CN111333702A

CN111333702A - 用于治疗溶酶体贮积病的vlp

Info

Publication number: CN111333702A
Application number: CN201911300544.9A
Authority: CN
Inventors: 维多利亚·德米娜; 马库斯·斯塔夫; 塞尔吉·索蒂尼科夫; 海科·曼尼加
Original assignee: Newhealth Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Newhealth Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-06-26
Also published as: CN115135757A; CA3121689A1; US11279938B2; US20210301302A1; CA3049197A1; JP2021502951A; CN111587289A; BR112019014209A2; US20200224205A1; SI3688147T1; US20230159938A1; EP3688147B1; BR102019026837A2; EP3688147A1; JP6884432B2; ES2933275T3; HUE060952T2; US20230157972A1; JP2020105169A; CA3065548A1

Abstract

本发明涉及与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的病毒样颗粒(VLP)，其用于治疗溶酶体贮积病的方法。本发明还涉及用于治疗溶酶体贮积病的方法的药物组合物、编码溶酶体酶的表达载体和将VLP与编码溶酶体酶的表达载体缔合的方法。

Description

用于治疗溶酶体贮积病的VLP

发明领域

本发明涉及与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的病毒样颗粒(VLP)，其用于在有需要的受试者(优选人)中治疗溶酶体贮积病的方法。本发明还涉及用于治疗溶酶体贮积病的方法的药物组合物、编码溶酶体酶的表达载体和将VLP与编码溶酶体酶的表达载体缔合的方法。

发明背景

溶酶体贮积病(LSD)是约50种遗传疾病的一组疾病。LSD大部分涉及溶酶体水解酶的功能障碍，其导致受损的底物降解。结果，未完全处理的细胞物质积聚在各种组织类型中，并出现疾病特异性的临床表现。

除底物降解外，溶酶体还参与能量稳态、细胞生长构件的生成、有丝分裂信号传导、血管生成和转移形成的组织启动以及转录程序的激活。

溶酶体贮积病的一个实例是异染性脑白质营养不良(MLD)。MLD的特征是芳基硫酸酯酶A(ASA)的活性降低，这是由于影响鞘脂的代谢的ASA基因中的突变所引起的。在没有ASA的情况下，硫苷脂在机体的许多组织中积聚，最终破坏神经系统的髓鞘。症状包括发育迟缓、无力、肌肉僵硬、精神衰退、痴呆和失明。

根据首个症状发作时受试者(人)的年龄，存在三种MLD临床亚型(van Rappard等人,Best Pract Res Clin Endocrinol Metab.2015；29(2):261-73)：

“晚期婴儿形式”通常在儿童30个月大之前发作。其特征在于硫苷脂的快速积累和精神运动退化的进展。死亡通常在症状发作后的几年内发生。不存在功能性酶。

在“青少年变体”中，症状始于2.5至16岁。在开始时，疾病进展比晚期婴儿形式慢，但是一旦神经系统症状变得更加明显，衰退很快，并且患者最终会失去所有技能。疾病的终末期可持续数年，并且其持续时间是变化的。大多数患者携带一个ASA等位基因，其允许表达少量功能性酶。

“成人变体”在16岁以后开始隐匿性发作。疾病的进展通常比婴儿和青少年形式慢。疾病发作后数十年内死亡。患者携带两个突变，允许表达少量功能性酶，其延缓了硫苷脂积累的过程从而延缓了疾病发作。

现有技术中已经讨论了以下基因治疗方法来治疗MLD：

-遗传修饰的自体造血干细胞的骨髓移植，其涉及重新施用使用慢病毒载体遗传修饰以稳定表达ASA的患者骨髓干细胞

-涉及递送过表达ASA基因的微囊化重组细胞的细胞治疗

-体内基因治疗，即，将编码hASA的优化腺病毒(或腺相关)或慢病毒载体直接递送至CNS以提供长期、持续和持久的遗传缺陷校正(Rosenberg等人,J Neurosci Res.2016；94(11):1169-79)。

现有技术中已经讨论了以下非基因治疗方法来治疗MLD：

-酶替代疗法，其涉及静脉内、脑室内或鞘内注射ASA酶

-造血干细胞疗法，其涉及供体造血干细胞穿过血脑屏障(BBB)并分化为小胶质细胞以产生野生型ASA

-基于小分子的疗法，例如，使用N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)美格鲁特(

Actelion Pharmaceuticals Ltd,Allschwil,Switzerland)或华法林(香豆素)

-底物减少疗法。

这些治疗尝试是相当非特异性的，这意味着这些药物不会特异性靶向CNS，而是在施用后均匀分布在患者体内。另外，当施用例如病毒载体时，会引起安全隐患。

因此，存在对用于治疗溶酶体贮积病的安全有效疗法的需要。因此，本发明的目的是提供一种用于治疗溶酶体贮积病、特别是MLD的新疗法的手段，其克服了这些限制中的至少一个。

发明概述

本发明人已经发现，与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合，优选掺入溶酶体酶或掺入编码溶酶体酶的表达载体的病毒样颗粒(VLP)，更特别地JC病毒的VLP，特别适合于治疗溶酶体贮积病，例如MLD。根据本发明的VLP可用于将功能性溶酶体酶或编码此类酶的质粒有效递送至有此需要的患者的CNS中。为此，根据本发明，VLP与溶酶体酶(其缺失或活性降低是待治疗的LSD的原因)或编码溶酶体酶的表达载体缔合。

根据本发明的VLP可以有效地穿过血脑屏障(BBB)，有利地甚至生理上完整的BBB。因此，与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP可以将溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体有效递送至CNS。

本发明人在静脉内施用根据本发明的VLP后在小鼠脑中发现了ASA mRNA。此后还在脑中发现了ASA蛋白。因此，可以得出结论，通过施用根据本发明的VLP，可以增强CNS中的溶酶体酶活性。增强的溶酶体酶活性使得可以有效治疗溶酶体贮积病；如果溶酶体酶是ASA，则MLD的治疗成为可能。

出乎意料的是，已经发现根据本发明的VLP特异性靶向CNS，即，它们在施用至患者(例如静脉内)后不均匀地分布在体内。这意味着在CNS中发现比在CNS之外更大比例的根据本发明的VLP。

根据本发明的VLP特异性靶向星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞。本发明的VLP的特别优选的靶标是少突胶质细胞。

根据本发明的VLP也是稳定且均匀的，这对于临床使用特别重要，因为它允许药物产品的更好的质量管理和标准化。

因此，本发明人已经证明，与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP，特别是JC病毒的VLP，可以用于提供LSD特别是MLD的有效和安全的治疗。

还已经发现，当用于产生所述VLP的方法包括将VLP分解成五聚体和将五聚体重新组装成VLP的两个步骤时，可以提供具有改善的功效的来自JCV的VLP。

将溶酶体酶(优选人芳基硫酸酯酶A)或将编码溶酶体酶(优选人芳基硫酸酯酶A)的表达载体掺入VLP的方法优选包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

d)将c)的组合物的五聚体暴露于诱导五聚体重新组装成VLP的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

f)将e)的组合物的五聚体在诱导五聚体组装成与溶酶体酶或表达载体缔合的VLP的条件下暴露于溶酶体酶或表达载体。

改善的功效特别地意指更多的货物(即特别是溶酶体酶，优选人芳基硫酸酯酶A，或编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的表达载体)到达CNS。改善的功效可能有可相互影响的多种原因。例如，较高的功效可能是由于VLP更有效地穿过了BBB，因此，更大量的VLP和/或货物进入了CNS。同样可能是由于在到达CNS后来自VLP的货物的释放得到了改善。此外，更高的功效的原因可能是这样的事实，即每个单独的VLP可以装载更多的货物，或者可以增加所装载的VLP的总量。

当VLP的货物是萤光素酶表达质粒

时，通过萤光素酶的增加的表达示例性地证明了通过本发明的方法可获得的VLP或通过本发明的方法可获得的药物递送系统的改善的功效(下面的实施例11，图11)。

实施例11还提供了步骤f)中获得的VLP有效地穿过BBB的证据(下面的实施例11，图12和13)。因此，提供了证据证明VLP可用作将药物运输到CNS中的药物递送系统。

此外，已经发现，在步骤d)中获得的VLP特别适合于储存。它们将-80℃的储存条件保留超过24小时。在储存之后，VLP可以被进一步处理，例如用于提供药物递送系统。因此，它们代表了在制造包含与货物缔合的VLP的药物递送系统过程中合适的可储存中间产品。

因此，在一个具体方面，本发明涉及用于为VLP提供增加的储存适用性的方法。出于实际原因，这种VLP极大地促进了药物递送系统的生产。它允许大规模制造VLP和随后其在无货物情况下的中间储存。在储存之后，根据各个客户的需求，可以对储存的VLP进行进一步处理并装载所需的货物。因此，步骤d)中提供的VLP的中间储存使得能够在基于VLP的药物递送系统的制造过程中实现更大的灵活性。

此外，已经发现根据本发明的VLP是稳定的。它们的稳定性可以与由VP1生产和直接后续组装(即无分解/重新组装步骤)产生的VLP等同地比较(图16)。由此得出，出乎意料的是，根据本发明的两个分解和重新组装步骤对VLP的稳定性没有负面影响。

在另一个方面，本发明涉及包含VLP的药物递送系统或组合物。

进一步出乎意料地发现，可以通过在两个步骤中重新组装步骤d)的五聚体来改善包含VLP的组合物的均质性，而第一步骤包括诱导步骤c)的五聚体的聚集，和第二步骤包括从诱导五聚体聚集的条件分离五聚体(下面的实施例13，图17和18)。

包含VLP的组合物的均匀的尺寸分布是有利的，因为它允许产生确定的VLP群体以用作药物递送系统，这对于实现确定的质量标准很重要。

附图简要说明

图1：VP1蛋白与少突胶质细胞标志物Olig2的共定位。

左上图显示了用染料DAPI染色的细胞核。右上图显示了VP1蛋白的定位(FITC荧光)。左下图显示了用抗Olig2抗体的染色(TRITC荧光)。右下图代表Olig2标志物和VP1蛋白的染色的合成图。对VP1和Olig2呈阳性的细胞用箭头标记。

图2：VP1蛋白与神经元标志物NeuN的共定位。

左上图显示了用染料DAPI染色的细胞核。右上图显示了VP1蛋白的定位(FITC荧光)。左下图显示了用抗NeuN抗体的染色(TRITC荧光)。右下图代表NeuN标志物和VP1蛋白的染色的合成图。对VP1和NeuN呈阳性的细胞用箭头标记。

图3：VP1蛋白与小胶质细胞标志物Iba1的共定位。

左上图显示了用染料DAPI染色的细胞核。右上图显示了VP1蛋白的定位(FITC荧光)。左下图显示了用抗Iba1抗体的染色(TRITC荧光)。右下图代表Iba1标志物和VP1蛋白的染色的合成图。对VP1和Iba1呈阳性的细胞用箭头标记。

图4：在体外BBB模型中与pNL质粒缔合的VLP的穿透

A：在体外BBB模型中，BBB细胞的DAPI(左)和WGA(右)染色。

B：荧光染料(FITC，TRITC)、与质粒(FITC-pNL)偶联的荧光染料和与pNL质粒缔合的VLP的穿透。相对于无细胞穿透的穿透百分比。左四列没有EDTA，右四列有EDTA。

图5：注射了与编码ASA的表达载体缔合的VLP的健康小鼠的肝脏和脑中的ASAmRNA分析

注射与编码ASA的表达载体缔合的VLP后72和120h时健康小鼠的肝脏和脑中ASA和mRNA水平的分析。与媒介物(缓冲剂)相比的倍数增加。括号中的数字表示相应的小鼠数量。

图6：单只小鼠分析(健康小鼠)–脑中ASA mRNA检测

注射与编码ASA的表达载体缔合的VLP后72小时(上图)和120小时(下图)后，ASAmRNA的单只小鼠分析。数字表示单只小鼠。相对倍数调节是指与媒介物对照组相比的基因上调(表达)。

图7：单只小鼠分析(健康小鼠)-蛋白质印迹分析(脑中hASA检测)和相应的qPCR

注射与编码ASA的表达载体缔合的VLP后，脑中的ASA蛋白的单只小鼠分析(蛋白质印迹，上图)，和相应的qPCR分析(下图)。比较媒介物(缓冲剂)、质粒和质粒+VLP。数字表示单只小鼠。相对倍数调节是指与媒介物对照组相比的基因上调(表达)。

图8：通过qPCR分析人ASA在胶质母细胞瘤细胞中的表达。

用与hASA表达载体缔合的VLP孵育胶质母细胞瘤细胞后，对人ASA表达进行qPCR分析。

A：在1:0.2的VLP:质粒包装比下与四种不同hASA表达载体缔合的VLP

B：在两种不同的包装比(高浓度[1:0.5的VLP:质粒]和低浓度[1:0.2的VLP:质粒])下与A的构建体4缔合的VLP

图9：与四种不同hASA表达载体缔合的VLP的nDSF和AF4分析

A：四个样品的nDSF分析(与表达载体构建体1-4缔合的VLP)

B：相同四个样品的AF4分析

图10：与四种不同hASA表达载体缔合的VLP的TEM图像

VLP本身(“VLP原始”：不与货物缔合)(左)和与四种不同表达载体缔合的VLP(构建体1-4，右)的比较。

图11：比较不同制备的VLP的萤光素酶活性

在用两轮分解和重新组装制备的VLP或仅分解和重新组装一次的VLP转染的胶质母细胞瘤细胞中测得的萤光素酶活性

图12：作为单一培养物的BBB模型

作为单一培养物的BBB模型的设置(A)和用两轮分解和重新组装制备的VLP的穿透性(B)

