MX2015003489A - Proteina central y proteina del antigeno de superficie del virus de la hepatiris b y vacunas comprenden estas,. - Google Patents

Proteina central y proteina del antigeno de superficie del virus de la hepatiris b y vacunas comprenden estas,.

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Abstract

Se proporcionan en la presente secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas centrales del virus de la hepatitis B (VHB), proteínas del antígeno de superficie, fragmentos y combinaciones de estos, así como también construcciones genéticas/vectores y vacunas que expresan las secuencias de proteínas. Estas proteínas son capaces de inducir una respuesta inmunitaria en el hígado y en forma periférica mediante la captación de agentes celulares y humorales. Además, se proporcionan métodos para inmunizar individuos contra el VHB en forma profiláctica y/o terapéutica. La vacuna combinada se puede utilizar también para vacunas de diseño particulares, para niveles de respuestas inmunitarias particulares para la prueba de provocación del VHB.

Description

PROTEÍNA CENTRAL Y PROTEÍNA DEL ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B Y VACUNAS QUE COMPRENDEN ÉSTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas centrales, proteínas del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB), fragmentos y combinaciones de estos, con las proteínas centrales, proteínas del antígeno de superficie, del virus de la hepatitis B virus (VHB), fragmentos y combinaciones de estos, con vacunas mejoradas del VHB, con métodos mejorados para inducir respuestas inmunitarias contra el VHB y con métodos mejorados para inmunizar individuos contra el VHB profiláctica y/o terapéuticamente .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hepatitis B es una infección común que prevalece en todo el mundo, que lleva al desarrollo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular . Una cantidad significa iva de casos de hepatitis no son registrados debido a la naturaleza asintomática de la enfermedad. No obstante, se registran aproximadamente 350 millones de casos de hepatitis B crónica cada año. La mayor parte de la población infectada con hepatitis se encuentra en los países subdesarrollados o en vías de desarrollo.
REF.:254813 El virus se divide en cuatro grandes serotipos (adr, adw, ayr, ayw) según los epítopos antigénicos en sus proteínas de envoltura. Hay al menos ocho genotipos (A-H) del VHB de acuerdo con la variación de las secuencias genómicas. Los genotipos alternativos del VHB tienen una distribución geográfica prevalente.
La Tabla 1 presenta la distribución geográfica de los genotipos del VHB.
Tabla 1 Distribución geográfica del VHB J. Med. Virol, DOI 10.1002jmv El genoma del VHB es una molécula de ADN circular que es principalmente de hebra doble pero que tiene una región de hebra simple que surge dado que una hebra es más larga que la otra. La región de hebra doble surge de la hibridación de una hebra más corta de aproximadamente 3020 nucleótidos con una hebra más larga de aproximadamente 3320 nucleótidos. La región de hebra simple en los nucleótidos no hibridados de la hebra larga se relaciona con la polimerasa del ADN del VHB. Tanto el ADN genómico del VHB como la polimerasa del ADN del VHB están contenidos dentro de una nucleocápside formada por múltiples moléculas de proteína central del VHB (HBcAg). La proteína central del VHB está envuelta por la proteína de superficie del VHB o el antígeno (HBsAgs) y moléculas lipídicas .
El genoma del VHB contiene cuatro cuadros de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés) que codifican siete proteínas diferentes: 1) un ORF que codifica la polimerasa de ADN del VHB, 2) un ORF que tiene dos codones de inicio, donde la secuencia unida al segundo codón de inicio codifica a la proteína central y la secuencia que incluye el codón de inicio anterior adicional codifica una secuencia a las que se hace referencia como pre-C; 3) un ORF que tiene tres codones de inicio, donde uno codifica a la proteína de superficie (proteína S; gp27), uno incluye un codón de inicio anterior que codifica una secuencia a la que se hace referencia como pre-S2 (gp36) y otro que incluye un codón de inicio aún anterior que codifica una secuencia a la que se hace referencia como pre-Sl (gp42); y 4) un ORF que codifica HBxAg, una proteína cuya función no se entiende tanto (Figura 1). Estos incluyen 3 proteínas o antígenos de superficie (HBsAg): preSl, preS2 y la S principal.
Los rasgos de las HBsAgs se ilustran en la Figura 2. Los epítopos de HBsAgs implicados en la expresión de las especificidades de subtipo se ubican en una región que incluye dos bucles externos de las moléculas de antígeno de superficie del VHB (es decir, los aminoácidos 110-180 de la proteína S) y son lo que hace que las cepas del VHB sean diversas desde el punto de vista de los antígenos. La misma región contiene una cantidad desconocida de epítopos que definen el determinante "a" de HBsAg, que es común a todas las cepas del VHB de tipo salvaje conocidas.
Las vacunas y tratamiento profilácticos para la infección por VHB implican la inyección de partículas subvirales purificadas del plasma de portadores crónicos o partículas subvirales producidas como proteínas recombinantes en líneas celulares eucariota transfectadas de forma estable. Las partículas subvirales son proteínas virales y frecuentemente se hace referencia a tales vacunas como vacunas de subunidades. Se administran las proteínas del VHB a un individuo y se vuelven objetivos del sistema inmunitario del individuo. En los individuos no infectados, una respuesta inmunitaria contra la vacuna de subunidades protege al individuo no infectados de la infección por VHB. En individuos infectados, la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna puede tener efectos terapéuticos.
Chisari F.V., Am J Pathol., 2000. 156:1117-1132 y Pumpeus P. et ál. Intervirology 2001.44:98-114 describen la organización genómica del VHB. Deny P. y F. Zoulim, Pathologie Biologie 2010, Ago, 58(4):245 53 trata sobre el diagnóstico y el tratamiento del virus de la hepatitis B. Michel M.L. y P. Tiollais, Pathologie Biologie 2010, Ago, 58(4):288 95 trata sobre las vacunas para hepatitis B y su eficacia protectora y potencial terapéutico. La publicación PCT W02004026899 describe el uso de la secuencia de polipéptidos que contiene el inmunógeno con secuencias de aminoácidos del VHB. La solicitud PCT publicada W02008093976 describe las vacunas, proteínas y secuencias que codifican el VHB, lo que incluye una vacuna que comprende un antígeno de superficie del VHB de longitud completa recombinante y un antígeno central del VHB. El antígeno de superficie del VHB completo consta de tres tipos de proteína de superficie (la proteína L, la proteína M y la proteína S). La solicitud PCT publicada W02009130588 describe las vacunas, proteínas y secuencias que codifican el VHB, lo que incluye un ácido nucleico que codifica un antígeno central del virus de la hepatitis B que se encuentra optimizado por codones para su expresión en seres humanos. La publicación PCT W02010127115 describe la administración de las secuencias del VHB utilizando vectores recombinantes.
