CN116836237A - 提高视网膜靶向性的aav病毒衣壳蛋白突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高视网膜靶向性的AAV病毒衣壳蛋白突变体及其应用。通过在AAV病毒衣壳蛋白特定位置插入TGVPNPLRGGLS或TGSILQVGSQRGLS得到的衣壳蛋白突变体，可以有效提高AAV病毒视网膜靶向性，有效提高了AAV2感染视网膜各层细胞的效率，为视网膜相关疾病动物模型的构建、视网膜相关疾病药物的开发，特别是视网膜相关疾病转基因药物的开发提供了更佳的选择。

Description

提高视网膜靶向性的AAV病毒衣壳蛋白突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及提高视网膜靶向性的AAV病毒衣壳蛋白突变体及其应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种广泛应用于基因治疗的递送载体，其原理是通过基因工程方法将AAV基因组ITR之间序列替换成目的基因序列，经细胞感染传递到靶细胞，达到基因治疗目的。基于重组AAV具有安全性、高效性、稳定性、持续性、特异性、低整合性等特点，使得AAV成为基因治疗领域主要递送手段之一。在基因治疗应用过程中，活体动物往往需要注射高剂量、高纯度的AAV病毒，而高昂的AAV生产成本成为基因治疗过程中的瓶颈之一。
伴随着基因治疗下游研发技术的成熟，上游AAV生产通量的问题的限制变得越来越明显。为了解决这个问题，现有的策略集中在以下两个方面，一是优化现有的AAV生产工艺；二是寻找包装能力、组织靶向性更好的病毒载体。AAV生产工艺更多的是通过其外部包装条件的优化，不涉及AAV本身的改造。而基于AAV病毒的结构特征，其病毒特征如组织靶向性、免疫原性、包装产量等特征主要由其表面衣壳蛋白决定。如何对AAV衣壳蛋白的改造，进行提高AAV病毒的组织靶向性，是一项亟待解决的问题。
AAV衣壳蛋白与其靶向性的关系尚不明确，现有技术中，主要通过突变体发现具有特定靶向性或高靶向性的AAV衣壳蛋白。CN113766934A、CN111770999A、CN105755044A、CN103561774A、CN116003533A等公开了多种不同具有一定视网膜靶向性的AAV病毒。
视网膜细胞与多种眼科疾病相关，传统的AAV载体对视网膜的靶向性较低，开发一种对视网膜细胞具有靶向性AAV载体，对于构建视网膜相关疾病模型、开发视网膜相关疾病治疗制剂具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供提高视网膜靶向性的AAV病毒衣壳蛋白突变体及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
提高AAV病毒视网膜靶向性的衣壳蛋白插入肽，其氨基酸序列为TGVPNPLRGGLS或TGSILQVGSQRGLS。
本发明的第二个方面，提供：
一种AAV病毒衣壳蛋白突变体，野生型AAV病毒衣壳蛋白的587与588位氨基酸之间插入有多肽TGVPNPLRGGLS或TGSILQVGSQRGLS。
在一些AAV病毒衣壳蛋白突变体的实例中，野生型AAV病毒衣壳蛋白选自野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10病毒衣壳蛋白中的一种。
在一些AAV病毒衣壳蛋白突变体的实例中，野生型AAV病毒衣壳蛋白为野生型AAV2病毒衣壳蛋白。
本发明的第三个方面，提供：
编码本发明第一个方面所述肽或本发明第二个方面所述蛋白的基因。
本发明的第四个方面，提供：
一种表达体系，其可以表达本发明第二个方面所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体，或含有本发明第三个方面所述的基因。
在一些表达体系的实例中，所述表达体系为重组AAV载体，所述重组AAV载体通过对AAV载体插入或替换改造得到。
在一些表达体系的实例中，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其突变体中的任意一种。
在一些表达体系的实例中，所述表达体系还包括编码功能性基因产物的核酸分子。
本发明的第五个方面，提供：
一种组合物，包括本发明第四个方面所述表达体系及可接受的辅料。
在一些组合物的实例中，可接受的辅料为保持表达体系稳定、利于使用的常规辅料。
本发明的第六个方面，提供：
组合物在制备转基因制剂中的应用，所述组合物包括本发明第二个方面所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体，或本发明第四个方面所述表达体系。
在一些应用的实例中，所述转基因制剂作为基因治疗制剂使用，或用于动物疾病模型构建。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的AAV病毒衣壳蛋白突变体R5（插入肽TGVPNPLRGGLS）和R22（插入肽TGSILQVGSQRGLS），可以有效提高AAV病毒视网膜靶向性，有效提高了AAV2感染视网膜各层细胞的效率，为视网膜相关疾病动物模型的构建、视网膜相关疾病药物的开发，特别是视网膜相关疾病转基因药物的开发提供了更佳的选择。