图13：作为共培养物的BBB模型

作为共培养物的BBB模型的设置(A)和用两轮分解和重新组装制备的VLP的穿透性(B)

图14：VLP的TEM图像

具有中间储存的用两轮分解/重新组装制备的VLP相对用一轮分解和重新组装制备的VLP的TEM图像

图15：VLP的FFF-MALS分析

具有中间储存的VLP的用两轮分解和重新组装制备的VLP(A)、进行FFF-MALS分析，包括两轮分解和重新组装以及中间储存的VLP(A)，具有中间储存的五聚体的用一轮分解和重新组装制备的VLP(B)和新鲜制备的VLP(C)的FFF-MALS分析。

图16：VLP的nDSF分析

新鲜制备的VLP和具有中间储存的用两轮分解和重新组装制备的VLP的nDSF分析

图17：显示VLP的PDI的DLS分析

DLS分析显示了根据包括在储存之前诱导或不诱导五聚体聚集的情况下进行两轮分解和重新组装的方法的步骤d)的VLP的PDI

图18：显示VLP的平均直径的DLS分析

DLS分析显示了根据包括在储存前和储存后诱导或不诱导五聚体聚集的情况下进行两轮分解和重新组装的方法的步骤d)的VLP的平均直径

图19：用不同的冷冻添加剂储存的VLP的nDSF分析和萤光素酶活性

nDSF分析(A)和萤光素酶活性(B)

发明详述

在本发明的第一方面，本发明涉及与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP，其用于治疗受试者特别是人的溶酶体贮积病。因此，本发明还涉及用与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP治疗患有LSD的人的方法。溶酶体酶优选是ASA。LSD优选是MLD。

VLP本身(即不与货物缔合)不包含任何遗传物质，因为它们仅由蛋白质构成并在其他方面为“空的”。根据本发明的VLP与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合。在一个优选的实施方案中，根据本发明的VLP不包含编码病毒蛋白的病毒遗传物质。在该实施方案中，VLP可以包含病毒调控元件作为病毒遗传物质。

病毒遗传物质包括编码病毒蛋白的病毒遗传物质和作为病毒遗传物质的病毒调控元件。病毒遗传物质衍生自病毒的核酸，即与病毒RNA或DNA至少70％相同。优选地，根据本发明的VLP不包含任何病毒遗传物质。

因此，优选地，在根据本发明的VLP包含RNA或DNA的情况下，RNA或DNA不是衍生自病毒，即RNA或DNA不是病毒遗传物质，特别是RNA或DNA不编码病毒蛋白。特别优选RNA或DNA不编码病毒蛋白并且不包含病毒调控元件。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的VLP仅与仅编码溶酶体酶的表达载体缔合，即表达载体不编码任何其他蛋白质。在一个优选的实施方案中，表达载体不编码病毒蛋白。特别优选的是，表达载体不编码病毒蛋白并且不包含病毒调控元件。

优选地，受试者是动物或人类，优选人类。

有利地，根据本发明的VLP使得能够将溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体递送至优选在人中的目的位点(“靶标”)。优选地，递送对靶标是选择性的，即，与身体或器官的其他部位相比，更高比例的溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体被递送至靶标。

靶标优选是CNS。CNS是指脊髓和脑，特别是脑。术语“脑”包括其解剖学部分，例如额叶、顶叶、颞叶、枕叶和小脑。

如果溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体被递送至靶细胞和/或递送到靶细胞(优选CNS中的靶细胞，尤其是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞)中，则是特别有利的。在特别优选的实施方案中，靶细胞是少突胶质细胞。因此，溶酶体酶或表达载体优选进入星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经元，特别是少突胶质细胞。

当靶细胞与有效量的溶酶体酶接触时是特别有利的。有效量的溶酶体酶是指该量足以增强酶的活性(其的缺乏引起LSD)。

通常在向其添加底物的体外探针中(通常在源自固体组织、白细胞、成纤维细胞、培养的羊水细胞、血清、羊水、尿液或泪滴的探针中)测量受试者中的酶活性。例如，对于芳基硫酸酯酶A，典型的底物包括对硝基儿茶酚硫酸盐、硫苷脂、特别是[³H]标记的硫苷脂、乳糖基神经酰胺硫酸盐、半乳糖基-鞘氨醇硫酸盐、抗坏血酸2-硫酸盐或半脂质(seminolipid)(Raghavan等人,J Neurochem.1981；36(2):724-31)。特别地，对硝基儿茶酚硫酸盐可用作测量受试者的尿液中芳基硫酸酯酶A和B活性的底物(Baum等人,Clin ChimActa.1959；4(3):453-5)。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的VLP穿过血脑屏障，优选生理上完整的血脑屏障，以与溶酶体酶或表达载体一起进入CNS。换句话说，根据本发明的VLP优选在不事先增加BBB的穿透性的情况下穿过BBB。根据本发明的VLP能够穿过生理上完整的BBB。

如果靶标是CNS，特别是如果靶标细胞是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞，则BBB的穿透是特别有利的。因此，根据本发明的VLP可以用于治疗溶酶体贮积病的方法中，其中该方法不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的在先步骤。优选地，将根据本发明的VLP施用至在施用之前未接受用于损害或破坏BBB的任何化学或物理治疗的患者。

因此，在另一个实施方案中，与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP或包含根据本发明的VLP的药物组合物不含可影响BBB的穿透性的任何添加剂。

BBB的体外完整性可以通过已知方法测量，例如通过相对跨内皮电阻测量(TEER)测量(Rempe等人,Biochem Bioph Res Comm 2011,406(1):64-69)。建立了许多BBB体外模型，包括不同共培养物中的原代牛或人脑内皮细胞，例如人脑内皮细胞系HBEC-5i。在体内，可以将成像方法(例如CT扫描或MRI)与造影剂一起使用以可视化BBB穿透性。也可以使用功能成像，例如PET或SPECT。

根据本发明的VLP可以通过各种途径施用，包括口服、经皮、经鼻施用或肺途径或肠胃外注射(静脉内、皮下、肌内)。特别优选的是允许溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体的全身作用的剂型。在一个具体的实施方案中，根据本发明的VLP口服或肠胃外施用，特别是静脉内施用。

在根据本发明的VLP的应用导致不想要的免疫反应(例如通过炎性细胞因子和/或免疫细胞上的表面分子的上调测量)的情况下，可能需要额外应用免疫抑制剂以减少免疫系统的激活或功效。

在一个优选的实施方案中，在施用至待治疗的受试者特别是人后，可以在施用后少于10天，优选少于5天，更优选少于3天的CNS中检测到根据本发明的VLP。

在另一个优选的实施方案中，溶酶体酶具有至少10天，优选至少20天，更优选至少30天的治疗上有效的酶活性。可以通过导致治疗效果(即至少减轻或缓解疾病症状)的酶活性来测量治疗上有效的酶活性。

特别有利的是，治疗上有效的酶活性(优选地在靶位点处的)保持至少10天，优选至少20天，以延长溶酶体酶发挥其活性时的有效期。因此，可以限制根据本发明的VLP的注射次数或频率。

在本发明中，溶酶体酶优选是芳基硫酸酯酶A。

特别地，溶酶体酶是人类的酶。因此，在一个特别优选的实施方案中，溶酶体酶是人芳基硫酸酯酶A。

在一个实施方案中，溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％相同的氨基酸序列，优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一个实施方案中，溶酶体酶包含在其全长上与SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，其优选为SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1和2的序列属于人芳基硫酸酯酶A，并且如下表所示：

表1：人芳基硫酸酯酶A的氨基酸和核苷酸序列。

优选地，编码溶酶体酶的表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。当表达载体的尺寸相对较小，优选小于6kb或甚至小于5kb时，VLP与表达载体的缔合更有效。

在一个优选的实施方案中，表达载体具有选自CMV和CAG的启动子。

CAG启动子是特别有利的，因为它允许持久的表达。CAG启动子还抑制不想要的免疫反应，因此可以减少或甚至完全避免免疫抑制剂的额外应用。

如果需要更强和更短的表达，则优选CMV启动子。

持久表达或短期表达的需要可以根据疾病、疾病阶段和待治疗的受试者而变化。溶酶体酶的持久表达允许持久的作用，如果在受试者中不存在溶酶体酶活性或只有很少的残留活性，则其是有益的。如果存在溶酶体酶的残留活性，则较短的表达可能是足够的。同样，对轻量表达或强烈表达的需求可能会有所不同。

优选地，溶酶体酶表达(优选在靶位点处)至少1小时，优选至少5小时，更优选至少12小时，更优选至少1天，更优选至少3天，更优选至少1周，更优选至少1个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月，更优选至少9个月，更优选至少1年，更多优选至少1.5年，更优选至少2年。

最优选地，溶酶体酶在靶位点处表达至少1个月。

因此，在一个实施方案中，溶酶体酶在靶位点处可检测至少1小时，优选至少5小时，更优选至少12小时，更优选至少1天，更优选至少3天，更优选至少1周，更优选至少1个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月，更优选至少9个月，更优选至少1年，更多优选至少1.5年，更优选至少2年。

最优选地，溶酶体酶在靶位点处可检测至少1个月。

优选地，靶细胞中的表达是瞬时的。瞬时表达不排除该表达是持久的。在一个优选的实施方案中，表达是持久的和瞬时的。

在一个优选的实施方案中，表达载体是质粒。

在特别优选的实施方案中，质粒不含抗生素抗性基因。这是有利的，因为它允许在不使用抗生素的情况下培养此类质粒。这对于临床使用特别重要，因为注射抗生素可能会导致过敏或过敏性休克。“pFAR”质粒是例如没有抗生素抗性基因的质粒。优选地，使用pFAR质粒。pFAR质粒允许持久和稳定的表达而无需使用抗生素。

在另一个优选的实施方案中，使用“pNL”质粒或“pSF”质粒。

表述“pFAR质粒”、“pNL质粒”或“pSF质粒”是指具有pFAR质粒、pNL质粒或pSF质粒的主链的质粒用于将启动子和目的溶酶体酶克隆到主链中。

pFAR质粒例如在US 8,440,455B2中描述。特别优选的pFAR质粒是pFAR4，其主链在US 8,440,455B2中以SEQ ID NO：21公开，该序列在本文以SEQ ID NO：7公开。“pFAR1”质粒和优化的“pFAR4”质粒的构建在US 8,440,455B2的第17-18栏中公开。

pFAR质粒优选包含CMV或CAG启动子。pNL质粒优选包含CMV启动子。pSF质粒优选包含CAG启动子。

在一个优选的实施方案中，表达载体是pFAR-CMV-ASA，因此是具有CMV启动子并编码人ASA基因的pFAR主链。在另一个优选的实施方案中，表达载体是pFAR-CAG-ASA。在另一个优选的实施方案中，表达载体是pNL-CMV-ASA。表达载体pFAR-CAG-ASA是特别优选的。

在本发明中已经证明，可以使用不同的表达载体在胶质母细胞瘤细胞中表达人ASA。

在一个优选的实施方案中，如果货物是编码溶酶体酶的表达载体，则溶酶体贮积病优选MLD的治疗是通过溶酶体酶基因在待治疗的受试者的靶细胞优选少突胶质细胞中的瞬时表达来实现的。

由根据本发明的VLP治疗的受试者是例如患有溶酶体贮积病的患者或预期患有溶酶体贮积病的受试者，例如因为他们包含已知影响溶酶体酶的基因突变并因此导致溶酶体贮积病。

在一个优选的实施方案中，溶酶体贮积病是与受试者的神经功能缺损相关或潜在相关的疾病。“潜在相关”是指疾病的正常发展过程最终导致神经功能缺损，尽管受试者可能尚未出现神经功能缺损。优选地，待治疗的受试者具有神经功能缺损。

根据本发明的“神经功能缺损”是指由于脑、脊髓、肌肉或神经或CNS的其他部分的功能改变而导致的身体功能异常或改变。实例包括异常反射、言语或平衡障碍、感觉下降、精神功能问题、视力改变、行走问题或手臂或腿部无力。参照是具有正常反射、说话能力、正常感觉、平衡、精神功能、视力和行走以及手臂和腿部力量的健康受试者。

与受试者的神经功能缺损相关或潜在相关的溶酶体贮积病是例如MLD。在一个非常优选的实施方案中，溶酶体贮积病是MLD。

如果溶酶体贮积病与受试者的神经功能缺损相关或潜在相关，则根据本发明的VLP的靶标优选为CNS。更具体地说，靶细胞是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元或小胶质细胞，特别是少突胶质细胞。

存在可用于研究疾病和可能的治疗方法的不同的MLD小鼠模型：

ASA(-/-)小鼠具有双敲除的ASA基因。缺陷的动物在各种神经元和非神经元组织中储存了鞘脂性脑磷脂3硫酸盐。储存方式与受影响的人类相当，但是直到2岁时才观察到白质的严重缺陷。在12到14个月大时进行的神经系统检查显示神经运动协调能力显著受损(Hess等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93(25):14821-6)。

ASA(-/-)/CST(或者ASA(-/-)/Gal3St1)是在髓鞘形成细胞中过表达硫苷脂合成酶脑苷硫转移酶(CST)(或者半乳糖3-O-磺基转移酶1(Gal3St1))的ASA(-/-)小鼠。这些小鼠在脑和周围神经中的硫苷脂储存量显著增加。大于1岁的小鼠出现严重的神经系统症状(Ramakrishnan等人,J Neurosci.2007；27(35):9482-90)。

在ASA(-/-)/CGT小鼠中，神经细胞过表达硫苷脂合成酶UDP-半乳糖：神经酰胺半乳糖基转移酶(CGT)。这些小鼠显示出在髓鞘形成细胞中增加的硫苷脂储存，导致轴突变性和类似于MLD的神经系统症状的发展。(Eckhardt等人,J Neurosci.2007；27(34):9009-21)。