Las vacunas del VHB disponibles han demostrado algo de eficacia, pero su producción es costosa. Además, las vacunas de subunidades derivadas del plasma cuentan también con cierta preocupación sobre la seguridad. Varios enfoques de vacunas han sido explorados, inclusive aquellos en base a vectores recombinantes vivos, péptidos sintéticos y vacunas de ADN que comprenden secuencias de codificación optimizadas por codones de las proteínas del VHB. Estos otros enfoques han tenido, hasta el momento, una diversidad de eficacia limitada. Adicionalmente, debido a las diferencias genómicas, algunas vacunas del VHB demostraron eficacia positiva en algunas áreas geográficas y eficacia limitada en otras áreas.
Las vacunas a base de HBsAg disponibles actualmente derivadas de levadura transfectada con la proteína S que codifica el ADN (por ejemplo, ENGERIX-B, disponible en SmithKline Biologicals, que se ubica en Bélgica, y RECOMBIVAX/HB-VAX II, disponible en Merck & Co., que se ubica en EUA) no provocan una respuesta en aproximadamente de 5 % a 10 % de individuos (C. Belloni, Immunogenicity of hepatitis B vaccine in term and preterm infants. Acta Paediatrica, 1998. 87: p. 336-338). Adicionalmente, la tasa de no respuesta aumenta a 30 % en individuos mayores y la inmunidad contra el VHB puede disminuir varios años luego de la vacunación. También se utilizan múltiples dosis para obtener una protección completa. La seguridad es un tema de preocupación con las vacunas a base de HBsAg ENGERIX-B ya que ENGERIX-B triplica el riesgo de desmielinización inflamatoria del sistema nervioso central (SNC).
Otras vacunas a base de HBsAg derivadas de células de mamífero utilizan pre-Sl y pre-S2, además de la proteína S. Los antígenos pre-Sl y -S2 expresan los epítopos de linfocitos T y B altamente inmunogénicos y una de tales vacunas provoca una respuesta inmunitaria en aproximadamente 80 % de los individuos que no tienen respuesta o tienen una respuesta muy baja (Rendí-Wagner, P. et á., Comparative immunogenicity of PreS/S hepatitis B vaccine in non- and low responders to conventional vaccine. Vaccine, 2006. 24: p. 2781-9.).
Se ha estudiado la administración directa de las secuencias de ácido nucleico para vacunar contra enfermedades de animales y humanos y muchos esfuerzos se han dirigido a los medios eficaces y eficientes para la administración de ácido nucleico a los efectos de proporcionar una expresión necesaria de los antígenos deseados, la respuesta inmunogénica resultante y en última instancia, el éxito de esta téenica.
Las vacunas con ADN permiten la síntesis de antígenos endógenos, lo que induce un complejo de CD8+ histocompatible, linfocitos T citotóxicos de clase I-restringida que raramente se obtienen con vacunas de subunidades. Además, la síntesis de antígenos que ocurre durante un período sostenido de tiempo puede ayudar a vencer la baja sensibilidad y eliminar o reducir la necesidad de inyecciones de refuerzo. Además, las vacunas de ADN parecen ser muy estables y simples de producir.
Las vacunas de ADN son seguras, estables, se producen fácilmente y son bien toleradas por los seres humanos con pruebas preclínicas que indican poca evidencia de integración de plásmidos [Martin, T., et ál., Plasmid DNA malaria vaccine the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999.10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et ál., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9] .
Adicionalmente, las vacunas de ADN son adecuadas para la administración repetida debido al hecho de que la eficacia de la vacuna no se ve influenciada por las titulaciones de anticuerpos existentes previamente al vector [Chattergoon, M., J. Boyer, y D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997.11(10): p. 753-63]. Sin embargo, un obstáculo importante para la adopción clínica de las vacunas de ADN ha sido una disminución en la inmunogenicidad de plataformas cuando se trata de animales más grandes [Liu, M.A. y J.B. Ulmer, Human clinical triáis of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005.55: p. 25-40].
Los avances teenológicos recientes en la modificación de in unógenos en vacunas de ADN han mejorado la expresión e inmunogenicidad de vacunas de ADN, tales como optimización con codones, optimización del ARN y adición de secuencias líderes de inmunoglobulina [Andre, S., et ál., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., et ál., Múltiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p.10991-1001; Laddy, D.J., et ál., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p.2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], así como también teenología recientemente desarrollada en los sistemas de administración de plásmidos tales como la electroporación [Hirao, L.A., et ál., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008.26(3): p.440-8; Luckay, A., et ál., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007.81(10): p.5257-69; Ahlen, G., et ál., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007.179(7): p. 4741-53]. La técnica de electroporación in vivo se ha utilizado en ensayos clínicos humanos para administrar fármacos anticancerosos, tales como bleomicina, y en muchos estudios preclínicos sobre una gran cantidad de especies animales. Adicionalmente, algunos estudios han sugerido que el uso de inmunógenos de consenso puede incrementar el alcance de la respuesta celular inmunitaria en comparación con los antígenos naturales solos [Yan., J., et ál., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et ál., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007.81(16): p. 8507-14].
Los anticuerpos y linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) para diferentes antígenos del VHB pueden estar implicados en la reducción de la carga viral y supresión de las células infectadas con el VHB del hígado. Un gran desafío para los candidatos de vacunas actuales ha sido la inducción tanto de la inmunidad celular como humoral a los objetivos antígenos del VHB y contra los genotipos principales del VHB. Se mantiene la necesidad de construcciones de ácido nucleico que codifiquen las proteínas del VHB y composiciones útiles para inducir las respuestas inmunitarias contra el VHB. Se mantiene la necesidad de vacunas eficaces contra el VHB que sean económicas y eficaces. Se mantiene la necesidad de vacunas eficaces que aumenten los niveles de anticuerpos neutralizantes y provoquen un componente de linfocitos T. Se mantiene la necesidad de vacunas eficaces contra el VHB, inclusive aquellas eficaces contra las cepas del VHB que tengan un intervalo amplio de genotipos y preferentemente una vacuna universal que sea eficaz a nivel mundial.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se orienta a una vacuna que comprende: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, una proteína que es 98 % idéntica a la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10 y una proteína que es 98 % idéntica a la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14; y (c) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:16, una proteína que es 98 % idéntica a la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 y una proteína que es 98 % idéntica a la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:15.
La presente invención también puede orientarse a una vacuna que comprende (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:10, y una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:14; y (c) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:16, una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:12 y una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO:16.
