JP2023508731A - Rna誘導ヌクレアーゼ、その活性断片および多様体、ならびに使用方法 - Google Patents

Rna誘導ヌクレアーゼ、その活性断片および多様体、ならびに使用方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2023508731000001
目的の標的配列への結合のための組成物および方法が提供される。この組成物は、目的の標的配列の切断または改変、目的の標的配列の検出、および目的の配列の発現の変更に用途がある。組成物は、RNA誘導ヌクレアーゼポリペプチド、CRISPR RNA、トランス活性化CRISPR RNA、ガイドRNA、およびこれらをコードする核酸分子を含む。この核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞も提供される。RNA誘導ヌクレアーゼポリペプチドおよび1つ以上のガイドRNAを含む、目的の標的配列を結合させるためのCRISPRシステムもさらに提供される。
【選択図】図1

Description

関連出願との相互参照
本出願は、2019年12月30日出願の米国仮特許出願第62/955,014号および2020年7月29日出願の米国仮特許出願第63/058,169号の優先権を主張する。各出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにASCII形式で提出され、参照により本明細書に組み込まれる。ASCIIコピーはL103438_1180WO_(0077_8)_SLと名付けられ、558,899バイトの大きさであり、2020年12月17日に作成され、EFSウェブを通じて電子提出されている。
技術分野
本発明は、分子生物学および遺伝子編集の分野に関する。
標的ゲノム編集または改変は、急速に基礎研究および応用研究の重要な手段になりつつある。初期の方法は、ヌクレアーゼ、たとえばメガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガー融合タンパク質、またはTALENを操作することを含み、特定の各標的配列に特異的な操作されたプログラム可能な配列特異的DNA結合ドメインを有するキメラヌクレアーゼの作製を必要としていた。RNA誘導ヌクレアーゼ、たとえばクラスター化された規則的な配置の短い回文反復配列(CRISPR)-Cas細菌系のCRISPR関連(Cas)タンパク質は、特定の標的配列と特異的にハイブリダイズするガイドRNAとヌクレアーゼを複合することにより、特定の配列を標的化することができる。標的特異的なガイドRNAの作製は、各標的配列についてキメラヌクレアーゼを作製するよりも低コストで効率的である。このようなRNA誘導ヌクレアーゼを用いて、エラーが発生しやすい非相同末端結合(NHEJ)により修復される配列特異的切断の導入を通じてゲノムを編集し、特定のゲノム位置に変異を導入することができる。あるいは、相同組換え修復を介して異種DNAをゲノム部位に導入してもよい。RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)を、デアミナーゼと融合した場合の塩基編集または特定のヌクレオチド配列の検出に用いることもできる。
目的の標的配列を結合させるための組成物および方法が提供される。この組成物は、目的の標的配列の切断または改変、目的の標的配列の検出、および目的の配列の発現の変更に用途がある。組成物は、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、CRISPR RNA (crRNA)、トランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA)、ガイドRNA (gRNA)、それらをコードする核酸分子、その核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにRGN、gRNA、および検出用一本鎖DNAを含むキットを含む。RNA誘導ヌクレアーゼポリペプチドおよび1つ以上のガイドRNAを含む、目的の標的配列を結合させるためのCRISPRシステムも提供される。したがって、本明細書に開示の方法は、目的の標的配列の結合、および実施態様によっては、目的の標的配列の切断または改変に関する。たとえば、非相同末端結合、導入されたドナー配列による相同組換え修復、または塩基編集の結果として目的の標的配列を改変できる。さらに、検出用一本鎖DNAを用いてDNA分子の標的DNA配列を検出する方法およびキットを提供する。
図1は、本発明の代表的RGNの細菌ゲノム遺伝子座を示す。
本明細書に記載の発明の多くの変形例および他の実施態様は、以上の説明および関連する図面に示された教示の利益を有する、これらの発明が属する分野の当業者に想起されるであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施態様に限定されるものではなく、変形例および他の実施態様が添付の実施態様の範囲内に含まれることが意図されるものとする。本明細書では特定の用語を使用するが、限定を目的としてではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ、それらを使用する。
I.概要
RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)は、ゲノム内の特定の部位の標的操作を可能にし、治療および研究の用途での遺伝子標的に関して有用である。哺乳動物を含む様々な生物において、RNA誘導ヌクレアーゼは、たとえば、非相同末端結合および相同組換えを刺激することによるゲノム工学に使用されてきた。本明細書に記載の組成物および方法は、ポリヌクレオチドに一本鎖または二本鎖切断を起こす、ポリヌクレオチドを改変する、ポリヌクレオチド内の特定の部位を検出する、あるいは特定の遺伝子の発現を変化させるのに有用である。
本明細書に開示のRNA誘導ヌクレアーゼは、標的配列を改変して遺伝子発現を変化させることができる。特定の実施態様では、RNA誘導ヌクレアーゼは、クラスター化された規則的な配置の短い回文反復配列(CRISPR) RNA誘導ヌクレアーゼシステムの一部として、ガイドRNA (gRNA)により標的配列へ誘導される。ガイドRNAがRNA誘導ヌクレアーゼと複合体を形成し、RNA誘導ヌクレアーゼを標的配列に結合させるため、RGNは「RNAに誘導されている」と考えられ、実施態様によっては標的配列に一本鎖または二本鎖切断を導入する。標的配列が切断された後、修復過程中に標的配列のDNA配列が改変されるように、切断が修復されてもよい。したがって、RNA誘導ヌクレアーゼを用いて宿主細胞のDNA中の標的配列を改変する方法を本明細書で提供する。たとえば、RNA誘導ヌクレアーゼを用いて、真核細胞または原核細胞のゲノム遺伝子座の標的配列を改変できる。
II.RNA誘導ヌクレアーゼ
本明細書ではRNA誘導ヌクレアーゼを提供する。RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)という用語は、配列特異的に特定の標的ヌクレオチド配列に結合するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、そのポリペプチドと複合体を形成し標的配列とハイブリダイズするガイドRNA分子によって標的ヌクレオチド配列に誘導される。RNA誘導ヌクレアーゼは結合時に標的配列を切断できるが、「RNA誘導ヌクレアーゼ」という用語は、標的配列に結合することはできるが切断することはできない、ヌクレアーゼ失活型RNA誘導ヌクレアーゼも包含する。RNA誘導ヌクレアーゼによる標的配列の切断は、一本鎖または二本鎖切断を起こすことができる。二本鎖核酸分子の一本鎖のみを切断できるRNA誘導ヌクレアーゼを本明細書ではニッカーゼと呼ぶ。
本発明のRGNは、クラス2 CRISPR-Casシステムのメンバーである。より具体的には、それらはV型CRISPR-Casシステムのメンバーである。V型CRISPR-Casシステムは、ガイドRNAを用いるdsDNA(二本鎖DNA)の標的化に関与する単一のエフェクターヌクレアーゼを含むシステムと広く定義されている。また、単一のエフェクターヌクレアーゼは、触媒活性に関与する分断RuvCヌクレアーゼドメインを含む(Jinek et al 2014, Science doi:10.1126/science.1247997; Zetsche et al 2015, Cell doi:10.1016/j.cell.2015.09.038; Shmakov et al 2017, Nat Rev Microbiol doi:10.1038/nrmicro.2016.184; Yan et al 2018, Science doi:10.1126/science.aav7271; Harrington et al 2018, Science doi:10.1126/science.aav4294(各文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる)。ほとんどのV型エフェクターは、多くの場合PAMを必要とすることなくssDNA(一本鎖DNA)を標的化することもできる(Zetsche et al 2015; Yan et al 2018; Harrington et al 2018)。
V-A型シグネチャータンパク質はCas12aである。これは、1,000~1,400アミノ酸長で、RuvCドメインに加え、認識ローブを持つウェッジドメインを含む数個のドメインを有する(Yamano et al (2016) Cell 165:949-962)。対照的に、V-U型システムは、他のほとんどのV型システムと比較して小さい(500~700アミノ酸長)。V-Uは、分断RuvCドメインおよび正に帯電したブリッジヘリックスも有する(Shmakov et al 2017)。V-Uタンパク質は、エフェクタータンパク質と共にコードされるアクセサリーCasタンパク質を持たないことが多いが、Cas12aはcas1、cas2、場合によってはcas4と共局在する(Shmakov et al 2017)。V-U型システムと他のV型メンバーとのこれらの違いに基づき、Shmakovら(2017)は、機能性を決定するとV-U型システムは新しい型/亜型の指定を受ける必要があることを示唆した。
たとえば、Cas14酵素は400~700アミノ酸長である(Harrington et al 2018)。最初の公開時、これらのシステムは、V型の標準的なCas12エフェクタータンパク質とは別のCas酵素として勧められていた。Yanらによる後の出版物は、Cas14a、b、およびcをV型の命名法内のV-F亜型と呼ぶ。Cas14aおよびbは、V-U3型であるc2c10と最も密接に関連する。Cas14cは、それぞれV-U2型およびV-U4型であるc2c8およびc2c9と最も密接に関連する(Harrington et al 2018; Yan et al 2018)。Cas14 RGNのゲノム遺伝子座はアクセサリーCasタンパク質と関連し、tracrRNAはCas14と反復スペーサー配列の間でコードされる。複数のガイドRNAを含む単一の転写物から個々のガイドを処理できるCas12aとは異なり、これらのシステムは独自のガイドRNAを処理できない(Harrington et al 2018)。
本発明のRGNは、APG06369を除いてすべて、分断RuvCドメインを含む。しかし、本発明のRGNの多くは特有の遺伝子座配置を有し、このことは、これらのRGNが、分類のクラス2 CRISPR-Casシステムにとって新規であることを示唆している。本発明のRGNが由来する遺伝子座(実施例1の表1を参照のこと)のいずれも、Cas1またはCas2を含まない。
本明細書に開示するとおり、APG07339、APG09624、APG03003、APG05405、APG09777、APG05680、APG02119、APG03285、APG04998、およびAPG07078は、アクセサリー遺伝子と共にコードされない独立型のCasエフェクターであり、crRNAに加えてtracrRNAを必要とし得る。本明細書の開示に基づき、これらのCRISPR-Casシステムは新しい分類を受ける必要がある。また、系統発生分析により、これらのRGNは3つの異なる亜型に分類できることが明らかになった。1つの亜型はAPG07078を含む。第2の亜型は、APG05680およびAPG03285を含む。第3の亜型は、APG07339、APG09624、APG03003、APG05405、APG09777、APG02119、およびAPG04998を含む。
APG06369は、識別可能なRuvCドメインを欠き、非標準的なアクセサリー遺伝子を持つこれまでに見られなかったCRISPR遺伝子座に位置する独特のエフェクターヌクレアーゼである。APG06369は4つのアクセサリー遺伝子を有し(4つのアクセサリータンパク質を配列番号178~181として示す)、そのいずれも注釈付きドメインも機能も持たない。APG06369は独特なCasタンパク質である。
系統発生的に、APG03847、APG05625、APG03759、APG05123、およびAPG03524は、エフェクターヌクレアーゼを含む特有のRuvCの系統群を形成する。これらのRGNは最大3つのアクセサリー遺伝子を有する。1つはHNHエンドヌクレアーゼであり、1つはHTH転写制御因子であり、3つ目は既知の機能もドメインも持たない。APG03847のアクセサリータンパク質を配列番号182、183、および184として示す。APG05625のアクセサリータンパク質を配列番号185、186、および187として示す。APG03524のアクセサリータンパク質を配列番号188、189、および190として示す。APG03759およびAPG05123のアクセサリータンパク質をそれぞれ配列番号191および192として示す。それらは、APG03847、APG05625、APG03759、APG05123、およびAPG03524に関連する反復配列が多数のタンパク質のコード配列と重複する、特有のCRISPR反復配列の配置を遺伝子座に持つ。これはCRISPR-Casシステムでは非常に珍しい特徴であり、リーダー配列を必要としないCRISPR発現の形態を示唆している。このような形態のCRISPR発現は、これまでに知られているいずれのシステムとも異なる。
本明細書に開示のRNA誘導ヌクレアーゼは、表1に示されるRNA誘導ヌクレアーゼ(そのアミノ酸配列を配列番号1~109として示す)、およびRNAに誘導されて配列特異的に標的ヌクレオチドに結合する能力を保持するそれらの活性断片または多様体を含む。実施態様によっては、そのようなRGNの活性断片または多様体は、一本鎖または二本鎖の標的配列を切断できる。実施態様によっては、本発明のRGNの活性多様体は、配列番号1~109として示されるアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、本発明のRGNの活性断片は、配列番号1~109として示されるアミノ酸配列のいずれか1つの少なくとも50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個、またはそれ以上の連続するアミノ酸残基を含む。本明細書で提供されるRNA誘導ヌクレアーゼは、少なくとも1つのヌクレアーゼドメイン(たとえば、DNase、RNaseドメイン)およびガイドRNAと相互作用するための少なくとも1つのRNA認識および/またはRNA結合ドメインを含んでもよい。本明細書で提供されるRNA誘導ヌクレアーゼに見られ得るさらなるドメインとしては、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、および二量体化ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、本明細書で提供されるRNA誘導ヌクレアーゼは、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、および二量体化ドメインのうちの1つ以上に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を含んでもよい。
様々な実施態様において、標的ヌクレオチド配列は、本明細書で提供されるRNA誘導ヌクレアーゼに結合され、RNA誘導ヌクレアーゼと結合しているガイドRNAとハイブリダイズする。その後、ポリペプチドがヌクレアーゼ活性を有する場合、標的配列はRNA誘導ヌクレアーゼにより切断されてもよい。「切断する」または「切断」という用語は、標的配列に一本鎖または二本鎖切断を起こすことができる、標的ヌクレオチド配列の骨格内の少なくとも1つのホスホジエステル結合の加水分解を指す。様々な実施態様において、本開示のRGNは、エンドヌクレアーゼとして機能しポリヌクレオチド内のヌクレオチドを切断してもよいし、ポリヌクレオチドの末端(5'および/または3'末端)から連続するヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼであってもよい。実施態様によっては、開示のRGNは、ポリヌクレオチドの任意の位置内にある標的配列のヌクレオチドを切断してもよく、したがってエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両方として機能してもよい。本開示のRGNによる標的ポリヌクレオチドの切断は、ねじれ型切断を起こしてもよいし、平滑末端を起こしてもよい。
実施態様によっては、RGNは、標的ポリヌクレオチドの結合および/または切断のために、少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質の発現または存在を必要とする。これらの実施態様の一部では、RGNは、配列番号178~192として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片を必要とする。RGNがAPG06369(配列番号11)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、配列番号178~181として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片が活性に必要である。RGNがAPG03847(配列番号12)またはその多様体もしくは断片である実施態様の一部では、配列番号182~184として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片が活性に必要である。RGNがAPG05625(配列番号13)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、配列番号185~187として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片が活性に必要である。RGNがAPG03524(配列番号16)またはその多様体もしくは断片である実施態様の一部では、配列番号188~190として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片が活性に必要である。RGNがAPG03759(配列番号14)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、配列番号191として示されるRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片が活性に必要である。RGNがAPG05123(配列番号15)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、配列番号192として示されるRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片が活性に必要である。
実施態様によっては、本開示のRNA誘導ヌクレアーゼは、細菌または古細菌種に由来する野生型配列であってもよい。実施態様によっては、RNA誘導ヌクレアーゼは、野生型ポリペプチドの多様体または断片であってもよい。野生型RGNを改変して、たとえばヌクレアーゼ活性を変更、あるいはPAM特異性を変更してもよい。実施態様によっては、RNA誘導ヌクレアーゼは非天然である。
特定の実施態様では、RNA誘導ヌクレアーゼはニッカーゼとして機能し、標的ヌクレオチド配列の一本鎖のみを切断する。このようなRNA誘導ヌクレアーゼは、単一の機能性ヌクレアーゼドメインを有する。特定の実施態様では、ニッカーゼはプラス鎖またはマイナス鎖を切断できる。これらの実施態様の一部では、ヌクレアーゼ活性が低下あるいは排除されるように、さらなるヌクレアーゼドメインが変異している。
実施態様によっては、RNA誘導ヌクレアーゼはヌクレアーゼ活性を完全に欠き、本明細書ではヌクレアーゼ失活型またはヌクレアーゼ不活型と呼ばれる。アミノ酸配列に変異を導入するための当技術分野で知られている任意の方法、たとえばPCRによる変異誘発および部位特異的変異誘発を用いて、ニッカーゼまたはヌクレアーゼ失活型RGNを生成できる。たとえば、米国特許出願公開第2014/0068797号および米国特許第9,790,490号を参照のこと(これらの各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ヌクレアーゼ活性を欠くRNA誘導ヌクレアーゼを用いて、融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子搭載物を特定のゲノム位置に送達してもよい。これらの実施態様の一部では、RGNポリペプチドまたはガイドRNAを検出可能な標識に融合し、特定の配列を検出できるようにしてもよい。非限定的な例として、ヌクレアーゼ失活型RGNを検出可能な標識(たとえば蛍光タンパク質)に融合し、疾患に関連する特定の配列を標的にして、疾患関連配列を検出できるようにしてもよい。
実施態様によっては、ヌクレアーゼ失活型RGNは、特定のゲノム位置を標的にして所望の配列の発現を変更してもよい。実施態様によっては、ヌクレアーゼ失活型RNA誘導ヌクレアーゼの標的配列への結合の結果、標的ゲノム領域内のRNAポリメラーゼまたは転写因子の結合との干渉により標的配列または標的配列による転写制御下の遺伝子の発現が減少する。他の実施態様では、RGN(たとえば、ヌクレアーゼ失活型RGN)またはその複合されたガイドRNAは、標的配列に結合すると標的配列または標的配列による転写制御下の遺伝子の発現を抑制あるいは活性化するよう機能する発現調節因子をさらに含む。これらの実施態様によっては、発現調節因子は、後成学的な機構を介して標的配列または制御された遺伝子の発現を調節する。
実施態様によっては、ヌクレアーゼ失活型RGNまたはニッカーゼ活性のみを有するRGNを特定のゲノム位置に対して標的化し、核酸塩基を直接的に化学修飾(たとえば、脱アミノ化)して1つの核酸塩基から別の核酸塩基に変換させる塩基編集ポリペプチド(たとえば、デアミナーゼポリペプチドまたはその活性多様体もしくは断片)への融合により標的ポリヌクレオチドの配列を改変してもよい。塩基編集ポリペプチドをRGNのN末端に融合してもC末端に融合してもよい。さらに、ペプチドリンカーを介して塩基編集ポリペプチドをRGNに融合してもよい。このような組成物および方法に有用なデアミナーゼポリペプチドの非限定的な例としては、シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼ(たとえば、Gaudelli et al. (2017) Nature 551:464-471、米国特許出願公開第2017/0121693号および第2018/0073012号、国際公開第WO 2018/027078号に記載の塩基編集アデノシン、または国際公開第WO 2020/139873号および米国仮特許出願第62/785,391号(2018年12月27日出願)、第62/932,169号(2019年11月7日出願)、および第63/077,089号(2020年9月11日出願)に開示のデアミナーゼのいずれか;これらの各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。さらに、RGNと塩基編集酵素との特定の融合タンパク質が、デアミナーゼによる核酸分子中のシチジン、デオキシシチジン、またはシトシンのチミジン、デオキシチミジン、またはチミンへの変異率を増加させる少なくとも1種のウラシル安定化ポリペプチドをさらに含み得ることは、当技術分野で知られている。ウラシル安定化ポリペプチドの非限定的な例としては、2020年7月15日出願の米国仮出願第63/052,175号に開示のもの、および塩基編集効率を増加させる可能性のあるウラシルグリコシラーゼ阻害(UGI)ドメイン(配列番号137)が挙げられる。特定の実施態様では、本開示は、本明細書に記載のRGNまたはその多様体、デアミナーゼ、および任意で少なくとも1種のウラシル安定化ポリペプチド(UGIなど)を含む融合タンパク質を提供する。特定の実施態様では、塩基編集ポリペプチドに融合されるRGNは、塩基編集ポリペプチド(たとえば、デアミナーゼ)により作用されないDNA鎖を切断するニッカーゼである。ポリペプチドまたはドメインに融合されたRNA誘導ヌクレアーゼはリンカーにより分離あるいは結合されてもよい。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、2つの分子または部分、たとえばヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインを連結する化学基または分子を指す。実施態様によっては、リンカーは、RNA誘導ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと塩基編集ポリペプチド(デアミナーゼなど)とを結合する。実施態様によっては、リンカーは、ヌクレアーゼ失活型RGNとデアミナーゼを結合する。一般に、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるかこれらに隣接し、共有結合によりそれぞれと連結して、両者を連結する。実施態様によっては、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸(たとえば、ペプチドまたはタンパク質)である。実施態様によっては、リンカーは有機分子、基、重合体、または化学部分である。実施態様によっては、リンカーは5~100アミノ酸長、たとえば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30~35、35~40、40~45、45~50、50~60、60~70、70~80、80~90、90~100、100~150、または150~200アミノ酸長である。これより長い、あるいは短いリンカーも意図される。
様々な実施態様において、本開示は、細胞の核へのRGNの輸送を強化する少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)を含む、本開示のRNA誘導ヌクレアーゼを提供する。核局在化シグナルは当技術分野で知られており、一般に一続きの塩基性アミノ酸を含む(たとえば、Lange et al., J. Biol. Chem. (2007) 282:5101-5105を参照のこと)。特定の実施態様では、RGNは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上の核局在化シグナルを含む。核局在化シグナルは異種NLSであってもよい。本開示のRGNに有用な核局在化シグナルの非限定的な例は、SV40大型T抗原、ヌクレオパスミン、およびc-Mycの核局在化シグナルである(たとえば、Ray et al. (2015) Bioconjug Chem 26(6):1004-7を参照のこと)。特定の実施態様では、RGNは配列番号149または150として示されるNLS配列を含む。RGNは、そのN末端、C末端、またはN末端とC末端の両方に1つ以上のNLS配列を含んでもよい。たとえば、RGNは、N末端領域に2つのNLS配列、C末端領域に4つのNLS配列を含んでもよい。
ポリペプチドを特定の細胞内位置に局在化する当技術分野で知られている他の局在化シグナル配列を用いてRGNを標的化してもよく、色素体局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、および色素体とミトコンドリアの両方を標的とする二重標的化シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない(たとえば、NassouryおよびMorse (2005) Biochim Biophys Acta 1743:5-19; KunzeおよびBerger (2015) Front Physiol dx.doi.org/10.3389/fphys.2015.00259; HerrmannおよびNeupert (2003) IUBMB Life 55:219-225; Soll (2002) Curr Opin Plant Biol 5:529-535; CarrieおよびSmall (2013) Biochim Biophys Acta 1833:253-259; Carrie et al. (2009) FEBS J 276:1187-1195; Silva-Filho (2003) Curr Opin Plant Biol 6:589-595; PeetersおよびSmall (2001) Biochim Biophys Acta 1541:54-63; Murcha et al. (2014) J Exp Bot 65:6301-6335; Mackenzie (2005) Trends Cell Biol 15:548-554; Glaser et al. (1998) Plant Mol Biol 38:311-338を参照のこと)。
特定の実施態様では、ここに開示されるRNA誘導ヌクレアーゼは、RGNの細胞取り込みを促進する少なくとも1つの細胞透過性ドメインを含む。細胞透過性ドメインは当技術分野で知られており、一般に、正に帯電した一続きのアミノ酸残基(すなわちポリカチオン性細胞透過性ドメイン)、交互の極性アミノ酸残基および非極性アミノ酸残基(すなわち両親媒性細胞透過性ドメイン)、または疎水性アミノ酸残基(すなわち疎水性細胞透過性ドメイン)を含む(たとえば、Milletti F. (2012) Drug Discov Today 17:850-860を参照のこと)。細胞透過性ドメインの非限定的な例は、ヒト免疫不全ウイルス1のトランス活性化転写活性化因子(TAT)である。
核局在化シグナル、色素体局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、二重標的局在化シグナル、および/または細胞透過性ドメインをRNA誘導ヌクレアーゼのアミノ末端(N末端)、カルボキシル末端(C末端)、または内部位置に配置してもよい。
特定の実施態様では、本開示のRGNを、作用ドメイン、たとえば切断ドメイン、デアミナーゼドメイン、または発現調節ドメインに直接、あるいはリンカーペプチドを介して融合する。このようなドメインをRNA誘導ヌクレアーゼのN末端、C末端、または内部位置に配置してもよい。これらの実施態様の一部では、融合タンパク質のRGN成分はヌクレアーゼ失活型RGNである。
実施態様によっては、RGN融合タンパク質は、ポリヌクレオチド(すなわち、RNA、DNA、またはRNA/DNAハイブリッド)を切断できる任意のドメインである切断ドメイン(制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼ、たとえばIIS型エンドヌクレアーゼ(たとえばFokI)が挙げられるが、これらに限定されない)を含む(たとえば、Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993を参照のこと)。
実施態様によっては、RGN融合タンパク質は、核酸塩基を脱アミノ化して1つの核酸塩基を別の核酸塩基に変換するデアミナーゼドメイン(塩基編集シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼが挙げられるが、これらに限定されない)を含む(たとえば、Gaudelli et al. (2017) Nature 551:464-471、米国特許出願公開第2017/0121693号および第2018/0073012号、米国特許第9,840,699号、国際公開第WO/2018/027078号、国際出願第PCT/US2019/068079号、および米国特許仮出願第62/785,391号(2018年12月27日出願)および第62/932,169号(2019年11月7日出願)を参照のこと)。
実施態様によっては、RGN融合タンパク質の作用ドメインは、転写を増加あるいは減少するよう機能するドメインである発現調節ドメインであってもよい。発現調節ドメインは、後成的な修飾ドメイン、転写抑制ドメイン、または転写活性化ドメインであってもよい。
これらの実施態様の一部では、RGN融合タンパク質の発現調節因子は、DNAまたはヒストンタンパク質を共有結合により修飾し、DNA配列を変化させずにヒストン構造および/または染色体構造を変化させ、遺伝子発現の変化(すなわち増加または減少)を導く後成的修飾ドメインを含む。後成的修飾の非限定的な例としては、リジン残基のアセチル化またはメチル化、アルギニンメチル化、セリンおよびスレオニンリン酸化、ならびにヒストンタンパク質のリジンユビキチン化およびSUMO化、ならびにDNA中のシトシン残基のメチル化およびヒドロキシメチル化が挙げられる。後成的修飾ドメインの非限定的な例としては、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラーゼドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼドメイン、およびDNAデメチラーゼドメインが挙げられる。
実施態様によっては、融合タンパク質の発現調節因子は、転写制御配列および/または転写制御タンパク質、たとえばRNAポリメラーゼおよび転写因子と相互作用して少なくとも1つの遺伝子の転写を減少あるいは終結させる転写抑制ドメインを含む。転写抑制ドメインは当技術分野で知られており、Sp1様抑制因子、IκB、およびクルッペル関連ボックス(KRAB)ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
実施態様によっては、融合タンパク質の発現調節因子は、転写制御配列および/または転写制御タンパク質、たとえばRNAポリメラーゼおよび転写因子と相互作用して少なくとも1つの遺伝子の転写を増加あるいは活性化させる転写活性化ドメインを含む。転写活性化ドメインは当技術分野で知られており、単純ヘルペスウイルスVP16活性化ドメインおよびNFAT活性化ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
実施態様によっては、本開示のRGNポリペプチドは、検出可能な標識または精製タグを含む。直接あるいはリンカーペプチドを介して間接的に、検出可能な標識または精製タグをRNA誘導ヌクレアーゼのN末端、C末端、または内部位置に配置してもよい。これらの実施態様の一部では、融合タンパク質のRGN成分はヌクレアーゼ失活型RGNである。他の実施態様では、融合タンパク質のRGN成分はニッカーゼ活性を有するRGNである。
検出可能な標識は、視覚化あるいは他の方法で観察できる分子である。検出可能な標識を融合タンパク質(たとえば蛍光タンパク質)としてRGNに融合してもよいし、RGNポリペプチドに結合された視覚的にあるいは他の手段で検出可能な小分子であってもよい。本開示のRGNに融合タンパク質として融合できる検出可能な標識としては任意の検出可能なタンパク質ドメインが挙げられ、蛍光タンパク質、または特定の抗体で検出可能なタンパク質ドメインなどが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質(たとえば、GFP、EGFP、ZsGreen1)および黄色蛍光タンパク質(たとえば、YFP、EYFP、ZsYellow1)が挙げられる。小分子検出可能標識の非限定的な例としては、放射性標識、たとえば3Hおよび35Sが挙げられる。
実施態様によっては、本開示のRGNポリペプチドは、混合物(たとえば生体試料、培地)からタンパク質または融合タンパク質を単離するのに利用可能な任意の分子である精製タグを含む。精製タグの非限定的な例としては、ビオチン、myc、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が挙げられる。
III.ガイドRNA
本開示は、ガイドRNAおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。「ガイドRNA」という用語は、標的配列とハイブリダイズし、関連するRNA誘導ヌクレアーゼを標的ヌクレオチド配列に配列特異的に結合させるのに十分な標的ヌクレオチド配列との相補性を有するヌクレオチド配列を指す。したがって、RGNの各ガイドRNAは、RGNに結合してRGNを特定の標的ヌクレオチド配列に結合するよう誘導できる1つ以上(一般に、1つまたは2つ)のRNA分子であり、RGNがニッカーゼまたはヌクレアーゼ活性を有する実施態様ではさらに標的ヌクレオチド配列を切断する。実施態様によっては、ガイドRNAはCRISPR RNA(crRNA)を含み、実施態様によっては、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。crRNAとtracrRNAの両方を含む天然ガイドRNAは一般に、crRNAの反復配列およびtracrRNAの反反復配列を介して互いにハイブリダイズする2つの別々のRNA分子を含む。
実施態様によっては、CRISPR配列内の天然の直接反復配列は、28~37塩基対の長さの範囲である。実施態様によっては、CRISPR配列内の天然の直接反復配列は、約23 bp~約55 bp(たとえば、23 bp~55 bp)の長さの範囲である。実施態様によっては、CRISPR配列内のスペーサー配列は、約32~約38 bpの長さの範囲である。実施態様によっては、CRISPR配列内のスペーサー配列は、約21 bp~約72 bp(たとえば、21 bp~72 bp)の範囲である。実施態様によっては、本明細書に開示のCRISPR配列は、50単位未満のCRISPR反復配列-スペーサー配列を含む。CRISPRは、CRISPR配列の大部分を構成する一次CRISPR転写物と呼ばれる長い転写物の一部として転写される。一次CRISPR転写物はCasタンパク質により切断されてcrRNAを生成し、場合によってはpre-crRNAを生成し、これがさらなるCasタンパク質により処理されて成熟crRNAになる。成熟crRNAはスペーサー配列およびCRISPR反復配列を含む。pre-crRNAが処理されて成熟(すなわち処理済み)crRNAになる実施態様の一部では、成熟は、約1~約6個またはそれ以上の5'側、3'側、または5'側および3'側のヌクレオチドの除去を伴う。目的の特定の標的ヌクレオチド配列をゲノム編集あるいは標的化する目的では、pre-crRNA分子の成熟時に除去されるこれらのヌクレオチドはガイドRNAの生成または設計に必要ではない。本開示のRGNタンパク質(配列番号1~109)のそれぞれのコンセンサス反復配列を、配列番号201~309にそれぞれ開示する。APG07339(配列番号1)、APG09624(配列番号2)、APG03003(配列番号3)、APG05405(配列番号4)、APG09777(配列番号5)、APG05680(配列番号6)、APG06369(配列番号11)、APG03847(配列番号12)、APG05625(配列番号13)、およびAPG03524(配列番号16)のそれぞれの処理済みcrRNA反復配列を、配列110~119にそれぞれ開示する。
CRISPR RNA(crRNA)は、スペーサー配列およびCRISPR反復配列を含む。「スペーサー配列」は、目的の標的ヌクレオチド配列と直接ハイブリダイズするヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、目的の標的配列と完全または部分的に相補的であるように設計される。様々な実施態様において、スペーサー配列は、約8ヌクレオチドから約30ヌクレオチド、またはそれ以上を含んでもよい。たとえば、スペーサー配列は、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、またはそれ以上のヌクレオチド長である。実施態様によっては、スペーサー配列は、約10~約26ヌクレオチド長または約12~約30ヌクレオチド長である。特定の実施態様では、スペーサー配列は約30ヌクレオチド長である。実施態様によっては、スペーサー配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを用いて最適に整列された場合、約50%以上、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれ以上である。特定の実施態様では、スペーサー配列は二次構造を含まず、このことは、当技術分野で知られている任意の適切なポリヌクレオチド折畳みアルゴリズム(mFold(たとえば、ZukerおよびStiegler (1981) Nucleic Acids Res. 9:133-148を参照のこと)およびRNAfold(たとえば、Gruber et al. (2008) Cell 106(1):23-24を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない)を用いて予測可能である。
CRISPR RNA反復配列は、RGN分子によって認識される、それ自体であるいはハイブリダイズしたtracrRNAと協調して構造を形成するヌクレオチド配列を含む。様々な実施態様において、CRISPR RNA反復配列は、約8ヌクレオチド~約30ヌクレオチドまたはそれ以上を含んでもよい。たとえば、CRISPR反復配列は、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。実施態様によっては、CRISPR反復配列は約21ヌクレオチド長である。実施態様によっては、CRISPR反復配列とそれに対応するtracrRNA配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを用いて最適に整列された場合、約50%以上、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれ以上である。特定の実施態様では、CRISPR反復配列は、ガイドRNA内に含まれる場合に、本明細書で提供される関連RNA誘導ヌクレアーゼの目的の標的配列への配列特異的結合を誘導できる、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のヌクレオチド配列のいずれか1つまたはその活性多様体もしくは断片を含む。特定の実施態様では、野生型配列の活性CRISPR反復配列多様体は、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309として示されるヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様では、野生型配列の活性CRISPR反復配列断片は、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309として示されるヌクレオチド配列のいずれか1つの少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の連続するヌクレオチドを含む。
特定の実施態様では、crRNAは非天然である。これらの実施態様によっては、特定のCRISPR反復配列は、本来は設計されたスペーサー配列に連結されておらず、CRISPR反復配列はスペーサー配列に対して異種であると見なされる。特定の実施態様では、スペーサー配列は非天然の操作された配列である。
実施態様によっては、ガイドRNAはtracrRNA分子をさらに含む。トランス活性化CRISPR RNAまたはtracrRNA分子は、crRNAのCRISPR反復配列にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する領域(この領域を本明細書では反反復領域と呼ぶ)を含むヌクレオチド配列を含む。実施態様によっては、tracrRNA分子は、二次構造(たとえばステムループ)を有する領域をさらに含むか、その対応するcrRNAとハイブリダイズすると二次構造を形成する。特定の実施態様では、CRISPR反復配列に完全または部分的に相補的であるtracrRNAの領域は分子の5'末端にあり、tracrRNAの3'末端は二次構造を含む。二次構造のこの領域は一般に、反反復配列に隣接して見られるいくつかのヘアピン構造、たとえばネクサスヘアピンを含む。多くの場合、tracrRNAの3'末端には、構造および数が異なり得るが、GCが豊富なRho非依存性転写終結ヘアピンおよびそれに続く3'末端の一連のUを含むことが多い末端ヘアピンがある。たとえば、Briner et al. (2014) Molecular Cell 56:333-339, BrinerおよびBarrangou (2016) Cold Spring Harb Protoc; doi: 10.1101/pdb.top090902、および米国特許出願公開第2017/0275648号を参照のこと。これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施態様では、CRISPR反復配列に完全または部分的に相補的であるtracrRNAの反反復領域は、約6ヌクレオチド~約30ヌクレオチド、またはそれ以上を含む。たとえば、tracrRNA反反復配列とCRISPR反復配列との間の塩基対形成の領域は、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。特定の実施態様では、CRISPR反復配列に完全または部分的に相補的であるtracrRNAの反反復領域は約10ヌクレオチド長である。実施態様によっては、CRISPR反復配列とそれに対応するtracrRNA反反復配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを用いて最適に整列された場合、約50%以上、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれ以上である。
