PL240801B1 - Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie - Google Patents

Description

PL 240 801 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie.

Bakteriofag TP-84 infekuje niektóre gatunki termofilne bakterii Bacillus (nowa nomenklatura: Geobacillus). Polinukleotydy według wynalazku mogą być stosowane do modyfikacji genetycznych genomu TP-84, polegających w szczególności na klonowaniu, ekspresji lub modyfikacji genów TP-84, zwłaszcza mających zastosowanie w technologiach biologii i biotechnologii molekularnej, medycynie oraz przemyśle. Termofilne geny bakteriofagowe, kodujące białka kapsydu mogą znaleźć zastosowanie do konstrukcji systemów phage display’, a geny kodujące helikazy lub białka wiążące DNA mogą służyć do usprawnienia reakcji powielania kwasów nukleinowych, konstrukcji szczepionek, adjuwantów, biosensorów, systemów wychwytu jonów metali lub terapii fagowej. Ponadto ujawniono sposób uzyskiwania klonów wspomnianych białek oraz wektory DNA do realizacji tego sposobu.

Saunders i Campbell, Biochemistry 4:2836-2844 (1965) ujawniają charakterystykę DNA bakteriofaga TP-84, infekującego bakterię Bacillus stearothermophilus szczep 10. DNA kodujące genom bakteriofaga ma długość 13,6 μm, masę cząsteczkową 22,4-22,6 mln Da i zawiera 42% par GC.

Saunders i Campbell, Journal of Bacteriology 91:340-348 (1966) ujawniają odkrycie i charakterystykę termofilnego bakteriofaga TP-84, infekującego bakterię Bacillus stearothermophilus szczep 10. Ujawniono, że TP-84 jest bakteriofagiem litycznym dla 3 spośród 24 testowanych szczepów Bacillus stearothermophilus w zakresie temperatur 43°C do 76°C, wykazujących czas eklipsy 22 do 24 minut. Ujawniono, że kasyd TP-84 zawiera wielościenną (heksagonalną) główkę o wymiarach 53 χ 30 nm oraz ogonek o długości 130 nm i 3-5 nm szerokości. Ujawniono, że całkowita masa cząsteczkowa TP-84 wynosi ok. 50 mln Daltonów oraz jego genom zawiera 42% par zasad GC.

Egbert i Mitchell, Journal of Virology 1:610-616 (1967) ujawnili odkrycie i charakterystykę termofilnego bakteriofaga Τφ3 infekującego Bacillus stearothermophilus ATCC8005 w temperaturze 60°C. Bakteriofag ten wykazuje termostabilność w zakresie temperatur do 75°C.

Bassel i współpracownicy Journal of Virology 7:663-672 (1971) ujawnili wrażliwość bakteriofaga TP-84 na dysocjację pod wpływem czynników chelatujących, w szczególności EDTA oraz fosforany, oraz powstałe w wyniku dysocjacji substruktury bakteriofagowe: główki, ogonki, wolne DNA i cienie bakteriofagowe.

Epstein i Campbell, Applied Microbiology 29:219-223 (1975) ujawniają sposób wydajnej produkcji i oczyszczanie termofilnego bakteriofaga TP-84. Ujawniono warunki hodowli gospodarza bakteryjnego oraz infekcji bakteriofagiem, pozwalające na uzyskanie miana bakteriofagów 5 χ 10¹¹/ml, polegające na zastosowaniu wzbogaconego składu pożywki, zapobiegającego produkcji przetrwalników, pH 6,5, temperatury 58°C oraz dodatku chlorku magnezu i prowadzeniu procesu w fermentorze stosując środowisko aerobowe. Ujawniono sposób oczyszczania bakteriofaga TP-84, polegający na precypitacji glikolem polietylenowym oraz ultrawirowaniem w gradiencie chlorku cezu.

Sharpy i współpracownicy, Journal of General Microbiology 132:1709-1722 (1986) ujawniają izolowanie i charakterystykę 24 bakteriofagów, infekujących obligatoryjnie termofilne szczepy bakterii Bacillus, izolowane z różnorodnych źródeł: m.in. kompostu, gleby, gnijącego siana. Ujawniono powszechność infekcyjności bakterii Bacillus przez bakteriofagi, o różnorodnych rozmiarach, morfologii i biochemii: od cylindrycznych do wielościennych z ogonkiem długości 15-500 nm, a ich genomowe DNA wykazywało różnice wielkości fragmentów podczas analizy restrykcyjnej. Ujawniono, że większość bakteriofagów była stabilna w temperaturze 50°C przez 4-5 godzin, natomiast w temperaturze 70°C w ciągu 2 godzin miana bakteriofagów obniżały się 10²-10⁷-krotnie.

Blanc i współpracownicy, Int J Syst Bacteriol. 47:1246-1248 (1997) ujawniają metodę identyfikacji heterotroficznych, termofilnych, tworzących przetrwalniki bakterii, izolowanych z kompostu. Ujawniają sposób profilowania analizą restrykcyjną fragmentów DNA genomowego, kodującego 16S rDNA, powielonego metodą Polymerase Chain Reaction (PCR), pozwalający na określenie i różnicowanie gatunków i szczepów bakterii Bacillus sp. Ujawniono wyniki analiz powielenia i sekwencjonowania 1409 par zasad, kodujących 16S rDNA bakteriofaga TP-84 i zdeponowano je w GeneBank pod numerem dostępu AJ002154.

Golec i współpracownicy, Journal of Microbiological Methods 84:486-489 (2011) ujawniają metodę przechowywania bakteriofagów. Przedstawiony sposób jest uniwersalny i pozwala na długoterminowe przechowywanie bakteriofagów w postaci zainfekowanych komórek bakteryjnych, zamrożo

PL 240 801 B1 nych w temperaturze -80°C. W tych warunkach utrata żywotności komórek bakteryjnych jest niewielka, a przeżywalność znajdujących się wewnątrz komórek bakteriofagów wysoka.

Lee i współpracownicy, International Journal of Nanomedicine 8:3917-3925 (2013) ujawniają w pracy przeglądowej rozwinięcia technologii phage display’ w kierunku konstrukcji biosensorów, opartych na zabiegach inżynierii genetycznej, przeprowadzonych na genomach bakteriofagów.

Pouyanfard i współpracownicy, PLOS One 7:e49539 (2012) ujawniają konstrukcję zmodyfikowanego genetycznie bakteriofaga T7, eksponującego w systemie phage display’ immunodominujące epitopy pochodzące ze szczurzej onkoproteiny HER2/neu. Ujawniono, że tak skonstruowana chimeryczna nanocząstka bakteriofaga T7 wykazuje wysoką immunogenność w modelowych liniach myszy BALB/c, wykazując działanie przeciwnowotworowe zarówno profilaktyczne jak i terapeutyczne, tym samym stanowiąc prototyp szczepionki przeciwnowotworowej.