La vacuna puede ser un plásmido que comprende los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico pueden incorporarse en partículas virales. La vacuna puede comprender además una molécula adyuvante. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), TNFa, TNRb, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 o una combinación de estos; y en algunas modalidades, IL-12, IL-15, IL-28 o RANTES.
La presente invención se orienta también a un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB que comprende la administración de una vacuna de la presente invención a un sujeto.
La presente invención se orienta también a un método de protección para un sujeto contra la infección por VHB que comprende la administración de una vacuna de la presente invención a un sujeto.
La presente invención se orienta adicionalmente a un método de protección para un sujeto que ha sido diagnosticado con infección por VHB que comprende la administración de una vacuna de la presente invención al sujeto.
La presente invención incluye además vacunas útiles para la inducción de una respuesta inmunitaria contra el VHB. El desarrollo de una vacuna terapéutica inmunitaria contra el VHB con eficacia amplia contra múltiples genotipos puede proporcionarse utilizando una vacuna de ADN terapéutico para infección por VHB basada en volver diana a los antígenos centrales-específicos del VHB conservados universalmente. El uso de inmunógenos del VHB de consenso induce respuestas inmunitarias más amplias y puede ser útil para minimizar el grado de disparidad entre las diferentes cepas del virus.
En la presente se proporcionan proteínas seleccionadas del grupo que consta de: proteínas que comprenden SEQ ID NO:2, proteínas que son 95 % idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; fragmentos de la SEQ ID NO:2; proteínas que son 95 % idénticas a un fragmento de las SEQ ID NO:2; SEQ ID N0:4, proteínas que son 95 % idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; fragmentos de la SEQ ID NO:4; proteínas que son 95 % idénticas a un fragmento de las SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:6, proteínas que son 95 % idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6; fragmentos de la SEQ ID NO:6; y proteínas que son 95 % idénticas a un fragmento de la SEQ ID NO:6.
También se proporciona en la presente una proteína seleccionada del grupo que consta de (a) la SEQ ID NO:2; (b) una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de longitud completa como se establece en la SEQ ID NO:2; (c) un fragmento inmunogénico de la SEQ ID NO:2 que comprende 20 o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y (d) un fragmento inmunogénico de una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que comprende 20 o más aminoácidos.
También se proporcionan moléculas que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas de proteína establecidas anteriormente. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de: la SEQ ID NO:1; una secuencia de ácido nucleico que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; un fragmento de la SEQ ID N0:1; una secuencia de ácido nucleico que es 95 % idéntica a un fragmento de las SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; una secuencia de ácido nucleico que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; un fragmento de la SEQ ID NO:3; una secuencia de ácido nucleico que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; un fragmento de la SEQ ID NO:5; y una secuencia de ácido nucleico que es 95 % idéntica a un fragmento de la SEQ ID NO:5.
Algunos aspectos de la invención proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra el VHB que comprende la etapa de: administrar a un individuo composiciones y/o moléculas de antígenos de superficie del VHB y/o antígenos centrales del VHB.
Los aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos de protección contra una infección por el VHB. Los métodos comprenden la etapa de: administrar al individuo una cantidad profilácticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico o las composiciones; donde la secuencia de ácido nucleico se expresa en las células del individuo y se induce una respuesta inmunitaria protectora frente a una proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico.
En algunos aspectos de la invención, se proporcionan métodos para el tratamiento de un individuo que ha sido infectado por el VHB. Los métodos comprenden la etapa de: administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de las moléculas de ácido nucleico y/o composición.
La presente invención proporciona, en otro aspecto, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de codificación que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de: (a) una proteína que comprende las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16; (b) una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16; (c) un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 que tiene al menos 20 aminoácidos; y (d) un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 O SEQ ID NO:16 que tiene al menos 20 aminoácidos.
La molécula de ácido nucleico puede comprender una o más secuencias seleccionadas del grupo que consta de: (a) una secuencia de ácido nucleico que comprende las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (b) una secuencia de ácido nucleico que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) fragmentos de estas que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 20 aminoácidos codificados por las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; y (d) fragmentos de estas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 20 aminoácidos de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15. La molécula de ácido nucleico puede ser un plásmido. La molécula de ácido nucleico puede ser un vector de expresión y las secuencias que codifican tales una o más proteínas se encuentran unidas de forma operativa a elementos reguladores. La molécula de ácido nucleico puede incorporarse en una partícula viral.
Algunos aspectos de la invención proporcionan un método de inducción de una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB que comprende la administración de una molécula de ácido nucleico de la presente invención a un sujeto.
Algunos aspectos de la invención proporcionan un método para proteger a un sujeto de la infección por VHB que comprende la administración de una molécula de ácido nucleico de la presente invención al sujeto.
Algunos aspectos de la invención proporcionan un método para proteger a un sujeto que ha sido diagnosticado con infección por VHB que comprende la administración de una molécula de ácido nucleico de la presente invención al sujeto La presente invención proporciona, en aún otro aspecto, una proteína seleccionada del grupo que consta de: (a) las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16; (b) una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16; (c) un fragmento inmunogénico de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 que comprende 20 o más aminoácidos; y (d) un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 que comprende 20 o más aminoácidos.
Algunos aspectos de la invención proporcionan una vacuna útil para la generación de una respuesta inmunitaria contra el VHB en un sujeto que comprende: una molécula de ácido nucleico de la presente invención y una molécula adyuvante.
El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNEb, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 o una combinación de estos; y en algunas modalidades, IL-12, IL-15, IL-28 O RANTES.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un mapa que presenta la organización del genoma del VHB que consta de cuatro ORF que se superponen.
La Figura 2 ilustra la organización y los rasgos de los antígenos de superficie del VHB.
La Figura 3 ilustra igELS y los sitios de escisión endoproteolí icos en el antigeno de superficie del VHB de consenso.
La Figura 4 ilustra el antígeno de superficie VHB de consenso largo (LHB, por sus siglas en inglés) y el antígeno de superficie del VHB de consenso pequeño (SHB, por sus siglas en inglés).
La Figura 5 es un mapa del vector pGX1801 HepB - Mcore (SEQ ID NO:17).
La Figura 6 es un mapa del vector pGX1802 HepB pLHBs-A (SEQ ID NO:18).
La Figura 7 es un mapa del vector pGX1803 HepB pLHBs-C (SEQ ID NO:19).
La Figura 8 es un mapa del vector pGX1804 HepB pSHBs-A (SEQ ID NO:20).
La Figura 9 es un mapa del vector pGX1805 HepB SHBs-C (SEQ ID NO:21).