様々な実施態様において、全長tracrRNAは、約60個のヌクレオチドから約210個を超えるヌクレオチドを含んでもよい。たとえば、tracrRNAは、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。特定の実施態様では、tracrRNAは、約100~約201ヌクレオチド長、たとえば、約95、約96、約97、約98、約99、約100、約105、約106、約107、約108、約109、および約100ヌクレオチド長である。特定の実施態様では、tracrRNAは約96ヌクレオチド長である。
特定の実施態様では、tracrRNAは、ガイドRNA内に含まれる場合に、本明細書で提供される関連RNA誘導ヌクレアーゼの目的の標的配列への配列特異的結合を誘導できる、配列番号120~128、140、142、145、147、および148のヌクレオチド配列のいずれか1つまたはその活性多様体もしくは断片を含む。特定の実施態様では、野生型配列の活性tracrRNA配列多様体は、配列番号120~128、140、142、145、147、および148として示されるヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様では、野生型配列の活性tracrRNA配列断片は、配列番号120~128、140、142、145、147、および148として示されるヌクレオチド配列のいずれか1つの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。
2つのポリヌクレオチド配列が厳しい条件で互いにハイブリダイズする場合、この2つの配列を実質的に相補的と見なすことができる。同様に、RGNに結合したガイドRNAが厳しい条件で標的配列に結合する場合、RGNは配列特異的に特定の標的配列に結合すると見なされる。「厳しい条件」または「厳しいハイブリダイゼーション条件」は、2つのポリヌクレオチド配列が他の配列に対してよりも検出可能な程度に多く(たとえばバックグラウンドの少なくとも2倍)互いにハイブリダイズする条件を意図する。厳しい条件は配列に依存し、様々な状況によって異なる。一般に、厳しい条件は、塩濃度が約1.5 M Naイオン未満、一般にはpH 7.0~8.3で約0.01~1.0 M Naのイオン濃度(または他の塩)であり、温度が、短い配列(たとえば10~50ヌクレオチド)の場合は少なくとも約30℃、長い配列(たとえば、50ヌクレオチド超)の場合は少なくとも約60℃である条件である。不安定化剤、たとえばホルムアミドを加えて厳しい条件を得てもよい。模範的な低度に厳しい条件としては、37℃での30~35%ホルムアミド、1 M NaCl、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝液を用いるハイブリダイゼーション、および50~55℃での1倍~2倍SSC(20倍SSC = 3.0 M NaCl / 0.3 Mクエン酸三ナトリウム)での洗浄が挙げられる。模範的な中程度に厳しい条件としては、37℃での40~45%ホルムアミド、1.0 M NaCl、1%SDSでのハイブリダイゼーション、および55~60℃での0.5倍~1倍SSCでの洗浄が挙げられる。模範的な高度に厳しい条件としては、37℃での50%ホルムアミド、1 M NaCl、1%SDSでのハイブリダイゼーション、および60~65°Cでの0.1倍SSCでの洗浄が挙げられる。必要に応じて、洗浄緩衝液は、約0.1%~約1%のSDSを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの持続時間は一般に約24時間未満であり、通常は約4~約12時間である。洗浄時間の長さは、少なくとも平衡に達するのに十分な長さである。
Tmは、相補的な標的配列の50%が、完全に一致する配列と(定義されたイオン強度およびpHで)ハイブリダイズする温度である。DNAとDNAのハイブリッドの場合、TmはMeinkothおよびWahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式、すなわちTm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (%ホルム) - 500/L(式中、Mは一価の陽イオンのモル濃度、%GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率、%ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率、Lは塩基対でのハイブリッドの長さである)で概算できる。一般に、厳しい条件は、定義されたイオン強度およびpHでの特定の配列およびその補体の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。ただし、非常に厳しい条件では、熱融解温度(Tm)よりも1、2、3、または4℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を用いてもよく、中程度に厳しい条件では、熱融解温度(Tm)よりも6、7、8、9、または10℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を用いてもよく、低度に厳しい条件では、熱融解温度(Tm)よりも11、12、13、14、15、または20℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を用いてもよい。当業者は理解しているように、式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のTmを用いてハイブリダイゼーションおよび/または洗浄溶液の厳しさの変動が本質的に説明される。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2(生化学・分子生物学実験技術-核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション、-第I部第2章)(Elsevier, New York);およびAusubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2(分子生物学における現在のプロトコル、第2章) (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に記載されている。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子クローニング:実験室マニュアル) (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)を参照のこと。
「配列特異的」という用語は、無作為のバックグラウンド配列への結合よりも高い頻度での標的配列の結合を指すこともある。
実施態様によっては、たとえばガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAの両方を含む場合には、ガイドRNAは単一ガイドRNAであっても二重ガイドRNAシステムであってもよい。単一ガイドRNAはRNAの単一分子上のcrRNAおよびtracrRNAを含むが、二重ガイドRNAシステムはcrRNAのCRISPR反復配列の少なくとも一部およびtracrRNA(crRNAのCRISPR反復配列と完全または部分的に相補性であってもよい)の少なくとも一部を介して互いにハイブリダイズした2つの異なるRNA分子上に存在するcrRNAおよびtracrRNAを含む。ガイドRNAが単一のガイドRNAである実施態様の一部では、crRNAおよびtracrRNAはリンカーヌクレオチド配列により分離されている。一般に、リンカーヌクレオチド配列は、リンカーヌクレオチド配列内のあるいはリンカーヌクレオチド配列のヌクレオチドを含む二次構造の形成を避けるために、相補的塩基を含まない配列である。実施態様によっては、crRNAとtracrRNAとの間のリンカーヌクレオチド配列は、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施態様では、単一ガイドRNAのリンカーヌクレオチド配列は少なくとも4ヌクレオチド長である。特定の実施態様では、リンカーヌクレオチド配列は、配列番号136として示されるヌクレオチド配列である。他の実施態様では、リンカーヌクレオチド配列は少なくとも6ヌクレオチド長である。
単一ガイドRNAまたは二重ガイドRNAは、化学的にあるいはインビトロでの転写により合成可能である。RGNとガイドRNAとの間の配列特異的結合を決定するための検定は当技術分野で知られており、限定されないが、発現RGNとガイドRNAとのインビトロでの結合検定が挙げられる。この検定を検出可能な標識(たとえばビオチン)でタグ付けすることができ、この検定は、ガイドRNAとRGNの複合体を検出可能な標識で(たとえばストレプトアビジンビーズで)捕捉するプルダウン検出検定に用いられる。ガイドRNAとは無関係の配列または構造を持つ対照ガイドRNAをRGNのRNAへの非特異的結合の陰性対照として用いることができる。特定の実施態様では、ガイドRNAは、配列番号129~135および310のいずれか1つであり、スペーサー配列は任意の配列であってもよく、ポリ-N配列として示される。
特定の実施態様では、ガイドRNAをRNA分子として標的細胞、細胞小器官、または胚に導入してもよい。ガイドRNAはインビトロで転写されても化学合成されてもよい。他の実施態様では、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を細胞、細胞小器官、または胚に導入する。これらの実施態様の一部では、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列をプロモーター(たとえばRNAポリメラーゼIIIプロモーター)に作動可能に連結する。プロモーターは、固有のプロモーターであってもよく、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列と異種であってもよい。
様々な実施態様において、本明細書に記載されるように、ガイドRNAを、ガイドRNAがRNA誘導ヌクレアーゼポリペプチドに結合しているリボ核タンパク質複合体として標的細胞、細胞小器官、または胚に導入してもよい。
ガイドRNAは、ガイドRNAが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることにより、関連するRNA誘導ヌクレアーゼを目的の特定の標的ヌクレオチド配列に向ける。標的ヌクレオチド配列は、DNA、RNA、または両方の組合せを含んでもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。標的ヌクレオチド配列は、ゲノムDNA(すなわち、染色体DNA)、プラスミドDNA、またはRNA分子(たとえば、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、転移RNA、マイクロRNA、低分子干渉RNA)であってもよい。標的ヌクレオチド配列は、インビトロまたは細胞内でRNA誘導ヌクレアーゼにより結合(かつ、実施態様によっては切断)されてもよい。RGNの標的となる染色体配列は、核、色素体、またはミトコンドリアの染色体配列であってもよい。実施態様によっては、標的ヌクレオチド配列は標的ゲノムに固有である。
実施態様によっては、標的ヌクレオチド配列はプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接している。特定の実施態様では、一本鎖標的配列の切断はPAMに依存しないが、二本鎖標的配列の切断はPAMの存在に依存する。プロトスペーサー隣接モチーフは、一般に標的ヌクレオチド配列から約1~約10ヌクレオチド以内(標的ヌクレオチド配列から約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10ヌクレオチドを含む)である。PAMは標的配列の5'または3'であってもよい。実施態様によっては、PAMは本開示のRGNの標的配列の5'である。一般に、PAMは約3~4ヌクレオチドのコンセンサス配列であるが、特定の実施態様では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。実施態様によっては、PAMは標的配列の5'であり、Tに富む。
実施態様によっては、RGNは、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のいずれか1つに示されるCRISPR反復配列またはその活性多様体もしくは断片と配列番号120~128、140、142、145、147、および148のいずれか1つにそれぞれ示されるtracrRNA配列またはそれらの活性多様体もしくは断片とを含むガイド配列に結合する。RGNシステムについては本明細書の実施例1および表1にさらに記載する。
所定のヌクレアーゼ酵素に対するPAM配列特異性が酵素濃度に影響されることは当技術分野で周知である(たとえば、Karvelis et al. (2015) Genome Biol 16:253を参照のこと)が、これをRGNの発現に用いられるプロモーター、または細胞、細胞小器官もしくは胚へ送達されるリボ核タンパク質複合体量を変えて変化させてもよい。
RGNによる結合および切断がPAM配列に依存する実施態様では、その対応するPAM配列を認識すると、RGNは標的ヌクレオチド配列を特定の切断部位で切断できる。本明細書で使用される場合、切断部位は、標的ヌクレオチド配列内の2つの特定のヌクレオチドで構成され、その間でヌクレオチド配列はRGNによって切断される。切断部位は、PAMから5'または3'方向の1番目と2番目、2番目と3番目、3番目と4番目、4番目と5番目、5番目と6番目、7番目と8番目、または8番目と9番目のヌクレオチドを含んでもよい。実施態様によっては、切断部位は、PAMから5'または3'方向のいずれかで10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドを超えてもよい。実施態様によっては、切断部位はPAMから4ヌクレオチド離れている。他の実施態様では、切断部位はPAMから少なくとも15ヌクレオチド離れている。 RGNは標的ヌクレオチド配列を切断してねじれ型の末端にすることができるため、実施態様によっては、切断部位はポリヌクレオチドのプラス(+)鎖上のPAMから2ヌクレオチドの距離およびポリヌクレオチドのマイナス(-)鎖上のPAMから2ヌクレオチドの距離に基づいて定義される。
IV. RNA誘導ヌクレアーゼ、CRISPR RNA、および/またはtracrRNAをコードするヌクレオチド
本開示は、本開示のCRISPR RNA、tracrRNA、および/またはsgRNAを含むポリヌクレオチド、ならびに本開示のRNA誘導ヌクレアーゼ、CRISPR RNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドとしては、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のヌクレオチド配列のいずれか1つを含むCRISPR反復配列、またはガイドRNA内に含まれる場合に、関連RNA誘導ヌクレアーゼの目的の標的配列への配列特異的結合を導くことができるその活性多様体もしくは断片を含むかコードするものが挙げられる。配列番号120~128、140、142、145、147、および148のヌクレオチド配列のいずれか1つを含むtracrRNA、またはガイドRNA内に含まれる場合に関連RNAガイドヌクレアーゼの目的の標的配列への配列特異的結合を導くことができるその活性多様体もしくは断片を含むかコードするポリヌクレオチドについても開示する。配列番号1~109として示されるアミノ酸配列のいずれか1つを含むRNA誘導ヌクレアーゼ、およびRNAに誘導されて配列特異的に標的ヌクレオチド配列に結合する能力を保持するその活性断片または多様体をコードするポリヌクレオチドも提供する。
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、本開示をDNAを含むポリヌクレオチドに限定することを意図するものではないが、そのようなDNAポリヌクレオチドが意図される。当業者は認識していることだが、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド(RNA)ならびにリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを含み得る。このようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドには、天然の分子および合成の類似体の両方が含まれる。これらの例としては、たとえば、ペプチド核酸(PNA)、PNA-DNAキメラ、架橋型核酸(LNA)、およびホスホチオアート結合配列が含まれる。本明細書に開示のポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態、DNA-RNAハイブリッド、三重構造、ステムループ構造、環状形態(たとえば、環状RNAを含む)を含む(ただしこれらに限定されない)すべての形態の配列も包含する。
実施態様によっては、RGNをコードする核酸分子は、目的の生物での発現のためにコドン最適化されている。「コドン最適化された」コード配列は、そのコドン使用頻度を特定の宿主細胞の好ましいコドン使用頻度または転写条件を模倣するように設計されたポリヌクレオチドコード配列である。特定の宿主細胞または生物での発現は、翻訳されたアミノ酸配列が変化しないような核酸レベルの1つ以上のコドンの変更の結果として強化される。核酸分子を全体的または部分的にコドン最適化してもよい。広範囲の生物の優先情報を示すコドン表および他の参考文献が当技術分野で利用可能である(たとえば、植物で優先されるコドン使用の考察についてはCampbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照のこと)。植物で優先される遺伝子を合成する方法は当技術分野で利用可能である。たとえば、米国特許第5,380,831号および第5,436,391号、ならびにMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照のこと。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるRGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードするポリヌクレオチドは、実施態様によっては、インビトロでの発現または目的の細胞、細胞小器官、胚、または生物での発現のための発現カセット内で提供される。このカセットは、ポリヌクレオチドの発現を可能にする、本明細書で提供されるRGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された5'および3'制御配列を含んでもよい。このカセットは、生物に同時形質転換される少なくとも1つのさらなる遺伝子または遺伝子要素をさらに含んでもよい。さらなる遺伝子または要素が含まれる場合、それらの成分を作動可能に連結する。「作動可能に連結された」という用語は、2つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図している。たとえば、プロモーターと目的の翻訳領域(たとえば、RGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードする領域)との間の作動可能な連結は、目的の翻訳領域の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結された要素は、連続していてもいなくてもよい。2つのタンパク質翻訳領域の連結を指すのに使用される場合、「作動可能に連結される」は翻訳領域が同じ読み枠内にあることを意図する。あるいは、さらなる遺伝子または要素を複数の発現カセットで提供することもできる。たとえば、本開示のRGNをコードするヌクレオチド配列は1つの発現カセット上に存在してもよいし、crRNA、tracrRNA、または完全なガイドRNAをコードするヌクレオチド配列が別々の発現カセット上に存在してもよい。このような発現カセットは、制御領域の転写制御下におかれるポリヌクレオチドを挿入するための複数の制限部位および/または組換え部位を備える。発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
発現カセットは、転写の5'→3'方向に、転写(および実施態様によっては翻訳)開始領域(すなわちプロモーター)、RGN、crRNA、tracrRNAおよび/またはsgRNAをコードする本発明のポリヌクレオチド、ならびに目的の生物で機能する転写(および実施態様によっては翻訳)終結領域(すなわち終結領域)を含んでもよい。本発明のプロモーターは、宿主細胞でコード配列の発現を誘導あるいは駆動できる。制御領域(たとえば、プロモーター、転写制御領域、および翻訳終結領域)は、宿主細胞に対してあるいは互いに内因性であっても異種であってもよい。本明細書で使用される場合、配列に関する「異種」は、外来性の種に由来する配列であるか、あるいは、同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入により、組成および/またはゲノム遺伝子座中のその天然の形態から実質的に改変されている。本明細書で使用される場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に連結されたコード配列を含む。
重宝な終結領域、たとえばオクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域はA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)のTiプラスミドから入手可能である。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; およびJoshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639も参照のこと。
さらなる制御シグナルとしては、転写開始部位(transcriptional initiation start sites)、オペレーター、アクチベーター、エンハンサー、他の制御要素、リボソーム結合部位、開始コドン、終結シグナルなどが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、米国特許第5,039,523号および第4,853,331号;EPO 0480762A2;Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子クローニング:研究の手引き), ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)(以下、「Sambrook 11」); Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (高度な細菌遺伝学)(Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, N.Y.、ならびにそれらに引用されている参照文献を参照のこと。
発現カセットを調製する際、適切な配向の、また必要に応じて適切な読み枠のDNA配列を提供するように様々なDNA断片を操作してもよい。この目的に向けて、アダプターまたはリンカーを用いてDNA断片を連結してもよいし、あるいは、好都合な制限部位を提供するために、その他の操作、たとえば過剰なDNAの除去、制限部位の除去などが含まれてもよい。この目的のため、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、たとえば、遷移および転換が含まれてもよい。
本発明の実施には多くのプロモーターを使用できる。プロモーターを所望の結果に基づき選択できる。核酸を、目的の生物での発現のために構成的、誘導性、成長段階特異的、細胞型特異的、組織優先的、組織特異的、またはその他のプロモーターと組み合わせてもよい。たとえば、WO 99/43838ならびに米国特許第8,575,425号; 第7,790,846号; 第8,147,856号;第8,586832号;第7,772,369号;第7,534,939号;第6,072,050号;第5,659,026号;第5,608,149号;第5,608,144号;第5,604,121号;第5,569,597号;第5,466,785号;第5,399,680号;第5,268,463号;第5,608,142号;および第6,177,611号(参照により本明細書に組み込まれる)に示されるプロモーターを参照のこと。
植物での発現の場合、構成的プロモーターとしては、CaMV 35Sプロモーター(Odell et al. (1985) Nature 313:810-812);イネアクチン(McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171);ユビキチン(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588);ならびにMAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730)も含まれる。
誘導性プロモーターの例は、低酸素または低温ストレスにより誘導されるAdh1プロモーター、熱ストレスにより誘導されるHsp70プロモーター、いずれも光により誘導されるPPDKプロモーターおよびPEPカルボキシラーゼプロモーターである。化学的に誘導可能なプロモーター、たとえばより安全に誘導されるIn2-2プロモーター(米国特許第5,364,780号)、オーキシン誘導されタペータム特異的だがカルスでも活性なAxig1プロモーター(PCT US01/22169)、ステロイド応答性プロモーター(たとえば、エストロゲン誘導されるEREプロモーター、ならびにSchena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425およびMcNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257の糖質コルチコイド誘導性プロモーターを参照のこと)、ならびにテトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター(たとえば、Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237および米国特許第5,814,618号および第5,789,156号を参照のこと)も有用であり、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
組織特異的または組織優先プロモーターを利用して特定の組織での発現構築物の発現を標的化できる。特定の実施態様では、組織特異的または組織優先プロモーターは植物組織で活性である。植物の発達制御下にあるプロモーターの例としては、特定の組織、たとえば葉、根、果実、種子、または花で優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。「組織特異的」プロモーターは、特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの相互作用するレベルの遺伝子制御の結果である。したがって、相同のあるいは密接に関連する植物種に由来のプロモーターは、特定の組織で導入遺伝子の効率的かつ信頼性の高い発現を達成するべく使用するのに好ましい可能性がある。実施態様によっては、発現は組織優先プロモーターを含む。「組織優先」プロモーターは、転写を特定の組織で優先的に(ただし、必ずしも完全でも単独でもなく)開始するプロモーターである。
実施態様によっては、RGN、crRNA、および/またはtracrRNAをコードする核酸分子は細胞型特異的プロモーターを含む。「細胞型特異的」プロモーターは、主に1つ以上の器官の特定の細胞型での発現を駆動するプロモーターである。植物で機能する細胞型特異的プロモーターが主に活性である可能性のある植物細胞のいくつかの例としては、たとえば、BETL細胞、根、葉、茎細胞の維管束細胞、および幹細胞が挙げられる。核酸分子は、細胞型優先的プロモーターも含み得る。「細胞型優先的」プロモーターは、大部分は1つ以上の器官の特定の細胞型での発現を主に(ただし、必ずしも完全でも単独でもなく)駆動するプロモーターである。植物で機能する細胞型優先プロモーターが優先的に活性である可能性のある植物細胞のいくつかの例としては、たとえば、BETL細胞、根、葉、茎細胞の維管束細胞、および幹細胞が挙げられる。
RGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードする核酸配列を、たとえばインビトロでのmRNA合成のために、ファージRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結してもよい。このような実施態様では、インビトロで転写されたRNAを本明細書に記載の方法に用いるために精製してもよい。たとえば、プロモーター配列は、T7、T3、もしくはSP6プロモーター配列、またはT7、T3、もしくはSP6プロモーター配列の変形であってもよい。このような実施態様では、発現したタンパク質および/またはRNAを本明細書に記載のゲノム改変の方法に用いるために精製してもよい。
特定の実施態様では、RGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードするポリヌクレオチドを、ポリアデニル化シグナル(たとえば、SV40ポリAシグナルおよび植物で機能するその他のシグナル)および/または少なくとも1つの転写終結配列に連結してもよい。また、本明細書の他の場所に記載するように、RGNをコードする配列を少なくとも1つの核局在化シグナル、少なくとも1つの細胞透過性ドメイン、および/またはタンパク質を特定の細胞内位置に輸送できる少なくとも1つのシグナルペプチドをコードする配列に連結してもよい。
RGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードするポリヌクレオチドは1つ以上のベクター中に存在してもよい。「ベクター」は、核酸を宿主細胞に移入、送達、あるいは導入するためのポリヌクレオチド組成物を指す。適切なベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工/ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター(たとえば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター)が挙げられる。ベクターは、さらなる発現制御配列(たとえば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列)、選択可能なマーカー配列(たとえば、抗生物質耐性遺伝子)、複製起点などを含んでもよい。さらなる情報は、“Current Protocols in Molecular Biology”(「分子生物学の現在の手順」)Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”(「分子クローニング:実験の手順」)Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd edition, 2001に記載されている。
ベクターはまた、形質転換細胞を選択するための選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織の選択に利用される。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、たとえばネオマイシンホスホトランスフェラーゼII (NEO)およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)をコードする遺伝子、さらには除草剤化合物、たとえばグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)への耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
実施態様によっては、RGNポリペプチドをコードする配列を含む発現カセットまたはベクターは、crRNAおよび/もしくはtracrRNAまたはガイドRNAを作製するために組み合わせられたcrRNAとtracrRNAをコードする配列をさらに含んでもよい。crRNAおよび/またはtracrRNAをコードする配列を、目的の生物または宿主細胞でcrRNAおよび/またはtracrRNAを発現させるために少なくとも1つの転写制御配列に作動可能に連結してもよい。たとえば、crRNAおよび/またはtracrRNAをコードするポリヌクレオチドをRNAポリメラーゼIII (Pol III)により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結してもよい。適切なPol IIIプロモーターの例としては、哺乳動物のU6、U3、H1、および7SLのRNAプロモーター、ならびにイネU6およびU3プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
記載のとおり、RGN、crRNA、tracrRNA、および/またはsgRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を用いて目的の生物を形質転換できる。形質転換の方法は、ヌクレオチド構築物を目的の生物に導入することを含む。「導入する」は、構築物が宿主細胞の内部に到達できるようにヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入することを意味する。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を宿主生物に導入するための特定の方法を必要とせず、ヌクレオチド構築物が宿主生物の少なくとも1つの細胞の内部へのアクセスを得ることのみを必要とする。宿主細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。特定の実施態様では、真核生物の宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である。ヌクレオチド構築物を植物および他の宿主細胞に導入するための方法は当技術分野で知られており、安定形質転換法、一過的形質転換法、およびウイルス媒介法が挙げられるが、これらに限定されない。
この方法により、植物、たとえば植物全体および植物器官(たとえば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚、その子孫などの形質転換された生物が得られる。植物細胞は、分化していても未分化(たとえば、カルス、浮遊培養細胞、原形質体、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉)であってもよい。
「遺伝子導入生物」もしくは「形質転換生物」または「安定に形質転換された」生物もしくは細胞もしくは組織は、本発明のRGN、crRNA、および/またはtracrRNAをコードするポリヌクレオチドを組み込まれたあるいは統合された生物を指す。他の外因性または内因性の核酸配列またはDNA断片も宿主細胞に組み込まれ得ることが認識されている。アグロバクテリウムおよび微粒子銃を介した形質転換は、依然として植物細胞の形質転換に主に採用されている2つの手法である。しかし、宿主細胞の形質転換を感染、遺伝子導入、微量注入、電気穿孔、微小投射、微粒子銃またはパーティクルガン法、電気穿孔、シリカ/カーボンファイバー、超音波媒介、PEG媒介、リン酸カルシウム共沈殿、ポリカチオンDMSO技術、DEAEデキストラン法、およびウイルス媒介、リポソーム媒介などにより実行してもよい。RGN、crRNA、および/またはtracrRNAをコードするポリヌクレオチドのウイルスによる導入としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる導入および発現、ならびにカリモウイルス、ジェミニウイルス、およびRNA植物ウイルスの使用が挙げられる。
形質転換手順、ならびにポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を植物に導入するための手順は、形質転換の対象となる宿主細胞(たとえば、単子葉植物または双子葉植物細胞)の型に応じて変化してもよい。形質転換の方法は当技術分野で知られており、米国特許第8,575,425号、第7,692,068号、第8,802,934号、第7,541,517号(これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているものが挙げられる。Rakoczy-Trojanowska, M. (2002) Cell Mol Biol Lett. 7:849-858; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5; Rivera et al. (2012) Physics of Life Reviews 9:308-345; Bartlett et al. (2008) Plant Methods 4:1-12; Bates, G.W. (1999) Methods in Molecular Biology 111:359-366; BinnsおよびThomashow (1988) Annual Reviews in Microbiology 42:575-606; Christou, P. (1992) The Plant Journal 2:275-281; Christou, P. (1995) Euphytica 85:13-27; Tzfira et al. (2004) TRENDS in Genetics 20:375-383; Yao et al. (2006) Journal of Experimental Botany 57:3737-3746; ZupanおよびZambryski (1995) Plant Physiology 107:1041-1047; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5も参照のこと。
形質転換により、細胞への核酸の安定または一過的な取込みが得られてもよい。「安定な形質転換」は、宿主細胞に導入されたヌクレオチド構築物が宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫により継承されることができることを意味するよう意図される。「一過的な形質転換」は、ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入され、宿主細胞のゲノムに組み込まれないことを意味するよう意図される。
葉緑体の形質転換のための方法は当技術分野で知られている。たとえば、Svab et al. (1990) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; SvabおよびMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; SvabおよびMaliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照のこと。この方法は、選択可能なマーカーを含むDNAのパーティクルガン法による送達と、相同組換えによる色素体ゲノムへのDNAの標的化に依存する。また、核にコードされ色素体指向性であるRNAポリメラーゼの組織優先発現により無変化の色素体導入遺伝子をトランス活性化して、色素体の形質転換を達成できる。このようなシステムは、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305で報告されている。
形質転換された細胞を従来の方法に従って遺伝子導入生物、たとえば植物に成長させてもよい。たとえば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照のこと。次に、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株または異なる株で受粉させ、所望の表現型の特徴の構成的発現を有する得られた雑種を特定してもよい。所望の表現型の特徴の発現が安定に維持され受け継がれることを確実にするために2世代以上を成長させ、次に所望の表現型の特徴の発現が得られたことを確実にするために種子を回収してもよい。このようにして、本発明は、ゲノムに安定して組み込まれた本発明のヌクレオチド構築物、たとえば本発明の発現カセットを有する形質転換種子(「遺伝子導入種子」とも呼ばれる)を提供する。
あるいは、形質転換された細胞を生物に導入してもよい。これらの細胞は、細胞が生体外の手法で形質転換されている生物に由来してもよい。
本明細書で提供される配列を任意の植物種、たとえば単子葉植物および双子葉植物(ただしこれらに限定されない)の形質転換に用いてもよい。目的の植物の例としては、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナ、ブラシカ属、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞用植物、針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。
野菜としては、トマト、レタス、サヤインゲン、ライマメ、エンドウ、およびキュウリ属の一部、たとえばキュウリ、カンタループ、マスクメロンが挙げられるが、これらに限定されない。観賞用植物としては、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、キクなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の植物は、作物植物(たとえば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど)である。
本明細書で使用される場合、植物という用語は、植物細胞、植物原形質体、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、および植物または植物の一部(胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯など)において未変化の植物細胞を包含する。子実は、種の栽培または繁殖以外の目的で商業生産者により生産された成熟種子を意味するよう意図される。再生植物の子孫、多様体、および変異体も、これらの部分が導入されたポリヌクレオチドを含むという条件で、本発明の範囲内に含まれる。さらに、本明細書に開示の配列を保持する加工植物製品または副産物(たとえば大豆粕)をさらに提供する。
RGN、crRNA、および/またはtracrRNAをコードするポリヌクレオチドを任意の原核生物種、たとえば古細菌および細菌(たとえば、バチルス属(Bacillus)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、リゾビウム属(Rhizobium)、エシェリヒア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、シゲラ属(Shigella)、ビブリオ属(Vibrio)、エルシニア属(Yersinia)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)が挙げられるが、これらに限定されない)を形質転換するのに用いることもできる。
RGN、crRNA、および/またはtracrRNAをコードするポリヌクレオチドを用いて任意の真核生物種、(動物(たとえば、哺乳動物、昆虫、魚、鳥、および爬虫類)、真菌、アメーバ、藻類、および酵母が挙げられるが、これらに限定されない)を形質転換してもよい。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入法を用いて、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入できる。このような方法を用いて、CRISPRシステムの成分をコードする核酸を培養中の細胞または宿主生物に投与してもよい。非ウイルスベクター送達システムとしては、DNAプラスミド、RNA(たとえば、本明細書に記載のベクターの転写物)、裸の(naked)核酸、および送達媒体(たとえばリポソーム)と複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達システムは、細胞への送達後にエピソームまたは統合されたゲノムのいずれかを有するDNAおよびRNAウイルスを含む。遺伝子治療方法の概要については、Anderson, Science 256: 808- 813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative NeurologyおよびNeuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, DoerflerおよびBohm (eds) (1995);ならびにYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照のこと。
