JP6399589B2 - 肺炎球菌における発現プロモーター - Google Patents
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Description
本発明は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドからなるプロモーターに関する。
肺炎は日本における死亡原因の９．９％を占め、がん、心疾患に次ぐ第３位の疾患である。そして、市中における肺炎原因菌としてもっとも頻度が高いのが肺炎球菌である。
この肺炎球菌は通性嫌気性のグラム陽性双球菌である。肺炎球菌は様々な病原性因子（溶血毒、ＩｇＡ分解酵素など）を持ち、特に莢膜による宿主免疫細胞（貪食細胞）からの回避及び補体が形成する膜侵襲複合体からの防御が、宿主定着（感染）に重要である。莢膜は単純構造のため抗原性が弱く濾胞Ｂ細胞によるＴ細胞依存性の抗体生産が行なわれず、親和性の高いＩｇＧ抗体産生Ｂ細胞が発現しない。代わりに、漿膜腔に局在するＢ１細胞や脾臓辺縁帯Ｂ細胞によるＴ細胞非依存性の抗体産生が行なわれ、親和性の低いＩｇＭ抗体による応急的な免疫防御機構を誘導する。ＩｇＭ抗体が肺炎球菌莢膜に結合すると、補体系及び細胞性免疫を賦活化して肺炎球菌を駆除することができるが、本抗体産生機構においてはメモリーＢ細胞が作られないために長期の「免疫記憶」が起こらず、肺炎球菌による再感染の危険を常にはらんでいる。さらに、肺炎球菌の莢膜は判明しているだけでも９０種類以上に及ぶため、一度肺炎球菌感染を起こしても、異なる血清型のものに感染する可能性がある。
このように肺炎球菌は巧みな免疫回避機構により感染を成立させるため、免疫機能の衰えた高齢者や免疫機能が未発達な乳幼児においては特に危険な細菌である。さらに、近年、第一選択薬として用いられるβ−ｌａｃｔａｍ系の抗生物質に耐性の肺炎球菌が報告されており、治療が難しくなってきている。現在、易感染者における効果的な感染予防のために、肺炎球菌の莢膜多糖を主成分とするワクチン及び莢膜多糖にアジュバントを付加したワクチンが開発されている。これらワクチンは海外での効果的な肺炎球菌感染予防実績を有し、我が国においても数年前に認可され、ワクチン接種が広まりつつある。
肺炎球菌の病原性を理解するためには、肺炎球菌内で病原因子の遺伝子発現を調節し解析することが必要である。これまでに外来遺伝子を細胞内で発現させるためのプロモーターは、ヒトや大腸菌において、いくつか実用化されている。例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、ヒトに不顕性感染するサイトメガロウイルス由来のプロモーターであり、哺乳類細胞におけるタンパク質高発現のために使用される一般的なプロモーターである（非特許文献１参照）。細菌に関しては、多様な大腸菌株に対応可能なプロモーターとして、ｔａｃプロモーター（非特許文献２参照）が広く用いられている。ｔａｃプロモーターは、大腸菌由来のｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターを組み合わせたプロモーターで、大腸菌に目的のタンパク質を発現させる際に有用である。しかし、肺炎球菌においては、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターやｔａｃプロモーターのような一般的な高発現プロモーターは実用化されていない。そのため、肺炎球菌の肺組織内での定着機構や宿主の免疫系を回避する機構の解析など、肺炎球菌の性状・機能解析がこれまで思うように進んでいないのが現状である。したがって、肺炎球菌内で標的分子を高発現できるような効率的な発現系の開発が求められていた。
Schmidt EV, Christoph G, Zeller R, Leder P. Mol Cell Biol. (1990) 10(8): 4406-4411
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これまで大腸菌など一般的な細菌では高発現系の開発が進んでいるが、肺炎球菌は基本的な発現システムが異なるため、一般的な細菌の高発現系を肺炎球菌で利用しても、肺炎球菌で高発現させることができない。そこで、本発明の課題は、肺炎球菌内で目的遺伝子を高発現できるプロモーターを提供することにある。
発明者らは、肺炎球菌において活性の高いプロモーターを探索するなかで、肺炎球菌の病原性因子のひとつとして知られているＰｓｐＡタンパク質のプロモーターを用いれば、肺炎球菌内で目的タンパク質を発現誘導できると考えた。このＰｓｐＡタンパク質は肺炎球菌の病原性因子のひとつであり、細胞表面分子である。このＰｓｐＡタンパク質を欠損させると感染宿主内で貪食されやすくなり病原性が低下することが知られており、肺炎球菌内での発現が確実なタンパク質である。
そこで、肺炎球菌ＧＴＣ２６１株のクロモソームをテンプレートとしてＰｓｐＡタンパク質のプロモーター部位（配列番号１）をＰＣＲで増幅し、さらに、ｐｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（クロンテック社製）をテンプレートとしてｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子をＰＣＲで増幅し、これらのＰＣＲ産物を利用して図１に示す組換え大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターpLS5-HSG398-PpspA-mCherry（PpspA-mCherry）を作製した。さらに、かかる組換え大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その結果、赤色蛍光を発する複数の大腸菌ＪＭ１０９株が得られた。