ASA(-/-)/hASAc69s小鼠表现出对hASA的免疫耐受性(无活性hASA的表达)和ASA(-/-)小鼠的MLD样表型的维持。已经用该模型研究了酶替代疗法(Matzner等人,MolMed.2007；13(9-10):471-9)。

ASA(-/-)/CST/hASAc69s小鼠是双转基因mASA小鼠，其具有对hASA的免疫耐受性(无活性hASA的表达)和异常的硫苷脂合成速率(脑苷脂磺基转移酶(CST)过度表达)。已经用该模型研究了酶替代疗法(Matthes等人,Hum Mol Genet.2012；21(11):2599-609)。

本发明的VLP优选衍生自John Cunningham病毒(JCV)。“JC病毒”或JohnCunningham病毒(JCV；NCBI分类标准10632)是人多瘤病毒。JCV具有二十面体对称性，直径约为45nm，并由72个VP1五聚体组成。还存在少量的结构蛋白VP2和VP3。

在本发明的上下文中，“病毒样颗粒”(VLP)被定义为具有由病毒结构蛋白或修饰的病毒结构蛋白或衍生自病毒结构蛋白的蛋白组成的外壳(也称为衣壳)的复制缺陷颗粒。如上所述，VLP本身不包含遗传物质。根据本发明的VLP优选衍生自人多瘤病毒，优选JCV，即其外壳优选由JCV的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3或JCV的修饰的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3或衍生自JCV的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3的蛋白组成。在一个优选的实施方案中，根据本发明的VLP由JC病毒的VP1蛋白组成。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，根据本发明的VLP的外壳中唯一的病毒结构蛋白是VP1蛋白。在最优选的实施方案中，根据本发明的VLP的外壳由VP1蛋白组成，即该外壳不包含任何其他蛋白。

病毒结构蛋白特别是VP1组装成五聚体结构(五聚体)。根据本发明，根据本发明的VLP外壳优选地由几种VP1蛋白，特别是几种VP1五聚体，尤其是72种VP1五聚体组成。

在本发明的上下文中，“五聚体”是当五个多肽例如VP1蛋白组装时形成的结构。组装成五聚体可能是由于多肽之间形成了共价或非共价键。多肽通常形成具有五边形对称性的环状结构。在五聚体中，每个多肽亚基优选与两个相邻的亚基相互作用。

根据本发明的“肽”可以由任何类型的任何数目的氨基酸，优选天然存在的氨基酸(其优选地通过肽键连接)组成。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选至少5个、至少7个、至少9个、至少12个或至少15个氨基酸。肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过500个氨基酸，优选地不超过400、300、250、200、150或120个氨基酸。超过约10个氨基酸的肽也可以称为“多肽”。

优选地，根据本发明的VLP的结构蛋白特别是VP1与JCV的天然结构蛋白相同或衍生自JCV的天然结构蛋白。“修饰或衍生”涵盖一种或多种氨基酸的插入、缺失或取代，同时保留VP1组装成衣壳的功能。

在一个实施方案中，可以对天然(JCV)结构蛋白进行修饰以便在其产生、其细胞靶向概况和特异性或其细胞内靶向概况或特异性方面优化根据本发明的VLP。修饰或衍生可包括对编码结构蛋白特别是VP1的核苷酸序列进行密码子优化，以增强蛋白翻译。

根据本发明的术语“VP1”或“病毒蛋白1”是指能够组装到衣壳中并且优选地与JCV的天然(自然)VP1相同或衍生自与JCV的天然(自然)VP1的蛋白。

根据本发明的术语“VP1”包括在序列上与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在本发明的最优选的实施方案中，VP1具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

根据本发明的术语“VP1”也包括天然VP1的部分。优选地，VP1的所述部分至少包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的32至316位的氨基酸或其衍生物，所述衍生物在该序列上与SEQ ID NO：3的氨基酸位置32至316的氨基酸序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％或至少99％的同一性。

在本发明的另一个实施方案中，VP1具有在其全长上与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO：4的氨基酸序列相同。

在一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列在其全长上与SEQ ID NO：5的核苷酸序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％相同，其优选为SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列在其全长上与SEQ ID NO：6的核苷酸序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％相同。在一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：6的核苷酸序列相同。

序列描述于表2。

表2：VP1蛋白的氨基酸和核苷酸序列。

在本发明的优选实施方案中，VP1的氨基酸序列在其整个长度上与根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列至少90％相同。

在本发明的一个优选实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列在其整个长度上与SEQID NO：5的核苷酸序列至少80％相同。

结构蛋白优选VP1可以在例如大肠杆菌或昆虫细胞中表达。根据本发明的一个优选实施方案，结构蛋白优选VP1在昆虫细胞中表达。这是有利的，因为与在大肠杆菌中的表达相比，在昆虫细胞中的表达导致与例如来自JCV的野生型蛋白相比更少的修饰，例如翻译后修饰。

根据本发明的VLP还可在衣壳中包含一种或几种另外的异源蛋白质，即与VP1的来源(例如，JCV)不同或不衍生自VP1的来源(例如，JCV)的蛋白质。例如，异源蛋白可以锚定在衣壳中，即该蛋白的至少一部分优选可从外部接近。原则上，任何蛋白质都适合作为这种异源蛋白质，只要该异源蛋白质可以掺入衣壳中并且基本不干扰根据本发明的VLP的组装。

根据本发明的VLP与货物缔合，即与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合。这意味着货物可逆地结合到VLP。这可以例如是由于与衣壳的任何部分的物理化学相互作用或附着，或者是由于货物掺入到衣壳中。掺入可以是完整的或不完整的。在本发明的一个特别优选的实施方案中，货物总量的主要部分完全掺入到衣壳中。最优选的是，将货物完全封装在根据本发明的VLP的衣壳中。

在本发明的上下文中，“VLP包含货物”的表述与VLP“与货物缔合”的表述同义。VLP与货物的缔合可能是用货物“装载”或“包装”VLP的结果。

“装载”是指导致VLP与货物缔合的任何过程，例如通过渗透冲击或通过将VP1或VP1五聚体与货物一起组装到VLP中。“装载的VLP”是此过程产生的VLP。术语“包装”涉及通过将VP1或VP1五聚体与货物一起组装到VLP中来装载VLP的过程。由此产生的VLP被称为“包装的”VLP。

在本发明的上下文中，术语“货物”用于溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体。

在本发明的一个具体实施方案中，根据本发明的VLP是在用于在受试者中治疗溶酶体贮积病的方法中使用的药物组合物的一部分，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在一个优选的实施方案中，药物组合物包含根据本发明的VLP、盐和缓冲剂，并且pH为7.0至8.0，优选为约7.5。该药物组合物优选包含：

a.120mM至170mM的NaCl，优选150mM的NaCl，

b.1-5mM的CaCl₂，优选2mM的CaCl₂，和

c.5至30mM的Tris-HCl，优选10至25mM的Tris-HCl，更优选10mM的Tris-HCl。

该药物组合物允许在生理条件下处理根据本发明的VLP。在这些条件下，根据本发明的VLP基本上保持完整，优选它们基本上保持其衣壳结构。如果装载有货物例如溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体，则根据本发明的VLP基本上保持与货物缔合。该药物组合物特别适合作为用于将根据本发明的VLP静脉内施用至受试者特别是人的药物组合物。

在另一方面，本发明涉及一种表达载体，其具有编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的编码区、选自包含CAG和CMV的组的启动子(优选为CAG)，并且其尺寸小于7kb，优选小于6kb。

在一个优选的实施方案中，由表达载体编码的溶酶体酶包含在其全长上与SEQ IDNO：2的核苷酸序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％相同的核苷酸序列，其优选是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

优选地，表达载体编码人芳基硫酸酯酶A，包含启动子CAG，并且具有小于6kb的尺寸。

如果在制造后没有立即施用根据本发明的VLP，则可以将其储存，优选储存在液氮中。

根据本发明的VLP可以根据标准方法表征，例如通过Bradford测定、HA、DLS、nDSF、HPLC-SEC、AF4、TEM表征。

本发明还涉及用根据本发明的VLP治疗溶酶体贮积病特别是MLD的方法。该治疗方法优选包括将VLP施用至有此需要的受试者的步骤。

本发明还涉及根据本发明的VLP在制备用于治疗溶酶体贮积病特别是MLD的药物中的用途。治疗方法优选不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。优选地，将本发明的VLP施用至尚未接受任何用于损害或破坏BBB的化学或物理治疗的患者。

本发明还涉及根据本发明的VLP，其用于将溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体穿过BBB递送至CNS，特别是CNS细胞，例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞。

重要的是，根据本发明的VLP穿过BBB能够使VLP展现出靶向脑内的特定细胞群的功能，即，将溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体递送至靶细胞，优选星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞。在本发明的上下文中，所述VLP包括递送至靶细胞和/或递送到靶细胞中。

在另一个实施方案中，本发明涉及将VLP与编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的表达载体缔合的方法，其中该方法包括以下步骤：

-提供VLP，尤其是衍生自JCV的VLP

-使VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下

-以1:0.1至1:0.5的VLP与表达载体的比例优选1:0.2的比例使五聚体暴露于表达载体，并暴露于诱导五聚体组装成与表达载体缔合的VLP的条件下

-可选地纯化VLP

-进行透析步骤。

在另一个优选的实施方案中，提供了将VLP与溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A或编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的表达载体缔合的方法，其中该方法包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

VLP与表达载体的比例(即包装比例)可以根据特定需要而变化。例如，VLP形成或基因表达的效率可以取决于该比例。优选地，使用1:0.1至1:0.5，更优选地1:0.2的VLP与表达载体的比例。本领域技术人员将针对特定表达载体(优选质粒)和所需用途调整比例。1:0.2的包比例为是优选的。

在本发明的上下文中，和为了易于解释，由步骤b)得到的VLP也可以称为“pVLP”(主要VLP)。由步骤d)得到的VLP也可以称为“rVLP”(重新组装的VLP)。由步骤f)得到的VLP也可以被称为“cVLP”(货物VLP)。根据本发明，货物是溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A，或编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的表达载体。

在本发明的另一方面，本发明涉及可通过上述方法获得的VLP。

在本发明的另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含由JCV衍生的根据本发明的VLP，其特征在于以下参数中的一个或多个：

a.多分散指数(PDI)小于0.3，优选小于0.2，优选小于0.1，更优选在0.01至0.09的范围内，

b.至少70％的VLP的平均直径为20nm至70nm，优选为30nm至70nm，更优选为35nm至65nm，更优选为40nm至60nm，

c.组合物中的VLP含量为至少80％(v/v)、优选至少85％(v/v)、优选至少90％(v/v)、优选至少95％(v/v)。

在另一个方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的药物递送系统。药物递送系统可以用于治疗和/或诊断的方法中，优选地用于治疗神经系统疾病，即溶酶体贮积病，特别是MLD。因此，本发明还涉及一种用根据本发明的药物递送系统治疗疾病，特别是CNS疾病的方法。该治疗方法优选包括将药物递送系统施用至需要其的受试者的步骤。

药物递送系统优选具有改善的功效。根据本发明的VLP可以在不事先增加BBB的穿透性的情况下穿过BBB。因此，本发明的药物递送系统可以用于治疗CNS疾病的方法，其中该方法不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。优选地，将本发明的药物递送系统施用至尚未接受任何用于损害或破坏BBB的化学或物理治疗的患者。

在本发明的又一方面，提供了一种包含VLP的组合物，其具有以下特征(“目标参数”)中的至少一个优选所有特征：

表3：根据本发明的VLP和含VLP的组合物的优选特性。

AUC＝曲线下面积

在一个实施方案中，根据本发明的VLP在nDSF分析中显示出＞67℃的主要拐点峰。

在一个实施方案中，根据本发明的VLP的AF4分析显示出小于20％的聚集体和小于15％的微小体(tiny)。至少70％为尺寸为40至50nm的VLP。

本发明的药物递送系统可以通过各种途径施用，包括口服、经皮、经鼻或肺途径或注射。特别优选的是允许药物产品具有全身作用的剂型。在一个具体的实施方案中，本发明的药物递送系统口服或肠胃外施用，特别是静脉内施用。

在本发明的上下文中，术语“药物递送系统”是指用于将药物产品施用至有需要的受试者，特别是人或动物的组合物。药物递送系统有利地使得能够将包含在其中或附着于其上的药物产品递送至感兴趣的部位(优选其在人或动物中)。优选地，递送对于靶标是选择性的，即，更多的药物产品被递送到靶标而不是身体或器官的其他部位。

“用于CNS的药物递送系统”是指药物递送系统选择性地靶向CNS。

根据本发明，表述使某种物质(例如VP1、五聚体、VLP)“暴露于”影响某种物质(例如诱导组装)的条件下是指将所考虑的材料(例如VP1、五聚体、VLP)置于可能导致这种特定影响(例如，诱导组装)的条件下。可以通过改变材料的条件来进行这样的暴露，例如通过使材料与不同的缓冲剂、盐或pH接触。这可以通过向包含材料的组合物中添加某种物质来实现或反之亦然，或者通过将材料与组合物分离，然后将材料加入至不同的组合物中来实现。

条件的改变也可以通过改变温度、辐射等来实现。自然地，这样的用于改变条件的手段可以被组合和/或重复。诱导期望效果(例如VP1或五聚体组装成VLP和/或诱导VLP的聚集)的其他合适条件也是本领域技术人员众所周知的。这同样适用于暴露于相应条件的合适持续时间；这可以通过本领域技术人员的普通方法来发现。