附图说明
图1是构建的突变质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2是本发明实施例中pAAV2-Rep2/Cap2包装质粒图谱。
图3是本发明实施例中pAAV2-Rep2/Cap2-7M8包装质粒图谱。
图4是本发明实施例中构建得到的pAAV2-Rep2/Cap2-R5包装质粒图谱。
图5是本发明实施例中构建得到的pAAV2-Rep2/Cap2-R22包装质粒图谱。
图6是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-EGFP表达质粒图谱。
图7是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pHelper辅助质粒图谱。
图8是不同腺相关病毒变体和对照组野生型腺相关病毒的病毒颗粒总量的检测结果图。
图9是本发明实施例的野生型、7M8、R5和R22感染小鼠3W活体眼底荧光图。
图10是本发明实施例的野生型、7M8、R5和R22感染小鼠3W的视网膜组织切片图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例：
发明人通过自主开发的AI算法，设计得到如下表1所示AAV2 衣壳蛋白。野生型腺相关病毒AAV2（AAV2-WT）衣壳蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示(蛋白ID：YP_680426.1)。已用于临床实验的视网膜靶向能力较强的AAV2腺相关病毒突变体AAV2-7M8的衣壳蛋白记为AAV2-7M8-Cap。
表1 AAV2突变体在Cap2 N587与R588之间插入氨基酸序列信息
序列名称 插入序列信息 SEQ ID NO.：
AAV2-WT-Cap 无
AAV2-7M8-Cap LALGETTRPA 4
AAV2-R5 GVPNPLRGGLS 5
AAV2-R22 TGSILQVGSQRGLS 6
AAV2-Mut071 TGILQALCRVGLS 7
AAV2-Mut072 TGIAQMLCRVGLS 8
AAV2-Mut073 TGILQALCRAGLS 9
AAV2-Mut074 TGGLSLLCRLGLS 10
AAV2-Mut075 TGILQSLCRVGLS 11
AAV2-Mut076 TGGLSLLCRVGLS 12
AAV2-Mut077 TGGISLLCRLGLS 13
AAV2-Mut078 TGPAWTHTAPPGLS 14
AAV2-Mut079 TGILSALCRVGLS 15
AAV2-Mut080 TGGLQILCRLGLS 16
AAV2-Mut081 TGIMQALCRLGLS 17
AAV2-Mut082 TGPISLLCRLGLS 18
AAV2-Mut083 TGGLQILCRVGLS 19
AAV2-Mut084 TGGLPILCRLGLS 20
AAV2-Mut085 TGLSLPSVTGLS 21
AAV2-Mut086 TGLLQALCRAGLS 22
AAV2-Mut087 TGITQILCRLGLS 23
AAV2-Mut088 TGILGALCRVGLS 24
AAV2-Mut089 TGGVLNFCRVGLS 25
AAV2-Mut090 TGILQALCRLGLS 26
1、质粒构建
通过基因合成（生工生物工程有限公司）AAV2-R5、R22和Mut071-Mut090等氨基酸序列（如表1所示）对应的核酸序列，将合成得到的序列通过现有方法克隆至pAAV2质粒，在Cap2 N587-R588之间插入突变序列，构建pAAV-突变质粒载体；连接产物转化大肠杆菌感受态Stbl3，挑取单菌落提取质粒进行测序验证与酶切验证，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，突变质粒构建成功，说明本发明的方法可以成功构建得到相应的突变质粒。
2、AAV2-WT、AAV2-7M8、AAV2-R5和AAV2-R22等AAV2病毒包装
AAV2-WT质粒和AAV2-突变质粒采用病毒包装三质粒系统转染至HEK293T细胞中，质粒图谱分别如图2～图7所示，包括以下步骤：
A 、细胞培养
（1）从液氮罐中取出一株HEK293T细胞，将细胞迅速放入37℃水浴中，轻轻晃动，使细胞迅速解冻，200×g离心5min，弃上清，重悬至10ml DMEM+10%胎牛血清完全培养基中，置于T75培养瓶中，补DMEM+10%胎牛血清完全培养基至25ml，在37℃，5％的CO2中培养；
（2）培养48-72小时后，细胞汇合度达80%左右，可对细胞进行传代培养；
（3）吸掉培养上清，加入10ml PBS缓冲液洗涤1次，加入2ml TrypLESelect（1×）消化液，37℃消化3-5min，加入15ml DMEM完全培养基终止消化；
（4）吹打细胞形成细胞悬液，按1：4-1：5的比例进行传代，接种至T300瓶中培养；
