KR20150056611A - B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원 단백질 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원 단백질 및 이를 포함하는 백신 Download PDF

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Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질, 표면 항원 단백질, 이들의 단편 및 조합을 코딩하는 핵산 서열, 및 상기 단백질 서열을 발현하는 유전자 작제물/벡터 및 백신이 본 명세서에서 제공된다. 이 백신은 세포 물질 및 체액 물질 둘 다를 동원함으로써 말초에서 및 간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. HBV에 대해 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 개체를 면역화하는 방법이 또한 제공된다. 조합 백신은 또한 HBV 공격에 대한 특정한 수준의 면역 반응을 위한 특정한 설계 백신에 사용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원 단백질 및 이를 포함하는 백신{HEPATITIS B VIRUS CORE PROTEIN AND SURFACE ANTIGEN PROTEIN AND VACCINE COMPRISING THE SAME}
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질, 표면 항원 단백질, 이들의 단편 및 조합을 코딩하는 핵산 서열, B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질, 표면 항원 단백질, 이들의 단편 및 조합, 개선된 HBV 백신, HBV에 대해 면역 반응을 유도하는 개선된 방법 및 HBV에 대해 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 개체를 면역화하는 개선된 방법에 관한 것이다.
B형 간염은 간경변, 간부전 및 간세포암의 발생을 일으키는 전세계에 걸쳐 널리 퍼져 있는 일반적인 감염이다. 상당한 수의 간염 사례는 질병의 무증상 성질로 인해 보고되지 않고 있다. 그럼에도 불구하고, 약 3억 5천만개의 만성 B형 간염 사례가 매년 보고되고 있다. 간염에 감염된 집단의 대부분은 저개발국 또는 개발도상국에 있다.
바이러스는 외막 단백질에 존재하는 항원 에피토프에 기초하여 4가지 주요 혈청형(adr, adw, ayr, ayw)으로 나뉜다. 게놈 서열의 변이에 따라 적어도 8가지 유전자형(A-H)의 HBV가 있다. HBV의 대안적인 유전자형은 지리적 분포가 널리 퍼져 있다.
표 1은 HBV 유전자형의 지리적 분포를 나타낸다.
Figure pct00001
HBV 게놈은 주로 이중 가닥이지만 하나의 가닥이 다른 가닥보다 더 길어서 생긴 단일 가닥 영역이 있는 원형 DNA 분자이다. 이중 가닥 영역은 약 3320개의 뉴클레오타이드인 더 긴 가닥에 대한 약 3020개의 뉴클레오타이드의 더 짧은 가닥의 혼성화에 의해 생긴다. 더 긴 가닥의 비혼성화 뉴클레오타이드 상의 단일 가닥 영역은 HBV DNA 폴리머라제와 회합된다. HBV 게놈 DNA 및 HBV DNA 폴리머라제는 둘 다 다수의 HBV 코어 단백질(HBcAg) 분자에 의해 형성된 뉴클레오캡시드 내에 포함된다. HBV 코어 단백질은 HBV 표면 단백질 또는 항원(HBsAg) 및 지질 분자에 의해 싸여있다.
HBV 게놈은 7개의 상이한 단백질을 코딩하는 4개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF), 즉 1) HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 ORF, 2) 2개의 출발 코돈을 갖는 ORF(여기서, 제2 출발 코돈에 연결된 서열은 코어 단백질을 코딩하고, 추가의 상류 출발 코돈을 포함하는 서열은 pre-C라 칭하는 서열을 코딩함); 3) 3개의 출발 코돈을 갖는 ORF(여기서, 한개는 표면 단백질(S 단백질; gp27)을 코딩하고, 한개는 pre-S2라 칭하는 서열(gp36)을 코딩하는 상류 출발 코돈을 포함하며, 다른 것은 pre-S1이라 칭하는 서열(gp42)을 코딩하는 더 상류의 출발 코돈을 포함함); 및 4) HBxAg(이 단백질의 기능은 덜 이해됨)를 코딩하는 ORF를 함유한다(도 1). 이들은 3개의 표면 단백질 또는 항원(HBsAg): preS1, preS2 및 메이저 S를 포함한다.
HBsAg의 특징은 도 2에 도시되어 있다. 아형 특이성의 발현에 관여하는 HBsAg의 에피토프는 HBV 표면 항원 분자의 2개의 외부 루프를 포함하는 영역(즉, S 단백질의 110-180번 아미노산)에 위치하고, HBV 균주가 항원상 다양하게 하는 것이다. 동일한 영역은 공지된 HBV 야생형 균주의 모두에 공통인 HBsAg의 "하나의" 결정인자를 규정하는 알려지지 않은 수의 에피토프를 함유한다.
HBV 감염에 대한 예방 백신 및 치료법은 만성 보균자의 혈장으로부터의 정제된 서브바이러스 입자(subviral particle), 또는 안정적으로 형질감염된 진핵 세포주에서 재조합 단백질로서 생산된 서브바이러스 입자의 주입을 포함한다. 서브바이러스 입자는 바이러스 단백질이며, 이러한 백신은 종종 서브유닛 백신이라 칭한다. HBV 단백질은 개체에게 투여되어 개체의 면역계를 위한 표적이 된다. 감염되지 않은 개체에서, 서브유닛 백신에 대한 면역 반응은 HBV 감염으로부터 감염되지 않은 개체를 보호한다. 감염된 개체에서, 백신에 의해 유도된 면역 반응은 치료 효과를 가질 수 있다.
문헌[Chisari F.V., Am J Pathol., 2000. 156:1117-1132 및 Pumpeus P. et al. Intervirology 2001. 44:98-114]은 HBV 게놈 조직을 개시한다. 문헌[Deny P. and F. Zoulim, Pathologie Biologie 2010, Aug, 58(4):245 53]은 B형 간염 바이러스 진단 및 치료를 논의한다. 문헌[Michel M.L. and P. Tiollais, Pathologie Biologie 2010, Aug, 58(4):288 95]은 B형 간염 백신 및 이의 보호 효능 및 치료 가능성을 논의한다. PCT 공개 WO 제2004026899호는 HBV 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 서열을 함유하는 면역원의 용도를 개시한다. PCT 공개 출원 WO 제2008093976호는 HBV 코딩 서열, 단백질 및 백신, 예를 들어 재조합 전장 HBV 표면 항원 및 HBV 코어 항원을 포함하는 백신을 개시한다. 전체 HBV 표면 항원은 3가지 유형의 표면 단백질(L 단백질, M 단백질 및 S 단백질)로 이루어진다. PCT 공개 출원 WO 제2009130588호는 인간에서의 발현에 최적화된 코돈인 B형 간염 바이러스 코어 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 HBV 코딩 서열, 단백질 및 백신을 개시한다. PCT 공개 WO 제2010127115호는 재조합 벡터를 사용한 HBV 서열의 전달을 개시한다.
이용가능한 HBV 백신은 약간의 효능을 나타내지만, 생산하기에 값이 비싸다. 또한, 혈장 유래 서브유닛 백신은 또한 안전성에 대한 우려가 있다. 재조합 생 벡터(live vector), 합성 펩타이드, 및 HBV 단백질의 코돈 최적화된 코딩 서열을 포함하는 DNA 백신에 기초한 것을 포함하여 여러 가지 백신 접근법이 연구되었다. 이제까지 이러한 다른 접근법에는 다양한 제한된 효능이 있었다. 추가로, 게놈 차이로 인해, 일부 HBV 백신은 일부 지리적 지역에서 긍정적인 효능을 나타내고 다른 지역에서는 제한된 효능을 나타냈다.
S 단백질을 코딩하는 DNA로 형질감염된 효모로부터 유래한 현재 이용가능한 HBsAg 기반 백신(예를 들어, 벨기에에 위치한 스미스클라인 바이올로지컬스(SmithKline Biologicals)로부터 구입 가능한 엔제릭스-비(ENGERIX-B) 및 미국에 위치한 머크 앤 코(Merck & Co.)로부터 구입 가능한 레콤비박스(RECOMBIVAX)/HB-VAX II))은 약 5% 내지 10%의 개체에서 반응을 유발하지 않는다(C. Belloni, Immunogenicity of hepatitis B vaccine in term and preterm infants. Acta Paediatrica, 1998. 87: p. 336-338). 추가로, 비반응 속도는 더 늙은 개체에서 30%로 증가하고, HBV에 대한 면역력은 백신접종 후 몇년 감소할 수 있다. 다회 용량이 완전한 보호를 달성하기 위해 또한 이용된다. 엔제릭스-비가 중추 신경계(CNS) 염증성 탈수초의 위험을 3배화하므로, 안전성은 HBsAg 기반 백신 엔제릭스-비와 관련이 있다.
포유동물 세포로부터 유래한 다른 HBsAg 기반 백신은 S 단백질 이외에 프레-S1 및 프레-S2를 이용한다. 프레-S1 및 프레-S2 항원은 높은 면역원성 T 및 B 세포 에피토프를 발현하고, 이러한 하나의 백신은 약 80%의 비반응 또는 저반응 개체에서 면역 반응을 유발한다(Rendi-Wagner, P. et al., Comparative Immunogenicity of PreS/S hepatitis B vaccine in non- and low responders to conventional vaccine. Vaccine, 2006. 24: p. 2781-9.).
동물 및 인간 질병에 대해 백신접종하기 위한 핵산 서열의 직접 투여가 연구되었고, 원하는 항원의 필수적인 발현을 생성하기 위해 핵산 전달의 효과적이고 효율적인 수단에 많은 노력이 집중되었으며, 면역원성 반응 및 궁극적으로 이러한 기술의 성공을 가져왔다.
DNA 백신은 내인성 항원 합성을 가능하게 하며, 이러한 합성은 서브유닛 백신으로 거의 얻어지지 않는 I형 제한된 세포독성 T 림프구인 CD8+ 조직적합성 복합체를 유도한다. 또한, 지속된 기간에 걸쳐서 일어나는 항원 합성은 낮은 반응성을 극복하고 보강 접종에 대한 필요조건을 제거하거나 줄이는 것을 도울 수 있다. 추가로, DNA 백신은 매우 안정적이고 생산하기에 간단한 것으로 보인다.
DNA 백신은 안전하고, 안정적이며, 용이하게 생산되고, 인간에서 잘 받아들여지며, 전임상 실험은 플라스미드 통합의 증거를 거의 나타내지 않는다[Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. 또한, DNA 백신은 백신의 효능이 벡터에 대한 기존의 항체 역가에 의해 영향을 받지 않는다는 사실로 인해 반복 투여에 대해 매우 적합하다[Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. 그러나, DNA 백신의 임상 채택에 대한 하나의 주요 장애는 더 큰 동물로 이동할 때 플랫폼의 면역원성의 감소이다[Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40].
DNA 백신 면역원의 조작에 있어서의 최근의 기술상 진보는 DNA 백신의 발현 및 면역원성을 개선시켰으며, 이와 같은 것으로는 코돈 최적화, RNA 최적화 및 면역글로불린 선도 서열의 추가[Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], 및 전기천공법과 같은 플라스미드 전달 시스템에서 최근에 개발된 기술[Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]을 갖는다. 생체내 전기천공 기술은 항암 약물, 예컨대 블레오마이신을 전달하기 위해 인간 임상 실험에서, 그리고 다수의 동물 종에서의 많은 전임상 연구에서 사용되었다. 또한, 연구는 컨센서스 면역원의 사용이 네이티브 항원 단독과 비교하여 세포성 면역 반응의 범위를 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다[Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14].
상이한 HBV 항원에 대한 항체 및 세포독성 T 세포(CTL)는 바이러스 로드를 감소시키고 간으로부터 HBV 감염된 세포를 청소하는 데 관여할 수 있다. 현재의 백신 후보물질에 대한 주요 공격은 다수의 HBV 항원 표적 및 HBV의 주요 유전자형에 대한 체액 면역 및 세포 면역 둘 다의 유도이다. HBV 단백질을 코딩하는 핵산 작제물 및 HBV에 대해 면역 반응을 유도하는 데 유용한 조성물에 대한 수요가 존재한다. 경제적이고 효과적인 HBV에 대한 효과적인 백신에 대한 수요가 존재한다. 중화 항체 수준을 증가시키고 T 세포 성분을 발생시키는 효과적인 백신에 대한 수요가 존재한다. HBV에 대해 효과적인 백신, 예를 들어 광범위한 범위의 유전자형을 갖는 HBV 균주에 대해 효과적인 백신, 바람직하게는, 세계적으로 효과적인 보편적 백신에 대한 수요가 존재한다.
본 발명은 (a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자; (b) 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 10의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질 및 서열 번호 14의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (c) 서열 번호 12, 서열 번호 16, 서열 번호 12의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질 및 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 및 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자; (b) 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 10의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질 및 서열 번호 14의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (c) 서열 번호 12, 서열 번호 16, 서열 번호 12의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질 및 서열 번호 16의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것일 수 있다.
백신은 상기 기재된 핵산을 포함하는 플라스미드일 수 있다. 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 편입될 수 있다. 백신은 아쥬반트 분자(adjuvant molecule)를 추가로 포함할 수 있다. 아쥬반트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 또는 이들의 조합; 및 몇몇 실시형태에서, IL-12, IL-15, IL-28 또는 RANTES일 수 있다.
본 발명은, 또한 본 발명의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 또한 본 발명의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 추가로 본 발명의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로 진단된 대상체를 보호하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 HBV에 대해 면역 반응을 유도하는 데 유용한 백신을 추가로 포함한다. 다수의 유전자형에 대해 광범위한 효과를 갖는 HBV 면역 치료 백신의 개발은 보편적으로 보존된 HBV-코어 특이적 항원을 표적화하는 것에 기초한 HBV 감염에 대한 치료학적 DNA 백신을 사용하여 제공될 수 있다. 컨센서스 HBV 면역원의 이용은 더 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하고, 상이한 바이러스 균주 중에서 서열 비유사성의 정도를 최소화하는 데 유용할 수 있다.
서열 번호 2를 포함하는 단백질, 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질; 서열 번호 2의 단편; 서열 번호 2의 단편에 95% 동일한 단백질; 서열 번호 4, 서열 번호 4의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질; 서열 번호 4의 단편; 서열 번호 4의 단편과 95% 동일한 단백질, 서열 번호 6, 서열 번호 6의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질; 서열 번호 6의 단편; 및 서열 번호 6의 단편과 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이 본 명세서에 제공된다.
(a) 서열 번호 2; (b) 서열 번호 2에 기재된 전장 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질; (c) 서열 번호 2의 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 2의 면역원성 단편; 및 (d) 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이 본 명세서에 또한 제공된다.
상기 기재된 하나 이상의 단백질 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1; 서열 번호 1의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 핵산 서열; 서열 번호 1의 단편; 서열 번호 1의 단편에 95% 동일한 핵산 서열; 서열 번호 3; 서열 번호 3의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 핵산 서열; 서열 번호 3의 단편; 서열 번호 3의 단편에 95% 동일한 핵산 서열; 서열 번호 5; 서열 번호 5의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 핵산 서열; 서열 번호 5의 단편; 및 서열 번호 5의 단편에 95% 동일한 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇 양상은, HBV 코어 항원 및/또는 HBV 표면 항원 분자 및/또는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양상은 HBV 감염에 대해 개체를 보호하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이러한 핵산 서열을 포함하는 예방학적 유효량의 핵산 분자 또는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하고; 이 핵산 서열은 상기 개체의 세포에서 발현되고, 보호 면역 반응은 상기 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질에 대해 유도된다.
본 발명의 몇몇 양상에서, HBV에 의해 감염된 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 이러한 핵산 분자 및/또는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 다른 양상에서 (a) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16을 포함하는 단백질; (b) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질; (c) 적어도 20개의 아미노산인 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16을 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 (d) 적어도 20개의 아미노산인 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
핵산 분자는 (a) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15을 포함하는 핵산 서열; (b) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 핵산 서열; (c) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15에 의해 코딩된 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이의 단편; 및 (d) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 플라스미드일 수 있다. 핵산 분자는 발현 벡터일 수 있고, 상기 하나 이상의 단백질을 코딩하는 서열은 조절 구성요소에 작동적으로 연결된다. 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 편입될 수 있다.
본 발명의 몇몇 양상은, 본 발명의 핵산 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 몇몇 양상은, 본 발명의 핵산 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 몇몇 양상은, 본 발명의 핵산 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로 진단된 대상체를 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 양상에서 (a) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16; (b) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질; (c) 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 면역원성 단편; 및 (d) 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 제공한다.
본 발명의 몇몇 양상은 본 발명의 핵산 분자 및 아쥬반트 분자를 포함하는 대상체에서 HBV에 대해 면역 반응을 생성하는 데 유용한 백신을 제공한다. 아쥬반트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 또는 이들의 조합; 및 몇몇 실시형태에서, IL-12, IL-15, IL-28 또는 RANTES일 수 있다.
도 1은 4개의 중첩하는 ORF로 이루어진 HBV 게놈의 구성을 보여주는 맵이다.
도 2는 HBV 표면 항원의 구성 및 특징을 예시한다.
도 3은 컨센서스 HBV 표면 항원에서의 IgELS 및 엔도단백분해 분할 부위(endoproteolytic cleavage site)를 예시한다.
도 4는 긴 컨센서스 HBV 표면 항원(LHBs) 및 작은 컨센서스 HBV 표면 항원(SHBs)을 예시한다.
도 5는 벡터 pGX1801 HepB - Mcore(서열 번호 17)의 맵이다.
도 6은 벡터 pGX1802 HepB pLHBs-A(서열 번호 18)의 맵이다.
도 7은 벡터 pGX1803 HepB pLHBs-C(서열 번호 19)의 맵이다.
도 8은 벡터 pGX1804 HepB pSHBs-A(서열 번호 20)의 맵이다.
도 9는 벡터 pGX1805 HepB SHBs-C(서열 번호 21)의 맵이다.
도 10은 개별 유전자형 A, B, C, D 및 E와 비교한 HBcAg 컨센서스 서열의 계통발생 분석을 예시한다.
도 11a 및 도 11b는 pM Core 발현 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 도 11a는 실험실내 번역 프로토콜로부터의 결과를 나타낸다. 도 11b는 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 12는 플라스미드 맵 및 pMCore의 서열을 예시하는 그래프이다.
도 13은 pMCore 플라스미드를 사용한 전사/번역 반응을 나타내고, 여기서 생성된 MCore 단백질은 항-HA 단일클론 항체로 면역 침강되고 SDS-PAGE 겔에서 실행된다.
도 14는 1차 단일클론 HA 태크 항체를 사용한 일시적으로 형질감염된 세포에서의 MCore 단백질의 검출, 이어서 DyLight 594-표지된 항-래빗 2차 항체에 의한 검출을 나타낸다. 훽스트(Hoechst) 균주는 세포 핵을 형광 표지하기 위해 또한 사용된다. MCore의 발현은 핵의 바깥을 염색함으로써 보이는 것처럼 세포질에 대부분 국재화된다.
도 15는 면역법 계획을 예시한다. 4마리의 마우스를 30㎍의 pMCore로 근육내 면역화하였다.
도 16은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스의 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 증대된 다량의 IFN-γ 분비를 나타낸다.
도 17은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스의 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 증대된 다량의 IFN-γ 분비를 나타낸다.
도 18은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스의 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 증대된 다량의 TNF-α 분비를 나타낸다.
도 19는 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스의 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 증대된 다량의 TNF-α 분비를 나타낸다.
도 20은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스의 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 증대된 다량의 CD 107a 분비를 나타낸다.
도 21은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스의 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 증대된 다량의 CD 107a 분비를 나타낸다.
도 22는 대조군 pVAX 또는 컨센서스 코어 항원 pMCore로 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 HBcAg-특이적 CD4 또는 CD8 IFN-γ+, TNF-α+ 분비 세포의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 23은 대조군 pVAX 또는 컨센서스 코어 항원 pMCore로 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 HBcAg-특이적 CD4 또는 CD8 이중 양성 생산 세포의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 24는 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스로부터의 간에서의 인터페론-감마 T 세포 반응을 나타낸다.
도 25는 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스로부터의 간에서의 인터페론-감마 T 세포 반응을 나타낸다.
도 26은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스로부터의 간에서의 종양 괴사 인자-α T 세포 반응을 나타낸다.
도 27은 pM-코어로 백신접종된 Balb/C 마우스로부터의 간에서의 종양 괴사 인자-α T 세포 반응을 나타낸다.