“将某种物质暴露于影响某种物质的条件”这一表达并不需要完成其效果，即并非所有材料都必须达到所考虑的效果。例如，“诱导五聚体聚集的条件”实质上意味着该条件适合于诱导聚集。并不需要确实所有五聚体都聚集。

如本文所用，术语“组装”或“组装成VLP”是指所考虑的结构(VP1蛋白或五聚体)缔合并建立VLP的衣壳。如果将VP1用作起始材料，则组装成VLP可以包括先形成五聚体，这意味着VP1蛋白可以首先形成五聚体，然后形成VLP，或者它们可以直接组装成VLP。VLP的组装是可逆的。

术语“分解”进而是指VLP的衣壳至少部分分解成五聚体结构和/或结构蛋白的过程。可以通过升高温度、通过添加蛋白酶和/或通过减少用于形成VLP的分子间相互作用例如分子间二硫键(例如，通过添加还原剂或添加螯合剂)来诱导分解。这样的条件还可以包括逐步暴露于条件。例如，可以在温度升高之前使组合物与还原剂接触。

诱导VP1和/或五聚体组装成VLP的方法是本领域技术人员通常已知的(Goldmann等人(J.Virol.1999；73(5):4465-69)；DE 195 43553A1)。这同样适用于将VLP分解为五聚体。因此，技术人员知道用于控制VLP的组装和分解的方法。

在本发明的一个实施方案中，包含VP1或五聚体的组合物中的Ca²⁺离子的浓度用于控制VLP的组装/分解。例如，为了诱导组装，可以增加游离Ca²⁺离子的浓度。如果需要分解，可通过向组合物中添加螯合剂来降低游离Ca²⁺离子的浓度。

诱导组装的另一种选择是增加VP1五聚体的浓度(例如通过减少包含五聚体的组合物中的溶剂)以促进组装成VLP。这可能需要调整碱土金属(例如Ca²⁺或Mg²⁺)的浓度。

根据本发明的优选实施方案，可以通过将VLP暴露于分子间二硫键被还原的条件下(例如通过使VLP暴露于还原条件下)来诱导分解。在一个优选的实施方案中，该步骤在另外存在螯合剂的情况下完成。更优选地，通过在螯合剂存在下和任选地在升高的温度下使VLP暴露于还原条件来诱导分解。

在本发明的特定实施方案中，优选在15℃至30℃、优选20℃至25℃、最优选在约23℃的温度下将VLP暴露于包含DTT和EDTA和/或EGTA的组合物。

根据本发明的优选实施方案，将c)的组合物的五聚体暴露于诱导其聚集的条件下。如果在步骤d)之前进行，此步骤是最合适的。在优选的实施方案中，至少20％、优选至少30％、更优选至少40％的材料(例如五聚体)聚集。

已经出乎意料地发现，该步骤可以导致VLP的更均匀的尺寸分布。这样可以实现更好的质量管理和标准化，如果在药物递送系统中使用VLP，这是至关重要的。因此，该额外程序优选地是药物递送系统的质量控制要求的一部分。

术语“聚集体”是指任何颗粒结构。“聚集”是指导致聚集的过程。这个过程是可逆的。

五聚体或VLP的聚集可以通过组合物中VLP的与对照相比增加的平均粒径来确定。较大的粒径可以通过标准方法例如动态光散射(DLS)来确定。

根据本发明的一个具体实施方案，五聚体或VP1的聚集可以由本领域已知的促进蛋白质沉淀的一种或多种试剂(沉淀剂)诱导。因此，根据本发明，最优选使用沉淀剂。

“沉淀剂”是指促进VP1或五聚体聚集的试剂。沉淀剂的概念通常是本领域技术人员已知的。沉淀剂通常用于促进蛋白质的浓缩和纯化。沉淀可以是改变溶剂的溶剂化潜能的结果，更具体地讲，是通过降低蛋白质的溶解度来实现的。也可以通过将组合物的pH调节至蛋白质的等电点来降低溶解度。此外，降低组合物的温度也可以降低蛋白质的溶解度。

可能的沉淀剂是例如聚乙二醇(PEG)或醇(例如乙醇)和盐。后者被本领域技术人员称为“盐析剂”。

优选地，根据本发明，沉淀剂是盐。最优选的是包含离子的盐，称为“Hofmeister系列”。Hofmeister系列描述了离子关于其对特定蛋白质的疏水作用(在其影响该蛋白质在溶液中的溶解度的能力方面)的顺序。特别优选对蛋白质具有疏水作用的离子。在本文中，这样的离子称为kosmotropic离子。

优选的是包含至少一种kosmotropic阴离子或阳离子的沉淀剂。优选的阴离子选自柠檬酸根(C₆H₅O₇ ^3-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、磷酸氢根(HPO₄ ^2-)、磷酸二氢根(H₂PO₄-)、碘酸根(IO₃ ^-)、氢氧根(OH^-)、氟化物(F^-)、溴酸根(BrO₃ ^-)或乙酸根(CH₃COO^-)或它们的组合，更优选的阴离子是柠檬酸根、磷酸根或硫酸根，最优选的阴离子是硫酸根。

优选的阳离子是铵或季铵化合物(NR₄ ⁺，R是烷基或芳基)，例如四甲基铵((CH₃)₄N⁺)或二甲基铵((CH₃)₂N₂ ⁺)。其他优选的阳离子选自钾(K⁺)、铯(Cs⁺)、铷(Rb⁺)或锂(Li⁺)或它们的组合，特别优选的是季铵化合物或铵，最优选的是铵。

因此，该盐优选包含选自以下的阴离子和阳离子：柠檬酸根(C₆H₅O₇ ^3-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、磷酸氢根(HPO₄ ^2-)、磷酸二氢根(H₂PO₄-)、碘酸根(IO₃ ^-)、氢氧根(OH^-)、氟化物(F^-)、溴酸根(BrO₃ ^-)或乙酸根(CH₃COO^-)、季铵化合物(NR₄ ⁺，R是烷基或芳基)，优选四甲基铵((CH₃)₄N⁺)或二甲基铵((CH₃)₂N₂ ⁺)，铵(NH₄ ⁺)、钾(K⁺)、铯(Cs⁺)、铷(Rb⁺)或锂(Li⁺)，优选包含SO₄ ^2-和/或NH₄ ⁺，或它们的组合。

根据一个优选的实施方案，该盐选自(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、(NH₄)₂HPO₄、K₂HPO₄和Na₂HPO₄。最优选的盐是硫酸铵((NH₄)₂SO₄)。

根据本发明，五聚体的聚集可以通过使五聚体与沉淀剂接触的任何方法来诱导，例如通过将沉淀剂添加到包含五聚体的组合物中，或反之亦然，即将包含五聚体的组合物添加至沉淀剂。其他方法(例如透析以使沉淀剂通过扩散到达五聚体)也是可能的。

根据本发明的一个优选实施方案，通过对包含沉淀剂的组合物，例如包含硫酸铵的组合物进行透析来诱导五聚体的聚集。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，包含用于聚集的五聚体的组合物具有0.3至5M，优选至多4M的硫酸铵浓度，甚至更优选的是1.8至2.2M的浓度。最优选的是约2M。

诱导五聚体聚集的步骤的持续时间优选为至少1小时，更优选为至少5小时，甚至更优选为至少12小时，最优选为至少16小时。优选该步骤的持续时间小于24小时。在一个优选的实施方案中，该步骤的持续时间为14至19小时。在最优选的实施方案中，该步骤的持续时间为16至18小时。在此期间，五聚体暴露于诱导聚集的条件下，特别是它们与硫酸铵接触。

在诱导五聚体聚集的步骤之后，有利的是，将五聚体与已经用于诱导聚集的条件分离的步骤包括在本发明的方法中。适用于这样的步骤的方法没有特别限制；允许将五聚体与聚集诱导条件分离的本领域技术人员已知的任何方法均适用。

在本发明的优选实施方案中，通过透析使五聚体与诱导其聚集的条件分离。如果通过使用沉淀剂诱导五聚体的聚集，则可以使用透析。也可以有利地应用透析原理以使五聚体与沉淀剂接触。如果根据本发明的方法包括至少两个透析步骤，最优选的是：针对包含沉淀剂的组合物进行步骤c)的组合物的第一次透析，以及在诱导聚集后针对基本上不含沉淀剂的组合物进行第二次透析。

用于将五聚体与沉淀剂分离的透析优选是针对至少类似于生理条件的组合物。这样的组合物优选包含盐并且具有6至8.5，优选6.5至8.5，更优选7至8，最优选7.2至7.5，特别是7.5的pH。组合物的重量克分子渗透压浓度优选为280至310mosmol/l，最优选308mosmol/l。该组合物可以例如具有0.8至0.92％(w/v)，优选0.9％(w/v)的盐水(氯化钠)浓度。

将五聚体与用于诱导聚集的条件分离优选进行至少1小时，更优选至少5小时、12小时，更优选至少18小时，更优选大约24小时或更长时间。取决于被诱导聚集的五聚体的浓度、包含五聚体的组合物以及沉淀剂的性质和浓度，更长的时间也是可能的。在一个优选的实施方案中，将包含聚集的五聚体的组合物针对与生理条件相似的组合物透析约24小时。

组合物优选还包含缓冲剂。合适的缓冲系统是本领域技术人员已知的。在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含TRIS缓冲剂、HEPES缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或碳酸氢盐缓冲剂系统。最优选的是TRIS缓冲剂。

在最优选的实施方案中，组合物包含10mM Tris-HCl和150mM NaCl，并且pH为7.5。

为了促进五聚体组装成VLP，组合物可进一步包含二价离子，例如Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺或其组合。最优选的是Ca²⁺，例如CaCl₂。在一个优选的实施方案中，组合物包含1-3mM CaCl₂，优选2mM CaCl₂。

在本发明的非常优选的实施方案中，至少与生理条件相似的组合物包含10mMTris-HCl、150mM NaCl和2mM CaCl₂，并且pH为7.5。

在本发明的另一个方面，出乎意料地发现，与五聚体的储存相比，VLP(rVLP)的储存是有利的(图14和15)。如果储存五聚体然后将其解冻并重新组装，则主要形成“微小”颗粒以及聚集体。这些VLP不适合用于生产药物递送系统。然而，在储存后已解离并重新组装的VLP形成根据本发明的适当尺寸的VLP的特别均匀的群体。因此，在本发明的一个实施方案中，向组合物提供具有20nm至70nm、优选30nm至70nm、更优选35nm至65nm、更优选40nm至60nm的平均直径的颗粒。为了满足质量控制要求，均匀的尺寸分布很重要。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括储存来自步骤d)的组合物的VLP的步骤。将VLP在约-80℃至约4℃的温度下储存至少10小时、15小时、20小时、优选至少24小时是可能的。甚至超过3天的储存是可能的。

在优选的实施方案中，将VLP储存在低于0℃的温度下(冷冻)。可以使用不同的冷却速率进行冷冻。例如，通过施加每分钟约-1℃的冷却速度可发生“慢速”冷冻，而可通过使样品(即包含组合物的容器)与液氮接触或通过将样品置于-80℃的冰箱中来进行快速冷冻。

在一个优选的实施方案中，在包含冷冻添加剂的组合物中进行储存，所述冷冻添加剂优选选自包含以下的组：多元醇、糖、无机盐、有机盐、氨基酸、聚合物、极端电解质(extremolyte)或衍生物或其组合。

在一个优选的实施方案中，无机盐包含硫酸根阴离子。优选的包含硫酸根阴离子的盐是硫酸钾、硫酸钠、硫代硫酸钠、硫酸镁和硫酸铵。优选地，无机盐是硫酸铵。

氨基酸优选是甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丙氨酸。优选的氨基酸衍生物是甜菜碱。其他可能的冷冻添加剂是甘油、蔗糖、DMSO、ectoin或hydroxyectoin。

已经发现，添加冷冻添加剂，特别是添加无机盐(例如包含硫酸根阴离子的盐，特别是硫酸铵)和/或氨基酸衍生物(例如甜菜碱)在VLP的稳定性、功能性或功效方面是有利的(图19)。如上所述，当使用VLP作为药物递送系统时，特别期望增强的稳定性和/或功能性或功效。出乎意料的是，在步骤d)的组合物中冷冻添加剂的添加在稳定性和功能性或功效方面对步骤f)的包装的VLP有影响。

冷冻添加剂的目的是保护生物组织免受冷冻损害(即由于冰的形成)。冷冻添加剂通常通过增加细胞中的溶质浓度来发挥作用。但是，为了适合生物学用途，它们必须易于穿透并且对细胞没有毒性。因此，这样的添加剂适合为五聚体和/或VLP提供较温和的储存条件。可以将冷冻添加剂添加到包含五聚体和/或VLP的组合物中以冷冻储存。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，将冷冻添加剂添加到包含VLP的组合物中，以在使用两个透析步骤(两步重新组装)组装VLP(优选rVLP)之后进行随后的冷冻。

除了基于多元醇的冷冻添加剂以外，冷冻添加剂的合适摩尔浓度可以是0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、2M、3M、4M、5M。这些冷冻添加剂优选以约1M的摩尔浓度使用，优选以1M的摩尔浓度使用。

基于多元醇的冷冻添加剂可以以至少0.3M，至少0.4M，至少0.5M，至少0.6M，至少0.7M，至少0.8M，至少0.9M，至少1M，至少2M或至少3M的摩尔浓度使用。优选地，可以以约0.6M至0.7M的浓度，更优选以0.68M的浓度使用基于多元醇的冷冻添加剂(优选为5％的甘油)。

或者，可以基于包含五聚体和/或VLP的组合物的体积百分比来添加基于多元醇的冷冻添加剂。合适的体积百分比包括3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)或10％(v/v)。优选地，以5％(v/v)添加基于多元醇的冷冻添加剂。