Nadal problemem jest łatwe uzyskiwanie użytecznych praktycznie konstruktów genetycznych, opartych na genach termofilnych bakteriofagów, w szczególności bakteriofaga TP-84.

Celem wynalazku jest rozwiązanie tego problemu i zaproponowanie sposobu, który pozwalałby na łatwe uzyskiwanie tego typu konstruktów. W szczególności, celem wynalazku jest dostarczenie konstruktów typu phage display’, eksponujących na powierzchni kapsydu polipeptydy i białka naturalne oraz uzyskane w wyniku zabiegów inżynierii genetycznej, przykładowo - sztuczne białka poliepitopowe. Konstrukty takie mogą tworzyć nanocząstki biologiczne, stosowane jako szczepionki, adjuwanty, biosensory, układy wychwytu jonów metali, elementy terapii fagowej. Kolejnym celem wynalazku są klonowane i eksprymowane geny, kodujące białka użyteczne w biologii i biotechnologii molekularnej, medycynie i przemyśle, w szczególności helikazy i białka wiążące DNA, usprawniające reakcje powielania kwasów nukleinowych.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 2.

Przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd kodujący gen rekombinantowy składający się z polinukleotydu kodującego białko bakteriofaga TP-84 określone powyżej oraz polinukleotydu kodującego sześć reszt histydyny, korzystnie posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 4.

Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera origin replikacji, korzystnie pBR322 ori, gen oporności na antybiotyk, korzystnie ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie BAD operonu arabinozowego, gen represora, korzystnie araC, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji oraz połączony z nimi operacyjnie polinukleotyd kodujący białko określony powyżej.

Korzystnie, wektor ekspresyjny według wynalazku posiada sekwencję o numerze 6.

Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza bakteryjnego, zwłaszcza Escherichia coli, transformowana wektorem ekspresyjnym określonym powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA kodowane przez polinukleotyd określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadające sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka bakteriofaga TP-84 posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5 do przeprowadzenia in vitro manipulacji DNA obejmującej wiązanie dwuniciowego DNA i rozplatanie helisy DNA.

Szczegółowy opis wynalazku

Ujawniono polinukleotyd kodujący element funkcjonalny pochodzący z genomu bakteriofaga TP-84. Jako element funkcjonalny należy rozumieć polinukleotyd posiadający sekwencję DNA pochodzącą z genomu bakteriofaga TP-84, który może znaleźć praktyczne zastosowanie, przykładowo w wytwarzaniu termofilnych systemów phage display’, zmodyfikowanych nanocząstek biologicznych, szczepionek, adjuwantów, biosensorów, terapeutyków bakteriofagowych. W szczególności takim elementem funkcjonalnym może być polinukleotyd kodujący pełen genom bakteriofaga TP-84 lub polinukleotyd kodujący jej dowolny fragment funkcjonalny, w szczególności taki jak: promotor, terminator lub otwarta ramka odczytu kodująca białko. Fragmenty funkcjonalne zidentyfikowane w genomie bakteriofaga TP-84 zostały wskazane na Fig. 2.

PL 240 801 B1

Mogą one znaleźć szereg praktycznych zastosowań. W szczególności mogą być one użyteczne w produkcji termofilnych genów bakteriofagowych, zwłaszcza kodujących białka kapsydu, które nadają się do konstrukcji systemów phage display’, a także innych białek fagowych, przykładowo helikaz lub białek wiążących DNA.

Korzystnie polinukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje białko bakteriofaga TP-84, przy czym stanowi on polinukleotyd o sekwencji o numerze 2.

Ujawniono polinukleotyd kodujący gen rekombinantowy składający się z polinukleotydu kodującego białko bakteriofaga TP-84 zdefiniowanego powyżej oraz sekwencji kodującej sześć reszt histydyny, korzystnie posiadający sekwencję wybraną spośród sekwencji o numerach 4 lub 9.

Białka fagowe mogą być wykorzystane między innymi do usprawnienia reakcji powielania kwasów nukleinowych, produkcji szczepionek, adjuwantów, biosensorów, systemów wychwytu jonów metali lub stosowania w terapii fagowej.

Przykładowe realizacje stanowią polinukleotyd posiadający sekwencję genu rekombinantowego kodującego białko TP84_31, o aktywności enzymatycznej helikazy DNA oraz sekwencja aminokwasowa białka TP84_31. W korzystnym wariancie, ww. sekwencje są połączone z sekwencją nukleotydową kodującą znacznik sześciu reszt histydyny, prowadzącą do biosyntezy fuzyjnego białka TP84_31-His6, ułatwiającego izolowanie produkowanego białka metodą chromatografii metalopowinowactwa.

Ujawniono również wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera origin replikacji, korzystnie pBR322 ori, gen oporności na antybiotyk, korzystnie ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie BAD operonu arabinozowego, gen represora, korzystnie araC, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji oraz połączony z nimi operacyjnie polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 lub białko fuzyjne, który został zdefiniowany powyżej.

Korzystnie, wektor ekspresyjny posiada sekwencję o numerze 6.

Przykładowymi realizacjami tego aspektu są wektory DNA, zawierające sklonowane geny bakteriofaga TP-84 (TP84_31), kodujące helikazę DNA lub białko wiążące DNA (TP84-35) w układzie ekspresyjnym bakterii Escherichia coli nadające się do ekspresji i izolowania tych białek z bakterii.

Ujawniona została również komórka gospodarza bakteryjnego, zwłaszcza Escherichia coli, transformowana wektorem ekspresyjnym opisanym powyżej.

Przykładowy sposób uzyskiwania rekombinantowego, fuzyjnego białka TP84_31 -His6 (ssb) charakteryzuje się tym, że połączony z białkiem znacznik sześciu reszt histydyny jest wykorzystany do izolowania białka metodą metalopowinowactwa.

Przykładowy sposób uzyskiwania rekombinantowego, fuzyjnego białka TP84_35-His6 charakteryzuje się tym, że połączony z białkiem znacznik sześciu reszt histydyny jest wykorzystany do izolowania białka metodą metalopowinowactwa.

Ujawniono również białko bakteriofaga TP-84 lub jego pochodną kodowane przez polinukleotyd opisany powyżej. Ujawnione białko bakteriofaga TP-84 lub jego pochodna posiadają sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 i 5.

Uzyskiwane zgodnie z wynalazkiem białka fagowe lub ich pochodne (np. białka fuzyjne z sekwencjami ułatwiającymi ich oczyszczanie), w szczególności białka TP84_31-His6 oraz TP84_35-His6 mogą być wykorzystane do usprawnienia metod biologii molekularnej, biotechnologii molekularnej, medycyny oraz przemysłu, korzystnie metod manipulacji DNA, w szczególności powielania kwasów nukleinowych.