B、细胞转染
（1）将上述细胞培养48h，细胞汇合度达80%-90%，可对细胞进行转染；
（2）每瓶细胞，向1ml DMEM培养基中依次加入包装质粒、pHelper、pAAV-CAG-EGFP共60μg，混匀，即为“质粒稀释液”；
（3）另取1ml DMEM培养基，加入180ugPEI混匀，即为“PEI稀释液”；
（4）将“PEI稀释液”倒入“质粒稀释液”中，快速混匀，在室温静置25分钟，形成转染复合物；将转染复合物加入80ml DMEM培养基中，轻晃混匀；
（5）取出T300细胞培养瓶，弃培养上清，加入含用转染复合物的培养基；
（6）在37℃，5％的CO2中培养。
C、病毒收获
（1）转染后细胞继续培养72小时，开始进行病毒收获；
（2）将培养上清收于离心瓶中，每ml上清中加入0.245mL的50% PEG8000溶液（含0.5mol/L NaCl)，充分混匀，2-8℃静置过夜；
（3）向培养瓶中细胞加入5ml 0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液（含全能核酸酶），37 ℃处理1-2h，然后加入0.55ml的5mol/L NaCl，充分混匀后4℃、3000g离心15min，收集上清，暂存于2-8℃；
（4）将PEG8000浓缩后的上清4℃、3000g离心15min，去上清，加入2ml 0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液（含全能核酸酶），37 ℃处理1-2h，然后加入0.22ml的5mol/LNaCl，充分混匀后，3000g离心15min，收集上清；
（5）将步骤（3）和步骤（4）中的2种上清并入一个离心管。
D、病毒纯化
1）取一支Ultra-Clear离心管，在底部相继加入0.5mL 60%Iodixanol，2mL 40%Iodixanol，1.5mL 25%Iodixanol，1.5 mL 15%Iodixanol，收集的病毒悬液，最后细胞裂解液进行配平；
2）10℃、230000g，升8降9超速离心18h；
3）取一支超滤管，用1mL PBS缓冲液浸润滤膜；
4）用移液枪小心抽取超速离心管40%Iodixanol-60%Iodixanol中间液层，避免吸到蛋白，转移到超滤管；
5） 加入适量PBS缓冲液吹打均匀，4500g离心3-5 min，重复此步骤5-7次至去除Iodixanol；
6）加入1mL PBS缓冲液吹打40～50下成病毒悬液，转移到EP管中；
7）用5mL注射器吸取EP管中病毒悬液0.22μm过滤器过滤，收取20μL病毒液做检测样品后，以100μL每管分装，得到腺相关病毒变体。
测试例
1、病毒滴度检测
（1）病毒裂解
1）分别取实施例和对比例的病毒样品20μL；
2）分别加入10%SDS、0.5mol/L EDTA、proteinaseK各1μL，混匀；
3）恒温混匀仪中56℃孵育1小时，然后90℃孵育10min；
4）取10ul病毒裂解液，10倍梯度稀释至10000倍，即为病毒稀释液，备用。
（2）标准曲线用标准品的制备
取原液2×1012copies/mL的质粒标准品，用超纯水ddH2O按照比例稀释为6个梯度作为标准品的模板2×1011copies/mL、2×1010copies/mL、2×109copies/mL、2×108copies/mL、2×107copies/mL、2×106copies/mL。
（3）绝对定量qPCR
1）取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，每个病毒稀释液3个重复。2× qPCR Mix10μL；正向、反向引物各0.2μL；5μL病毒稀释液；4.2μL ddH2O。
扩增引物：
正向引物 5’- GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’（SEQ ID NO.2）；
反向引物 5’- CGGCCTCAGTGAGCGA-3’ （SEQ ID NO.3）。
2）PCR扩增
预变性：95℃，2 min；
40×循环：95℃，15s；60℃，60s。
3）qPCR数据处理：病毒滴度=稀释倍数×病毒基因数组拷贝数。
本发明方案将AAV2-WT病毒包装三质粒系统（包含 pAAV2、pAAV-CAG-EGFP、pHelper三个质粒）和AAV2-突变病毒包装三质粒系统（包含pAAV2-突变体、pAAV-CAG-EGFP、pHelper三个质粒）分别等量转染至HEK293T细胞中，细胞裂解收获病毒液，碘克沙醇超离纯化，QPCR检测病毒滴度评估其产量。实验结果如表2和图8所示。
表2、不同AAV2的病毒滴度
病毒名称 滴度 病毒名称 滴度
AAV2-WT 5.92E+11 AAV2-Mut77 3.32E+09
AAV2-7M8 3.90E+11 AAV2-Mut79 8.97E+08
AAV2-R5 3.06E+11 AAV2-Mut80 4.76E+09
AAV2-R22 1.19E+12 AAV2-Mut81 9.45E+09