在本发明的优选实施方案中，对步骤c)的五聚体和/或步骤d)的VLP进行纯化。在本发明的上下文中，术语“纯化”是指从复杂的组合物中分离或分隔VP1、五聚体或VLP。可能的方法包括沉淀优选离心，过滤例如超滤和/或错流过滤，优选错流过滤，色谱例如制备色谱，优选尺寸排阻色谱或亲和色谱，和/或动态光散射(DLS)。特别地，可以使用DLS选择VLP。

是可以使用的示例性过滤单元。

术语“色谱”是指一种方法，其允许通过在固定相和流动相之间分配其各个成分来分离物质的混合物。特别地，色谱是指通过首先将目标物质结合并富集到固定相上然后在第二步骤中将其洗脱(色谱的结合和洗脱模式)或通过将杂质结合到固定相上并提高流通中的目标分子的纯度(流通模式)来纯化物质的方法。

色谱可以根据流动相中包含的分析物与固定相之间的相互作用进行分组。根据本发明的色谱的优选类型包括“反相”色谱、“离子交换”色谱、“亲和”色谱或尺寸排阻色谱(SEC)。在离子交换色谱中，可以基于固定相中存在的电荷将纯化方法进一步分离为阳离子交换色谱(CEX)(其中固定相具有负电荷，从而保留带正电荷的分子)以及阴离子交换色谱(AEX)(其中固定相具有正电荷，从而保留带负电荷的分子)。

特别地，色谱可以用于纯化通过根据本发明的方法获得的作为中间产物的rVLP。特别地，可以使用AEX纯化rVLP。

AEX中使用的固定相可以根据通过将固定相中存在的材料交换成“强阴离子交换剂”和“弱阴离子交换剂”所提供的离子相互作用的强度来进一步描述。术语“阴离子交换剂”或“阴离子交换基质”是同义词，两者均指天然或人造物质，其可以结合阴离子并可以将其与周围介质中的阴离子交换。阴离子交换剂携带正离子并交换带负电荷的抗衡离子。

本发明的VLP可以用核酸酶进一步处理和/或进行无菌过滤。如果将核酸例如表达载体用作货物，则优选进行核酸酶处理。不同的核酸酶是本领域技术人员已知的，包括例如benzonase。核酸酶用于水解未与VLP缔合的残留DNA。无菌过滤的方法尤其包括使用适于去除杂质的过滤器的渗滤或超速离心。这些处理对于本发明的VLP的临床应用特别有利。

可以将根据本发明的包含VLP的组合物的粒度分布评估为“多分散指数”(PDI)。PDI表示组合物中粒径的分布，因此描述了颗粒的均匀性。可以使用不同的方法获得PDI值，包括凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱、流变学、溶液粘度、膜渗透或光散射。

PDI优选地由动态光散射(DLS)确定。在DLS中，原始分布是指示从各种“切片”散射的光量的强度分布。DLS允许根据分布统计信息确定平均尺寸和与该平均尺寸的标准偏差。相对多分散性可以通过将标准偏差除以平均值来确定。从分布的相对多分散性可以得出作为其平方的多分散指数(PDI)。通过DLS获得的PDI值可以分为单分散的(PDI＜0.1)组合物和多分散的(PDI＞0.1)组合物，由此在多分散的组中较小的值还表明组合物内的分布更均匀。

根据本发明，0.1至0.4的PDI值是优选的。PDI值更优选为0.1至0.3，甚至更优选为0.1至0.2。

根据本发明的包含VLP的组合物的平均直径可以通过视觉方法(例如显微镜，优选地配备有确定平均直径的软件)来测量，但是也可以通过分析光散射方法例如DLS或纳米跟踪方法例如NTA来测量。

组合物中的VLP含量可以通过例如FFF-MALS和/或DLS测量。两种方法都可以区分尺寸合适的VLP和聚集体、“微小体”(小颗粒)和其他杂质，例如盐、碎片或五聚体。

这种包含根据本发明的VLP的组合物尤其满足通常施加在药物递送系统上的要求。显然，这样的组合物是均匀的并且具有高纯度。

在另一个方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的药物递送系统。这样的药物递送系统具有如上所述的优点。特别地，这样的药物递送系统可以用于治疗和/或诊断的方法中，优选地用于治疗神经系统疾病，即CNS疾病，即溶酶体贮积病，特别是MLD。

因此，本发明还涉及用根据本发明的药物递送系统治疗病症，特别是CNS疾病，即溶酶体贮积病，特别是MLD的方法。治疗方法优选包括将药物递送施用至有此需要的受试者的步骤。

本发明还涉及该药物递送系统在制备用于治疗神经系统疾病(即CNS疾病，即溶酶体贮积病，特别是MLD)的药物中的用途。治疗方法优选不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。优选地，将本发明的药物递送系统施用至尚未接受任何用于损害或破坏BBB的化学或物理治疗的患者。

在一个实施方案中，根据本发明的VLP穿过血脑屏障(BBB)。因此，在本发明的一个实施方案中，药物递送系统可以用于穿过BBB递送溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体。根据本发明，药物递送系统和/或VLP和/或溶酶体酶和/或编码溶酶体酶的表达载体可以穿过BBB。

重要的是，药物递送系统穿过BBB使药物递送系统能够发挥其靶向脑内的特定细胞群的功能，即将货物递送至靶细胞。在本发明的上下文中，所述药物递送系统包括递送至靶细胞和/或递送到靶细胞中。

在一个优选的实施方案中，本发明的VLP和/或其货物在施用至待治疗的受试者，特别是人后，可以在少于10天，优选少于5天，在CNS中被检测到。优选在施用后少于3天。优选将药物递送系统静脉内施用至受试者。当将VLP用作可靠的药物递送系统时，这特别有利。

优选地，该方法不需要BBB的完整性损失或增加BBB的穿透性。

根据本发明，不需要在施用药物递送系统之前或期间损害BBB的穿透性。因此，BBB优选在生理上是完整的，这意味着与健康的天然状态相比，完整性没有降低和/或穿透性没有增加。本发明的VLP优选穿过生理上完整的BBB。

包含药物递送系统的组合物优选不需要可能破坏BBB完整性的添加剂。因此，在本发明的最优选的实施方案中，药物递送系统不含任何可影响BBB的穿透性的添加剂。

材料和方法

VLP制造

病毒样颗粒(VLP)通过使用衍生自秋粘虫(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda))的Sf9昆虫细胞系(Thermo Fischer scientific)通过蛋白表达来制造。通过用含有John Cunningham病毒VP1-蛋白表达盒的重组杆状病毒感染细胞来产生VLP。重组杆状病毒是通过使用

杆状病毒表达系统(Thermo Fischer Scientific)制备的。在pH 6.3下在3.4L生物反应器(INFORS HT Minifors)中放置7至10天后，产生VLP。随时间控制气流和温度(26℃)。为了除去细胞和细胞碎片，将悬浮液在4℃、5,000g下离心，收集含有VLP的上清液。

之后，使用两种不同的浓缩方法对VLP进行浓缩：使用7.5％的聚乙二醇(PEG)的沉淀或使用

系统(GE Healthcare)的错流。为了进行PEG沉淀，将澄清的上清液与PEG混合以达到7.5％(v/v)的浓度，并在4℃下孵育2小时，然后通过在4℃、10,000g离心分离出沉淀并将其悬浮在50mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.5)中。错流是使用配有300kDa截止膜(

300kDa ECO,Sartorius)的

系统进行的。流动超滤在1.5巴的恒定压力下以8的因子(1L上清液针对8L缓冲剂)进行。

通过在室温下使用5mM DTT和10mM EDTA持续70分钟将VLP进一步分解为五聚体，然后使用HiScale CaptoQ柱(GE Healthcare)通过阴离子交换色谱(AEX)以150mM至1MNaCl的NaCl梯度纯化五聚体。用250mM NaCl步骤洗脱五聚体。洗脱后，如下处理五聚体：

立即放入20kDa截止值的透析盒(Slide-A-Lyzer^TM G2 Dialysis Device,ThermoScientific)中，并通过两步重新组装通过透析(两步透析)进行重新组装。首先，将五聚体针对2M硫酸铵缓冲剂(“AS”，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，2M(NH₄)₂SO₄，pH 7.5)透析24小时，然后对于接下来的24小时转移到10mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl₂(pH 7.5)(标准重缔合缓冲剂，“ST”)中。为了从VLP中分离出未重新组装的材料和聚集体，可使用HiPrep^TM

S-500HR色谱柱(GE Healthcare)通过尺寸排阻色谱(SEC)在级分的多分散指数(PDI)控制下在使用Zetasizer ZS Nano(Malvern Inc.)的动态光散射(DLS)中纯化包含VLP的组合物。选择具有目标尺寸的VLP级分并合并，然后在带有5kDa截止膜的

浓缩器(Sartorius)中浓缩，然后在-80℃下储存(如果适用)。

少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞中VLP的检测

将10μm薄的小鼠脑切片在二甲苯随后100％至70％的乙醇浓度中和随后用水再水化。之后，内源性过氧化物酶用0.5％H₂O2灭活，并用3％牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点。用VP1抗体(在牛奶中以1：500稀释)和荧光缀合的二抗检测VP1蛋白。脑细胞用细胞特异性标记物染色：

Olig2–少突胶质细胞(在牛奶中以1：200稀释)

NeuN–神经元(在牛奶中以1：200稀释)

IbaI–小胶质细胞(在牛奶中以1：200稀释)。

细胞核用Hoechst33342试剂(2μg/ml)染色。用荧光显微镜(Nikon)观察载玻片。

用于验证BBB穿透的人工血脑屏障(BBB)模型

VLP的BBB穿透通过在两室人工BBB模型中使用单一培养物通过直接定量穿透的以下荧光标记的材料来评估：4kDa FITC-葡聚糖，70kDa TRITC-葡聚糖，FITC标记的pNL1.1质粒(构建体)或包装到VLP中的FITC标记的pNL1.1质粒(包装)。

为此，将24孔可穿透的支持物(插片，1μm，ThinCert，Greiner Bio-One)转移至装有900μl培养基(DMEM/F-12，HEPES，Thermo Fisher Scientific)的24孔板(Greiner Bio-One)中。随后，将7.5*10⁴个BBB细胞(HBEC-5i，脑微血管内皮细胞)接种到含有200μl相同培养基的插片中。每隔一天更换孔中的培养基，将细胞孵育96小时至120小时。

将制备好的插片小心地转移到每孔装有900μl无酚培养基(DMEM/F-12，HEPES，无酚红，Thermo Fisher Scientific)的新的24孔板中。在将样品添加到插片之前，除去相应量的培养基，以在每个插片中保持恒定量的200μl培养基。在培养箱中于37℃孵育120分钟后，将每孔的3x 100μl转移至黑色96孔板，并使用酶标仪(Tecan Infinite M200，Tecan)测定样品的荧光。

小麦胚芽凝集素(WGA)染色是通过在室温下用与Alexa488缀合的WGA抗体将细胞膜染色15分钟以上来进行的。

为了确认BBB的形成，通过在插片中添加EDTA来破坏BBB。将插片转移至含有新鲜无酚培养基的24孔板中。将EDTA(c_End＝5mM，约5μl)添加至插片，并在37℃孵育90分钟。之后，如上所述测定荧光。通过将携带BBB细胞的插片的荧光信号标准化至没有BBB细胞的适当插片来计算穿透率。以相同的方式，在添加EDTA之后，验证BBB的完整性。

编码hASA的表达载体的克隆

表达载体：

1)pFAR-CMV-ASA(3.5kb)

2)pFAR-CAG-ASA(4.6kb)

3)pNL-BB-ASA(4.9kb)

4)pSF-CAG-ASA切割(3.1kb+3.7kb*)

从pFAR4质粒主链(如US 8,440,455B2的SEQ ID NO：21中公开，并在本文中公开为SEQ ID NO：7)、分别地CMV和CAG启动子以及人ASA基因(SEQ ID NO：2)产生构建体1和构建体2。

为了产生构建体3(4.9kb)，使用Gibson组装将hASA基因(SEQ ID NO：2)插入到pNL1.1质粒主链(Promega)中。该构建体包含CMV启动子。

为了产生构建体4(3.1kb+3.7kb)，将hASA基因(SEQ ID NO：2)插入到pSF-CAG质粒主链(Oxford Genetics)中，然后借助两种限制酶通过hASA表达载体的限制性消化来线性化。

用编码hASA的表达载体包装VLP

为了将hASA表达载体包装到VLP中，从-80℃取出预重新组装的VLP，并使用热振荡器(23℃，350rpm)解冻。随后，通过在解离缓冲剂(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT和10mM EDTA)存在下，将样品在23℃和450rpm下孵育15分钟来解离VLP。在hASA表达载体的存在下，解离的VLP被重新组装。简而言之，将解离的VLP与hASA表达载体以适当的浓度充分混合(VLP与表达构建体的包装比例为1：0.2)，然后将混合物针对标准重新缔合缓冲剂(10mMTris-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl₂，pH7.5)使用20kDa MWCO透析室(Slide-A-Lyzer^TM MINI透析设备，Thermo Scientific)进行透析。将样品孵育16至18小时。将样品从透析室转移到新鲜的反应杯中，并将未包装的核酸即表达载体通过在37℃下使用每25μgVLP 40u