도 28은 대조군 pVAX 또는 컨센서스 코어 항원 pMCore로 면역화된 Balb/c 마우스의 간에서의 HBcAg-특이적 CD4 및 CD8 IFN-γ+, TNF-α+ 생산 세포의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 29는 대조군 pVAX 또는 컨센서스 코어 항원 pMCore로 면역화된 Balb/c 마우스의 간에서의 HBcAg-특이적 CD4 또는 CD8 이중 양성 생산 세포의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 30은 항원-특이적 항체 생산 비장세포를 나타낸다. 값은 평균 ± 평균의 표준 오차이다. 유의도는 스튜던츠 t 테스트에 의해 결정된다.
도 31은 ELISPOT 검정으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 32는 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 자극 후 백만개의 비장세포당 HBcAg-특이적 IFN-γ 스폿 형성 단위(SFU)의 빈도를 나타낸다.
도 33은 백신접종된 동물 및 비백신접종된 동물에서의 CD8 T 세포에 의한 생체내 펩타이드 치료된 표적 세포의 제거를 비교하기 위한 CSFE 표지된 세포를 사용한 실험으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 34는 생체내 특이적 사멸을 나타낸다. pVax(대조군) 또는 pMCore로 면역화된 마우스의 2개의 그룹은 꼬리 정맥을 통해 CFSE-표지된 표적 세포(비연관 펩타이드로 펄스화된 CFSElo 또는 에피토프-특이적 펩타이드로 펄스화된 CFSEhi)를 수취하였다. CFSE-표지된 세포는 회수되었고, FACS에 의한 분석은 사멸의 퍼센트를 정량화하기 위해 이용되었다.
도 35는 pVax 벡터(대조군) 또는 HBV M-코어를 발현하는 플라스미드 pMCore로 치료된 CD3+CD4+ 세포 및 CD3+CD8+의 증식의 퍼센트의 비교를 나타낸다.
도 36은 CD4 및 CD8 T 세포의 증식의 퍼센트를 나타낸다.
도 37a 및 도 37b는 pVax 벡터(대조군) 또는 HBV M-코어를 발현하는 플라스미드 pMCore로 치료된 동물로부터의 혈청의 연속 희석에서의 항-HBV 코어 IgG 및 IgA의 비교를 나타낸다.
도 38은 혈청 및 비장세포에서의 pMCore에 의해 유도된 HBcAg-특이적 체액성 면역 반응을 나타낸다. 값은 평균 ± 평균의 표준 오차이다. 유의도는 스튜던츠 t 테스트에 의해 결정된다.
도 39는 혈청 및 비장세포에서의 pMCore에 의해 유도된 HBcAg-특이적 체액성 면역 반응을 나타낸다. 값은 평균 ± 평균의 표준 오차이다. 유의도는 스튜던츠 t 테스트에 의해 결정된다.
도 40은 CD4+ 및 CD8+ 비장 및 간 세포로부터의 TNF-α 및 IFN-γ의 퍼센트를 나타낸다.
도 41은 면역화된 마우스에 의해 유도된 청소율이 혈청 중 ALT 수치를 측정함으로써 간에 영향을 미치는지를 결정하기 위한 실험으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 42는 나이브 또는 pMCore로 면역화된 마우스로부터의 PBS, pMCore(HBcAg) 또는 pNS3/4A(HCV NS3-4A)의 유체역학 주사 후 3일에 취한 간 절편의 면역염색을 나타낸다. 청소율은 NS3/4a 형질감염된 대조군 간과 비교하여 pMCore-면역화된 간에 대해 훨씬 더 높다. pMCore 또는 NS3/4A 발현은 항-HA 항체(흰색/밝은 회색 세포)로 검출되었다.
도 43은 HBcAg 펩타이드에 의한 자극 이후 탈과립 마커 발현, CD107a 및 IFN-γ+ 발현에 대해 세포가 분석되는 형질감염 3일 후를 나타낸다.
도 44는 형질감염 후 3일, 6일 및 12일에 측정된 혈청 ALT 수치를 나타내고, 연관된 백신접종된 동물에서의 상승의 증거를 나타내지 않았다.
도 45는 작은(즉, pMCore, pSHb A 및 pSHb C), 긴(즉, pMCore, pLHb A 및 pLHb C) 및 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 원숭이에서의 전체 세포성 면역 반응을 나타낸다.
도 46은 작은(즉, pMCore, pSHb A 및 pSHb C), 긴(즉, pMCore, pLHb A 및 pLHb C) 및 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 원숭이에서의 코어-특이적 세포성 면역 반응을 나타낸다.
도 47은 작은(즉, pMCore, pSHb A 및 pSHb C), 긴(즉, pMCore, pLHb A 및 pLHb C) 및 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 원숭이에서의 표면 항원 A-특이적 세포성 면역 반응을 나타낸다.
도 48은 작은(즉, pMCore, pSHb A 및 pSHb C), 긴(즉, pMCore, pLHb A 및 pLHb C) 및 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 원숭이에서의 ELISPOT 검정 표면 항원 C-특이적 세포성 면역 반응으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 49는 작은(즉, pMCore, pSHb A 및 pSHb C), 긴(즉, pMCore, pLHb A 및 pLHb C) 및 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 원숭이에서의 전체 세포성 면역 반응을 나타낸다.
도 50은 작은(즉, pMCore, pSHb A 및 pSHb C), 긴(즉, pMCore, pLHb A 및 pLHb C) 및 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 원숭이로부터의 혈청의 연속 희석에서의 항-HBV 항체의 비교를 나타낸다.
도 51은 긴+IL-12(즉, pMCore, pLHb A, pLHb C 및 prlIL-12) 백신으로 면역화된 동물로부터의 연속 희석에서의 항-HBV 항체의 비교를 나타낸다.
도 52는 HBV 표면 항원 DNA 작제물 및 이의 발현을 나타낸다. (A) 천연 HBs와 비교된 유전자형 A 및 C의 HBs 컨센서스 서열의 계통발생 분석. 컨센서스 서열은 별표로 표시되어 있다. (B) DNA 플라스미드에서의 HBs 유전자 삽입체의 도식적 다이아그램. pLHBs 및 pSHBs는 큰 및 작은 HBs 단백질 항원을 나타낸다. preS1, preS2 및 메이저 S 단백질은 엔도단백분해 분할 부위와 연결된다. (C) 단일클론 항체 및 다중클론 마우스 혈청에 의해 형질감염된 RD 세포의 세포 내 염색을 통한 pLHBs 및 pSHBs의 검출.
도 53은 pLHBs 및 SHBs 둘 다 Balb/c에서의 튼튼한 항체 및 T 세포 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. 그룹당 5마리의 Balb/c 마우스를 3개의 상이한 실험에서 면역화하고 체액성 반응 및 세포성 반응 둘 다의 이의 유도에 분석하였다. (A) HBs-특이적 IgG 반응은 각각의 면역법 후 1주일에 측정되었다. 화살표는 면역법 시점을 나타낸다. (B) 합성 preS1/S2 및 메이저 S 펩타이드에 대해 각각의 작제물에 의해 유도된 전체 IFN-γ 반응. (C) 각각 LHBs 및 SHBs의 16 및 12 매트릭스 풀에서의 개별적인 HBs 펩타이드를 사용함으로써 HBs-특이적 면역우세 에피토프의 규명. 이는 세포 중재된 면역 반응의 증대된 규모를 나타낸다.
도 54는 생체내 특이적 사멸을 나타낸다. pVax(대조군) 또는 임의의 4개의 HBs 작제물로 면역화된 마우스의 상이한 그룹은 꼬리 정맥을 통해 CFSE-표지된 표적 세포(비연관 펩타이드로 펄스화된 CFSElo 또는 에피토프-특이적 펩타이드로 펄스화된 CFSEhi)를 수취하였다. CFSE-표지된 세포는 회수되었고, FACS(형광 활성화 세포 분류)에 의한 분석은 사멸의 퍼센트를 정량화하기 위해 이용되었다
도 55는 HBc/HB 백신 칵테일이 튼튼한 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. (A) 상이한 면역법 시점에서 HBs/HBc 백신 칵테일로 면역화된 마우스의 혈청으로부터의 HBs-특이적 항체 반응(화살표). (B) HBs/HBc 칵테일 면역화된 마우스로부터의 비장세포의 생체외 자극 후의 IFN-γ 반응. 면역화된 마우스는 코어 및 표면 항원 펩타이드 둘 다에 반응하였다.
도 56은 항원-특이적 CD8 T 세포가 항바이러스 사이토카인을 유도한다는 것을 나타낸다. 상이한 면역화된 그룹으로부터의 balb/c 마우스로부터의 비장세포의 생체외 자극 후의 항-바이러스 사이토카인의 세포 내 염색(표 3). 림프구를 CD3, CD4, CD8, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 CD107a에 대한 항체로 염색하였다. 이 데이터는 3개의 상이한 실험에서의 그룹당 4마리의 마우스를 대표한다.
도 57은 비인간 영장류에서의 면역원성을 나타낸다. 5마리의 레서스 마카크(Rhesus Macaque)를 pSHBs/pMCore, pLHBs/pMCore 또는 pLHBs/pMCore + pIL-12(표 4)로 근육내 면역화한 후 전기천공하였다. 원숭이는 3개의 면역법을 수취받았다. (A) HBs에 대한 높은 항체 역가가 단지 2개의 면역법 후에 관찰되었다. (B) IFN-γ 반응을 처음의 면역법 전에 1회 및 각각의 면역법 후 2주에 측정하였다. (C) 많은 양성 HBs 매트릭스 펩타이드 풀이 상이한 그룹으로부터의 대부분의 원숭이에서 관찰되어, 면역화된 마카크에서의 광범위한 T 세포 반응을 확인시켜준다. (D) 마지막 면역법 후의 PBMC의 세포 내 염색(IFN-γ, TNF-α, IL-2)은 CD4 및 CD8 둘 다에서의 HBs 및 HBc-특이적 항바이러스 사이토카인 생산을 나타낸다.
도 58a 내지 도 58d는 레서스 마카크에서의 치료학적 HBV 백신의 안전성을 나타낸다. 백신접종 전에(pre), 제3 백신접종 후에(3회), 제4 백신접종 전에(pre4th), 제4 백신접종 후에(4회) 샘플을 분석하였다. 제3 백신접종 후의 알칼리 포스파타제에 대한 검정 오차가 존재한다. 모든 측정에 대한 정상 범위는 점선으로 그려진다. (A) 혈청 알칼리 포스파타제. (B) 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수치. (C) 혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 수치. (D) 혈청 전체 빌리루빈 수치. (E) 혈청 크레아티닌 수치. (F) 혈청 혈액 유레아 질소 수치.
도 59a 내지 도 59d는 4개의 HBs 플라스미드에 대한 서열 설명을 나타낸다. IgE 리더, 엔도단백분해 분할 부위 및 C 말단 HA 태그에 대한 서열은 밑줄이 있다. 4개의 HBs 플라스미드는 유전자형 A 큰 표면 단백질(pLHBs-A)(A) 및 작은 표면 단백질(pSHBs-A)(B) 및 유전자형 C 큰 표면 단백질(pLHBs-C)(C) 및 작은 표면 단백질(pSHBs-C)(D)이다.
본 발명은 HBV 표면(HBs) 및 HBV 코어(HBc) 항원에 대한 항체 및 세포 중재 면역 둘 다를 유발하는 매우 최적화된 다가 합성 B형 간염 바이러스(HBV) 면역원에 관한 것이다. 바이러스의 가장 흔한 유전자형을 코딩하는 이 플라스미드는 HBs 항원에 대한 항체 결합을 유도하고, HBc 및 HBs 항원 둘 다에 대한 튼튼한 세포 중재 면역(CMI)을 추진시킨다. 플라스미드는 광범위한 교차 반응성 T 세포 반응 및 높은 역가 항체 반응, 및 백신 유도 세포독성 활성을 독립적으로 유발한다. 표면 항원 둘 다를 함유하는 플라스미드 칵테일은 다수의 항원 에피토프에 걸친 강하고 광범위한 세포성 면역 반응, 특히 바이러스의 A 유전자형과 C 유전자형 사이의 광범위한 교차 반응성을 유도한다. HBs 및 HBc 항원을 코딩하는 최적화된 플라스미드 칵테일은 S 항원을 표적화하는 강한 체액성 및 세포성 반응을 유도하고, 감염된 간세포의 청소와 관여되는 다양한 다중-에피토프 반응을 추진시킨다.
특히, 본 발명은 HBV 감염으로부터 개체를 보호하고 HBV 감염으로 진단받은 개체에게 치료학적 이점을 제공하기 위해 사용될 수 있는 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 백신에 관한 것이다. 이러한 백신은 또한 HBV 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 HBV 백신은 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 특히, 핵산 분자는 하나 이상의 컨센서스 HBV 코어 단백질을 코딩한다. 컨센서스 HBV 코어 단백질은 HBV 유전자형 A, B, C, D 및 E로부터의 코어 단백질의 서열로부터 유래하고, 따라서 컨센서스 HBV 코어 단백질은 독특하다. 핵산 분자는 또한 컨센서스 HBV 코어 단백질의 하나 이상의 면역원성 단편을 코딩할 수 있다.
추가로, 핵산 분자는 하나 이상의 컨센서스 HBV 표면 항원을 코딩할 수 있다. 컨센서스 HBV 표면 항원은 HBV 유전자형 A의 단리물로부터의 표면 항원의 서열로부터 유래하고, 따라서 컨센서스 HBV 표면 항원은 독특하다. 컨센서스 HBV 표면 항원은 또한 HBV 유전자형 C의 단리물로부터의 표면 항원의 서열로부터 유래할 수 있어서, 독특한 HBV 표면 항원을 생성시킨다. 핵산 분자는 또한 컨센서스 HBV 표면 항원의 하나 이상의 면역원성 단편을 코딩할 수 있다.
본 발명의 백신은 컨센서스 HBV 코어 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 컨센서스 HBV 표면 항원을 코딩하는 핵산 분자의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 백신은 또한 컨센서스 HBV 코어 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 컨센서스 HBV 표면 항원의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 분자의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
HBV 코어 단백질 및 HBV 표면 항원의 이 조합은 놀랍게도 및 예상치 못하게 HBV 코어 단백질 및 HBV 표면 항원에 대해 시차 면역 반응을 유도한다. 즉, HBV 코어 단백질 및 HBV 표면 항원에 대한 면역 반응의 강도는 대상체에 투여되는 특정 조합에 따라 다르다. 따라서, 본 발명의 백신의 임의의 사용자는 이러한 설계된 백신이 투여된 대상체에서의 원하는 면역 반응을 유도하기 위한 특정 조합을 포함하는 백신을 설계할 수 있다. 그러므로, 임의의 사용자는 대상체에서의 면역 반응의 수준을 제어하기 위해 본 발명의 백신을 맞춤 조정할 수 있다.
본 발명의 백신은 HBV 코어 단백질 및 HBV 표면 항원의 독특한 컨센서스 서열 때문에 다수의 유형의 HBV에 광범위하게 적용 가능하다.
본 발명의 백신은 상기 기재된 하나 이상의 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
1. 정의
본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정한 실시형태를 설명하기 위한 목적이고 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는다면, 단수 형태 "하나", "일" 및 "이"는 복수의 지시 대상을 포함한다.
본 명세서에서의 수치 범위의 열거에 있어서, 동일한 정확도로 그 사이의 각각의 개재하는 숫자가 명백하게 고려된다. 예를 들어, 범위 6 내지 9에 있어서, 숫자 6과 9 이외에 숫자 7과 8이 고려되며, 범위 6.0 내지 7.0에 있어서, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 "아쥬반트"는 DNA 플라스미드에 의해 코딩된 항원 및 이후 기술되는 코딩 핵산 서열의 면역원성을 증대시키기 위해 본 명세서에서 기술된 DNA 플라스미드 백신에 첨가되는 임의의 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 종류, 또는 단편의 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체를 의미하며, 이는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단쇄 항체, 이중항체(diabody), 이중특이적 항체, 이중작용성 항체 및 이들의 유도체를 포함한다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래한 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유동물의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다중클론 항체, 친화도 정제 항체(affinity purified antibody), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "코딩 서열" 또는 "코딩 핵산"은 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 구성요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "보체" 또는 "상보성"은 뉴클레오타이드 또는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 유사체 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍(예컨대, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴형(Hoogsteen) 염기쌍을 의미할 수 있는 핵산을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "컨센서스" 또는 "컨센서스 서열"은 특정한 HBV 항원, 예컨대 HBV 코어 또는 표면 항원의 다수의 아형의 정렬의 분석에 기초한 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 컨센서스 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산 서열이 제조될 수 있다. 컨센서스 서열을 포함하는 단백질 및/또는 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신은 특정한 HBV 항원의 다수의 아형 또는 혈청형에 대한 광범위한 면역력을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "전기천공법", "전자-투과화(electro-permeabilization)" 또는 "동전기 강화(electro-kinetic enhancement)"("EP")는 생체막에서 미시적 경로(기공)를 유도하기 위한 막통과 전기장 펄스의 이용을 의미하며; 이들의 존재는 생체 분자, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온 및 물이 세포막의 한쪽 면에서 다른 면으로 통과할 수 있게 한다.
핵산 서열에 대해 본 명세서에서 사용되는 "단편"은 전장 야생형 균주 HBV 항원과 교차 반응하는, 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 폴리펩타이드를 코딩하는, 핵산 서열 또는 이의 일부를 의미한다. 단편은 하기에 기재된 단백질 단편을 코딩하는 다양한 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다.