非ウイルスの核酸送達方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質と核酸の複合体、裸のDNA、人工ウイルス粒子、および薬剤で強化されるDNA取込みが挙げられる。リポフェクションは、たとえば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号、および第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている(たとえば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性の脂質としては、FeignerのWO91/17424およびWO91/16024のものが挙げられる。送達は、細胞に対して(たとえばインビトロまたは生体外投与)であっても標的組織に対して(たとえば生体内投与)であってもよい。脂質核酸複合体、たとえば免疫脂質複合体などの標的リポソームなどの調製は当業者によく知られている(たとえば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291- 297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号を参照のこと)。
核酸の送達のためのRNAまたはDNAウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化しウイルス搭載物を核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターを患者に直接(生体内)投与してもよいし、それらを用いて細胞をインビトロで処理し、改変細胞を必要に応じて患者に(生体外)投与してもよい。従来のウイルスに基づくシステムとしては、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現につながることが多い。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織で高い形質導入効率が確認されている。
外来性の外被タンパク質を組み込んで標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することにより、レトロウイルスの向性を変えることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、一般に高いウイルス力価を生じるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大6~10kbの外来配列の詰込み能力を有するシス作用性の長い末端反復配列で構成されている。最小のシス作用性LTRはベクターの複製および詰込みに十分であり、そこで、それらを用いて治療用遺伝子を標的細胞に統合し、永久的に導入遺伝子を発現させる。広く用いられるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる(たとえば、Buchscher et al., J. Viral. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Viral. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Viral. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Viral. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., 1. Viral. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700を参照のこと)。
一過的な発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを用いてもよい。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いると、高い力価および発現レベルが得られる。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に作製可能である。アデノ随伴ウイルス(「AAV」)ベクターを用いて標的核酸を、たとえば核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、また、生体内および生体外遺伝子治療方法のために、細胞に形質導入してもよい(たとえば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); 米国特許第4,797,368号; WO 93/24641; Katin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, 1. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照のこと)。組換えAAVベクターの構築は、複数の刊行物、たとえば米国特許第5,173,414号; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); およびSamulski et al., 1. Viral. 63:03822-3828 (1989)に記載されている。パッケージング細胞は一般に、宿主細胞に感染できるウイルス粒子を形成するのに用いられる。このような細胞としては、アデノウイルスを詰め込む293細胞、およびレトロウイルスを詰め込むψJ2細胞またはPA317細胞が挙げられる。
遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子に詰め込む細胞株を作製することにより生成される。ベクターは一般に、詰込みおよびその後の宿主への統合に必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、ポリヌクレオチドが発現されるための発現カセットにより置き換えられる。欠けているウイルス機能は、一般にパッケージング細胞株によりトランスで補われる。たとえば、遺伝子治療に用いられるAAVベクターは一般に、詰込みおよび宿主ゲノムへの統合に必要なAAVゲノムに由来のITR配列のみを有する。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするがITR配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージされる。
また、細胞株をヘルパーとしてアデノウイルスに感染させてもよい。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ITR配列がないため、ヘルパープラスミドは大量にパッケージされない。たとえば、アデノウイルスがAAVよりも影響を受けやすい熱処理により、アデノウイルスによる汚染を低減できる。細胞への核酸の送達のためのさらなる方法は当業者に知られている。たとえば、US20030087817(参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
実施態様によっては、宿主細胞に本明細書に記載の1つ以上のベクターを一過的的または非一過的に遺伝子導入する。実施態様によっては、細胞は、それが対象において本来存在するように遺伝子導入される。実施態様によっては、遺伝子導入される細胞は対象から採取される。実施態様によっては、細胞は対象から採取された細胞、たとえば細胞株に由来する。組織培養用の多様な細胞株が当技術分野で知られている。細胞株の例としては、限定されないが、C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLaS3、Huhl、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC-3、TFl、CTLL-2、CIR、Rat6、CVI、RPTE、AlO、T24、182、A375、ARH-77、Calul、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388Dl、SEM-K2、WEHI- 231、HB56、TIB55、lurkat、145.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4. COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1サル腎上皮、BALB/3T3マウス胚線維芽細胞、3T3 Swiss、3T3-Ll、132-d5ヒト胎児線維芽細胞;10.1マウス線維芽細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-I細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10Tl/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-Kl、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L235010、CORL23/ R23、COS-7、COV-434、CML Tl、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepalclc7、HL-60、HMEC、HT-29、lurkat、lY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KGl、KYOl、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-l0A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCKII、MDCKII、MOR/ 0.2R、MONO-MAC 6、MTD-lA、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞株、Peer、PNT-lA/ PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THPl 細胞株、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR、およびそれらの遺伝子導入変種が挙げられる。細胞株は当業者に知られている様々な供給源から入手可能である(たとえば、American Type Culture Collection (ATCC)(バージニア州マナッサス)を参照のこと)。
実施態様によっては、本明細書に記載の1つ以上のベクターを遺伝子導入された細胞を、1つ以上のベクター由来の配列を含む新しい細胞株の確立に用いる。実施態様によっては、本明細書に記載のCRISPRシステムの構成要素を(たとえば1つ以上のベクターの一過的遺伝子導入またはRNAの遺伝子導入により)一過的に遺伝子導入され、CRISPR複合体の活性により改変された細胞を、修飾を含むが他の任意の外因性配列を含まない細胞を含む新しい細胞株の確立に用いる。実施態様によっては、本明細書に記載の1つ以上のベクターを一過的または非一過的に遺伝子導入された細胞、またはそのような細胞に由来する細胞株を、1つ以上の試験化合物を評価する際に用いる。
実施態様によっては、本明細書に記載の1つ以上のベクターは、非ヒト遺伝子導入動物または遺伝子導入植物を作製するのに用いられる。実施態様によっては、遺伝子導入動物は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、またはウサギである。
V.ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの多様体ならびに断片
本開示は、アミノ酸配列が配列番号1~109として示される、天然に存在する(すなわち、野生型)RNA誘導ヌクレアーゼの活性多様体および断片、さらには、天然に存在するCRISPR反復配列、たとえば配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309として示される配列の活性多様体および断片、ならびに天然に存在するtracrRNA、たとえば配列番号120~128、140、142、145、147、および148として示される配列の活性多様体および断片、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドを提供する。天然に存在するRGNアクセサリータンパク質の活性多様体および断片、たとえば配列番号178~192として示される配列も提供される。
多様体または断片の活性は、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して変化していてもよいが、多様体および断片は、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能性を保持していなければならない。たとえば、多様体または断片は、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して増加した活性、減少した活性、異なる活性スペクトル、または他の任意の活性の変化を有してもよい。
天然に存在するRGNポリヌクレオチドの断片および多様体、たとえば本明細書に開示のものは、配列特異的なRNA誘導性のDNA結合活性を保持する。特定の実施態様では、天然に存在するRGNポリペプチドの断片および多様体、たとえば本明細書に開示されるものは、ヌクレアーゼ活性(一本鎖または二本鎖)を保持する。
天然に存在するCRISPR反復配列の断片および多様体、たとえば本明細書に開示されるものは、ガイドRNA(tracrRNAを含む)の一部である場合、(ガイドRNAと複合された)RNA誘導ヌクレアーゼに結合して配列特異的に標的ヌクレオチド配列へ誘導する能力を保持する。
天然に存在するtracrRNAの断片および多様体、たとえば本明細書に開示されるものは、ガイドRNA(CRISPR RNAを含む)の一部である場合、(ガイドRNAと複合された)RNA誘導ヌクレアーゼを配列特異的に標的へ誘導する能力を保持する。
天然に存在するRGNアクセサリータンパク質の断片および多様体、たとえば本明細書に開示されるものは、RGNシステム(すなわち、RGNタンパク質およびガイドRNA)の一部である場合、RGNシステムを配列特異的に標的ヌクレオチドに結合させる能力を保持する。
「断片」という用語は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部を指す。「断片」または「生物学的に活性な部分」は、生物学的活性(すなわち、ガイドRNA内に含まれる場合、RGNの標的ヌクレオチド配列への配列特異的な結合および誘導)を保持するのに十分な数の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。「断片」または「生物学的に活性な部分」は、生物学的活性(すなわち、ガイドRNAと複合された場合、RGNの標的ヌクレオチド配列への配列特異的な結合および誘導)を保持するのに十分な数の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドを包含する。RGNタンパク質の断片は、別の下流開始部位を使用するため、全長配列よりも短い断片を包含する。RGNタンパク質の生物学的に活性な部分は、たとえば、配列番号1~109の10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドであってもよい。このような生物学的に活性な部分を組換え技術によって調製し、配列特異的なRNA誘導DNA結合活性について評価してもよい。CRISPR反復配列の生物学的に活性な断片は、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のいずれか1つの少なくとも8個の連続したアミノ酸を含んでもよい。CRISPR反復配列の生物学的に活性な部分は、たとえば、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のいずれか1つの8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。tracrRNAの生物学的に活性な部分は、たとえば、配列番号120~128、140、142、145、147、および148のいずれか1つの8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。RGNアクセサリータンパク質の断片は、別の下流開始部位を用いるため、全長配列よりも短い断片を包含する。RGNアクセサリータンパク質の生物学的に活性な部分は、たとえば、配列番号178~192の10、25、50、100、150、200、またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドであってもよい。このような生物学的に活性な部分を組換え技術によって調製し、生物学的活性について評価してもよい。
一般に、「多様体」は、実質的に似た配列を意味するよう意図される。ポリヌクレオチドの場合、多様体は、天然ポリヌクレオチド内の1つ以上の内部部位の1つ以上のヌクレオチドの欠失および/もしくは付加、ならびに/または天然ポリヌクレオチドの1つ以上の部位の1つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用される場合、「天然」または「野生型」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合、保存的多様体は、遺伝暗号の縮重のために、目的の遺伝子の天然アミノ酸配列をコードする配列を包含する。これらのような天然に存在する対立遺伝子多様体を、周知の分子生物学的技術、たとえば以下に概説するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技術を用いて特定できる。多様体ポリヌクレオチドは、合成で誘導されたポリヌクレオチド、たとえば、部位特異的変異誘発を用いて作製されたが目的のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを依然としてコードするものを包含する。一般に、本明細書に開示の特定のポリヌクレオチドの多様体は、本明細書の他の箇所に記載の配列整列プログラムおよびパラメータにより決定する場合、その特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有する。
本明細書に開示の特定のポリヌクレオチド(すなわち基準ポリヌクレオチド)の多様体を、多様体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性を比較して評価することもできる。任意の2つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、本明細書の他の箇所に記載の配列整列プログラムおよびパラメータを用いて計算可能である。本明細書に開示の任意の所定のポリヌクレオチド対を、それらがコードする2つのポリペプチドが共有するパーセント配列同一性を比較して評価する場合、2つのコードされるポリペプチド間のパーセント配列同一性は、少なくとも約40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性である。
特定の実施態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1~109のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼポリペプチドをコードする。
本発明のRGNポリペプチドの生物学的に活性な多様体は、約1~15個のみのアミノ酸残基、約1~10(たとえば約6~10)個のみ、5個のみ、4個のみ、3個のみ、2個のみ、または1個のみのアミノ酸残基が異なってもよい。特定の実施態様では、ポリペプチドは、N末端またはC末端の短縮を含んでもよく、この短縮はポリペプチドのNまたはC末端からの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600個、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含んでもよい。
特定の実施態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号178~192のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼアクセサリーポリペプチドをコードする。
本発明のRGNアクセサリーポリペプチドの生物学的に活性な多様体は、約1~15個のみ、約1~10(たとえば約6~10)個のみ、5個のみ、4個のみ、3個のみ、2個のみ、または1個のみのアミノ酸残基が異なってもよい。特定の実施態様では、ポリペプチドは、N末端またはC末端の短縮を含んでもよく、この短縮はポリペプチドのNまたはC末端からの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200個、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含んでもよい。
特定の実施態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309として示されるヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むCRISPR反復配列を含むか、コードする。
本開示のポリヌクレオチドは、120~128、140、142、145、147、および148として示されるヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むtracrRNAを含むか、コードしてもよい。
本発明のCRISPR反復配列またはtracrRNASの生物学的に活性な多様体は、約1~15個のみ、約1~10個(たとえば約6~10個)のみ、5個のみ、4個のみ、3個のみ、2個のみ、または1個のみのヌクレオチドが異なってもよい。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは5'または3'の短縮を含んでもよく、この短縮はポリヌクレオチドの5'または3'末端からの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80個、またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含んでもよい。
本明細書で提供されるRGNポリペプチド、CRISPR反復配列、およびtracrRNAに改変を加えて多様体タンパク質およびポリヌクレオチドを作製してもよいと認識される。人間が設計した変更を部位特異的変異誘発技術の応用により導入してもよい。あるいは、本明細書に開示の配列に構造的かつ/または機能的に関連する未知または未確認の天然のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドも、本発明の範囲内であると認識される可能性がある。非保存領域でRGNタンパク質の機能を変更しない保存的アミノ酸置換を行ってもよい。あるいは、RGNの活性を改善する改変を加えてもよい。
多様体ポリヌクレオチドおよびタンパク質は、変異誘発および組換え誘発技術、たとえばDNAシャッフルで誘導される配列およびタンパク質も包含する。このような手順では、本明細書に開示の1つ以上の異なるRGNタンパク質(たとえば配列番号1~109)を操作して所望の特性を有する新しいRGNタンパク質を作製する。このようにして、実質的な配列同一性を有し、インビトロまたは生体内で相同的に組換えられ得る配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集合から、組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作製する。たとえば、この手法を用いて、目的のドメインをコードする配列モチーフを本明細書で提供されるRGN配列と他の既知のRGN遺伝子との間でシャッフルし、目的の改善された特性、たとえば酵素の場合、増加したKmを有するタンパク質をコードする新しい遺伝子を得てもよい。そのようなDNAシャッフルのための戦略は当技術分野で知られている。たとえば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; ならびに米国特許第5,605,793号および第5,837,458号を参照のこと。「シャッフルされた」核酸は、シャッフル手順、たとえば本明細書に記載の任意のシャッフル手順で作製される核酸である。2種以上の核酸(または文字列)をたとえば人工的、必要に応じて再帰的な方法で(物理的または仮想的に)組み換えることにより、シャッフルされた核酸を作製する。一般に、シャッフル過程では1つ以上の選別工程を用いて目的の核酸を特定する。この選別工程は、組換え工程の前に行われても後に行われてもよい。シャッフルの(すべてではない)実施態様によっては、選択の前に複数回の組換えを行い、選別されるプールの多様性を高めることが望ましい。必要に応じて、組換えおよび選択の過程全体を再帰的に反復する。状況に応じて、シャッフルは組換えおよび選択の過程全体を指す場合もあれば、単に過程全体のうち組換えの部分を指す場合もある。
本明細書で使用される場合、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大に対応するよう整列された場合に同一である2つの配列中の各残基を指す。タンパク質に関して配列同一性の百分率を用いる場合、同一ではない残基の位置は、アミノ酸残基を似た化学特性(たとえば電荷または疎水性)を持つ他のアミノ酸残基で置換する保存的なアミノ酸置換により異なり、したがって分子の機能特性を変更しない場合が多いことが認識されている。配列が保存的置換で異なる場合、置換の保存的性質を補正するためにパーセント配列同一性を上方に調整してもよい。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は当業者に知られている。一般に、これには保存的置換を完全な不一致でなく部分的な不一致として点数化して配列同一性の百分率を上げることが含まれる。このように、たとえば同一のアミノ酸に1点、非保存的置換に0点を与える場合、保存的置換には0~1点を与える。たとえばPC/GENEプログラム(Intelligenetics、カリフォルニア州マウンテン・ビュー)で保存的置換の点数化を実行する。
本明細書で使用される場合、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上で2つの最適に整列された配列を比較して決定される値を意味し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列を最適に整列した場合、基準配列(付加も欠失も含まない)と比較して付加または欠失(すなわちギャップ)を含み得る。この百分率は、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を算出し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性の百分率を求めることにより計算される。
特に述べない限り、本明細書に示される配列同一性/類似性の値は、GAPバージョン10で以下の変数を用いて、すなわち、ヌクレオチド配列の%同一性および%類似性についてはGAPの重み50、長さの重み3、およびnwsgapdna.cmp点数化行列;アミノ酸配列の%同一性および%類似性についてはGAPの重み8、長さの重み2、およびBLOSUM62点数化行列を使用し;あるいはそれと同等のプログラムを用いて得られた値を指す。「同等のプログラム」は、問題の任意の2つの配列について、GAPバージョン10により生成された対応する整列と比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有する整列を生成する任意の配列比較プログラムを意味する。
2つの配列は、定義されたアミノ酸置換行列(たとえばBLOSUM62)、ギャップ存在ペナルティ、およびギャップ伸長ペナルティを用いる類似性点数化のためにその配列対で可能な最高点に達するように整列されたとき、「最適に整列されている」。アミノ酸置換行列と2つの配列間の類似性の定量におけるその使用は当技術分野で周知であり、たとえば、Dayhoff et al. (1978) “A model of evolutionary change in proteins”(「タンパク質の進化的変化のモデル」)(“Atlas of Protein Sequence and Structure,” Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff)中)、pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.およびHenikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919に記載されている。BLOSUM62行列は、配列整列プロトコルの初期設定の点数化置換行列としてよく用いられる。整列した配列の一方への単一のアミノ酸ギャップの導入についてはギャップ存在ペナルティ、既に開いているギャップに挿入されたさらなる空のアミノ酸位置それぞれにギャップ伸長ペナルティを課す。整列は、整列の開始および終了の各配列のアミノ酸位置で定義され、必要に応じて、可能な限り最高点に達するように一方または両方の配列に1つ以上のギャップを挿入することで定義される。最適な整列および点数化を手動で実行してもよいが、この過程はコンピュータに実装された整列アルゴリズム、たとえばAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されNational Center for Biotechnology Informationのウェブサイト(ワールド・ワイド・ウェブ上のncbi.nlm.nih.gov)で公衆に利用可能になったギャップ付きBLAST 2.0を用いれば容易になる。多重整列などの最適な整列を、たとえば、www.ncbi.nlm.nih.govから利用可能でAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402により記載されているPSI-BLASTを用いて準備してもよい。
基準配列と最適に整列されたアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基は、整列において残基が対をなす基準配列中の位置に「対応する」。「位置」は、N末端に対するその位置に基づき、基準配列中の各アミノ酸を順番に識別する番号で示される。最適な整列を決定するときに考慮されなければならない欠失、挿入、短縮、融合などが原因で、一般に、N末端から単純に数えて決定される試験配列のアミノ酸残基数は、基準配列中の対応する位置の番号と必ずしも同じではない。たとえば、整列された試験配列に欠失がある場合、その欠失部位には基準配列中の位置に対応するアミノ酸はない。整列された基準配列への挿入がある場合、その挿入は基準配列のどのアミノ酸位置にも対応しない。短縮または融合の場合、基準配列または整列配列のいずれかに、対応する配列のどのアミノ酸にも対応しない一続きのアミノ酸が存在する可能性がある。
VI.抗体
本発明のRGNポリペプチドまたはRGNポリペプチドを含むリボ核タンパク質に対する抗体も包含される。このRGNポリペプチドは、配列番号1~109として示されるアミノ酸配列のいずれか1つまたはその活性多様体もしくは断片を有するもの、もしくは本発明のRGNアクセサリータンパク質、または配列番号178~192として示されるアミノ酸配列のいずれか1つまたはその活性多様体もしくは断片を有するものを含む。抗体を作製する方法は当技術分野で周知である(たとえば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.;および米国特許第4,196,265号を参照のこと)。これらの抗体をRGNポリペプチドまたはリボ核タンパク質の検出および単離のためのキットに用いてもよい。したがって、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドまたはリボ核タンパク質(たとえば配列番号1~109または178~192のいずれか1つの配列を有するポリペプチドなど)に特異的に結合する抗体を含むキットを提供する。
VII.目的の標的配列に結合させるためのシステムおよびリボ核タンパク質複合体ならびにその作製方法
本開示は、目的の標的配列に結合させるためのシステムを提供し、このシステムは、少なくとも1つのガイドRNAまたはそれをコードするヌクレオチド配列、および少なくとも1つのRNA誘導ヌクレアーゼまたはそれをコードするヌクレオチド配列を含む。ガイドRNAは目的の標的配列にハイブリダイズし、さらにRGNポリペプチドと複合体を形成して、RGNポリペプチドを標的配列に結合させる。これらの実施態様の一部では、RGNは、配列番号1~109のいずれか1つのアミノ酸配列、またはその活性多様体もしくは断片を含む。様々な実施態様において、ガイドRNAは、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のいずれか1つのヌクレオチド配列またはその活性多様体もしくは断片を含むCRISPR反復配列を含む。特定の実施態様では、ガイドRNAは、配列番号120~128、140、142、145、147、および148のいずれか1つのヌクレオチド配列、またはその活性多様体もしくは断片を含むtracrRNAを含む。システムのガイドRNAは、単一ガイドRNAであっても二重ガイドRNAであってもよい。特定の実施態様では、システムは、ガイドRNAと異種であるRNA誘導ヌクレアーゼを含み、RGNとガイドRNAは自然では互いに複合体化(すなわち、互いに結合)されていることは見出されない。
実施態様によっては、システムは、標的ポリヌクレオチドに結合かつ/あるいはそれを切断するために、少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質をさらに含む。これらの実施態様によっては、システムは、配列番号178~192として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含む。RGNがAPG06369(配列番号11)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、システムは、配列番号178~181として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含んでもよい。RGNがAPG03847(配列番号12)またはその多様体もしくは断片である実施態様の一部では、システムは、配列番号182~184として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含んでもよい。RGNがAPG05625(配列番号13)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、システムは、配列番号185~187として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含んでもよい。RGNがAPG03524(配列番号16)またはその多様体もしくは断片である一部の実施態様では、システムは、配列番号188~190として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含んでもよい。RGNがAPG03759(配列番号14)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、システムは、配列番号191として示されるRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含んでもよい。RGNがAPG05123(配列番号15)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、システムは、配列番号192として示されるRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片をさらに含んでもよい。
本明細書で提供される目的の標的配列に結合するためのシステムは、リボ核タンパク質複合体であってもよく、これは、少なくとも1種のタンパク質に結合したRNAの少なくとも1つの分子である。本明細書で提供されるリボ核タンパク質複合体は、RNA成分としての少なくとも1つのガイドRNAおよびタンパク質成分としてのRNA誘導ヌクレアーゼを含む。このようなリボ核タンパク質複合体は、RGNポリペプチドを自然発現する細胞または生物から精製されてもよく、目的の標的配列に特異的な特定のガイドRNAを発現するように設計されている。あるいは、リボ核タンパク質複合体は、RGNポリペプチドおよびガイドRNAをコードするポリヌクレオチドで形質転換され、RGNポリペプチドおよびガイドRNAの発現を可能にする条件で培養された細胞または生物から精製されてもよい。したがって、RGNポリペプチドまたはRGNリボ核タンパク質複合体を作製する方法が提供される。そのような方法は、RGNポリペプチド(および実施態様によってはガイドRNA)が発現される条件で、RGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(および実施態様によってはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列)を含む細胞を培養することを含む。次いで、RGNポリペプチドまたはRGNリボ核タンパク質を培養細胞の溶解物から精製してもよい。
生体試料の溶解物からRGNポリペプチドまたはRGNリボ核タンパク質複合体を精製する方法は当技術分野で知られている(たとえば、サイズ排除および/または親和性クロマトグラフィー、2D-PAGE、HPLC、逆相クロマトグラフィー、免疫沈降)。特定の方法では、RGNポリペプチドは組換えにより作製され、その精製を助ける精製用タグを含む。タグの例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン(TRX)、ポリ(NANP)、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、10xHis、ビオチンカルボキシル担体タンパク質(BCCP)、およびカルモジュリンが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、タグ付きRGNポリペプチドまたはRGNリボ核タンパク質複合体は、固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて精製される。当然だが、当技術分野で知られている他の類似の方法、たとえば他の形態のクロマトグラフィーまたはたとえば免疫沈降を単独であるいは組み合わせて使用できる。
「単離された」あるいは「精製された」、ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境に見られる場合にそのポリペプチドに通常は付随または相互作用する成分を実質的あるいは本質的に含まない。したがって、単離あるいは精製されたポリペプチドは、組換え技術によって生成される場合、他の細胞物質または培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。細胞物質を実質的に含まないタンパク質としては、混入タンパク質が約30%、20%、10%、5%、または1%(乾燥重量で)未満のタンパク質の調製物が包含される。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換えにより作製する場合、最適には、培地は化学的前駆体または目的のタンパク質以外の化学物質の約30%、20%、10%、5%、または1%(乾燥重量で)未満である。
目的の標的配列に結合かつ/あるいはそれを切断するために本明細書で提供される特定の方法は、インビトロで構築されたRGNリボ核タンパク質複合体の使用を含む。RGNリボ核タンパク質複合体のインビトロでの構築は、RGNポリペプチドのガイドRNAへの結合を可能にする条件でRGNポリペプチドをガイドRNAと接触させる、当技術分野で知られている任意の方法で実施できる。本明細書で使用される場合、「接触」、「接触させる」、「接触した」は、所望の反応を行うのに適した条件で所望の反応の成分を共に配置することを指す。RGNポリペプチドは、生体試料、細胞溶解物、または培地から精製されてもよいし、インビトロでの翻訳により生成されてもよいし、化学的に合成されてもよい。ガイドRNAは、生体試料、細胞溶解物、または培地から精製されてもよいし、インビトロで転写されてもよいし、化学的に合成されてもよい。RGNポリペプチドとガイドRNAを溶液(たとえば、緩衝生理食塩水)中で接触させてRGNリボ核タンパク質複合体をインビトロで構築してもよい。
VIII.標的配列の結合、切断、または改変の方法
本開示は、目的の標的ヌクレオチド配列を結合、切断、かつ/あるいは改変する方法を提供する。この方法は、少なくとも1つのガイドRNAまたはそれをコードするポリヌクレオチド、および少なくとも1種のRGNポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含むシステムを、標的配列または標的配列を含む細胞、細胞小器官、または胚に送達することを含む。これらの実施態様の一部では、RGNは、配列番号1~109のアミノ酸配列のいずれか1つ、またはその活性多様体もしくは断片を含む。様々な実施態様において、ガイドRNAは、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のヌクレオチド配列のいずれか1つを含むCRISPR反復配列またはその活性多様体もしくは断片を含む。特定の実施態様では、ガイドRNAは、配列番号120~128、140、142、145、147、および148のヌクレオチド配列のいずれか1つを含むtracrRNAまたはその活性多様体もしくは断片を含む。システムのガイドRNAは、単一ガイドRNAであっても二重ガイドRNAであってもよい。システムのRGNは、ヌクレアーゼ失活型RGNであってもよく、ニッカーゼ活性を有してもよく、融合ポリペプチドであってもよい。実施態様によっては、融合ポリペプチドは、塩基編集ポリペプチド、たとえばシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む。他の実施態様では、RGN融合タンパク質は逆転写酵素を含む。他の実施態様では、RGN融合タンパク質は、機能的核酸修復複合体の要素、たとえばヌクレオチド除去修復(NER)または転写結合ヌクレオチド除去修復(TC-NER)経路の要素を動員するポリペプチドを含み(Wei et al., 2015, PNAS USA 112(27):E3495-504 ; Troelstra et al., 1992, Cell 71:939-953; Marnef et al., 2017, J Mol Biol 429(9):1277-1288)、2020年1月27日出願の米国仮特許出願第62/966,203号に記載されているとおりである。同文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施態様によっては、RGN融合タンパク質は、TC-NER(ヌクレオチド除去修復)経路の要素であり他の要素の動員において機能するCSBを含む(van den Boom et al., 2004, J Cell Biol 166(1):27-36; van Gool et al., 1997, EMBO J 16(19):5955-65; その一例は配列番号138として示されている)。さらなる実施態様では、RGN融合タンパク質は、CSBの活性ドメイン、たとえば配列番号138のアミノ酸残基356~394を含むCSBの酸性ドメインを含む(Teng et al., 2018, Nat Commun 9(1):4115)。
特定の実施態様では、RGNおよび/またはガイドRNAは、RGNおよび/またはガイドRNA(またはRGNおよびガイドRNAの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド)が導入される細胞、細胞小器官、または胚に対して異種である。
実施態様によっては、この方法は、RGNが標的ポリヌクレオチドに結合し、かつ/あるいはこれを切断するために、少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに必要とする。これらの実施態様の一部では、この方法はさらに、配列番号178~192として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することを必要とする。RGNがAPG06369(配列番号11)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、この方法は、配列番号178~181として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに含む。RGNがAPG03847(配列番号12)またはその多様体もしくは断片である実施態様の一部では、この方法は、配列番号315~317として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに含む。RGNがAPG05625(配列番号13)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、この方法は、配列番号185~187として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに含む。RGNがAPG03524(配列番号16)またはその多様体もしくは断片である実施態様の一部では、この方法は、配列番号188~190として示される少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片を、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに含む。RGNがAPG03759(配列番号14)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、この方法は、配列番号191として示されるRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに含む。RGNがAPG05123(配列番号15)またはその多様体もしくは断片である特定の実施態様では、この方法は、配列番号192として示されるRGNアクセサリータンパク質またはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドを送達することをさらに含む。
