 4 파라미터 로지스틱 적합을 사용하여 표준 곡선으로부터 사이토카인 농도를 계산했다. 데이터는 도 5에 그래프로 표시된다. 도 5A(혈청 TTR), 도 5B(간 편집), 및 도 5C(사이토카인 p MCP1)를 참조하라.
제조사의 프로토콜에 따라 래트 특이적 ELISA 키트 (Aviva Systems Biology 카탈로그 번호 OKIA00159)를 사용하여 래트 TTR 혈청 수준을 측정했다. 간단히, 혈청을 10,000-배의 최종 희석까지 키트 샘플 희석제로 연속 희석했다. 이후 이러한 희석된 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가한 다음 지시에 따라 분석을 수행했다.
게놈 DNA를 대략 10 mg의 간 조직으로부터 단리하고 위에 기재된 바와 같이 NGS를 사용하여 분석했다. 증폭을 위한 PCR 프라이머 서열은 아래 기재된다.
도 5A 및 도 5B는 혈청 TTR 녹다운 및 간 편집이 2 mol-% 및 3 mol-% PEG 제제에서 충분함을 나타낸다. 도 5C는 3 mol-% PEG 제제를 사용하여 MCP-1 반응이 감소됨을 나타낸다.
실시예 5 - 비-인간 영장류로의 LNP 전달
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 LNP 제제로 세 가지 연구를 수행했다. 특정 몰량 및 카르고가 표 12-26에 제공된다. Cas9 mRNA 및 가이드 RNA(gRNA)를 함유하는 각각의 제제는 중량으로 1:1의 mRNA:gRNA 비율을 가졌다. LNP의 용량(mg/kg, 총 RNA 함량), 투여 경로 및 동물이 덱사메타손의 전처리를 받았는지 여부가 표에 나타난다. 덱사메타손(Dex) 전처리를 받은 동물의 경우, Dex가 LNP 또는 비히클 투여 1 시간 전에 IV 일시 주사에 의해 2 mg/kg로 투여되었다.
혈액 화학 분석을 위해, 측정된 각각의 인자에 대해 하기 표에 나타난 바와 같이 때때로 동물로부터 혈액을 채취했다. 사이토카인 유도는 전처리 및 후처리 NHP에서 측정되었다. 억제되고 의식이 있는 동물의 말초 정맥으로부터 최소 0.5 mL의 전혈을 4 mL 혈청 분리기 튜브로 수집했다. 혈액을 최소 30 분 동안 실온에서 응고시키고 이어서 2000 xg에서 15 분 동안 원심분리했다. 혈청을 각각 120 μL의 2 개의 폴리프로필렌 마이크로튜브에 분취하고 분석할 때까지 -60 내지 -86 ℃에서 보관했다. 분석을 위해 Meso Scale Discovery(MSD)의 비인간 영장류 U-Plex 사이토카인 커스텀 키트를 사용했다. IL-6 및 MCP-1에 초점을 맞추어 다음 파라미터가 분석 INF-g, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, MCP-1 및 TNF-a에 포함되었다. 키트 시약 및 표준물질은 제조업체의 프로토콜에 따라 준비되었다. NHP 혈청을 순수(neat)하게 사용했다. 플레이트를 MSD Discovery work bench 소프트웨어 버전 4012로 수행한 분석과 함께 MSD Sector Imager 6000에서 작동시켰다.
효소 면역분석법에 의해 처리 전 및 처리 후 동물에서 보체 수준을 측정했다. 억제되고 의식이 있는 동물의 말초 정맥으로부터 전혈(0.5 mL)을 0.5 mL k2EDTA를 포함하는 튜브로 수집했다. 혈액을 2000 xg에서 15 분 동안 원심분리했다. 혈장을 각각 120 μL의 2 개의 폴리프로필렌 마이크로튜브에 분취하고 분석할 때까지 -60 내지 -86 ℃에서 보관했다. Quidel MicroVue Complement Plus EIA 키트 (C3a -Cat # A031) 또는 (Bb-Cat # A027)를 분석에 사용했다. 키트 시약 및 표준물질은 제조업체의 프로토콜에 따라 준비되었다. 플레이트를 450 nm에서 광학 밀도로 MSD Sector Imager 6000에서 작동시켰다. 결과는 4-파라미터 곡선 맞춤을 사용하여 분석되었다.
사이토카인 유도 및 보체 활성화에 대한 데이터가 하기 표에 제공된다. "BLQ"는 정량 한계 미만을 의미한다.
표 12. 연구 1.
처리군 몰비 (각각 지질 A, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG N:P 카르고 샘플 크기 (n) 경로 용량 수준, 총 RNA 함량 (mg/kg) Dex
(1) TSS (비히클) n/a n/a n/a 3 IV - 주입 n/a 아니오
(2) LNP699 G502 45/44/9/2 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 3 IV - 주입 3 아니오
(3) LNP688 G506 45/44/9/2 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000506 3 IV - 주입 3 아니오
(4) LNP689 G509 45/44/9/2 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000509 3 IV - 주입 3 아니오
(5) LNP690 G510 45/44/9/2 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000510 3 IV - 주입 3 아니오
표 13. 연구 2.
처리군 몰비 (각각 지질 A, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG N:P 카르고 샘플 크기 (n) 경로 용량 수준, 총 RNA 함량 (mg/kg) Dex
(1) TSS (비히클) n/a n/a 1 IV-일시 n/a 네
(2) TSS (비히클) n/a n/a 1 IV-일시 n/a 아니오
(3) LNP898 G502 45/44/9/2 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 1 IV - 주입 3 네
(4) LNP898 G502 45/44/9/2 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 1 IV - 주입 3 아니오
(5) LNP897 G502 45/43/9/3 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 1 IV-일시 3 네
(6) LNP897 G502 45/43/9/3 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 1 IV-일시 3 아니오
(7) LNP897 G502 45/43/9/3 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 1 IV - 주입 3 네
(8) LNP897 G502 45/43/9/3 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:2); G000502 1 IV - 주입 3 아니오
(9)LNP916 GFP 45/43/9/3 4.5 eGFP mRNA (서열 식별 번호:) 1 IV - 주입 6 네
(10)
LNP916 GFP		 45/43/9/3 4.5 eGFP mRNA (서열 식별 번호:) 1 IV - 주입 6 아니오
표 14. 연구 3.
처리군 몰비 (각각 지질 A, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG N:P 카르고 샘플 크기 (n) 경로 용량 수준, 총 RNA 함량 (mg/kg) Dex
(1) TSS n/a n/a n/a 3 IV-일시 n/a 아니오
(2) LNP1021 G502 50/38/9/3 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000502 3 IV-일시 1 아니오
(3) LNP1021 G502 50/38/9/4 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000502 1 IV-일시 1 네
(4) LNP1022 G502 55/33/9/3 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000502 3 IV-일시 1 아니오
(5) LNP1023 G502 45/43/9/3 4.5 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000502 3 IV-일시 3 아니오
(6) LNP1024 G509 50/38/9/3 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000509 3 IV-일시 1 아니오
(7) LNP1024 G509 50/38/9/4 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000509 1 IV-일시 1 네
(8) LNP1025 G509 55/33/9/3 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000509 3 IV-일시 1 아니오
(9) LNP1021 G502 50/38/9/3 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000502 1 IV-일시 3 아니오
(10) LNP1022 G502 50/38/9/3 6 Cas9 mRNA (서열 식별 번호:1); G000502 1 IV-일시 3 아니오
표 15. 연구 1의 IL-6 측정.