폴리펩타이드 서열에 대해 "단편" 또는 "면역원성 단편"은 전장 야생형 균주 HBV 항원과 교차 반응하는, 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 컨센서스 단백질의 단편은 컨센서스 단백질의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 컨센서스 단백질의 단편은 컨센서스 단백질의 적어도 20개 이상의 아미노산, 적어도 30개 이상의 아미노산, 적어도 40개 이상의 아미노산, 적어도 50개 이상의 아미노산, 적어도 60개 이상의 아미노산, 적어도 70개 이상의 아미노산, 적어도 80개 이상의 아미노산, 적어도 90개 이상의 아미노산, 적어도 100개 이상의 아미노산, 적어도 110개 이상의 아미노산, 적어도 120개 이상의 아미노산, 적어도 130개 이상의 아미노산, 적어도 140개 이상의 아미노산, 적어도 150개 이상의 아미노산, 적어도 160개 이상의 아미노산, 적어도 170개 이상의 아미노산, 적어도 180개 이상의 아미노산, 적어도 190개 이상의 아미노산, 적어도 200개 이상의 아미노산, 적어도 210개 이상의 아미노산, 적어도 220개 이상의 아미노산, 적어도 230개 이상의 아미노산 또는 적어도 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유전자 작제물"은 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 구성요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현가능한 형태"는, 개체의 세포에 존재할 때 코딩 서열이 발현되도록, 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 필수 조절 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "상동성"은 상보성의 정도를 의미한다. 부분 상동성 또는 완전 상동성(즉, 동일성)이 존재할 수 있다. 표적 핵산에 대한 혼성화로부터 완전히 상보성인 서열을 적어도 부분적으로 억제하는 부분적으로 상보성인 서열은 기능 용어 "실질적으로 상동성"을 이용하는 것으로 일컬어진다. 이중 가닥 핵산 서열, 예컨대 cDNA 또는 게놈 클론과 관련하여 사용될 때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 상동성"은 낮은 엄격성의 조건 하에 이중 가닥 핵산 서열의 가닥에 혼성화할 수 있는 프로브를 의미한다. 단일 가닥 핵산 서열과 관련하여 사용될 때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 상동성"은 낮은 엄격성의 조건 하에 단일 가닥 핵산 주형 서열에 혼성화할 수 있는(즉, 이의 보체인) 프로브를 의미한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 "동일한" 또는 "동일성"은, 서열이 지정된 영역에 대해 동일한 지정된 잔기의 백분율을 갖는다는 것을 의미한다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 지정된 영역에 대해 2개의 서열을 비교하며, 동일한 잔기가 서열 둘 다에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치되는 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 지정된 영역에서의 위치의 전체 수로 나누며, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열이 상이한 길이를 갖거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고 비교의 지정된 영역이 단지 단일 서열을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에 포함되지만 계산의 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T)과 유라실(U)은 동등한 것으로 고려될 수 있다. 동일성은 수동으로, 또는 컴퓨터 서열 알고리즘, 예컨대 BLAST 또는 BLAST 2.0을 사용함으로써 실행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "면역 반응"은 항원, 예컨대 HBV 컨센서스 항원의 도입에 반응하는, 숙주의 면역계, 예를 들어 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 반응 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 서술은 또한 상보성 가닥의 서열을 한정한다. 따라서, 핵산은 또한 서술된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체는 소정의 핵산과 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥의 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은, 게놈 DNA 및 cDNA 둘 다, RNA, 또는 혼성체일 수 있으며, 핵산은 데옥시리보-뉴클레오타이드 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 유라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 아이소사이토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "작동가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 공간적으로 연결되어 있는 프로모터의 제어 하에 있는 것을 의미한다. 프로모터는 이의 제어 하에서 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는, 프로모터가 유래한 유전자에서 이것이 제어하는 프로모터와 유전자 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이 거리 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 증대시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래의 분자를 의미한다. 프로모터는 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함하여 이 서열의 발현을 추가로 증대시키고/증대시키거나, 이 서열의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경할 수 있다. 프로모터는 또한 원위의 인핸서 또는 리프레서 구성요소를 포함할 수 있고, 이들은 전사의 출발 자리로부터 수천 개의 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 소스로부터 유래할 수 있다. 프로모터는 세포, 발현이 일어나는 조직 또는 기관에 대해, 또는 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여 구조적으로 또는 차등적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
"신호 펩타이드" 및 "선도 서열"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에 기재된 HBV 단백질의 아미노 말단에서 연결될 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 신호 펩타이드/선도 서열은 전형적으로 단백질의 국지화를 지시한다. 본 명세서에서 사용되는 신호 펩타이드/선도 서열은 바람직하게 단백질이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 수월하게 한다. 신호 펩타이드/선도 서열은 세포로부터의 분비 시, 대개 성숙 단백질이라 칭하는 단백질의 나머지 부분으로부터 대개 개열된다. 신호 펩타이드/선도 서열은 단백질의 N 말단에서 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건"은, 예컨대 핵산의 복합 혼합물에서, 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)에 혼성화하는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 녹는점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 (한정된 이온 강도, pH 및 핵 농도 하에서의) 온도일 수 있다(표적 서열이 Tm에서 과량으로 존재하므로, 평형 상태에서 프로브의 50%가 점유됨). 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 미만, 예컨대 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이며, 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 초과의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 조건일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 폼아마이드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격화 혼성화 조건은, 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1%의 SDS에서 세척하면서, 42℃에서 항온처리되는 50%의 폼아마이드, 5x SSC 및 1%의 SDS, 또는 65℃에서 항온처리되는 5x SSC, 1%의 SDS를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보성"은 제1 서열이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 180개, 270개, 360개, 450개, 540개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해 제2 서열의 보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 엄격한 혼성화 조건 하에서 2개의 서열이 혼성화한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 보체와 실질적으로 상보성인 경우 제1 서열 및 제2 서열이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 180개, 270개, 360개, 450개, 540개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해, 또는 핵산과 관련하여 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미한다.
상호교환적으로 그리고 HBV와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "아형" 또는 "혈청형"은 HBV의 유전자 변이체를 의미하여, 하나의 아형은 상이한 아형 이외의 면역계에 의해 인식된다.
핵산에 대하여 본 명세서에서 사용되는 "변이체"는 (ⅰ) 언급된 뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 단편; (ⅱ) 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분의 보체; (ⅲ) 언급된 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (ⅳ) 엄격한 조건 하에 언급된 핵산, 이의 보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 의미한다.
"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 언급된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 아미노산을 유사한 특성(예컨대, 하전된 영역의 친수화도, 정도 및 분포)을 갖는 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 전형적으로 사소한 변화를 수반하는 것으로서 당해 분야에서 인식된다. 이러한 사소한 변화는 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). 아미노산의 수치 지수는 이의 소수화도 및 전하의 고려사항에 기초한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 일 양상에서, 수치 지수가 ±2인 아미노산은 치환된다. 아미노산의 친수화도는 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성하는 치환을 밝히는 데 사용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서의 아미노산의 친수화도의 고려사항은, 항원성 및 면역원성과 상관관계가 많이 있는 것으로 보고된 유용한 척도인, 펩타이드의 가장 큰 국소적인 평균 친수화도의 계산을 허용한다. 미국 특허 제4,554,101호는 본 명세서에 완전히 참조문헌으로 포함된다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 친수화도 값이 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 친수화도 값이 서로 ±2 이내인 아미노산으로 실행될 수 있다. 아미노산의 수치 지수와 친수화도 값 둘 다는 이 아미노산의 특정한 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일치하여, 소수화도, 친수화도, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 밝혀지는 바와 같이, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 아미노산의 상대 유사성, 특히 아미노산의 측쇄에 따라 달라지는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가복제 염색체 외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다.
2. 백신
본 발명은 B형 간염 백신에 관한 것이다. B형 간염 백신(HBV)은 HBV 코어 항원, HBV 표면 항원 또는 이들의 조합을 코딩하는 핵산; HBV 코어 항원, HBV 표면 항원 또는 이들의 조합 또는 (1) HBV 코어 항원 및/또는 HBV 표면 항원을 코딩하는 핵산 및 (2) HBV 코어 항원 및/또는 HBV 표면 항원의 조합 또는 (3) 이들의 조합을 포함할 수 있다. HBV 코어 항원은 다수의 HBV 유전자형으로부터의 코어 단백질의 아미노산 서열로부터 유래한 컨센서스 단백질을 포함할 수 있다. 유사하게, HBV 표면 항원은 다수의 HBV 유전자형으로부터의 표면 항원의 아미노산 서열로부터 유래한 컨센서스 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 컨센서스 HBV 코어 단백질 및 컨센서스 HBV 표면 항원은 독특하고 다수의 HBV 유전자형에 걸쳐 각각 코어 및 표면 항원에 유사성을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 백신은 다수의 유형의 HBV에 적용 가능하고, 널리 퍼진 집단에 유용하다. 추가로, 본 발명의 백신은 컨센서스 HBV 코어 단백질, 컨센서스 HBV 표면 단백질 또는 이들의 조합을 코딩하는 특정한 핵산에 맞춤 조정될 수 있다. 즉, 본 발명의 백신은 하나 이상의 HBV 혈청형에 대해 대상체에서 면역 반응의 수준 또는 강도를 제어하도록 설계될 수 있다.
백신은 DNA 백신일 수 있다. DNA 백신은 미국 특허 제5,593,972호, 제5,739,118호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,962,428호, 제5,981,505호, 제5,580,859호, 제5,703,055호 및 제5,676,594호(본 명세서에서 완전히 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다. DNA 백신은 이것이 염색체로 편입되는 것을 저해하는 구성요소 또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
백신은 HBV 코어 단백질 및/또는 the HBV 표면 항원 단백질의 RNA일 수 있다. RNA 백신은 세포로 도입될 수 있다.
a. HBV 코어 항원
본 발명의 백신은 HBV 코어 단백질을 포함할 수 있다. HBV 코어 단백질은 교차 제시를 위해 1) 세포독성 T 림프구(CTL) 반응, 2) T 헬퍼 세포성 반응 및/또는 3) B 세포성 반응 또는 바람직하게는 상기 언급된 모두를 유도함으로써 면역 중재 바이러스 청소율에 대한 표적이다.
표 2는 HBV-A, HBV-B, HBV-C, HBV-D 및 HBV-E 유전자형으로부터의 코어 항원에 대한 유전자형에 걸쳐 차트에서 "HBV-M-코어"라 칭하는 컨센서스 HBV 코어 단백질과의 유사성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, HBV M 코어 작제물은 광범위한 HBV 코어 표적에 대해 증가한 상동성을 갖도록 설계된다. 코어 항원에 대한 유전자형에서의 설계된 M-코어 작제물과의 유사성은 광범위한 HBV 코어 표적에 대한 상동성을 증가시킨다. 모든 유전자형은 HBV에 대해 보편적 면역 치료학적 백신에서 대표되어야 한다.
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항원은 항-HBV 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이게 만드는 코어 단백질 에피토프를 포함할 수 있다. HBV 항원은 전장 번역 생성물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
HBV 코어 항원은 컨센서스 단백질을 포함할 수 있다. HBV 컨센서스 코어 항원은 전신 및 간 둘 다에서 항원-특이적 T-세포 및 높은 역가 항체 반응을 유도한다. 그러므로, 보호 면역 반응은 HBV 컨센서스 코어 항원을 포함하는 백신에 의해 간에 제공된다. 따라서, 임의의 사용자는 면역 기반 치료법 및/또는 간에 대한 보호를 제공하기 위해 HBV 컨센서스 코어 항원을 포함하도록 본 발명의 백신을 설계할 수 있다.
특히 유도된 면역 반응에서, HBV 컨센서스 코어 항원은 비장세포, 특히 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포를 자극하여, 유사한 양의 인터페론-감마(INF-γ), 그러나 상이한 양의 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)를 분비하거나 생성시킨다. 흥미롭게도, 유도된 면역 반응은 비장 및 간에서 상이하다. 비장에서, CD4+ 세포보다 더 많은 CD8+ 세포가 INF-γ 및 TNF-α 둘 다를 생성하지만, 간에서는 반대가 발생한다. 즉, 간에서 CD8+ 세포보다 더 많은 CD4+ 세포가 INF-γ 및 TNF-α 둘 다를 생성한다. 추가로, 간에서, IgG보다 더 많은 항원-특이적 IgA가 생성되고, 보호 면역 반응은 놀랍게도 및 예상치 못하게 간 손상을 야기하지 않는 항원-특이적 CTL 반응을 포함한다. 따라서, HBV 컨센서스 코어 항원을 포함하는 본 발명의 백신은 말초에서 전달되어 간의 항원-특이적 표적화를 확립하여, 간에 대한 손상 또는 간의 염증을 야기하지 않으면서 HBV 감염된 세포를 청소하거나 제거할 수 있다.
컨센서스 HBV 코어 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5이다. 서열 번호 1은 HBV 컨센서스 코어 단백질을 코딩한다. 서열 번호 3은 IgE 리더에 연결된 HBV 컨센서스 코어 단백질을 코딩한다. 서열 번호 5는 IgE 리더 및 HA 태그에 연결된 HBV 컨센서스 코어 단백질을 코딩한다.
몇몇 실시형태는 HBV 컨센서스 단백질에 동일한 또는 상동성인 단백질을 코딩하는 핵산 서열, HBV 컨센서스 단백질의 면역원성 단편 및 상동성 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 이하의 동일성, 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 이하의 동일성, 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 이하의 동일성, 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97% 이하의 동일성, 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 이하의 동일성 및 99% 이하의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 이러한 핵산 분자가 제공될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 면역원성 단편 및 본 명세서에 기재된 단백질과 동일한 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열이 또한 제공된다.
몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 코딩 서열과 95%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 코딩 서열과 96%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 코딩 서열과 97%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 코딩 서열과 98%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 코딩 서열과 99%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 컨센서스 단백질의 코딩 서열에 상동성인 본 명세서에 개시된 코딩 서열을 갖는 핵산 분자는 본 명세서에 개시된 상동성 단백질 서열을 코딩하는 코딩 서열의 5' 말단에 연결된 IgE 선도 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태는 전장 HBV 코어 컨센서스 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 특정한 퍼센트의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, HBV 코어 컨센서스 단백질의 면역원성 단편 및 HBV 코어 컨센서스 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80% 이하의 동일성, 전장 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 85% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 90% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 91% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 92% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 93% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 94% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 이하의 동일성, 전장 HBV 코어 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99% 이하의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 이러한 핵산 분자가 제공될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 면역원성 단편 및 본 명세서에 기재된 HBV 코어 단백질에 대해 상기 표시된 유사한 퍼센트의 동일성을 갖는 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열이 또한 제공된다.
몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 83%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 85%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 90%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 91%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 92%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 93%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 94%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 컨센서스 HBV 코어 단백질의 코딩 서열과 상동성인 본 명세서에 개시된 코딩 서열을 갖는 핵산 분자는 본 명세서에 개시된 상동성 단백질 서열을 코딩하는 코딩 서열의 5' 말단에 연결된 IgE 선도 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 선도 서열을 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 IgE 리더를 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다.
몇몇 실시형태는 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더 등, 예컨대 IgE 리더를 코딩하는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열을 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 IgE 리더 등을 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다.
더욱이, 컨센서스 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 2이다. IgE 리더에 연결된 컨센서스 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 4이다. 특히, 서열 번호 4에서, IgE 리더는 컨센서스 HBV 코어 단백질의 아미노 말단에 연결된다. IgE 리더 및 HA 태그에 연결된 컨센서스 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 6이다. 서열 번호 6에서, IgE 리더 및 HA 태그는 컨센서스 HBV 코어 단백질의 각각 아미노 및 카복시 말단에 연결된다.
몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6에 상동성인 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 컨센서스 단백질 서열에 95%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 컨센서스 단백질 서열에 96%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 컨센서스 단백질 서열에 97%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 컨센서스 단백질 서열에 98%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 컨센서스 단백질 서열에 99%의 상동성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다.
몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 동일한 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 91% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 92% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 93% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 94% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에서, 단백질은 선도 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단백질은 IgE 리더를 함유하지 않는다. 컨센서스 단백질의 단편은 컨센서스 단백질의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 면역원성 단편은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더 등, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 IgE 리더 등을 함유하지 않는다.
서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 면역원성 단편과 아미노산 서열 상동성을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 95%의 상동성인 단백질의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 96%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 97%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 98%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 99%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더 등, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 IgE 리더 등을 함유하지 않는다.
서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6의 면역원성 단편과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 단백질의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더 등, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 IgE 리더 등을 함유하지 않는다.
단백질의 N 말단에 대한 신호 펩타이드 또는 선도 서열의 연결과 관련하여 본 명세서에 언급된 바대로, 신호 펩타이드/선도 서열은 신호 펩타이드 코딩 서열 없이 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 개시 코돈에 의해 코딩된 단백질의 N 말단 메티오닌을 대체한다. 따라서, 예를 들어 서열 번호 4는 서열 번호 2의 N 말단에서 연결된 신호 펩타이드/선도 서열을 갖는 서열 번호 2이고, 즉 서열 번호 4는 서열 번호 2의 N 말단에 연결된 신호 펩타이드를 포함하는 단백질이다. "Xaa"인 서열 번호 2에서의 제1 잔기는 신호 펩타이드가 존재하지 않을 때 전형적으로 메티오닌이다. 그러나, 서열 번호 2에 연결된 신호 펩타이드, 예컨대 서열 번호 4를 포함하는 단백질은 신호 펩타이드를 단백질에 연결하는 잔기로 Xaa에서 잔기 1 메티오닌을 대체한다. 따라서, 서열 번호 2의 N 말단 잔기는 어떤 것일 수 있지만, 이것이 개시 서열에 의해 코딩되면 이것은 메티오닌이다. 서열 번호 2의 N 말단에서의 신호 펩타이드/선도 서열의 연결은 N 말단 메티오닌을 전형적으로 제거한다. 본 명세서에서 사용된 바대로, 서열 번호 4는 서열 번호 2의 N 말단 Xaa 잔기의 제거에도 불구하고 서열 번호 2의 N 말단에서 연결된 신호 펩타이드/선도 서열을 갖는 서열 번호 2를 포함하도록 의도된다. 유사하게, 서열 번호 4에 대한 코딩 서열은 서열 번호 2에 대한 코딩 서열을 포함하고, 신호 펩타이드/선도 서열에 대한 코딩 서열은 서열 번호 2를 코딩하는 코딩 서열의 5' 말단에 연결된다. 개시 코돈은 서열 번호 2에 대해 코딩 서열에서 "nnn"일 수 있지만, 신호 펩타이드/선도 서열에 대한 코딩 서열이 서열 번호 2를 코딩하는 코딩 서열의 5' 말단에 연결될 때 이것은 제거된다. 본 명세서에서 사용되는 바대로, 서열 번호 4에 대한 코딩 서열은 서열 번호 2에 대한 코딩 서열을 포함하고, 신호 펩타이드/선도 서열에 대한 코딩 서열은 nnn이 발생하는 서열 번호 2의 코딩 서열의 5' 말단에 연결되도록 의도된다. 따라서, 예를 들어 서열 번호 3은 nnn 대신에 서열 번호 1을 포함하고, 신호 펩타이드/선도 서열에 대한 코딩 서열은 서열 번호 1의 5' 말단에 연결되도록 의도된다. 몇몇 실시형태에서, nnn은 서열 번호 1의 5' 말단에서 개시 코돈이다.
b. HBV 표면 항원
백신은 HBV 표면 항원을 포함할 수 있다. 하나 이상의 HBV 혈청형에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 HBV 표면 항원이 본 명세서에 제공된다. 표면 항원은 항-HBV 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 이들이 특히 효과적이게 만드는 표면 단백질 에피토프를 포함할 수 있다. HBV 표면 항원은 전장 번역 생성물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
HBV 표면 항원은 컨센서스 단백질을 포함할 수 있다. 컨센서스 HBV 표면 항원은 HBV 유전자형 A 또는 C의 1차 단리물로부터의 표면 항원의 서열로부터 생성된다. 특히, 컨센서스 HBV 표면 항원은 S 단백질 또는 S 단백질의 조합, pre-S2 및 pre-S1을 포함한다(도 3 및 도 4). 엔도단백분해 분할 부위는 컨센서스 HBV 표면 항원에 도입되어 적절한 단백질 폴딩 및 더 우수한 CTL 처리를 제공한다. 컨센서스 HBV 표면 항원에서의 코돈 사용빈도는 인간 유전자의 코돈 바이어스를 반영하도록 변형된다. 추가로, 매우 높은(예를 들어, 80% 초과의) 또는 매우 낮은(예를 들어, 30% 미만의) GC 함량의 영역이, 시스 작용 모티프, 예컨대 내부 TATA-박스, 반복 서열 및 구조화 서열과 같이, 회피된다. 코작(Kozak) 서열은 컨센서스 HBV 표면 항원으로 도입되어 번역 개시를 증가시키고, IgE 선도 서열은 첨가되어 단백질 발현을 증가시킨다.
컨센서스 HBV 표면 항원을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 및 서열 번호 15이다. 서열 번호 9는 유전자형 A로부터 유래하고 S 단백질, pre-S2 및 pre-S1(LHBs-A)을 포함하는 긴 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질을 코딩한다. 서열 번호 11은 유전자형 C로부터 유래하고 S 단백질, pre-S2 및 pre-S1(LHBs-C)을 포함하는 긴 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질을 코딩한다. 서열 번호 13은 유전자형 A로부터 유래하고 S 단백질(SHBs-A)을 포함하는 짧은 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질을 코딩한다. 서열 번호 15는 유전자형 C로부터 유래하고 S 단백질(SHBs-C)을 포함하는 짧은 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질을 코딩한다.
몇몇 실시형태는 컨센서스 HBV 표면 항원의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 동일한 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 컨센서스 HBV 표면 항원의 면역원성 단편 및 동일한 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 따라서, 컨센서스 HBV 표면 항원 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 이하의 동일성, 컨센서스 HBV 표면 항원 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 이하의 동일성, 컨센서스 HBV 표면 항원 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 이하의 동일성, 컨센서스 HBV 표면 항원 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97% 이하의 동일성, 컨센서스 HBV 표면 항원 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 이하의 동일성 및 컨센서스 HBV 표면 항원 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99% 이하의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 제공될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 면역원성 단편 및 본 명세서에 기재된 HBV 표면 항원 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 동일한 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열이 또한 제공된다.
몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질의 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 동일한 본 명세서에 개시된 코딩 서열을 갖는 핵산 분자는 본 명세서에 개시된 동일한 단백질 서열을 코딩하는 코딩 서열의 5' 말단에 연결된 IgE 선도 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태는 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 특정한 퍼센트의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, HBV 표면 항원 컨센서스 단백질의 면역원성 단편 및 HBV 표면 항원 컨센서스 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 85% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 90% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 91% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 92% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 93% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 94% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97% 이하의 동일성, 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 이하의 동일성 및 전장 HBV 표면 항원 컨센서스 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99% 이하의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 이러한 핵산 분자가 제공될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 면역원성 단편 및 본 명세서에 기재된 HBV 표면 항원 단백질에 대해 상기 표시된 유사한 퍼센트의 동일성을 갖는 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열이 또한 제공된다.
몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 83%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 85%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 90%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 91%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 92%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 93%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 94%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 전장 핵산 HBV 표면 항원 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질의 코딩 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 동일한 본 명세서에 개시된 코딩 HBV 표면 항원 서열을 갖는 핵산 분자는 본 명세서에 개시된 동일한 단백질 서열을 코딩하는 코딩 서열의 5' 말단에 연결된 IgE 선도 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 선도 서열을 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 IgE 리더를 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다.
몇몇 실시형태는 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 및 서열 번호 15의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 단편은 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 단편은 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더 등, 예컨대 IgE 리더를 코딩하는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열을 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 선도 서열, 예컨대 IgE 리더를 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다.
더욱이, 컨센서스 HBV 표면 항원, LHBs-A, LHBs-C, SHBs-A 및 SHBs-C의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16이다.
단백질은 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16과 동일할 수 있다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99%의 동일성을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다.
몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16과 동일한 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 91% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 92% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 93% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 94% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 기재된 전장 컨센서스 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 단백질에 관한 것이다.
컨센서스 단백질의 단편은 컨센서스 단백질의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 면역원성 단편은 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다.
서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 면역원성 단편과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다.
서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 면역원성 단편과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55% 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 96%의 동일성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 97%의 동일성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 98%의 동일성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 99%의 동일성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다.
c. HBV 코어 및 표면 항원의 조합
백신은 상기 기재된 HBV 코어 및 표면 항원의 조합을 포함할 수 있다. HBV 항원의 이 조합은 하나 이상의 HBV 혈청형에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 백신은 HBV 항원의 특정한 조합을 갖도록 설계되거나 맞춤 조정되어, 결국 포유동물에서 면역 반응의 수준 또는 강도를 제어하는 능력을 제공할 수 있다.
조합은 (1) HBV-M-코어, LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C 및 SHBs-C; (2) HBV-M-코어, LHBs-A, SHBs-A 및 LHBs-C; (3) HBV-M-코어, LHBs-A 및 SHBs-A; (4) HBV-M-코어 및 LHBs-A; (5) HBV-M-코어, SHBs-A, LHBs-C 및 SHBs-C; (6) HBV-M-코어, LHBs-C 및 SHBs-C; (7) HBV-M-코어 및 SHBs-C; (8) HBV-M-코어, LHBs-A, LHBs-C 및 SHBs-C; (9) HBV-M-코어, LHBs-A 및 SHBs-C; (10) HBV-M-코어 및 SHBs-C; (11) HBV-M-코어, LHBs-A, SHBs-A 및 SHBs-C; (12) HBV-M-코어, LHBs-A 및 SHBs-C; (13) HBV-M-코어, SHBs-A 및 SHBs-C; (14) LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C 및 SHBs-C; (15) LHBs-A, SHBs-A 및 LHBs-C; (16) LHBs-A 및 SHBs-A; (17) SHBs-A, LHBs-C 및 SHBs-C; (18) LHBs-C 및 SHBs-C; (19) LHBs-A, LHBs-C 및 SHBs-C; (20) LHBs-A 및 SHBs-C; (21) LHBs-A, SHBs-A 및 SHBs-C; (22) LHBs-A 및 SHBs-C; (23) SHBs-A 및 SHBs-C; (24) HBV-M-코어 및 SHBs-A; (25) HBV-M-코어, LHBs-A 및 LHBs-C; 또는 (26) LHBs-A 및 LHBs-C를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태는 HBV-M-코어, LHBs-A 및 LHBs-C를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 백신에 관한 것이다. 다른 예시적인 실시형태는 HBV-M-코어, SHBs-A 및 SHBs-C를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 백신에 관한 것이다. 또 다른 예시적인 실시형태는 HBV-M-코어, LHBs-A 및 LHBs-C 및 아쥬반트, 예컨대 IL-12를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 백신에 관한 것이다.
조합 백신은 또한 하나 이상의 단백질 아단위의 형태의 하나 이상의 컨센서스 HBV 코어 단백질 및/또는 HBV 표면 항원 단백질, 하나 이상의 컨센서스 HBV 코어 단백질 및/또는 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질을 포함하는 하나 이상의 사멸된 바이러스 입자 또는 하나 이상의 컨센서스 HBV 코어 단백질 및/또는 HBV 표면 항원 단백질을 포함하는 하나 이상의 약독화된 바이러스 입자를 포함한다. 약독화된 백신은 약독화된 생 백신, 사멸된 백신 및 하나 이상의 컨센서스 HBV 코어 단백질 및/또는 HBV 표면 항원 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 백신, 및 또한 아단위 및 당단백질 백신일 수 있다. 약독화된 생 백신, 외래 항원을 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 것, 아단위 백신 및 당단백질 백신의 예는 미국 특허 제4,510,245호; 제4,797,368호; 제4,722,848호; 제4,790,987호; 제4,920,209호; 제5,017,487호; 제5,077,044호; 제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제5,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,364호; 제5,462,734호; 제5,470,734호; 제5,474,935호; 제5,482,713호; 제5,591,439호; 제5,643,579호; 제5,650,309호; 제5,698,202호; 제5,955,088호; 제6,034,298호; 제6,042,836호; 제6,156,319호 및 제6,589,529호(각각 본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
d. 백신 작제물 및 플라스미드
백신은 HBV 코어 단백질을 코딩하는 핵산 작제물 또는 플라스미드, HBV 표면 항원 및 HBV 코어 단백질/표면 항원의 조합을 포함할 수 있다. 컨센서스 단백질 서열, 컨센서스 단백질 서열에 상동성인 서열, 컨센서스 단백질 서열의 단편 및 컨센서스 단백질 서열의 단편에 상동성인 서열을 포함하는 본 명세서에 개시된 HBV 코어 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 유전자 작제물이 본 명세서에 제공된다. 추가로, 컨센서스 단백질 서열, 컨센서스 단백질 서열에 상동성인 서열, 컨센서스 단백질 서열의 단편 및 컨센서스 단백질 서열의 단편에 상동성인 서열을 포함하는 본 명세서에 개시된 HBV 코어 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 유전자 작제물이 본 명세서에 제공된다. 유전자 작제물은 기능성 염색체 외 분자로서 세포에 존재할 수 있다. 유전자 작제물은 동원체, 텔로머 또는 플라스미드 또는 코스미드를 포함하는 선형 미니염색체일 수 있다.
유전자 작제물은 또한 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 게놈의 일부일 수 있다. 유전자 작제물은 세포에서 살아 있는 약독화된 살아 있는 미생물 또는 또는 재조합 미생물 벡터에서 유전자 물질의 일부일 수 있다.
유전자 작제물은 핵산의 코딩 서열의 유전자 발현을 위한 조절 구성요소를 포함할 수 있다. 조절 구성요소는 프로모터, 인핸서, 개시 코돈, 정지 코돈 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
핵산 서열은 벡터일 수 있는 유전자 작제물을 구성할 수 있다. 벡터는 포유동물에서 면역 반응을 유발하는 데 효과적인 분량으로 포유동물의 세포에서 항원을 발현할 수 있다. 벡터는 재조합일 수 있다. 벡터는 항원을 코딩하는 이종성 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드일 수 있다. 벡터는 항원을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염하는 데 유용할 수 있고, 형질전환된 숙주 세포는 항원의 발현이 일어나는 조건 하에 배양되고 유지된다.
코딩 서열은 발현의 안정성 및 높은 수준을 위해 최적화될 수 있다. 일부 경우에, 코돈은 분자 내 결합으로 인해 형성된 것과 같은 RNA의 2차 구조 형성을 감소시키도록 선택된다.
벡터는 항원을 코딩하는 이종성 핵산을 포함할 수 있고, 항원 코딩 서열의 상류에 있을 수 있는 개시 코돈, 및 항원 코딩 서열의 하류에 있을 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 및 종결 코돈은 항원 코딩 서열과 프레임 내에 있을 수 있다. 벡터는 또한 항원 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 항원 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 유인원 바이러스 40(SV40) 유래의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대 소과 면역 결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(ALV) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 전초기 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유전자, 예컨대 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인 유래의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 조직 특이적 프로모터, 예컨대 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 미국 특허 출원 공개 US20040175727호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 포함된다.
벡터는 또한 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있으며, 이는 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 하류에 있을 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 벡터(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 폴리아데닐화 신호일 수 있다
벡터는 또한 컨센서스 HBV 코어 단백질 코딩 서열의 상류에 있는 인핸서 또는 컨센서스 HBV 표면 항원 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA 발현에 필수적일 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, HA, RSV 또는 EBV 유래의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호 및 WO94/016737호에 기재되어 있으며, 각각의 내용은 참조문헌으로 완전히 포함된다.
벡터는 또한 염색체 외로 벡터를 유지하고 세포에서 벡터의 다수의 복제물을 생산하기 위해 포유동물의 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 인비트로겐(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 pVAX1, pCEP4 또는 pREP4일 수 있으며, 이들은 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함할 수 있고, 이들은 통합 없이 많은 복제물의 에피솜 복제를 생산할 수 있다. 벡터는 변화를 갖는 pVAX1 또는 pVax1 변이체, 예컨대 본 명세서에 기재된 변이체 플라스미드일 수 있다. 변이체 pVax1 플라스미드는 백본 벡터 플라스미드 pVAX1의 2998개의 염기쌍 변이체(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)이다. CMV 프로모터는 137번 내지 724번 염기에 위치한다. T7 프로모터/프라이밍 자리는 664번 내지 683번 염기에 있다. 다수의 클로닝 자리는 696번 내지 811번 염기에 있다. 소 GH 폴리아데닐화 신호는 829번 내지 1053번 염기에 있다. 카나마이신 내성 유전자는 1226번 내지 2020번 염기에 있다. pUC 기원은 2320번 내지 2993번 염기에 있다.
인비트로겐으로부터 구입 가능한 pVAX1의 서열에 기초하여, 다음의 돌연변이가 본 명세서에서 기재된 플라스미드 1 내지 6에 대한 백본으로서 사용된 pVAX1의 서열에서 발견되었다:
C>G 241 CMV 프로모터에서
C>T 1942 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGH폴리A)의 하류인 백본
A>- 2876 카나마이신 유전자의 하류인 백본
C>T 3277 pUC 복제 기원(Ori)의 높은 복제 수의 돌연변이에서(문헌[Nucleic Acid Research 1985] 참조)
G>C 3753 RNASeH 자리의 pUC Ori 상류의 맨 끝에서
2번, 3번 및 4번 염기쌍은 CMV 프로모터의 상류인 백본에서 ACT에서 CTG로 변화된다.
벡터의 백본은 pAV0242일 수 있다. 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5형(Ad5) 벡터일 수 있다.
벡터는 또한 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 벡터가 투여되는 포유동물 또는 인간 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다. 컨센서스 HBV 코딩 서열은 코돈을 포함할 수 있고, 이는 숙주 세포에서 코딩 서열의 보다 효율적인 전사를 가능하게 할 수 있다.
벡터는 pSE420(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)일 수 있고, 이는 에스케리치아 콜리(E. coli)에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 벡터는 또한 pYES2(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)일 수 있고, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 균주에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 벡터는 또한 MAXBAC(상표명) 완전한 바큘로바이러스 발현 시스템(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 가질 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 벡터는 또한 pcDNA I 또는 pcDNA3(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)일 수 있고, 이는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 벡터는 통상적인 기술 및 용이하게 구입 가능한 출발 물질, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)](이는 참조문헌으로 완전히 포함됨)에 의해 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터 또는 시스템일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호 17은 컨센서스 HBV 코어 단백질을 코딩하고, 서열 번호 18-21은 컨센서스 HBV 표면 항원을 코딩한다. 서열 번호 17-21의 벡터 맵이 각각 도 5 내지 도 9에 도시되어 있다.
e. 백신의 약제학적 조성물
백신은 약제학적 조성물의 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 백신을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 약 5나노그램 내지 약 10㎎의 백신 DNA를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 25나노그램 내지 약 5㎎의 백신 DNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 50나노그램 내지 약 1㎎의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 5 내지 약 250마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10 내지 약 200마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 15 내지 약 150마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 20 내지 약 100마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 75마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 30 내지 약 50마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 35 내지 약 40마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10마이그로그램 내지 약 100마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 20마이크로그램 내지 약 80마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25마이크로그램 내지 약 60마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 30나노그램 내지 약 50마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 35나노그램 내지 약 45마이그로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이크로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350마이크로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250마이크로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200마이크로그램 DNA를 함유한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100나노그램의 백신의 DNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000마이크로그램의 백신의 DNA를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10㎎ 이상의 백신의 DNA를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100나노그램 이하의 백신의 DNA를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000마이크로그램 이하의 백신의 DNA를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10㎎ 이하의 백신의 DNA를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제제화 목적을 위해 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 주사용 약제학적 조성물인 경우, 이 조성물은 멸균이고 발열성을 함유하지 않고 미립자를 함유하지 않는다. 등장성 제제가 바람직하게는 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 등장성 용액, 예컨대 인산염 완충 식염수가 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 혈관수축제가 제제에 첨가된다.
백신은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 비히클, 아쥬반트, 담체 또는 희석제로서 작용성 분자일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 형질감염을 수월하게 하는 제제일 수 있고, 이는 표면 활성제, 예컨대 면역-자극 복합체(immune-stimulating complexes; ISCOMS), 프로인트 불완전 아쥬반트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포(vesicle), 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 폴리음이온, 폴리양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염을 수월하게 하는 제제를 포함할 수 있다.
형질감염을 수월하게 하는 제제는 폴리음이온, 폴리양이온, 예를 들어 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질이다. 형질감염을 수월하게 하는 제제는 폴리-L-글루타메이트이고, 더 바람직하게는 폴리-L-글루타메이트는 6㎎/㎖ 미만의 농도로 백신에 존재한다. 형질감염을 수월하게 하는 제제는 또한 표면 활성제, 예컨대 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 아쥬반트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 히알루론산은 유전자 작제물과 함께 투여하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, DNA 벡터 백신은 또한 형질감염을 수월하게 하는 제제, 예컨대 지질, 리포좀, 예를 들어 레시틴 리포좀 또는 DNA-리포좀 혼합물로서 당해 분야에 공지된 다른 리포좀(예를 들어, W09324640호 참조), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 폴리음이온, 폴리양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염을 수월하게 하는 제제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형질감염을 수월하게 하는 제제는 폴리음이온, 폴리양이온, 예를 들어 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질이다. 백신 내 형질감염 물질의 농도는 4㎎/㎖ 미만, 2㎎/㎖ 미만, 1㎎/㎖ 미만, 0.750㎎/㎖ 미만, 0.500㎎/㎖ 미만, 0.250㎎/㎖ 미만, 0.100㎎/㎖ 미만, 0.050㎎/㎖ 미만, 또는 0.010㎎/㎖ 미만이다.
약제학적으로 허용되는 부형제는 아쥬반트일 수 있다. 아쥬반트는 대안적인 플라스미드에서 발현되거나 백신에서 상기 플라스미드와 조합되어 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 아쥬반트는 α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현 케모카인(TECK), 점막-연관 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, 예를 들어 결실된 신호 서열을 갖는 IL-15, 및 임의로 IgE 유래의 신호 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 아쥬반트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 아쥬반트는 IL-12이다.
유용한 아쥬반트일 수 있는 다른 유전자는 MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피세포 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능성 단편을 코딩하는 것을 포함한다.
f. 백신 전달의 방법
HBV 바이러스 감염에 대한 면역 반응이 유도될 수 있는 것에 대해 특히 효과적인 면역원이 되게 하는 에피토프를 포함하는 HBV 코어 단백질 및/또는 HBV 표면 항원의 유전자 작제물 및 단백질을 제공하기 위한, 약제학적 제제를 전달하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 백신을 전달하는 방법 또는 백신접종의 방법은 치료학적 및/또는 예방학적 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 백신접종 과정은 복수의 HBV 유전자형에 대해 포유 동물에서 면역 반응을 생성할 수 있다. 백신은 개체에 전달되어 포유동물의 면역계의 활성을 조절하고 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 백신의 전달은 면역계가 세포성, 체액성, 또는 세포성 및 체액성 반응을 인식하고 유도할 시 세포에서 발현되고 세포의 표면으로 전달되는 핵산 분자로서의 HA 항원의 형질감염일 수 있다. 백신의 전달은 본 명세서에 기재된 바와 같이 포유동물에 백신을 투여함으로써 복수의 HBV 바이러스에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유도하거나 발생시키는 데 사용될 수 있다.
포유동물에게의 백신의 전달 시 및 포유동물의 세포로의 벡터의 전달 시, 형질감염된 세포는 컨센서스 HBV 코어 단백질 및 컨센서스 HBV 표면 항원을 발현하고 분비할 것이다. 이러한 분비된 단백질, 또는 합성 항원은 면역계에 의해 외래물질로서 인식될 것이고, 이는 항원에 대해 만들어진 항체, 및 특이적으로 항원에 대한 T 세포 반응을 포함할 수 있는 면역 반응을 증가시킬 것이다. 몇몇 예에서, 본 명세서에 기재된 백신으로 백신접종된 포유동물은 프라이밍된 면역계를 가질 것이고, HBV 바이러스 균주로 공격될 때, 프라이밍된 면역계는, 체액성, 세포성 또는 둘 다를 통하든, 후속하는 HBV 바이러스의 신속한 청소를 가능하게 할 것이다. 백신은 개체로 전달되어 개체의 면역계의 활성을 조절함으로써 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
백신의 DNA를 전달하는 방법은 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있고, 이들 둘 다는 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다.
백신은 포유동물에 투여되어 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 소, 돼지, 양, 염소, 영양, 들소, 물소, 소과 동물, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 랫트 또는 닭, 바람직하게는 인간, 소, 돼지 또는 닭일 수 있다.
g. 아쥬반트를 갖는 백신의 전달
약제학적 조성물, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 백신은 아쥬반트를 코딩하는 유전자 또는 단백질과 조합되어 투여될 수 있고, 이는 α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피세포 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, 아포(Apo)-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제(Caspase) ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1 또는 TAP2 또는 이의 기능성 단편을 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 아쥬반트는 IL-12이다.
h. 백신에 의해 면역 반응을 생성하는 방법
백신은 치료학적 또는 예방학적 면역 반응을 포함하여 포유동물에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응은 HBV 코어 항원, HBV 표면 항원 또는 이들의 조합에 지시된 항체 및/또는 킬러 T 세포를 생성할 수 있다. 이러한 항체 및 T 세포는 단리될 수 있다.
몇몇 실시형태는 HBV 코어 단백질, HBV 표면 항원 단백질 및 이들의 조합에 대해 면역 반응을 생성하는 방법을 제공하고, 이 방법은 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태는 HBV 감염에 대해 개체를 예방학적으로 백신접종하는 방법을 제공하고, 이 방법은 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, HBV로 감염된 개체를 치료학적으로 백신접종하는 방법을 제공한다. 백신의 투여 전의 HBV 감염의 진단은 통상적으로 실행될 수 있다.
i. 백신에 의한 치료 방법
백신은 간을 보호하는 포유동물에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응은 간에 대한 손상 또는 간의 염증을 야기하지 않는 항원-특이적 CTL 반응을 생성할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 백신은 말초에서 전달되어 간의 항원-특이적 표적화를 확립하여, 간에 대한 손상 또는 간의 염증을 야기하지 않으면서 HBV 감염된 세포를 청소하거나 제거할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 간의 항원-특이적 표적화를 확립하여, 간에 대한 손상 또는 간의 염증을 야기하지 않으면서 HBV 감염된 세포를 청소하거나 제거하도록 말초에 대한 HBV 컨센서스 코어 항원을 포함하는 백신의 전달을 포함할 수 있다.
3. 투여 경로
백신 또는 약제학적 조성물은 상이한 경로에 의해, 예를 들어 경구로, 비경구로, 설하로, 경피로, 직장으로, 경점막으로, 국소적으로, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉막내로, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 척추강내 및 관절내 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다. 수의학적 용도를 위해, 상기 조성물은 보통의 수의학적 관행에 따라 적절하게 허용되는 제형으로서 투여될 수 있다. 수의사는 특정한 동물에 대해 가장 적절한 투여 경로 및 투약 요법을 용이하게 결정할 수 있다. 백신은 전통적인 주사기, 무바늘 주입 장치, "미세투사물 충격 유전자 총" 또는 다른 물리적 방법, 예컨대 전기천공("EP"), "유체역학 방법" 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.