次に、肺炎球菌における赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙの発現を確認するため、赤色蛍光を発した大腸菌ＪＭ１０９株から発現プラスミドを抽出して肺炎球菌を形質転換したが、図２に示すように、ｌａｃプロモーターの下流にｍＣｈｅｒｒｙを連結した発現プラスミド（lac_promoter-mCherry：作製方法は後述）を肺炎球菌に導入した場合と同様、赤色蛍光を強く発する肺炎球菌は得られなかった。この結果から、肺炎球菌で目的分子の発現誘導を試みる場合、理論的に可能であると考えられるプロモーターを用いても効率のよい発現を誘導することが難しいことが明らかとなった。そのため、肺炎球菌内で目的遺伝子を高発現させるためには、新規のプロモーターの発見が必要であると考え、肺炎球菌のクロモソームを制限酵素で部分切断してスクリーニングを行ったところ、得られた膨大な断片の中から肺炎球菌内で目的遺伝子を高発現させることが可能な配列を見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
（１）（ａ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチド；の（ａ）又は（ｂ）に示すポリヌクレオチドからなるプロモーター。
（２）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、配列番号３に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）記載のプロモーター。
（３）上記（１）又は（２）記載のプロモーターを含む組換えベクター。
（４）上記（３）記載の組換えベクターが導入された肺炎球菌の形質転換体。
（１）（ａ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチド；の（ａ）又は（ｂ）に示すポリヌクレオチドからなるプロモーター。
（２）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、配列番号３に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）記載のプロモーター。
（３）上記（１）又は（２）記載のプロモーターを含む組換えベクター。
（４）上記（３）記載の組換えベクターが導入された肺炎球菌の形質転換体。
本発明のプロモーターは、肺炎球菌内で下流に連結した目的遺伝子を高発現できるという効果を奏する。かかるプロモーターを用いることで、目的遺伝子がコードするタンパク質の解析、肺炎球菌の肺組織内での定着機構や宿主の免疫系を回避する機構の解析など、肺炎球菌の性状・機能解析を行うことが可能となる。
本発明のプロモーターとしては、（ａ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチド；の（ａ）又は（ｂ）に示すポリヌクレオチドからなるプロモーターであれば特に制限されず、かかる肺炎球菌は肺炎双球菌や肺炎レンサ球菌とも呼ばれ、肺炎の原因となるグラム陽性の双球菌である。
本発明において、プロモーターとは、目的遺伝子配列の上流に配置され、ＲＮＡポリメラーゼが結合することにより、下流に配置された遺伝子の発現の制御に関わる領域の塩基配列を意味し、エンハンサー領域やリボソーム結合領域の塩基配列を含んでもよい。
本発明における配列番号２に示す塩基配列は肺炎球菌のクロモソームを制限酵素Sau3AIで処理して得られた断片に含まれていた配列であり、配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、配列番号２に示す塩基配列を含有している限り特に制限されず、配列番号３に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができ、下流に連結した目的遺伝子を発現しうるかぎり、上流又は下流に構造遺伝子の全部又は一部や、マーカー遺伝子や、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡなどの他の塩基配列を含んでいてもよく、また、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。
本発明において、配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドにおける「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、より具体的には、７０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件であり、例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning, A laboratory manual）、第３版、第６章に記載の方法で行うことができる。
上記肺炎球菌において、下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドとしては、肺炎球菌において下流に作動可能に連結した目的遺伝子を発現しうる限り特に制限されないが、たとえばｌａｃプロモーターを用いた場合と比較して、目的遺伝子を２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは５倍以上発現させるポリヌクレオチドを挙げることができる。
