JP6399589B2 - 肺炎球菌における発現プロモーター - Google Patents
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(1)(a)配列番号2に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド;(b)配列番号2に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチド;の(a)又は(b)に示すポリヌクレオチドからなるプロモーター。
(2)配列番号2に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、配列番号3に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであることを特徴とする上記(1)記載のプロモーター。
(3)上記(1)又は(2)記載のプロモーターを含む組換えベクター。
(4)上記(3)記載の組換えベクターが導入された肺炎球菌の形質転換体。
肺炎球菌において発現能力が高いプロモーターを探索するために、肺炎球菌のクロモソームを制限酵素で部分切断し、mCherryをコードする遺伝子を含む大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターに挿入して発現プラスミドを作製し、かかる発現プラスミドを大腸菌及び肺炎球菌に導入してmCherryの発現を調べた。
大腸菌はJM109株を用い、肺炎球菌はGTC261株を用いた。大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターはpLS5-HSG398 rev-mCherry revを用いた。上記シャトルベクターは、pLS21(ATCC67492)のEcoRI断片とpHSG398のEcoRI断片を結合し、HindIII切断部位にmCherry遺伝子(Z2522N:pmCherry由来、タカラバイオ社製)を挿入して作製した。かかるシャトルベクターは、大腸菌の複製開始点(origin of replication)、肺炎球菌の複製開始領域(repA/B/D)をもつ。さらに、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質遺伝子mCherryを含んでいる。pLS21、pHSG398及びpLS5-HSG398 rev-mCherry revのマップを図3に示す。
上記シャトルベクターpLS5-HSG398 rev-mCherry rev 50ngに、制限酵素BamHI(15U/μl)0.5μlとCIP(10−30U/μl)0.125μlを加えて30℃で60分間反応させた(反応系50μl)。また、肺炎球菌GTC261株のクロモソーム500ngに制限酵素Sau3AI(10U/μl)を128倍に希釈したものを1μl加え、37℃で60分間反応させた(反応系50μl)。反応後に酵素の失活処理を行い、シャトルベクターの反応液と肺炎球菌クロモソームの反応液を混合してエタノール沈殿処理を行った。濃縮及び乾燥させた上記反応液混合物にT4 DNA Ligase(350U/μl)を1μl添加して16℃で一晩反応させて(反応系10μl)、発現プラスミド(肺炎球菌クロモソーム断片ライブラリー)を作製した。
井上・野島法(Inoue H, Nojima H, Okayama H. Gene(1990) 96(1):23-28)により作製した大腸菌JM109株コンピテントセル100μlを、上述で作製した、ライゲーション処理後の発現プラスミド溶液に加え、氷中に30分間静置した。その後、42℃の環境に45秒間静置した。5分間氷中に置いた後、LBG液体培地(終濃度2% LB培地、終濃度0.1% glucose)を1ml加えて37℃で1時間静置し、テトラサイクリン(終濃度20μg/ml)を含むLBG平板培地(LBG液体培地に終濃度1.5%寒天末を添加)に全量を塗布し、30℃で二晩培養した。
適度な大きさになったコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光を発した40個のコロニーを、それぞれ各々テトラサイクリン(終濃度20μg/ml)を含むLBG液体培地5mlに植え継いで30℃で一晩培養した。吸光度計を用いて濁度が1を超えていることを確認した後、一晩培養液を遠心し集菌してから、QIAprep(登録商標) Spin Miniprep Kit(Qiagen社製)を用いて、mCherryを発現した大腸菌JM109由来の発現プラスミド(以下、「JM109由来mCherry発現プラスミド」ともいう)を抽出し、40種類の発現プラスミドを得た。
肺炎球菌におけるmCherryの発現を確認するため、肺炎球菌へ40種類のJM109由来mCherry発現プラスミドをそれぞれ導入した。まず、対数増殖期にある肺炎球菌(GTC261株)1mlを、HCl(終濃度10mM)とグリシン(終濃度20mM)を加えたTSBY液体培地(終濃度3% Soybean−Casein Digest Broth、終濃度0.5% Yeast extract)100mlに移して37℃で3時間培養した。培養液は吸光度計を用いて濁度0.1程度まで肺炎球菌が増殖したことを確認した。培養液にNaOH(終濃度10mM)を加えて中和した後、4℃、7000rpm、5分間遠心した。菌体をTB(Transfer Buffer、終濃度4.88%glucose、終濃度10mM MgCl2、pH6.5)で3回洗い、TB800μlに懸濁した。このTB懸濁菌液200μlに上記抽出した40種類のJM109由来mCherry発現プラスミド75−225ngをそれぞれ添加したものをエレクトロポレーション用のキュベット(0.2cmギャップ)に注ぎ、MicroPulser(Bio-Rad社製)により2.9kVの電流を3.70〜3.90ms流した。次にキュベット内の菌液に1mlのTSBY液体培地を加えて37℃で1時間培養した。この培養液を250μl分取し、新しいTSBY液体培地750μlに加え、37℃で2時間培養した。その後、培養液を全量が各1mlとなるように1/10と1/1000濃度に希釈し、TSBY平板培地(TSBY培地に終濃度1.5%寒天末、5%脱繊維羊血液、終濃度0.5μg/mlテトラサイクリン添加)に全量塗布した。塗布した肺炎球菌は37℃、5%CO2の環境で一晩培養した。適度な大きさになったそれぞれのコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光を発しているコロニー、すなわち肺炎球菌でmCherryを強く発現している株(GTC261−S株)が得られた。なお、GTC261−S株に導入したJM109由来mCherry発現プラスミドを、以後「断片S-mCherry」ともいう。