La Figura 10 ilustra un análisis filogenético de la secuencia de consenso de HBcAg en comparación con los genotipos individuales A, B, C, D y E.
Las Figuras 11A y 11B muestran resultados de los experimentos de expresión pM Core. La Figura 11A presenta los resultados del protocolo de traducción in vitro. La Figura 11B presenta los resultados de una Western Blot.
La Figura 12 es una gráfica que ilustra el mapa de plásmidos y la secuencia de pMCore.
La Figura 13 presenta una reacción de transcripción/traducción utilizando un plásmido pMCore, en el que la proteína MCore resultante se inmunoprecipitó con un anticuerpo monoclonal anti-HA y se realizó en un gel SDS-PAGE La Figura 14 presenta la detección de la proteína MCore en linfocitos Transfectadas de manera transitoria utilizando una etiqueta HA monoclonal primaria seguido por la detección con un anticuerpo secundario anticonejo marcado con DyLight 594. La tinción Hoechst también se utilizó para marcar en forma fluorescente los núcleos celulares. La expresión de MCore se encuentra principalmente en el citoplasma, tal como se presenta por la tinción fuera del núcleo.
La Figura 15 ilustra un esquema de inmunización. Se inmunizaron 4 ratones de forma intramuscular con 30 m9 de pMCore.
La Figura 16 presenta la magnitud mejorada de la secreción IFN-g en los linfocitos T CD8+ y CD4+ de los bazos de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 17 presenta la magnitud mejorada de la secreción IFN-g en los linfocitos T CD8+ y CD4+ de los bazos de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 18 presenta la magnitud mejorada de la secreción TNF-a en los linfocitos T CD8+ y CD4+ de los bazos de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 19 presenta la magnitud mejorada de la secreción TNF-a en los linfocitos T CD8+ y CD4+ de los bazos de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 20 presenta la magnitud mejorada de la secreción CD 107a en los linfocitos T CD8+ y CD4+ de los bazos de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 21 presenta la magnitud mejorada de la secreción CD 107a en los linfocitos T CD8+ y CD4+ de los bazos de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 22 presenta el porcentaje promedio de células secretoras de CD4 específicos para HBcAg o CD8 IFN-y, TNF-oc+ de ratones Balb/c inmunizados con pVAX de control o el antígeno central de consenso pMCore.
La Figura 23 presenta el porcentaje promedio de las células productoras de CD4 específicos para HBcAg o CD8 doble positivo de ratones Balb/c inmunizados con pVAX de control o el antígeno central de consenso pMCore.
La Figura 24 presenta la respuesta de linfocitos T a interferón-gamma en el hígado de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 25 presenta la respuesta de linfocitos T a interferón-gamma en el hígado de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 26 presenta la respuesta de linfocitos T al factor de necrosis tumoral a en el hígado de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 27 presenta la respuesta de linfocitos T al factor de necrosis tumoral a en el hígado de ratones Balb/C vacunados con pM-Core.
La Figura 28 presenta el porcentaje de células productoras de CD4 específicos para HBcAg o CD8 IFN-y·, TNF-ot+ de ratones Balb/c inmunizados con pVAX de control o el antígeno central de consenso pMCore.
La Figura 29 presenta el porcentaje promedio de las células productoras de CD4 específicos para HBcAg o CD8 doble positivo en el hígado de ratones Balb/c inmunizados con pVAX de control o el antígeno central de consenso pMCore.
La Figura 30 presenta esplenocitos que producen un anticuerpo específico para un antígeno. Los valores son las medias ± error estándar de la media. La importancia se determinó mediante la prueba t de Student.
La Figura 31 presenta datos de los ensayos ELISPOT.
La Figura 32 presenta la frecuencia de unidades de formación espontánea de IFN-g específicas para HBcAg (SFU) por millón de esplenocitos luego de la estimulación de las células del bazo de los ratones inmunizados.
La Figura 33 presenta datos de experimentos utilizando células marcadas con CSFE para comparar la supresión de las células diana tratadas con péptidos in vivo mediante linfocitos T CD8 en animales vacunados y no vacunados.
La Figura 34 presenta destrucción específica in vivo. Dos grupos de ratones inmunizados ya sea con pVax (control) o pMCore recibieron células diana marcadas con CFSE (CFSE10 pulsado con péptidos irrelevantes o CFSEhi pulsado con péptidos específicos para el epítopo) mediante la vena de la cola. Se recuperaron las células marcadas con CFSE y se utilizó un análisis mediante FACS para cuantificar el porcentaje de destrucción.
La Figura 35 presenta una comparación del porcentaje de proliferación de las células CD3+CD4+ y CD3+CD8+ tratadas con el vector pVax (control) o con el plásmido pMCore, que expresa M-core del VHB.
La Figura 36 presenta el porcentaje de proliferación de los linfocitos T CD4 y CD8.
Las Figuras 37A y 37B presentan una comparación de IgG e IgA centrales anti-VHB en dilución en serie de los sueros de los animales tratados con el vector pVax (control) o con el plásmido pMCore que expresa M-core del VHB.
La Figura 38 presenta la respuesta inmunitaria humoral específica para HBcAg inducida por pMCore en los sueros y esplenocitos. Los valores son las medias ± error estándar de la media. La importancia se determinó mediante la prueba t de Student.
La Figura 39 presenta la respuesta inmunitaria humoral específica para HBcAg inducida por pMCore en los sueros y esplenocitos. Los valores son las medias ± error estándar de la media. La importancia se determinó mediante la prueba t de Student.
La Figura 40 presenta el porcentaje de TNF-a e IFN-g de las células hepáticas y del bazo CD4+ y CD8+.
La Figura 41 presenta datos de los experimentos para determinar si la supresión inducida por los ratones inmunizados afectó en verdad al hígado mediante la medición de los niveles de ALT en suero.
La Figura 42 presenta la inmunotinción de cortes de hígado tomadas tres días luego de la inyección hidrodinámica de PBS, pMCore (HBcAg) o pNS3/4A (VHC NS3-4A) de ratones sin tratamiento o inmunizados con pMcore. La supresión es mucho mayor para hígados inmunizados con pMCore en comparación con hígados de control transfectados con NS3/4a. Se detectó la expresión de PMcore o NS3/4A con un anticuerpo anti-HA (células blancas/gris claro).
La Figura 43 presenta 3 días luego de la transfección, en la que se analizaron células para la expresión del marcador de degranulación, la expresión de CD107a y IFN-y+ luego de la estimulación con péptidos HBcAg.
La Figura 44 presenta la medición de los niveles de ALT en suero en el día 3, 6 y 12 luego de la transfección y no se mostraron pruebas de aumento en animales vacunados recientemente.