백신의 벡터는 몇몇 널리 공지된 기술, 예를 들어 생체내 전기천공과 함께 또는 이것 없이 DNA 주입(또한 DNA 접종이라고도 칭함), 리포좀 매개, 나노입자 수월화된, 재조합 벡터, 예컨대 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관 바이러스 및 재조합 백시니아에 의해 포유동물에게 전달될 수 있다. HBV 항원은 DNA 주입을 통해 그리고 생체내 전기천공과 함께 전달될 수 있다.
a. 전기천공
백신 또는 약제학적 조성물은 전기천공에 의해 투여될 수 있다. 전기천공을 통한 백신의 투여는 가역적인 기공을 세포막에서 형성하도록 하기에 효과적인 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직으로 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 사용하여 실행될 수 있고, 바람직하게는 에너지의 펄스는 사용자에 의해 입력된 미리 설정된 전류와 유사한 정전류이다. 전기천공 장치는 전기천공 부품 및 전극 조립체 또는 핸들 조립체를 포함할 수 있다. 전기천공법 부품은 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 시험기, 파형 자동 기록계(waveform logger), 입력 소자, 상황 보고 소자, 통신 포트, 메모리 부품, 전력원, 및 전원 스위치를 포함하는 하나 이상의 전기천공 장치의 다양한 부품을 포함하고 통합시킬 수 있다. 전기천공은 플라스미드에 의한 세포의 형질감염을 수월하게 하는 생체내 전기천공 장치, 예를 들어 셀렉트라(CELLECTRA(등록상표)) EP 시스템(이노비오 파마슈티칼스, 인크.(Inovio Pharmaceuticals, Inc.), 미국 펜실베이니아주 블루 벨 소재) 또는 엘겐(Elgen) 전기천공기(이노비오 파마슈티칼스, 인크.)를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 DNA 백신의 전달을 수월하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등), 미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등에 의해 제출됨)에 기술된 것들을 포함하고, 이들의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. DNA 백신의 전달을 수월하게 하는 데 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은 동시 계류중이고 공유인 미국 특허 출원 일련번호 제11/874072호(출원일: 2007년 10월 17일)에 제공된 것을 포함하며, 이는 35 USC 119(e) 하에 미국 가특허 출원 일련번호 제60/852,149호(출원일: 2006년 10월 17일) 및 제60/978,982호(출원일: 2007년 10월 10일)에 대한 이익을 주장하고, 이들 모두는 본 명세서에 그 전문이 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등)는 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포로의 생체 분자의 도입을 수월하게 하기 위한 모듈식 전극 시스템 및 이의 용도를 기술한다. 모듈식 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사침; 프로그램 가능한 정전류 펄스 조절기로부터 복수의 바늘 전극까지 도전성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 조작자는 지지 구조물에 탑재된 복수의 바늘 전극을 잡아서, 신체 및 식물의 선택된 조직으로 이를 견고하게 삽입할 수 있다. 이후, 생체 분자는 선택된 조직으로 피하 주사침을 통해 전달된다. 프로그램 가능한 정전류 펄스 조절기가 활성화되고 정전류 전기적 펄스가 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기적 펄스는 복수의 전극 사이의 세포로의 생체 분자의 도입을 수월하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등에 의해 제출됨)는 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포로의 생체 분자의 도입을 효과적으로 수월하게 하는 데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 전기천공 장치는 조작이 소프트웨어 또는 펌웨어로 지정된 동전기 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어에 기초한 어레이 내의 전극과 펄스 파라미터의 입력 사이의 일련의 프로그램 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 가능하게 한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이, 주사 바늘을 위한 중앙 주입 채널 및 제거형 가이드 디스크를 갖는 대체형 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 제2005/0052630호의 전체 내용은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/0052630호에 기술된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 장기로의 깊숙한 침투를 위해 적합화될 수 있다. 전극 어레이의 구성으로 인해, (선택된 생체 분자를 전달하는) 주사 바늘은 또한 표적 장기로 완전히 삽입되고, 주입은 전극으로 미리 윤곽화된 영역에서 표적 조직에 대해 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/005263호에 기술된 전극은 바람직하게는 길이가 20㎜이고 게이지가 21이다.
추가로, 전기천공 장치 및 이의 용도를 포함하는 몇몇 실시형태에서 고려하면, 미국 특허 제5,273,525호(공고일: 1993년 12월 28일), 미국 특허 제6,110,161호(공고일: 2000년 8월 29일), 제6,261,281호(공고일: 2001년 7월 17일), 제6,958,060호(공고일 2005년 10월 25일) 및 미국 특허 제6,939,862호(공고일: 2005년 9월 6일)에 기술된 전기천공 장치가 있다. 더욱이, 미국 특허 제6,697,669호(공고일: 2004년 2월 24일; 다양한 장치 중 임의의 것을 사용하는 DNA의 전달에 관한 것임), 및 미국 특허 제7,328,064호(공고일: 2008년 2월 5일; DNA를 주입하는 방법에 접근함)에 기재된 것인 전기천공 장치가 존재한다. 상기 특허는 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
4. 백신을 제조하는 방법
본 명세서에 기재된 백신을 포함하는 DNA 플라스미드를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 포유동물 발현 플라스미드로의 최종 서브클로닝 단계 후, DNA 플라스미드는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양물을 접종하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 EP 장치에 의한 사용을 위한 DNA 플라스미드는 공지된 장치 및 기술의 조합을 이용하여 제제화되고 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이는 미국 공개 출원 제20090004716호(출원일: 2007년 5월 23일)에 기술된 최적화된 플라스미드 제조 기술을 사용하여 제조된다. 몇몇 예에서, 이 연구에 이용된 DNA 플라스미드는 10㎎/㎖ 이상의 농도로 제제화될 수 있다. 제조 기술은 또한 등록된 특허인 미국 특허 제7,238,522호(공고일: 2007년 7월 3일)에 기술된 것들을 포함하여 미국 일련번호 제60/939792호에 기술된 것 이외에 당업자에게 통상 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 통합한다. 상기 언급된 출원 및 특허인 미국 일련번호 제60/939,792호 및 미국 특허 제7,238,522호는 각각 본 명세서에 그 전문이 포함된다.
실시예
본 명세서는 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 이는 단지 설명으로서 주어지는 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 용법 및 조건에 본 발명을 적합하게 하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술되고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이와 같은 변형은 또한 첨부된 특허청구범위의 범주에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1
HBV 코어 단백질
컨센서스 HBV 코어 단백질(또한, HBV 변형된, MCore 또는 M-코어 작제물이라고도 칭함)은 HBV 유전자형 A, B, C, D 및 E 유래의 에피토프 서열로부터 설계되었다. 이들 유전자형 유래의 HBV 코어 단백질 서열은 광범위한 유전자형에 대해 면역력을 유도함으로써 HBV에 대한 보편적 백신을 제공하는 컨센서스 코어의 구성에서의 포함을 위해 선택되었다. 몇몇 실시형태에서, M-코어 작제물의 변형은 IgE 선도 서열의 첨가를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, M-코어 단백질은 증대된 발현을 위해 코돈 최적화 및 RNA 최적화를 이용하여 코딩된다.
1. 컨센서스 코어 항원의 작제 및 발현
HBV 유전자형 A, B, C, D 및 E 코어 컨센서스 뉴클레오타이드 서열은 각각의 유전자형에 대한 코어 유전자의 컨센서스 서열을 생성하고 이후 모든 5개의 유전자형 컨센서스의 컨센서스 서열을 생성함으로써 작제되어서, 심하게 서열분석된 유전자형에 대한 바이어스를 피했다. 추가로, 서열은 심하게 서열분석된 유전자형에 대한 샘플링 바이어스를 피하기 위해 여러 국가로부터 수집되었다. 최종 HBcAg 컨센서스 서열을 개발하기 위해 클러스털(clustal) X 소프트웨어를 이용하여 서열을 정렬하였다. 도 10에 도시된 바대로, 상이한 유전자형으로부터의 모든 샘플링된 서열에 대한 다중-유전자형 컨센서스 HBcAg 서열의 관찰된 상대 밀접성이 존재한다.
컨센서스 서열이 생성된 후, 플라스미드로부터 항원 발현 수준을 증가시키기 위해 몇몇 변형을 수행하였다. 특히, 매우 효과적인 IgE 선도 서열 및 C 말단 HA 태그를 추가하고, 작제물은 RNA이고 코돈 최적화되었다. 이는 IgE 리더 및 HA 태그를 갖는 M-코어 서열을 코딩하는 핵산 서열(서열 번호 5)을 생성시키고, 이는 EcoRI 및 NotI로 절단되고 거대세포 바이러스 전초기 프로모터의 제어 하에 발현 벡터 pVAX(인비트로겐)로 클로닝되었다. 이후, 생성된 작제물은 pMCore(서열 번호 17)라고 칭했다.
실험실내 발현 시험은 pMCore 작제물 및 pVAX(대조군으로서 사용됨)을 사용하여 실행되었다. 양성 발현을 나타내는 결과는 도 11a 및 도 11b에 도시된 겔 이미지에 도시되어 있다.
추가로, HBcAg 단백질은 B형 간염의 코어 유전자를 함유하는 pMCore DNA 플라스미드를 형질감염시킴으로써 발현되었다(도 12). pMCore의 발현은 35S-메티오닌(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 메디슨 소재)을 함유하는 전사/번역 시스템의 TNT(등록상표) 퀵 커플드 발현(Quick Coupled Expression of Transcription/Translation System)을 이용하여 검출되었다. 합성된 유전자 생성물은 코딩된 HA 에피토프, 클론 HA-7(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 표적화하는 항-HA 단일클론 항체를 이용하여 면역 침강되었다. 면역 침강된 단백질은 12%의 SDS-PAGE 겔에서 전기영동되고 이후 고정되고 건조되었다. 방사성 35S의 통합을 갖는 합성된 단백질은 방사선사진촬영(autoradiography)에 의해 검출되었다. 용해물에서의 이 실험실내 번역 검정은 28kDa의 예상 분자량에서 검출 가능한 HBcAg를 나타냈다(도 13).
발현은 면역형광 검정에 의해 항-HA 태그화 단일클론 항체를 이용하여 추가로 확인되었다. 횡문근육종(RD) 세포주는 제조업자의 가이드라인에 따라 터보펙트(TURBOFECT)(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 이용하여 pMCore로 형질감염되었다. 세포는 처음에 2%의 폼알데하이드로 고정되고 이후 단백질 발현을 위해 평가되었다. 고정된 세포는 1시간 동안 실온에서 '1차 표준 용액'(0.1%의 BSA, 0.2%의 사포닌, 0.02%의 아지드화나트륨) 중에 희석된 래빗 단일클론 HA 태그(인비트로겐)와 항온처리되었다. 세포는 후속하여 20분 동안 실온에서 DyLight 594-표지된 항-래빗 2차 항체(써모 사이언티픽)와 항온처리되었다. 공초점 영상화를 이용하여 도 14에 도시된 바대로 형질감염된 RD 세포의 핵 주위에서 및 세포질에서 HBcAg를 가시화하였다. 발현 패턴은 컨센서스 코어 유전자를 보유하는 DNA 플라스미드가 실험실내 상이한 세포에서 고도로 발현된다는 것을 확인시켜준다. 구체적으로, 이미지는 자이스 액시오버트(Zeiss Axiovert) 100 도립 공초점 현미경을 사용하여 얻었다. 형광 강도의 분석 및 정량화를 이미지 J 소프트웨어(NIH, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)를 이용하여 수행하였다.
2. 마우스의 면역법
C57BL/6 형질전환 마우스는 각각 4마리 마우스의 2개의 그룹으로 나누고 전기천공을 사용하여 2주 간격으로 20㎍의 DNA로 3회 면역화시켰다(1그룹 - pVAX 벡터 대조군; 2그룹 pM-코어). 마우스는 0일, 14일, 28일째에 면역화시키고, 35일째에 희생시켰다. 비장, 간 및 혈청을 희생된 동물로부터 수거하였다.
추가로, T 및 B 세포성 면역 반응의 생성을 평가하기 위해, 다양한 말초 조직에서 반응 둘 다에 대해 Balb/c 마우스를 면역화시키고 측정하였다. 마우스는 30㎍의 pMCore 또는 pVax의 3회 근육내 면역법을 받은 후 면역법 계획에 기재된 바대로 전기천공되었다(도 15). 특히, 6주령 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 잭슨 레버러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 구입하였다. 동물을 미국 국립 보건원(National Institutes of Health) 및 펜실베니아 대학교 기관 관리 및 사용 위원회(University of Pennsylvania Institutional Care and Use Committee)(IACUC) 가이드라인에 따라 유지시켰다. DNA 면역법 연구를 위해, 8마리의 동물을 2개의 그룹으로 나눴다. 면역화된 그룹에서의 각각의 동물은 전경골(TA) 근육에서 2주마다 30㎍의 pMCore의 전체 3회 면역법을 받았다. 각각의 면역법은 셀렉트라 적응형 정전류 전기천공 장치(이노비오 파마슈티칼스, 인크., 미국 펜실베이니아주 블루 벨 소재)로 생체내 전기천공에 의해 수반되었다. 2개의 0.2 Amp 정전류 구형파 펄스가 근육으로 완전히 삽입된 26-게이지 고체 스테인리스 강 전극으로 이루어진 삼각형 3-전극 어레이를 통해 전달되었다. 각각의 펄스는 펄스 간 1초 지연으로 52밀리초의 길이이다.
Balb/C 마우스 균주의 생체내 연구는 비장으로부터 취한 CD8 및 CD4 T-세포에서 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터페론 감마 T-세포(IFN-γ) 및 CD107a의 분비의 양의 증대를 나타낸다. 도 16 및 도 17은 pM-코어에 의한 Balb/C 마우스의 백신접종이 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 IFN-γ 분비의 양을 증대시킨다는 것을 나타낸다. 도 18 및 도 19는 pM-코어에 의한 Balb/C 마우스의 백신접종이 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 TNF-α 분비의 양을 증대시킨다는 것을 나타낸다. 도 20 및 도 21은 pM-코어에 의한 Balb/C 마우스의 백신접종이 비장으로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 CD 107a 분비의 양을 증대시킨다는 것을 나타낸다.
추가의 실험에서, IFN-γ 및 TNF-α 분비는 T 세포에서 검사되었다. 이 추가의 실험에 대해 비장세포를 수확하기 위해, 마우스를 마지막 면역법 후 1주일에 희생시키고, 비장을 수확하고 R10 배지(10%의 FBS 및 1x 항생제-항진균제로 보충된 RPMI 배지)에 위치시켰다. 비장을 개별적으로 분쇄하고, 40μM의 세포 스트레이너(strainer)로 변형시키고 5분 동안 1㎖의 ACK 용해물 완충제로 처리하여 용해물 적혈구가 되었다. 비장세포를 완전한 R10 배지 중에 재현탁시키고 추가의 면역학적 검정에 사용하였다.
비장세포의 하위세트를 1㎖당 107의 농도로 R10 배지 중에 재현탁시키고 100㎕를 96웰 환저 플레이트에 도말하였다. pMCore 혼주된 펩타이드를 함유하는 100㎕의 배지 또는 양성 대조군으로서의 10ng/㎖의 PMA(시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 500ng/㎖의 이오노마이신(칼바이오켐(Calbiochem), 노바바이오켐, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 혼합물 또는 음성 대조군으로서의 0.1%의 디메틸 설폭사이드(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 모든 웰은 5㎕/㎖의 2개의 단백질 운송 억제제, 브레펠딘 A(GolgiPlug) 및 모넨신(Golgistop)(모두 비디 바이오사이언스(BD Bioscience)로부터 구입)을 함유하였다. 세포를 5% CO2 중에 5시간 동안 37℃에서 항온처리하고 37℃에서 10분 동안 라이브/데드 픽서블 데드 세포 염색(LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain)(인비트로겐)으로 염색하였다. 세포 외 염색을 마우스 CD3, CD4 및 CD8에 특이적인 항체를 사용하여 수행하였다. 이후, 비장세포를 각각 BD 사이토픽스(CYTOFIX)/사이토펌(CYTOPERM) 및 펌(PERM)/와시(WASH)(비디 바이오사이언스)를 사용하여 투과시키고 세척하였다.
세포 내 사이토카인 염색
세포 내 사이토카인을 이후 마우스 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자-알파에 대한 항체로 염색하였다. 림프구의 하위세트를 1㎖당 107의 농도로　R10 배지 중에 재현탁시키고 100㎕를 96웰 환저 플레이트에 도말하였다. pMCore 혼주된 펩타이드를 함유하는 100㎕의 배지 또는 양성 대조군으로서의 10ng/㎖의 PMA(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 500ng/㎖의 이오노마이신(칼바이오켐, 노바바이오켐, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 혼합물 또는 음성 대조군으로서의 0.1%의 디메틸 설폭사이드(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 모든 웰은 5㎕/㎖의 2개의 단백질 운송 억제제, 브레펠딘 A(GolgiPlug) 및 모넨신(Golgistop)(모두 비디 바이오사이언스로부터 구입)을 함유하였다. 세포를 5% CO2 중에 5시간 동안 37℃에서 항온처리하고 37℃에서 10분 동안 라이브/데드(등록상표) 픽서블 데드 세포 염색(인비트로겐)으로 염색하였다. 세포 외 염색을 마우스 CD3, CD4 및 CD8에 특이적인 항체를 사용하여 수행하였다. 이후, 비장세포를 각각 BD 사이토픽스/사이토펌 및 펌/와시(비디 바이오사이언스)를 사용하여 투과시키고 세척하였다. 이후, 세포를 세포 내 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자-알파, 인터류킨-2 및 리소좀-연관 막 단백질 1에 대한 항체로 염색하였다.
접합된 항-마우스 항체는 CD3-피코에리트린/Cy7(PE/Cy7), CD4-페리디닌 엽록소 단백질(PerCP), CD8-알로피코사이아닌(APC), IFN-γ-알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 700, TNF-a-플루오레신 아이소티오사이이네이트(FITC) 및 IL-2-피코에리트린 사이아닌(PE)(모두 비디 바이오사이언시스(미국 캘리포니아주 산 호세 소재)로부터 구입)를 포함하는 세포 외 및 세포 내 염색 동안 사용되었다.
유도된 평균 HBcAg-특이적 IFN-γ T 세포 반응은 100만개의 비장세포당 2000(± 210)의 SFU에서 튼튼하였다. 흥미롭게도, 자극된 비장세포의 세포 내 염색은 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다 각각 거의 유사한 양의 항원-특이적 IFN-γ, 0.74 및 0.94를 생성하지만, 각각 약 0.3% 및 1.5%의 CD4+ 및 CD8+ 세포로 상이한 수준의 TNF-α를 생성한다는 것을 나타낸다(도 22). 유사한 경향이 사이토카인 둘 다에 이중 양성인 세포로 관찰되었다. 이중 양성 CD8+ 세포(평균 0.7%)보다 비장에서 더 적은 이중 양성 CD4+ 세포(약 0.2%)가 있다(도 23).
간으로의 HBV 특이적 T-세포 이동은 pM-코어 DNA 백신이 투여된 동물에서 또한 입증되었다. 높은 빈도의 HBV 코어 항원 특이적 T 세포의 표적화 및 간에 대한 이팩터 기능은 HBV 면역 치료법의 개발을 위한 목표이다. 면역법 이후, 동물을 희생시키고 이의 간을 제거하고, 간으로의 HBV 특이적 이팩터 T 세포 이동을 결정하였다. 결과는 pM-코어 백신이 생체내 간으로 이팩터 T 세포를 추진시킨다는 것을 나타낸다. 도 24 및 도 25는 인터페론-γ T 세포 간 반응을 나타내고, 도 26 및 27은 종양 괴사 인자-α 간 면역 반응 및 pM-코어에 의한 백신접종으로부터 생긴 상승된 반응을 나타낸다.
pM-코어 DNA 작제물에 의해 코딩된 M-코어 컨센서스 면역원은 강한 균형된 CD4+/CD8+ T 세포성 면역 반응을 추진시킨다. 유도된 T 세포는 높은 빈도로 간으로 통행하고 HBV 감염 후 면역 청소율에 대해 정확한 이팩터 표현형을 나타내어, 이 면역 치료학적 백신의 추가의 개발을 지지한다.