Niniejszy opis został również wzbogacony o opisane poniżej przykłady wykonania, nie powinny być one jednak utożsamiane z pełnym zakresem wynalazku, który został omówiony powyżej oraz zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

P r z y k ł a d 1. Namnażanie termofilnego bakteriofaga TP-84 w bakteriach Bacillus stearothermophilus szczep 10.

W przykładowej realizacji namnożono bakterie Bacillus stearothermophilus szczep 10, korzystnie będący jednym z możliwych gospodarzy dla bakteriofaga TP-84. Do hodowli gospodarza Bacillus stearothermophilus szczep 10 oraz infekcji i namnażania bakteriofaga TP-84 stosowano pożywkę T, zawierającą na 1 L pożywki: 20 g Trypticase™, 3 g ekstraktu drożdżowego, 1,47 g CaC^2H2O, 7 mg FeCl2^6H2O, 15 mg MgSO^7H2O, 1 mg MnCl24H2O, pH 7,4. Do przygotowania inoculum bakteryjnego pożywkę T zestalano poprzez dodanie i rozpuszczenie 2% agaru oraz przygotowanie płytek Petriego, zawierających 30 ml zestalonej pożywki T, inkubowane z wysianymi bakteriami w temperaturze

PL 240 801 B1

55°C przez 18-48 godzin. Pobierano pojedyncze kolonie Bacillus stearothermophilus szczep 10 w celu namnożenia w płynnej pożywce T. Kultury bakteryjne inkubowano w temperaturze 65°C, stosując intensywne napowietrzanie poprzez wytrząsanie w inkubatorze-wytrząsarce. Do przygotowania inoculum bakteriofaga TP-84 pożywkę T zestalano poprzez dodanie i rozpuszczenie 2% agaru oraz przygotowanie płytek Petriego, zawierających 30 ml zestalonej pożywki T. Następnie przygotowano 2,5 ml pożywki T, do której dodano i rozpuszczono 0,65% agaru, chłodzono do 60°C, dodano 0,3 ml zawiesiny bakterii Bacillus stearothermophilus szczep 10, znajdujących się w fazie logarytmicznego wzrostu oraz 0,1 ml zawiesiny bakteriofaga TP-84, inkubowano 10 min w temperaturze 55°C i wylewano jako warstwę górną na płytki Petriego, zawierające 30 ml zestalonej pożywki T. Po zestaleniu warstwy górnej płytki inkubowano w temperaturze 55°C przez 12-20 godzin. W celu hodowli bakteriofaga TP-84 w skali preparatywnej, przygotowano 5 kultur Bacillus stearothermophilus szczep 10, zaszczepiając porcje po 1 L pożywki T za pomocą 1 ml hodowli bakterii, znajdującej się w logarytmicznej fazie wzrostu. Hodowle intensywne napowietrzano poprzez wytrząsanie w inkubatorze-wytrząsarce w temperaturze 65°C, aż do osiągnięcia miana populacji bakteryjnej ok. 5 χ 10⁸ komórek w 1 ml. Bakterie infekowano lizatem bakteriofaga TP-84, stosując wielokrotność infekcji (MOI) 0,1 oraz dodano roztworu glukozy do stężenia 0,5%. Kontynuowano napowietrzanie przez 3-4 godziny, aż do osiągnięcia lizy komórek i przejaśnienia hodowli. Uzyskane lizaty bakteriofagowe typowo charakteryzowały się mianem bakteriofagów ok. 10¹¹ PFU (jednostek formowania łysinek fagowych).

P r z y k ł a d 2. Oczyszczanie bakteriofaga TP-84 oraz izolowanie genomowego DNA TP-84.

W przykładowej realizacji namnożone bakteriofagi TP-84 jak wskazano w Przykładzie 1, poddano oczyszczeniu od pozostałości zlizowanych i całych komórek gospodarza Bacillus stearothermophilus szczep 10, stosując wieloetapową procedurę: (i) lizat bakteriofaga poddano różnicowemu wirowaniu w wirówce preparatywnej, rotorze kątowym stosując przyśpieszenie 16 000 g przez 15 min. Supernatant, zawierający bakteriofagi TP-84 dekantowano znad debris bakteryjnego; (ii) celem usunięcia bakteryjnego DNA i RNA z lizatu, dodawano DNazę I do stężenia 10 ug/ml i RNazę A do stężenia 1 ug/ml, a następnie inkubowano przez 30 min w temperaturze 37°C; (iii) bakteriofagi precypitowano za pomocą (NH4)2SO4, stopniowo dodanego w ilości 30 g/1 L lizatu bakteriofagowego oraz inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 4°C. Precypitat bakteriofagowy odwirowywano w wirówce w rotorze kątowym, stosując przyśpieszenie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C, supernatant odrzucano, bakteriofagi TP-84 zawieszano w wodzie destylowanej, dializowano przez 18 godzin wobec wody destylowanej oraz odwirowywano w wirówce w rotorze kątowym, stosując przyśpieszenie 16 000 g przez 10 minut, osad odrzucono; (iv) supernatant wirowano stosując przyśpieszenie 27 000 g przez 2 godziny, supernatant odrzucono, osad zawieszono w buforze: 15 mM cytrynian trójsodowy pH 7,0; 0,15 M NaCI; (v) do zawiesiny bakteriofaga TP-84 dodawano CsCI do osiągnięcia gęstości roztworu 1,51 g/cm³ oraz ultrawirowano w rotorze SW-39 przy przyśpieszeniu 30 000 g przez 24 godziny. Białe pasmo w gradiencie CsCI, zawierające stężoną zawiesinę bakteriofaga TP-84 wybierano poprzez igłę strzykawki, przebijając ściankę probówki. Zawiesinę bakteriofaga dializowano wobec roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 10 mM MgCl2 i przechowywano w 4°C lub po dodaniu glicerolu do 20% w temperaturze -80°C.

DNA bakteriofaga TP-84 izolowano po dodaniu EDTA do stężenia 50 mM za pomocą 3-krotnej ekstrakcji fenolem, nasyconym 20 mM buforem fosforanowym pH 7,0 i 2-krotnej ekstrakcji chloroformem. DNA precypitowano 2-ma objętościami alkoholu etylowego w obecności 0,3 M octanu sodu o pH 7,0, odwirowano, przemywano osad DNA 70% alkoholem etylowym, suszono i rozpuszczano w buforze TE o składzie: 10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA.

P r z y k ł a d 3. Sekwencjonowanie genomu i analiza bioinformatyczna genomu bakteriofaga TP-84.