처리군 사전 출혈 6 시간 24 시간
(1) TSS (비히클) 5.71±2.70 29.1±20.37 7.05±3.49
(2) LNP699 G502 9.73±8.34 1296.41±664.71 5.43±7.68
(3) LNP688 G506 16.83±4.08 1749.47±1727.22 38.57±39.39
(4) LNP689 G509 18.11±11.51 1353.49±766.66 32.42±18.40
(5) LNP690 G510 13.95±1.85 11838±17161.74 90.07±96.02
표 16. 연구 1의 MCP-1 측정.
처리군 사전 출혈 6 시간 24 시간
(1) TSS (비히클) 810.49±178.27 1351.16±397.31 745.25±56.49
(2) LNP699 G502 842.31±350.65 19298.49±11981.14 2092.89±171.21
(3) LNP688 G506 1190.79±383.64 13500.17±12691.60 1414.71±422.43
(4) LNP689 G509 838.63±284.42 14427.7±8715.48 1590±813.23
(5) LNP690 G510 785.32±108.97 52557.24±48034.68 6319.77±983.37
표 17. 연구 1의 보체 C3a측정.
처리군 사전 출혈 6 시간 7 일
(1) TSS (비히클) 23.9±11.95 25.51±14.79 30.67±18.36
(2) LNP699 G502 32.36±11.29 94.33±58.45 38.50±12.69
(3) LNP688 G506 22.30±1.73 127.00±22.34 37.80±6.86
(4) LNP689 G509 35.83±21.94 174.00±44.51 50.83±21.92
(5) LNP690 G510 36.30±8.21 163.00±40.60 42.50±12.44
표 18. 연구 1의 보체 bb 측정.
처리군 04-bb 사전 출혈 6 시간 7 일
(1) TSS (비히클) 대조군 1.53±0.19 3.37±2.13 1.43±0.71
(2) LNP699 G502 G502 1.45±0.39 9.01±5.28 1.57±0.54
(3) LNP688 G506 G506 1.45±0.78 11.78±2.33 1.78±0.84
(4) LNP689 G509 G509 1.95±0.99 15.73±2.23 2.83±0.88
(5) LNP690 G510 G510 2.12±0.44 13.57±1.23 2.21±0.72
표 19. 연구 2의 IL-6 측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS (비히클) 1.77 11.46 4.2 2.76 3.01
(2) TSS (비히클) 5.23 18.11 20.36 13.2 6.36
(3) LNP898 G502 2.02 1305.75 1138.22 383.32 16.02
(4) LNP898 G502 2.34 37.19 91.59 14.11 3.07
(5) LNP897 G502 2.1 55.79 6.89 2.26 2.01
(6) LNP897 G502 6.8 10.1 44.72 5.4 2.01
(7) LNP897 G502 1.97 44.87 32.61 2.97 1.11
(8) LNP897 G502 3.14 37.68 73.41 8.58 2.22
(9) LNP916 GFP 1.6 BLQ 95.32 27.58 BLQ
(10) LNP916 GFP 2.43 BLQ 883.01 66.71 BLQ
표 20. 연구 2의 MCP-1 측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS (비히클) 312.12 197.24 145.36 177.02 403.82
(2) TSS (비히클) 232.44 175.08 187.72 136.64 325.69
(3) LNP898 G502 249.1 2183.5 1814.64 1887.41 372.38
(4) LNP898 G502 349.51 430.49 5635.55 953.05 236.6
(5) LNP897 G502 492.3 989.98 409.08 302.97 506.82
(6) LNP897 G502 283.79 225.1 1141.08 484.59 259.46
(7) LNP897 G502 223.16 349.79 398.57 172.67 287.09
(8) LNP897 G502 584.42 853.51 3880.81 1588.46 692.99
(9) LNP916 GFP 325.84 BLQ 1189.97 2279.82 BLQ
(10) LNP916 GFP 175.47 BLQ 3284.16 2023.53 BLQ
표 21. 연구 2의 보체 C3a측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS (비히클) 0.087 0.096 0.048 0.033 0.038
(2) TSS (비히클) 0.369 0.311 0.146 0.1 0.106
(3) LNP898 G502 0.087 0.953 0.647 0.277 0.065
(4) LNP898 G502 0.099 0.262 0.123 0.049 0.044
(5) LNP897 G502 0.067 0.479 0.209 0.036 0.036
(6) LNP897 G502 0.141 0.433 0.34 0.11 0.074
(7) LNP897 G502 0.1 0.345 0.396 0.096 0.127
(8) LNP897 G502 0.261 0.458 0.409 0.244 0.313
(9) LNP916 GFP 0.149 BLQ 0.714 0.382 BLQ
(10) LNP916 GFP 0.117 BLQ 0.752 0.723 BLQ
표 22. 연구 2의 보체 bb 측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS (비히클) 0.087 0.096 0.048 0.033 0.038
(2) TSS (비히클) 0.369 0.311 0.146 0.1 0.106
(3) LNP898 G502 0.087 0.953 0.647 0.277 0.065
(4) LNP898 G502 0.099 0.262 0.123 0.049 0.044
(5) LNP897 G502 0.067 0.479 0.209 0.036 0.036
(6) LNP897 G502 0.141 0.433 0.34 0.11 0.074
(7) LNP897 G502 0.1 0.345 0.396 0.096 0.127
(8) LNP897 G502 0.261 0.458 0.409 0.244 0.313
(9) LNP916 GFP 0.149 BLQ 0.714 0.382 BLQ
(10) LNP916 GFP 0.117 BLQ 0.752 0.723 BLQ
표 23. 연구 3의 IL-6 측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS 1.89±0.97 2.56±1.41 0.90±0.71 BLQ 0.08
(2) LNP1021 G502 210±0.35 7.44±5.16 6.94±8.45 1.07±1.11 1.76±0.98
(3) LNP1021 G502 0.79 2.96 4.25 0.67 0.27
(4) LNP1022 G502 1.54±1.32 20.42±31.60 13.94±10.10 0.98±0.41 2.04±0.65
(5) LNP1023 G502 2.92±1.68 6.28±7.18 6.06±2.31 3.62±4.68 2.00±1.21
(6) LNP1024 G509 1.43±0.62 2.64±1.92 7.72±11.96 0.45±0.19 0.88±0.79
(7) LNP1024 G509 1.35±0.74 2.64±2.35 1.71±0.41 0.36±0.58 0.51±0.32
(8) LNP1025 G509 1.64 2.68 25.65 0.58 2.00
(9) LNP1021 G502 0.56 6.15 28.80 0.85 0.61
(10) LNP1022 G502 1.76 8.66 2907.86 11.26 1.72
표 24. 연구 2의 MCP-1 측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS 204.01±46.39 197.62±19.54 310.84±45.87 179.07±20.77 234.61±71.79
(2) LNP1021 G502 303.67±36.37 337.63±195.18 755.20±581.45 339.75±206.20 214.82±40.81
(3) LNP1021 G502 229.30 358.10 3182.00 413.56 178.30
(4) LNP1022 G502 393.63±187.81 467.72±221.61 1852.94±2199.66 497.12±412.30 382.19±67.27
(5) LNP1023 G502 213.72±8.85 196.18±62.81 1722.18±1413.90 197.83±74.01 156.16±18.87
(6) LNP1024 G509 237.76±96.36 210.37±95.17 468.53±250.42 22.32±69.06 141.20±71.90
(7) LNP1024 G509 207.36 183.07 1885.66 235.70 163.11
(8) LNP1025 G509 259.57±112.98 299.21±304.89 1193.10±974.04 258.82±88.53 219.86±219.86
(9) LNP1021 G502 199.29 286.04 2001.23 197.57 196.44
(10) LNP1022 G502 305.81 970.65 7039.06 8379.05 203.47
표 25. 연구 3의 보체 C3a측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS 42.47±10.30 55.40±13.58 29.30±14.46 41.70±23.65 27.43±12.43
(2) LNP1021 G502 34.37±0.50 86.50±3.66 90.07±4.85 56.60±2.25 32.53±0.93
(3) LNP1021 G502 34.30 128.00 93.30 33.40 28.20
(4) LNP1022 G502 41.55±13.51 151.37±109.98 82.00±31.82 45.57±18.58 32.77±6.45
(5) LNP1023 G502 31.67±3.19 74.40±22.08 74.13±48.61 33.83±9.75 27.70±8.05
(6) LNP1024 G509 56.60±25.61 100.37±77.95 74.73±70.15 55.20±48.34 49.97±39.94
(7) LNP1024 G509 33.80 33.90 33.70 26.10 20.90
(8) LNP1025 G509 39.90±13.01 75.73±1.38 46.13±30.56 25.00±3.80 23.90±7.18
(9) LNP1021 G502 34 85.70 133.00 62.00 25.50
(10) LNP1022 G502 29.8 68.10 113.00 71.70 23.30
표 26. 연구 3의 보체 bb 측정.