方法がガイドRNAおよび/またはRGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達することを含む実施態様では、細胞または胚をその後、ガイドRNAおよび/またはRGNポリペプチドが発現される条件下で培養してもよい。様々な実施態様において、この方法は、標的配列をRGNリボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。RGNリボ核タンパク質複合体は、ヌクレアーゼ失活型またはニッカーゼ活性を有するRGNを含んでもよい。実施態様によっては、リボ核タンパク質複合体のRGNは、塩基編集ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。特定の実施態様では、この方法は、標的配列を含む細胞、細胞小器官、または胚にRGNリボ核タンパク質複合体を導入することを含む。RGNリボ核タンパク質複合体は、本明細書に記載のように、生体試料から精製されたもの、組換えで生成された後に精製されたもの、またはインビトロで構築されたものであってもよい。標的配列または細胞小器官、または胚と接触させるRGNリボ核タンパク質複合体をインビトロで構築する実施態様では、この方法は、標的配列、細胞、細胞小器官、または胚との接触の前にインビトロでの複合体の構築をさらに含んでもよい。
精製された、あるいはインビトロで構築されたRGNリボ核タンパク質複合体を当技術分野で知られている任意の方法(電気穿孔が挙げられるがこれに限定されない)で細胞、細胞小器官、または胚に導入できる。あるいは、RGNポリペプチドおよび/またはガイドRNAをコードするか含むポリヌクレオチドを当技術分野で知られている任意の方法(たとえば電気穿孔)で細胞、細胞小器官、または胚に導入できる。
標的配列または標的配列を含む細胞、細胞小器官、もしくは胚に送達されるか接触すると、ガイドRNAは、配列特異的にRGNを標的配列に結合させる。RGNがヌクレアーゼ活性を有する実施態様では、RGNポリペプチドは結合時に目的の標的配列を切断する。次いで、標的配列を内因性の修復機構、たとえば非相同末端結合、または提供されたドナーポリヌクレオチドによる相同組換え修復を介して改変できる。
標的配列へのRGNポリペプチドの結合を測定する方法は当技術分野で知られており、クロマチン免疫沈降検定、ゲル移動度シフト検定、DNAプルダウン検定、レポーター検定、マイクロプレート捕捉・検出検定が挙げられる。同様に、標的配列の切断または改変を測定する方法は当技術分野で知られており、分解産物を検出しやすくするための適切な標識(たとえば、放射性同位体、蛍光物質)が標的配列に付けられているかにかかわらず、PCR、配列決定、またはゲル電気泳動を用いて切断を確認するインビトロまたは生体内での切断検定が挙げられる。あるいは、ニッキング誘発指数増幅反応(NTEXPAR)検定を用いてもよい(たとえば、Zhang et al. (2016) Chem. Sci. 7:4951-4957を参照のこと)。 生体内での切断をSurveyor検定を用いて評価してもよい(Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol 649:247-256)。
実施態様によっては、この方法は、2つ以上のガイドRNAと複合された単一型のRGNの使用を含む。2つ以上のガイドRNAは、単一の遺伝子の異なる領域を標的としてもよいし、複数の遺伝子を標的としてもよい。
ドナーポリヌクレオチドが提供されない実施態様では、RGNポリペプチドにより導入された二本鎖切断を非相同末端結合(NHEJ)修復過程により修復することができる。NHEJはエラーが発生しやすい性質があるため、二本鎖切断の修復が標的配列の改変につながる可能性がある。本明細書で使用される場合、核酸分子に関する「改変」は、核酸分子のヌクレオチド配列の変化を指し、これは1個以上のヌクレオチドの欠失、挿入、もしくは置換、またはそれらの組合せであり得る。標的配列の改変は、変化したタンパク質産物の発現またはコード配列の不活性化につながる可能性がある。
ドナーポリヌクレオチドが存在する実施態様では、導入された二本鎖切断の修復の過程でドナーポリヌクレオチド中のドナー配列を標的ヌクレオチド配列に組み込むか組み換えてもよく、これにより外因性ドナー配列が導入される。したがって、ドナーポリヌクレオチドは、目的の標的配列に導入されることが望まれるドナー配列を含む。実施態様によっては、ドナー配列は、新たに組み込まれたドナー配列がRGNによって認識され切断されないように、元の標的ヌクレオチド配列を変更する。標的ヌクレオチド配列に隣接する配列と実質的な配列同一性を有し、相同組換え修復過程を可能にする隣接配列(本明細書では「相同性アーム」と呼ぶ)をドナーポリヌクレオチドに含むことにより、ドナー配列の組み込みを強化してもよい。実施態様によっては、相同性アームは、少なくとも50塩基対、少なくとも100塩基対、かつ最大2000塩基対以上の長さを有し、標的ヌクレオチド配列内のそれらに対応する配列と少なくとも90%、少なくとも95%、またはそれ以上の配列相同性を有する。
RGNポリペプチドがねじれ型の二本鎖切断を導入する実施態様では、ドナーポリヌクレオチドは、適合性の突出に隣接するドナー配列を含み、二本鎖切断の修復中に非相同修復過程により、突出を含む切断された標的ヌクレオチド配列にドナー配列を直接連結するのを可能にしてもよい。
この方法がニッカーゼである(すなわち、二本鎖ポリヌクレオチドの一本の鎖のみを切断することができる)RGNの使用を含む実施態様では、この方法は、同一または重複する標的配列を標的とし、ポリヌクレオチドの異なる鎖を切断する2種のRGNニッカーゼを導入することを含んでもよい。たとえば、二本鎖ポリヌクレオチドのプラス(+)鎖のみを切断するRGNニッカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドのマイナス(-)鎖のみを切断する第2のRGNニッカーゼと共に導入してもよい。
様々な実施態様において、標的ヌクレオチド配列を結合し、標的配列を検出する方法が提供される。この方法は、細胞、細胞小器官、または胚に、少なくとも1つのガイドRNAまたはそれをコードするポリヌクレオチド、および少なくとも1種のRGNポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを導入すること、ならびにガイドRNAおよび/またはRGNポリペプチドを発現させること(コード配列を導入する場合)を含み、RGNポリペプチドはヌクレアーゼ失活型RGNであり、検出可能な標識をさらに含み、方法は検出可能な標識を検出することをさらに含む。検出可能な標識は、融合タンパク質(たとえば、蛍光タンパク質)としてRGNに融合されてもよいし、視覚的にあるいは他の手段で検出され得るRGNポリペプチドに結合されているか組み込まれた小分子であってもよい。
本明細書では、標的配列または標的配列の制御下にある目的の遺伝子の発現を調節する方法も提供する。この方法は、細胞、細胞小器官、または胚に、少なくとも1つのガイドRNAまたはそれをコードするポリヌクレオチド、および少なくとも1種のRGNポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを導入すること、ならびにガイドRNAおよび/またはRGNポリペプチドを発現させること(コード配列を導入する場合)を含み、RGNポリペプチドはヌクレアーゼ失活型RGNである。これらの実施態様の一部では、ヌクレアーゼ失活型RGNは、本明細書に記載の発現調節ドメイン(すなわち、後成学的修飾ドメイン、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメイン)を含む融合タンパク質である。
本開示は、目的の標的ヌクレオチド配列を結合かつ/あるいは改変する方法も提供する。この方法は、少なくとも1つのガイドRNAまたはそれをコードするポリヌクレオチド、本発明のRGNおよび塩基編集ポリペプチド(たとえば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ)を含む少なくとも1種の融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むシステムを標的配列または標的配列を含む細胞、細胞小器官、または胚に送達することを含む。
当業者は、本開示の方法のいずれかを用いて、単一の標的配列または複数の標的配列を標的化できることを理解している。したがって、この方法は、単一の遺伝子および/または複数の遺伝子内の複数の別個の配列を標的化できる複数の別個のガイドRNAと組み合わせて単一のRGNポリペプチドを使用することを含む。複数の別個のガイドRNAを複数の別個のRGNポリペプチドと組み合わせて導入する方法も本明細書に包含される。これらのガイドRNAおよびガイドRNA/RGNポリペプチドシステムは、単一の遺伝子および/または複数の遺伝子内の複数の別個の配列を標的化できる。
一側面では、本発明は、上記の方法および組成物の開示された要素のいずれか1つ以上を含むキットを提供する。実施態様によっては、キットは、ベクターシステムおよびキットを使用するための説明書を含む。実施態様によっては、ベクターシステムは、(a) crRNA配列をコードするDNA配列に作動可能に連結された第1の制御配列、およびコードされたcrRNA配列の上流にガイド配列を挿入するための1つ以上の挿入部位であって、発現時にガイド配列は、(a)ガイドRNAポリヌクレオチド配列と複合されたCRISPR酵素を含むCRISPR複合体を真核細胞内の標的配列に配列特異的に結合させる、第1の制御配列、ならびに/または(b)核局在化配列を含む前記CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第2の制御配列を含む。
実施態様によっては、キットは、ガイド配列と制御配列を作動可能に連結するようにベクターに挿入されるガイド配列に対応する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。実施態様によっては、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一側面では、本発明は、CRISPRシステムの1つ以上の要素を使用する方法を提供する。本発明のCRISPR複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための効果的な手段を提供する。本発明のCRISPR複合体は、多数の細胞型における標的ポリヌクレオチドの改変(たとえば、欠失、挿入、移動、不活性化、活性化、塩基編集)を含む多様な用途を有する。したがって、本発明のCRISPR複合体は、たとえば遺伝子治療、薬物選別、疾患診断、および予後において幅広い用途を有する。例示的なCRISPR複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合されたCRISPR酵素を含む。
IX.標的ポリヌクレオチド
一側面では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これは、生体内でも、生体外でも、インビトロであってもよい。実施態様によっては、この方法は、ヒトもしくは非ヒト動物または植物(微細藻類を含む)から細胞または細胞集団を採取すること、および細胞を改変することを含む。培養は生体外の任意の段階で起こってもよい。細胞を非ヒト動物または植物(微細藻類を含む)にさらに再導入してもよい。
自然の変動性を利用し、植物育種家は、望ましい品質、たとえば、収量、品質、均一性、耐久性、有害生物への抵抗性に最も有用な遺伝子を組み合わせる。これらの望ましい品質は、成長、日長の選好性、温度要件、花成または生殖器官形成の開始日、脂肪酸含有量、昆虫抵抗性、病害抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、除草剤抵抗性、干ばつ、暑さ、湿気、寒さ、風、不利な土壌条件(高塩分など)などの様々な環境要因に対する耐性も含まれる。これらの有用な遺伝子の供給源としては、天然または外来の品種、伝播品種、野生植物の近縁種、および誘発変異、たとえば植物材料を変異誘発剤で処理することが挙げられる。本発明を用いれば、植物育種家は変異誘発のための新たな手段を得る。したがって、当業者は、本発明を用いて、有用な遺伝子の供給源についてゲノムを分析し、また、所望の特性または形質を有する品種において、過去の変異誘発剤よりも正確に有用な遺伝子の増加を誘導し、それによって植物育種計画を促進かつ改善できる。
RGNシステムの標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。たとえば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物(たとえばタンパク質)をコードする配列または非コード配列(たとえば、制御ポリヌクレオチドまたはジャンクDNA)であってもよい。実施態様によっては、標的配列はCRISPR複合体によって認識される短い配列であるPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)と結合している。PAMの正確な配列および長さの要件は、用いられるCRISPR酵素によって異なる(実施態様によっては、RGNはPAM配列を必要としない)が、PAMは一般に、プロトスペーサー(すなわち標的配列)に隣接する2~5塩基対の配列である。
CRISPR複合体の標的ポリヌクレオチドは、多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチド、ならびにシグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子およびポリヌクレオチドを含んてもよい。標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナル伝達生化学経路に関連する配列、たとえば、シグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、罹患組織に由来の細胞内で、非罹患対照の組織または細胞と比較して異常なレベルまたは異常な形態で転写または翻訳産物を産生する任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。それは異常に高レベルで発現されるようになる遺伝子であってもよいし、異常に低レベルで発現されるようになる遺伝子であってもよく、発現の変化は疾患の発生および/または進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に関与する遺伝子(たとえば原因変異)に直接関与するか、または連鎖不平衡にある変異または遺伝的多様性を有する遺伝子を指す。転写産物または翻訳産物は、既知であっても未知であってもよく、さらには正常レベルであっても異常レベルであってもよい。疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ジョンズ・ホプキンス大学(メリーランド州ボルチモア)のMcKusick-Nathans遺伝医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine)、および米国国立医学図書館(メリーランド州ベセスダ)の国立生物工学情報センターからワールドワイドウェブで入手できる。
CRISPRシステムは、目的のゲノム配列を比較的容易に標的化できるため特に有用であるが、原因変異に対処するためにRGNが何をできるかという問題が残っている。1つの手段は、RGN(好ましくはRGNの不活性またはニッカーゼ多様体)と、塩基編集酵素または塩基編集酵素の活性ドメイン、たとえば塩基編集シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼと融合タンパク質を生成することである(米国特許第9,840,699号(参照により本明細書に組み込まれる))。実施態様によっては、方法は、DNA分子を(a)本発明のRGNおよびデアミナーゼなどの塩基編集ポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびに(b) (a)の融合タンパク質をDNA鎖の標的ヌクレオチド配列に標的化するgRNAと接触させることを含む。ここで、核酸塩基の脱アミノ化に適した条件で、有効な量でDNA分子を融合タンパク質およびgRNAと接触させる。実施態様によっては、標的DNA配列は疾患または障害に関連する配列を含み、核酸塩基の脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が得られる。実施態様によっては、標的DNA配列は作物植物の対立遺伝子に存在し、目的の形質の特定の対立遺伝子は、より低い農学的価値の植物につながる。核酸塩基の脱アミノ化により、形質を改善し、植物の農業的価値を高める対立遺伝子が得られる。
実施態様によっては、DNA配列は、疾患または障害に関連するT→CまたはA→G点変異を含み、変異CまたはG塩基の脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が得られる。実施態様によっては、脱アミノ化は疾患または障害に関連する配列における点変異を補正する。
実施態様によっては、疾患または障害に関連する配列はタンパク質をコードし、脱アミノ化により、疾患または障害に関連する配列に終止コドンが導入され、コードされたタンパク質が短縮される。実施態様によっては、接触は、疾患または障害を有しやすい、有する、あるいは疾患または障害を診断された対象の生体内で行われる。実施態様によっては、疾患または障害は、ゲノムにおける点変異または一塩基変異に関連する疾患である。実施態様によっては、疾患は、遺伝性疾患、がん、代謝性疾患、またはリソソーム蓄積症である。
X.医薬組成物および治療方法
本開示のRGNポリペプチドならびにその活性多様体および断片、さらにはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のgRNAまたはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のシステム、あるいはRGNポリペプチドまたはRGNをコードするポリヌクレオチド、gRNAまたはgRNAをコードするポリヌクレオチド、またはRGNシステムのいずれかを含む細胞、ならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、有効成分(すなわち、RGNポリペプチド、RGNをコードするポリヌクレオチド、gRNA、gRNAをコードするポリヌクレオチド、RGNシステム、またはこれらのいずれか1つを含む細胞)および医薬的に許容される担体を含む、標的の状態または疾患を予防、強度低下、治癒、あるいは他の形で治療するのに使用される組成物である。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」は、生物に重大な刺激を引き起こさず、有効成分(すなわち、RGNポリペプチド、RGNをコードするポリヌクレオチド、gRNA、gRNAをコードするポリヌクレオチド、RGNシステム、またはこれらのいずれか1つを含む細胞)の活性および性質を損なわない物質を指す。担体は、治療対象への投与に適したものにするために、十分に高純度かつ十分に低毒性でなければならない。担体は不活性であってもよく、医薬的な利点を有してもよい。実施態様によっては、医薬的に許容される担体は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適した1種以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤、または被包物質を含む。実施態様によっては、医薬的に許容される担体は天然に存在しない。実施態様によっては、医薬的に許容される担体および有効成分は、自然では一緒に見られない。
本開示の方法で使用される医薬組成物を、適切な担体、賦形剤、さらには適切な移動、送達、耐性などを提供する他の薬剤と共に製剤してもよい。多数の適切な製剤が当業者に知られている。たとえば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)を参照のこと)。適切な製剤としては、たとえば、散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、担体(リポフェクチン担体など)を含む脂質(カチオン性またはアニオン性)、脂質ナノ粒子、DNA複合体、無水吸収ペースト、水中油型または油中水型の乳剤、乳剤カーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。経口または非経口使用のための医薬組成物を有効成分の用量に適合しやすい単位用量剤形に調製できる。そのような単位用量剤形としては、たとえば、錠剤、ピル、カプセル、注射(アンプル)、坐剤などが挙げられる。
本開示のRGN、gRNA、RGNシステムまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含むか、それにより改変された細胞を対象に投与する一部の実施態様では、細胞を医薬的に許容される担体を有する懸濁液として投与する。当業者であれば認識していることだが、細胞組成物に使用される医薬的に許容される担体は、対象へ送達される細胞の生存能力を実質的に妨害する量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、防腐剤、または他の薬剤を含まない。細胞を含む製剤は、たとえば、細胞膜の完全性を維持することを可能にする浸透圧緩衝液、および必要に応じて、投与時に細胞生存率を維持するか生着を強化するための栄養素を含んでもよい。そのような製剤および懸濁液は当業者に知られており、かつ/あるいは一般的な実験を用いて本明細書に記載の細胞での使用に適合可能である。
乳化手順が細胞の生存率に悪影響を及ぼさないという条件で、細胞組成物を乳化するかリポソーム組成物として提示してもよい。細胞および他の任意の有効成分を、本明細書に記載の治療方法に使用するのに適した量で、医薬的に許容されかつ有効成分と適合性のある賦形剤と混合してもよい。
細胞組成物に含まれるさらなる薬剤は、その中の成分の医薬的に許容される塩を含んでもよい。医薬的に許容される塩としては、塩酸もしくはリン酸などの有機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの無機酸で形成される(ポリペプチドの遊離アミノ酸で形成される)酸付加塩が挙げられる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩を無機塩基、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄、および有機塩基、たとえばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導してもよい。
生理学的に許容されかつ医薬的に許容される担体は、当技術分野でよく知られている。模範的な液体担体は、活性成分および水の他に材料を含まないか、緩衝剤、たとえば生理的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水、またはその両方(リン酸緩衝生理食塩水など)を含む、滅菌水溶液である。さらに、水性担体は1種以上の緩衝塩、さらには塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質を含んでもよい。液体組成物はさらに、水に加えて、および水を排除して、液相を含んでもよい。そのようなさらなる液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油乳剤である。特定の障害または状態の治療に有効な細胞組成物に使用される活性化合物の量は、その障害または状態の性質に依存してもよく、標準的な臨床技術で決定できる。
特定の投与形態および剤形に応じて、本開示のRGNポリペプチド、ガイドRNA、RGNシステム、またはそれをコードするポリヌクレオチドを医薬的に許容される賦形剤、たとえば担体、溶媒、安定剤、補助剤、希釈剤と共に製剤してもよい。実施態様によっては、製剤および投与経路に応じて、生理的に適合するpHであってpH約3~pH約11、pH約3~pH約7の範囲のpHを達成するようにこれらの医薬組成物を製剤する。実施態様によっては、pHをpH約5.0~pH約8の範囲に調整してもよい。実施態様によっては、組成物は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも1種の化合物を1種以上の医薬的に許容される賦形剤と共に含んでもよい。実施態様によっては、組成物は、本明細書に記載の化合物の組合せを含むか、細菌増殖の治療または予防に有用な第2の有効成分(限定しないが、たとえば抗菌剤(anti-bacterial or anti-microbial agents))を含むか、本開示の試薬の組合せを含む。
適切な賦形剤としては、たとえば、大型でゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子、たとえばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子が挙げられる。他の模範的な賦形剤としては、抗酸化剤(限定しないが、たとえばアスコルビン酸)、キレート剤(限定しないが、たとえばEDTA)、炭水化物(限定しないが、たとえばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロースに限定されない)、ステアリン酸、液体(限定しないが、たとえば油、水、生理食塩水、グリセリン、およびエタノール)、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などを挙げることができる。
実施態様によっては、製剤を単位用量または複数用量の容器、たとえば、密封されたアンプルおよびバイアルで提供してもよく、使用直前に滅菌液体担体、たとえば生理食塩水、注射用水、半液状の泡、またはゲルの添加を必要とする凍結乾燥状態で保存してもよい。前述の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から即時注射溶液および懸濁液を調製してもよい。実施態様によっては、有効成分を緩衝溶液に溶解して単位用量または複数用量の容器で凍結し、後で注射のために解凍するか、使用まで冷蔵下で保持/安定化してもよい。
治療薬は、制御放出システムに含まれてもよい。多くの場合、薬物の効果を延長するために、皮下、髄腔内、または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせるのが望ましい。水溶性の低い結晶性または非結晶性材料の懸濁液を用いてこれを達成してもよい。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は、結晶の大きさと結晶形に依存する可能性がある。あるいは、非経口投与された剤形の遅延吸収は、薬物を油性溶媒に溶解または懸濁することにより達成される。実施態様によっては、長期徐放性留置剤の使用が慢性状態の治療に特に適している可能性がある。長期徐放性留置剤は当業者によく知られている。
疾患の治療を必要とする対象において疾患を治療する方法を本明細書で提供する。この方法は、有効量の本開示のRGNポリペプチドまたはその活性多様体もしくは断片、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のgRNAまたはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のRGNシステム、またはこれらの組成物のいずれかにより改変されたかそれらを含む細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
実施態様によっては、治療は、本開示のRGNポリペプチド、gRNA、もしくはRGNシステム、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを投与することによる生体内遺伝子編集を含む。実施態様によっては、治療は、細胞を本開示のRGNポリペプチド、gRNA、もしくはRGNシステム、またはそれをコードするポリヌクレオチドで、生体外で遺伝子改変した後に改変細胞を対象に投与する、生体外遺伝子編集を含む。実施態様によっては、遺伝子改変細胞は、後に改変細胞が投与される対象に由来し、この移植細胞を本明細書では自己由来という。実施態様によっては、遺伝子改変細胞は、改変細胞を投与される対象(すなわちレシピエント)と同じ種の別の対象(すなわち、ドナー)に由来し、この移植細胞を本明細書では同種由来という。本明細書に記載の例によっては、細胞を、それを必要とする対象に投与する前に培養して増殖させてもよい。
実施態様によっては、本開示の組成物で治療される疾患は、免疫療法、たとえばキメラ抗原受容体(CAR)T細胞で治療できる疾患である。このような疾患としてはがんが挙げられるが、これに限定されない。
実施態様によっては、本開示の組成物で治療される疾患は、その疾患もしくは障害の治療またはその疾患もしくは障害に関連する症状の軽減のために変異された配列(すなわち、その配列が疾患または障害の原因であるか、疾患または障害に関連する症状の原因である)に関連する。実施態様によっては、本開示の組成物で治療される疾患は原因変異に関連する。本明細書で使用される場合、「原因変異(causal mutation)」は、対象における疾患または障害の重症度または存在に関与するゲノム中の特定のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を指す。原因変異の補正により、疾患または障害によって起こる少なくとも1つの症状が改善する。実施態様によっては、原因変異は、本明細書に開示のRGNにより認識されるPAM部位に隣接している。本開示のRGN、または本開示のRGNおよび塩基編集ポリペプチド(すなわち、塩基編集物質)を含む融合ポリペプチドで原因変異を補正することができる。原因変異に関連する疾患の非限定的な例としては、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、および鎌状赤血球症が挙げられる。疾患関連遺伝子および変異のさらなる非限定的な例は、ジョンズ・ホプキンス大学(メリーランド州ボルチモア)のMcKusick-Nathans遺伝医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine)および米国国立医学図書館(メリーランド州ベセスダ)の国立生物光学情報センターからワールドワイドウェブで入手できる。
実施態様によっては、本明細書で提供される方法を用いて、疾患または障害に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子または対立遺伝子に不活性化点変異を導入する。たとえば、実施態様によっては、本開示の組成物を用いてがん遺伝子に不活性化点変異を導入する(たとえば、増殖性疾患の治療において)方法を本明細書で提供する。不活性化変異は、実施態様によっては、コード配列に未成熟終止コドンを生成してもよく、これにより切断型遺伝子産物、たとえば、全長タンパク質の機能を欠く切断型タンパク質が発現する。実施態様によっては、本明細書で提供される方法の目的は、ゲノム編集を介して機能不全の遺伝子の機能を回復することである。本開示のRGNポリペプチドおよびそれを含むシステムの遺伝子編集によるインビトロでのヒト治療について、たとえばヒト細胞培養における疾患関連変異の補正により検証することができる。
本明細書で使用される場合、「治療」もしくは「治療する」、または「緩和する」もしくは「寛解させる」は交換可能に使用される。これらの用語は、有益または所望の結果(治療上の利益および/または予防上の利益が挙げられるが、これらに限定されない)を得るための手段を指す。治療上の利益は、治療中の1つ以上の疾患、状態、または症状における、治療に意味のある改善または効果を意味する。予防上の利益のために、組成物を特定の疾患、状態、もしくは症状を発症するリスクのある対象、または疾患、状態、もしくは症状がまだ現れていないかもしれなくても、疾患の生理的症状の1つ以上を報告している対象に投与してもよい。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与方法などのうちの1つ以上に応じて変化してもよく、当業者によって容易に決定できる。具体的な用量は、選択された特定の薬剤、従うべき投薬計画、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれを運ぶ送達システムのうちの1つ以上に応じて変化してもよい。
「投与する」という用語は、所望の部位、たとえば損傷または修復部位に導入された活性成分を少なくとも部分的に局在化させる方法または経路による対象への活性成分の配置を指し、所望の効果を生じる。細胞が投与される実施態様では、移植細胞または細胞の成分の少なくとも一部が生存し続ける、対象体内の所望の位置への送達を導く任意の適切な経路で細胞を投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、最短で数時間、たとえば、24時間から数日、最長で数年または患者の寿命(すなわち長期生着)であり得る。たとえば、本明細書に記載の側面によっては、有効量の光受容体細胞または網膜前駆細胞を全身投与経路、たとえば腹腔内または静脈内経路を介して投与する。
実施態様によっては、投与はウイルス送達による投与を含む。実施態様によっては、投与は電気穿孔による投与を含む。実施態様によっては、投与はナノ粒子送達による投与を含む。実施態様によっては、投与はリポソーム送達による投与を含む。任意の有効な投与経路を用いて本明細書に記載の有効量の医薬組成物を投与することができる。実施態様によっては、投与は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、直腸投与、エアロゾル投与、非経口投与、眼投与、肺投与、経皮投与、膣投与、耳投与、経鼻投与、および局所投与、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される方法による投与を含む。実施態様によっては、細胞の送達のために、注射または輸液による投与を用いる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、診断、処置、または治療が望まれる任意の個体を指す。実施態様によっては、対象は動物である。実施態様によっては、対象は哺乳動物である。実施態様によっては、対象はヒトである。
治療の有効性は、熟練した臨床医により判断できる。ただし、疾患または障害の徴候または症状のいずれかまたはすべてが有益な形で変更された場合(たとえば、少なくとも10%減少した場合)、あるいはその他の臨床的に認められた症状またはマーカーが改善または緩和した場合、治療を「有効な治療」と見なす。有効性は、入院または医学的介入の必要性により評価された場合、個体が悪化しない(たとえば、病気の進行が停止するか、少なくとも遅くなる)ことによっても測定できる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られている。治療としては以下が挙げられる:(1)疾患の阻害、たとえば、症状の進行を阻止する、あるいは遅らせる;(2)疾患の緩和、たとえば症状の退行を引き起こす;(3)症状の発症の可能性の予防または軽減。
A.塩基編集による原因変異の改変
実施態様によっては、本発明のRGNは、塩基編集を用いて原因変異を改変するのに用いられる。本発明のRGNベースの編集融合タンパク質を利用する手法で補正できる遺伝性疾患の例は、ハーラー症候群である。MPS-1としても知られるハーラー症候群は、α-L-イズロニダーゼ(IDUA)の欠損の結果であり、分子レベルではリソソームにデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の蓄積を特徴とするリソソーム蓄積症を引き起こす。この病気は一般に、α-L-イズロニダーゼをコードするIDUA遺伝子の変異により引き起こされる遺伝性の遺伝疾患である。一般的なIDUA変異はW402XおよびQ70Xであり、どちらもナンセンス変異であり、翻訳の早期終了を引き起こす。正確なゲノム編集(PGE)手法でこのような変異に適切に対処する。これは、たとえば塩基編集手法による単一ヌクレオチドの復帰により野生型コード配列が復元され、遺伝子座の内因性制御機構により制御されるタンパク質発現が起こるからである。さらに、ヘテロ接合体は無症候性であることが知られているため、これらの変異の1つを標的とするPGE療法がこの疾患の患者の大部分に有用である。というのも、変異した対立遺伝子の1つのみを補正する必要があるからである(Bunge et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3(6): 861-866、参照により本明細書に組み込まれる)。
ハーラー症候群の現在の治療法としては、酵素補充療法および骨髄移植が挙げられる(Vellodi et al. (1997) Arch. Dis. Child. 76(2): 92-99; Peters et al. (1998) Blood 91(7): 2601-2608、参照により本明細書に組み込まれる)。酵素補充療法はハーラー症候群患者の生存率および生活の質に劇的な影響を及ぼしたが、この手法は高価で時間のかかる毎週の注入を必要とする。さらなる手法としては、発現ベクターでのIDUA遺伝子の送達、または高発現する遺伝子座、たとえば血清アルブミンの遺伝子座への遺伝子の挿入が挙げられる(米国特許第9,956,247号、参照により本明細書に組み込まれる)。ただし、これらの手法では、元のIDUA遺伝子座が正しいコード配列に復元されない。ゲノム編集戦略には多くの利点があり、最も顕著なのは、遺伝子発現の制御が健常な固体に存在する自然の機構で制御されることである。さらに、塩基編集の使用は、腫瘍抑制機構の破壊による大規模な染色体再構成、細胞死、または腫瘍形成につながる可能性がある二本鎖DNA切断を引き起こす必要はない。一般的な戦略は、本発明のRGNベースの編集融合タンパク質を用いて、ヒトゲノムにおける特定の疾患原因変異を標的かつ補正することを対象とし得る。塩基編集により補正できる標的疾患に対する同様の手法を追求してもよいことが認識される。他の種、特に一般的な家庭用ペットまたは家畜における疾患原因変異を標的とする同様の手法も本発明のRGNを用いて展開できることもさらに認識される。一般的な家庭用ペットおよび家畜としては、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ヘビ、フェレット、および魚介類、たとえばサケやエビが挙げられる。
B.標的欠失による原因変異の改変
本発明のRGNは、原因変異がより複雑であるヒトの治療手法にも役立つ可能性がある。たとえば、フリードライヒ運動失調症やハンチントン病などの一部の疾患は、遺伝子の特定の領域で3ヌクレオチドモチーフの反復が著しく増加した結果であり、発現したタンパク質の機能または発現能力に影響する。フリードライヒ運動失調症(FRDA)は常染色体劣性遺伝疾患であり、脊髄の神経組織の進行性変性を引き起こす。ミトコンドリア内のフラタキシン(FXN)タンパク質のレベルが低下すると、細胞レベルで酸化的損傷および鉄欠乏が引き起こされる。FXN発現の低下は、体細胞および生殖細胞系FXN遺伝子のイントロン1内のGAA三塩基伸長に関連する。FRDA患者では、GAA反復は70を超える、場合によっては1000を超える(最も一般的には600~900)三塩基で構成されることが多いのに対し、罹患していない個体では約40反復以下である(Pandolfo et al. (2012) Handbook of Clinical Neurology 103: 275-294; Campuzano et al. (1996) Science 271: 1423-1427; Pandolfo (2002) Adv. Exp. Med. Biol. 516: 99-118;すべて参照により本明細書に組み込まれる)。
フリードライヒ運動失調症(FRDA)を引き起こす三塩基反復配列の拡大は、FRDA不安定領域と呼ばれるFXN遺伝子内の定義された遺伝子座で発生する。RNAガイドヌクレアーゼ(RGN)を用いて、FRDA患者の細胞の不安定領域を切除できる。この手法は、1)ヒトゲノムの対立遺伝子を標的とするようにプログラムできるRGNおよびガイドRNA配列、ならびに2)RGNおよびガイド配列の送達手法を必要とする。ゲノム編集に用いられる多くのヌクレアーゼ、たとえば一般に用いられる化膿連鎖球菌(S. pyogenes)由来のCas9ヌクレアーゼ(SpCas9)は、特に機能的発現カセットに必要な他の遺伝子要素の他にSpCas9遺伝子およびガイドの長さを考慮すると、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに詰め込むには大きすぎる。これにより、SpCas9を用いる手法がより困難になる。
本発明の特定のRNA誘導ヌクレアーゼは、ガイドRNAと共にAAVベクターに詰め込むのに非常に適している。2つのガイドRNAを詰め込むには、第2のベクターが必要になる可能性があるが、この手法は、2つのベクター間でタンパク質配列を分割する必要があるより大きなヌクレアーゼ、たとえばSpCas9に必要なものと同等である。本発明は、ゲノム不安定性の領域が除去される、本発明のRGNを用いる戦略を包含する。このような戦略は、ハンチントン病など、同様の遺伝的根拠を持つ他の疾患や障害にも適用できる。本発明のRGNを使用する同様の戦略を、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ヘビ、フェレット、および魚介類、たとえばサケやエビを含む、農業的または経済的に重要な非ヒト動物における同様の疾患および障害に適用してもよい。
C.標的変異誘発による原因変異の改変
本発明のRGNはまた、有益な効果につながる可能性のある破壊的変異を導入するためのものであってもよい。ヘモグロビン、特にベータグロビン鎖をコードする遺伝子(HBB遺伝子)の遺伝的欠陥は、ヘモグロビン症として知られる多くの疾患、たとえば鎌状赤血球貧血および地中海貧血症の原因となり得る。
成人では、ヘモグロビンは2つのアルファ(α)様グロビン鎖と2つのベータ(β)様グロビン鎖、および4つのヘム基を含むヘテロ四量体である。成人では、α2β2四量体はヘモグロビンA(HbA)または成人ヘモグロビンと呼ばれる。通常、アルファグロビン鎖とベータグロビン鎖は約1:1の比で合成され、この比はヘモグロビンおよび赤血球(RBC)の安定化の観点から重要だと思われる。発育中の胎児では、ヘモグロビンAよりも酸素に対して高い結合親和性を有する異なる形態のヘモグロビンである胎児ヘモグロビン(HbF)が生成され、母親の血流を介して胎児の系に酸素を供給できる。胎児ヘモグロビンも2つのαグロビン鎖を含むが、成人のβ-グロビン鎖の代わりに2つの胎児ガンマ(γ)-グロビン鎖を有する(すなわち、胎児ヘモグロビンはα2γ2である)。ガンマグロビンの生成からベータグロビンへの切り替えの制御は非常に複雑であり、主にガンマグロビン転写の減少と同時にベータグロビン転写の増加を必要とする。妊娠約30週間で、胎児のガンマグロビンの合成が低下し始め、ベータグロビンの生成が増加する。生後約10か月までに、新生児のヘモグロビンはほぼすべてα2β2になるが、一部のHbF(総ヘモグロビンの約1~3%)は成人期まで持続する。異常ヘモグロビン症の患者のほとんどでは、ガンマグロビンをコードする遺伝子が依然として存在するが、上記のように出産の前後で発生する正常な遺伝子抑制により、発現は相対的に低い。
鎌状赤血球症は、βグロビン遺伝子(HBB)のV6E変異(DNAレベルでのGAG→GTG)により引き起こされ、その結果生じるヘモグロビンを「ヘモグロビンS」または「HbS」と呼ぶ。低酸素条件では、HbS分子は凝集して繊維状の沈殿物を形成する。これらの凝集体は、RBCの異常すなわち「鎌状化」を引き起こし、細胞の柔軟性を失う。鎌状赤血球は毛細血管床に入り込めず、鎌状赤血球症患者に血管閉塞症を引き起こす可能性がある。さらに、鎌状赤血球は通常の赤血球よりも脆く、溶血しやすく、最終的に患者に貧血を引き起こす。
鎌状赤血球症患者の治療および管理は、抗生物質治療、疼痛管理、急性発症中の輸血を含む生涯にわたる提案である。1つの手法は、ヒドロキシ尿素の使用である。これは、ガンマグロビンの生成を増加させて部分的にその効果を発揮する。しかし、慢性ヒドロキシ尿素療法の長期的な副作用はまだ不明であり、治療が望ましくない副作用を引き起こし、患者ごとに有効性が異なる可能性がある。鎌状赤血球治療の有効性は高くなっているにもかかわらず、患者の平均余命はまだ50代半ばから後半であり、関連する疾患の病的状態は患者の生活の質に深刻な影響を及ぼす。
地中海貧血症(アルファ地中海貧血症およびベータ地中海貧血症)もヘモグロビンに関連する疾患であり、通常、グロビン鎖の発現低下を伴う。これは、遺伝子の制御領域の変異を介して、あるいは発現の低下または機能性グロビンタンパク質のレベルの低下を起こすグロビンコード配列の変異から発生し得る。地中海貧血症の治療には通常、輸血および鉄キレート療法が含まれる。適切なドナーを特定できれば、重度の地中海貧血症患者の治療にも骨髄移植が使用されるが、この手順は重大なリスクを持つ可能性がある。