DNA 면역법 후 간내 항원-특이적 T 세포의 사이토카인 생성 능력을 또한 검사하였다. 1㎖의 PBS를 각각의 마우스의 간 정맥으로 직접 주입함으로써 각각의 간을 관류시켰다. 특히, 간을 수확하고 분쇄하고 5㎖의 44% 등장성 퍼콜(Percoll) 중에 재현탁시켰다. 혼합물을 3㎖의 66% 등장성 퍼콜 아래에 두고, 20분 동안 2000rpm에서 구배 분리를 위해 원심분리하였다. 림프구를 수집하고 10㎖의 R10 중에 세척하고 필요한 경우 ACK 용해물로 처리하였다. 간으로부터 단리된 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다 실험실내 HBcAg 펩타이드로 자극될 때 IFN-γ 및 TNF-α를 생성한다(도 28 및 29). CD4 T 세포가 높은 퍼센트의 이중 생성자를 나타내는 반면, CD8은 약한 IFN-γ+TNF-α+ 생성 세포이거나 이 세포가 아니라는 것을 나타낸다. 대신에, 대부분의 CD8 T 세포는 IFN-γ 또는 TNF-a 둘 다를 생성하였다. 간에서의 HBcAg-특이적 CD4 T 세포의 농후화가 관찰되었고, 이는 비장의 것과 반대이었다. 휴식 중인 간에서의 HBcAg-특이적 CD4 T 이중 양성 퍼선트는 비장에서 관찰된 것에 필적하였다. 게다가, 말초 CD8 T 세포는 간에 있는 CD8 T 세포보다 더 우수한 이중 생성자인 것으로 확인되었다. 면역화된 마우스로부터의 간에 있는 B 세포의 항체 생성 능력이 또한 관찰되었다. 흥미롭게도, 점막 장기로서의 간은 IgG보다 더 높은 항원-특이적 IgA를 생성하였고(도 30), 이는 이전에 연구되지 않은 관찰이다.
도 31은 효소-결합 면역흡착 스팟(Enzyme-linked immunosorbent spot; ELISPOT) 검정을 이용한 pM-코어에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 나타낸다. 비장세포는 pM코어의 전체 길이에 걸쳐있고 8개의 아미노산으로 중첩하는 15합체 펩타이드의 2가지 풀로 자극되었다. R10 배지에서의 200,000개 비장세포를 96웰의 IFN-γ 포획 항체(알앤디 시스템(R&D system))로 코팅된 플레이트에 도말하고, 5% CO2 중에 37℃에서 특이적 펩타이드 풀의 존재 하에 밤새 자극하였다. 세포를 세척하고, 플레이트를 바이오티닐화 항-마우스 IFN-γ 검출 항체(알앤디 시스템)와 밤새 항온처리하였다. 후속하여 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 및 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염 및 나이트로 블루 테트라졸륨 클로라이드를 스팟을 전개시키도록 사용하였다. 스팟을 자동화 ELISPOT 판독기(CTL 리미티드)를 사용하여 계수하였다. 도 31에 도시된 바와 같이, pM코어에 의한 면역법은 강한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있었다. 평균 HBcAg-특이적 IFN-γ T 세포 반응은 100만개의 비장세포당 약 2000(± 210)의 SFU이었다.
ELISPOT 검정을 이용하여 IFN-γ을 추가로 검사하였다. 특히, 비장세포는 HBcAg의 전체 길이에 걸쳐있고 8개의 아미노산으로 중첩하는 15합체 펩타이드의 2가지 풀로 자극되었다. 풀 1로 가는 처음의 17개의 펩타이드 및 풀 2에서의 마지막 16개로 무작위로 혼주된 33개의 전체 개별 펩타이드가 있었다. IgELs 및 HA 태그는 가능한 천연 항원에 가깝운 펩타이드를 만들도록 배제되었다. R10 배지에서의 200,000개의 비장세포를 96웰의 IFN-γ 포획 항원(알앤디 시스템)로 코팅된 플레이트에 도말하고, 5% CO2 중에 37℃에서 특이적 펩타이드 풀의 존재 하에 밤새 자극하였다. 세포를 세척하고, 플레이트를 바이오티닐화 항-마우스 IFN-γ 검출 항체(알앤디 시스템)와 밤새 항온처리하였다. 후속하여 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 및 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염 및 나이트로 블루 테트라졸륨 클로라이드를 스팟을 전개시키도록 사용하였다. 스팟을 자동화 ELISPOT 판독기(CTL 리미티드)를 사용하여 계수하였다. 처음의 면역법 1주일 후에, pMCore 면역화된 마우스가 생체외 자극 이후 IFN-γ ELISPOT 검정에 의해 확인된 바대로 강한 HBcAg T 세포 반응의 증거를 나타낸다는 것이 관찰되었다. 도 32는 우세한 에피토프가 펩타이드 풀 2에 대해 바이어스된다는 것을 나타낸다.
생체내 세포독성 검정 연구를 유동세포 계수법과 조합된 카복시플루오레신 다이아세테이트 숙신이미딜 에스터(CFSE) 표지화를 이용하여 실행하였다. 세포 집단의 세포 사이에서 세포 분열을 평가하였다. 비장세포를 나이브 마우스로부터 단리하고 2개의 집단으로 나누었다. CFSE로 높게 표지된 일 집단은 연관 펩타이드(예를 들어, HBV 코어 펩타이드)로 펄스화하였다. CFSE로 낮게 표지된 다른 집단은 연관되지 않은 펩타이드(예를 들어, HCV NS3 펩타이드)로 펄스화하였다. 표지된, 펩타이드로 처리된 세포는 유동 분석이 실행된 적응형 이입 실험에서 조합되어 사용되었다. 처리되고 표지화된 표적 세포의 조합된 집단을 2개 그룹의 마우스, 즉 대조군과 면역화된 그룹에 투여하였다. 비장세포를 각 그룹의 마우스로부터 단리하고 샘플을 유세포 분석기에서 실행하였다. CFSE의 양을 측정하였다. 전형적으로, 이러한 실험에서, 2개의 피크가 형성되는데, 제1 피크는 연관되지 않은 펩타이드이고; 제2 피크는 더 큰 CFSE를 나타내는 피크에서의 면역화한 펩타이드이다.
도 33은 백신접종에 의해 유도된 CD8 T 세포가 특이적으로 생체내 표적 세포를 제거할 수 있다는 것을 나타낸다. 결과는 나이브 마우스 유래의 비장 및 간의 샘플이 연관되지 않은 펩타이드와 연관된 펩타이드 피크에서 거의 동등한 양의 세포를 함유한다는 것을 나타내는 반면, 결과는 면역화된 그룹 사이에서, 연관된 펩타이드로 펄스화된 그룹 유래의 세포에 대한 피크가 연관되지 않은 펩타이드보다 상당히 적다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 HBV 펩타이드로 처리된 표적 세포가 특이적으로 HBV 백신으로 면역화된 마우스에서 제거되지만, 비면역화된 마우스에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 연관되지 않은 펩타이드로 처리된 표적 세포의 임의의 제거는, 어쨌든 일어난다면, HBV 백신으로 면역화된 마우스와 비면역화된 마우스에서 동일하고, HBV 펩타이드로 처리된 표적 세포의 제거보다 상당히 더 적다.
생체내 표적 세포를 특이적으로 제거하는 DNA 면역법 후 유도된 HBV-특이적 CD8 T 세포의 능력을 추가로 검사하였다. 코어 항원을 표적화하는 인간 CTL은 만성 감염에 비해 HBV의 급성 청소율에서 중요하다. 최종 면역법 1주일 후, pVax 또는 면역화된 pMCore의 2개의 그룹의 각각으로부터의 4마리의 마우스를 HBcAg(연관) 또는 HCV-NS3/4A(비연관) 펩타이드로 펄스화된 표적 비장세포로 적응형으로 이입시켰다. 간단히 말하면, 나이브 마우스로부터의 비장세포를 1μM 또는 1nM의 CFDA SE(인비트로겐)로 염색하였다. 이후, 표지된 비장세포를 표시된 펩타이드(1μM)로 코팅하고, 각각의 집단의 107개의 세포를 나이브 또는 면역화된 마우스에 정맥내 주입하였다. 24 또는 90시간 후, 비장 및 간으로부터의 세포를 단리하고, 유동세포 계수법으로 분석하였다. 사멸의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다: 100 - ([(감염에서 펼스화된 연관 펩타이드(%) / 감염에서 펼스화된 비연관 펩타이드(%)) / (비감염에서 펼스화된 연관 펩타이드(%) /비감염에서 펼스화된 비연관 펩타이드(%))] x 100). 사멸을 추적하도록 CFSE 표지된 비장세포에서 게이팅함으로써, pMCore 백신접종된 마우스가 도 34에 도시된 바대로 항원-펄스화된 표적 세포의 강한 특이적 사멸을 유도할 수 있다는 것이 관찰되었다. 비장에서 관찰된 사멸의 평균 퍼센트는 약 83%인 반면, 간에서는 평균이 76%이어서, 간으로 이동하고 이에 보유된 백신-유도된 CTL이 HBV 펩타이드 펄스화된 표적 세포를 사멸할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 임의의 방법 및 구체적으로 전신 면역법에 의해 간에서의 HBcAg-특이적 CTL 반응의 유도를 나타내는 최초의 연구이다. 이 데이터는 말초 면역법이 간으로 이동하고 표적 세포를 용해시킬 수 있는 이팩터 세포를 유도할 수 있다는 증거를 제공한다.
도 35는 CFSE 표지화를 이용한 T 세포 증식 검정으로부터 수집된 데이터를 나타낸다. pVax 벡터(대조군) 또는 플라스미드 pMCore(HBV M-코어를 발현함)로 처리된 CD3+CD4+ 세포 및 CD3+CD8+ 세포의 증식의 퍼센트를 비교하였다. 간단히 말하면, 단리된 비장세포를 제조업자의 지시에 따라 카복시플루오레신 다이아세테이트, 숙신이미딜 에스터(CFDA-SE) 세포 트레이서 키트(Cell Tracer Kit)(인비트로겐)로 염색하였다. 염색된 세포를 식염수로 3회 세척하고, pMCore-특이적 중첩 펩타이드로 자극하였다. 세포를 37℃에서 96시간 동안 항온처리하였다. 48시간 후, 배양 배지 중 50%를 제거하고 새로운 R10으로 대체하였다. 4일째에, 세포를 수확하고 CD3, CD4 및 CD8-특이적 단일클론 항체(BD Pharmingen)로 염색하였다. 세포를 PBS와 함게 1%의 파라폼알데하이드(PFA)로 고정하고 FACScalibur(백톤 디킨슨(Becton Dickinson))에서 획득하였다. 데이터를 플루조(FlowJo) 프로그램을 이용하여 분석하였다. CFSE 저 및 CFSE 중간 집단은 증식된 세포로 생각되었다. 도 35에 도시된 바대로, 비장으로부터 단리된 CD3+CD8+ T 세포는 CD3+CD4+ T 세포와 비교하여 더 증식하였다.
T 세포 증식 검정에 의한 추가의 실험은 또한 CFSE 표지화를 이용하였다. 특히, 단리된 비장세포를 제조업자의 지시에 따라 카복시플루오레신 다이아세테이트, 숙신이미딜 에스터(CFDA-SE) 세포 트레이서 키트(인비트로겐)로 염색하였다. 염색된 세포를 식염수로 3회 세척하고 1㎍/mL의 농도에서 HBcAg 혼주된 펩타이드를 함유하는 200㎕의 배지의 전체 용적으로 96웰의 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 세포를 37℃에서 96시간 동안 항온처리하였다. 48시간 후, 배양 배지 중 50%를 제거하고 새로운 R10으로 대체하였다. 상기 기재된 바대로 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다 사이의 사이토카인 생산의 차이는 이의 최종 증식 역량에 필적하였다. 항원 특이적 펩타이드에 의한 자극의 4일째에, CD8+ T 세포는 CD4+ 세포보다 2배 초과로 증식하여(도 36), 반응에서 명확한 CD8 T 세포 바이어스를 나타낸다.
도 37a 및 도 37b는 pVax 벡터(대조군) 또는 플라스미드 pMCore(HBV M-코어를 발혐함)로 처리한 동물 유래의 혈청의 연속 희석에서의 항-HBV 코어 항체의 비교를 나타내는 ELISA 데이터이다. 간단히 말하면, 고결합 ELISA 플레이트(코스타(Costar), 미국 뉴욕주 코닝 소재)를 4℃에서 24시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 HBcAg 단백질로 코팅하고, 이후 PBS-트윈(Tween)으로 세척하고 1%의 BSA를 함유하는 PBS로 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 연속하여 희석된 혈청 샘플을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 혈청 항체가 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG(도 37a) 또는 IgA(도 37b)로 나타났다. 페록시다제-접합 Ab를 기질로서 테트라메틸벤지딘(시그마-알드리치)을 사용하여 검출하고, 450㎚에서의 OD를 멀티스캔 ELISA 플레이트 판독기(Multiscan ELISA Plate Reader)를 이용하여 측정하였다. 면역화된 마우스로부터 수집한 혈청 중의 항원-특이적 체액성 반응을 관찰하였다.
pMCore-면역화된 마우스에서 유도된 면역 반응을 추가로 조사하기 위해, 항원-특이적 IgG 및 IgA 반응은 백신접종 후 수집된 각각 비장세포 및 혈청을 이용하여 B 세포 ELISpot에 의해 및 ELISA에서 분석되었다. 비장세포를 상기 기재된 바대로 단리하고 정제하였다. ELISA를 위해, 고결합 ELISA 플레이트(코스타, 미국 뉴욕주 코닝 소재)를 4℃에서 24시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 HBcAg 단백질로 코팅하고, 이후 0.1%의 PBS-트윈으로 세척하고 1%의 BSA를 함유하는 PBS로 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 연속하여 희석된 혈청 샘플을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 혈청 항체가 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgA 또는 IgG로 검출되었다. 페록시다제-접합 항체를 기질로서 테트라메틸벤지딘(시그마-알드리치)을 사용하여 검출하고, 450㎚에서의 OD를 멀티스캔 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 높은 IgG 및 IgA 역가가 대조군 동물과 비교할 때 면역화된 마우스의 혈청 중에 관찰되었다(도 38). 면역화된 마우스로부터의 B 세포 ELISpot(도 39)는 각각 100만개의 세포당 대략 200의 SFU 및 100의 SFU에서 HBcAg-특이적 IgG 및 IgA를 나타냈다. 이는 pMCore에 의한 면역법에 의한 B 세포 구획의 활성화를 나타낸다. 합성 HBcAg 플라스미드는 3회 면역법 후 항원-특이적 세포 및 체액성 반응을 효과적으로 유도하였다.
도 40은 CD4+ 및 CD8+ 비장 및 간 세포 유래의 TNF-α 및 IFN-γ의 퍼센트를 나타낸다.
HBV에 대한 작은 동물 모델의 부재 하에, HBcAg는 유체역학 주사를 통해 마우스 간을 일시적으로 형질감염시키기 위해 사용되었다. 면역화된 마우스 간을 pMCore 또는 HCV NS3/4A로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후 면역조직화학 염색은 NS3/4A-형질감염된 간세포와 비교하여 HBcAg-형질감염된 간세포의 청소율을 나타냈다. 혈청 중 ALT 수치를 측정하여 면역화된 마우스에 의해 유도된 청소율이 어떠한 간 손상도 일으키지 않는다는 것을 보장하였다. 도 41의 결과는 면역화된 마우스에 의해 유도된 청소율이 어떠한 간 손상도 일으키지 않는다는 것을 나타낸다.
직접 유체역학 주사는 또한 마우스 간을 형질감염시키기 위해 사용되었다. 여기서, 면역화된 또는 나이브 마우스 간을 pMCore 또는 C형 간염 항원을 코딩하는 비연관 플라스미드(HCV NS3/4A)로 형질감염시켰다. 간단히 말하면, 면역화된 마우스에 7초의 기간 내에 2㎖(마우스 체중의 약 10% 용적)의 링거액 중의 100㎍의 플라스미드를 정맥내 주사하여 간을 일시적으로 형질감염시켰다. 플라스미드의 발현 또는 청소율은 항-HA 단일클론 항체에 의해 간을 염색함으로써 결정되었다. 형질감염 3일 후의 면역조직화학 염색(도 42)은 NS3/4A-형질감염된 동물 간과 비교하여 HBcAg-형질감염된 간세포의 청소율을 나타낸다. 도 43에서 pMCore 유체역학 주사된 마우스로부터 단리된 CD8 T 세포는 비연관 플라스미드로 형질감염된 면역화된 동물 간과 비교하여 탈과립의 마커인 IFN-γ+ CD107a+의 더 높은 빈도를 나타낸다.
pMCore-형질감염된 간세포의 청소율이 탈과립을 수반하는 것으로 보이므로, 사멸이 간 손상을 야기할 수 있는 것으로 생각된다. 면역화된 마우스가 상당한 간 손상을 유도함이 없이 형질감염된 간세포를 청소할 수 있는지를 조사하기 위해, 효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 활성을 측정하는 검정을 이용하여 혈청에서 효소 수준이 상승할 때 간 손상의 존재를 나타냈다(도 44). 특히, 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 활성은 바이오텍 시너지(BioTek Synergy) 2 마이크로플레이트 판독기에서 흡광 기반 검정(스탠바이오 레버러토리(Stanbio Laboratory))을 이용하여 측정되었다. 결과는 리터당 단위(U/ℓ)로 보고되고, 분당 1ℓ의 NADH당 1μmol을 산화시키는 효소의 양을 나타낸다. 이 연구는 HBcAg-형질감염된 간세포의 특이적 청소율이 5-30U/ℓ의 정상 범위를 넘어 형질감염된 면역화된 동물에서 ALT 수치를 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다(도 44).
실시예 2
HBV 표면 단백질
1. HBsAg DNA 백신 설계
매우 가변적인 항원 서열을 갖는 가변적인 병원균의 맥락에서의 컨센서스 면역원의 사용은 단일 네이티브 면역원에 의한 면역법과 비교하여 네이티브 바이러스 다양성과 싸우는 더 직접적인 면역 반응을 유도하는 데 있어서 효과적일 수 있다. 82개의 간염 유전자형 A 대형 표면 항원 서열 및 70개의 간염 유전자형 C 대형 표면 항원 서열을 젠뱅크(GenBank)로부터 수집하고, 유전자형-특이적 대형 표면 항원 및 소형 표면 항원 컨센서스 서열을 다중 정렬을 수행한 후 얻었다. 크리스털 X(1.8 버전) 소프트웨어를 이용하여 컨센서스 서열을 생성하기 위해 이용된 다중 정렬을 생성하였다.
유전자형 A 또는 C(세계에서 가장 흔한 유전자형 중 2개임)를 코딩하는 컨센서스 서열을 사용하여 메이저 S 단독 또는 preS1/S2와 HBV 표면 봉입 단백질의 메이저 S를 코딩하는 DNA 작제물을 생성하였다(도 52a, 도 59a 내지 도 59d). preS1의 아미노 말단 도메인이 바이러스 부착 및 진입을 보조할 수 있는 반면 preS2의 카복실 말단이 감염력과 관련될 수 있으므로, 전장 HBs 또는 메이저 S 단독을 코딩하는 작제물에 의해 유발된 면역 반응의 차이를 조사하였다. 메이저 S 단독 작제물은 일명 소형 HBs(SHBs)인 반면, preS1/S2를 함유하는 플라스미드는 일명 대형 HBs(LHBs)이다.
컨센서스 HBV 표면 단백질을 HBV 유전자형 A의 1차 단리물로부터의 에피토프 서열로부터 설계하여, 생성된 컨센서스 단백질은 HBV 유전자형 A 1차 단리물의 표면 단백질과 94.2 퍼센트 내지 99.8 퍼센트의 서열 동일성을 가졌다. 특히, 이러한 컨센서스 단백질의 2개의 버전을 설계하였다(도 4 및 도 52b). 첫번째는 S 단백질을 포함하고 또한 SHBs-A라 칭하고, 여기서 서열 번호 13은 핵산 서열이고, 서열 번호 14는 아미노산 서열이다. 두번째는 S 단백질, pre-S2 및 pre-S1을 포함하고 또한 LHBs-A라 칭하고, 여기서 서열 번호 9는 핵산 서열이고, 서열 번호 10은 아미노산 서열이다.