断片S-mCherryに挿入されたクロモソーム断片を含む領域をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った。
上記「発現プラスミドの抽出」で得た断片S-mCherry 200ngにつきPrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、5×PrimeSTAR Buffer10μl、dNTP Mixture(2.5mM each)4μl、配列番号4に示すプライマーseq Fと配列番号5に示すプライマーseq R(10pmol/μl)各1μlを加えて、50μl系で反応を行った。アニーリング、伸長時の温度と反応時間は各々適切なものを選択した。PCR反応後のDNAは、精製、濃度測定を行い、シークエンス解析に使用した。
上述で得られたPCR反応後のDNA、すなわち断片S-mCherryに挿入されたクロモソーム断片とmCherry遺伝子の一部を含む範囲の配列をシークエンス解析した。すでに塩基配列が解析されたゲノムから相同性の高い配列を探すため、解析で得られた配列を、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)で相同性検索した。
シークエンス解析の結果、断片S-mCherryに挿入されたクロモソーム断片の配列は、配列番号3に示す塩基配列(図4)であることが明らかとなった。かかる結果より、配列番号3に示す塩基配列は肺炎球菌において目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドであることが明らかとなった。なお、以下、配列番号3に示す塩基配列を、以後「断片S」ともいう。また、BLASTによる相同検索の結果、配列番号3に示す塩基配列のうち、1〜453番目の塩基配列のA領域はUvrABCシステムタンパク質A(UvrABC system protein A)、585〜818番目の塩基配列のB領域は推定トランスポーター(putative transporter)、958〜1530番目の塩基配列のC領域はCorA様Mg2+トランスポータータンパク質(CorA-like Mg2+ transporter protein)、1542〜1995番目の塩基のD領域は推定膜タンパク質(putative membrane protein:S protein)をコードしていることが明らかとなった。
実施例1の結果より、断片S-mCherryに挿入されたクロモソーム断片は配列番号3に示す断片Sであることが明らかとなった。そこで、断片Sの肺炎球菌におけるプロモーター活性を調べるために、実施例1で得られた断片S-mCherryを実施例1と同様の方法で肺炎球菌に導入し、TSBY平板培地で培養して蛍光顕微鏡で観察した。コントロールとしてベクターpLS5-HSG398 revにlacプロモーター及びmCherry遺伝子を導入したプラスミド(lac_promoter-mCherry)を以下に示す方法で調製し、上記と同様に肺炎球菌に導入し、TSBY平板培地で培養して蛍光顕微鏡で観察した。なお、lac_promoter-mCherryを導入した肺炎球菌の培養においては、IPTG無しの群とIPTGを100μMとなるように加えた培地で培養した群の2群で行った。断片S-mCherryを導入した肺炎球菌の培養においては、IPTG無しである。
pmCherryプラスミド(クロンテック社製)をテンプレートとし配列番号6に示すプライマーPlac-mCherry Fと配列番号7に示すプライマーPlac-mCherry Rを用いてPCRを行い、Plac-mCherry断片を得た。得られたPCR産物は制限酵素BglIIとSacIで切断した。また、pLS21プラスミド(ATCC 6749)とpHSG398プラスミド(クロンテック社製)に基づき作製したpLS5-HSG398 revを制限酵素BamHIとSacIで切断した。pLS5-HSG398 revのマップを図5に示す。
培養した培地を蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光がみられたコロニーを3つ選択し、プレパラートを作製した。蛍光顕微鏡でプレパラート上の菌の写真を露光時間2秒で複数視野撮影し、写真上の100個の菌について輝度を測定・解析した。100個の菌の輝度の平均値から背景部分の輝度を引いた値を、そのプラスミドを持った菌の蛍光強度とした。輝度の測定・解析には画像統合ソフトNIS-elements(ニコン社製)を使用した。
各プラスミドを導入した肺炎球菌における蛍光強度を表1に、蛍光顕微鏡写真を図7示す。図7において、(a)、(b)がlac_promoter-mCherryを導入した肺炎球菌、(c)が断片S-mCherryを導入した肺炎球菌である。また、蛍光強度の数値はNIS-elementsを用いて測定した際の実測値で、1pixelあたりの「輝度」を表す。
断片Sには、図4に示すようにタンパク質をコードするA〜D領域が含まれていることから、B領域の上流の非コード領域の配列(Sp:配列番号2)が肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子の発現に大きく関与していると考えられた。そこで、上記断片Sのうち、配列番号2に示されるSpを含むプラスミド(Sp-mCherry)を以下の方法で作製して肺炎球菌を形質転換し、蛍光強度を測定した。
表2及び図9に示すように、Sp-mCherryを導入した肺炎球菌においても強い蛍光強度が観察され、Spは肺炎球菌内でmCherry遺伝子を高発現させることが明らかとなった。
Claims (4)
- 以下の(a)又は(b)に示すポリヌクレオチドからなるプロモーター。
(a)配列番号2に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントな条件が、95%以上の配列相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより配列相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である前記ポリヌクレオチド; - 配列番号2に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、配列番号3に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載のプロモーター。
- 請求項1又は2記載のプロモーターを含む組換えベクター。
- 請求項3記載の組換えベクターが導入された肺炎球菌の形質転換体。
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