鎌状赤血球症(SCD)およびベータ地中海貧血症の両方の治療のために提案されている1つの手法は、HbFが異常な成人ヘモグロビンを機能的に置き換えるようにガンマグロビンの発現を増加させることである。上記のように、ヒドロキシ尿素によるSCD患者の治療は、ガンマグロビン発現の増加に対する効果(DeSimone (1982) Proc Nat'l Acad Sci USA 79(14):4428-31; Ley, et al., (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475; Ley, et al., (1983) Blood 62: 370-380; Constantoulakis et al., (1988) Blood 72(6):1961-1967、すべて参照により本明細書に組み込まれる)のため、部分的に成功すると考えられている。HbFの発現を増加させるには、その産物がガンマグロビン発現の制御に役割を果たす遺伝子の特定が必要である。そのような遺伝子の1つはBCL11Aである。BCL11Aは、成体赤血球前駆細胞で発現される亜鉛フィンガータンパク質をコードし、その発現の減少は、ガンマグロビン発現の増加につながる(Sankaran et at (2008) Science 322: 1839、参照により本明細書に組み込まれる)。BCL11A遺伝子を標的とする阻害性RNAの使用が提案されているが(たとえば、米国特許公開第2011/0182867号、参照により本明細書に組み込まれる)、この技術には、完全なノックダウンが達成されない可能性があること、そのようなRNAの送達が問題になり得ること、RNAが継続的に存在しなければならず生涯にわたって複数の治療が必要なこと、などのいくつかの潜在的な欠点がある。
本発明のRGNを使用して、BCL11Aエンハンサー領域を標的にして、BCL11Aの発現を破壊することにより、ガンマグロビン発現を増加させることができる。この標的破壊は非相同末端結合(NHEJ)により達成できる。これにより、本発明のRGNは、BCL11Aエンハンサー領域内の特定の配列を標的とし、二本鎖切断を行い、細胞の機構が切断を修復する(一般には有害な変異を同時に導入する)。他の疾患標的について記載されているのと同様に、本発明のRGNは比較的小さいため、他の既知のRGNに対して利点を有する可能性があり、これにより、RGNおよびそのガイドRNAの発現カセットを生体内に送達するために単一のAAVベクターに詰め込むことができる。本発明のRGNを用いる同様の戦略はまた、ヒトおよび農学的または経済的に重要な非ヒト動物の両方における同様の疾患および障害に適用できる可能性がある。
XI.ポリヌクレオチド遺伝子改変を含む細胞
本明細書に記載のRGN、crRNA、および/またはtracrRNAにより媒介される方法を用いて改変された目的の標的配列を含む細胞および生物が本明細書で提供される。これらの実施態様において、RGNは、配列番号1~109のアミノ酸配列のいずれか1つ、またはその活性多様体もしくは断片を含む。様々な実施態様において、ガイドRNAは、配列番号110~119、139、141、143、146、および201~309のヌクレオチド配列のいずれか1つを含むCRISPR反復配列またはその活性多様体もしくは断片を含む。特定の実施態様では、ガイドRNAは、配列番号120~128、140、142、145、147、および148のヌクレオチド配列のいずれか1つを含むtracrRNAまたはその活性多様体もしくは断片を含む。システムのガイドRNAは、単一ガイドRNAであっても二重ガイドRNAであってもよい。
改変された細胞は、真核細胞(たとえば、哺乳動物、植物、昆虫の細胞)であっても原核細胞であってもよい。本明細書に記載のRGN、crRNA、および/またはtracrRNAを利用する方法により改変された少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む細胞小器官および胚も提供される。遺伝子改変された細胞、生物、細胞小器官、および胚は、改変されたヌクレオチド配列についてヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。
細胞、生物、細胞小器官、または胚の染色体改変により、発現の変化(増加もしくは減少)、不活性化、または変化したタンパク質産物もしくは組込み配列の発現が起こる可能性がある。染色体改変により遺伝子の不活性化または非機能的タンパク質産物の発現のいずれかが起こる実施態様では、遺伝子改変された細胞、生物、細胞小器官、または胚を「ノックアウト」と呼ぶ。ノックアウト表現型は、欠失変異(すなわち、少なくとも1個のヌクレオチドの欠失)の結果であってもよく、挿入変異(すなわち、少なくとも1個のヌクレオチドの挿入)の結果であってもよく、ナンセンス変異(すなわち、終止コドンが導入されるような少なくとも1個のヌクレオチドの置換)の結果であってもよい。
実施態様によっては、細胞、生物、細胞小器官、または胚の染色体改変により、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の染色体組込みにより起こる「ノックイン」を生成することができる。これらの実施態様によっては、野生型タンパク質をコードする染色体配列は不活性化されるが外因的に導入されたタンパク質は発現するように、コード配列が染色体に組み込まれる。
実施態様によっては、染色体改変により多様体タンパク質産物が産生される。発現された多様体タンパク質産物は、少なくとも1つのアミノ酸置換および/または少なくとも1つのアミノ酸の付加もしくは欠失を有し得る。変更された染色体配列によりコードされる多様体タンパク質産物は、野生型タンパク質と比較した場合、変更された特性または活性(変更された酵素活性または基質特異性を含むがこれらに限定されない)を示す可能性がある。
実施態様によっては、染色体改変により、タンパク質の発現パターンが変化する可能性がある。非限定的な例として、タンパク質産物の発現を制御する制御領域における染色体の変化により、タンパク質産物の過剰発現もしくは減少、または組織もしくは時間的発現パターンの変化が起こる可能性がある。
改変された細胞を従来の方法に従って植物などの生物に成長させてもよい。たとえば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照のこと。次いで、これらの植物を成長させ、同じ改変株または異なる株で受粉させてもよく、得られた雑種は遺伝子改変を有する。本発明は、遺伝子改変された種子を提供する。再生植物の子孫、多様体、および変異体も、これらの部分が遺伝子改変を含むという条件で、本発明の範囲内に含まれる。さらに、遺伝子改変を保持する加工された植物産物または副産物、たとえばダイズ粕などが提供される。
本明細書で提供される方法を任意の植物種、たとえば単子葉植物および双子葉植物(ただしこれらに限定されない)の改変に用いてもよい。目的の植物の例としては、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナ、ブラシカ属、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞用植物、針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。
野菜としては、トマト、レタス、サヤインゲン、ライマメ、エンドウ、およびキュウリ属の一部、たとえばキュウリ、カンタループ、マスクメロンが挙げられるが、これらに限定されない。観賞用植物としては、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、キクなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の植物は、作物植物(たとえば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど)である。
本明細書で提供される方法を古細菌および細菌(たとえば、バチルス属(Bacillus)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、リゾビウム属(Rhizobium)、エシェリヒア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、シゲラ属(Shigella)、ビブリオ属(Vibrio)、エルシニア属(Yersinia)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)が挙げられるが、これらに限定されない)を遺伝子改変するのに用いることもできる。
本明細書で提供される方法を用いて任意の真核生物種(動物(たとえば、哺乳動物、昆虫、魚、鳥、および爬虫類)、真菌、アメーバ、藻類、および酵母が挙げられるが、これらに限定されない)を遺伝子改変してもよい。実施態様によっては、本開示の方法によって改変される細胞としては、造血系由来、たとえば免疫系の細胞(すなわち免疫細胞)(B細胞、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられるがこれらに限定されない)、幹細胞(多能性幹細胞および誘導多能性幹細胞、キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞が挙げられる)が挙げられる。
改変された細胞を生物に導入してもよい。これらの細胞は、自家細胞移植の場合で同じ生物(たとえばヒト)に由来した細胞であってもよく、その場合、細胞を生体外の手法で改変する。あるいは、同種異系細胞移植の場合、細胞は同じ種内の別の生物(たとえば、別のヒト)に由来する。
XII.標的DNAを検出あるいは一本鎖DNAの集合を切断するためのキットおよび方法
本開示のRGN、特にAPG09624およびAPG05405(配列番号2および4として示される)は、標的DNAの検出により活性化されると、非標的一本鎖DNA(ssDNA)を無差別に切断できる。したがって、試料中の標的DNA(二本鎖または一本鎖)を検出するための組成物および方法が本明細書で提供される。
DNA分子の標的DNAを検出する方法は、試料をRGN(またはそれをコードするポリヌクレオチド)、RGNおよびDNA分子内の標的DNA配列とハイブリダイズ可能なガイドRNA(またはそれをコードするポリヌクレオチド)、およびガイドRNAとハイブリダイズしない検出用一本鎖DNA(検出用ssDNA)と接触させた後、RGNによるssDNAの切断により生成される検出可能なシグナルを測定し、それによりDNA分子の標的DNA配列を検出することを含む。実施態様によっては、この方法は、RGNおよびガイドRNAとの接触の前または接触と同時に、試料中の核酸分子を増幅する工程を含んでもよい。これらの実施態様の一部では、検出方法の感度を高めるために、ガイドRNAがハイブリダイズする特定の配列を増幅してもよい。
試料を、RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび/またはガイドRNAをコードするポリヌクレオチドと接触させる実施態様では、試料は未変化の細胞を含み、ポリヌクレオチドはそれらが後に発現される細胞に導入される。これらの実施態様によっては、ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、RGNポリペプチドおよび/またはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。
実施態様によっては、所望の標的は、RNA、たとえばコロナウイルスなどのRNAウイルスのゲノムまたはゲノムの一部として存在してもよい。実施態様によっては、コロナウイルスは、SARS様コロナウイルスであってもよい。さらなる実施態様では、コロナウイルスは、SARS-CoV-2、SARS-CoV、またはコウモリSARS様コロナウイルス、たとえばコウモリSL-CoVZC45(受入番号MG772933)であってもよい。標的がRNAとして存在する実施態様では、標的はRGNにより効果的に標的化できるDNA分子に逆転写されてもよい。逆転写の後、熱サイクルを含む増幅工程、たとえば当技術分野で知られているRT-PCRを行ってもよいし、増幅工程は等温法、たとえばRT-LAMP(逆転写ループ媒介等温増幅)によるものでもよい(Notomi et al., Nucleic Acids Res 28: E63, (2000))。
核酸増幅は、試料をRGN、ガイドRNA、および検出用ssDNAと接触させる前に起こってもよく、あるいは、増幅は接触工程と同時に起こってもよい。
特定の実施態様では、この方法は、試料をRGNおよび2つ以上のガイドRNAと接触させることを含む。それぞれRGNとハイブリダイズ可能なガイドRNAは、検出可能なシグナルを増幅してそのDNA分子の検出を導くために、単一のDNA分子の固有の標的配列に結合できる。
これらの組成物および方法は、ガイドRNAとハイブリダイズせず、非標的ssDNAである検出用ssDNAの使用を含む。実施態様によっては、検出用ssDNAは、検出用ssDNAの切断後に検出可能なシグナルを提供する検出可能な標識を含む。非限定的な例は、蛍光色素/消光剤の対を含む検出用ssDNAであり、検出用ssDNAが完全である(すなわち切断されていない)場合、そのシグナルは、近接する消光剤の存在により抑制されるため、蛍光色素は蛍光を発しない。検出用ssDNAが切断されると、消光剤が除去され、蛍光標識を検出できる。蛍光標識または色素の非限定的な例としては、Cy5、フルオレセイン(たとえば、FAM、6 FAM、5(6)FAM、FITC)、Cy3、AlexaFluor(登録商標)色素、およびテキサスレッドが挙げられる。消光剤の非限定的な例としては、Iowa Black(登録商標)FQ、Iowa Black(登録商標)RQ、Qx1消光剤、ATT0消光剤、およびQSY色素が挙げられる。実施態様によっては、検出用ssDNAは、バックグラウンドを減少させて信号検出を増加させられる第2の消光剤、たとえばZEN(商標)、TAO(商標)、およびBlack Hole Quencher(登録商標)のような内部消光剤を含む。
他の実施態様では、検出用ssDNAは、検出用ssDNAの切断の前に検出可能なシグナルを提供する検出可能な標識を含み、ssDNAの切断はシグナルの検出を阻害あるいは防止する。このようなシナリオの非限定的な例は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を含む検出用ssDNAである。FRETは、近接した励起状態の第1の(供与)蛍光色素から第2の(受容)蛍光色素にエネルギーの非放射伝達が発生する過程である。供与蛍光色素の発光スペクトルは、受容蛍光色素の励起スペクトルと重なる。したがって、受容蛍光色素は、検出用ssDNAが完全である(つまり、切断されていない)ときに蛍光を発し、検出用ssDNAが切断されると、供与蛍光色素と受容蛍光色素は互いに近接しなくなるため、受容蛍光色素は蛍光を発しない。FRET供与および受容蛍光色素は当技術分野で知られており、シアニン蛍光タンパク質(CFP)/緑色蛍光タンパク質(GFP)、Cy3/Cy5、およびGFP/黄色蛍光タンパク質(YFP)が挙げられるが、これらに限定されない。
実施態様によっては、検出用ssDNAは、約2ヌクレオチド~約30ヌクレオチド、たとえば約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、および約30ヌクレオチド(ただし、これらに限定されない)の長さを有する。
検出用ssDNAを含むこれらの組成物および方法を用いて標的DNAを検出できる試料としては、核酸(たとえば、DNAまたはRNA分子)を含む、あるいは含むと考えられる任意の試料が挙げられる。試料は任意の起源、たとえば精製された核酸の合成的組合せ、または生体試料、たとえば呼吸器の拭き取り検体(たとえば、鼻咽頭の拭き取り検体)抽出物、細胞溶解物、患者試料、細胞、組織、唾液、血液、血清、血漿、尿、吸引物、生検試料、脳脊髄液、または生物(細菌、ウイルスなど)であってもよい。
試料とRGN、ガイドRNA、および検出用ssDNAとの接触は、インビトロ、生体外、または生体内での接触を含み得る。実施態様によっては、検出用ssDNAおよび/またはRGNおよび/またはガイドRNAをたとえば側方流動装置に固定化し、固定化された検出用ssDNAおよび/またはRGNおよび/またはガイドRNAに試料を接触させる。実施態様によっては、検出用ssDNA上の抗原部分に対する抗体を、切断された検出用ssDNAと未変化の検出用ssDNAを区別できる方法で、たとえば側方流動装置に固定化する。また、国際公開第WO 2020/028729号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるような、固定化された検出用ssDNAを含む装置も提供される。RGN およびガイドRNAは、装置への試料の添加前、添加と同時、または添加後に試料に添加されてもよく、標的DNAが試料中に存在する場合、RGNは標的DNAおよび検出用ssDNAを切断し、標的DNA配列の存在を検出するために測定できる検出可能なシグナルを増加あるいは減少させる。あるいは、RGNおよび/またはガイドRNAを装置(たとえば、側方流動、マイクロ流体)に固定化し、試料および検出用ssDNAを装置に加える。検出用ssDNAは、装置への試料の添加前、添加中、または添加後に試料に添加されてもよい。別の代替の装置(たとえば、側方流動マイクロ流体装置)は、検出用ssDNAの抗原部分に対する固定化抗体を含み、試料、検出用ssDNA、RGN、およびガイドRNAを装置に加える。実施態様によっては、方法は、試料中に存在する標的DNAの量を決定することをさらに含んでもよい。試験試料中の検出可能なシグナルの測定値を基準測定値(たとえば、既知量の標的DNAを含む基準試料またはその一連の試料の測定値)と比較してもよい。
組成物および方法の用途の非限定的な例としては、一塩基多型(SNP)検出、がん検診、細菌感染の検出、抗生物質耐性の検出、およびウイルス感染の検出が挙げられる。
RGNによるssDNAの切断により生成される検出可能なシグナルを当技術分野で知られている任意の適切な方法、たとえば、限定しないが、蛍光シグナルの測定、ゲル上のバンドの目視による分析、比色変化、および電気シグナルの有無を用いて測定してもよい。
本発明は、試料中のDNA分子の標的DNAを検出するためのキットを提供し、このキットは、本発明のRGNポリペプチド(またはRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、RGNおよびDNA分子中の標的DNA配列とハイブリダイズ可能なガイドRNA(またはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、およびガイドRNAとハイブリダイズしない検出用ssDNAを含む。検出される標的がRNAである実施態様では、キットは逆転写酵素をさらに含んでもよい。核酸増幅が用いられる実施態様では、RGNおよびガイドRNA(またはそれをコードするポリヌクレオチド)、および検出用ssDNAを含むキットは、核酸増幅試薬(たとえば、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液)をさらに含んでもよい。キットがRGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび/またはガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む実施態様では、ポリヌクレオチドをそれらが後に発現される細胞に導入する。これらの実施態様の一部では、ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、RGNポリペプチドおよび/またはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。特定の実施態様では、キットは、それぞれRGNとハイブリダイズ可能な2つ以上のガイドRNA(または2つ以上のガイドRNAをコードするポリヌクレオチド)を含む。ガイドRNAは、検出可能なシグナルを増幅し、そのDNA 分子の検出を導くために、単一のDNA 分子の固有の標的配列に結合できる。
キットの要素は、個別にまたは組み合わせて提供されてもよく、任意の適切な容器、たとえばバイアル、瓶、またはチューブで提供されてもよい。実施態様によっては、キットは、1つ以上の言語の説明書を含む。実施態様によっては、キットは、本明細書に記載の1つ以上の要素を利用する方法で使用するための1種以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器で提供されてもよい。たとえば、キットは、1種以上の反応緩衝液または保存緩衝液を提供してもよい。試薬は、特定の検定で使用可能な形態、または使用前に1つ以上の他の成分を加える必要がある形態(たとえば、濃縮物または凍結乾燥形態)で提供されてもよい。緩衝液は任意の緩衝液、たとえば、限定しないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、Tris緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、およびそれらの組合せであってもよい。実施態様によっては、緩衝液はアルカリ性である。実施態様によっては、緩衝液は、約7~約10のpHを有する。
本明細書では、DNA分子の標的DNA配列および複数の非標的ssDNAを含む核酸の集団をRGNならびにRGNおよび標的DNA配列とハイブリダイズ可能なガイドRNAと接触させて一本鎖DNAを切断する方法も提供される。これらの実施態様によっては、核酸の集団は細胞溶解物中にある。これらの実施態様によっては、非標的ssDNAは細胞にとって外来性であり、これらの実施態様によっては、非標的ssDNAはウイルスDNAである。特定の実施態様では、標的DNA配列はウイルス配列である。この方法は、インビトロ、生体内、または生体外で行われてもよい。たとえば、この方法は生体内で行われてもよく、対象は、RGNポリペプチドおよびガイドRNA、またはRGNポリペプチドおよび/もしくはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを投与され、RGNによるウイルス標的DNA配列の結合および切断により、感染細胞内の非標的ウイルスssDNAの切断が起こってもよい。
冠詞「a」および「an」は、本明細書において、1つまたは1つ以上(すなわち少なくとも1つ)のその冠詞の文法上の目的語を指すために用いられる。例として、「ポリペプチド(a polypeptide)」は、1つ以上のポリペプチドを意味する。
本明細書で言及されるすべての刊行物および特許出願は、本開示が属する分野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的で、説明および例示のために以上の発明を詳細に説明したが、特定の変更および修正を添付の実施態様の範囲内で実施してもよいことは明らかである。
非限定的な実施態様は、以下を含む。
1.RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記RGNポリペプチドは、標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNA (gRNA)と結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合でき、かつ
RGNポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに対して異種のプロモーターに作動可能に連結されている、核酸分子。
2.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様1に記載の核酸分子。
3.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様1に記載の核酸分子。
4.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様1~3のいずれか1つに記載の核酸分子。
5.前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、実施態様4に記載の核酸分子。
6.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様1~3のいずれか1つに記載の核酸分子。
7.前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、実施態様6に記載の核酸分子。
8.前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、実施態様7に記載の核酸分子。
9.前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、実施態様7に記載の核酸分子。
10.前記RGNポリペプチドは塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合している、実施態様1~9のいずれか1つに記載の核酸分子。
11.前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、実施態様10に記載の核酸分子。
12.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様1~11のいずれか1つに記載の核酸分子。
13.前記RGNポリペプチドは1つ以上の核局在化シグナルを含む、実施態様1~12のいずれか1つに記載の核酸分子。
14.前記RGNポリペプチドは、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施態様1~13のいずれか1つに記載の核酸分子。
15.実施態様1~14のいずれか1つに記載の核酸分子を含むベクター。
16.RGNアクセサリータンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含み、前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様15に記載のベクター。
17.前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181に対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184に対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187に対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190に対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様16に記載のベクター。
18.前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181に対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184に対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187に対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190に対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様16に記載のベクター。
19.前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な前記gRNAをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含む、実施態様15~18のいずれか1つに記載のベクター。
20.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記gRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様19に記載のベクター。
21.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記gRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様19に記載のベクター。
22.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記gRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様19に記載のベクター。
23.前記gRNAはtracrRNAを含む、実施態様19に記載のベクター。
24.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様23に記載のベクター。
25.前記tracrRNAは、
a) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様23に記載のベクター。
26.前記tracrRNAは、
a) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むtracrRNA、および
i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様23に記載のベクター。
27.前記gRNAは単一ガイドRNAである、実施態様23~26のいずれか1つに記載のベクター。
28.前記gRNAは二重ガイドRNAである、実施態様23~26のいずれか1つに記載のベクター。
29.実施態様1~14のいずれか1つに記載の核酸分子または実施態様15~28のいずれか1つに記載のベクターを含む細胞。
30.実施態様29に記載の細胞を、RGNポリペプチドが発現する条件で培養することを含む、RGNポリペプチドの作製方法。
31.配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子を細胞に導入すること、および
前記細胞を前記RGNポリペプチドが発現する条件で培養することを含み、
前記RGNポリペプチドは、標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNA (gRNA)に結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合する、RGNポリペプチドの作製方法。
32.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様31に記載の方法。
33.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様31に記載の方法。
34.前記RGNポリペプチドを精製することをさらに含む、実施態様30~33のいずれか1つに記載の方法。
35.前記細胞は、前記RGNポリペプチドに結合してRGNリボ核タンパク質複合体を形成する1つ以上のガイドRNAをさらに発現する、実施態様30~33のいずれか1つに記載の方法。
36.前記RGNリボ核タンパク質複合体を精製することをさらに含む、実施態様35に記載の方法。
37.単離されたRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドであって、前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
前記RGNポリペプチドは、標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNA (gRNA)に結合する際に、RNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合できる、RGNポリペプチド。
38.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様37に記載の単離されたRGNポリペプチド。
39.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様37に記載の単離されたRGNポリペプチド。
40.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様37~39のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド。
41.前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、実施態様40に記載の単離されたRGNポリペプチド。
42.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様37~39のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド。
43.前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、実施態様42に記載の単離RGNポリペプチド。
44.前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、実施態様43に記載の単離されたRGNポリペプチド。
45.前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、実施態様43に記載の単離されたRGNポリペプチド。
46.前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、実施態様37~45のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド。
47.前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、実施態様46に記載の単離されたRGNポリペプチド。
48.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様37~47のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド。
49.前記RGNポリペプチドは、1つ以上の核局在化シグナルを含む、実施態様37~48のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド。
50.CRISPR RNA (crRNA)をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記crRNAはスペーサー配列およびCRISPR反復配列を含み、前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
a)前記crRNAまたは
b)前記crRNAおよび前記crRNAの前記CRISPR反復配列とハイブリダイズ可能なトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA)
を含むガイドRNAは、前記ガイドRNAがRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドと結合する際に、前記crRNAのスペーサー配列を介して配列特異的にDNA分子の標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、
crRNAをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターと作動可能に連結されている、核酸分子。
51.前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様50に記載の核酸分子。
52.前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様50に記載の核酸分子。
53.実施態様50~52のいずれか1つに記載の核酸分子を含むベクター。
54.前記tracrRNAをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様53に記載のベクター。
55.前記CRISPR反復配列は、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
56.前記CRISPR反復配列は、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
57.前記CRISPR反復配列は、配列番号110に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号120に対して少なくとも100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
58.配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様55~57のいずれか1つに記載のベクター。
59.前記RGNポリペプチドは、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様58に記載のベクター。
60.前記RGNポリペプチドは、配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様58に記載のベクター。
61.前記CRISPR反復配列は、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
62.前記CRISPR反復配列は、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
63.前記CRISPR反復配列は、配列番号111に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号121に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
64.配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様61~63のいずれか1つに記載のベクター。
65.前記RGNポリペプチドは、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様64に記載のベクター。
66.前記RGNポリペプチドは、配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様64に記載のベクター。
67.前記CRISPR反復配列は、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
68.前記CRISPR反復配列は、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
69.前記CRISPR反復配列は、配列番号112に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号122に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
70.配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様67~69のいずれか1つに記載のベクター。
71.前記RGNポリペプチドは、配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様70に記載のベクター。
72.前記RGNポリペプチドは、配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様70に記載のベクター。
73.前記CRISPR反復配列は、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
74.前記CRISPR反復配列は、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
75.前記CRISPR反復配列は、配列番号113に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号123に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
76.配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様73~75のいずれか1つに記載のベクター。
77.前記RGNポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様76に記載のベクター。
78.前記RGNポリペプチドは、配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様76に記載のベクター。
79.前記CRISPR反復配列は、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
80.前記CRISPR反復配列は、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
81.前記CRISPR反復配列は、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号124に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
82.配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様79~81のいずれか1つに記載のベクター。
83.前記RGNポリペプチドは、配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様82に記載のベクター。
84.前記RGNポリペプチドは、配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様82に記載のベクター。
85.前記CRISPR反復配列は、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
86.前記CRISPR反復配列は、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
87.前記CRISPR反復配列は、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号125に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
88.配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様85~87のいずれか1つに記載のベクター。
89.前記RGNポリペプチドは、配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様88に記載のベクター。
90.前記RGNポリペプチドは、配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様88に記載のベクター。
91.前記CRISPR反復配列は、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
92.前記CRISPR反復配列は、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
93.前記CRISPR反復配列は、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号126に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
94.配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様91~93のいずれか1つに記載のベクター。
95.前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様94に記載のベクター。
96.前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様94に記載のベクター。
97.前記CRISPR反復配列は、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
98.前記CRISPR反復配列は、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
99.前記CRISPR反復配列は、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号127に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
100.配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様97~99のいずれか1つに記載のベクター。
101.前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様100に記載のベクター。
102.前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様100に記載のベクター。
103.前記CRISPR反復配列は、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
104.前記CRISPR反復配列は、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
105.前記CRISPR反復配列は、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号128に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様54に記載のベクター。
106.配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様103~105のいずれか1つに記載のベクター。
107.前記RGNは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様106に記載のベクター。