La Figura 45 presenta las respuestas inmunitarias celular total en monos inmunizados con las vacunas reducidas (es decir, pMCore, pSHb A y pSHb C), grandes (es decir, pMCore, pLHb A y pLHb C) y grandes+IL-12 (es decir, pMCore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
La Figura 46 presenta las respuestas inmunitarias celulares específicas para núcleos en monos inmunizados con las vacunas reducidas (es decir, pMCore, pSHb A y pSHb C), grandes (es decir, pMCore, pLHb A y pLHb C) y grandes+IL-12 (es decir, pMCore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
La Figura 47 presenta las respuestas inmunitarias celulares específicas para el antígeno A de superficie en monos inmunizados con las vacunas reducidas (es decir, pMCore, pSHb A y pSHb C), grandes (es decir, pMCore, pLHb A y pLHb C) y grandes+IL-12 (es decir, pMCore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
La Figura 48 presenta datos de los ensayos ELISPOT de respuestas inmunitarias celulares específicas para el antígeno C de superficie en monos inmunizados con las vacunas reducidas (es decir, pMCore, pSHb A y pSHb C), grandes (es decir, pMCore, pLHb A y pLHb C) y grandes+IL-12 (es decir, pMCore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
La Figura 49 presenta las respuestas inmunitarias celular total en monos inmunizados con las vacunas reducidas (es decir, pMCore, pSHb A y pSHb C), grandes (es decir, pMCore, pLHb A y pLHb C) y grandes+IL-12 (es decir, pMCore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
La Figura 50 presenta una comparación de los anticuerpos anti-VHB en dilución en serie de los sueros de los monos inmunizados con las vacunas reducidas (es decir, pMCore, pSHb A y pSHb C), grandes (es decir, pMCore, pLHb A y pLHb C) y grandes+IL-12 (es decir, pMCore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
La Figura 51 presenta una comparación de los anticuerpos anti-VHB en dilución en serie de animales inmunizados con las vacunas grandes+IL-12 (es decir, pMcore, pLHb A, pLHb C y prlIL-12).
Las Figuras 52A-52C presentan construcciones de ADN de antígeno de superficie del VHB y su expresión. (FIG.52A) Análisis filogenéticos de las secuencia de consenso HBs de los genotipos A y C en comparación con HBs naturales. Las secuencias de consenso se indican con asteriscos. (FIG.52B) Diagrama esquemático de injertos génicos HBs en los plásmidos de ADN. pLHBs y pSHBs representan los antígenos de proteínas HBs grandes y pequeñas. Las proteínas preSl, preS2 y S grandes se unen con los sitios de escisión endoproteolíticos. (FIG.52C) Detección de pLHBs y pSHBs mediante tinción intracelular de las células RD transfectadas con el anticuerpo monoclonal y suero de ratón policlonal.
Las Figuras 53A-53C presentan que tanto pLHBs como SHBs provocaron fuertes respuestas de linfocitos T y anticuerpos en Balb/c. Se inmunizaron cinco ratones Balb/c por grupo en tres experimentos diferentes y se analizaron por su inducción tanto de las respuestas humorales y celulares (FIG.53A) respuestas de IgG específicas para HBs medidas una semana después de cada inmunización. La flecha indica el momento de inmunización. (FIG.53B) las respuestas totales de IFN-g inducidas por cada construcción para preSl/S2 sintético y péptidos S principales. (FIG.53C) Caracterización de los epítopos inmunodominantes específicos para HBs mediante el uso de péptidos HBs individuales en 16 y 12 conjunto de matriz de LHB y SHB respectivamente. Esto presenta una amplitud mejorada de las respuestas inmunitarias celulares.
La Figura 54 presenta destrucción específica in vivo. Dos grupos distintos de ratones inmunizados ya sea con pVax (control) o cualquiera de las cuatro construcciones HBs recibieron células diana marcadas con CFSE (CFSE10pulsado con péptidos irrelevantes o CFSEhi pulsado con péptidos específicos para el epítopo) mediante la vena de la cola. Se recuperaron las células marcadas con CFSE y se utilizó un análisis mediante FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) para cuantificar el porcentaje de destrucción.
Las Figuras 55A-55B muestran que el cóctel de la vacuna de HBc/HBs induce fuertes respuestas inmunitarias. (FIG.55A) Las respuestas de anticuerpos específicas para HBs de sueros de ratones inmunizados con el cóctel de la vacuna HBs/HBc en diferentes momentos de la inmunización (flecha). (FIG.55B) Las respuestas de IFN-g luego de la estimulación de esplenocitos ex vivo de los ratones inmunizados con el cóctel HBs/HBc. Los ratones inmunizados respondieron tanto a los péptidos de antígeno de superficie como centrales.
Las Figuras 56A-56F muestran que los linfocitos T CD8 específicos para el antígeno inducen citocinas antivirales. Tinción intracelular de citocinas antivirales luego de la estimulación de esplenocitos ex-vivo de ratones balb/c de diferentes grupos inmunizados (Tabla 3). Se tiñeron los linfocitos con anticuerpos para CD3, CD4, CD8, IFN-g, TNF-a, IL-2 y CD107a. Estos datos son representativos de 4 ratones por grupo en 3 experimentos diferentes.
Las Figuras 57A-57D presenta la inmunogenicidad en primates no humanos. Se inmunizaron cinco macacos Rhesus intramuscularmente con pSHBs/pMCore, pLHBs/pMCore o pLHBs/pMCore + pIL-12 (Tabla 4) seguido por electroporación. Los monos recibieron tres inmunizaciones. (FIG.57A) Se observaron títulos elevados de anticuerpos para HBs justo después de 2 inmunizaciones. (FIG.57B) Las respuestas IFN-g se midieron una vez antes de la primera inmunización y 2 semanas después de cada inmunización. (FIG.57C) Se observaron muchos grupos de péptidos de matriz de HBs positivos en la mayoría de los monos de diferentes grupos, lo que confirma las respuestas de linfocitos T amplias en los macacos inmunizados. (FIG.57D) La tinción intracelular (IFN-g, TNF-a, IL-2) de PBMC luego de la última inmunización muestra una producción de citocina antiviral específica para HBs y HBc tanto en CD4 como CD8.