W przykładowej realizacji, izolowane i oczyszczone DNA bakteriofaga TP-84 uzyskane jak wskazano w Przykładzie 2 poddano sekwencjonowaniu genomowego, korzystnie przy użyciu technologii Next Generation Sequencing (NGS) na Sekwenatorze Genomowym HiSeq 2000 firmy Illumina w trybie PE250. Wykonano bibliotekę genomową z krótkimi wstawkami 100-600 par zasad, otrzymane odczyty składano i analizowano programami: CutAdapt, CLCGenomicWorkbench i PROKKA. Uzyskano 140683713 nukleotydów, 626934 sekwencji w parach, ostateczna złożona sekwencja stanowiła pojedynczy, liniowy segment dwuniciowego DNA o długości 47703 par zasad (Sek. 1). Uzyskaną sekwencję poddano dalszej analizie bioinformatycznej, korzystnie przy użyciu specjalistycznego oprogramowania: MyRAST, Kodon, BLASTP and SnapGene oraz korekcie wizualnej.

PL 240 801 B1

Fig. 1 przedstawia mapę całego genomu bakteriofaga TP-84 z uwidocznionymi Otwartymi Ramami Odczytu (ORF) z przypisanymi indywidualnymi nazwami genów, unikatowymi sekwencjami rozpoznawanymi przez endonukleazy restrykcyjne, rejonami promotorów inicjacji transkrypcji (oznaczonymi jako ‘promoter’), hipotetycznymi rejonami regulatorowymi (oznaczonymi jako ODD’, ‘regulatory ODD’, ‘miscaleneous’ i ‘regulatory region’) oraz rejonami regulacji inicjacji translacji - sekwencji wiązania rybosomów (oznaczonymi jako ‘RBS’). Fig. 2 przedstawia pełną sekwencję dwuniciowego DNA, kodującego genom bakteriofaga TP-84 wraz z zaznaczonymi sekwencjami nukleotydowymi Otwartych Ram Odczytu (ORF) z przypisanymi indywidualnymi nazwami genów, promotorów transkrypcji, hipotetycznymi rejonami regulatorowymi oraz rejonami inicjacji translacji RBS. Fig. 3 przedstawia tabelę zawierającą listę Otwartych Ram Odczytu, kodujących hipotetyczne białka wraz z ich podstawowymi właściwościami, ustalonymi na podstawie analizy bioinformatycznej. Wyniki zaprezentowane na Fig. 1, 2, 3 oraz Sek. 1 ujawniają, że genom posiada 85 Otwartych Ram Odczytu (ORF), kodujących hipot etyczne białka bakteriofaga TP-84. Znamienne jest, że niemal wszystkie - 83 (Fig. 1, 2, 3), są skierowane w tym samym kierunku, zgodnym z kierunkiem arbitralnie ustalonej nici górnej DNA genomu, co prowadzi do wniosku, że również dominujący przebieg transkrypcji zachodzi w tym samym kierunku. Tym samym jedna z nici DNA genomu bakteriofaga jest silnie dominująca pod względem kodowania produktów mRNA i białek, jak wskazano w Fig. 1, 2, 3. W kierunku przeciwnym skierowane są jedynie 2 niewielkie Otwarte Ramy Odczytu (ORF): TP84_22 (204 pary zasad) i TP84_54 (264 pary zasad), potencjalnie kodujące polipeptydy o nieustalonej funkcji. Znamiennym również jest, że informacja genetyczna jest wysoce skondensowana, Otwarte Ramy Odczytu (ORF) są położone bardzo blisko siebie, a w szeregu wypadkach są wzajemnie zachodzącą. Właściwość ta służy typowo konserwacji kodującej przestrzeni w obrębie genomu, który ma ograniczoną wielkość ze względu na pojemność kapsydu bakteriofaga. Wśród wykrytych Otwartych Ram Odczytu (ORF), większość (54), koduje hipotetyczne białka o nieustalonej funkcji, wśród których mogą znajdować się białka o użytecznych właściwościach. Wśród kodowanych białek o funkcji przypisanej na podstawie homologii do sekwencji białek umieszczonych w publicznych bazach danych znajduje się m.in. (Fig. 3): 5 hipotetycznych białek membranowych (TP84_01, TP84_18, TP84_37, TP84_64, Tp84_84) (Fig. 3); 12 hipotetycznych białek replikacji, rekombinacji, regulacji i metabolizmu DNA (TP84_24 - regulator transkrypcji,

TP84_25 - białko RecB-podobne, TP84_26 - białko wspomagające hybrydyzację jednoniciowego DNA, TP84_30 - inhibitor replikacyjnej helikazy DNA, TP84_31 - replikacyjna helikaza DNA,

TP84_33 - HNH endonukleaza typu hom/ng’, TP84_35 - białko wiążące jednoniciowe DNA (single-stranded binding protein, ssb), TP84_40 syntetaza tymidylanowa, TP84_41 - dUTP difosfataza,

TP84_44 - RecU białko rekombinacyjne, TP-84_56 - terminaza, mała podjednostka, TP84_57 - terminaza, duża podjednostka) (Fig. 3); 9 hipotetycznych białek zaangażowanych w budowę otoczki białkowej (kapsydu) bakteriofaga (TP84_61 - białko strukturalne kapsydu, TP_63 - mniejsze białko kapsydu, TP84_65 - proteaza dojrzewania pro-głowy kapsydu, TP84_67 - główne białko kapsydu, TP84_72 - białko składania ogonka, TP84_76 - białko mierzące długość ogonka, TP84_77 - dystalne białko ogonka, TP84_78 - białko ogonka, TP84_80 - dystalne białko ogonka; 1 hipotetyczna glikozylaza zaangażowana w proces sporulacji (TP84_81); 2 hipotetyczne białka lizy ściany i błony komórkowej (TP84_82 - holina, TP84_83 - endolizyna). Ww. grupy białek mogą zostać rozszerzone o niektóre z pozostałych hipotetycznych białek o w tej chwili nieustalonej funkcji. Białka bakteriofaga TP-84 mogą znaleźć szereg zastosowań praktycznych, m.in. do: usprawnienia metod powielania kwasów nukleinowych, klonowania, diagnostyki molekularnej (korzystnie spośród hipotetycznych białek replikacji, rekombinacji, regulacji i metabolizmu DNA), tworzenia systemu phage display’, szczepionek, adjuwantów, prezentacji bio- i chemaktywnych motywów aminokwasowych (korzystnie spośród hipotetycznych białek zaangażowanych w budowę otoczki białkowej), dezintegracji komórek bakteryjnych (korzystnie spośród hipotetycznych białek lizy ściany i błony komórkowej).

P r z y k ł a d 4. Klonowanie molekularne genu TP84_31, kodującego helikazę DNA bakteriofaga TP-84.