核酸酶(Merck)和2.5mM MgCl₂孵育1小时来消化。过滤样品(

离心管过滤器；孔径0.22μm)，并在液态N2中冷冻。之后，分析和/或将VLP储存在-80℃。

VLP表征

为了验证样品的稳定性，使用Tycho NT.6(Nanotemper)通过nDSF评估每个样品的拐点温度。

为了分析样品组成，进行了不对称流场流动分离(AF4，Wyatt Inc.)。通过使用多角度光散射(MALS)、动态光散射(DLS)和UV检测器分析样品。

借助在80kV电压下工作的Zeiss EM900电子显微镜进行透射电子显微镜(TEM)分析以在不同的实验步骤下直接可视化样品。对于这种方法，样品事先使用2％乙酸铀酰(Sigma Aldrich)在碳涂层的铜网格(Plano GmbH)上染色。

hASA在细胞中的表达：RNA分离、cDNA合成和qPCR

在将细胞与样品(即与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP)一起孵育72小时后，使用胰蛋白酶收获胶质母细胞瘤细胞，沉淀并使用PBS洗涤。

使用RNA分离试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞沉淀物中分离出RNA。分离后，使用NanoDrop(Thermo Scientific)测定RNA浓度。

对于cDNA合成，使用250ng RNA。之后，将cDNA样品在ddH₂O中以1：5稀释，并将样品保存在-20℃下直至使用。

使用EvaGreen染料和适用于hASA的合适引物以1:10稀释度在Lightcycler(CFX96Touch，BioRad)中进行qPCR。

用VLP/hASA注射小鼠

动物：BALB/cJ雄性，由Janvier Labs提供，研究开始时年龄为10周。

分组：

组	时间点1(72h)	时间点2(120h)
			第1组-媒介物	2只小鼠(1-2)	2只小鼠(3-4)
第2组–pCAG质粒	2只小鼠(9-10)	2只小鼠(11-12)
			第3组–EPCs+pCAG质粒	5只小鼠(23-27)	5只小鼠(28-32)

用180μl的测试化合物或媒介物静脉内注射动物一次。每个治疗组中的一半小鼠在注射后72小时终止，另一半在注射后120小时终止。

终止后，将动物用Tris缓冲盐水灌注，并采样以下器官：脑、肾、肝、肺、心脏。组织样品在液态N₂中进行休克冷冻，并保存在-80℃下。

用qPCR分析肝脏和脑中的mRNA

将一部分组织置于具有RNA酶的500μl TBS+0.5％Triton-X100中，并通过3个循环每次20秒的超声处理均质化。将样品以11,000rpm离心10分钟。使用RNA分离试剂盒(Macherey-Nagel)从组织中分离RNA。分离后，使用NanoDrop(Thermo Scientific)测定RNA浓度。

蛋白质印迹

将一部分组织置于500μl TBS+0.5％Triton-X100中，并通过3个循环每次20秒的超声处理均质化。将样品以11,000rpm离心10分钟，并用BCA测定测量蛋白质浓度。将50μg的每个样品放入凝胶(4-20％梯度SDS-PAGE)中，并进行标准电泳和印迹法。在用缓冲剂洗涤并在5％的牛奶中于4℃封闭过夜后，制备抗体染色(hASA抗体，在牛奶中以1：500稀释)。用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体进行二抗染色。染色后，将膜用缓冲剂洗涤并显影。之后，用缓冲剂洗涤膜，用剥离缓冲剂剥离并用肌动蛋白(1-19)HRP缀合的抗体(在牛奶中以1：1000的稀释度)染色以进行肌动蛋白对照染色。

实施例

1.共定位分析显示少突胶质细胞中VP1蛋白的存在

进行共定位实验以鉴定VLP的各个靶细胞。为此，将VP1蛋白与标志物Olig 2共定位，该标志物特异性位于少突胶质细胞上。如图1的左下图所示，通过使用Olig2标志物，可以在脑切片中检测到几个不规则的斑点，其在每种情况下也都被核染色剂DAPI染色(图1的左上图)并因此指示少突胶质细胞。如图1右下图所示，这些少突胶质细胞中的每一个也都对VP1蛋白呈阳性。对Olig2和VP1呈阳性的细胞标有白色箭头。因此，VP1蛋白位于CNS少突胶质细胞中。因此，本发明的VLP特别适合于治疗性治疗与少突胶质细胞相关的疾病，例如MLD。

2.共定位分析显示神经元中VP1蛋白和萤光素酶的存在

在另一个共定位实验中，将VP1蛋白与标志物NeuN共定位，该标志物特异性位于神经元上。如图2的左下图所示，通过使用NeuN标志物，可以在脑切片中检测到几个不规则的斑点，其在每种情况下也都被核染色剂DAPI染色(图2的左上图)并因此指示神经元。如图2右下图所示，这些神经元中的每一个也对VP1蛋白呈阳性。对NeuN和VP1呈阳性的细胞标有白色箭头。因此，VP1蛋白位于CNS神经元中。

3.共定位分析显示小胶质细胞中VP1蛋白和萤光素酶的存在

在另一个共定位实验中，将VP1蛋白与标志物Iba1共定位，该标志物Iba1特异性位于小胶质细胞上。如图3的左下图所示，通过使用Iba1标志物，可以在脑切片中检测到几个不规则的斑点，其在每种情况下也都被核染色剂DAPI染色(图3的左上图)并因此指示神经元小胶质细胞。如图3右下图所示，这些小胶质细胞中的每一个也对VP1蛋白呈阳性。对Iba1和VP1呈阳性的细胞标有白色箭头。因此，VP1蛋白位于CNS小胶质细胞中。

4.在体外BBB模型中，与pNL质粒缔合的VLP显示出良好的穿过BBB的穿透性

图4A和B显示了体外BBB穿透模型。图4A显示了BBB细胞的细胞核的DAPI染色(左)和WGA染色(右)。细胞层是完整的，代表完整的BBB。

图4B显示了BBB模型中荧光染料(FITC，TRITC)、与质粒偶联的荧光染料(FITC-pNL)和与pNL质粒缔合的VLP的穿透。显示了相对于无细胞穿透的％穿透。左四列是没有EDTA的样品，右四列是有EDTA的样品。可以看出，尽管所有四个样品都在一定程度上穿过了人工BBB，但代表与pNL质粒缔合的VLP的样品“包装”显示出最高的穿透率。EDTA对BBB的破坏打开了所有四个样品的BBB。

5.健康小鼠的脑中ASA mRNA水平的显著增加

注射了与编码ASA的表达载体缔合的VLP的健康小鼠的肝脏和脑中的mRNA分析显示72和120小时后脑中ASA mRNA显著增加(图5)。没有VLP的表达载体(质粒)的注射没有导致表达增加。因此，表达是在脑中特异性发现的。

6.脑中ASA mRNA的单只小鼠分析

注射与编码ASA的表达载体缔合的VLP后72小时(上图)和120小时(下图)后的单只小鼠分析(图6)。数字表示单只小鼠。在这些分析的几乎所有小鼠中，观察到了增加的ASA表达。

7.脑中ASA蛋白的单只小鼠分析

注射与编码ASA的表达载体缔合的VLP后，健康小鼠的脑中的ASA蛋白的单只小鼠分析(蛋白质印迹，上图)和相应的qPCR分析(下图)示于图7。比较媒介物(缓冲剂)、质粒和质粒+VLP。明显的是，VLP与质粒的缔合导致脑中ASA的增加的mRNA和蛋白表达。

8.具有不同hASA表达构建体的ASA表达

图8显示了通过qPCR分析人ASA在胶质母细胞瘤细胞中的表达。将该值相对于各个质粒对照标准化。

图8A中的表达载体是：

构建体1：pFAR-CMV-ASA(3.5kb)

构建体2：pFAR-CAG-ASA(4.6kb)

构建体3：pNL-BB-ASA(4.9kb)

构建体4：pSF-CAG-ASA切割(3.1kb+3.7kb*)

VLP：质粒的包装比为1：0.2。所有四个表达载体导致ASA表达。

在图8B中，以两种不同的包装比(高浓度[1:0.5的VLP:质粒]和低浓度[1:0.2的VLP:质粒])使用A的构建体4(pSF-CAG-ASA切割(3.1kb+3.7kb*))。可以看出，低浓度[1:0.2的VLP:质粒]导致较高的ASA表达。

9.与不同的hASA表达构建体缔合后的VLP分析：nDSF和AF4分析

图9A通过nDSF分析显示所有四个样品(与图8A的表达载体缔合的VLP)是稳定的。AF4分析(图9B)进一步显示，VLP的级分优于微小体、聚集体和残留物的级分，因为大多数检测到的颗粒是VLP，即VLP是非常均质的。

10.与表达载体缔合的VLP的TEM图像

图10显示了未包装的VLP(没有缔合的表达载体)(左)和与四种不同的表达载体(右；与图8A中相同的表达载体)缔合的VLP的比较。可以看出，所有样品都显示了其外观与未包装的VLP相同的VLP。

其他实施例的材料和方法

VLP制造

病毒样颗粒(VLP)通过使用衍生自秋粘虫(草地贪夜蛾)的Sf9昆虫细胞系(ThermoFischer scientific)通过蛋白表达来制造。通过用含有John Cunningham病毒VP1-蛋白表达盒的重组杆状病毒感染细胞来产生VLP。重组杆状病毒是通过使用

300kDa ECO,Sartorius)的

系统进行的。流动超滤在1.5bar的恒定压力下以8的因子(1L上清液针对8L缓冲剂)进行。

a)与货物混合并重新组装(参见“将新鲜或储存的五聚体与货物一起包装”)；

b)在-80℃下用5％甘油冷冻以储存五聚体(随后可与货物混合并重新组装，参见“将新鲜或储存的五聚体与货物一起包装”)或

c)立即放入20kDa截止值的透析盒(Slide-A-Lyzer^TMG2 Dialysis Device,ThermoScientific)中，并通过两步重新组装通过透析(两步透析)进行重新组装。首先，将五聚体针对2M硫酸铵缓冲剂(“AS”，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，2M(NH₄)₂SO₄，pH 7.5)透析24小时，然后对于接下来的24小时转移到10mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl₂(pH 7.5)(标准重缔合缓冲剂，“ST”)(AS>ST)中。备选地，在两个步骤中都使用ST缓冲剂进行两步透析(ST>ST)。在这两种情况下，为了从VLP中分离出未重新组装的材料和聚集体，可使用HiPrep^TM

浓缩器(Sartorius)中浓缩，然后在-80℃下储存(如果适用)。

将重新包装的VLP与货物一起包装

对于重新组装的VLP的VLP包装，从-80℃取出上述步骤c)中储存的VLP，并使用热振荡器(23℃，350rpm)解冻。随后，通过在解离缓冲剂(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mMDTT和10mM EDTA)存在下将样品在23℃和45rpm下孵育15分钟来解离解冻的VLP样品。解离的VLP在货物(例如核酸)的存在下重新组装。简而言之，将解离的VLP与货物以适当的浓度充分混合，然后使用20kDa MWCO透析室(Slide-A-Lyzer^TM MINI透析设备，ThermoScientific)针对标准重缔合缓冲剂(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl₂，pH7.5)透析混合物。4至6小时后，将透析缓冲剂替换为新鲜的透析缓冲剂，并将样品再孵育16至18小时。如果使用核酸作为货物，则将未包装的核酸通过在37℃下使用每25μgVLP 40u

核酸酶(Merck)和2.5mM MgCl₂孵育1小时来消化。在分析之前，将样品过滤(

离心管过滤器；孔径0.22μm)。之后直接分析VLP和/或将其保存在-80℃。

将新鲜或储存的五聚体与货物一起包装

对于五聚体包装，将新鲜的或在-80℃下储存的五聚体直接混合并与货物重新组装，或使用热振荡器(23℃，350rpm)解冻，然后在存在货物(例如核酸)的情况下重新组装。简而言之，将五聚体与货物以适当的浓度充分混合，然后使用20kDa MWCO透析室(Slide-A-Lyzer^TM MINI透析设备，Thermo Scientific)针对标准重缔合缓冲剂(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl₂，pH7.5)透析混合物。如果使用核酸作为货物，则将未包装的核酸通过在37℃下使用每25μg重组装的VLP 40u

核酸酶(Merck)和2.5mM MgCl₂孵育1小时来消化。重新组装的五聚体随后被直接分析。

VLP/萤光素酶测定的功能测试

在装载有核酸的VLP(由新鲜或储存的五聚体制造，或由重新组装和纯化的VLP制造)的情况下，萤光素酶

质粒已被用作货物。胶质母细胞瘤细胞预先在补充有10％FCS(Thermo Fisher)和1％Pen-Strep(PAN-Biotech)的900μl DMEM培养基、高葡萄糖、GutaMAX^TM(Thermo Fisher)中以3*10⁴的密度接种24小时。在添加样品之前，除去相应量的培养基以在每个孔中保持恒定量的培养基。将样品添加到细胞中，并在37℃和5％CO₂下孵育48小时。之后，去除细胞培养基，并用PBS洗涤细胞。萤光素酶活性根据制造商的说明(

萤光素酶测定(Promega))进行测定。在

多检测系统(Promega)中测量白色96孔板(Greiner bio-one)中的发光。

VLP表征

为了验证样品的解离、重组和稳定性，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern.)测量样品的动态光散射(DLS)和多分散指数(PDI)。使用Zetasizer软件(版本7.11，Malvern)记录VLP尺寸和PDI。另外，使用Tycho NT.6(Nanotemper)通过nDSF评估每个样品的拐点温度。

为了分析样品组成，进行不对称流场流动分离(AF4，Wyatt Inc.)。通过使用多角度光散射(MALS)、动态光散射(DLS)和UV检测器分析样品。

用于验证BBB穿透的人工血脑屏障(BBB)模型

VLP的BBB穿透通过在两室人工BBB模型中使用单一培养物(直接定量穿透的荧光标记物质)或共培养物(靶细胞中由穿透物质引起的蛋白质表达)来评估。

在这两种情况下，事先用1:20纤连蛋白(BioReagent)和1:75I型胶原蛋白(MerckMillipore)在磷酸缓冲盐水(PBS)中的混合物将24孔可穿透性支持物(插片，0.4μm，Corning Costar)在37℃下涂覆90分钟。小心除去多余的涂层后，将经涂覆的插片转移到装有900μl培养基(EndoGRO，SCME004，Merck Millipore)的新的24孔板(Greiner Bio-One)中。将7.5*10⁴个BBB细胞(HBEC-5i，脑微血管内皮细胞)接种到含有200μl培养基的插片中。每隔一天更换孔中的培养基，将细胞孵育96小时至120小时。