Las Figuras 58A-58F presentan la seguridad de una vacuna del VHB terapéutica en macacos rhesus. Se analizaron muestras antes de la vacunación (pre), luego de la tercera vacunación (3era), antes de la cuarta vacunación (pre 4ta) luego de la cuarta vacunación (4ta). Hubo un error de ensayo para la fosfatasa alcalina luego de la tercera vacunación. El intervalo normal para todas las medidas se ilustra con líneas punteadas. (FIG.58A) Fosfatasa alcalina en suero. (FIG.58B) Niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero. (FIG.58C) Niveles de aspartato aminotransferasa (AST) en suero. (FIG.58D) Niveles de bilirrubina totales. (FIG.58E) Niveles de creatinina en suero. (FIG.58F) Niveles de nitrógeno ureico en suero sanguíneo.
Las Figuras 59A-59D presentan la secuencia de anotación para los cuatro plásmidos HBs. Las secuencias para la líder IgE, el sitio de escisión endoproteolítico y la etiqueta HA de extremo C se encuentra subrayadas. Los cuatro plásmidos HBs son: Proteína de superficie grande de genotipo A (pLHBs-A) (FIG.59A) y proteína de superficie pequeña (pSHBs-A) (FIG.59B) y proteína de superficie grande del genotipo C (pLHBs-C) (FIG.59C) y proteína de superficie pequeña (pSHBs-C) (FIG.59D).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con inmunógenos del virus de la hepatitis B (VHB) sintéticos, multivalentes y altamente optimizados que provocan tanto anticuerpos como inmunidad celular contra los antígenos de superficie del VHB (HBs) y centrales del VHB (HBc). Estos plásmidos, que codifican los genotipos más dominantes del virus, inducen la unión de anticuerpos a los antígenos HBs y conducen la inmunidad celular fuerte (CMI, por sus siglas en inglés) tanto a los antígenos HBc como HBs. Los plásmidos provocaron independientemente respuestas de los linfocitos T con reactividad cruzada amplia y respuestas de los anticuerpos de título elevado, así como también actividad citotóxica inducida por vacunas. Los cócteles de plásmidos que contienen ambos antígenos de superficie inducen una respuesta inmunitaria celular fuerte y amplia en múltiples epítopos antigénicos, en particular, una reactividad cruzada amplia entre los genotipos A y C del virus. Los cócteles de plásmidos optimizados que codifican los antígenos HBs y HBc indujeron respuestas celulares y humorales fuertes con diana en el antígeno S y condujeron diversas respuestas con múltiples epítopos implicadas en la supresión de los hepatocitos infectados.
En particular, la presente invención se relaciona con vacunas para el virus de la hepatitis B (VHB) que pueden utilizarse para proteger a un individuo de la infección por VHB y proporcionar beneficios terapéuticos a un individuo diagnosticado con infección por VHB. Tales vacunas también pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB. La vacuna para el VHB de la presente invención incluye una o más moléculas de ácido nucleico. En particular, la molécula de ácido nucleico codifica una o más proteínas centrales del VHB de consenso. Las proteínas centrales del VHB de consenso derivan de las secuencias del VHB de los genotipos A, B, C, D y E y, por lo tanto, las proteínas centrales del VHB de consenso son únicas Las moléculas de ácido nucleico también pueden codificar uno o más fragmentos inmunogénicos de las proteínas centrales del VHB de consenso.
Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico codifican uno o más antígenos de superficie del VHB de consenso. Los antígenos de superficie del VHB de consenso derivan de secuencias de los antígenos de superficie de aislados del VHB del genotipo A y, por lo tanto, los antígenos de superficie del VHB de consenso son únicos. Los antígenos de superficie del VHB de consenso también pueden derivar de secuencias de los antígenos de superficie de aislados del VHB del genotipo C, que tienen como resultado antígenos de superficie del VHB únicos. Las moléculas de ácido nucleico también pueden codificar uno o más fragmentos inmunogénicos de los antígenos de superficie del VHB de consenso.
La vacuna de la presente invención puede incluir cualquier combinación de moléculas de ácido nucleico que codifiquen la proteína central del VHB de consenso y/o las moléculas de ácido nucleico que codifican antígenos de superficie del VHB de consenso. La vacuna puede incluir también cualquier combinación de moléculas de ácido nucleico que codifiquen fragmentos inmunogénicos de las proteínas centrales del VHB de consenso y/o moléculas de ácido nucleico que codifiquen fragmentos inmunogénicos de los antígenos de superficie del VHB de consenso.
Estas combinaciones de la proteína central del VHB y antígeno de superficie del VHB sorpresiva e inesperadamente inducen una respuesta inmunitaria diferencial a la proteína central del VHB y el antígeno de superficie del VHB. En otras palabras, la fuerza de la respuesta inmunitaria a la proteína central del VHB y el antígeno de superficie del VHB difieren según la combinación específica administrada a un sujeto. Por consiguiente, cualquier usuario de la vacuna de la presente invención puede diseñar una vacuna que comprende una combinación específica para inducir una respuesta inmunitaria deseada en un sujeto al que se le administró tal vacuna diseñada. Como tal, cualquier usuario puede adecuar la vacuna de la presente invención para controlar el nivel de respuesta inmunitaria en el sujeto.
La vacuna de la presente invención es ampliamente aplicable a los múltiples tipos del VHB por las secuencias de consenso únicas de proteína central del VHB y antígeno de superficie del VHB.
La vacuna de la presente invención puede incluir adicionalmente una o más moléculas de ácido nucleico, tal como se describió anteriormente, y una o más proteínas codificadas por tales moléculas de ácido nucleico. 1. Definiciones La terminología usada en la presente tiene el propósito de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser taxativa. Tal como se usa en la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una" y "el/la", incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
Para enumerar los intervalos numéricos en la presente, se contempla explícitamente cada número interviniente entre estos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo de 6.0-7.0, se contemplan explícitamente los números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 y 7.0.
"Adyuvante" tal como se usa en la presente se refiere a cualquier molécula agregada a las vacunas de plásmidos de ADN descritas en la presente para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos codificados por los plásmidos de ADN y la secuencia de ácido nucleico codificante descrita más adelante en la presente.
"Anticuerpo" tal como se usa en la presente significa un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o fragmentos, fragmentos o derivados de estos, que incluyen Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de hebra simple, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de estos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado de la muestra de suero del mamífero, un anticuerpo policlonal, anticuerpo purificado de afinidad o mezclas de estos que exhiben suficiente especificidad de unión a un epítopo deseado o a una secuencia derivada de este.
La "secuencia de codificación" o "ácido nucleico codificante" tal como se usa en la presente puede referirse al ácido nucleico (molécula de ARN o ADN) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia de codificación puede incluir adicionalmente señales de iniciación y finalización unidas de manera operativa a elementos reguladores que incluyen una señal promotora y de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero a quien se le administra el ácido nucleico.