108.前記RGNは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様106に記載のベクター。
109.前記crRNAをコードする前記ポリヌクレオチドと前記tracrRNAをコードする前記ポリヌクレオチドは同一のプロモーターに作動可能に連結されており、単一ガイドRNAとしてコードされる、実施態様54~109のいずれか1つに記載のベクター。
110.前記crRNAをコードする前記ポリヌクレオチドと前記tracrRNAをコードする前記ポリヌクレオチドは別個のプロモーターに作動可能に連結されている、実施態様54~109のいずれか1つに記載のベクター。
111.トランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA)をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記tracrRNAは、配列番号120~128のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
a) 前記tracrRNAならびに
b) スペーサー配列およびCRISPR反復配列を含むcrRNAであって、前記tracrRNAが前記crRNAの前記CRISPR反復配列とハイブリダイズ可能である、crRNA
を含むガイドRNAは、前記ガイドRNAがRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドと結合する際に、前記crRNAのスペーサー配列を介して配列特異的に標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、
tracrRNAをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターと作動可能に連結されている、核酸分子。
112.前記tracrRNAは、配列番号120~128のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様111に記載の核酸分子。
113.前記tracrRNAは、配列番号120~128のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様111に記載の核酸分子。
114.実施態様111~113のいずれか1つに記載の核酸分子を含むベクター。
115.前記crRNAをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様114に記載のベクター。
116.前記crRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
117.前記CRISPR反復配列は、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様116に記載のベクター。
118.前記CRISPR反復配列は、配列番号110に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号120に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様116に記載のベクター。
119.配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様116~118のいずれか1つに記載のベクター。
120.前記RGNポリペプチドは、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様119に記載のベクター。
121.前記RGNポリペプチドは、配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様119に記載のベクター。
122.前記crRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
123.前記CRISPR反復配列は、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様122に記載のベクター。
124.前記CRISPR反復配列は、配列番号111に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号121に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様122に記載のベクター。
125.配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様122~124のいずれか1つに記載のベクター。
126.前記RGNポリペプチドは、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様125に記載のベクター。
127.前記RGNポリペプチドは、配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様125に記載のベクター。
128.前記crRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
129.前記CRISPR反復配列は、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様128に記載のベクター。
130.前記CRISPR反復配列は、配列番号112に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号122に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様128に記載のベクター。
131.配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様128~130のいずれか1つに記載のベクター。
132.前記RGNポリペプチドは、配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様131に記載のベクター。
133.前記RGNポリペプチドは、配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様131に記載のベクター。
134.前記crRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
135.前記CRISPR反復配列は、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様134に記載のベクター。
136.前記CRISPR反復配列は、配列番号113に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号123に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様134に記載のベクター。
137.配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様134~136のいずれか1つに記載のベクター。
138.前記RGNポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様137に記載のベクター。
139.前記RGNポリペプチドは、配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様137に記載のベクター。
140.前記crRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
141.前記CRISPR反復配列は、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様140に記載のベクター。
142.前記CRISPR反復配列は、配列番号114に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号124に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様140に記載のベクター。
143.配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様140~142のいずれか1つに記載のベクター。
144.前記RGNポリペプチドは、配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様143に記載のベクター。
145.前記RGNポリペプチドは、配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様143に記載のベクター。
146.前記crRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
147.前記CRISPR反復配列は、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様146に記載のベクター。
148.前記CRISPR反復配列は、配列番号115に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号125に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様146に記載のベクター。
149.配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様146~148のいずれか1つに記載のベクター。
150.前記RGNポリペプチドは、配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様149に記載のベクター。
151.前記RGNポリペプチドは、配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様149に記載のベクター。
152.前記crRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
153.前記CRISPR反復配列は、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様152に記載のベクター。
154.前記CRISPR反復配列は、配列番号117に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号126に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様152に記載のベクター。
155.配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様152~154のいずれか1つに記載のベクター。
156.前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様155に記載のベクター。
157.前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様155に記載のベクター。
158.前記crRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
159.前記CRISPR反復配列は、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様158に記載のベクター。
160.前記CRISPR反復配列は、配列番号118に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号127に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様158に記載のベクター。
161.配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様158~160のいずれか1つに記載のベクター。
162.前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様161に記載のベクター。
163.前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様161に記載のベクター。
164.前記crRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含み、前記tracrRNAは、配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様115に記載のベクター。
165.前記CRISPR反復配列は、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様164に記載のベクター。
166.前記CRISPR反復配列は、配列番号119に対して100%の配列同一性を有し、前記tracrRNAは、配列番号128に対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様164に記載のベクター。
167.配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様164~166のいずれか1つに記載のベクター。
168.前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様167に記載のベクター。
169.前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様167に記載のベクター。
170.前記crRNAをコードする前記ポリヌクレオチドと前記tracrRNAをコードする前記ポリヌクレオチドは同一のプロモーターに作動可能に連結されており、単一ガイドRNAとしてコードされる、実施態様115~169のいずれか1つに記載のベクター。
171.前記crRNAをコードする前記ポリヌクレオチドと前記tracrRNAをコードする前記ポリヌクレオチドは別個のプロモーターに作動可能に連結されている、実施態様115~169のいずれか1つに記載のベクター。
172.DNA分子の標的DNA配列を結合させるためのシステムであって、
a) 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な1つ以上のガイドRNA、または前記1つ以上のガイドRNA (gRNA)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド、および
b) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記RGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、
前記1つ以上のガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および前記RGNポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも1つは、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモーターに作動可能に連結され、かつ
前記1つ以上のガイドRNAは、前記RGNポリペプチドを前記DNA分子の前記標的DNA配列に結合させるために、前記RGNポリペプチドと複合体を形成できる、システム。
173.DNA分子の標的DNA配列を結合させるためのシステムであって、
a) 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な1つ以上のガイドRNA、または前記1つ以上のガイドRNA (gRNA)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド、および
b) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドを含み、
前記1つ以上のガイドRNAは、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、かつ
前記1つ以上のガイドRNAは、前記RGNポリペプチドを前記DNA分子の前記標的DNA配列に結合させるために、前記RGNポリペプチドと複合体を形成できる、システム。
174.前記1つ以上のガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも1つは、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモーターに作動可能に連結されている、実施態様173に記載のシステム。
175.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様172~174のいずれか1つに記載のシステム。
176.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様172~174のいずれか1つに記載のシステム。
177.前記RGNポリペプチドと前記1つ以上のガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、実施態様172~176のいずれか1つに記載のシステム。
178.前記標的DNA配列は真核生物の標的DNA配列である、実施態様172~177のいずれか1つに記載のシステム。
179.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様172~178のいずれか1つに記載のシステム。
180.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様172~178のいずれか1つに記載のシステム。
181.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様172~178のいずれか1つに記載のシステム。
182.前記1つ以上のガイドRNAはtracrRNAを含む、実施態様172~181のいずれか1つに記載のシステム。
183.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様182に記載のシステム。
184.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様182に記載のシステム。
185.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様182に記載のシステム。
186.前記1つ以上のガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、実施態様182~185のいずれか1つに記載のシステム。
187.前記1つ以上のガイドRNAは二重ガイドRNAである、実施態様182~185のいずれか1つに記載のシステム。
188.少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質、またはそれをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに含み、前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様172~187に記載のシステム。
189.前記少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様188に記載のシステム。
190.前記少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様188に記載のシステム。
191.前記標的DNA配列は細胞内にある、実施態様172~190のいずれか1つに記載のシステム。
192.前記細胞は真核細胞である、実施態様191に記載のシステム。
193.前記真核細胞は植物細胞である、実施態様192に記載のシステム。
194.前記真核細胞は哺乳動物細胞である、実施態様192に記載のシステム。
195.前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、実施態様194に記載のシステム。
196.前記ヒト細胞は免疫細胞である、実施態様195に記載のシステム。
197.前記ヒト細胞は幹細胞である、実施態様196に記載のシステム。
198.前記幹細胞は誘導多能性幹細胞である、実施態様197に記載のシステム。
199.前記真核細胞は昆虫細胞である、実施態様192に記載のシステム。
200.前記細胞は原核細胞である、実施態様191に記載のシステム。
201.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様172~200のいずれか1つに記載のシステム。
202.前記1つ以上のガイドRNAは、転写されると前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、かつ前記ガイドRNAは、前記RGNポリペプチドと複合体を形成して前記標的DNA配列の切断を導ける、実施態様201に記載のシステム。
203.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様172~200のいずれか1つに記載のシステム。
204.前記1つ以上のガイドRNAは、転写されると前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、かつ前記ガイドRNAは、前記RGNポリペプチドと複合体を形成して前記標的DNA配列の切断を導ける、実施態様203に記載のシステム。
205.前記RGNポリペプチドは二本鎖切断を起こすことができる、実施態様204に記載のシステム。
206.前記RGNポリペプチドは一本鎖切断を起こすことができる、実施態様204に記載のシステム。
207.前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に連結されている、実施態様172~206のいずれか1つに記載のシステム。
208.前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、実施態様207に記載のシステム。
209.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様172~208のいずれか1つに記載のシステム。
210.前記RGNポリペプチドは、1つ以上の核局在化シグナルを含む、実施態様172~209のいずれか1つに記載のシステム。
211.前記RGNポリペプチドは、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施態様172~210のいずれか1つに記載のシステム。
212.前記1つ以上のガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは1つのベクターに配置されている、実施態様172~211のいずれか1つに記載のシステム。
213.1つ以上のドナーポリヌクレオチド、または前記1つ以上のドナーポリヌクレオチドをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、実施態様172~212のいずれか1つに記載のシステム。
214.実施態様1~14、50~52、および111~113のいずれか1つに記載の核酸分子、実施態様15~28、53~110、および114~171のいずれか1つに記載のベクター、実施態様29に記載の細胞、実施態様37~49のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド、または実施態様172~213のいずれか1つに記載のシステム、ならびに医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
215.DNA分子の標的DNA配列に結合させる方法であって、実施態様172~213のいずれか1つに記載のシステムを前記標的DNA配列または前記標的DNA配列を含む細胞に送達することを含む、方法。
216.前記RGNポリペプチドまたは前記ガイドRNAは、検出可能な標識をさらに含むことで前記標的DNA配列の検出を可能にする、実施態様215に記載の方法。
217.前記ガイドRNAまたは前記RGNポリペプチドは、発現調節因子をさらに含むことで前記標的DNA配列または前記標的DNA配列の転写制御下にある遺伝子の発現を調節する、実施態様215に記載の方法。
218.DNA分子の標的DNA配列を切断する方法であって、実施態様172~213のいずれか1つに記載のシステムを前記標的DNA配列または前記標的DNA配列を含む細胞に送達することを含む、方法。
219.改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列への異種DNAの挿入を含む、実施態様218に記載の方法。
220.改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列からの少なくとも1つのヌクレオチドの欠失を含む、実施態様218に記載の方法。
221.改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列中の少なくとも1つのヌクレオチドの変異を含む、実施態様218に記載の方法。
222.DNA分子の標的DNA配列に結合させる方法であって、
a) インビトロで、
i) 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な1つ以上のガイドRNAと
ii) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRGNポリペプチド
をRGNリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件で混合してRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)リボヌクレオチド複合体を構築すること、および
b) 前記標的DNA配列または前記標的DNA配列を含む細胞を、インビトロで構築された前記RGNリボヌクレオチド複合体に接触させること
を含み、前記1つ以上のガイドRNAは前記標的DNA配列とハイブリダイズして前記RGNポリペプチドを前記標的DNA配列に結合させる、方法。
223.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様222に記載の方法。
224.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様222に記載の方法。
225.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様222~224のいずれか1つに記載の方法。
226.前記RGNポリペプチドまたは前記ガイドRNAは、検出可能な標識をさらに含むことで前記標的DNA配列の検出を可能にする、実施態様222~225のいずれか1つに記載の方法。
227.前記ガイドRNAまたは前記RGNポリペプチドは、発現調節因子をさらに含むことで前記標的DNA配列または前記標的DNA配列の転写制御下にある遺伝子の発現の調節を可能にする、実施態様222~225のいずれか1つに記載の方法。
228.DNA分子の標的DNA配列を切断および/または改変する方法であって、前記DNAを
a) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、および
b) (a)の前記RGNを前記標的DNA配列に向けることができる1つ以上のガイドRNA
と接触させることを含み、
前記1つ以上のガイドRNAは前記標的DNA配列とハイブリダイズし、これにより前記RGNポリペプチドを前記標的DNA配列に結合させ、かつ前記標的DNA配列の切断および/または改変が起こる、方法。
229.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様228に記載の方法。
230.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様228に記載の方法。
231.前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、実施態様230に記載の方法。
232.前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、実施態様230に記載の方法。
233.前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に連結されている、実施態様228~232のいずれか1つに記載の方法。
234.前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼを含む、実施態様233に記載の方法。
235.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様228~234のいずれか1つに記載の方法。
236.改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列への異種DNAの挿入を含む、実施態様228~235のいずれか1つに記載の方法。
237.改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列からの少なくとも1つのヌクレオチドの欠失を含む、実施態様228~235に記載の方法。
238.改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列中の少なくとも1つのヌクレオチドの変異を含む、実施態様228~235に記載の方法。
239.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様222~238のいずれか1つに記載の方法。
240.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様222~238のいずれか1つに記載の方法。
241.前記RGNポリペプチドと前記ガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、実施態様222~240のいずれか1つに記載の方法。
242.前記標的DNA配列は真核生物の標的DNA配列である、実施態様222~241のいずれか1つに記載の方法。
243.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様222~242のいずれか1つに記載の方法。
244.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様222~242のいずれか1つに記載の方法。
245.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様222~242のいずれか1つに記載の方法。
246.前記1つ以上のガイドRNAはtracrRNAを含む、実施態様222~242のいずれか1つに記載の方法。
247.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様246に記載の方法。
248.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様246に記載の方法。
249.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様246に記載の方法。
250.前記1つ以上のガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、実施態様246~249のいずれか1つに記載の方法。
251.前記1つ以上のガイドRNAは二重ガイドRNAである、実施態様246~249のいずれか1つに記載の方法。
252.前記DNA分子を1種以上のRGNアクセサリータンパク質と接触させることをさらに含み、前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様222~251に記載の方法。
253.前記1種以上のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様252に記載の方法。
254.前記1種以上のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様252に記載の方法。
255.前記標的DNA配列は細胞内にある、実施態様215~254のいずれか1つに記載の方法。
256.前記細胞は真核細胞である、実施態様255に記載の方法。
257.前記真核細胞は植物細胞である、実施態様256に記載の方法。
258.前記真核細胞は哺乳動物細胞である、実施態様256に記載の方法。
259.前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、実施態様258に記載の方法。
260.前記ヒト細胞は免疫細胞である、実施態様259に記載の方法。
261.前記ヒト細胞は幹細胞である、実施態様260に記載の方法。
262.前記幹細胞は誘導多能性幹細胞である、実施態様261に記載の方法。
263.前記真核細胞は昆虫細胞である、実施態様256に記載の方法。
264.前記細胞は原核細胞である、実施態様255に記載の方法。
265.実施態様228~254のいずれか1つに記載の方法に従って改変された標的DNA配列を含む細胞。
266.前記細胞は真核細胞である、実施態様265に記載の細胞。
267.前記真核細胞は植物細胞である、実施態様266に記載の細胞。
268.実施態様267に記載の細胞を含む植物。
269.実施態様267に記載の細胞を含む種子。
270.前記真核細胞は哺乳動物細胞である、実施態様266に記載の細胞。
271.前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、実施態様270に記載の細胞。
272.前記ヒト細胞は免疫細胞である、実施態様271に記載の細胞。
273.前記ヒト細胞は幹細胞である、実施態様272に記載の細胞。
274.前記幹細胞は誘導多能性幹細胞である、実施態様273に記載の細胞。
275.前記真核細胞は昆虫細胞である、実施態様266に記載の細胞。
276.前記細胞は原核細胞である、実施態様265に記載の細胞。
277.実施態様266および270~274のいずれか1つに記載の細胞ならびに医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
278.試料中のDNA分子の標的DNA配列を検出するためのキットであって、
a) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNAと結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合してそれを切断できる、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記RGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
b) 前記ガイドRNAまたは前記ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
c) 前記ガイドRNAとハイブリダイズしない検出用一本鎖DNA (ssDNA)
を含む、キット。
279.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様278に記載のキット。
280.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様278に記載のキット。
281.前記ガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および前記RGNポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも1つは、前記ヌクレオチド配列に対して異種であるプロモーターと作動可能に連結されている、実施態様278~280のいずれか1つに記載のキット。
282.前記RGNポリペプチドと前記ガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、実施態様278~281のいずれか1つに記載のキット。
283.前記標的DNA配列は真核生物の標的DNA配列である、実施態様278~282のいずれか1つに記載のキット。
284.前記検出用ssDNAは、蛍光色素と消光剤の対を含む、実施態様278~283のいずれか1つに記載のキット。
285.前記検出用ssDNAは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を含む、実施態様278~283のいずれか1つに記載のキット。
286.少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質をさらに含み、前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様278~285のいずれか1つに記載のキット。
287.前記少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様286に記載のキット。
288.前記少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様286に記載のキット。
289.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様278~288のいずれか1つに記載のキット。
290.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様278~288のいずれか1つに記載のキット。
291.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様278~288のいずれか1つに記載のキット。
292.前記1つ以上のガイドRNAはtracrRNAを含む、実施態様278~288のいずれか1つに記載のキット。
293.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様292に記載のキット。
294.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様292に記載のキット。
295.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様292に記載のキット。
296.前記1つ以上のガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、実施態様292~295のいずれか1つに記載のキット。
297.前記1つ以上のガイドRNAは二重ガイドRNAである、実施態様292~295のいずれか1つに記載のキット。
298.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様278~297のいずれか1つに記載のキット。
299.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様278~297のいずれか1つに記載のキット。
300.前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、実施態様299に記載のキット。
301.前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、実施態様299に記載のキット。
302.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様278~301のいずれか1つに記載のキット。
303.試料中のDNA分子の標的DNA配列を検出する方法であって、
a) 前記試料を、
i) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNAと結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合してそれを切断できる、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、
ii) 前記ガイドRNA、および
iii) 前記ガイドRNAとはハイブリダイズしない検出用一本鎖DNA (ssDNA)
と接触させること、ならびに
b) 前記RGNによる検出用ssDNAの切断により発生する検出可能なシグナルを測定して前記標的DNA配列を検出すること
を含む、方法。
304.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様303に記載の方法。
305.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様303に記載の方法。
306.前記試料は、細胞溶解物に由来のDNA分子を含む、実施態様303~305に記載の方法。
307.前記試料は細胞を含む、実施態様303~305のいずれか1つに記載の方法。
308.前記細胞は真核細胞である、実施態様307に記載の方法。
309.前記標的DNA配列を含むDNA分子は、RNAを含む試料中に存在するRNA鋳型分子の逆転写により生成される、実施態様303~305のいずれか1つに記載の方法。
310.前記RNA鋳型分子はRNAウイルスである、実施態様309に記載の方法。
311.前記RNAウイルスはコロナウイルスである、実施態様310に記載の方法。
312.前記コロナウイルスはコウモリSARS様コロナウイルス、SARS-CoV、またはSARS-CoV-2である、実施態様311に記載の方法。
313.前記RNAを含む試料は、細胞を含む試料に由来する、実施態様309~312のいずれか1つに記載の方法。
314.前記検出用ssDNAは、蛍光色素と消光剤の対を含む、実施態様303~313のいずれか1つに記載の方法。
315.前記検出用ssDNAは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を含む、実施態様303~313のいずれか1つに記載の方法。
316.工程a)の接触の前またはそれと同時に前記試料中の核酸を増幅することをさらに含む、実施態様303~315のいずれか1つに記載の方法。
317.前記試料を1種以上のRGNアクセサリータンパク質と接触させることをさらに含み、前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様303~316のいずれか1つに記載の方法。
318.前記1種以上のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様317に記載の方法。
319.前記1種以上のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様317に記載の方法。
320.一本鎖DNA (ssDNA)を切断する方法であって、標的DNA配列を含むDNA分子および複数の非標的ssDNAを含む核酸の集合を、
a) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNAと結合する際にRNAに誘導されて配列特異的に前記標的DNA配列に結合してそれを切断できる、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、および
b) 前記ガイドRNA
と接触させることを含み、
前記RGNポリペプチドは、前記複数の非標的ssDNAを切断する、方法。
321.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様320に記載の方法。
322.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様320に記載の方法。
323.前記核酸の集合は細胞溶解物中にある、実施態様320~322のいずれか1つに記載の方法。
324.前記標的DNA配列を含むDNA分子は、RNA鋳型分子の逆転写により生成される、実施態様320~323のいずれか1つに記載の方法。
325.前記集合を1種以上のRGNアクセサリータンパク質と接触させることをさらに含み、前記RGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも90%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様320~324のいずれか1つに記載の方法。
326.前記1種以上のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して少なくとも95%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様325に記載の方法。
327.前記1種以上のRGNアクセサリータンパク質は、
a) 配列番号178~181のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
b) 配列番号182~184のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
c) 配列番号185~187のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
d) 配列番号191に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号14に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、
e) 配列番号192に対して100%の配列同一性を有するRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号15に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質、および