컨센서스 HBV 표면 단백질은 또한 HBV 유전자형 C의 1차 단리물로부터의 에피토프 서열로부터 설계하여, 생성된 컨센서스 단백질은 HBV 유전자형 C 1차 단리물의 표면 단백질과 96.5 퍼센트 내지 99.8 퍼센트의 서열 동일성을 가졌다. 특히, 이러한 컨센서스 단백질의 2개의 버전을 설계하였다(도 4). 첫번째는 S 단백질을 포함하고 또한 SHBs-C라 칭하고, 여기서 서열 번호 15는 핵산 서열이고, 서열 번호 16은 아미노산 서열이다. 두번째는 S 단백질, pre-S2 및 pre-S1을 포함하고 또한 LHBs-C라 칭하고, 여기서 서열 번호 11은 핵산 서열이고, 서열 번호 12는 아미노산 서열이다.
컨센서스 유전자형 A 또는 C 대형 및 소형 표면 항원 컨센서스 서열을 생성한 후, 코돈 최적화 및 RNA 최적화를 수행하였다. 상기 컨센서스 HBV 표면 항원의 경우, 엔도단백분해 분할 부위를 컨센서스 HBV 표면 항원에 도입하여 적절한 단백질 폴딩 및 더 우수한 항원 처리를 제공하였다(도 3). 컨센서스 HBV 표면 항원에서의 코돈 사용빈도를 변형하여 인간 유전자의 코돈 바이어스를 반영하였다. 추가로, 매우 높은(예를 들어, 80% 초과의) 또는 매우 낮은(예를 들어, 30% 미만의) GC 함량의 영역이, 시스 작용 모티프, 예컨대 내부 TATA-박스, 반복 서열 및 구조화 서열과 같이, 회피된다. 코작 서열은 컨센서스 HBV 표면 항원으로 도입되어 번역 개시를 증가시킨다. 매우 효과적인 IgE 선도 서열은 출발 코돈의 상류에 첨가되어 상기 기재된 바대로 단백질 발현을 증대시키고 증가시킨다(Yan et al., Vaccine (2008) 26:5210-5215)(도 3 및 도 52b 참조). 최적화된 유전자를 합성하고 서열을 검증하였다.
컨센서스 HBV 표면 항원 SHBs-A, LHBs-A, SHBs-C 및 LHBs-C를 발현 벡터로 클로닝하여 각각 작제물 pSHb A(또한 pSHb-A라 칭함), pLHb A(또한 pLHb-A라 칭함), pSHb C(또한 pSHb-C라 칭함) 및 pLHb C(또한 pLHb-C라 칭함)를 생성하였다(도 4). 합성된 유전자형 A 대형 및 소형 표면 항원 유전자를 BamHI 및 XhoI 자리에서 발현 벡터 pGX0001로 서브클로닝하는 반면, 합성된 합성된 유전자형 C 대형 및 소형 표면 항원 유전자를 EcoRI 및 NotI 자리에서 pGX0001로 서브클로닝하였다. HBcAg 플라스미드(pMCore)의 생성이 실시예 1에 기재되어 있다.
2. 다중 HBAg DNA 백신의 실험실내 발현
횡문근육종(RD) 및 인간 간 암종(Hep G2) 세포주를 제조업자의 지시에 따라 터보펙트(상표명)(써모 사이언티픽)를 사용하여 pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A 및 pSHBs-C로 형질감염시켰다. 세포 내 검정을 위해, 세포를 세척하고 제조업자의 지시에 따라 사이토픽스/사이토펌 키트(BD PharMingen(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재))를 사용하여 고정하였다. 고정 후, 세포를 B형 간염 바이러스 표면(압캠(Abcam)(미국 메사추세츠주 캠브리지 소재))에 대해 면역화된 마우스 또는 마우스 단일클론 항체로부터의 혈청으로 염색하였다. 이후, 세포를 플루오레신 아이소티오사이이네이트 접합된 항-마우스 2차(비디 바이오사이언시스(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재))로 염색하였다. 세포를 세척하고 2%의 폼알데하이드로 고정하였다. 염색되고 고정된 세포를 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(비디 바이오사이언시스)를 사용하여 LSR 기기에서 획득하고 플루조 소프트웨어(트리 스타(Tree Star), 미국 오레곤주 애쉬랜드 소재)로 분석하였다.
4개의 작제물의 작제 및 최적화 후, 각각의 플라스미드의 단백질 발현은 세포 내 염색에 의해 확인되었다. RD 또는 Hep G2 세포를 개별 작제물 또는 대조군으로서의 빈 pGX0001 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 항-HBsAg 다중클론 마우스 혈청 또는 상업적으로 획득된 마우스 단일클론 항체를 사용하여 48시간 후 세포 내 염색하였다. 발현은 유동세포 계수법을 이용하여 확인되었다(도 52c). HB 단백질 발현의 증가된 수준이 빈 벡터(pGX0001)로 형질감염된 세포에 대해 각각의 작제물로 형질감염된 세포에서 관찰되었다.
실시예 3
작은 동물 모델에서의 개별 합성 HBsAg DNA 플라스미드의 면역원성
발현 연구 후, 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응을 유도하는 개별 플라스미드의 능력을 생체내 평가하였다. 6주령 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 잭슨 레버로토리즈로부터 구입하였다. 동물을 미국 국립 보건원 및 펜실베니아 대학교 기관 관리 및 사용 위원회(IACUC) 가이드라인에 따라 유지시켰다. Balb/c 마우스는 소형 또는 대형 S 항원을 발현하는 15㎍의 플라스미드 또는 pGX0001 대조군으로 0주, 2주 및 4주의 2주 간격으로 근육내(IM) 면역법을 3회 받았다. 각각의 백신접종은 이전에 기재된 바대로 감염 자리에 대한 전기천공 직후였다(Hirao et al., Vaccine (2008) 26:440-448).
면역법을 위해, 모든 DNA를 뉴클레아제 비함유 물(퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 91355 발렌시아)을 사용하여 희석하였다. 면역화된 그룹에서의 각각의 동물은 15㎍의 적절한 플라스미드의 전체 3회 근육내 면역법을 받았다. 조합 연구를 위해, 각각의 동물은 전경골(TA) 근육 둘 다에서 전체 45㎍의 DNA를 받았다. 면역법은 셀렉트라(등록상표) 적응형 정전류 전기천공 장치(이노비오 파마슈티칼스, 인크., 미국 펜실베이니아주 블루 벨 소재)로 생체내 전기천공에 의해 수반되었다. 2개의 0.2 Amp 정전류 구형파 펄스가 근육으로 완전히 삽입된 26-게이지 고체 스테인리스 강 전극으로 이루어진 삼각형 3-전극 어레이를 통해 전달되었다. 각각의 펄스는 펄스 간 1초 지연으로 52밀리초의 길이이다. 더 오래된 DNA 백신이 상당한 항체 반응을 생성하는 데 일관되지 않으므로, 백신-유도된 체액성 반응이 처음에 조사되었다.
1. 항원 ELISA 검정
표적 항원으로서 재조합 전장 HBsAg 단백질을 사용하여 각각의 면역법 후 7일에 마우스로부터 수집된 혈청에서 항원-특이적 IgG 반응을 분석하기 위해 ELISA를 수행하였다. 고결합 ELISA 플레이트(코스타, 미국 뉴욕주 코닝 소재)를 4℃에서 24시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 재조합 단백질로 코팅하고, 이후 0.1%의 PBS-트윈으로 세척하고 1%의 BSA를 함유하는 PBS로 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 연속하여 희석된 혈청 샘플을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 IgG가 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG에 의해 검출되었다. 페록시다제-접합 항체를 기질로서 테트라메틸벤지딘(시그마-알드리치)을 사용하여 검출하고, 450㎚에서의 OD를 멀티스캔 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다.
어느 한 유전자형으로부터의 pLHBs 및 pSHBs는 매우 면역원성이었다. 추가로 면역법은 항체 반응으로 이 반응을 부스팅하여, 제3 면역법 후 2주에 가장 큰 증대를 나타낸다(도 53a). 반대로, pGX0001 대조군으로 면역화된 마우스는 오직 IgG 반응의 배경 수준을 나타냈다. IgG 반응의 양의 약간의 차이가 각각의 그룹에서 관찰되었지만, 각각의 면역법 후 점진적 증대는 그룹 내에 일관되었다.
2. IFN-γ ELISPOT
세포성 면역 반응을 유도하는 pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A 및 pSHBs-C 작제물의 능력은 IFN-γ ELISPOT에 의해 검사되었다. 매칭 HepB 컨센서스 코어, 표면 항원 A 및 표면 항원 C 15합체 펩타이드는 진스크립트(Genescript)(미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)에 의해 합성되었고 DMSO 중에 재현탁되고 각각의 펩타이드에 대해 1㎎/㎖의 근사 최종 농도로 혼주되었다. 제조업자의 지시에 따라 세포성 반응을 IFN-γ ELISpot(MabTech, 스웨덴)을 사용하여 측정하였다. 샘플을 R10(L-글루타민과 함께 10%의 열 불활화 소 태아 혈청 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640) 및 PMA/IM(PMA 0.1㎍/㎖ 및 이오노마이신 0.5㎍/㎖, 시그마 알드리치(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)) 대조군으로 3회 실행하였다.
HBsAg-특이적 IFN-γ 분비 세포를 컨센서스 대형 HBV 표면 단백질로부터 발생한 합성 펩타이드의 2개의 풀에 반응하여 분석하였다. 제1 펩타이드 풀은 preS1 및 preS2 단백질에 걸친 펩타이드를 함유하는 반면, 제2 펩타이드 풀은 메이저 S 단백질에 걸친 펩타이드로 이루어졌다. 모든 4개의 컨센서스 작제물은 강한 T 세포 반응을 유도할 수 있었고, 교차 면역 반응성은 2개의 유전자형 내에 관찰되었다. 도 53b. 함께, preS 단백질은 메이저 S 단백질과 크기가 거의 유사하지만, 메이저 S 단백질에 대한 세포 중재 면역(CMI) 반응에서 에피토프-바이어스가 존재한다. 이 결과는 전장 또는 오직 HBV 표면 항원의 메이저 S 부분으로 코딩된 합성 DNA 면역원은 HBV의 메이저 유전자형을 표적화하는 데 충분히 다양한 면역원성을 나타낸다는 것을 보여준다. 전장 작제물은 더 짧은 작제물에 비해 HBV 네이티브 단백질에 대한 IgG의 유도에서의 상당한 차이를 나타내지 않았다.
3. HBV 표면 항원(15합체) 펩타이드 맵핑
CMI의 양을 확인한 후, 유전자형-특이적 표적에 대한 세포성 반응의 규모를 조사하였다. 따라서, 인터페론-감마 ELISpot 검정의 세트를 다양한 매트릭스 펩타이드 풀에 대해 수행하였다. 8개의 아미노산으로 중첩하는 15개의 아미노산 잔기를 각각 함유하는 LBHs-A 또는 LHBs-C 단백질에 걸친 펩타이드의 2개의 세트를 진스크립트(미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)에 의해 합성하였다. 면역우세 에피토프를 맵핑하기 위해, 펩타이드의 2개의 세트를 각각 대형 또는 소형 HBsAg 그룹에 대해 16개 또는 12개의 풀로 혼주하였다. IFN-γ ELISpot 검정을 상기 기재된 바대로 수행하였다. 혼주된 펩타이드의 이 상이한 세트를 매트릭스 검정에서 사용하여 각각의 작제물의 에피토프를 맵핑하였다. 100만개의 세포당 50의 SFU를 넘는 반응은 양성인 것으로 생각되었다.
이 데이터는 다양한 에피토프 반응이 BALB/c 마우스에서 이 합성 표면 항원 플라스미드에 의해 유도된다는 것을 나타낸다. pLHBs-A-면역화된 마우스에서의 16개 중 12개의 양성 LHBs-A 매트릭스 풀 및 pLHBs-C-면역화된 마우스에서의 16개 중 8개의 양성 LHBs-C 매트릭스 풀이 관찰되었다. 소형 HBS 플라스미드는 12개 중 9개의 SHBs-A 매트릭스 펩타이드 풀에 반응하여 pSHBs-A 면역화된 마우스에 의한 더 높은 배수의 반응을 나타내는 반면, pSHBs-C 면역화된 마우스는 모든 SHBs-C 매트릭스 풀에 대한 반응을 나타냈다(도 53c). 이 데이터는 이 4개의 HBs 작제물에 유도된 높은 정도의 광범위한 교차 반응성 세포성 반응을 나타낸다. 그 결과, 이 유전자형-특이적 컨센서스 백신은 이 유전자형에 걸쳐 일탈도가 8% 이하인 다양한 1차 표면 항원 단리물에 대한 교차 반응성 세포성 반응을 유도할 수 있다.
실시예 4
백신접종된 마우스의 간 및 비장에서 관찰된 세포독성 검정 및 항원-특이적 CTL
항바이러스 이팩터 CD8 T 세포는 세포독성을 유도할 수 있고, 이는 HBV-감염된 간세포를 제거하는 세포 활성이다. 면역화된 마우스의 간으로 또한 귀소할 수 있는 말초에서의 HBs-특이적 CTL을 생성하는 작제물의 능력은, 생체내 세포독성 검정을 이용하여 평가되었다. 나이브 마우스로부터의 비장세포를 1μM(고) 또는 1nM(저) CFDA SE(인비트로겐, 미국 뉴욕주 아일랜드 소재)로 염색하였다. 이후, 표지된 비장세포를 표시된 펩타이드(연관 또는 비연관 펩타이드)(1μM)로 코팅하고, 각각의 집단의 107개의 세포를 나이브 또는 면역화된 마우스로 정맥내 주사하였다. 90시간 후, 혈액, 비장 또는 간으로부터의 세포를 단리하고 유동세포 계수법으로 분석하였다. 사멸의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다: 100 - ([(감염에서 펼스화된 연관 펩타이드(%) / 감염에서 펼스화된 비연관 펩타이드(%)) / (비감염에서 펼스화된 연관 펩타이드(%) /비감염에서 펼스화된 비연관 펩타이드(%))] x 100).
간으로의 HBV-특이적 CTL의 이동은 감염된 세포의 간내 제거에 필수적이다. HBsAg 합성 펩타이드로 펄스화된 적응형 이동된 표적 비장세포의 항원-특이적 제거가 관찰되었다. SHBs 작제물로 면역화된 마우스에 대한 비장에서의 표적 세포의 사멸의 평균 퍼센트는 각각 유전자형 A 및 C에 대해 39% 및 48%이었다. LHBs 작제물에 대한 평균 표적 세포 제거는 유전자형 A의 경우 35% 및 유전자형 C의 경우 51%이었다. 청소율은 강력하였지만, 실시예 1에 기재된 바대로(여기서, 83% 및 76%의 표적 청소율이 각각 비장 및 간에서 보고됨) 코어 Ag 플라스미드 단독으로 면역화된 마우스에서 관찰된 반응만큼 강력하지 않았다. HBs에 대해 생성된 CTL이 간에서의 항원 청소율을 표적화할 수 있다는 입증은 이것이 HBs 및 HBc의 조합을 지지하여 세포 효력 및 제한 탈출을 추가로 연장한다는 점에서 유망하다. 간에서의 표적 세포의 제거의 퍼센트는 SHB-A 및 SHB-C의 경우 45% 및 66% 및 LHBs-A 및 LHBs-C 그룹의 경우 60% 및 74%이었다(도 54). 백신-특이적 CTL가 간으로 통행하면서, T 세포 반응을 억제하고 내약성을 유도하는 것으로 공지된 장기는 작용성 CMI를 유도하는 데 있어서 작제물의 효과를 강조한다.
실시예 5
HBsAg - HBcAg DNA 칵테일의 면역원성
각각의 합성 HBsAg 플라스미드에 의한 면역법이 광범위한 교차 반응성 면역 반응을 발생시키므로, 반응은 표면 항원을 넘어 연장되어 바이러스 내의 다양한 항원에 대한 면역원성을 추가로 증대시킨다. HBs 플라스미드는 HBcAg를 코딩하는 플라스미드(pMCore)와 조합되어 면역법에 대한 HBs-HBc DNA 백신 칵테일을 생성하여, HBV의 코어 항원이 HBcAg-특이적 CTL 반응의 유도를 통해 바이러스 청소율에 관여되므로 T 세포가 제거하기 위해 인식하는 면역 에피토프의 수를 증가시킴으로써 이 칵테일이 세포성 반응을 증대시키는지를 결정하였다.
마우스의 5개의 그룹을 HBs 단독 항원 또는 HBs 및 HBc 조합 항원의 백신 칵테일로 면역화하였다. 각각의 마우스는 2개의 샷(shot)을 받은 후 TA 둘 다에서 전기천공되었다. 마우스를 표면 항원(유전자형 둘 다)만을 함유하는 칵테일 또는 실시예 1에 기재된(표 3 참조) 표면 항원 및 컨센서스 코어 항원 플라스미드(pMCore) 둘 다를 함유하는 칵테일로 면역화하였다. HBsAg-단독 면역화된 마우스는 이 혈청에서 높은 IgG 역가를 생성하였다. 흥미롭게도, 유사한 역가가 SHBs-pMCore 그룹에서 관찰되었지만 LHBs-pMCore 칵테일 그룹에서 덜 튼튼하였다(도 55a). 항원 표적의 증가는 약간의 항체 억제를 발생시켰다.
Figure pct00003
HBs-HBc 면역화된 마우스에 의해 유발된 면역 반응을 추가로 조사하기 위해, 각각의 면역화된 그룹으로부터의 IFN-γ의 생성을 평가하였다. pMCore가 없는 그룹에 대한 100만개의 비장세포당 평균 SFU는 각각 유전자형 A의 경우 약 689 및 666이고, 유전자형 C 펩타이드에 대해 1160 및 1312이었다. 게다가, pMCore의 첨가는 평균적으로 유전자형 C에 대한 400개의 스팟으로 100만개의 비장세포당 전체 SFU를 증가시키고, 비장세포가 유전자형 A 펩타이드로 자극되었을 때 반응을 배가시켰다(도 55b).
CD8 T 세포는 HBV 청소율의 원인인 주요 이팩터 세포인 것으로 공지되어 있다. 이것은 T 세포 유형이 관찰된 IFN-γ 생성의 원인인지를 결정하고, 이 T 세포가 다른 항바이러스 사이토카인, 예컨대 TNF-α 및 IL-2 및 탈과립 마커, 예컨대 CD107a를 방출함으로써 항원 재차 조우에 반응하여 다수의 항바이러스 기능을 유도할 수 있는지를 조사하기 위해 중요하다. 이 사이토카인 및 마커를 유도하기 위한 면역화된 마우스로부터의 CD8 T 세포의 능력은 적절한 펩타이드에 의한 생체외 자극 후 평가되었다. 다중 색상 유동 분석은 각각의 그룹으로부터의 상당한 퍼센트의 CD8 T 세포가 모든 그룹 내에 다작용성(즉, 다수의 사이토카인을 생성) 활성화된 CD8 T 세포라는 것을 나타낸다(도 56a - 도 56f). 이 CD8 T 세포에서 CD107a인 림프구 탈과립 마커의 항원 특이적 유도가 또한 관찰되었다. HBs-HBc 칵테일 그룹으로부터의 CD8 T 세포는 표면 항원 펩타이드로 자극될 때 더 높은 다작용성 활성을 나타내어, CD8 T 세포 항바이러스 사이토카인, 예컨대 IFN-γ TNF-α 및 IL-2, 및 CD107a인 탈과립 마커에서 상승 효과를 확인시켜준다. 이동된 항원 펄스화된 세포의 청소율을 통한 CTL의 유도가 또한 관찰되었다. LHBs 작제물을 포함하는 칵테일의 경우 HBs에 대한 항체 반응의 감소가 존재하지만, SHBs-pMCore 백신 칵테일은 SHBs로만 면역화된 동물에서 검출된 체액성 반응을 유지하였다.