目的遺伝子の発現は、たとえば、プロモーターの下流に、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰなどの蛍光遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドを肺炎球菌に導入し、得られた形質転換体を、終濃度１．５％寒天末、５％脱繊維羊血液を加えたＴＳＢＹ平板培地に塗布して３７℃、５％ＣＯ2の環境で一晩培養したときの蛍光強度を測定・解析することによって求めることができる。また、蛍光強度の測定・解析は、画像統合ソフトNIS-elements（ニコン社製）などの市販のソフトを用いることによって行うことができる。
上記目的遺伝子としては、用途に合わせて全長の遺伝子でも、その一部でもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製された人工的な遺伝子でもよい。
本発明の組換えベクターに用いるベクターとしては、本発明のプロモーターを含み、該プロモーターの下流に作動可能に組み込んだ目的遺伝子を発現できるものであれば特に制限されず、直鎖状でも環状でもよく、自立複製可能であるものや、染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ターミネーターなどの制御配列や選択マーカーを含有しているものを用いてもよい。
本発明の組換えベクターが導入された肺炎球菌としては、本発明の組換えベクターが導入された肺炎球菌の形質転換体を意味する。本発明の組換えベクターの肺炎球菌への導入方法としては特に制限されず、酢酸リチウム法、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法などの化学的方法；ウイルスベクターを利用する方法、細胞融合法などの生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法などの物理的方法；などの公知の方法を例示することができる。
本発明の組換えベクターを含む肺炎球菌の形質転換体を培養することで、目的遺伝子がコードするタンパク質を効率よく生産することができる。培養方法としては肺炎球菌の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、本発明の組換えベクターが導入された肺炎球菌を３７℃前後、ｐＨ７前後、５％ＣＯ2の環境で培養することができる。目的遺伝子がコードするタンパク質は培養液又は破砕した肺炎球菌から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティなどのクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
［ｍＣｈｅｒｙを発現しうる肺炎球菌の作製］
肺炎球菌において発現能力が高いプロモーターを探索するために、肺炎球菌のクロモソームを制限酵素で部分切断し、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を含む大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターに挿入して発現プラスミドを作製し、かかる発現プラスミドを大腸菌及び肺炎球菌に導入してｍＣｈｅｒｒｙの発現を調べた。
肺炎球菌において発現能力が高いプロモーターを探索するために、肺炎球菌のクロモソームを制限酵素で部分切断し、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を含む大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターに挿入して発現プラスミドを作製し、かかる発現プラスミドを大腸菌及び肺炎球菌に導入してｍＣｈｅｒｒｙの発現を調べた。
（大腸菌・肺炎球菌シャトルベクター）
大腸菌はＪＭ１０９株を用い、肺炎球菌はＧＴＣ２６１株を用いた。大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターはpLS5-HSG398 rev-mCherry revを用いた。上記シャトルベクターは、pLS21（ATCC67492）のEcoRI断片とpHSG398のEcoRI断片を結合し、HindIII切断部位にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子（Z2522N:pmCherry由来、タカラバイオ社製）を挿入して作製した。かかるシャトルベクターは、大腸菌の複製開始点(origin of replication)、肺炎球菌の複製開始領域(repA/B/D)をもつ。さらに、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙを含んでいる。pLS21、pHSG398及びpLS5-HSG398 rev-mCherry revのマップを図３に示す。
大腸菌はＪＭ１０９株を用い、肺炎球菌はＧＴＣ２６１株を用いた。大腸菌・肺炎球菌シャトルベクターはpLS5-HSG398 rev-mCherry revを用いた。上記シャトルベクターは、pLS21（ATCC67492）のEcoRI断片とpHSG398のEcoRI断片を結合し、HindIII切断部位にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子（Z2522N:pmCherry由来、タカラバイオ社製）を挿入して作製した。かかるシャトルベクターは、大腸菌の複製開始点(origin of replication)、肺炎球菌の複製開始領域(repA/B/D)をもつ。さらに、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙを含んでいる。pLS21、pHSG398及びpLS5-HSG398 rev-mCherry revのマップを図３に示す。
（発現プラスミドの作製）