单一培养物实验(荧光标记的货物的穿透)

为了确认BBB的形成，通过在插片中添加EDTA来破坏BBB。将插片转移至含有新鲜无酚培养基的24孔板中。将EDTA(c_End＝5mM，约5μl)添加至插片，并在37℃孵育90分钟。之后，如上所述测定荧光。

通过将携带BBB细胞的插片的荧光信号标准化至没有BBB细胞的适当插片来计算穿透率。以相同的方式，在添加EDTA之后，验证BBB的完整性。

共培养物实验(穿透的物质的活性)

将插片转移至含有靶细胞(胶质母细胞瘤细胞)的新的24孔板中，该24孔板预先在补充有10％FCS(Thermo Fisher)和1％Pen-Strep(PAN-Biotech)的900μl DMEM培养基、高葡萄糖、GutaMAX^TM(Thermo Fisher)中以3*10⁴的密度接种24小时。在将样品(装有

质粒的VLP)添加到插片之前，除去相应量的培养基，以在每个插片中保持恒定量的200μl培养基。24小时后，将插片从24孔板中移出并使用PBS洗涤。相应地，使用手术刀切下膜(携带BBB细胞)，并转移至1.5ml反应瓶中。萤光素酶活性根据制造商的说明(

萤光素酶测定(Promega)进行测定。

将孔(包含靶细胞)再孵育24小时，然后根据制造商的说明(

萤光素酶测定(Promega)进行萤光素酶测定。

在冷冻保护下的储存

将冷冻添加剂甘油(Carl Roth)、蔗糖(Carl Roth)硫酸铵(Carl Roth)DMSO(CarlRoth)和甜菜碱(Merck)各自添加到VLP中，最终添加剂浓度为1M，除了5％(v/v)的甘油对应于0.68M以外。另外，一个等分试样不包含添加物质(w/o)。通过施加两个冷冻速度将样品分开并冷冻：将每个样品的一半以大约-1℃/min冷却速度的冷冻(缓慢冷冻)，而另一半通过将容器浸入液氮中进行快速冷冻(快速冷冻)。所有样品均在-80℃下保存1至10天。在23℃解冻并以350rpm摇动后，样品在室温下针对10mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl₂(pH7.5)透析2小时，以降低添加剂的浓度及其对分析结果的影响。粒径和PDI通过ZetasizerNanoseries(Malvern)测定。使用Tycho NT.6(Nanotemper)测量拐点温度。在

质粒包装和随后的

萤光素酶测定(Promega)的帮助下，证明了储存后的VLP功能性。

其他实施例

实施例11：功能分析

比较了使用不同方法制备的VLP的货物递送效率(图11)。为此，产生了经历两轮的分解和随后的重新组装或一轮的分解和随后的重新组装(在两种方法中，在萤光素酶质粒存在下进行最后一次重新组装)的VLP。值得注意的是，与经历一轮分解和随后的重新组装的质粒相比并与“仅质粒”和“仅细胞”对照相比，经历两轮分解和随后的重新组装的VLP的萤光素酶活性显著提高。

接下来，分析了通过两轮分解和随后的重新组装制备的VLP穿透血脑屏障(BBB)的能力(图12)。图12A显示了人工血脑屏障(BBB)模型的设置，其用于在单一培养物设置中通过VLP或质粒(圆圈)测试BBB的穿透性。将人脑内皮细胞(BBB细胞，HBEC-5i)铺在可穿透的支持物上。图12B显示了与“仅质粒”对照相比，经历两轮分解和随后的重新组装(在荧光标记质粒的存在下进行第二次重组)的VLP的穿透性。黑色柱代表完整BBB的实验。白色柱表示使用人工破坏的BBB(通过添加EDTA)进行的实验。出乎意料的是，用两轮分解和随后的重新组装制备的VLP能够以比裸质粒大得多的比例穿过BBB。破坏BBB层的完整性破坏了这种差异，显示了通过两轮分解和随后的重新组装制备的VLP的选择性的有效穿透能力。

为了评估通过两轮分解和随后的重新组装制备的VLP递送到靶细胞中的功效，使用了共培养BBB模型(图13)。图13A显示了人工BBB模型的设置，其用于测试VLP或质粒(圆圈)的BBB穿透以及在共培养设置中靶细胞中由穿透的物质引起的后续蛋白质表达。图13B显示了在插片中存在的BBB细胞(在HBEC-5i细胞中)中测量的萤光素酶活性和穿透后靶细胞中的萤光素酶活性。测试了人工BBB(“涂层+BBB细胞”)和不含BBB细胞的涂层(“仅涂层”)。仅当存在细胞时并且当将萤光素酶质粒包装入用两轮分解和随后重新组装制备的VLP(与仅质粒相比)中时才测量到插片的细胞的萤光素酶活性(因此，“仅涂层”样品未显示预期的任何萤光素酶活性)。靶细胞的萤光素酶活性也仅在具有用两轮分解和随后的重新组装制备的VLP(仅与质粒的比较)的样品中测量到，无论是否存在BBB细胞层或仅存在涂层。

因此，用两轮分解和随后的重新组装制备的VLP能够有效地通过BBB，同时保持高的传染性和货物递送能力。样品(包装的)是指经过两轮分解和随后的重新组装(在萤光素酶质粒存在下进行第二次组装)的VLP。

实施例12：储存五聚体相对储存VLP

为了研究包含已经历不同储存程序的装载的VLP的组合物的均质性和均匀性，进行了透射电子显微镜(TEM)。将通过一轮分解和随后的重新组装生成的VLP(冷冻的五聚体，左)与通过两轮分解和随后的重新组装生成的VLP(冷冻的VLP，右)进行比较(图14)。在后一种情况下生成的VLP与在制造过程中将五聚体冷冻的VLP相比显示出明显更均匀的分布，因为它们没有任何可见的缺陷病毒颗粒结构。

为了进一步研究如图14所示生成的装载的VLP的均质性，进行了FFF-MALS分析(图15)。将两个样品与作为参照的新鲜制备的VLP(无货物，因此无分解/重新组装)进行比较。出乎意料的是，与参照相比(图15C)，在两轮的分解和在中间冷冻VLP的情况下随后重新组装后产生的VLP(图15A)显著降低了组合物中存在的VLP聚集体的量。此外，VLP的分布甚至更加均匀。VLP的尺寸以及“微小体”和“盐、碎片、五聚体”的存在是可比较的。

值得注意的是，当在一轮分解和随后的重新组装(冷冻五聚体)后生成VLP时，几乎没有结构完整的VLP被识别(图15B)。因此，使用两轮分解和随后重新组装的方法允许中间储存VLP作为重新组装的VLP，并生成几乎没有聚集的高度均匀的经装载的VLP的群体。给出的百分比不包括聚集体。

为了新鲜制备的VLP(无货物，因此无分解/重新组装，“样品(wt)”，虚线)相比，进一步表征经过两轮分解和在中间冷冻VLP的情况下随后重新组装后产生的VLP(“样品(包装的)”，实线)的稳定性，进行nDSF分析以揭示解链温度(拐点温度)(图16)。值得注意的是，两个VLP样品的解链曲线几乎无法区分，表明经过两轮分解和随后的重新组装制备的VLP与新鲜制备的VLP一样稳定。

实施例13：在重新组装之前诱导聚集

接下来，测量了在五聚体重新组装成VLP的过程中诱导聚集的效果。通过DLS分析均质性(图17和18)。图17显示在诱导聚集(白色柱)和不诱导聚集(黑色柱)的情况下在透析后获得的VLP的PDI。与在不诱导聚集的情况下重新组装的VLP相比，通过首先诱导聚集重新组装的VLP显示出强烈降低的PDI。因此，重新组装过程中聚集的诱导导致更加均匀的尺寸分布。两种样品均在冷冻前采集(因此，它们经历了一轮分解和重新组装)。

图18显示了通过DLS测定的如图17制备的样品(图18，左)和经历相同重新组装条件但经历了随后的冷冻步骤的样品(图18，右)的平均尺寸分布。在诱导聚集的情况下重新组装的两个样品(实线)显示出非常均匀的尺寸分布，而未经历聚集步骤的样品(虚线)显示至少两个VLP群体。甚至更多，冷冻步骤显然对后一个样品有害，因为包含在不诱导聚集的情况下重新组装的VLP的组合物在冷冻后变得更加异质。但是，可以冷冻在诱导聚集的情况下重新组装的VLP而不影响样品的均质性。

实施例14：冷冻添加剂的作用

为了进一步研究样品储存对VLP的影响，向包含在一轮分解和随后的重新组装以及包括AS缓冲剂的两个透析步骤(用于在重新组装过程中诱导聚集)后冷冻的VLP的组合物中添加不同的冷冻添加剂(图19)。图19A显示了已储存的经装载的VLP的稳定性，如nDSF分析所描述。明显地，与其他冷冻添加剂相比，已经储存在包含硫酸铵的缓冲剂中的VLP显著更加稳定(即，显示较高的拐点温度)。有趣的是，这种效果与VLP是否被快速冷冻(黑柱)或缓慢冷冻(点线柱)无关。

在下一步中，将这些样品用于萤光素酶测定(图19B)。出乎意料的是，通过储存在包含硫酸铵的组合物中的VLP，萤光素酶活性强烈提高。与不含冷冻添加剂和其他经过测试的冷冻添加剂的样品相比，甜菜碱也具有优势。因此，使用冷冻添加剂尤其是硫酸铵显著提高了VLP的稳定性，并提高了经装载的VLP的传染性和货物递送功效。同样，此效果与VLP是否被快速冷冻(黑柱)或缓慢冷冻(白柱)无关。

实施方案

1.与溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体缔合的VLP，用于治疗受试者的溶酶体贮积病。

2.根据实施方案1使用的VLP，其中所述VLP不包含病毒遗传物质，并且所述表达载体不编码病毒蛋白。

3.根据实施方案1或2使用的VLP，其中所述受试者是动物或人，优选人。

4.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述受试者患有神经功能缺损。

5.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述溶酶体酶是人类的酶。

6.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述溶酶体酶是芳基硫酸酯酶A。

7.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％相同的氨基酸序列，最优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

8.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述溶酶体贮积病是异染性脑白质营养不良病(MLD)。

9.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。

10.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述表达载体具有选自包含CMV和CAG的组的启动子。

11.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，优选其是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

12.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述VLP衍生自人多瘤病毒，优选JCV。

13.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述VLP穿过血脑屏障，优选生理上完整的血脑屏障，以与所述溶酶体酶或所述表达载体一起进入CNS。

14.根据实施方案13的VLP，中所述溶酶体酶或所述表达载体进入星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经元，优选少突胶质细胞。

15.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述VLP口服或肠胃外施用，优选静脉内施用。

16.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中靶细胞与有效量的溶酶体酶接触。

17.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述溶酶体酶具有至少10天，优选至少20天，更优选至少30天的治疗上有效的酶活性。

18.根据前述实施方案中任一项使用的VLP，其中所述VLP由JC病毒的VP1蛋白组成。

19.根据实施方案18的VLP，其中所述VP1蛋白包含在其全长上与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少80％相同，优选至少90％相同的氨基酸序列。

20.用于在受试者中治疗溶酶体贮积病的方法中的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据实施方案1至19中任一项的VLP和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

21.表达载体，其具有编码溶酶体酶，优选人芳基硫酸酯酶A的编码区，和选自包含CAG和CMV的组的启动子，优选为CAG，并且所述表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。

22.根据实施方案21的表达载体，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQID NO：2的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，优选其是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

23.将溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A或将编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的表达载体掺入VLP中的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

24.可通过实施方案23的方法获得的VLP。

实施方式

1.一种掺入溶酶体酶或掺入编码溶酶体酶的表达载体的VLP，其用于在受试者中治疗异染性脑白质营养不良病(MLD)的方法，其中所述VLP衍生自JCV。

2.根据实施方式1所述使用的VLP，其中所述VLP不包含病毒遗传物质，并且所述表达载体不编码病毒蛋白。

3.根据实施方式1或2所述使用的VLP，其中所述受试者是动物或人类，优选是人类。

4.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述受试者患有神经功能缺损。

5.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶是人类的酶。

6.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶是芳基硫酸酯酶A。

7.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％相同的氨基酸序列，最优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

8.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。

9.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体具有选自包含CMV和CAG的组的启动子。

10.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，优选其是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

11.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP穿过血脑屏障，优选生理上完整的血脑屏障，以与所述溶酶体酶或所述表达载体一起进入CNS。

12.根据实施方式11所述的VLP，其中所述溶酶体酶或所述表达载体进入星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经元，优选少突胶质细胞。

13.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP口服或肠胃外施用，优选静脉内施用。

14.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中使靶细胞与有效量的溶酶体酶接触。

15.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶具有至少10天，优选至少20天，更优选至少30天的治疗上有效的酶活性。

16.根据前述实施方式中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP由JC病毒的VP1蛋白组成。

17.根据实施方式16所述的VLP，其中所述VP1蛋白包含在其全长上与根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列至少80％相同，优选至少90％相同的氨基酸序列。

18.用于在受试者中治疗溶酶体贮积病的方法的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据实施方式1至17中任一项所述的VLP以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