W przykładowej realizacji wykorzystania sekwencji nukleotydowej genomu bakteriofaga TP-84 (Sekw. 1) jak wskazano w przykładach 1,2 i 3 powielono w reakcji Polymerase Chain Reaction (PCR) korzystnie gen TP84_31 o długości 564 par zasad, kodujący replikacyjną helikazę DNA, składającą się z łańcucha polipeptydowego o długości 187 aminokwasów, o masie cząsteczkowej 21,7 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 5,32. Fig. 4 przedstawia wyniki reakcji PCR, do której zaprojektowano i zastosowano startery reakcji PCR, korzystnie wprowadzające sekwencję nukleotydową,

PL 240 801 B1 kodującą znacznik sześciu reszt histydyny do genu helikazy TP-84 oraz sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną Ncol do klonowania do wektora ekspresyjnego pBAD-MycHisA: 5’-GGAGGACCATGGCTCACCATCATCATCATCATGATTTTGACGATAAAACACGTGAACG-3’ (kodon Start ATG i znacznik sześciu reszt histydyny podkreślony) oraz 5’ -TT GAGAT CTT CAT GATGCTTCATCGAATCGGCG-3’ (kodon Stop w nici dolnej DNA podkreślony). Sekwencję nukleotydową kodującą znacznik sześciu reszt histydyny wprowadzono na koniec 5’ genu, tworząc fuzję z N-końcem białka TP84_31, jakkolwiek może być ona wprowadzona również na koniec 3’, tworząc fuzję z C-końcem białka. Sekw. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową genu TP84_31, Sekw. 3 przedstawia sekwencję aminokwasową białka TP84_31. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji PCR: stężenie starterów - 0,4 μΜ, dNTPs - 0,8 mM, bufor reakcyjny 1x (10 mM Tris-HCI pH 8,8 w 25°C, 50 mM KCI, 0,08% (v/v) Nonidet P40), MgCl2 - 2 mM, 2 jednostki Polimerazy TaqNova (BLIRT S.A., Polska), DNA genomowe bakteriofaga TP-84 - 2 ng, początkowa denaturacja 94°C przez 180 sekund, 30 cykli termicznych: 94°C - 30 sekund, 55°C - 30 sekund, 72°C - 30 sekund; końcowe wydłużanie 72°C - 120 sekund. Zaprezentowany w Fig. 4 powielony i zmodyfikowany za pomocą użytych starterów gen TP84_31 o długości 585 par zasad, koduje replikacyjną helikazę DNA TP-84, opatrzoną znacznikiem 6-ciu reszt histydyny oraz dodatkową resztą aminokwasu alaniny, znajdującą się za kodonem Start, składającą się z łańcucha polipeptydowego o długości 194 aminokwasów, o masie cząsteczkowej 22,6 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 5,92. Sekw. 4 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję nukleotydową genu TP84_31, Sekw. 5 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję aminokwasową białka TP84_31. W uzyskanym produkcie PCR gen TP84_31 opatrzony jest flankującymi segmentami DNA, zawierającymi przeznaczone do klonowania , korzystnie do wektora pBAD-MycHisA, sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne Ncol i BglII. Tak uzyskany moduł genetyczny może być przeniesiony drogą klonowania do różnych klas wektorów. Na Fig. 4 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1kb (Thermo Scientific, USA); ścieżka 1, reakcja PCR na matrycy genomowego DNA TP-84; ścieżka 2, kontrolna reakcja PCR, bez dodanej matrycy. Oczyszczony produkt PCR oraz DNA wektora pBAD-MycHisA zostały strawione endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i BglII oraz poddane reakcji kierunkowej ligacji ligazą bakteriofaga T4 w taki sposób, że nastąpiła fuzja z zachowaniem ciągłości Otwartej Ramy Odczytu (ORF) opatrzonego znacznikiem 6-ciu reszt histydyny genu TP84_31 z sygnałami inicjacji translacji wektora pBAD-MycHisA. Fig. 5 przedstawia wyniki uzyskane po transformacji mieszaniną ligacyjną bakterii Escherichia coli TOP10. Kolonie rekombinantowych bakterii poddano analizie PCR, stosując startery, zastosowane wcześniej do powielenia genu TP84_31 z genomu bakteriofaga TP-84, uzyskując w przypadku 3 klonów powielenie odcinka DNA o oczekiwanej długości genu TP84_31, opatrzonego sekwencjami flankującymi, wprowadzonymi przez startery. Na Fig. 5 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1 kb (Thermo Scientific); ścieżki K1-K10, analizowane DNA poszczególnych klonów. Klon oznaczony K9, z przypisaną nazwą konstruktu pBADMycHisA-TP-84_helicase poddano sekwencjonowaniu DNA, potwierdzając pełną zgodność uzyskanej sekwencji nukleotydowej z sekwencją zmodyfikowanego genu TP84_31, wskazaną w Sekw. 4. Sekw. 6 przedstawia sekwencję nukleotydową konstruktu pBADMycHisA-TP-84_helicase.

P r z y k ł a d 5. Ekspresja genetyczna klonu, kodującego białko helikazę DNA - TP84_31-Hiss bakteriofaga TP-84.

Klon pBADMycHisA-TP-84_helicase, zawierający gen TP84_31 wklonowany w wektorze pBAD-MycHisA, jak wskazano w Przykładach 3 i 4, pod kontrolą indukowalnego promotora arabinozowego BAD, którego poziom transkrypcji jest regulowany stężeniem cukru arabinozy, poddano eksperymentowi ekspresji (biosyntezy białka in vivo) w rekombinantowych komórkach bakterii Escherichia coli TOP10. Rekombinantowe bakterie Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_helicase] korzystnie hodowano w pożywce LB, zawierającą na 1 L pożywki: 10 g Tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCI, pH 7,4, w temperaturze 37°C, stosując intensywne napowietrzanie w inkubatorze-wytrząsarce. Po osiągnięciu przez hodowlę bakterii gęstości optycznej OD = 0,45, wykonano indukcję chemiczną promotora BAD i inicjację biosyntezy rekombinantowego białka TP84_31 -His6 poprzez dodanie arabinozy do stężenia 0,02%.