처리군 사전 출혈 90 분 6 시간 24 시간 7 일
(1) TSS 1.46±0.70 2.18±0.78 1.96±0.64 0.945±0.15 1.34±0.50
(2) LNP1021 G502 1.77±0.60 6.51±3.66 11.00±4.85 3.59±2.25 2.07±0.93
(3) LNP1021 G502 1.24 2.90 11.50 2.97 1.24
(4) LNP1022 G502 1.52±0.34 5.67±2.28 10.2±3.36 3.66±1.68 1.84±0.24
(5) LNP1023 G502 1.65±0.94 4.4±1 7.68±4.67 2.64±1.18 2.08±1.32
(6) LNP1024 G509 1.61±0.13 4.52±1.81 4.50±3.22 1.63±0.84 1.63±0.32
(7) LNP1024 G509 0.96 2.99 2.64 1.13 1.07
(8) LNP1025 G509 1.37±0.17 4.9±4.51 3.79±3.84 1.66±1.43 1.35±0.44
(9) LNP1021 G502 1.41 5.67 11.50 4.64 1.38
(10) LNP1022 G502 1.28 5.22 14.10 5.64 1.87
실시예 6 - PEG 지질 스크린
다른 연구에서, 대안의 PEG 지질을 2 mol-% 또는 3 mol-%의 PEG 지질을 포함하는 LNP 제제에서 비교했다.
세 가지 PEG 지질이 연구에서 사용되었다: 지질 1 (DMG-PEG2k; Nof)은 다음과 같이 나타나고:
Figure pct00005
Heyes, et al., J. Controlled Release, 107 (2005), pp. 278-279 ("Synthesis of PEG2000-C-DMA" 참조)에 기재된 바와 같이 합성된 지질 2는 다음과 같이 나타나고:
Figure pct00006
WO2016/010840 (화합물 S027, 단락 [00240] 내지 [00244] 참조) 및 WO2011/076807에 개시된 지질 3은 다음과 같이 나타날 수 있다:
Figure pct00007
.
지질 A를 각각의 PEG 지질로써 2 mol-% 및 3 mol-%로 제제화했다. 지질 나노입자 성분을 상기 제시된 지질 성분 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. 요약하면, RNA 카르고를 25 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.0에서 제조하여, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카르고 농도가 되었다. LNP는 약 4.5의 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비, 중량으로 1:1의 mRNA 대 gRNA의 비율로 제제화되었다.
LNP # LNP
784 		LNP
785 		LNP
786 		LNP
787 		LNP
788 		LNP
789
CL/콜레스테롤/DSPC/PEG
(이론적 mol-%)		 45/44/9/2 45/43/9/3 45/44/9/2 45/43/9/3 45/44/9/2 45/43/9/3
mRNA Cas9 서열 식별 번호:48 Cas9 서열 식별 번호:48 Cas9 서열 식별 번호:48 Cas9 서열 식별 번호:48 Cas9 서열 식별 번호:48 Cas9 서열 식별 번호:48
gRNA G282 서열 식별 번호:42 G282 서열 식별 번호:42 G282 서열 식별 번호:42 G282, 서열 식별 번호:42 G282, 서열 식별 번호:42 G282 서열 식별 번호:42
PEG 유형 지질 1 지질 1 지질 2 지질 2 지질 3 지질 3
N/P 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
Cas9 mRNA, sg282, 및 LNP를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조했다.지질 1, 지질 2, 또는 지질 3을 포함하는 LNP 조성물을 암컷 CD-1 마우스에게 투여하고 1 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 체중으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가했다 마우스의 코호트를 실시예 1의 방법에 따른 차세대 시퀀싱 (NGS) 및 혈청 TTR 수준에 의해 간 편집에 대해 측정했다.
도 6A 및 도 6B는 PEG 지질 제제 사이의 혈청 TTR 수준을 비교한다. 도 6A는 혈청 TTR을 μg/mL로 나타내고, 도 6B는 녹다운 퍼센트(%TSS)로서 데이터를 나타낸다. 도 6C는 간에서 달성된 편집 퍼센트를 나타낸다. 데이터는 테스트된 PEG 지질 각각을 갖는 LNP 조성물이 2 mol-% 및 3 mol-%에서 효능을 테스트했고, 지질 1이 지질 2 및 지질 3보다 약간 더 일관되게 수행함을 나타낸다.
실시예 7 - 지질 A 유사체
지질 A의 다수의 구조적 유사체를 본원에 기재된 LNP 조성물에서 합성하고 테스트했다.
합성: 지질 A는 4,4-비스(옥틸옥시)부탄산(WO2015/095340의 실시예 13에서 "중간체 13b")을 (9Z,12Z)-3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트("중간체 13c")와 반응시키고, 그 후 중간체 13b 및 중간체 13c의 생성물을 3-디에틸아미노-1-프로판올과 반응시켜 헤드 그룹을 첨가하여 제조된다. (WO2015/095340의 pp 84-86을 참조하라.)
WO2015/095340의 중간체 13b(4,4 비스(옥틸옥시)부탄산)를 다음과 같이 4,4-비스(옥틸옥시)부탄니트릴을 통해 합성했다:
중간체 13a: 4,4-비스(옥틸옥시)부탄니트릴
Figure pct00008
4,4-디에톡시부탄니트릴 (9.4 g, 60 mmol) 및 옥탄-1-올 (23.1 g, 178 mmol)의 혼합물에 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 (748 mg, 3.0 mmol)를 rt에서 첨가했다. 혼합물을 105℃로 가온하고 반응 용기를 공기 중에 개방하고 환류 응축기가 장착되지 않은 상태에서 18 시간 동안 교반했다. 이후 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 실리칼 겔에서 정제하여 (헥산 중의 에틸 아세테이트의 0-5% 구배) 10.1 g (31.0 mmol)의 중간체 13a를 투명한 오일로 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.55 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.63 - 1.50 (m, 4H), 1.38 - 1.19 (m, 20H), 0.93 - 0.82 (m, 6H) ppm.