上記シャトルベクターpLS5-HSG398 rev-mCherry rev ５０ｎｇに、制限酵素BamHI（１５Ｕ／μｌ）０．５μｌとＣＩＰ（１０−３０Ｕ／μｌ）０．１２５μｌを加えて３０℃で６０分間反応させた（反応系５０μｌ）。また、肺炎球菌ＧＴＣ２６１株のクロモソーム５００ｎｇに制限酵素Sau3AI（１０Ｕ／μｌ）を１２８倍に希釈したものを１μｌ加え、３７℃で６０分間反応させた（反応系５０μｌ）。反応後に酵素の失活処理を行い、シャトルベクターの反応液と肺炎球菌クロモソームの反応液を混合してエタノール沈殿処理を行った。濃縮及び乾燥させた上記反応液混合物にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μｌ）を１μｌ添加して１６℃で一晩反応させて（反応系１０μｌ）、発現プラスミド（肺炎球菌クロモソーム断片ライブラリー）を作製した。
上記シャトルベクターpLS5-HSG398 rev-mCherry rev ５０ｎｇに、制限酵素BamHI（１５Ｕ／μｌ）０．５μｌとＣＩＰ（１０−３０Ｕ／μｌ）０．１２５μｌを加えて３０℃で６０分間反応させた（反応系５０μｌ）。また、肺炎球菌ＧＴＣ２６１株のクロモソーム５００ｎｇに制限酵素Sau3AI（１０Ｕ／μｌ）を１２８倍に希釈したものを１μｌ加え、３７℃で６０分間反応させた（反応系５０μｌ）。反応後に酵素の失活処理を行い、シャトルベクターの反応液と肺炎球菌クロモソームの反応液を混合してエタノール沈殿処理を行った。濃縮及び乾燥させた上記反応液混合物にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μｌ）を１μｌ添加して１６℃で一晩反応させて（反応系１０μｌ）、発現プラスミド（肺炎球菌クロモソーム断片ライブラリー）を作製した。
（大腸菌への発現プラスミドの導入）
井上・野島法（Inoue H, Nojima H, Okayama H. Gene(1990) 96(1):23-28）により作製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル１００μｌを、上述で作製した、ライゲーション処理後の発現プラスミド溶液に加え、氷中に３０分間静置した。その後、４２℃の環境に４５秒間静置した。５分間氷中に置いた後、ＬＢＧ液体培地（終濃度２％ ＬＢ培地、終濃度０．１％ ｇｌｕｃｏｓｅ）を１ｍｌ加えて３７℃で１時間静置し、テトラサイクリン（終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＧ平板培地（ＬＢＧ液体培地に終濃度１．５％寒天末を添加）に全量を塗布し、３０℃で二晩培養した。
井上・野島法（Inoue H, Nojima H, Okayama H. Gene(1990) 96(1):23-28）により作製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル１００μｌを、上述で作製した、ライゲーション処理後の発現プラスミド溶液に加え、氷中に３０分間静置した。その後、４２℃の環境に４５秒間静置した。５分間氷中に置いた後、ＬＢＧ液体培地（終濃度２％ ＬＢ培地、終濃度０．１％ ｇｌｕｃｏｓｅ）を１ｍｌ加えて３７℃で１時間静置し、テトラサイクリン（終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＧ平板培地（ＬＢＧ液体培地に終濃度１．５％寒天末を添加）に全量を塗布し、３０℃で二晩培養した。
（発現プラスミドの抽出）
適度な大きさになったコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光を発した４０個のコロニーを、それぞれ各々テトラサイクリン（終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＧ液体培地５ｍｌに植え継いで３０℃で一晩培養した。吸光度計を用いて濁度が１を超えていることを確認した後、一晩培養液を遠心し集菌してから、QIAprep（登録商標） Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙを発現した大腸菌ＪＭ１０９由来の発現プラスミド（以下、「ＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミド」ともいう）を抽出し、４０種類の発現プラスミドを得た。
適度な大きさになったコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光を発した４０個のコロニーを、それぞれ各々テトラサイクリン（終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＧ液体培地５ｍｌに植え継いで３０℃で一晩培養した。吸光度計を用いて濁度が１を超えていることを確認した後、一晩培養液を遠心し集菌してから、QIAprep（登録商標） Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙを発現した大腸菌ＪＭ１０９由来の発現プラスミド（以下、「ＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミド」ともいう）を抽出し、４０種類の発現プラスミドを得た。
（肺炎球菌へのＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドの導入）