Fig. 6 przedstawia mapę klonu plazmidowego pBADMycHisA-TP-84_helicase, zawierającego gen wskazany w Przykładach 3 i 4, kodujący białko TP84_35-His6, wklonowane w wektorze pBAD-MycHisA, pod kontrolą indukowalnego promotora arabinozowego BAD. Na Fig. 7 przedstawiono analizę rezultatów ekspresji transformowanego DNA klonu pBADMycHisA-TP-84_helicase, zawie

PL 240 801 B1 rającego fuzyjny gen, kodujący rekombinantowe białko TP84_31-His6. Wykonana została analiza elektroforetyczna eksprymowanego białka w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących; żel barwiono Coomassie Blue. Pobierano próbki hodowli w odstępach czasowych w zakresie 0 do 16 godzin, odwirowywano bakterie i wykonywano elektroforetyczną analizę profilu białkowego z całych komórek. Na Fig. 7 przedstawiono kolejno: ścieżka 1, hodowla przed indukcją; ścieżka 2, hodowla 2 godziny po indukcji; ścieżka 3, 4 godziny po indukcji; ścieżka 4, 16 godzin po indukcji; ścieżka M, wzorce masy cząsteczkowej białek - LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare, USA). Ewidentna jest masywna biosynteza rekombinantowego białka TP84_31-His6, widoczna jako przyrost intensywności prążka białkowego na wysokości żelu odpowiadającej ok. 22 kDa, zgodnej z oczekiwaną wielkością ustaloną na podstawie sekwencji aminokwasowej TP84_31-His6. Ze względu na to, że TP84_31-His6 jest białkiem fuzyjnym, zawierającym znacznik sześciu reszt histydyny, do jego oczyszczania mają zastosowanie metody izolowania metodą metalochromatografii powinowactwa IMAC na immobilizowanych jonach metali przejściowych, korzystnie Ni²⁺.

P r z y k ł a d 6. Klonowanie molekularne genu TP84_35 bakteriofaga TP-84, kodującego białko wiążące jednoniciowe DNA (ssb).

W przykładowej realizacji wykorzystania sekwencji nukleotydowej genomu bakteriofaga TP-84 (Sekw. 1) powielono w reakcji PCR, korzystnie gen TP84_35 o długości 468 par zasad, kodujący białko wiążące jednoniciowe DNA jak wskazano w Przykładzie 3, składające się z łańcucha polipeptydowego o długości 155 aminokwasów, o masie cząsteczkowej 17,4 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 5,16. Sekw. 7 przedstawia sekwencję nukleotydową genu TP84_35, Sekw. 8 przedstawia sekwencję aminokwasową białka TP84_35. Fig. 8 przedstawia wyniki reakcji PCR, do której zaprojektowano i zastosowano startery reakcji PCR, korzystnie wprowadzające sekwencję nukleotydową, kodującą znacznik sześciu reszt histydyny do genu białka wiążącego jednoniciowe DNA oraz sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną Ncol do klonowania do wektora ekspresyjnego pBAD-MycHisA: 5'-ggaggaccatGgctcaccatcatcatcatcataacaatgtgacgttagtgggaagattgacg-3' (kodon Start ATG i znacznik sześciu reszt histydyny podkreślony) oraz 5’-TTGAGATCTCTA AAATGGCAGATCGTCATCATTCACATAAATCGG-3’ (kodon Stop w nici dolnej DNA podkreślony). Sekwencję nukleotydową kodującą znacznik sześciu reszt histydyny wprowadzono na koniec 5’ genu, tworząc fuzję z N-końcem białka TP84_35, jakkolwiek może być ona wprowadzona również na koniec 3’, tworząc fuzję z C-końcem białka. Sekw. 9 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję nukleotydową genu TP84_35, Sekw. 10 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję aminokwasową białka TP84_35. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji PCR: stężenie starterów - 0,4 μM, dNTPs - 0,8 mM, bufor reakcyjny 1x, MgCl2 - 2 mM, 2 jednostki Polimerazy TaqNova (BLIRT S.A.) DNA genomowe bakteriofaga TP-84 - 2 ng, początkowa denaturacja 94°C przez 180 sekund, 30 cykli termicznych: 94°C - 30 sekund, 55°C - 30 sekund, 72°C - 30 sekund; końcowe wydłużanie 72°C - 120 sekund. Zaprezentowany w Fig. 8 powielony i zmodyfikowany za pomocą użytych starterów gen TP84_35 o długości 489 par zasad, koduje białko wiążące jednoniciowe DNA, opatrzone znacznikiem 6-ciu reszt histydyny oraz dodatkową resztą aminokwasu alaniny, znajdującą się za kodonem Start (Sekw. 9), składające się z łańcucha polipeptydowego o długości 162 aminokwasów (Sekw. 10), o masie cząsteczkowej 18,3 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 6,28. Na Fig. 8 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1 kb (Thermo Scientific); ścieżka 1, reakcja PCR na matrycy genomowego DNA TP-84; ścieżka 2, kontrolna reakcja PCR, bez dodanej matrycy. W uzyskanym produkcie PCR gen TP84_35 opatrzony jest flankującymi segmentami DNA, zawierającymi przeznaczone do klonowania, korzystnie do wektora pBAD-MycHisA, sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne Ncol i BglII. Tak uzyskany moduł genetyczny może być przeniesiony drogą klonowania do różnych klas wektorów. Produkt PCR oraz DNA wektora pBAD-MycHisA zostały strawione endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i BglII oraz poddane reakcji kierunkowej ligacji ligazą bakteriofaga T4 w taki sposób, że nastąpiła fuzja z zachowaniem ciągłości Otwartej Ramy Odczytu (ORF) opatrzonego znacznikiem 6-ciu reszt histydyny genu TP84_35-His6 z sygnałami inicjacji translacji wektora pBAD-MycHisA. Fig. 9 przedstawia wyniki uzyskane po transformacji mieszaniną ligacyjną bakterii Escherichia coli TOP10. Kolonie rekombinantowych bakterii poddano analizie PCR, stosując startery, zastosowane wcześniej do powielenia genu TP84_35 z genomu bakteriofaga TP-84, uzyskując w przypadkach 5-ciu klonów powielenie odcinka DNA o oczekiwanej długości genu TP84_35-His6, opatrzonego sekwencjami flankującymi, wprowadzonymi przez startery. Na Fig. 9 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1 kb

PL 240 801 B1 (Thermo Scientific); ścieżki K1-K9, analizowane DNA poszczególnych klonów. Klon oznaczony K7, z przypisaną nazwą konstruktu pBADMycHisA-TP-84_ssb poddano sekwencjonowaniu DNA, potwierdzając pełną zgodność uzyskanej sekwencji nukleotydowej z sekwencją zmodyfikowanego genu TP84_35-His6, wskazaną w Sekw. 9. Sekw. 11 przedstawia sekwencję nukleotydową konstruktu pBADMycHisA-TP-84_ssb.

P r z y k ł a d 7. Ekspresja genetyczna klonu, kodującego białko TP84_35-His6 bateriofaga TP-84, wiążące jednoniciowe DNA (ssb).