다음으로, 에탄올 (30 mL) 중의 중간체 13a (8.42 g, 31 mmol)의 용액에 31 mL의 수성 포타슘 하이드록사이드 (2.5 M, 30.9 mL, 77.3 mmol)를 실온에서 첨가했다. 용기에 환류 응축기를 장착하고, 혼합물을 110 ℃까지 가열하고 24 시간 동안 교반했다. 이후 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 수성 하이드로클로라이드 산 (1N)으로 pH 5로 산성화하고, 헥산으로 3 회 추출했다. 조합된 유기 추출물을 물 (2 회) 및 염수(brine)로 세척하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, 진공에서 농축시켜 8.15 g (23.6 mmol)의 중간체 13b를 투명한 오일로 수득했고, 이를 추가의 정제 없이 사용했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.50 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.57 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.41 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.92 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.56 (m, 4H), 1.37 - 1.21 (m, 20H), 0.92 - 0.83 (m, 6H) ppm (하기 구조).
중간체 13b
Figure pct00009
상기 기재된 방법을 사용하여, 중간체B3-F3로 지칭되고 아래에 도시된 C(5, 6, 7, 9, 및 10)-아세탈 산 중간체를 적절한 알칸-1-올 시약을 사용하여 제조했다.
중간체 B3 4,4-비스(펜틸옥시)부탄산
Figure pct00010
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.52 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.58 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.41 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.45 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.57 (m, 4H), 1.32 (m, J = 3.7 Hz, 8H), 0.95 - 0.83 (m, 6H) ppm.
중간체 C3: 4,4-비스(헥실옥시)부탄산
Figure pct00011
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.44 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.49 (dt, J = 9.3, 6.9 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.8 Hz, 2H), 2.12 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.79 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.54 (m, 4H), 1.29 (m, 12H), 0.94 - 0.82 (m, 6H) ppm.
중간체 D3: 4,4-비스(헵틸옥시)부탄산
Figure pct00012
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.85 (br s, 1H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.52 (dt, J = 9.4, 6.8 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.8 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.85 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.53 (m, 4H), 1.29 (m, 16H), 0.94 - 0.80 (m, 6H) ppm.
중간체 E3: 4,4-비스(노닐옥시)부탄산
Figure pct00013
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.32 (br s, 1H), 4.44 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.49 (dt, J = 9.3, 6.9 Hz, 2H), 3.38 (dt, J = 9.4, 6.9 Hz, 2H), 2.10 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.78 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.53 (m, 4H), 1.27 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm.
중간체 F3: 4,4-비스(데실옥시)부탄산:
Figure pct00014
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.42 (m, 2H), 2.29 (dd, J = 10.8, 7.5 Hz, 2H), 1.90 - 1.82 (m, 2H), 1.55 (m, 4H), 1.27 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H) ppm.
지질 A의 아세탈 유사체 (C(8))를 C(5, 6, 7, 9, 또는 10)-아세탈 산 중간체 (B3-F3)를 중간체 13c과 반응시키고, 그 후 그 단계의 생성물을 3-디에틸아미노-1-프로판올과 반응시켜 합성했다. (WO2015/095340의 pp 84-86을 참조하라.) 각 유사체를 합성하고 1H NMR (데이터는 나타나지 않음)로 특징규명했다.
C7, C9, 및 C10 유사체를 45 mol-% 지질 A 유사체, 2 mol-% DMG-PEG2k, 9 mol-% DSPC, 및 44 mol-% 콜레스테롤에서, 4.5의 N:P 비율로 제제화했다. 각 유사체를 또한 55 mol-% 지질 A 유사체, 2.5 mol-% DMG-PEG2k, 9 mol-% DSPC, 및 38.5 mol-% 콜레스테롤에서, 6의 N:P 비율로 제제화했다. 지질 나노입자 성분을 상기 제시된 지질 성분 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. RNA 카르고를 25 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.0에서 제조하여, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카르고 농도가 되었다.
RNA 카르고는 위에 기재된 바와 같이 제조된 서열 식별 번호:43 및 sg282를 포함하는 Cas9 mRNA를 포함했다. LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 형성되었다.
C(5) 및 C(6) 지질 A 유사체를 포함하는 LNP 조성물을 포함하는 아세탈 유사체의 확장된 패널을 이전 패널과 함께 테스트했다. 두 가지 새로운 유사체를 위에 기재된 바와 같이 55 mol-% 지질 A 유사체, 2.5 mol-% DMG-PEG2k, 9 mol-% DPSC, 및 33.5 mol-% 콜레스테롤에서, 6의 N/P 비율로 제제화했다. 분석은 모든 LNP의 크기가 120 nm 미만이고, PDI가 0.2 미만이고 캡슐화된 RNA %가 80% 초과임을 나타냈다. 제제에 대한 분석 결과는 하기 표 28에 있다.
LNP ID 지질 A 유사체 유사체 mol-% PEG% N/P RNA
농도
(mg/mL) 		%EE Z-평균 (nm) PDI 수 평균 (nm)
LNP 1122 C5 유사체
(LP000030-001)		 55 2.5 6 0.063 88 118.8 0.103 88.17
LNP 1123 C6 유사체(LP000031-001) 55 2.5 6 0.067 95 107.6 0.038 88.1
LNP 1004 C7 유사체
(LP000020-001)		 55 2.5 6 0.068 98 100 0.012 81.55
LNP 1002 LP000001-011 55 2.5 6 0.067 98 95.06 0.01 78.95
LNP 1006 C9 유사체(LP000021-001) 55 2.5 6 0.067 97 95.43 0.022 80.35
LNP 1008 C10 유사체
(LP000022-001)		 55 2.5 6 0.069 95 103.9 0.008 86.79
물에 용해된 6-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산 ("TNS")을 사용하여 pKa에 대해 유사체를 평가했다. 이 분석에서 0.1 M 포스페이트 버퍼를 4.5 내지 10.5 범위의 상이한 pH 값에서 제조했다. 각각의 유사체를 100% 에탄올에서 개별적으로 제조했다. 이후 지질 및 TNS를 개별 pH 버퍼에 첨가하고 플레이트로 옮겨 321-488 nm 파장에서 SpectraMax 플레이트 판독기에서 분석했다. pKa를 생성하기 위해 값을 플로팅했고, logIC50을 pKa로서 사용한다.
실시예 1에 기재된 바에 따라 암컷 CD-1 마우스에게 0.3 mg/kg (도 7A-도 7E), 또는 kg당 0.1 mg (도 7F-도 7G) 투여했다. 요약하면, 그룹당 n=5인 Charles River Laboratories의 CD-1 암컷 마우스에 다양한 용량으로 LNP 조성물을 투여했다. 부검에서 (투여 후 7 일), TTR 분석을 위해 혈청을 수집하고 편집 분석을 위해 간을 수집했다. 혈청 TTR 및 편집 퍼센트 분석을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행했다. 도 7A-도 7E의 혈청 TTR 수준 및 간 편집은 모든 유사체가 체중 킬로그램당 0.3 밀리그램에서 지질 A에 필적하게 수행했음을 나타낸다. 도 7F-도 7G는 지질 A가 가장 높은 효능을 가지지만, 새로 합성된 유사체가 모두 적합한 TTR 녹다운 및 간 편집을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 8 - 용량 반응 곡선 - 일차 시노 간세포
일차 간 간세포. 일차 시노몰구스 간 간세포(PCH)(Gibco)를 해동하고 보충제(Gibco, Cat. CM7000)를 포함한 간세포 해동 배지에 재현탁시킨 후 80 g에서 4 분 동안 원심분리했다. 상청액을 버리고 펠렛화된 세포를 간세포 플레이팅 배지 더하기 보충제 팩 (Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM3000)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 50,000 세포/웰의 밀도로 Bio-코트 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트 (ThermoFisher, Cat. 877272)에 플레이팅했다. LNP 투여 전에 플레이팅된 세포를 조직 배양 인큐베이터 (37℃ 및 5% CO2 대기)에서 24 시간 동안 침강 및 부착시켰다. 인큐베이션 후 세포를 단층 형성으로 확인하고 배지를 간세포 배양 배지를 무혈청 보충제 팩(Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM4000)로 교체했다.