AAV2-Mut78 8.58E+11 AAV2-Mut82 1.03E+10
AAV2-Mut85 6.10E+11 AAV2-Mut83 5.28E+09
AAV2-Mut71 6.20E+10 AAV2-Mut84 3.76E+09
AAV2-Mut72 5.82E+09 AAV2-Mut86 3.44E+09
AAV2-Mut73 3.73E+09 AAV2-Mut87 4.78E+08
AAV2-Mut74 2.83E+09 AAV2-Mut88 1.12E+11
AAV2-Mut75 4.57E+09 AAV2-Mut89 2.78E+09
AAV2-Mut76 7.80E+10 AAV2-Mut90 3.40E+10
从表2和图8可以看出，AAV2-R5、AAV2-R22、AAV2-Mut78、AAV2-Mut85病毒颗粒总量分别为AAV2-WT的0.52倍、2.01倍、1.45倍和1.03倍，对比例2（AAV2-7M8）产量为AAV2-WT的0.66倍。其余28个突变体病毒总颗粒数为AAV2-WT的18.93%-0.15%，选择AAV2-R5、AAV2-R22、AAV2-Mut78、AAV2-Mut85进行小鼠体内视网膜感染能力测试。
2、小鼠视网膜感染效果测试
（1）分别取实施例和对比例样品稀释至2E+9vg/µl，玻璃体腔注射至C57BL-6J小鼠，每只眼睛注射1.5µl（病毒总量为3E+9vg)，每种病毒注3只小鼠。
（2）病毒注射3W后，对小鼠进行麻醉，用Micron IV 小动物视网膜影像系统进行荧光眼底成像，拍照参数为：Gain (dB)-10dB、Frame Rate (fps)-2fps、Exposure-Auto
（3）取小鼠眼球，固定后石蜡包埋、切片、DAPI染色后，荧光显微镜观察及拍照。
病毒注射3W后，活休荧光结果如图9所示，从图中可以看出AAV2-R5和AAV2-R22病毒在视网膜中的表达显著强于AAV2-WT病毒，AAV2-Mut78和AAV2-Mut85病毒在视网膜中的表达弱于AAV2-WT病毒。AAV2-7M8在视网膜中的表达强度与AAV2-WT病毒相近。对眼球石蜡切片进行DAPI染色后，荧光显微镜观察结果如图10所示，AAV2-R5和AAV2-R22病毒经玻璃体空注射后，能感染视网膜从RGC到PRC的各层细胞，而AAV2-WT仅感染RGC层细胞。AAV2-7M8虽也能感染视网膜从RGC到PRC的各层细胞，但感染面积和表达强度低于AAV2-R5和AAV2-R22。证明本发明方案的腺相关病毒变体AAV2-R5和AAV2-R22在视网膜中的感染能力及穿透性有显著提高。
综上所述，本发明方案制备得到的腺相关病毒变体相较野生型能够显著增强AAV2病毒的视网膜感染能力及穿透性。
相关序列：
野生型腺相关病毒衣壳蛋白Cap2 (major coat protein VP1 [adeno-associated virus 2])的氨基酸序列如下：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(蛋白ID：YP_680426.1，SEQ ID NO.1)。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.提高AAV病毒视网膜靶向性的衣壳蛋白插入肽，其氨基酸序列为TGVPNPLRGGLS或TGSILQVGSQRGLS。
2.一种AAV病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，野生型AAV病毒衣壳蛋白的587与588位氨基酸之间插入有多肽TGVPNPLRGGLS或TGSILQVGSQRGLS。
3.根据权利要求2所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，野生型AAV病毒衣壳蛋白为野生型AAV2病毒衣壳蛋白。
4.编码权利要求1所述衣壳蛋白插入肽或权利要求2或3所述蛋白的基因。
5.一种表达体系，其特征在于，其可以表达权利要求2或3所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体，或含有权利要求4所述的基因。
6.根据权利要求5所述的表达体系，其特征在于，所述表达体系为重组AAV载体，所述重组AAV载体通过对AAV载体插入或替换改造得到。
7.根据权利要求6所述的表达体系，其特征在于，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其突变体中的任意一种。
8.根据权利要求5～7任一项所述的表达体系，其特征在于，所述表达体系还包括编码功能性基因产物的核酸分子。
9.一种组合物，包括权利要求5～8任一项所述表达体系及可接受的辅料。
10.组合物在制备转基因制剂中的应用，所述组合物包括权利要求2或3所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体，或权利要求5～8任一项所述表达体系。
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