肺炎球菌におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を確認するため、肺炎球菌へ４０種類のＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドをそれぞれ導入した。まず、対数増殖期にある肺炎球菌（ＧＴＣ２６１株）１ｍｌを、ＨＣｌ（終濃度１０ｍＭ）とグリシン（終濃度２０ｍＭ）を加えたＴＳＢＹ液体培地（終濃度３％ Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ、終濃度０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１００ｍｌに移して３７℃で３時間培養した。培養液は吸光度計を用いて濁度０．１程度まで肺炎球菌が増殖したことを確認した。培養液にＮａＯＨ（終濃度１０ｍＭ）を加えて中和した後、４℃、７０００ｒｐｍ、５分間遠心した。菌体をＴＢ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ、終濃度４．８８％ｇｌｕｃｏｓｅ、終濃度１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ６．５）で３回洗い、ＴＢ８００μｌに懸濁した。このＴＢ懸濁菌液２００μｌに上記抽出した４０種類のＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミド７５−２２５ｎｇをそれぞれ添加したものをエレクトロポレーション用のキュベット（０．２ｃｍギャップ）に注ぎ、MicroPulser（Bio-Rad社製）により２．９ｋＶの電流を３．７０〜３．９０ｍｓ流した。次にキュベット内の菌液に１ｍｌのＴＳＢＹ液体培地を加えて３７℃で１時間培養した。この培養液を２５０μｌ分取し、新しいＴＳＢＹ液体培地７５０μｌに加え、３７℃で２時間培養した。その後、培養液を全量が各１ｍｌとなるように１／１０と１／１０００濃度に希釈し、ＴＳＢＹ平板培地（ＴＳＢＹ培地に終濃度１．５％寒天末、５％脱繊維羊血液、終濃度０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン添加）に全量塗布した。塗布した肺炎球菌は３７℃、５％ＣＯ2の環境で一晩培養した。適度な大きさになったそれぞれのコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光を発しているコロニー、すなわち肺炎球菌でｍＣｈｅｒｒｙを強く発現している株（ＧＴＣ２６１−Ｓ株）が得られた。なお、ＧＴＣ２６１−Ｓ株に導入したＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドを、以後「断片Ｓ-mCherry」ともいう。
肺炎球菌におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を確認するため、肺炎球菌へ４０種類のＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドをそれぞれ導入した。まず、対数増殖期にある肺炎球菌（ＧＴＣ２６１株）１ｍｌを、ＨＣｌ（終濃度１０ｍＭ）とグリシン（終濃度２０ｍＭ）を加えたＴＳＢＹ液体培地（終濃度３％ Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ、終濃度０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１００ｍｌに移して３７℃で３時間培養した。培養液は吸光度計を用いて濁度０．１程度まで肺炎球菌が増殖したことを確認した。培養液にＮａＯＨ（終濃度１０ｍＭ）を加えて中和した後、４℃、７０００ｒｐｍ、５分間遠心した。菌体をＴＢ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ、終濃度４．８８％ｇｌｕｃｏｓｅ、終濃度１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ６．５）で３回洗い、ＴＢ８００μｌに懸濁した。このＴＢ懸濁菌液２００μｌに上記抽出した４０種類のＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミド７５−２２５ｎｇをそれぞれ添加したものをエレクトロポレーション用のキュベット（０．２ｃｍギャップ）に注ぎ、MicroPulser（Bio-Rad社製）により２．９ｋＶの電流を３．７０〜３．９０ｍｓ流した。次にキュベット内の菌液に１ｍｌのＴＳＢＹ液体培地を加えて３７℃で１時間培養した。この培養液を２５０μｌ分取し、新しいＴＳＢＹ液体培地７５０μｌに加え、３７℃で２時間培養した。その後、培養液を全量が各１ｍｌとなるように１／１０と１／１０００濃度に希釈し、ＴＳＢＹ平板培地（ＴＳＢＹ培地に終濃度１．５％寒天末、５％脱繊維羊血液、終濃度０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン添加）に全量塗布した。塗布した肺炎球菌は３７℃、５％ＣＯ2の環境で一晩培養した。適度な大きさになったそれぞれのコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光を発しているコロニー、すなわち肺炎球菌でｍＣｈｅｒｒｙを強く発現している株（ＧＴＣ２６１−Ｓ株）が得られた。なお、ＧＴＣ２６１−Ｓ株に導入したＪＭ１０９由来ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドを、以後「断片Ｓ-mCherry」ともいう。
［クロモソーム断片のシークエンス解析］
断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片を含む領域をＰＣＲで増幅し、シークエンス解析を行った。
断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片を含む領域をＰＣＲで増幅し、シークエンス解析を行った。