이 연구를 위한 LNP 제제(LNP1021, LNP1022, LNP1023, LNP1024, LNP1025, 및 LNP897)를 위에 기재된 바와 같이 제조했다.
변형된 sgRNA를 포함하는 다양한 용량의 지질 나노입자 제제를 일차 시노 간세포에서 테스트하여 용량 반응 곡선을 생성했다. 플레이팅 및 24 시간 배양 후, LNP를 6% 시노 혈청을 함유하는 간세포 유지 배지에서 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 LNP를 100 ng mRNA에서 시작하여 8 점 2-배 용량 반응 곡선에서 일차 사이노 간세포에 첨가했다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위한 처리 후 72 시간에 세포를 용해시켰다. 다양한 LNP 조성물에 대해 편집 퍼센트를 측정했고 데이터는 도 8A에 그래프로 나타난다. Cas9 mRNA(서열 식별 번호 48) 및 U-고갈된 Cas9 mRNA(SEQ I NO:43)에 의한 편집 %가 도 8B에 제시된다. LNP 조성물은 표 2(LNP 897) 및 표 5(LNP 1021, 1022, 1023, 1024, 및 1025)에 기재되어 있다.
결과는 비교 효능 평가에 대한 정량 분석을 보여주며, mRNA 및 LNP 조성물 두 가지 모두 효능에 영향을 준다는 것을 입증한다.
실시예 9 - RNA 카르고: mRNA 및 gRNA 공제제
이 연구는 gRNA 대 mRNA의 상이한 비율의 마우스에서 생체내 효능을 평가했다. 서열 식별 번호: 4의 ORF, HSD 5' UTR, 인간 알부민 3' UTR, 코작 서열, 및 폴리-A 테일을 갖는 CleanCap™ 캡핑된 Cas9 mRNA를 우리딘 트리포스페이트 대신 N1-메틸슈도우리딘 트리포스페이트를 사용하여 실시예 1에서 지시된 바와 같이 IVT 합성에 의해 제조했다.
50:38:9:3 몰비의 지질 A, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG 및 6의 N:P 비율을 갖는, 실시예 2에 기재된 바와 같은 기재된 mRNA 및 sg282(서열 식별 번호: 42; G282)로부터 제조된 LNP 제제. 제제의 gRNA:Cas9 mRNA 중량비가 표 29에 나타났다.
LNP ID 가이드 : Cas9 mRNA 비율 (w/w) RNA 농도 (mg/mL) EE (%) Z-평균 크기 (nm) 입자 PDI 수 평균 (nm)
1110 8:1 0.92 99 69.52 0.022 56.47
1111 4:1 0.86 97 76.65 0.065 57.36
1112 2:1 0.90 99 76.58 0.036 63.11
1113 1:1 0.97 99 76.60 0.071 58.92
1114 1:2 1.05 99 76.34 0.018 62.82
1115 1:4 0.65 99 82.64 0.018 66.63
1116 1:8 0.75 100 82.01 0.039 65.05
생체내 특징규명을 위해, 상기 LNP는 kg당 0.1 mg 총 RNA(mg 가이드 RNA + mg mRNA)로 마우스에게 투여되었다 (그룹당 n=5). 투여 후 7 내지 9 일에, 동물을 희생시키고, 혈액 및 간을 수집하고, 혈청 TTR 및 간 편집을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정했다. 혈청 TTR 및 간 편집 결과는 도 9A 및 9B에 나타난다. 음성 대조군 마우스에 TSS 비히클을 투여했다.
또한, 상기 LNP를 kg당 0.06 mg 내지 kg당 0.4 mg로 gRNA 용량을 변화시키면서 kg당 0.05 mg mRNA의 일정 mRNA 용량에서 마우스에게 투여했다 (그룹당 n=5). 투여 후 7 내지 9 일에, 동물을 희생시키고, 혈액 및 간을 수집하고, 혈청 TTR 및 간 편집을 측정했다. 혈청 TTR 및 간 편집 결과는 도 9C 및 도 9D에 나타난다. 음성 대조군 마우스에 TSS 비히클을 투여했다.
실시예 10 - 중성 지질
LNP의 생체내 효능을 평가하기 위해, LNP 제제는 실시예 2에 기재된 바와 같이 실시예 2의 mRNA 및 sg534(서열 식별 번호: 72; G534)로써 제조되었다. 지질 나노입자 성분을 하기 제시된 지질 성분 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. 간단히 말하면, RNA 카르고는 pH 5.0에서 25 mM 시트레이트 및 100 mM NaCl의 버퍼에서 제조되어, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카르고 농도가 되었다. LNP는 약 6의 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비로 중량으로 1:2 gRNA 대 mRNA의 비율로 제제화되었다.
LNP 제제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석되엇다. 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율의 분석이 표 30에 나타난다. 지질의 몰비는 아민 지질 (지질 A)/중성 지질/헬퍼 지질 (콜레스테롤)/PEG 지질 (PEG2k-DMG)로서 제공된다. 중성 지질은 명시된 바와 같이 DSP, DPPC이거나 부재했다.
표 30. LNP 조성물 및 데이터. (지질의 몰비는 아민 지질 (지질 A)/중성 지질/헬퍼 지질 (콜레스테롤)/PEG 지질 (PEG2k-DMG)로 제공됨.)
샘플 ID 중성 지질 몰비 RNA
농도
(mg/mL) 		%EE Z-평균 (nm) PDI 수 평균 (nm) 간 편집 % 혈청 TTR (μg/mL) % TTR KD
TSS 대조군 0.0 1248.9
CO241 - 50.0/0.0/47.0/3.0 1.46 94 75.64 0.090 54.21 1.8 1070.2 14.3
CO242 - 59.0/0.0/38.0/3.0 1.51 94 92.25 0.019 75.56 12.0 819.6 34.4
CO243 - 54.5/0.0/42.5/3.0 1.62 94 78.90 0.052 61.49 3.3 1260.5 -0.9
CO244 DSPC 50.0/9.0/39.0/2.0 1.50 93 101.3 0.044 80.73 27.4 741.0 40.7
CO034 DSPC 50.0/9.0/38.0/3.0 1.48 97 84.23 0.040 66.96 34.2 630.1 49.6
CO245 DSPC 52.5/4.0/42.5/3.0 1.55 95 81.88 0.054 64.54 5.8 846.6 32.2
CO246 DPPC 50.0/9.0/38.0/3.0 1.52 96 87.11 0.040 70.04 35.9 528.6 57.7
CO247 DPPC 52.5/4.0/42.5/3.0 1.54 97 83.67 0.050 66.43 18.3 726.6 41.8
생체내 특징규명을 위해, 상기 LNP를 암컷 Sprague Dawley 래트에게 kg 체중당 0.3 mg 총 RNA(가이드 RNA 및 mRNA)로 정맥내 투여했다. 그룹당 다섯 마리의 래트가 있었다. 투여 후 7일에, 동물을 희생시키고, 혈액 및 간을 수집하고, 혈청 TTR 및 간 편집을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정했다. 음성 대조군 동물에 TSS 비히클을 투여했다. 혈청 TTR 및 간 편집 결과는 도 10A 및 10B, 및 (상기) 표 30에 나타난다.