Fig. 10 przedstawia mapę klonu plazmidowego pBADMycHisA-TP-84_ssb, zawierający gen wskazany w Przykładach 3 i 6, kodujący białko TP84_35-His6, wklonowane w wektorze pBAD-MycHisA, pod kontrolą indukowalnego promotora arabinozowego BAD. Transformowane DNA klonu poddano eksperymentowi ekspresji w komórkach bakterii Escherichia coli TOP10. Rekombinantowe bakterie Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_ssb] korzystnie hodowano w pożywce LB, w temperaturze 37°C, stosując intensywne napowietrzanie w inkubatorze-wytrząsarce. Po osiągnięciu przez hodowlę bakterii gęstości optycznej OD = 0,40, wykonano indukcję chemiczną promotora BAD i inicjację biosyntezy rekombinantowego białka TP84_35-His6 poprzez dodanie arabinozy do stężenia 0,02%.

Na Fig. 11 została przedstawiona analiza rezultatów ekspresji fuzyjnego genu, kodującego rekombinantowe białko TP84_35-His6. Wykonana została analiza elektroforetyczna eksprymowanego białka w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących, który barwiono Coomassie Blue. Pobierano próbki hodowli w odstępach czasowych w zakresie 0 do 16 godzin, odwirowywano bakterie i wykonywano analizę profilu białkowego z całych komórek za pomocą elektroforezy denaturującej. Na Fig. 11 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorce masy cząsteczkowej białek - LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare); ścieżka 1, hodowla przed indukcją; ścieżka 2, hodowla 2 godziny po indukcji; ścieżka 3, 4 godziny po indukcji; ścieżka 4, 16 godzin po indukcji. Ewidentna jest masywna biosynteza rekombinantowego białka TP84_35-His6, widoczna jako przyrost intensywności prążka białkowego na wysokości żelu odpowiadającej ok. 17 kDa, zgodnej z oczekiwaną wielkością ustaloną na podstawie sekwencji aminokwasowej TP84_35-His6. Ze względu na to, że TP84_35-His6 jest białkiem fuzyjnym, zawierającym znacznik sześciu reszt histydyny, do jego oczyszczania mają zastosowanie metody izolowania metodą metalochromatografii powinowactwa IMAC na immobilizowanych jonach metali przejściowych, korzystnie Ni²⁺.

P r z y k ł a d 8. Izolowanie rekombinantowego białka TP84_35-His6 bakteriofaga TP-84, wiążącego jednoniciowe DNA.

W przykładowej realizacji komórki rekombinantowych bakterii Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_ssb], wskazane w Przykładach 6 i 7, zawierające eksprymowane białko TP84_35-His6, wiążące jednoniciowe DNA poddano procesowi separacji białka. Ekspresję genetyczną wykonano w 50 ml pożywki LB, komórki po trwającej 16 godzin indukcji promotora BAD odwirowano i zawieszono w 20 ml buforu do dezintegracji ultradźwiękowej: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 0,01% Triton X-100, 0,5 mg/ml lizozymu jaja kurzego, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1/5 tabletki SIGMAFAST™ Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free. Zawiesinę, chłodzoną w łaźni lodowej, poddano sonikacji, a pozostałości komórek bakteryjnych odwirowano przy 19 500 g w temperaturze 4°C przez 30 minut, uzyskując 20 ml supernatantu. 5 ml uzyskanego supernatantu, zawierającego białko TP84_35-His6 naniesiono na kolumnę, zawierającą 2 ml złoża do chromatografii metalopowinowactwa Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). Kolumnę płukano 10-ma ml buforu A zawierającego: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 5 mM imidazol, a następnie 10-ma ml buforu A zawierającego: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 40 mM imidazol. Związane do kolumny białko TP84_35-His6 eluowano 10-ma ml buforu E zawierającego: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 300 mM imidazol. Frakcje zawierające wyeluowane białko TP84_35-His6 dializowano wobec buforu S zawierającego: 20 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,2 mM beta-merkaptoetanol, 0,01% Triton X100, 50% glicerol i przechowywano w temperaturze -20°C. Fig. 12 przedstawia analizę elektroforetyczną w warunkach denaturujących kolejnych etapów izolowania rekombinantowego białka TP84_35-His6: ścieżki M, wzorce masy cząsteczkowej białek - LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare); ścieżka 2, przesącz z kolumny, zawierający niezwiązane białka; ścieżki 2-5, frakcje po płukaniu buforem A; ścieżki 6-9, frakcje po płukaniu buforem B; ścieżki 10-18, frakcje zawierające wyeluowane buforem E rekombinantowe białko TP84_35-His6.

PL 240 801 B1

P r z y k ł a d 9. Funkcjonalna aktywność biologiczna rekombinantowego białka helikazy DNA - TP84_34-His6 bakteriofaga TP-84.

W przykładowej realizacji komórki rekombinantowych bakterii Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_helicase], wskazane w Przykładach 3 i 4, 5, zastosowano do otrzymania oczyszczonego, rekombinantowego białka TP84_35-Hiss, któremu na podstawie analizy bioinformatycznej wskazanej w Przykładzie 3, przypisano funkcję enzymu helikazy, rozplatającego dwuniciowe DNA. Idea testu funkcjonalnego polega na wykazaniu zdolności termostabilnego białka TP84_34-Hiss do rozplatania zhybrydyzowanych nici DNA, monitorowane zaawansowaną metodą pomiaru zmiany poziomu fluorescencji barwnika interkalującego jedynie do dwuniciowego DNA (Eva Green, Jena Bioscience, Niemcy), mierzoną w urządzeniu metodą real time PCR (model MyGoPRO, IT-IS Life Science Ltd., Ireland). Spadek poziomu fluorescencji po dodaniu rekombinantowego białka TP84_35-Hiss jest wyznacznikiem jego aktywności biologicznej.