（ＰＣＲ法）
上記「発現プラスミドの抽出」で得た断片Ｓ-mCherry ２００ｎｇにつきPrimeSTAR HS DNA Polymerase（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、５×PrimeSTAR Buffer１０μｌ、dNTP Mixture（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）４μｌ、配列番号４に示すプライマーseq Fと配列番号５に示すプライマーseq R（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各１μｌを加えて、５０μｌ系で反応を行った。アニーリング、伸長時の温度と反応時間は各々適切なものを選択した。ＰＣＲ反応後のＤＮＡは、精製、濃度測定を行い、シークエンス解析に使用した。
上記「発現プラスミドの抽出」で得た断片Ｓ-mCherry ２００ｎｇにつきPrimeSTAR HS DNA Polymerase（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、５×PrimeSTAR Buffer１０μｌ、dNTP Mixture（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）４μｌ、配列番号４に示すプライマーseq Fと配列番号５に示すプライマーseq R（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各１μｌを加えて、５０μｌ系で反応を行った。アニーリング、伸長時の温度と反応時間は各々適切なものを選択した。ＰＣＲ反応後のＤＮＡは、精製、濃度測定を行い、シークエンス解析に使用した。
（シークエンス解析）
上述で得られたＰＣＲ反応後のＤＮＡ、すなわち断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片とｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の一部を含む範囲の配列をシークエンス解析した。すでに塩基配列が解析されたゲノムから相同性の高い配列を探すため、解析で得られた配列を、ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）で相同性検索した。
上述で得られたＰＣＲ反応後のＤＮＡ、すなわち断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片とｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の一部を含む範囲の配列をシークエンス解析した。すでに塩基配列が解析されたゲノムから相同性の高い配列を探すため、解析で得られた配列を、ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）で相同性検索した。
（シークエンス解析結果）
シークエンス解析の結果、断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片の配列は、配列番号３に示す塩基配列（図４）であることが明らかとなった。かかる結果より、配列番号３に示す塩基配列は肺炎球菌において目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドであることが明らかとなった。なお、以下、配列番号３に示す塩基配列を、以後「断片Ｓ」ともいう。また、ＢＬＡＳＴによる相同検索の結果、配列番号３に示す塩基配列のうち、１〜４５３番目の塩基配列のＡ領域はＵｖｒＡＢＣシステムタンパク質Ａ（UvrABC system protein A）、５８５〜８１８番目の塩基配列のＢ領域は推定トランスポーター（putative transporter）、９５８〜１５３０番目の塩基配列のＣ領域はＣｏｒＡ様Ｍｇ2+トランスポータータンパク質（CorA-like Mg2+ transporter protein）、１５４２〜１９９５番目の塩基のＤ領域は推定膜タンパク質（putative membrane protein:S protein）をコードしていることが明らかとなった。
シークエンス解析の結果、断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片の配列は、配列番号３に示す塩基配列（図４）であることが明らかとなった。かかる結果より、配列番号３に示す塩基配列は肺炎球菌において目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドであることが明らかとなった。なお、以下、配列番号３に示す塩基配列を、以後「断片Ｓ」ともいう。また、ＢＬＡＳＴによる相同検索の結果、配列番号３に示す塩基配列のうち、１〜４５３番目の塩基配列のＡ領域はＵｖｒＡＢＣシステムタンパク質Ａ（UvrABC system protein A）、５８５〜８１８番目の塩基配列のＢ領域は推定トランスポーター（putative transporter）、９５８〜１５３０番目の塩基配列のＣ領域はＣｏｒＡ様Ｍｇ2+トランスポータータンパク質（CorA-like Mg2+ transporter protein）、１５４２〜１９９５番目の塩基のＤ領域は推定膜タンパク質（putative membrane protein:S protein）をコードしていることが明らかとなった。
［断片Ｓを含むプラスミドで形質転換した肺炎球菌における蛍光強度の測定］