공개된 서열의 간단한 설명
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서열 자체에 대해 하기 서열 표를 참조하라. 전사물 서열은 일반적으로 ARCA와 함께 사용하기 위한 최초 세 개의 뉴클레오타이드로서 GGG 또는 CleanCapTM와 함께 사용하기 위한 최초 세 개의 뉴클레오타이드로서 AGG를 포함한다. 따라서, 최초 세 개의 뉴클레오타이드는 백시니아(Vaccinia) 캡핑 효소와 같은 다른 캡핑 접근법과 함께 사용하기 위해 변형될 수 있다. 프로모터 및 폴리-A 서열은 전사물 서열에 포함되지 않는다. 프로모터, 예컨대 T7 프로모터 (서열 식별 번호: 31) 및 폴리-A 서열, 예컨대 서열 식별 번호: 62 또는 63이 5' 및 3' 말단에서 각각 개시된 전사물 서열에 부가될 수 있다. 대부분의 뉴클레오타이드 서열이 DNA로서 제공되지만 Ts를 Us로 변경하여 RNA로 용이하게 전환될 수 있다.
서열 표
다음 서열 표는 본원에 개시된 서열의 목록을 제공한다. DNA 서열 (Ts 포함)이 RNA와 관련하여 참조되는 경우, Ts가 (맥락에 따라 변형된 또는 비변형일 수 있는) Us로 대체되어야 하고, 그 반대도 마찬가지인 것으로 이해된다.
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* = PS 연결; 'm' = 2'-O-Me 뉴클레오타이드
마우스 G000282 NGS 프라이머 서열
정방향 프라이머:
CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTTTGTTCCAGAGTCTATCACCG
역방향 프라이머:
GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACGAATAAGAGCAAATGGGAAC
래트 G000390 NGS 프라이머 서열
정방향 프라이머:
CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCATTTCATGAGACCGAAAACA
역방향 프라이머:
GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTACAGTAGAGCTGTACATAAAACTT
GFP 서열:
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAGGAATTATGCAGTCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTAGACTTAAGCTTGATGAGCTCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCG
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> FORMULATIONS <130> 12793.0014-00304 <140> PCT/US2018/053559 <141> 2018-09-28 <150> 62/566,240 <151> 2017-09-29 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg atgggcagtc 60 atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa cacagacaga 120 cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga aacagcagaa 180 gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa cagaatctgc 240 tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccacaga 300 ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gatcttcgga 360 aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca cctgagaaag 420 aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc actggcacac 480 atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga caacagcgac 540 gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga agaaaacccg 600 atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag caagagcaga 660 agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact gttcggaaac 720 ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga cctggcagaa 780 gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa cctgctggca 840 cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag cgacgcaatc 900 ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct gagcgcaagc 960 atgatcaaga gatacgacga acaccaccag gacctgacac tgctgaaggc actggtcaga 1020 cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa cggatacgca 1080 ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140 gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga cctgctgaga 1200 aagcagagaa cattcgacaa cggaagcatc ccgcaccaga tccacctggg agaactgcac 1260 gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag agaaaagatc 1320 gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac cgctggcaag aggaaacagc 1380 agattcgcat ggatgacaag aaagagcgaa gaaacaatca caccgtggaa cttcgaagaa 1440 gtcgtcgaca agggagcaag cgcacagagc ttcatcgaaa gaatgacaaa cttcgacaag 1500 aacctgccga acgaaaaggt cctgccgaag cacagcctgc tgtacgaata cttcacagtc 1560 tacaacgaac tgacaaaggt caagtacgtc acagaaggaa tgagaaagcc ggcattcctg 1620 agcggagaac agaagaaggc aatcgtcgac ctgctgttca agacaaacag aaaggtcaca 1680 gtcaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgacag cgtcgaaatc 1740 agcggagtcg aagacagatt caacgcaagc ctgggaacat accacgacct gctgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga agacatcgtc 1860 ctgacactga cactgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactgaa gacatacgca 1920 cacctgttcg acgacaaggt catgaagcag ctgaagagaa gaagatacac aggatgggga 1980 agactgagca gaaagctgat caacggaatc agagacaagc agagcggaaa gacaatcctg 2040 gacttcctga agagcgacgg attcgcaaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 agcctgacat tcaaggaaga catccagaag gcacaggtca gcggacaggg agacagcctg 2160 cacgaacaca tcgcaaacct ggcaggaagc ccggcaatca agaagggaat cctgcagaca 2220 gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga aaacatcgtc 2280 atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa ggaacacccg 2400 gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca gaacggaaga 2460 gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga cgtcgaccac 2520 atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacgtc ccgagcgaag aagtcgtcaa gaagatgaag 2640 aactactgga gacagctgct gaacgcaaag ctgatcacac agagaaagtt cgacaacctg 2700 acaaaggcag agagaggagg actgagcgaa ctggacaagg caggattcat caagagacag 2760 ctggtcgaaa caagacagat cacaaagcac gtcgcacaga tcctggacag cagaatgaac 2820 acaaagtacg acgaaaacga caagctgatc agagaagtca aggtcatcac actgaagagc 2880 aagctggtca gcgacttcag aaaggacttc cagttctaca aggtcagaga aatcaacaac 2940 taccaccacg cacacgacgc atacctgaac gcagtcgtcg gaacagcact gatcaagaag 3000 tacccgaagc tggaaagcga attcgtctac ggagactaca aggtctacga cgtcagaaag 3060 atgatcgcaa agagcgaaca ggaaatcgga aaggcaacag caaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gacagaaatc acactggcaa acggagaaat cagaaagaga 3180 ccgctgatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtct gggacaaggg aagagacttc 3240 gcaacagtca gaaaggtcct gagcatgccg caggtcaaca tcgtcaagaa gacagaagtc 3300 cagacaggag gattcagcaa ggaaagcatc ctgccgaaga gaaacagcga caagctgatc 3360 gcaagaaaga aggactggga cccgaagaag tacggaggat tcgacagccc gacagtcgca 3420 tacagcgtcc tggtcgtcgc aaaggtcgaa aagggaaaga gcaagaagct gaagagcgtc 3480 aaggaactgc tgggaatcac aatcatggaa agaagcagct tcgaaaagaa cccgatcgac 3540 ttcctggaag caaagggata caaggaagtc aagaaggacc tgatcatcaa gctgccgaag 3600 tacagcctgt tcgaactgga aaacggaaga aagagaatgc tggcaagcgc aggagaactg 3660 cagaagggaa acgaactggc actgccgagc aagtacgtca acttcctgta cctggcaagc 3720 cactacgaaa agctgaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagct gttcgtcgaa 3780 cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gaacagatca gcgaattcag caagagagtc 3840 atcctggcag acgcaaacct ggacaaggtc ctgagcgcat acaacaagca cagagacaag 3900 ccgatcagag aacaggcaga aaacatcatc cacctgttca cactgacaaa cctgggagca 3960 ccggcagcat tcaagtactt cgacacaaca atcgacagaa agagatacac aagcacaaag 4020 gaagtcctgg acgcaacact gatccaccag agcatcacag gactgtacga aacaagaatc 4080 gacctgagcc agctgggagg agacggagga ggaagcccga agaagaagag aaaggtctag 4140 <210> 2 <211> 4143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 atggataaga agtactcaat cgggctggat atcggaacta attccgtggg ttgggcagtg 60 atcacggatg aatacaaagt gccgtccaag aagttcaagg tcctggggaa caccgataga 120 cacagcatca agaaaaatct catcggagcc ctgctgtttg actccggcga aaccgcagaa 180 gcgacccggc tcaaacgtac cgcgaggcga cgctacaccc ggcggaagaa tcgcatctgc 240 tatctgcaag agatcttttc gaacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccaccgc 300 ctggaagaat ctttcctggt ggaggaggac aagaagcatg aacggcatcc tatctttgga 360 aacatcgtcg acgaagtggc gtaccacgaa aagtacccga ccatctacca tctgcggaag 420 aagttggttg actcaactga caaggccgac ctcagattga tctacttggc cctcgcccat 480 atgatcaaat tccgcggaca cttcctgatc gaaggcgatc tgaaccctga taactccgac 540 gtggataagc ttttcattca actggtgcag acctacaacc aactgttcga agaaaaccca 600 atcaatgcta gcggcgtcga tgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc gaagtcgcgg 660 cgcctcgaaa acctgatcgc acagctgccg ggagagaaaa agaacggact tttcggcaac 720 ttgatcgctc tctcactggg actcactccc aatttcaagt ccaattttga cctggccgag 780 gacgcgaagc tgcaactctc aaaggacacc tacgacgacg acttggacaa tttgctggca 840 caaattggcg atcagtacgc ggatctgttc cttgccgcta agaacctttc ggacgcaatc 900 ttgctgtccg atatcctgcg cgtgaacacc gaaataacca aagcgccgct tagcgcctcg 960 atgattaagc ggtacgacga gcatcaccag gatctcacgc tgctcaaagc gctcgtgaga 1020 cagcaactgc ctgaaaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa tgggtacgca 1080 gggtacatcg atggaggcgc tagccaggaa gagttctata agttcatcaa gccaatcctg 1140 gaaaagatgg acggaaccga agaactgctg gtcaagctga acagggagga tctgctccgg 1200 aaacagagaa cctttgacaa cggatccatt ccccaccaga tccatctggg tgagctgcac 1260 gccatcttgc ggcgccagga ggacttttac ccattcctca aggacaaccg ggaaaagatc 1320 gagaaaattc tgacgttccg catcccgtat 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 83 ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctgc tacagtagag ctgtacataa aactt 55 <210> 84 <211> 3783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 84 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ctaatacgac