19.一种表达载体，其具有编码溶酶体酶，优选人芳基硫酸酯酶A的编码区，和选自包含CAG和CMV的组的启动子，优选为CAG，并且所述表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。

20.根据实施方式19所述的表达载体，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，优选其是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

21.将溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A或将编码溶酶体酶优选人芳基硫酸酯酶A的表达载体掺入VLP中的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

22.可通过根据实施方式21所述的方法获得的VLP。

23.可通过根据实施方式21所述的方法获得的药物递送系统。

24.根据实施方式1至17中任一项所述使用的VLP，其用作药物递送系统。

25.根据实施方式24所述使用的VLP，其中治疗MLD的方法不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。

26.用掺入溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体的VLP治疗MLD的方法，其中所述VLP衍生自JCV。

27.一种掺入溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体的VLP，其用于将溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体递送至靶标，其中所述靶标是CNS。

28.根据实施方式27所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体被递送至CNS中的靶细胞，特别是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞。

29.根据实施方式28所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶在所述靶细胞中瞬时表达。

30.掺入溶酶体酶或编码溶酶体酶的表达载体的VLP，用于增强溶酶体酶的活性。

31.根据实施方式1至17中任一项所述的VLP在制备用于治疗MLD的药物中的用途。

32.根据实施方式23所述的药物递送系统在制备用于治疗MLD的药物中的用途。

序列表

<110> 纽卫制药有限公司

<120> 用于治疗溶酶体贮积病的VLP

<130> 60 212 K

<150> PCT/EP2018/085699

<151> 2018-12-18

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ser Met Gly Ala Pro Arg Ser Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Leu Ala Val Ala Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp

20 25 30

Leu Gly Tyr Gly Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe

50 55 60

Tyr Val Pro Val Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr

65 70 75 80

Gly Arg Leu Pro Val Arg Met Gly Met Tyr Pro Gly Val Leu Val Pro

85 90 95

Ser Ser Arg Gly Gly Leu Pro Leu Glu Glu Val Thr Val Ala Glu Val

100 105 110

Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu

115 120 125

Gly Val Gly Pro Glu Gly Ala Phe Leu Pro Pro His Gln Gly Phe His

130 135 140

Arg Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ser His Asp Gln Gly Pro Cys Gln Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Phe Pro Pro Ala Thr Pro Cys Asp Gly Gly Cys Asp Gln

165 170 175

Gly Leu Val Pro Ile Pro Leu Leu Ala Asn Leu Ser Val Glu Ala Gln

180 185 190

Pro Pro Trp Leu Pro Gly Leu Glu Ala Arg Tyr Met Ala Phe Ala His

195 200 205

Asp Leu Met Ala Asp Ala Gln Arg Gln Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Tyr Ala Ser His His Thr His Tyr Pro Gln Phe Ser Gly Gln Ser Phe

225 230 235 240

Ala Glu Arg Ser Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Ser Leu Met Glu Leu

245 250 255

Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu Met Thr Ala Ile Gly Asp Leu Gly Leu

260 265 270

Leu Glu Glu Thr Leu Val Ile Phe Thr Ala Asp Asn Gly Pro Glu Thr

275 280 285

Met Arg Met Ser Arg Gly Gly Cys Ser Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys

290 295 300

Gly Thr Thr Tyr Glu Gly Gly Val Arg Glu Pro Ala Leu Ala Phe Trp

305 310 315 320

Pro Gly His Ile Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu

325 330 335

Asp Leu Leu Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro Leu Pro Asn

340 345 350

Val Thr Leu Asp Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Leu Leu Gly Thr Gly

355 360 365

Lys Ser Pro Arg Gln Ser Leu Phe Phe Tyr Pro Ser Tyr Pro Asp Glu

370 375 380

Val Arg Gly Val Phe Ala Val Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Ala His Phe

385 390 395 400

Phe Thr Gln Gly Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys

405 410 415

His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp

420 425 430

Leu Ser Lys Asp Pro Gly Glu Asn Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Ala

435 440 445

Gly Ala Thr Pro Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu

450 455 460

Lys Ala Gln Leu Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Pro Ser Gln Val Ala

465 470 475 480

Arg Gly Glu Asp Pro Ala Leu Gln Ile Cys Cys His Pro Gly Cys Thr

485 490 495

Pro Arg Pro Ala Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala

500 505

<210> 2

<211> 1530

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgtccatgg gggcaccgcg gtccctcctc ctggccctgg ctgctggcct ggccgttgcc 60

cgtccgccca acatcgtgct gatctttgcc gacgacctcg gctatgggga cctgggctgc 120

tatgggcacc ccagctctac cactcccaac ctggaccagc tggcggcggg agggctgcgg 180

ttcacagact tctacgtgcc tgtgtctctg tgcacaccct ctagggccgc cctcctgacc 240

ggccggctcc cggttcggat gggcatgtac cctggcgtcc tggtgcccag ctcccggggg 300

ggcctgcccc tggaggaggt gaccgtggcc gaagtcctgg ctgcccgagg ctacctcaca 360

ggaatggccg gcaagtggca ccttggggtg gggcctgagg gggccttcct gcccccccat 420

cagggcttcc atcgatttct aggcatcccg tactcccacg accagggccc ctgccagaac 480

ctgacctgct tcccgccggc cactccttgc gacggtggct gtgaccaggg cctggtcccc 540

atcccactgt tggccaacct gtccgtggag gcgcagcccc cctggctgcc cggactagag 600

gcccgctaca tggctttcgc ccatgacctc atggccgacg cccagcgcca ggatcgcccc 660

ttcttcctgt actatgcctc tcaccacacc cactaccctc agttcagtgg gcagagcttt 720

gcagagcgtt caggccgcgg gccatttggg gactccctga tggagctgga tgcagctgtg 780

gggaccctga tgacagccat aggggacctg gggctgcttg aagagacgct ggtcatcttc 840

actgcagaca atggacctga gaccatgcgt atgtcccgag gcggctgctc cggtctcttg 900

cggtgtggaa agggaacgac ctacgagggc ggtgtccgag agcctgcctt ggccttctgg 960

ccaggtcata tcgctcccgg cgtgacccac gagctggcca gctccctgga cctgctgcct 1020

accctggcag ccctggctgg ggccccactg cccaatgtca ccttggatgg ctttgacctc 1080

agccccctgc tgctgggcac aggcaagagc cctcggcagt ctctcttctt ctacccgtcc 1140

tacccagacg aggtccgtgg ggtttttgct gtgcggactg gaaagtacaa ggctcacttc 1200

ttcacccagg gctctgccca cagtgatacc actgcagacc ctgcctgcca cgcctccagc 1260

tctctgactg ctcatgagcc cccgctgctc tatgacctgt ccaaggaccc tggtgagaac 1320

tacaacctgc tggggggtgt ggccggggcc accccagagg tgctgcaagc cctgaaacag 1380

cttcagctgc tcaaggccca gttagacgca gctgtgacct tcggccccag ccaggtggcc 1440

cggggcgagg accccgccct gcagatctgc tgtcatcctg gctgcacccc ccgcccagct 1500

tgctgccatt gcccagatcc ccatgcctga 1530

<210> 3

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自JC病毒

<400> 3

Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Pro Lys Asp Pro Val Gln Val

1 5 10 15

Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr

20 25 30

Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met

35 40 45

Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile

50 55 60

Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met Leu Pro Cys

65 70 75 80

Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr

85 90 95

Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val

100 105 110

Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr

115 120 125

His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe

130 135 140

Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr

165 170 175

Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys

180 185 190

Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro

210 215 220

Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala

245 250 255

Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp

260 265 270

Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val

275 280 285

Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg

290 295 300

Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln

305 310 315 320

Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp

325 330 335

Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Lys Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys

340 345 350

Met Leu

<210> 4

<211> 354

<212> PRT

<213> JC病毒

<400> 4

Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Arg Lys Asp Pro Val Gln Val

1 5 10 15

Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr

20 25 30

Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met

35 40 45

Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile

50 55 60

Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Ser Lys Asp Met Leu Pro Cys

65 70 75 80

Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr

85 90 95

Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val

100 105 110

Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Ala

115 120 125

His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe

130 135 140

Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr

165 170 175

Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys

180 185 190

Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro

210 215 220

Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala

245 250 255

Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp

260 265 270

Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val

275 280 285

Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg

290 295 300

Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln

305 310 315 320

Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp

325 330 335

Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Arg Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys

340 345 350

Met Leu

<210> 5

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自JC病毒

<400> 5

atggctccca ccaagcgcaa gggcgagccc aaggaccccg tgcaagtgcc caagctgctg 60

atccgtggtg gtgtcgaggt gctggaagtc aagaccggcg tggactccat taccgaggtg 120

gagtgcttcc tcacccccga gatgggtgac cctgacgagc acctgagggg cttctccaag 180

tccatctcca tctccgacac cttcgagtcc gactccccca accgtgacat gctgccctgc 240

tactccgtgg ctcgtatccc cctgcccaac ctgaacgagg acctgacttg cggcaacatc 300

ctgatgtggg aggctgtgac cctcaagacc gaggtcatcg gcgtgacttc cctgatgaac 360

gtgcactcca acggccaggc tacccacgac aacggtgctg gcaagcccgt gcagggaacc 420

tccttccact tcttctccgt gggtggcgag gctctggaac tccagggcgt ggtgttcaac 480

taccgtacca agtaccccga cggcaccatc ttccccaaga acgctactgt gcagtcccaa 540

gtgatgaaca ccgagcacaa ggcttacctg gacaagaaca aggcctaccc cgtggagtgc 600

tgggtgcccg accccacccg taacgagaac acccgttact tcggcaccct gaccggtgga 660

gagaacgtgc cccccgtgct gcacatcacc aacaccgcta ccaccgtgct gctggacgag 720

ttcggtgtcg gtcccctgtg caagggcgac aacctgtacc tgtccgctgt ggacgtgtgc 780

ggcatgttca ccaaccgttc cggttcccag cagtggcgtg gcctgtcccg ctacttcaag 840

gtgcagctgc gcaagcgtcg tgtgaagaac ccctacccta tctccttcct gctgaccgac 900

ctgatcaacc gtcgtacccc tcgtgtggac ggccagccca tgtacggcat ggacgctcag 960

gtggaagagg tccgcgtgtt cgagggcacc gaggaattgc ccggcgaccc cgacatgatg 1020

cgttacgtgg acaagtacgg ccagctccag accaagatgc tgtaa 1065

<210> 6

<211> 1065

<212> DNA

<213> JC病毒

<400> 6

atggccccaa caaaaagaaa aggagaaagg aaggaccccg tgcaagttcc aaaacttctt 60

ataagaggag gagtagaagt tctagaagtt aaaactgggg ttgactcaat tacagaggta 120

gaatgctttt taactccaga aatgggtgac ccagatgagc atcttagggg ttttagtaag 180

tcaatatcta tatcagatac atttgaaagt gactccccaa atagggacat gcttccttgt 240

tacagtgtgg ccagaattcc actacccaat ctaaatgagg atctaacctg tggaaatata 300

ctcatgtggg aggctgtgac cttaaaaact gaggttatag gggtgacaag tttgatgaat 360

gtgcactcta atgggcaagc aactcatgac aatggtgcag ggaagccagt gcagggcacc 420

agctttcatt ttttttctgt tgggggggag gctttagaat tacagggggt gctttttaat 480

tacagaacaa agtacccaga tggaacaatt tttccaaaga atgccacagt gcaatctcaa 540

gtcatgaaca cagagcacaa ggcgtaccta gataagaaca aagcatatcc tgttgaatgt 600

tgggttcctg atcccaccag aaatgaaaac acaagatatt ttgggacact aacaggagga 660

gaaaatgttc ctccagttct tcatataaca aacactgcca caacagtgtt gcttgatgaa 720

tttggtgttg ggccactttg caaaggtgac aacttatact tgtcagctgt tgatgtctgt 780

ggcatgttta caaacaggtc tggttcccag cagtggagag gactctccag atattttaag 840

gtgcagctaa ggaaaaggag ggttaaaaac ccctacccaa tttctttcct tcttactgat 900

ttaattaaca gaaggactcc tagagttgat gggcagccta tgtatggcat ggatgctcaa 960

gtagaggagg ttagagtttt tgagggaaca gaggagcttc caggggaccc agacatgatg 1020

agatacgttg acaaatatgg acagttgcag acaaaaatgc tgtaa 1065

<210> 7

<211> 1130

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pFAR4多核苷酸

<400> 7

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctaa gtaagcttcc 60

gggccccccc gccatggggt atcgataatg atatcgaatt cctgcagcgg ggatccacta 120

gttctagagc ggccgccacc gcggtggaca gctggctgtc gacgaagtac tgaccggtct 180

taggcctaaa aaaaatcctt agctttcgct aaggatctgc agtggggtgg ctaatgggat 240

tcgaacccac gacaactgga tttagaatcc agggctctac caactgagct atagccaccg 300

aattgtgcgt tacaagtatt acacaaagtt ttttatgttg agaatatttt tttgatgggg 360

cgcgacttat ttttgatcgt tcgctcaaag aagcggcgcg tcatgaccaa aatcccttaa 420

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 480

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 540

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 600

agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 660

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 720

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 780

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 840

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 900

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 960

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1020

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 1080

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 1130

Claims

2.根据权利要求1所述使用的VLP，其中所述VLP不包含病毒遗传物质，并且所述表达载体不编码病毒蛋白。

3.根据权利要求1或2所述使用的VLP，其中所述受试者是动物或人类，优选是人类。

4.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述受试者患有神经功能缺损。

5.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶是人类的酶。

6.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶是芳基硫酸酯酶A。

7.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％相同的氨基酸序列，最优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。

9.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体具有选自包含CMV和CAG的组的启动子。

10.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述溶酶体酶包含在其全长上与根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，优选其是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。