"Complemento" o "complementario" tal como se usa en la presente significa un ácido nucleico puede significar un par de bases Watson-Crick (por ej., A-T/U y C-G) o Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótido de moléculas de ácido nucleico.
"Consenso" o "secuencia de consenso", tal como se utiliza en la presente, significa una secuencia de polipéptidos basada en el análisis de una alineación de múltiples subtipos de un antígeno del VHB particular, tal como un antígeno de superficie o central del VHB. Se pueden preparar secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de polipéptidos de consenso. Las vacunas que comprenden proteínas que comprenden secuencias y/o moléculas de ácido nucleico de consenso que codifican las proteínas se pueden utilizar para inducir una inmunidad amplia frente a múltiples subtipos o serotipos de un antígeno del VHB particular.
"Electroporación", "electropermeabilización" o "mejora electrocinética" ("EP") tal como se usa en la presente indistintamente puede referirse al uso de un pulso de campo eléctrico de transmembrana para inducir vías microscópicas (poros) en una biomembrana; su presencia permite que las biomoléculas tales como plásmidos, oligonucleótidos, ARNip, fármacos, iones y agua pasen de un lado de la membrana celular a otro.
"Fragmento" tal como se emplea en la presente con respecto a las secuencias de ácido nucleico significa una secuencia de ácido nucleico o una parte de esta, que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que presentan una reactividad cruzada con un antígeno del VHB de la cepa de tipo salvaje de longitud completa. Los fragmentos pueden ser fragmentos de ADN seleccionados de al menos una de varias secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de proteína establecidos a continuación.
"Fragmento" o "fragmento inmunogénico" respecto a las secuencias de polipéptidos significa un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que presenta una reactividad cruzada con un antígeno del VHB de la cepa de tipo salvaje de longitud completa. Los fragmentos de proteínas de consenso pueden comprender al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % de una proteína de consenso. En algunas modalidades, los fragmentos de proteínas de consenso pueden comprender al menos 20 aminoácidos o más, al menos 30 aminoácidos o más, al menos 40 aminoácidos o más, al menos 50 aminoácidos o más, al menos 60 aminoácidos o más, al menos 70 aminoácidos o más, al menos 80 aminoácidos o más, al menos 90 aminoácidos o más, al menos 100 aminoácidos o más, al menos 110 aminoácidos o más, al menos 120 aminoácidos o más, al menos 130 aminoácidos o más, al menos 140 aminoácidos o más, al menos 150 aminoácidos o más, al menos 160 aminoácidos o más, al menos 170 aminoácidos o más, al menos 180 aminoácidos o más, al menos 190 aminoácidos o más, al menos 200 aminoácidos o más, al menos 210 aminoácidos o más, al menos 220 aminoácidos o más, al menos 230 aminoácidos o más o al menos 240 aminoácidos o más de una proteína de consenso.
Tal como se emplea en la presente, el término "construcción genética" se refiere a las moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia de codificación incluye señales de iniciación y finalización unidas operativamente a elementos regulatorios que incluyen una señal promotora y de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células del individuo a quien se le administró la molécula de ácido nucleico. Tal como se usa en la presente, el término "forma expresable" se refiere a construcciones génicas que contienen los elementos regulatorios necesarios unidos operativamente a la secuencia de codificación que codifica una proteína de modo tal que, cuando esté presente en la célula del individuo, se exprese la secuencia de codificación.
El término "homología, " tal como se utiliza en la presente, hace referencia a un grado de complementariedad. Puede haber una homología parcial o una homología completa (es decir, identidad). Se hace referencia a una secuencia con complementariedad parcial que inhibe, al menos en parte, una secuencia con complementariedad completa desde la hibridación a un ácido nucleico diana tal y como se usa el término funcional "básicamente homologa" . Cuando se utiliza respecto a una secuencia de ácido nucleico de hebra doble tal como un ADNc o un clon genómico, el término "básicamente homologa'' tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una sonda que puede hibridarse a una hebra de la secuencia de ácido nucleico de hebra doble en las condiciones de baja rigurosidad. Cuando se utiliza respecto a una secuencia de ácido nucleico de hebra simple, el término "básicamente homologa" tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una sonda que puede hibridarse (es decir, es el complemento) a la secuencia base de ácido nucleico de hebra simple en las condiciones de baja rigurosidad.
"Idéntico/a" o "identidad" tal como se usa en la presente en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos significa que las secuencias tienen un porcentaje específico de residuos que son idénticos en una región específica. El porcentaje se puede calcular alineando de manera óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias en la región específica, determinando la cantidad de posiciones en las que ocurre el residuo idéntico en ambas secuencias para proporcionar la cantidad de posiciones de correspondencia, dividiendo el número de posiciones de correspondencia entre la cantidad total de posiciones en la región específica y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos en que las dos secuencias tienen distintas longitudes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región específica de comparación incluye solo una secuencia única, los residuos de secuencia única se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo. Al comparar el ADN y el ARN, la timina (T) y el uracilo (U) se pueden considerar equivalentes. La identidad se puede llevar a cabo manualmente o usando un algoritmo de secuencias computacional tal como BLAST o BLAST 2.0.
"Respuesta inmunitaria", tal como se usa en la presente, significa la activación del sistema inmunitario de un hospedador, por ejemplo, el de un mamífero, en respuesta a la introducción de un antígeno tal como un antígeno del VHB de consenso. La respuesta inmunitaria puede ser en forma de respuesta celular o humoral, o ambas. "Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido" tal como se usan en la presente significan al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. La descripción de una hebra simple también define la secuencia de la hebra complementaria. Por lo tanto, un ácido nucleico también comprende la hebra complementaria de una hebra simple descrita. Se pueden usar muchas variantes de un ácido nucleico con el mismo fin que un ácido nucleico dado. Por consiguiente, un ácido nucleico también comprende ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de estos. Una hebra simple proporciona una sonda que puede hibridarse a una secuencia diana en condiciones estrictas de hibridación. Por lo tanto, un ácido nucleico también comprende una sonda que se híbrida en condiciones estrictas de hibridación.
Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra simple o hebra doble, o pueden contener partes tanto de secuencia de hebra doble como de hebra simple. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos se pueden obtener por métodos de síntesis químicas o por métodos recombinantes.
"Unido operativamente" tal como se usa en la presente significa que la expresión de un gen está bajo control de un promotor con el cual se conecta espacialmente. Un promotor se puede ubicar en la posición 5' (anterior) o 3' (posterior) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente igual a la distancia entre ese promotor y el gen que controla en el gen del cual deriva el promotor. Tal como se conoce en la téenica, la variación en esta distancia puede adecuarse sin pérdida de función promotora.