실시예 6
칵테일에 의한 레서스 마카크의 면역법은 강한 세포성 HBc - 및 HBs -특이적 및 체액성 HBs -특이적 면역 반응을 유도한다
이전 DNA 작제물의 DNA 백신 효력은 더 몸집이 큰 동물 및 인간에서 일관되게 약했다. 마우스에서의 pLHBs 또는 pSHBs 및 pMCore의 조합에 의해 조장된 강한 항체 및 T 세포 반응은 인간 면역 반응을 더 가깝게 모방하는 비인간 영장류 모델(NHP)에서 이 작제물의 면역원성의 평가를 발생시켰다. 이는 더 큰 크기로 백신 면역원성에 대한 장애이고, NHP의 이계 교배된 MHC 집단은 전형적으로 마우스 모델과 비교하여 감소된 또는 비존재의 면역원성을 발생시킨다. 이 연구의 경우, Th1-추진 사이토카인인 IL-12가 첨가되어 분석되었다. IL-12는 다양한 병원균으로부터 상이한 항원에 대한 면역 반응을 증대시키기 위해 아쥬반트로서 면역법에 첨가될 때 CD8 T 세포의 프라이밍 및 확장을 보조함으로써 CMI를 추진시키는 것으로 나타났다. 이 아쥬반트는 마우스 및 마카크 및 인간에서 DNA 백신의 T 세포 반응을 증가시킨다.
1. 백신접종
15마리의 인디안 레서스 마카크를 미국 실험 동물 관리 평가 협회의 기준에 따라 바이오컬(Bioqual)(미국 메릴랜드주 락빌 소재)에서 수용하였다. 레서스 마카크 원숭이를 그룹에 넣고, 각 그룹은 5마리의 원숭이를 가졌다. 표 4 참조.
Figure pct00004
1개의 그룹에 근육내(IM) 전달(또한 생체내 전기천공으로 공지됨)을 통해 1.0㎎의 각각의 작제물 pMCore, pSHb A 및 pSHb C를 포함하는 백신을 투여하고; 이 그룹은 "작은" 그룹이라 칭한다. 제2 그룹에 IM 전달을 통해 1.0㎎의 각각의 작제물 pMCore, pLHb A 및 pLHb C를 포함하는 백신을 투여하고; 이 그룹은 "긴" 그룹이라 칭한다. 제3 그룹에 IM 전달을 통해 1.0㎎의 각각의 작제물 pMCore, pLHb A 및 pLHb C 및 0.4㎎의 prhIL-12(플라스미드 발현된 최적화된 레서스 IL-12)를 포함하는 백신을 투여하고; 이 그룹은 "긴 + IL-12" 또는 "pLHBs+12" 그룹이라 칭한다. 작제물 prhIL-12는 레서스 마카크 IL-12 단백질을 코딩한다. DNA는 대퇴사두근에서 단일 자리로 전달된 후 0.5A의 정전류, 52ms의 펄스 길이 및 펄스 간 1초의 휴지의 3회 펄스로 정전류 셀렉타(등록상표) 장치(이노비오 파마슈티칼스, 인크., 미국 펜실베이니아주 블루 벨 소재)에 의해 생체내 EP되었다. 동물을 0주, 4주, 12주 및 30주에 백신접종하였다.
2. 샘플 수집
샘플을 면역법 전에 0주에 및 또한 각각의 면역법 후(즉, 0주, 4주 및 12주 후) 원숭이로부터 수확하였다. 동물을 각각의 면역법 2주 후 사혈시켰다. 혈액(각 시점에 20㎖)을 EDTA 관에서 수집하고, PBMC를 아쿠스핀(Accuspin) 관(시그마-알드리치)에 의한 표준 피콜(Ficoll)-하이파크(Hypaque) 절차를 이용하여 단리하였다. 첨가 5㎖의 혈액을 응고관으로 수집하고 혈청을 분석을 위해 분취하였다.
HBsAg에 대한 높은 역가 항체 반응이 pSHBs/pMCore에 의한 2회 면역법 후 관찰되었지만 pLHBs/pMCore에 의해서는 관찰되지 않았다. 이 반응은 도 55a의 마우스 항체 데이터와 필적하였다. pLHBs/pMCore에 대한 반응을 제3 면역법 후 부스팅하였다. IL-12 아쥬반트는 단지 2회 면역법 후에 pLHBs/pMCore 칵테일 면역법의 항체 역가를 증대시켰다(도 57a).
PBMC로부터의 세포성 면역 반응은 제1 면역법 후 HBs 또는 HBc-특이적 반응을 거의 나타내지 않거나 나타내지 않았다. 그러나, 반응은 제2 면역법 후에 관찰되었고 각각의 후속 면역법 후 부스팅되었다. 100만개의 PBMC당 2000 초과의 SFU의 튼튼한 반응이 제3 면역법 후 모든 그룹에서 관찰되었고 주로 코어 항원에 표적화되었다. IL-12 아쥬반트의 첨가는 pLHBs/pMCore 칵테일 단독과 비교하여 100만개의 PBMC당 T 세포 반응 1000의 SFU의 양을 증대시켰다(도 57b). 세포성 반응의 규모를 추가로 한정하기 위해, 가능한 에피토프의 수를 결정하기 위해 컨센서스 코어 펩타이드의 매트릭스 풀을 생성하였다. T 세포 반응은 12개의 펩타이드 에피토프에 대한 평균 반응으로 다수의 펩타이드 풀에 걸친다(도 57c). 이 반응은 작은 동물 모델에서 이전에 관찰되는 것과 일치한다. 이 결과는 튼튼한 양 및 규모 둘 다로 세포성 반응을 유도할 수 있는 칵테일이 존재하고 이 반응의 양이 IL-12의 첨가에 의해 추가로 증대될 수 있다는 것을 제시한다.
도 45 내지 도 48은 작은, 긴 및 긴+IL-12 그룹에 투여된 백신에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 나타낸다. 실시예 1에서 상기 기재된 바대로 세포성 면역 반응을 결정하기 위해 효소-결합 면역흡착 스팟(ELISPOT) 검정을 이용하였다. 도 45 내지 도 48에 도시된 바대로, T 세포 반응은 각각의 백신접종으로 부스팅되었다. 그러나, HBV 코어 항원은 HBV 표면 항원 A 및 HBV 표면 항원 C보다 더 면역원성이었다. 데이터는 또한 더 긴 컨센서스 HBV 표면 항원(즉, S 단백질, pre-S2 및 pre-S1을 포함)이 더 작은 컨센서스 HBV 표면 항원(즉, S 단백질을 포함)만큼 면역원성이라는 것을 나타낸다.
도 45 내지 도 48과 유사하게, 도 49는 ELISPOT 검정에 의해 측정된 바대로 작은, 긴 및 긴+IL-12 그룹에 투여된 백신에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 나타내지만, 코어 항원, 표면 항원 A 및 표면 항원 C를 포괄하는 펩타이드의 상이한 풀을 조사하였다. 다시, T 세포 반응을 각각의 백신접종으로 부스팅하고, IL-12의 첨가는 세포성 면역 반응을 증대시키고, 긴 및 짧은 컨센서스 HBV 표면 항원은 유사하게 면역원성이었다.
도 50은 작은, 긴 및 긴+IL-12 그룹에 대한 항-HBV 항체 반응을 포함하는 ELISA 데이터를 나타낸다. ELISA를 실시예 1에서 상기 기재된 바대로 실행하였다. 면역화된 원숭이로부터 수집된 혈청에서의 항원-특이적 체액성 반응이 관찰되었다. 특히, 긴 컨센서스 표면 항원을 포함하는 백신(즉, S 단백질, pre-S2 및 pre-S1)은 더 우수한 항체 반응을 갖고, 이는 백신에 존재하는 추가의 에피토프로 인할 수 있다.
도 51은 면역법 전(prevac) 및 면역법 후 0주, 4주 및 12주(즉, 각각 제1 후, 제2 후 및 제3 후) 긴+IL-12 그룹에 대한 항-HBV 항체 반응을 비교하는 ELISA 데이터를 나타낸다. ELISA를 실시예 1에서 상기 기재된 바대로 실행하였다. 도 51에서의 데이터는 2 면역법 또는 용량이 측정 가능한 항체 생성에 필요하다는 것을 나타낸다. 더욱이, 항-HBV 항체 반응에서의 상당한 부스트가 제3 면역법 또는 용량 후에 관찰되었다.
실시예 7
실시예 5에서의 마우스에 의한 실험과 유사하게, 비장세포, 즉, CD8 및 CD4 T-세포를 실시예 6의 면역화된 레서스 원숭이로부터 단리하여 컨센서스 코어 및 컨센서스 표면 항원의 조합의 투여에 반응하는 INF-γ 및 TNF-α 분비의 수치를 조사하였다. CD8 및 CD4 T-세포는 다작용성 및 표현형 유동 분석을 통해 연구하여, 이 CD8 및 CD4 T-세포로부터의 종양 괴사 인자, 인터페론 감마 및 CD107a의 분비를 조사하여, 실시예 6으로부터의 면역화된 원숭이의 CD8 및 CD4 T 세포가 실시예 1에서 연구된 마우스 CD8 및 CD4 T 세포와 유사한 특징을 갖는지를 결정하였다.
세포 면역 반응의 기능을 추가로 규정하기 위해, 항바이러스 사이토카인에 대한 세포 내 염색을 A 및 C 유전자형으로부터의 코어 및 표면 항원에 의한 자극 후 실행하였다. 항바이러스 사이토카인에 대한 항체에 의한 세포 내 염색은 항바이러스 사이토카인(IFN-γ, TNF-α 및 IL-2)의 항원-특이적 생성이 면역화된 원숭이로부터의 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다에서 유도된다는 것을 나타낸다. 도 57d는 3회 면역법 후, HBV-특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응 둘 다 관찰된다는 것을 나타낸다. IFN-γ ELISpot에 의해 관찰되는 결과와 유사하게, 코어 항원에 대한 반응이 우세하였다. IL-12의 첨가는 반응의 전체 규모를 증대시키지만, 예상된 바대로 이 효과는 CD8 T 세포에 대해 더 뚜렸하였다. 평균 1%의 CD4 및 CD8 반응 둘 다의 유도는 Th1 및 Th2 면역원으로 이루어진 광범위한 면역 반응의 유도를 제시하고 인간 실험에서의 이 전략의 개선을 강력히 촉구한다.
HBs 및 HBc 항원 둘 다에 대한 항체 및 T 세포 반응은 실시예 5에서 마우스로 생성된 결과와 유사하였다. Th1 편향 사이토카인 아쥬반트인 IL-12가 pLHBs-pMCore 칵테일에 첨가될 때 이 반응은 훨씬 더 인상적이었다. pLHBs-pMCore + IL-12 제제가 바람직한 조합으로서 매우 효과적인 것으로 나타났다. 백신 제제가 간 손상과 관련된 매개변수를 상승시키지 않는다는 것은 가치가 있다.
실시예 8
간 혈액 화학 패널을 사용한 백신접종 후 비인간 영장류에서의 간 기능의 분석
HBV로 능동 감염된 환자의 임상 연구가 T 세포 반응이 질병 동안 간 병리학에 연결될 수 있다는 가능성을 제시하면서, 간 기능과 관련하여 이 다가 백신의 전체 안전성의 사전 분석을 실행하였다. 간 기능을 조사하기 위해, 알칼리 포스파타제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 전체 빌리루빈의 혈청 수준을 면역법 전, 제3 백신접종 후 및 제4 백신접종 직전 및 제4 백신접종 후 백신접종된 동물에서 분석하였다. 혈액 화학 패널은 IDEXX 레버러토리즈에 의해 실행되고, 알칼리 포스파타제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 전체 빌리루빈을 포함하였다. 이 분석의 결과는 도 58에 도시되어 있다. 면역법 기간의 완료 전의, 동안의 및 후의 간 기능 시험에서의 알칼리 포스파타제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 전체 빌리루빈의 상승의 결여는 HBV-특이적 면역 반응의 유도가 백신접종된 동물의 간에 대해 상당한 손상을 유도하지 않는다는 것을 제시한다.
종합하면, 데이터는 특정한 전기천공와 조합하여 설계된 HBV 항원을 코딩하는 이 합성 DNA 백신 칵테일의 투여가 큰 독성을 피하면서 마우스 및 NHP 둘 다에서 튼튼하고 다양한 세포성 및 체액성 반응을 추진한다는 것을 지지한다.
상기 상세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 예시이고, 첨부된 특허청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 취해지지 않는 것으로 이해된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변경 및 변형이 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명의 화학 구조, 치환, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제제 또는 사용 방법과 관련한 것을 제한 없이 포함하는 이러한 변경 및 변형은 이의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA <120> HEPATITIS B VIRUS CORE PROTEIN AND SURFACE ANTIGEN PROTEIN AND VACCINE COMPRISING THE SAME <130> WO2014/047286 <140> PCT/US13/60618 <141> 2013-09-19 <150> US 13/622,965 <151> 2012-09-19 <160> 21 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence M-core <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 nnngacatcg acccctacaa agaattcggc gccaccgtgg aactgctgag cttcctgccc 60 agcgacttct tcccctccgt gcgggacctg ctggataccg ccagcgccct gtacagagag 120 gccctggaaa gccccgagca ctgcagccct caccacacag ccctgcggca ggccatcctg 180 tgctggggcg agctgatgac cctggccacc tgggtcggaa gcaacctgga agatcccgcc 240 agccgggacc tggtggtgtc ctacgtgaac accaacatgg gcctgaagat ccggcagctg 300 ctgtggttcc acatctcctg cctgaccttc ggccgggaaa ccgtgctgga atacctggtg 360 tccttcggcg tgtggatcag aaccccccct gcctacagac cccccaacgc ccctatcctg 420 agcaccctgc ccgagacaac cgtggtccgc agacggggca gaagccccag aagaagaacc 480 cccagcccta gacggcggag atctcagagc cccaggcgga gaagatccca gagccgcgag 540 agccagtgct ga 552 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of M-Core <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Xaa Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val 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gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 3420 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 3480 gcttcaataa tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 3540 cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 3600 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 3660 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 3720 accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 3780 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 3840 cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 3900 gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 3960 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 4020 gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 4080 cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 4140 tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 4200 ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg 4260 ctggcctttt gctcacatgt tctt 4284 <210> 20 <211> 3690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (pGX1804 HepB pSHBs-A) <400> 20 gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240 ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600 ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660 aattaatacg actcactata gggagaccca 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catctgttgt ttgcccctcc 1560 cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 1620 gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 1680 gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 1740 atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc 1800 cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttctcg ccgccaagga 1860 tctgatggcg caggggatca agctctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 1920 ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 1980 atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 2040 aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag 2100 acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 2160 acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 2220 tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 2280 ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 2340 agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 2400 atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg 2460 aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 2520 gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 2580 cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 2640 tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 2700 agttcttctg aattattaac gcttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2760 tgtgcggtat ttcacaccgc atacaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 2820 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 2880 ataaatgctt caataatagc acgtgctaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2940 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3000 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3060 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3120 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3180 tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 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gtctgccctc 1140 tgctgccagg aacctcaacc acaagcacag gcccttgtaa gacttgcacc attcccgctc 1200 aggggactag tatgttccct tcatgctgtt gcacaaaacc atctgatgga aattgtactt 1260 gcatcccaat tcccagctcc tgggccttcg ctaggtttct gtgggagtgg gccagtgtgc 1320 gcttttcctg gctgtctctg ctggtgccct tcgtccagtg gtttgtcggc ctgagcccta 1380 cagtgtggct gtccgtcatc tggatgatgt ggtactgggg gcctagcctg tataatatcc 1440 tgtcaccatt tctgccactg ctgccaatct tcttttgcct gtgggtctac atctgataag 1500 cggccgctcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct 1560 agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 1620 actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 1680 cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 1740 agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag 1800 caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag 1860 taaactggat ggctttctcg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agctctgatc 1920 aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 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atacaggtgg 2820 cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 2880 tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatagc acgtgctaaa 2940 acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 3000 aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 3060 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 3120 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 3180 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 3240 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 3300 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 3360 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 3420 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 3480 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 3540 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 3600 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 3660 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggg cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 3720

Claims (44)

  1. 백신으로서,
    (a) 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 10의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질 및 서열 번호 14의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 또는
    (b) 서열 번호 12, 서열 번호 16, 서열 번호 12의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질 및 서열 번호 16의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신.
  2. 제1항에 있어서,
    (c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 백신.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 10의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질 및 서열 번호 14의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자;
    (b) 서열 번호 12, 서열 번호 16, 서열 번호 12의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질 및 서열 번호 16의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 및 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 백신.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드인 것인 백신.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 편입된 것인 백신.
  7. 제1항에 있어서, 아쥬반트 분자(adjuvant molecule)를 더 포함하는 백신.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아쥬반트는 IL-12, IL-15, IL-28 또는 RANTES인 것인 백신.
  9. 제1항의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV(hepatitis B virus) 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  10. 제1항의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법.
  11. 제1항의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로 진단된 대상체를 보호하는 방법.
  12. 서열 번호 2를 포함하는 단백질; 서열 번호 2의 전장 아미노산 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질; 적어도 20개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 20개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질의 N 말단에 연결된 신호 펩타이드를 더 포함하는 핵산 분자.
  14. 제12항에 있어서, 서열 번호 2; 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  15. 제12항에 있어서, 서열 번호 1을 포함하는 핵산 서열; 서열 번호 1의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 핵산 서열; 서열 번호 1에 의해 코딩된 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이의 단편; 및 서열 번호 1에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산 분자.
  16. 제12항에 있어서, 상기 핵산 서열의 5' 말단에 연결된 신호 펩타이드를 더 포함하는 핵산 분자.
  17. 제12항에 있어서, 서열 번호 1; 서열 번호 3; 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  18. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드인 것인 핵산 분자.
  19. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터이고, 상기 하나 이상의 단백질을 코딩하는 서열은 조절 구성요소에 작동적으로 연결된 것인 핵산 분자.
  20. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 편입된 것인 핵산 분자.
  21. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자는 적어도 60개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 60개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  22. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자는 적어도 120개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 120개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  23. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자는 적어도 180개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 180개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  24. 제12항의 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  25. 제12항의 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로부터 개체를 보호하는 방법.
  26. 제12항의 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로 진단된 개체를 보호하는 방법.
  27. (a) 서열 번호 2;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 전장 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질;
    (c) 서열 번호 2의 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 2의 면역원성 단편;
    (d) 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 95% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 단백질은 적어도 60개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 60개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단백질.
  29. 제27항에 있어서, 상기 단백질은 적어도 120개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 120개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단백질.
  30. 제27항에 있어서, 상기 단백질은 적어도 180개의 아미노산인 서열 번호 2를 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및 적어도 180개의 아미노산인 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단백질.
  31. 제27항의 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  32. 제27항의 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로부터 개체를 보호하는 방법.
  33. 제27항의 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로 진단된 개체를 보호하는 방법.
  34. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (a) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16을 포함하는 단백질;
    (b) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질;
    (c) 적어도 20개의 아미노산인 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16을 포함하는 단백질의 면역원성 단편; 및
    (d) 적어도 20개의 아미노산인 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편.
  35. 제34항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (a) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15를 포함하는 핵산 서열;
    (b) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 핵산 서열;
    (c) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15에 의해 코딩된 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이의 단편; 및
    (d) 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이의 단편.
  36. 제34항에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드인 것인 핵산 분자.
  37. 제34항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터이고, 상기 하나 이상의 단백질을 코딩하는 서열은 조절 구성요소에 작동적으로 연결된 것인 핵산 분자.
  38. 제34항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 편입된 것인 핵산 분자.
  39. 제34항의 핵산 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  40. 제34항의 핵산 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로부터 개체를 보호하는 방법.
  41. 제34항의 핵산 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염으로 진단된 개체를 보호하는 방법.
  42. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질:
    (a) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16;
    (b) 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질;
    (c) 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 면역원성 단편; 및
    (d) 20개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 98% 동일한 단백질의 면역원성 단편.
  43. 대상체에서 HBV에 대해 면역 반응을 생성하기에 유용한 백신으로서,
    제34항의 핵산 분자, 및
    아쥬반트 분자를 포함하는 백신.
  44. 제43항에 있어서, 상기 아쥬반트는 IL-12, IL-15, IL-28 또는 RANTES인 것인 백신.
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