tcactatagg 420 gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 480 tcggatccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 540 agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 600 ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 660 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 720 acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 780 ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 840 acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 900 tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 960 agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 1020 agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 1080 acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 1140 acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 1200 acaagtaata ggaattatgc agtctagcca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg 1260 agaataagag aaagaaaatg aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg 1320 tgtaaagcca acaccctgtc taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct 1380 ctgtgcttca attaataaaa aatggaaaga acctcgagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaatc tagacttaag cttgatgagc tctagcttgg cgtaatcatg 1560 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 1620 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 1680 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 1740 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 1800 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 1860 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 1920 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 1980 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2040 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2100 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2160 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 2220 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 2280 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 2340 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 2400 aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 2460 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 2520 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 2580 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 2640 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 2700 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 2760 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 2820 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 2880 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 2940 aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 3000 gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 3060 gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 3120 ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 3180 gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 3240 gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 3300 gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 3360 tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 3420 gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 3480 agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 3540 aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 3600 ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 3660 gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 3720 agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 3780 tcg 3783

Claims (75)

  1. 다음을 포함하는 지질 나노입자("LNP") 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함:
    약 50-60 mol-% 아민 지질;
    약 8-10 mol-% 중성 지질; 및
    약 2.5-4 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 6임.
  2. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분;
    약 50-60 mol-% 아민 지질;
    약 27-39.5 mol-% 헬퍼 지질;
    약 8-10 mol-% 중성 지질; 및
    약 2.5-4 mol-% PEG 지질,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 5-7임.
  3. 제2항에 있어서, N/P 비율은 약 6인 LNP 조성물.
  4. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함
    약 50-60 mol-% 아민 지질;
    약 5-15 mol-% 중성 지질; 및
    약 2.5-4 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10임.
  5. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함
    약 40-60 mol-% 아민 지질;
    약 5-15 mol-% 중성 지질; 및
    약 2.5-4 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 6임.
  6. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함
    약 50-60 mol-% 아민 지질;
    약 5-15 mol-% 중성 지질; 및
    약 1.5-10 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 6임.
  7. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함
    약 40-60 mol-% 아민 지질;
    약 0-10 mol-% 중성 지질; 및
    약 1.5-10 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10임.
  8. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함:
    약 40-60 mol-% 아민 지질;
    약 1 mol-% 미만의 중성 지질; 및
    약 1.5-10 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10임.
  9. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함:
    약 40-60 mol-% 아민 지질; 및
    약 1.5-10 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-10이고,
    여기서 LNP 조성물에는 중성 인지질이 본질적으로 없거나 없음.
  10. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    RNA 성분; 및
    지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함함:
    약 50-60 mol-% 아민 지질;
    약 8-10 mol-% 중성 지질; 및
    약 2.5-4 mol-% PEG 지질,
    여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고,
    여기서 LNP 조성물의 N/P 비율은 약 3-7임.
  11. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 mRNA를 포함하는 조성물.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 RNA-유도 DNA-결합제, 예컨대 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는 조성물.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는 조성물.
  14. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 Cas9 뉴클레이스 mRNA를 포함하는 조성물.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 변형된 mRNA인 조성물.
  16. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 RNA-유도 DNA-결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA를 포함하고, 여기서 오픈 리딩 프레임은 최소 우리딘 함량 내지 최소 우리딘 함량의 150% 범위의 우리딘 함량을 갖는 조성물.
  17. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 RNA-유도 DNA-결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 mRNA를 포함하고, 여기서 오픈 리딩 프레임은 최소 우리딘 디뉴클레오타이드 함량 내지 최소 우리딘 디뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 우리딘 디뉴클레오타이드 함량을 갖는 조성물.
  18. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 서열 식별 번호: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, 또는 66 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 mRNA를 포함하고, 여기서 mRNA는 RNA-유도 DNA-결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 조성물.
  19. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 gRNA 핵산을 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, gRNA 핵산은 gRNA인 조성물.
  21. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함하는 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 핵산은 이중-가이드 RNA(dgRNA)이거나 이를 인코딩하는 조성물.
  23. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 핵산은 sgRNA이거나 이를 인코딩하는 조성물.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA는 변형된 조성물.
  25. 제24항에 있어서, gRNA는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합; 및 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드로부터 선택된 변형을 포함하는 조성물.
  26. 제24항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA는 5' 말단에서 최초 다섯 개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는 조성물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA는 3' 말단에서 최종 다섯 개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는 조성물.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA는 최초 네 개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함하는 조성물.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA는 최종 네 개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함하는 조성물.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에서 최초 세 개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 말단에서 최종 세 개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 조성물.
  32. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA는 중량으로 약 10:1 내지 약 1:10 범위의 비율로 존재하는 조성물.
  33. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA는 중량으로 약 5:1 내지 약 1:5 범위의 비율로 존재하는 조성물.
  34. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA는 중량으로 약 3:1 내지 약 1:1 범위의 비율로 존재하는 조성물.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA는 중량으로 약 2:1 내지 약 1:1 범위의 비율로 존재하는 조성물.
  36. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA는 중량으로 약 2:1의 비율로 존재하는 조성물.
  37. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA는 중량으로 약 1:1의 비율로 존재하는 조성물.