f) 配列番号188~190のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有する少なくとも1種のRGNアクセサリータンパク質であって、前記RGNポリペプチドは、配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、RGNアクセサリータンパク質
からなる群から選択される、実施態様325に記載の方法。
328.前記RGNポリペプチドと前記ガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、実施態様303~327のいずれか1つに記載の方法。
329.前記標的DNA配列は真核細胞のDNA配列である、実施態様303~328のいずれか1つに記載の方法。
330.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様303~329のいずれか1つに記載の方法。
331.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様303~329のいずれか1つに記載の方法。
332.前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、実施態様303~329のいずれか1つに記載の方法。
333.前記ガイドRNAはtracrRNAを含む、実施態様303~329のいずれか1つに記載の方法。
334.前記tracrRNAは
a) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様333に記載の方法。
335.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様333に記載の方法。
336.前記tracrRNAは、
a) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
b) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
c) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
d) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
からなる群から選択される、実施態様333に記載の方法。
337.前記ガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、実施態様333~336のいずれか1つに記載の方法。
338.前記ガイドRNAは二重ガイドRNAである、実施態様333~336のいずれか1つに記載の方法。
339.前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様303~338のいずれか1つに記載の方法。
340.前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、実施態様303~338のいずれか1つに記載の方法。
341.前記RGNポリペプチドによる前記標的DNA配列の切断は二本鎖切断を起こす、実施態様340に記載の方法。
342.前記RGNポリペプチドによる前記標的DNA配列の切断は一本鎖切断を起こす、実施態様340に記載の方法。
343.前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、実施態様303~342のいずれか1つに記載の方法。
344.遺伝性疾患の原因変異が補正された遺伝子改変細胞を作製する方法であって、前記細胞に、
a) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記細胞内での前記RGNポリペプチドの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
b)配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むCRISPR反復配列を含む、ガイドRNA (gRNA)、または前記細胞内での前記gRNAの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記gRNAをコードするポリヌクレオチド
を導入することを含み、
前記RGNおよびgRNAは前記原因変異のゲノム位置を標的とし、前記原因変異を除去するようゲノム配列を改変する、方法。
345.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様344に記載の方法。
346.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様344に記載の方法。
347.前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に連結されている、実施態様344~346のいずれか1つに記載の方法。
348.前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、実施態様347に記載の方法。
349.前記細胞は動物細胞である、実施態様344~348のいずれか1つに記載の方法。
350.前記細胞は哺乳動物細胞である、実施態様344~348のいずれか1つに記載の方法。
351.前記細胞はイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヒトに由来する、実施態様349に記載の方法。
352.前記遺伝性疾患は一塩基多型により引き起こされる、実施態様349に記載の方法。
353.前記遺伝性疾患はハーラー症候群である、実施態様351に記載の方法。
354.前記gRNAは、原因の前記一塩基多型に近接した領域を標的とするスペーサー配列をさらに含む、実施態様353に記載の方法。
355.疾患を引き起こす不安定なゲノム領域における除去を伴う遺伝子改変細胞を作製する方法であって、前記細胞に、
a) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記細胞内での前記RGNポリペプチドの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
b)配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むCRISPR反復配列を含み、前記不安定なゲノム領域の5'側隣接部を標的とするスペーサー領域をさらに含む、第1のガイドRNA (gRNA)、または前記細胞内での前記第1のgRNAの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記第1のgRNAをコードするポリヌクレオチド、および
c)配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むCRISPR反復配列を含み、前記不安定なゲノム領域の3'側隣接部を標的とするスペーサー領域をさらに含む、第2のガイドRNA (gRNA)、または前記細胞内での前記第2のgRNAの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記第2のgRNAをコードするポリヌクレオチド
を導入することを含み、
前記RGNならびに前記第1および第2のgRNAは前記不安定なゲノム領域を標的とし、前記不安定なゲノム領域の少なくとも一部は除去される、方法。
356.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第1のgRNAおよび前記第2のgRNAの前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様355に記載の方法。
357.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第1のgRNAおよび前記第2のgRNAの前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様355に記載の方法。
358.前記細胞は動物細胞である、実施態様355~357のいずれか1つに記載の方法。
359.前記細胞は哺乳動物細胞である、実施態様355~357のいずれか1つに記載の方法。
360.前記細胞はイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヒトに由来する、実施態様359に記載の方法。
361.前記遺伝性疾患は、フリードライヒ運動失調症またはハンチントン病である、実施態様358に記載の方法。
362.前記第1のgRNAのスペーサー配列は、前記不安定なゲノム領域内またはそれに近接した領域をさらに標的とする、実施態様358に記載の方法。
363.前記第2のgRNAのスペーサー配列は、前記不安定なゲノム領域内またはそれに近接した領域をさらに標的とする、実施態様362に記載の方法。
364.BCL11AのmRNAおよびタンパク質発現が減少した哺乳動物の遺伝子改変造血前駆細胞を作製する方法であって、単離されたヒト造血前駆細胞に、
a) 配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記細胞内での前記RGNポリペプチドの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記RGNポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
b)配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むCRISPR反復配列を含む、ガイドRNA (gRNA)、または前記細胞内での前記gRNAの発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された、前記gRNAをコードするポリヌクレオチド
を導入することを含み、
前記RGNおよびgRNAは前記細胞内で発現され、BCL11Aエンハンサー領域を切断し、それにより前記ヒト造血前駆細胞を遺伝子改変し、BCL11AのmRNAおよび/またはタンパク質発現を減少する、方法。
365.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様364に記載の方法。
366.前記RGNポリペプチドは、配列番号1~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CRISPR反復配列は、配列番号110~119のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様364に記載の方法。
367.前記gRNAは、前記BCL11Aエンハンサー領域内またはそれに近接する領域を標的とするスペーサー配列をさらに含む、実施態様364~366のいずれか1つに記載の方法。
368.前記ガイドRNA、第1のガイドRNA、および第2のガイドRNAはtracrRNAを含む、実施態様344~367のいずれか1つに記載の方法。
369.前記tracrRNAは、配列番号120~128のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様368に記載の方法。
370.前記tracrRNAは、配列番号120~128のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様368に記載の方法。
371.前記tracrRNAは、配列番号120~128のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様368に記載の方法。
372.疾患の治療が必要な対象に有効量の実施態様214~277の医薬組成物を投与することを含む、疾患を治療する方法。
373.前記疾患は原因変異に関連し、前記有効量の前記医薬組成物は前記原因変異を補正する、実施態様372に記載の方法。
374.対象における疾患の治療のための、実施態様1~14、50~52、および111~113のいずれか1つに記載の核酸分子、実施態様15~28、53~110、および114~171のいずれか1つに記載のベクター、実施態様29、266、および270~274のいずれか1つに記載の細胞、実施態様37~49のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド、または実施態様172~213のいずれか1つに記載のシステムの使用。
375.前記疾患は原因変異に関連し、前記治療は前記原因変異を補正することを含む、実施態様374に記載の使用。
376.疾患の治療に有用な医薬品の製造のための、実施態様1~14、50~52、および111~113のいずれか1つに記載の核酸分子、実施態様15~28、53~110、および114~171のいずれか1つに記載のベクター、実施態様29、266、および270~274のいずれか1つに記載の細胞、実施態様37~49のいずれか1つに記載の単離されたRGNポリペプチド、または実施態様172~213のいずれか1つに記載のシステムの使用。
377.前記疾患は原因変異に関連し、有効量の前記医薬品は前記原因変異を補正する、実施態様376に記載の使用。
限定ではなく例示として、以下の実施例を示す。
実施例1.RNA誘導ヌクレアーゼの特定
トランスポザーゼと配列類似性を持つCRISPR関連配列を目的のゲノムで特定した。CRISPR反復配列を、配列内の最小反復数を2に設定してminCED(環境データセットへのCRISPRのマイニング)により確認した。同じコンティグ上の反復配列と共に局在する推定RNA誘導ヌクレアーゼのみをさらなる調査に考慮した。コンティグ上の反復配列と推定cas遺伝子の間の距離に対して、だんだん厳しくなるいくつかのカットオフ値(100 kb、50 kb、20 kb、10 kb)を用いた。5 kbの最終フィルターを選択した。
文献では、活性なシステムにおけるCRISPR反復配列は27~47ヌクレオチド長である。この特徴を用いて、非CRISPR反復特徴をフィルターし除去した。CRISPR配列の新しいスペーサー配列の取得の一部では、配列拡張に適切な化学を提供するために、反復配列の最初のヌクレオチドはGである必要がある。この工程の一部として、コンセンサス反復配列、さらには反復スペーサー配列の向きを予測した。このフィルターを、可能性の高い機能性RGNを優先するために含めた。配列に必要な最小反復数を3に増やした。
一部のタンパク質、主にDNA結合タンパク質は、誤ってCRISPR 遺伝子座として検出される可能性がある反復アミノ酸を一次構造内に有する。反復特徴がタンパク質の内部で発生した推定RGNを切り捨てた。遺伝子間反復のみをさらなる分析に考慮した。
相同体のクラスターを決定するために、タンパク質とコンセンサス反復配列を整列し、それらの系統発生に基づいてクラスターに分類した。反復配列とタンパク質は系統発生的に共クラスター化する傾向があり、相同体のクラスターの概念に重みを与える。タンパク質クラスター情報も表1に示す。cdhitを使用して95%の同一性でタンパク質をクラスター化した。
スペーサー内容を比較することにより菌株の関連性を追跡できる。システムが同じ反復配列および類似のタンパク質配列を有する場合、それらを関連していると言い、それらのスペーサーの内容は、それらの共通の経緯に関する情報を提供できる。同じクラスター内の相同体は、保存された祖先スペーサーを共有する傾向がある。分岐株は、互いに完全に独自のスペーサー内容を有する。クローン分離株は、正確に同じスペーサー内容を完全に共有する。反復配列は保存されているがスペーサーの内容はゲノム間で異なるシステムは、活性である可能性がより高いシステムを促進する可能性があり、これらを優先した。
109の異なるCRISPR関連RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)を確認した。これらを下の表1に記載する。表1は、各RGNの名称、そのアミノ酸配列、由来源、および処理されたcrRNAおよびtracrRNA配列を示す。
CRISPR免疫に必要となり得る潜在的なアクセサリー遺伝子を得るべく、各推定ヌクレアーゼを囲む遺伝子座を検索した。いくつかの推定ヌクレアーゼは、潜在的なアクセサリー遺伝子を持つオペロン構造にあるように思われたが、いずれの遺伝子座もcas1、cas2、cas4、または他の既知のcas遺伝子との相同体を含まなかった(図1)。さらに、いくつかのシステムはヌクレアーゼの末端と重なる反復配列を含み、CRISPR反復配列の上流に期待されるリーダー配列を欠失しており、CRISPR RNA発現の新しい機構が示唆される。
Figure 2023508731000002
Figure 2023508731000003
Figure 2023508731000004
実施例2:タンパク質分析
interproデータベースでドメインを検索して、ヌクレアーゼドメインを予測した。既知のCasタンパク質の分断されたRuvCドメイン上に構築されたhmmヌクレアーゼドメインプロファイルを用いて、分断されたRuvCヌクレアーゼドメインを予測した。予測されたヌクレアーゼ残基は表2に記載されている(ND = 未決定)。
Figure 2023508731000005
Figure 2023508731000006
Figure 2023508731000007
実施例3:ガイドRNAの予測および確認
調査されるRNA誘導ヌクレアーゼシステムを自然に発現する細菌の培養物を対数期中期(OD600約0.600)まで増殖させ、ペレット化し、急速冷凍した。mirVANA miRNA Isolation Kit(Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド)を用いて、ペレットからRNAを単離し、NEBNext Small RNA Library Prep kit(NEB、マサチューセッツ州ビバリー)を用いて、単離されたRNAから配列決定ライブラリーを調製した。ライブラリー調製物を6%ポリアクリルアミドゲルで分画し、200nt未満のRNA種を捕捉して、それぞれcrRNAおよびtracrRNAを検出した。サービス提供者(MoGene、ミズーリ州セントルイス)により、Next Seq 500(High Outputキット)でディープ配列決定(75 bpペアエンド)を実行した。読取りデータをCutadaptで品質トリミングし、Bowtie2を用いて基準ゲノムにマッピングした。カスタムRNAseqパイプラインをPython内に書き、crRNAおよびtracrRNA転写産物を検出した。天然の反復スペーサー配列の配列包括度により、処理されたcrRNA配列の境界を決定した。寛容なBLASTnパラメータを用いて、tracrRNAの反反復部分を特定した。RNA配列決定の深さにより、反反復配列を含む転写産物を特定することによって、処理されたtracrRNAの境界が確認された。RNA折畳みソフトウェアであるRNAfoldによる二次構造予測を用いて、RNAの手動での精選を行った。sgRNAカセットをDNA合成により調製し、全体的に以下のように(5'→3')設計した:処理されたtracrRNAであって、その3'末端で4 bpの非相補的リンカー(AAAG;配列番号136)に作動可能に連結され、その3'末端でcrRNAの処理された反復部分に作動可能に連結され、その3'末端で20~30 bpのスペーサー配列に作動可能に連結されている。他の4 bpの非相補的リンカーも使用してもよい。
インビトロでの検定では、TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit (ThermoFisher)を用いるsgRNAカセットのインビトロでの転写により、sgRNAおよびいくつかのtracrRNAを合成した。crRNAおよびいくつかのtracrRNAを合成的に生成した。
タンパク質の発現および精製のために、C末端のHis10タグに融合した推定RGNを含むプラスミドを構築し、大腸菌(E. coli)のBL21 (DE3)株に形質転換した。カナマイシンを添加したMagic Media自己誘導培地を用いて発現を行った。溶解および清澄の後、固定化金属親和性クロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。ヘパリンクロマトグラフィーを用いてAPG05405のさらなる精製を行った。
tracrRNA配列の上流にT7プロモーターを有するdsDNA鋳型を用いるインビトロ転写(IVT)によって、より長いtracrRNA(配列番号140、145、および147)を生成した。合成されたgBlock鋳型(Integrated DNA Technologies)からIVTの鋳型をPCRで増幅した。より短いtracrおよびcrRNAを合成的に生成した。
RNA結合を示差走査蛍光測定により確認した(Niesen, F.H., H. BerglundおよびM. Vedadi. 2007. Nat. Protoc. 2: 2212-2221)。Annealing Buffer (Synthego、60 mM KCl、6 mM HEPES、pH 7)中で過剰のcrRNAをtracrRNAと混合して、二重RNA複合体を作製した。候補エフェクタータンパク質およびガイドRNA(二重RNA複合体またはsgRNA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Thermo Fisher)で、最終濃度が0.5 μMのエフェクタータンパク質、1 μMのガイドRNAになるよう恒温放置した。これらを室温で20分間恒温放置し、次いでPBSで希釈したSypro Orange色素溶液と1:1で混合した。温度の関数として蛍光強度(FI)を測定して融解曲線を得て、融解曲線の一次導関数(dFI/dT)を計算した。元のヌクレアーゼに対する推定RNPの温度の関数としてのdFI/dTのプロットのずれはRNA結合を示し、これを用いて推定ガイドRNAの組合せを評価した。確認された元のガイドの組合せのうち、全長の推定tracrRNAおよびcrRNAのみが、RGN APG09624およびAPG05405の温度関数に対するdFI/dTの有意なずれを引き起こすことが観察された。この機能における小さなずれは他のタンパク質/RNAの組合せで観察されたが、機能性RNP形成について以前に観察されたものよりも規模が小さく、機能性複合体の形成を示すものと解釈されなかった。ピーク1は、所定の試料について観察された最大のピークに関連付けられた温度を指す。第2のピークが観察された場合、[ピーク2]の欄に示される。複合体の形成に関するデータの解釈は、表3の「結合あり?」の欄に示される。「あり」は、結合が観察されたことを示す。「N/A」は、結合が起こった可能性があるかどうかを判断するのに十分なデータが得られなかったことを示す。
Figure 2023508731000008
実施例4:直接的なssDNA標的切断
精製APG09624、APG05405、および触媒不活化APG05405(配列番号173として示されるdAPG05405)を、単一ガイドRNA(sgRNA)Gsg.2(配列番号194として示される)のCutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液と共に20分間恒温放置し、最終濃度を200 nMのヌクレアーゼおよび400 nMのsgRNAにした。次いで、これらを本明細書でLE111(配列番号195として示される)またはLE113(配列番号196として示される)と呼ばれる5' Cy5標識ssDNA (10 nM)の1.5倍Cutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液に、最終濃度が100 nMのヌクレアーゼになるように加えた。
0分、40分、80分、および120分の時点で、RNaseおよびEDTAをそれぞれ0.1 mg/mLおよび45 mMの最終濃度になるよう加えて試料を反応停止し、氷上に置いた。すべての試料を反応停止した後、50℃で30分間、次に95℃で5分間、恒温放置した。5分の1容量の添加緩衝液(1倍TBE、12%フィコール、7 M尿素)を各反応液に加え、95℃で15分間恒温放置し、5 μlの各反応液を15% TBE-尿素アクリルアミドゲル(Bio-Rad 3450092)で分析した。
時間の関数としての切断産物の定量、ヌクレアーゼ、およびガイドRNAを下の表4に示す。LE111(配列番号195)の配列を陰性対照として用い、一方、LE113(配列番号196)の配列は、ヌクレアーゼに添加されたsgRNAの標的配列を有する。
Figure 2023508731000009
Figure 2023508731000010
ゲル分析により、主にsgRNAにより標的とされ触媒活性のあるヌクレアーゼを含む試料中で切断産物が時間依存的に形成されることが明らかになり、これらのタンパク質のRNA誘導ヌクレアーゼ活性が実証され、重要な触媒残基が正しく定義されているという証拠が示された。APG09624 RNPをLE111と共に恒温放置した場合、いくらかの非特異的活性が観察されるが、これは、dAPG05405およびAPG05405のバッチが追加のクロマトグラフィー工程により精製されたことが原因である可能性があり、したがって、APG09624のバッチは、発現宿主由来のヌクレアーゼの不完全な除去によるある程度のバックグラウンド活性を有する可能性がある。
実施例5:プログラム可能なDNA結合および遺伝子活性化
RGN遺伝子活性化およびgRNA哺乳動物発現プラスミドの構築
哺乳動物発現用のヌクレアーゼ構築物を合成した。サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号152)に制御される、N末端SV40(配列番号149)およびC末端ヌクレオプラスミンNLS配列(それぞれ配列番号149および150)、N末端3xFLAGタグ(配列番号151)、およびCまたはN末端VPR活性化ドメイン(配列番号154;Chavez, et al. 2015, Nature Methods, 12(4): 326-328)を有するヒトコドン最適化APG05405を作製し、哺乳動物発現ベクターに導入した。APG05405の推定触媒活性型および触媒不活性型(「dAPG5405」)の両方を用いた。それぞれヒトRNAポリメラーゼIII U6プロモーター(配列番号153)に制御される、単一のgRNAをコードするガイドRNA発現構築物も作製した。ヌクレアーゼ構築物を下の表5に示す。
Figure 2023508731000011
哺乳動物細胞における遺伝子導入および発現
遺伝子導入の1日前に、1×104個のHEK293T細胞(Sigma)を、10%(容量/容量)ウシ胎児血清(Gibco)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に加え、96ウェルプレートに蒔いた。翌日、細胞が50~60%の集密度になると、100 ngのRGN 発現プラスミドおよび100 ngの単一gRNA発現プラスミドを、製造元の指示に従い、ウェルあたり0.3 μLのリポフェクタミン3000 (Thermo Scientific)を用いて同時遺伝子導入した。48時間の増殖後、Cells-to-Ct One Stepキット(ThermoFisher)を用いて全RNAを回収した。
標的遺伝子発現に関するTaqman検定
HEK細胞では通常は発現が低いが、CRISPR活性化により誘導される可能性がある内因性遺伝子を選択した。この目的のためにRHOXF2およびCD2を選択した。正規化対照としてRHOXF2およびCD2についてはFAM標識プローブ、ACTBについてはVIC標識プローブ(すべてThermoFisherのプローブ)を用いて、TaqMan遺伝子発現検定を実行する。BioRad CFX96 Real Time Thermocyclerで、Cells-to-CT(商標)One Stepキット(Thermofisher)で製造元の指示に従いTaqMan検定を実行する。gRNAが存在しない同様の実験でバックグラウンドを測定する。バックグラウンドに対する遺伝子発現の倍率変化を、2-ΔΔCt法(Livak et al. 2001, Methods, 25(4):402-8)を用いて計算し、発現をACTB転写レベルに対して正規化する。
Figure 2023508731000012
Figure 2023508731000013
実施例6:プログラム可能なDNA結合および塩基編集
オリゴヌクレオチドおよびPCR
以下に記載する全てのPCR反応を、0.5 μMの各プライマーを含む20 μlの反応液中10 μlの2倍Master Mix Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific)を用いて行う。各標的遺伝子を含む大きなゲノム領域を、まずPCR#1プライマーを用いて、98℃で1分;[98℃で10秒;62℃で15秒;72℃で5分]を30サイクル;72℃で5分;12℃で長時間というプログラムで増幅する。次に、このPCR反応液1マイクロリットルを、各ガイドに特異的なプライマー(PCR#2プライマー)を用いて、98℃で1分;[98℃で10秒;67℃で15秒;72℃で30秒]を35サイクル;72℃で5分;12℃で長時間というプログラムで増幅する。PCR#2用のプライマーとしては、Illumina配列決定用のNextera Read 1およびRead 2 Transposase Adapter突出部配列が挙げられる。
RGN塩基編集の構築物およびgRNA哺乳動物発現プラスミド
哺乳動物発現用のヌクレアーゼ構築物を合成する。サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号152)に制御される、N末端SV40(配列番号149)およびC末端ヌクレオプラスミンNLS配列(それぞれ配列番号149および150)、N末端3xFLAGタグ(配列番号151)、およびN末端デアミナーゼ(たとえば、hAPOBEC3A;配列番号177)を有するヒトコドン最適化APG05405を作製し、哺乳動物発現ベクターに導入する。APG05405の触媒不活性型(「dAPG5405」)を用いる。それぞれヒトRNAポリメラーゼIII U6プロモーター(配列番号153)に制御される、単一のgRNAをコードするガイドRNA発現構築物も作製する。
哺乳動物細胞における遺伝子導入および発現
遺伝子導入の1日前に、1×105個のHEK293T細胞(Sigma)を、10%(容量/容量)ウシ胎児血清(Gibco)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に加え、24ウェルプレートに蒔く。細胞が50~60%の集密度になると、500 ngのAPG05405発現プラスミドおよび500 ngの単一gRNA発現プラスミドを、製造元の指示に従い、ウェルあたり1.5 μLのリポフェクタミン3000 (Thermo Scientific)を用いて同時遺伝子導入する。48時間の増殖後、ゲノムDNA単離キット(Machery-Nagel)を用いて、製造元の指示に従い全ゲノムDNAを回収する。
次世代配列決定
PCR#2で得られたIllumina突出部配列を含む生成物で、Illumina 16S Metagenomic Sequencing Libraryの手順に従い、ライブラリー調製を行った。サービス提供者(MoGene)により、Illumina Mi-Seqプラットフォームでディープ配列決定を行う。通常、増幅産物あたり200,000 250 bpペアエンドの読取りデータ(2×100,000の読取りデータ)が生成される。CRISPResso (Pinello, et al. 2016 Nature Biotech, 34:695-697)を用いて読取りデータを分析し、塩基編集率を計算する。出力された整列を手動で精選して、塩基編集ウィンドウを確認し、さらには挿入または削除を確認する。標的にわたる各位置を分析して、各位置で発生する編集率および特定のヌクレオチド変化を決定する。
実施例7:トランスssDNA切断
7.1.トランスDNA切断のための検定条件の決定
精製APG05405を、単一ガイドRNA(sgRNA)のCutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液と共に10分間恒温放置し、最終濃度を50 nMのヌクレアーゼおよび100 nMのsgRNAまたは200 nMのヌクレアーゼおよび400 nMのsgRNAにした。これらのRNP溶液を、ssDNA(標的または不適合な陰性対照ssDNA)(最終濃度10 nM)およびレポーターssDNAプローブ(最終濃度250 nM)の1.5倍Cutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液に加えた。レポータープローブ(TB0125およびTB0089、それぞれ配列番号197および198として示される)は、5'末端に蛍光色素(TB0125については56-FAM、TB0089についてはCy5)、3'末端に消光剤(TB0125については3IABkFQ、TB0089については3IAbRQSp)を含み、任意に内部消光剤を含む(内部消光剤ZENはTB0125にのみ存在する)。レポータープローブが切断されると、蛍光色素が脱消光し、したがって蛍光シグナルが増加する。蛍光強度を監視するために、10 μLの各反応液をCorning低容量384ウェルマイクロプレートに入れ、マイクロプレートリーダー(CLARIOstar Plus)内に30℃で恒温放置した。
この検定に適したパラメータを決定するため、多くの条件を調査した。消光されたプローブ設計または蛍光色素特性の影響があるかどうかを判断するため、2つのそのようなレポーターを各反応に混合物として含めた。それらは、任意の所定の反応液で互いに同じ濃度であった。いずれの場合も、対照または標的ssDNA濃度(それぞれ配列番号199および200として示されるLE201またはLE205)は10 nMであった。下の表7に示されるRNP名はヌクレアーゼおよび標的を意味する。
Figure 2023508731000014
結果を下の表8に示す。
Figure 2023508731000015
Figure 2023508731000016
この実験から、RNP濃度が100 nMの場合、一般にRNP濃度が25 nMの場合よりも高いレポータープローブの切断速度が得られると結論付けられた。一般に、レポーターの切断速度は、レポーター濃度が250 nMまではレポーターオリゴヌクレオチドの濃度が高いほど高く、レポーター濃度をそれ以上高くしても、利点はほとんど見られない。特に、TB0089レポーター(Cy5チャネルで検出)の場合、特に250 nMより高いレポーター濃度では、標的の区別を妨げる非常に高いバックグラウンド活性レベルが存在する。したがって、250 nMを超えるレポーター濃度は有益ではなく、一般に、二重消光TB0125プローブ(FAMチャネルで検出される)は広範囲のレポーター濃度においてバックグラウンド活性に対してより高い比率を提供するため、将来の実験により適していると結論付けられた。
7.2.APG09624トランスDNA切断および非特異的活性に対する精製の影響
精製APG05405およびAPG09624を、以下に示す単一ガイドRNA(sgRNA)の1倍Cutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液と共に37℃で10分間恒温放置し、最終濃度を200 nMのヌクレアーゼおよび400 nMのsgRNAにした。
Figure 2023508731000017
次いで、これらのRNP溶液を、ssDNA(標的または不適合な陰性対照ssDNA)(最終濃度10 nM)およびレポータープローブ(TP0003;配列番号314として示される)(最終濃度250 nM)の1.5倍Cutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液に加えた。レポータープローブは、5'末端に蛍光色素、3'末端に消光剤を含む。レポータープローブが切断されると、蛍光色素が脱消光し、したがって蛍光シグナルが増加する。蛍光強度を監視するために、10 μLの各反応液をCorning 低容量384ウェルマイクロプレートに入れ、マイクロプレートリーダー(CLARIOstar Plus)内に37℃で恒温放置した。
標的配列と共に恒温放置することにより、陰性対照と比較して、時間の関数としての蛍光強度が大幅に増加した。切断速度を便宜上、表10に示すように、時間関数に対する蛍光の直線部分の傾きとして要約する。
Figure 2023508731000018
これらのデータは、APG05405およびAPG09624の両方から形成されたRNPによる標的配列の区別を示す。
7.3.PCR産物によるトランスDNA切断活性化
標的の5'側の縮重ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをPCR増幅して標的配列を作製した。標的dsPCR2およびdsPCR3は、標的配列ACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGG (dsPCR2)およびTGGAATGGGAACTAAAGTAATGG (dsPCR3)(それぞれ、配列番号311および312として示される)を含み、ガイドRNAにコードされる標的の5'側のそれぞれ8 bpおよび5 bpの縮重領域を含んでいた。オリゴ対をアニールし、適切なプライマーを用いてPCR増幅した。さらに、ssDNA標的(上記の標的配列の逆相補体を含むオリゴヌクレオチドCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGT(LE205;配列番号200)およびCCATTACTTTAGTTCCCATTCCA(LE501;配列番号174))を実験に含めた。
ヌクレアーゼおよびsgRNAをそれぞれ0.5 μMおよび1 μMで1倍NEBuffer2 (New England Biolabs)中で恒温放置し、20分間室温で恒温放置して、RNP溶液を形成した。
Figure 2023508731000019
5'にTEX615標識、3'にIowa Black FQ消光剤を有する1.5 μMのレポーター、および100 nMの各PCR産物またはssDNAオリゴヌクレオチドLE501もしくはLE205(それぞれ、配列番号174および200として示される;LE501は5'にFAM蛍光色素を含んでいた)を含む1.5倍NEBuffer 2中で切断反応を行った。レポータープローブが切断されると、蛍光色素が脱消光し、したがって蛍光シグナルが増加する。蛍光強度を監視するために、10 μLの各反応液をCorning 低容量384ウェルマイクロプレートに入れ、マイクロプレートリーダー(CLARIOstar Plus)内に37℃で恒温放置した。動態分析の結果を表12に示す。
Figure 2023508731000020
これらの結果は、ssDNAの非配列特異的切断の標的配列特異的な活性化を示す。dsDNA PCR産物および標的ssDNAオリゴヌクレオチドはいずれも、この活性を誘導することができた。
7.4.誘導された非特異的ssDNA切断によるPAM決定
所定のシステムがDNA結合、改変、または切断のためにPAMを必要とする場合、RNPと共にDNA標的を含む三元複合体(PAMライブラリーを含む)の分離、およびそれから回収されるDNAの配列決定を用いてPAM配列を特定できる。多くの方法、たとえば免疫プルダウン、固定化金属親和性樹脂(Ni-NTAアガロースなど)による捕捉、またはサイズ排除クロマトグラフィーによる分離により、この複合体を捕捉できる。
あるいは、固定された標的に隣接して異なるPAM配列を有するDNA断片の並列ライブラリーを作製する。推定ヌクレアーゼおよび適切なガイドRNA(固定された標的を標的とする単一ガイドまたは二重RNAガイド)を含むRNPをライブラリー内の各断片と共に恒温放置し、DNA断片の電気泳動移動度のシフト、サイズ排除液体クロマトグラフィー、またはいずれかの成分に親和性を持つ固相担体を用いる共沈を用いて、結合を評価する。
7.5.並列プラスミドDNAライブラリーを用いるPAM決定
標的配列ACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGG(配列番号313として示される)を含み、その前に8 bpの縮重配列(配列番号176として示されるNNNNNNNN)を有するプラスミドライブラリーを作製する。形質転換受容性の細胞に形質転換し、選択培地を含む寒天プレートに蒔くと、この反応物の形質転換により生じる各コロニーは原則としてクローンプラスミドDNA配列に対応し、したがって、単一コロニーに由来する培養物からのプラスミドDNAの調製物は、元のライブラリーから採取される特有のプラスミド調製物である。96個のコロニーの試料採取によりプラスミド調製物を得る。これらの調製物を個々にサンガー配列決定に供し、それらのPAM配列を確認する。
精製APG05405を、単一ガイドRNA(sgRNA)Gsg.2(配列番号194として示される)の1倍Cutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液と共に室温で20分間恒温放置し、最終濃度を200 nMのヌクレアーゼおよび400 nMのsgRNAにする。
これらのRNP溶液を、最終濃度100 nMになるように、プラスミドDNA、ならびに蛍光色素および消光剤を含むssDNAレポーター鎖の50 nMの1.5倍Cutsmart緩衝液(New England Biolabs B7204S)溶液に加えた。時間の関数としての蛍光強度を監視するために、10 μLの各反応液をCorning低容量384ウェルマイクロプレートに入れ、マイクロプレートリーダー(CLARIOstar Plus)内に37℃で恒温放置する。各ウェルは、特定のPAM配列による個々の消化反応に対応する。データ収集が完了すると、蛍光の増加率を決定する。蛍光増加率の高いウェルに対応する配列を分析して、コンセンサスPAM配列を構築する。決定的でない場合は、追加のライブラリーを作成し評価してもよい。
実施例8:診断としてのssDNA切断の使用
これらのヌクレアーゼは、標的DNA配列の存在下で光学的に検出可能なシグナルを生成する能力を持つため、遺伝性疾患または感染症の病原体(細菌、ウイルス、または真菌など)を検出するための診断装置への実装の有用性の見込みがある。
診断手順は、試験される試料からの核酸の単離または増幅を含んでもよい。試料によっては核酸の単離または精製を行わずに使用するのが適切である場合もある。というのも、核酸は増幅(PCRなど)なしで検出できる十分な量で試料中に存在するか、検出またはシグナル生成を妨げる物質を含まない場合があるからである。
他の実施例に記載のように形成されたRNPを、その後、レポーター、たとえば先の例で用いられた蛍光色素および消光剤改変ssDNAオリゴヌクレオチド、または切断時に目視もしくは他の方法で容易に検出できるシグナルを生成する他の種類のいくつかのssDNA基質と共に試料(または前の段落に記載の処理済み試料)に露出する。蛍光色素-消光剤結合DNAオリゴヌクレオチド(前述の例のとおり)を用いる場合、先の例で説明したように、蛍光光度計を用いてこれらを検出できる。検出を簡素にするために、上記の動態検定の代わりにエンドポイント検定を行ってもよい。これは、検定を一定時間実行し、この経過時間の最後に陽性および陰性対照と比較して読み取ってもよいという意味である。
これらの試薬を、所定の病原体または特定の核酸配列(個体の罹患した対立遺伝子など)を、ほとんど機器を用いずに検出できる側方流動試験装置に統合してもよい。この検定では、ssDNAレポーターを抗体または親和性試薬の捕捉に適した複数の分子、たとえばフルオレセイン、ビオチン、および/またはジゴキシゲニンに結合する。
実施例8.1.COVID19診断検定
標準的な習慣に従って汎用性輸送用培地(UTM)で鼻咽頭拭取り検体を用いて患者から試料を採取し、RNAを抽出する。Broughton et al 2020 (Nat. Biotechnol. 38: 870-874)と同様に、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)を用いて遺伝子材料を増幅する。実施態様によっては、RT-LAMPによって生成される一本鎖DNA(ssDNA)は、本明細書に開示のRGNによるPAM非依存的検出に十分であり得る。実施態様によっては、RT-LAMPは、標的鎖にのみホスホロチオアートプライマーによる増幅を用いてssDNAを生成し、非標的鎖のT7エキソヌクレアーゼ消化は可能である。
Broughton et al 2020と同様に、適切なプライマーを用いてRT-LAMP増幅を行い、SARS-CoV2ゲノムのN遺伝子およびE遺伝子、さらには試料採取および調製のための品質管理チェックとしてのヒトRNase Pを増幅する。2つのLAMP内部プライマー(一般にFIPまたはBIPと呼ばれる)のうち1つは、ホスホロチオアート基を含む。完了したPCR反応をT7エキソヌクレアーゼで処理すると、ホスホロチオアートプライマーから伸長したssDNAは溶液中に存在する主要な種である。この配列に対するガイドを、上記の蛍光検定を用いて特異的かつ効率的な活性化について評価する。特異性については、検出スキームを他のコロナウイルスの相同遺伝子、たとえばHCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、MERS-CoV、および/またはSARS-CoVに対して試験し、交差反応性がないことを保証してもよい。この検定を、FAMおよびビオチンを含むオリゴヌクレオチドを用いることにより側方流動検定に変換してもよい。

Claims (196)

  1. RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
    前記RGNポリペプチドは、標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNA (gRNA)と結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合でき、かつ
    RGNポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに対して異種のプロモーターに作動可能に連結されている、核酸分子。