Fig. 13 przedstawia wyniki analizy kinetyki zmian fluorescencji w urządzeniu real time PCR. Zaprojektowano dwa wzajemnie komplementarne fragmenty jednoniciowego DNA, które zostały zsyntetyzowane chemicznie o sekwencjach: 5’-GCTAGTCGTCGCGTAAGCCAATCGACCCCAAAATAGCGA GCATCAGTGTAGAGAGTTGGA-3’ oraz 5’-TCCAACTCTCTACACTGATGCTCGCTATTTTGGGGTC GATTGGCTTACGCGACGACTAGC-3’. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji monitorowania zmian fluorescencji, przeprowadzonych w objętościach po 20 μl: stężenie jednoniciowych odcinków DNA - 1,5 μM, dNTPs - 0,1 mM, bufor reakcyjny 1 x: 20 mM Tris-HCI pH 7,5, MgCl2 10 mM, BSA - 1 mg/ml, ATP - 2 mM. Zastosowano schemat cykli termicznych: 37°C - 1 minuta, 55°C - 30 minut. Komponenty reakcji były dodawane do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C a następnie umieszczone w urządzeniu do real time PCR i niezwłocznie poddane cyklom termicznym. Na Fig. 13 przedstawiono wykres obrazujący kinetykę hybrydyzacji jednoniciowych odcinków DNA, gdzie w próbie kontrolnej bez dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss widoczny jest stopniowy wzrost stężenia form odcinków DNA zhybrydyzowanych do dwuniciowych odcinków, tym samym zwiększając poziom fluorescencji w czasie cykli hybrydyzacyjnych. W próbach zawierających dodane rekombinantowe białko TP84_34-Hiss widoczny jest znacznie niższy poziom wzrostu fluorescencji lub jej spadek, w zależności od ilości dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss. Krzywe na wykresie w Fig. 13 oznaczono kolorami: purpurowym - reakcja kontrolna bez dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; czarnym - reakcja zawierająca 1,65 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; czerwonym - reakcja zawierająca 1,24 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; zielonym - reakcja zawierająca 0,825 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; niebieskim - reakcja zawierająca 0,412 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss. Obserwowana jest negatywna zależność kinetyki hybrydyzacji jednoniciowego DNA, od ilości dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss. Tym samym wykazano, że rekombinantowe białko TP84_34-Hiss wykazuje aktywność biologiczną helikazy oddziaływującej z DNA, wywierając efekt rozplatania helisy dwuniciowego DNA. Właściwość ta może mieć istotne zastosowania praktyczne w technologiach manipulacji DNA, w szczególności w usprawnieniu reakcji powielania DNA.

P r z y k ł a d 10. Funkcjonalna aktywność biologiczna rekombinantowego białka TP84_35-Hiss bakteriofaga TP-84, wiążącego jednoniciowe DNA.

W przykładowej realizacji komórki rekombinantowych bakterii Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_ssb], wskazane w Przykładach 6, 7, 8 zastosowano do otrzymania oczyszczonego rekombinantowego białka TP84_35-Hiss, wiążącego jednoniciowe DNA. Idea testu funkcjonalnego polega na wykazaniu zdolności termostabilnego białka TP84_35-Hiss do usprawniania reakcji PCR poprzez wiązanie do jednoniciowych starterów i tym samym stymulowanie specyficzności hybrydyzacji do matrycowego DNA, eliminując lub zmniejszając artefakty reakcji PCR, obserwowane podczas technik analitycznych reakcji PCR, takie jak pojawianie się obserwowanych na elektroforetycznych żelach agarozowych lub akrylamidowych dodatkowych prążków DNA, ‘smugi’ DNA, dimerów starterów. Artefakty te są efektem hybrydyzacji starterów do nie w pełni homologicznych sekwencji nukleotydowych w matrycy oraz wzajemnej hybrydyzacji starterów.

Fig. 14 przedstawia wyniki reakcji PCR, do której zaprojektowano i zastosowano startery reakcji PCR: 5’-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3’ oraz 5’-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3’, powielające testowy odcinek 470 par zasad z genomu Candida albicans, gdzie reakcja powielania nie skutkuje powstaniem wyłącznie oczekiwanego jednorodnego, pojedynczego prążka DNA. Tym samym zawiera liczne artefakty, widoczne na agarozowym żelu elektroforetycznym w postaci prążków dodatkowych

Claims (8)

1. PL 240 801 B1 oraz ‘smugi’ DNA. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji PCR przeprowadzonych w objętości 25 μΙ: stężenie starterów - 0,4 μM, dNTPs - 0,1 mM, bufor reakcyjny 1x, MgCl2 - 3 mM, 2 jednostki Polimerazy TaqStoffel, DNA genomowe Candida albicans - 23 ng, początkowa denaturacja 95°C przez 180 sekund, 30 cykli termicznych: 95°C - 30 sekund, 45°C - 30 sekund, 72°C 30 sekund; końcowe wydłużanie 72°C - 180 sekund. Czerwona strzałka oznacza oczekiwany produkt PCR o długości 470 par zasad, przedstawiony na Sekw. 12. Na Fig. 14 przedstawiono kolejno: ścieżki M, marker wielkości fragmentów DNA 100 bp Plus (Fermentas, Litwa); ścieżka 1, kontrolna reakcja PCR na matrycy genomowego Candida albicans bez dodanego białka TP84_35-His; ścieżka 2, reakcja PCR, przeprowadzono jak w ścieżce 1 z dodatkiem 0,36 ng białka TP84_35-His; ścieżka 3, PCR z 0,72 ng białka TP84_35-His; ścieżka 4, PCR z 1,08 ng białka TP84_35-His; ścieżka 5, PCR z 1,44 ng białka TP84_35-His; ścieżka 6, PCR z 2,16 ng białka TP84_35-His; ścieżka 7, PCR z 2,88 ng białka TP84_35-His; ścieżka 8, PCR z 3,60 ng białka TP84_35-His. Komponenty reakcji były dodawane do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C, a następnie umieszczone w termocyklerze PCR (model TPROFESSIONAL BASIC, Biometra, Niemcy) i niezwłocznie poddane cyklom termicznym. Wyniki wykazują stopniowe zmniejszanie się ilości artefaktów w ścieżkach 2-7, aż do całkowitej ich eliminacji w ścieżce 8. Tym samym wykazano, że rekombinantowe białko TP84_35-His wykazuje aktywność biologiczną oddziaływania z DNA, w przeprowadzonym teście objawiającą się dodatkowo jako usprawnienie reakcji PCR. Właściwość ta może mieć istotne zastosowania praktyczne w technologiach manipulacji DNA, w szczególności w usprawnieniu reakcji powielania DNA.

   Zastrzeżenia patentowe

   1. Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 2.
2. 2. Polinukleotyd kodujący gen rekombinantowy składający się z polinukleotydu kodującego białko bakteriofaga TP-84 określone w zastrz. 1 oraz polinukleotydu kodującego sześć reszt histydyny, korzystnie posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 4.
3. 3. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera origin replikacji, korzystnie pBR322 ori, gen oporności na antybiotyk, korzystnie ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie BAD operonu arabinozowego, gen represora, korzystnie araC, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji oraz połączony z nimi operacyjnie polinukleotyd kodujący białko określony w zastrz. 1 albo 2.
4. 4. Wektor ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada sekwencję o numerze 6.
5. 5. Komórka gospodarza bakteryjnego, zwłaszcza Escherichia coli, transformowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 3 lub 4.
6. 6. Białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA kodowane przez polinukleotyd określony w zastrz. 1 albo 2.
7. 7. Białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadające sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5.
8. 8. Zastosowanie białka bakteriofaga TP-84 posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5 do przeprowadzenia in vitro manipulacji DNA obejmującej wiązanie dwuniciowego DNA i rozplatanie helisy DNA.