  38. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 주형을 추가로 포함하는 조성물.
  39. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% PEG 지질은 약 3인 조성물
  40. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 약 50인 조성물
  41. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 약 55 조성물
  42. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 ± 3 mol-%인 조성물.
  43. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 ± 2 mol-%인 조성물.
  44. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 47-53 mol-%인 조성물
  45. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 48-53 mol-%인 조성물
  46. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, mol-% 아민 지질은 53-57 mol-%인 조성물
  47. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, N/P 비율은 6 ± 1인 조성물.
  48. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, N/P 비율은 6 ± 0.5인 조성물.
  49. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 지질은 지질 A인 조성물.
  50. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 지질은 지질 A의 유사체인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 유사체는 아세탈 유사체인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 아세탈 유사체는 C4-C12 아세탈 유사체인 조성물.
  53. 제50항에 있어서, 아세탈 유사체는 C5-C12 아세탈 유사체인 조성물.
  54. 제50항에 있어서, 아세탈 유사체는 C5-C10 아세탈 유사체인 조성물.
  55. 제50항에 있어서, 아세탈 유사체는 C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11, 및 C12 유사체로부터 선택되는 조성물.
  56. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤인 조성물.
  57. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질은 DSPC인 조성물.
  58. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질은 DPPC인 조성물.
  59. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 지질은 디미리스토일글리세롤(DMG)을 포함하는 조성물.
  60. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 지질은 PEG-2k를 포함하는 조성물.
  61. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 지질은 PEG-DMG인 조성물.
  62. 제61항에 있어서, PEG-DMG는 PEG2k-DMG인 조성물.
  63. 제9항에 있어서, LNP 조성물에는 중성 지질이 본질적으로 없는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 중성 지질은 인지질인 조성물.
  65. 세포를 제12항 내지 제64항 중 어느 한 항의 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 방법.
  66. 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 가이드 RNA 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하고, 여기서 클래스 2 Cas mRNA 및 가이드 RNA 핵산은 제13항 내지 제64항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 LNP 조성물로서 제제화되는 유전자 편집 방법.
  67. 세포를 제12항 내지 제64항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 LNP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 조작된 세포 제조 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, LNP 조성물은 적어도 2 회 투여되는 방법.
  69. 제68항에 있어서, LNP 조성물은 2-5 회 투여되는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 편집은 재투여 시 개선되는 방법.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 주형 핵산을 세포에 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA은 제1 LNP 조성물로 제제화되고 가이드 RNA 핵산은 제2 LNP 조성물로 제제화되는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 동시에 투여되는 방법.
  74. 제72항에 있어서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 연속적으로 투여되는 방법.
  75. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 및 가이드 RNA 핵산은 단일 LNP 조성물로 제제화되는 방법.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020198697A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods comprising a ttr guide rna and a polynucleotide encoding an rna-guided dna binding agent
KR20220004984A (ko) 2019-03-28 2022-01-12 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. Ttr 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 및 코르티코스테로이드를 포함하는 attr 아밀로이드증의 치료 또는 그의 용도
JP2022542839A (ja) 2019-07-19 2022-10-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
CN115176001A (zh) * 2019-12-11 2022-10-11 因特利亚治疗公司 用于基因编辑的修饰的引导rna
WO2021222287A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of in vitro cell delivery
EP4153224A1 (en) 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Coronavirus antigen compositions and their uses
TW202208629A (zh) 2020-05-20 2022-03-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 免疫原性組成物及其用途
CA3180101A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
EP4158032A2 (en) 2020-05-29 2023-04-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and methods relating thereto
MX2023002439A (es) 2020-09-03 2023-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones immunogénicas y usos de las mismas.
KR20230124927A (ko) 2020-11-25 2023-08-28 아카제라 메디신즈, 인크. 핵산 전달을 위한 지질 나노입자, 및 관련 사용 방법
AU2021396403A1 (en) 2020-12-11 2023-06-29 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing mhc class ii in a cell
IL303506A (en) 2020-12-11 2023-08-01 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compounds and methods for genome editing involving deamination
EP4267732A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions of modified trems and uses thereof
CA3205042A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying ciita in a cell
WO2022140586A2 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing hla-a in a cell
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
KR20240017791A (ko) 2021-04-17 2024-02-08 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. Dna-의존적 단백질 키나제의 억제제 및 이의 조성물 및 용도
KR20240032013A (ko) 2021-06-10 2024-03-08 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 유전자 편집을 위한 내부 링커를 포함하는 변형된 가이드 rna
AU2022296523A1 (en) 2021-06-22 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for in vivo editing of a liver gene
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
AR127073A1 (es) 2021-09-17 2023-12-13 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones y métodos para producir polirribonucleótidos circulares
TW202322826A (zh) 2021-10-18 2023-06-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
AU2022382975A1 (en) 2021-11-03 2024-05-02 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
AU2022398478A1 (en) 2021-11-24 2024-06-13 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
CA3238735A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Jennifer A. Nelson Immunogenic compositions and their uses
AU2022397292A1 (en) 2021-11-24 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
WO2023102550A2 (en) 2021-12-03 2023-06-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for efficient in vivo delivery
TW202340461A (zh) 2021-12-22 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法
TW202342064A (zh) 2021-12-23 2023-11-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
US11951177B2 (en) 2022-03-23 2024-04-09 Nanovation Therapeutics Inc. High sterol-containing lipid nanoparticles
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2023184038A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Nanovation Therapeutics Inc. Mrna delivery method and composition thereof
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023205148A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
TW202408595A (zh) 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於對細胞進行遺傳修飾之方法及組合物
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
US20240042021A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
US20240182561A1 (en) 2022-11-04 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201407996PA (en) 2009-12-23 2015-01-29 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
US8691750B2 (en) * 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
KR20150095861A (ko) 2012-12-17 2015-08-21 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 인간 게놈 조작
ES2887254T3 (es) 2013-03-08 2021-12-22 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos
CA2906732C (en) * 2013-03-15 2023-08-08 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
EP3971287A1 (en) * 2013-07-11 2022-03-23 ModernaTX, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
BR112016013213A2 (pt) * 2013-12-12 2017-12-05 Massachusetts Inst Technology administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para visar distúrbios e doenças usando componentes de administração de partículas
ES2774968T3 (es) * 2013-12-19 2020-07-23 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para la administración de agentes activos
ES2949172T3 (es) 2014-07-16 2023-09-26 Novartis Ag Método de encapsulamiento de un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas
CN107532161A (zh) 2015-03-03 2018-01-02 通用医疗公司 具有改变的PAM特异性的工程化CRISPR‑Cas9核酸酶
AU2016237148A1 (en) 2015-03-24 2017-11-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid-containing lipid nanoparticles
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
WO2017049074A1 (en) * 2015-09-18 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
US11851653B2 (en) 2015-12-01 2023-12-26 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
WO2017109757A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
US20210206818A1 (en) 2016-01-22 2021-07-08 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
WO2017173054A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
KR102551664B1 (ko) * 2016-12-22 2023-07-05 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
IL273541A (en) 2020-05-31
WO2019067992A1 (en) 2019-04-04
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JP2023103421A (ja) 2023-07-26
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AU2018338915A1 (en) 2020-04-23
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TW201924724A (zh) 2019-07-01
FI3688162T3 (fi) 2024-05-15
CN111406108A (zh) 2020-07-10
SG11202002653UA (en) 2020-04-29
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US20230140670A1 (en) 2023-05-04
LT3688162T (lt) 2024-05-27
RS65493B1 (sr) 2024-05-31

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