実施例１の結果より、断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片は配列番号３に示す断片Ｓであることが明らかとなった。そこで、断片Ｓの肺炎球菌におけるプロモーター活性を調べるために、実施例１で得られた断片Ｓ-mCherryを実施例１と同様の方法で肺炎球菌に導入し、ＴＳＢＹ平板培地で培養して蛍光顕微鏡で観察した。コントロールとしてベクターpLS5-HSG398 revにｌａｃプロモーター及びｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を導入したプラスミド（lac_promoter-mCherry）を以下に示す方法で調製し、上記と同様に肺炎球菌に導入し、ＴＳＢＹ平板培地で培養して蛍光顕微鏡で観察した。なお、lac_promoter-mCherryを導入した肺炎球菌の培養においては、ＩＰＴＧ無しの群とＩＰＴＧを１００μＭとなるように加えた培地で培養した群の２群で行った。断片Ｓ-mCherryを導入した肺炎球菌の培養においては、ＩＰＴＧ無しである。
実施例１の結果より、断片Ｓ-mCherryに挿入されたクロモソーム断片は配列番号３に示す断片Ｓであることが明らかとなった。そこで、断片Ｓの肺炎球菌におけるプロモーター活性を調べるために、実施例１で得られた断片Ｓ-mCherryを実施例１と同様の方法で肺炎球菌に導入し、ＴＳＢＹ平板培地で培養して蛍光顕微鏡で観察した。コントロールとしてベクターpLS5-HSG398 revにｌａｃプロモーター及びｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を導入したプラスミド（lac_promoter-mCherry）を以下に示す方法で調製し、上記と同様に肺炎球菌に導入し、ＴＳＢＹ平板培地で培養して蛍光顕微鏡で観察した。なお、lac_promoter-mCherryを導入した肺炎球菌の培養においては、ＩＰＴＧ無しの群とＩＰＴＧを１００μＭとなるように加えた培地で培養した群の２群で行った。断片Ｓ-mCherryを導入した肺炎球菌の培養においては、ＩＰＴＧ無しである。
（lac_promoter-mCherryの作製）
pmCherryプラスミド（クロンテック社製）をテンプレートとし配列番号６に示すプライマーPlac-mCherry Fと配列番号７に示すプライマーPlac-mCherry Rを用いてＰＣＲを行い、Plac-mCherry断片を得た。得られたＰＣＲ産物は制限酵素BglIIとSacIで切断した。また、pLS21プラスミド（ATCC 6749）とpHSG398プラスミド（クロンテック社製）に基づき作製したpLS5-HSG398 revを制限酵素BamHIとSacIで切断した。pLS5-HSG398 revのマップを図５に示す。
pmCherryプラスミド（クロンテック社製）をテンプレートとし配列番号６に示すプライマーPlac-mCherry Fと配列番号７に示すプライマーPlac-mCherry Rを用いてＰＣＲを行い、Plac-mCherry断片を得た。得られたＰＣＲ産物は制限酵素BglIIとSacIで切断した。また、pLS21プラスミド（ATCC 6749）とpHSG398プラスミド（クロンテック社製）に基づき作製したpLS5-HSG398 revを制限酵素BamHIとSacIで切断した。pLS5-HSG398 revのマップを図５に示す。
制限酵素処理済みのPlac-mCherry断片とベクターpLS5-HSG398 revを混合し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μｌ）を１μｌ添加して１６℃で一晩反応させた（反応系１０μｌ）。ライゲーション産物を上述の井上・野島法により作製した大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルに混合して大腸菌ＪＭ１０９へ遺伝子導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたコロニーから上述のプラスミドの抽出と同様の方法でプラスミドを抽出し、pLS5-HSG398 rev-Plac-mCherry（lac_promoter-mCherry）プラスミド（図６）を得た。
（蛍光観察）
培養した培地を蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光がみられたコロニーを３つ選択し、プレパラートを作製した。蛍光顕微鏡でプレパラート上の菌の写真を露光時間２秒で複数視野撮影し、写真上の１００個の菌について輝度を測定・解析した。１００個の菌の輝度の平均値から背景部分の輝度を引いた値を、そのプラスミドを持った菌の蛍光強度とした。輝度の測定・解析には画像統合ソフトNIS-elements（ニコン社製）を使用した。
培養した培地を蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光がみられたコロニーを３つ選択し、プレパラートを作製した。蛍光顕微鏡でプレパラート上の菌の写真を露光時間２秒で複数視野撮影し、写真上の１００個の菌について輝度を測定・解析した。１００個の菌の輝度の平均値から背景部分の輝度を引いた値を、そのプラスミドを持った菌の蛍光強度とした。輝度の測定・解析には画像統合ソフトNIS-elements（ニコン社製）を使用した。
（結果）
各プラスミドを導入した肺炎球菌における蛍光強度を表１に、蛍光顕微鏡写真を図７示す。図７において、（ａ）、（ｂ）がlac_promoter-mCherryを導入した肺炎球菌、（ｃ）が断片Ｓ-mCherryを導入した肺炎球菌である。また、蛍光強度の数値はNIS-elementsを用いて測定した際の実測値で、１ｐｉｘｅｌあたりの「輝度」を表す。