  2. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
  3. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
  4. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、請求項4に記載の核酸分子。
  6. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、請求項6に記載の核酸分子。
  8. 前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、請求項7に記載の核酸分子。
  9. 前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、請求項7に記載の核酸分子。
  10. 前記RGNポリペプチドは塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、請求項6~9のいずれか一項に記載の核酸分子。
  11. 前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、請求項10に記載の核酸分子。
  12. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項6~11のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 前記RGNポリペプチドは1つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の核酸分子。
  14. 前記RGNポリペプチドは、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1~13のいずれか一項に記載の核酸分子。
  15. 請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
  16. 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な前記gRNAをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項15に記載のベクター。
  17. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記gRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項16に記載のベクター。
  18. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記gRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項16に記載のベクター。
  19. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記gRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項16に記載のベクター。
  20. 前記gRNAはtracrRNAを含む、請求項16に記載のベクター。
  21. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項20に記載のベクター。
  22. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項20に記載のベクター。
  23. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むtracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記gRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項20に記載のベクター。
  24. 前記gRNAは単一ガイドRNAである、請求項20~23のいずれか一項に記載のベクター。
  25. 前記gRNAは二重ガイドRNAである、請求項20~23のいずれか一項に記載のベクター。
  26. 請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項15~25のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
  27. 請求項26に記載の細胞を、RGNポリペプチドが発現する条件で培養することを含む、RGNポリペプチドの作製方法。
  28. 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子を細胞に導入すること、ならびに
    前記細胞を前記RGNポリペプチドが発現する条件で培養することを含み、
    前記RGNポリペプチドは、標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNA (gRNA)に結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合する、RGNポリペプチドの作製方法。
  29. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の方法。
  30. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の方法。
  31. 前記RGNポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項28~30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記細胞は、前記RGNポリペプチドに結合してRGNリボ核タンパク質複合体を形成する1つ以上のガイドRNAをさらに発現する、請求項28~30のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記RGNリボ核タンパク質複合体を精製することをさらに含む、請求項32に記載の方法。
  34. 単離されたRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドであって、前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
    前記RGNポリペプチドは、標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNA (gRNA)に結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合できる、RGNポリペプチド。
  35. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  36. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  37. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項34~36のいずれか一項に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  38. 前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、請求項37に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  39. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項34~36のいずれか一項に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  40. 前記RGNポリペプチドは、結合時に前記標的DNA配列を切断できる、請求項39に記載の単離RGNポリペプチド。
  41. 前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、請求項40に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  42. 前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、請求項40に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  43. 前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、請求項39~42のいずれか一項に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  44. 前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、請求項43に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  45. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項34~44のいずれか一項に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  46. 前記RGNポリペプチドは、1つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項34~45のいずれか一項に記載の単離されたRGNポリペプチド。
  47. DNA分子の標的DNA配列を結合させるためのシステムであって、
    a) 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な1つ以上のガイドRNA、または前記1つ以上のガイドRNA (gRNA)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド、ならびに
    b) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記RGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    前記1つ以上のガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および前記RGNポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも1つは、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモーターに作動可能に連結され、かつ
    前記1つ以上のガイドRNAは、前記RGNポリペプチドを前記DNA分子の前記標的DNA配列に結合させるために、前記RGNポリペプチドと複合体を形成できる、システム。
  48. DNA分子の標的DNA配列を結合させるためのシステムであって、
    a) 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な1つ以上のガイドRNA、または前記1つ以上のガイドRNA (gRNA)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド、ならびに
    b) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチドを含み、
    前記1つ以上のガイドRNAは、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、かつ
    前記1つ以上のガイドRNAは、前記RGNポリペプチドを前記DNA分子の前記標的DNA配列に結合させるために、前記RGNポリペプチドと複合体を形成できる、システム。
  49. 前記1つ以上のガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも1つは、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項48に記載のシステム。
  50. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項47~49のいずれか一項に記載のシステム。
  51. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項47~49のいずれか一項に記載のシステム。
  52. 前記RGNポリペプチドと前記1つ以上のガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、請求項47~51のいずれか一項に記載のシステム。
  53. 前記標的DNA配列は真核生物の標的DNA配列である、請求項47~51のいずれか一項に記載のシステム。
  54. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項47~53のいずれか一項に記載のシステム。
  55. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項47~53のいずれか一項に記載のシステム。
  56. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項47~53のいずれか一項に記載のシステム。
  57. 前記1つ以上のガイドRNAはtracrRNAを含む、請求項47~53のいずれか一項に記載のシステム。
  58. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項57に記載のシステム。
  59. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項57に記載のシステム。
  60. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項57に記載のシステム。
  61. 前記1つ以上のガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、請求項57~60のいずれか一項に記載のシステム。
  62. 前記1つ以上のガイドRNAは二重ガイドRNAである、請求項57~60のいずれか一項に記載のシステム。
  63. 前記標的DNA配列は細胞内にある、請求項47~62のいずれか一項に記載のシステム。
  64. 前記細胞は真核細胞である、請求項63に記載のシステム。
  65. 前記真核細胞は植物細胞である、請求項64に記載のシステム。
  66. 前記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項64に記載のシステム。
  67. 前記真核細胞は昆虫細胞である、請求項64に記載のシステム。
  68. 前記細胞は原核細胞である、請求項63に記載のシステム。
  69. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項47~68のいずれか一項に記載のシステム。
  70. 前記1つ以上のガイドRNAは、転写されると前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、かつ前記ガイドRNAは、前記RGNポリペプチドと複合体を形成して前記標的DNA配列の切断を導ける、請求項69に記載のシステム。
  71. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項47~68のいずれか一項に記載のシステム。
  72. 前記1つ以上のガイドRNAは、転写されると前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能であり、かつ前記ガイドRNAは、前記RGNポリペプチドと複合体を形成して前記標的DNA配列の切断を導ける、請求項71に記載のシステム。
  73. 前記RGNポリペプチドは二本鎖切断を起こすことができる、請求項72に記載のシステム。
  74. 前記RGNポリペプチドは一本鎖切断を起こすことができる、請求項72に記載のシステム。
  75. 前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に連結されている、請求項71~74のいずれか一項に記載のシステム。
  76. 前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼである、請求項75に記載のシステム。
  77. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項71~76のいずれか一項に記載のシステム。
  78. 前記RGNポリペプチドは、1つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項47~77のいずれか一項に記載のシステム。
  79. 前記RGNポリペプチドは、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項47~78のいずれか一項に記載のシステム。
  80. 前記1つ以上のガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは1つのベクターに配置されている、請求項47~79のいずれか一項に記載のシステム。
  81. 1つ以上のドナーポリヌクレオチド、または前記1つ以上のドナーポリヌクレオチドをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項47~80のいずれか一項に記載のシステム。
  82. 請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項15~25のいずれか一項に記載のベクター、請求項26に記載の細胞、請求項34~46のいずれか一項に記載の単離されたRGNポリペプチド、および請求項47~81のいずれか一項に記載のシステム、ならびに医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  83. DNA分子の標的DNA配列を結合させる方法であって、請求項47~81のいずれか一項に記載のシステムを前記標的DNA配列または前記標的DNA配列を含む細胞に送達することを含む、方法。
  84. 前記RGNポリペプチドまたは前記ガイドRNAは、検出可能な標識をさらに含むことで前記標的DNA配列の検出を可能にする、請求項83に記載の方法。
  85. 前記ガイドRNAまたは前記RGNポリペプチドは、発現調節因子をさらに含むことで前記標的DNA配列または前記標的DNA配列による転写制御下にある遺伝子の発現を調節する、請求項83に記載の方法。
  86. DNA分子の標的DNA配列を切断する方法であって、請求項47~81のいずれか一項に記載のシステムを前記標的DNA配列または前記標的DNA配列を含む細胞に送達することを含む、方法。
  87. 改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列への異種DNAの挿入を含む、請求項86に記載の方法。
  88. 改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列からの少なくとも1つのヌクレオチドの欠失を含む、請求項86に記載の方法。
  89. 改変された前記標的DNA配列は、前記標的DNA配列中の少なくとも1つのヌクレオチドの変異を含む、請求項86に記載の方法。
  90. DNA分子の標的DNA配列を結合させる方法であって、
    a) インビトロで、
    i) 前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能な1つ以上のガイドRNAと
    ii) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRGNポリペプチド
    をRGNリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件で混合してRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)リボヌクレオチド複合体を構築すること、ならびに
    b) 前記標的DNA配列または前記標的DNA配列を含む細胞を、インビトロで構築された前記RGNリボヌクレオチド複合体に接触させること
    を含み、前記1つ以上のガイドRNAは前記標的DNA配列とハイブリダイズして前記RGNポリペプチドを前記標的DNA配列に結合させる、方法。
  91. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項90に記載の方法。
  92. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項90に記載の方法。
  93. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項92に記載の方法。
  94. 前記RGNポリペプチドまたは前記ガイドRNAは、検出可能な標識をさらに含むことで前記標的DNA配列の検出を可能にする、請求項90~93のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記ガイドRNAまたは前記RGNポリペプチドは、発現調節因子をさらに含むことで前記標的DNA配列の発現の調節を可能にする、請求項90~93のいずれか一項に記載の方法。
  96. DNA分子の標的DNA配列を切断および/または改変する方法であって、前記DNA分子を
    a) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むRNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、ならびに
    b) (a)の前記RGNを前記標的DNA配列に向けることができる1つ以上のガイドRNA
    と接触させることを含み、
    前記1つ以上のガイドRNAは前記標的DNA配列とハイブリダイズし、これにより前記RGNポリペプチドを前記標的DNA配列に結合させ、かつ前記標的DNA配列の切断および/または改変が起こる、方法。
  97. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項96に記載の方法。
  98. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項96に記載の方法。
  99. 前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、請求項98に記載の方法。
  100. 前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、請求項98に記載の方法。
  101. 前記RGNポリペプチドは、塩基編集ポリペプチドに作動可能に連結されている、請求項98~100のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記塩基編集ポリペプチドはデアミナーゼを含む、請求項101に記載の方法。
  103. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項98~102のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記改変された標的DNA配列は、前記標的DNA配列への異種DNAの挿入を含む、請求項96~103のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記改変された標的DNA配列は、前記標的DNA配列からの少なくとも1つのヌクレオチドの欠失を含む、請求項96~103に記載の方法。
  106. 前記改変された標的DNA配列は、前記標的DNA配列中の少なくとも1つのヌクレオチドの変異を含む、請求項96~103に記載の方法。
  107. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項90~106のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項90~106のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記RGNポリペプチドと前記1つ以上のガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、請求項90~108のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記標的DNA配列は真核生物の標的DNA配列である、請求項90~109のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項90~110のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項90~110のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項90~110のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記1つ以上のガイドRNAはtracrRNAを含む、請求項90~110のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項114に記載の方法。
  116. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項114に記載の方法。
  117. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項114に記載の方法。
  118. 前記1つ以上のガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、請求項114~117のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記1つ以上のガイドRNAは二重ガイドRNAである、請求項114~117のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記標的DNA配列は細胞内にある、請求項83~119のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記細胞は真核細胞である、請求項120に記載の方法。
  122. 前記真核細胞は植物細胞である、請求項121に記載の方法。
  123. 前記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項121に記載の方法。
  124. 前記真核細胞は昆虫細胞である、請求項121に記載の方法。
  125. 前記細胞は原核細胞である、請求項120に記載の方法。
  126. 請求項96~119のいずれか一項に記載の方法に従って改変された標的DNA配列を含む細胞。
  127. 前記細胞は真核細胞である、請求項126に記載の細胞。
  128. 前記真核細胞は植物細胞である、請求項127に記載の細胞。
  129. 請求項128に記載の細胞を含む植物。
  130. 請求項128に記載の細胞を含む種子。
  131. 前記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項127に記載の細胞。
  132. 前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項131に記載の細胞。
  133. 前記ヒト細胞は免疫細胞である、請求項132に記載の細胞。
  134. 前記ヒト細胞は幹細胞である、請求項133に記載の細胞。
  135. 前記幹細胞は誘導多能性幹細胞である、請求項134に記載の細胞。
  136. 前記真核細胞は昆虫細胞である、請求項127に記載の細胞。
  137. 前記細胞は原核細胞である、請求項126に記載の細胞。
  138. 請求項127および131~135のいずれか一項に記載の細胞ならびに医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  139. 試料中のDNA分子の標的DNA配列を検出するためのキットであって、
    a) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNAと結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合してそれを切断できる、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、または前記RGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
    b) 前記ガイドRNAまたは前記ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに
    c) 前記ガイドRNAとハイブリダイズしない検出用一本鎖DNA(ssDNA)
    を含む、キット。
  140. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項139に記載のキット。
  141. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項139に記載のキット。
  142. 前記ガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および前記RGNポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも1つは、前記ヌクレオチド配列と異種であるプロモーターと作動可能に連結されている、請求項139~141のいずれか一項に記載のキット。
  143. 前記RGNポリペプチドと前記1つ以上のガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、請求項139~142のいずれか一項に記載のキット。
  144. 前記標的DNA配列は真核生物の標的DNA配列である、請求項139~142のいずれか一項に記載のキット。
  145. 前記検出用ssDNAは、蛍光色素と消光剤の対を含む、請求項139~144のいずれか一項に記載のキット。
  146. 前記検出用ssDNAは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を含む、請求項139~144のいずれか一項に記載のキット。
  147. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項139~146のいずれか一項に記載のキット。
  148. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項139~146のいずれか一項に記載のキット。
  149. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項139~146のいずれか一項に記載のキット。
  150. 前記1つ以上のガイドRNAはtracrRNAを含む、請求項139~146のいずれか一項に記載のキット。
  151. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項150に記載のキット。
  152. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項150に記載のキット。
  153. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記1つ以上のガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項150に記載のキット。
  154. 前記1つ以上のガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、請求項150~153のいずれか一項に記載のキット。
  155. 前記1つ以上のガイドRNAは二重ガイドRNAである、請求項150~153のいずれか一項に記載のキット。
  156. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項139~155のいずれか一項に記載のキット。
  157. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項139~155のいずれか一項に記載のキット。
  158. 前記RGNポリペプチドによる切断は二本鎖切断を起こす、請求項157に記載のキット。
  159. 前記RGNポリペプチドによる切断は一本鎖切断を起こす、請求項157に記載のキット。
  160. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項157~159のいずれか一項に記載のキット。
  161. 試料中のDNA分子の標的DNA配列を検出する方法であって、
    a) 前記試料を、
    i) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNAと結合する際にRNAに誘導されて配列特異的にDNA分子の前記標的DNA配列に結合してそれを切断できる、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、
    ii) 前記ガイドRNA、ならびに
    iii) 前記ガイドRNAとはハイブリダイズしない検出用一本鎖DNA (ssDNA)
    と接触させること、ならびに
    b) 前記RGNによる検出用ssDNAの切断により発生する検出可能なシグナルを測定して前記標的DNA配列を検出すること
    を含む、方法。
  162. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項161に記載の方法。
  163. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項161に記載の方法。
  164. 前記試料は、細胞溶解物に由来のDNA分子を含む、請求項161~163に記載の方法。
  165. 前記試料は細胞を含む、請求項161~163のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記細胞は真核細胞である、請求項165に記載の方法。
  167. 前記標的DNA配列を含むDNA分子は、RNAを含む試料中に存在するRNA鋳型分子の逆転写により生成される、請求項161~163のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記RNA鋳型分子はRNAウイルスである、請求項167に記載の方法。
  169. 前記RNAウイルスはコロナウイルスである、請求項168に記載の方法。
  170. 前記コロナウイルスはコウモリSARS様コロナウイルス、SARS-CoV、またはSARS-CoV-2である、請求項169に記載の方法。
  171. 前記RNAを含む試料は、細胞を含む試料に由来する、請求項167~170のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記検出用ssDNAは、蛍光色素と消光剤の対を含む、請求項161~171のいずれか一項に記載の方法。
  173. 前記検出用ssDNAは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を含む、請求項161~171のいずれか一項に記載の方法。
  174. 工程a)の接触の前またはそれと同時に前記試料中の核酸を増幅することをさらに含む、請求項161~173のいずれか一項に記載の方法。
  175. 一本鎖DNA (ssDNA)を切断する方法であって、標的DNA配列を含むDNA分子および複数の非標的ssDNAを含む核酸の集合を、
    a) 配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記標的DNA配列にハイブリダイズ可能なガイドRNAと結合する際にRNAに誘導されて配列特異的に前記標的DNA配列に結合してそれを切断できる、RNA誘導ヌクレアーゼ(RGN)ポリペプチド、ならびに
    b) 前記ガイドRNA
    と接触させることを含み、
    前記RGNポリペプチドは、前記複数の非標的ssDNAを切断する、方法。
  176. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項175に記載の方法。
  177. 前記RGNポリペプチドは、配列番号2、4、1、3、および5~109のいずれか1つに対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項175に記載の方法。
  178. 前記核酸の集合は細胞溶解物中にある、請求項175~177のいずれか一項に記載の方法。
  179. 前記標的DNA配列を含むDNA分子は、RNA鋳型分子の逆転写により生成される、請求項175~178のいずれか一項に記載の方法。
  180. 前記RGNポリペプチドと前記ガイドRNAは、自然では互いに複合体化されていることは見出されない、請求項161~179のいずれか一項に記載の方法。
  181. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項161~180のいずれか一項に記載の方法。
  182. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ガイドRNAは、配列番号116に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項161~180のいずれか一項に記載の方法。
  183. 前記RGNポリペプチドは、配列番号11に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ガイドRNAは、配列番号116に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項161~180のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記ガイドRNAはtracrRNAを含む、請求項161~180のいずれか一項に記載の方法。
  185. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも90%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも90%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項184に記載の方法。
  186. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号111に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号113に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号110に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号112に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号114に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号117に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号118に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して少なくとも95%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号119に対して少なくとも95%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項184に記載の方法。
  187. 前記tracrRNAは、
    a) 配列番号121に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号111に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号2に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    b) 配列番号123に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号113に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号4に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    c) 配列番号120に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号110に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号1に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    d) 配列番号122に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号112に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号3に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    e) 配列番号124に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号114に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号5に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    f) 配列番号125に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号115に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号6に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    g) 配列番号126に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号117に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号12に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、
    h) 配列番号127に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号118に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号13に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA、および
    i) 配列番号128に対して100%の配列同一性を有するtracrRNAであって、前記ガイドRNAは、配列番号119に対して100%の配列同一性を有するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAをさらに含み、前記RGNポリペプチドは配列番号16に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、tracrRNA
    からなる群から選択される、請求項184に記載の方法。
  188. 前記ガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)である、請求項184~187のいずれか一項に記載の方法。
  189. 前記ガイドRNAは二重ガイドRNAである、請求項184~187のいずれか一項に記載の方法。
  190. 前記標的DNA配列は、一本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項161~189のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記標的DNA配列は、二本鎖である前記DNA分子の領域内にある、請求項161~189のいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記RGNポリペプチドによる前記標的DNA配列の切断は二本鎖切断を起こす、請求項191に記載の方法。
  193. 前記RGNポリペプチドによる前記標的DNA配列の切断は一本鎖切断を起こす、請求項191に記載の方法。
  194. 前記標的DNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接して位置する、請求項191~193のいずれか一項に記載の方法。
  195. 疾患の治療が必要な対象に有効量の請求項82~138の医薬組成物を投与することを含む、疾患を治療する方法。
  196. 前記疾患は原因変異に関連し、前記有効量の前記医薬組成物は前記原因変異を補正する、請求項195に記載の方法。
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