各プラスミドを導入した肺炎球菌における蛍光強度を表１に、蛍光顕微鏡写真を図７示す。図７において、（ａ）、（ｂ）がlac_promoter-mCherryを導入した肺炎球菌、（ｃ）が断片Ｓ-mCherryを導入した肺炎球菌である。また、蛍光強度の数値はNIS-elementsを用いて測定した際の実測値で、１ｐｉｘｅｌあたりの「輝度」を表す。
表１及び図７に示すように、断片Ｓ-mCherryを導入した肺炎球菌では、lac_promoter-mCherryで形質転換した肺炎球菌と比較して、ＩＰＴＧ無しに対して７倍以上、ＩＰＴＧ１００μＭに対して５倍以上も蛍光強度が高く、断片Ｓは肺炎球菌内でｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を高発現させることが明らかとなった。
［断片Ｓの一部を含むプラスミドで形質転換した肺炎球菌における蛍光強度の測定］
断片Ｓには、図４に示すようにタンパク質をコードするＡ〜Ｄ領域が含まれていることから、Ｂ領域の上流の非コード領域の配列（Ｓｐ：配列番号２）が肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子の発現に大きく関与していると考えられた。そこで、上記断片Ｓのうち、配列番号２に示されるＳｐを含むプラスミド（Sp-mCherry）を以下の方法で作製して肺炎球菌を形質転換し、蛍光強度を測定した。
断片Ｓには、図４に示すようにタンパク質をコードするＡ〜Ｄ領域が含まれていることから、Ｂ領域の上流の非コード領域の配列（Ｓｐ：配列番号２）が肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子の発現に大きく関与していると考えられた。そこで、上記断片Ｓのうち、配列番号２に示されるＳｐを含むプラスミド（Sp-mCherry）を以下の方法で作製して肺炎球菌を形質転換し、蛍光強度を測定した。
ＧＴＣ２６１株のクロモソームをテンプレートとし配列番号８に示す プライマーSp Fと配列番号９に示すプライマーSp Rを用いてＰＣＲを行い、Ｓｐ断片を得た。得られたＰＣＲ産物は制限酵素SphIとNdeIで切断した。また、pmCherryプラスミド（クロンテック社製）をテンプレートとし配列番号１０に示すプライマーmCherry Fと配列番号１１に示すプライマーmCherry Rを用いてＰＣＲを行い、Ｓｐ断片の下流に挿入するｍＣｈｅｒｒｙ断片を得た。得られたＰＣＲ産物は制限酵素NdeIとBamHIで切断した。さらに、ベクターpLS5-HSG398 revを制限酵素SphIとBamHIで切断した。
得られた制限酵素処理済みのＳｐ断片、ｍＣｈｅｒｒｙ断片及びベクターpLS5-HSG398 revを混合し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μｌ）を１μｌ添加して１６℃で一晩反応させた（反応系１０μｌ）。ライゲーション産物を上述の井上・野島法により作製した大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルに混合して大腸菌ＪＭ１０９へ遺伝子導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたコロニーから上述のプラスミドの抽出と同様の方法でプラスミドを抽出し、pLS5-HSG398-rev-Sp-mCherry（Sp-mCherry）プラスミド（図８）を得た。
上述で作製したSp-mCherryを用いて実施例１と同様の方法で肺炎球菌ＧＴＣ２６１株を形質転換し、実施例２と同様の方法で培養し、蛍光強度を測定した。結果を表２及び図９に示す。
（結果）
表２及び図９に示すように、Sp-mCherryを導入した肺炎球菌においても強い蛍光強度が観察され、Ｓｐは肺炎球菌内でｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を高発現させることが明らかとなった。
表２及び図９に示すように、Sp-mCherryを導入した肺炎球菌においても強い蛍光強度が観察され、Ｓｐは肺炎球菌内でｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を高発現させることが明らかとなった。
本発明のプロモーターは肺炎球菌内で目的遺伝子を高発現できることから、肺炎球菌の肺組織内での定着機構や宿主の免疫系を回避する機構の解析、又は肺炎球菌の病原因子を標的としたワクチン開発の分野において利用可能である。
Claims (4)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すポリヌクレオチドからなるプロモーター。
（ａ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肺炎球菌において下流に連結した目的遺伝子を発現しうるポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントな条件が、９５％以上の配列相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより配列相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である前記ポリヌクレオチド； - 配列番号２に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、配列番号３に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
- 請求項１又は２記載のプロモーターを含む組換えベクター。
- 請求項３記載の組換えベクターが導入された肺炎球菌の形質転換体。
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