"Promotor" tal como se usa en la presente significa una molécula de origen natural o sintética que es capaz de conferir, activar o mejorar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras transcripcionales específicas para mejorar adicionalmente la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de estas. Un promotor también puede comprender elementos represivos o potenciadores distales, que se pueden ubicar tal como varios miles de pares de base del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor se puede derivar de fuentes que incluyen virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente gen constitutivamente o diferencialmente con respecto a la célula, el tejido u órgano en los que ocurre la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que ocurre la expresión o en respuesta a los estímulos externos tales como los estrés fisiológicos, los patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Los ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor bacteriófago T7, el promotor bacteriófago T3, el promotor SP6, el promotor operador lac, el promotor tac, el promotor tardío SV40, el promotor temprano SV40, el promotor RSV-LTR, el promotor CMV IE, el promotor temprano SV40 o el promotor tardío SV40 y el promotor CMV IE.
"Péptido de señal" y "secuencia líder" se utilizan de manera intercambiable en la presente y hacen referencia a una secuencia de aminoácidos que puede unirse al extremo amino de una proteína del VHB que se establece en la presente. Los péptidos de señal/secuencias líder se dirigen típicamente a la localización de uunnaa pprrootteeíínnaa.. Los péptidos de señal/secuencias líder que se utilizan en la presente facilitan preferentemente la secreción de la proteína a partir de la célula en la que se producen. Los péptidos de señal/secuencias líder por lo general se escinden a partir del resto de la proteína, por lo general se denominan proteína madura tras la secreción desde la célula. Los péptidos de señal/secuencias líder están unidos en el N-terminal de la proteína.
Las "condiciones estrictas de hibridación" tal como se usa en la presente significa las condiciones en las que una primera secuencia de ácido nucleico (por ej., sonda) se hibridará a una segunda secuencia de ácido nucleico (por ej., diana), tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones estrictas son dependientes de secuencias y diferirán en distintas circunstancias. Las condiciones estrictas pueden seleccionarse para que sean de aproximadamente 5-10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en un pH de fuerza iónica definido. La Tm puede ser la temperatura (según concentración nucleica, pH y fuerza iónica definidos) en la que el 50 % de las sondas complementarias a la diana hibridan la secuencia diana en equilibrio (como las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones estrictas pueden ser aquellas en donde la concentración salina es menor a alrededor de 1,0 M de concentración de ion de sodio, tal como alrededor de 0,01- 1,0 M de concentración de ion de sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos alrededor de 30 °C para sondas cortas (por ej., de 10 -50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 °C para sondas largas (por ej., mayor a 50 nucleótidos). Las condiciones estrictas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores tales como la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos de 2 a 10 veces la hibridación antecedente. Los ejemplos de condiciones estrictas de hibridación incluyen los siguientes: 50 % de formamida, 5x SSC y 1 % de SDS, incubar a 42 °C, o 5x SSC, 1 % de SDS, incubar a 65 °C, con lavado en 0.2x SSC y 0.1 % de SDS a 65 °C.
"Básicamente complementario/a", tal como se usa en la presente, significa que una primera secuencia es al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al complemento de una segunda secuencia en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 o más nucleótidos o aminoácidos, o que las dos secuencias se hibridan en condiciones estrictas de hibridación.
"Básicamente idéntico/a", tal como se usa en la presente, significa que una primera y segunda secuencia son al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia.
"Subtipo" o "serotipo" tal como se usan en la presente, indistintamente y con referencia al VHB, significan variantes genéticas de un VHB de modo que un subtipo se reconoce mediante un sistema inmunitario distinto del de otro subtipo.
"Variante" usado en la presente con respecto a un ácido nucleico significa (i) una parte o fragmento de una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia o parte de esta; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico al que se hace referencia o el complemento de este; o (iv) un ácido nucleico que se híbrida en condiciones estrictas al ácido nucleico de la referencia, al complemento de este o a secuencias sustancialmente idénticas a este.
"Variante" con respecto a un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión o sustitución conservadora de aminoácidos, pero conserva al menos una actividad biológica. La variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína a la que se hace referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente con propiedades similares (por ej., hidrofilicidad, grado y distribución de regiones cargadas) se reconoce en la téenica, que típicamente implica una carga menor. Estas cargas menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, según se entiende en la técnica. Kyte et ál., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. En la técnica se conoce que los aminoácidos de índices hidropáticos similares se pueden sustituir y aun retener la función proteica. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilicidad de aminoácidos también se puede usar para revelar sustituciones que resultarían en proteínas que conservan la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite calcular la mayor hidrofilicidad promedio local de ese péptido, una medida útil que, según se informa, se correlaciona bien con la antigenicidad e inmunogenicidad. La patente estadounidense N° 4,554,101, se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad similares puede dar como resultado péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo inmunogenicidad, tal como se entiende en la téenica. Las sustituciones se pueden llevar a cabo con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influenciados por la hebra lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácido que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal como se revela mediante la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades.
El "vector" tal como se usa en la presente significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector viral, bacteriófago, cromosoma artificial bacteriano o cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante, y preferentemente, es un plásmido de ADN. 2. Vacunas La presente invención se orienta a una vacuna contra la hepatitis B. La vacuna contra la hepatitis B (VHB) puede comprender un ácido nucleico que codifica un antígeno central del VHB, un antígeno de superficie del VHB o una combinación de estos; un antígeno central del VHB, un antígeno de superficie del VHB o una combinación de estos, o una combinación de (1) un ácido nucleico que codifica un antígeno central del VHB y/o un antígeno de superficie del VHB y (2) un antígeno central del VHB y/o un antígeno de superficie del VHB o (3) combinaciones de estos. El antígeno central del VHB puede comprender una proteína de consenso derivada de las secuencias de aminoácidos de las proteínas centrales de múltiples genotipos del VHB. De manera similar, el antígeno de superficie del VHB puede comprender una proteína de consenso derivada de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de superficie de múltiples genotipos del VHB. Tales proteínas centrales del VHB de consenso y antígenos de superficie del VHB de consenso son únicas y guardan similitud con los antígenos centrales y de superficie, respectivamente, a través de los múltiples genotipos del VHB. Como tal, la vacuna de la presente invención es aplicable a múltiples tipos del VHB y es útil para las poblaciones en general. Adicionalmente, la vacuna de la presente invención puede ajustarse a ácidos nucleicos particulares que codifiquen la proteína central del VHB de consenso, la proteína de superficie del VHB de consenso o una combinación de estos. En otras palabras, la vacuna de la presente invención puede diseñarse para controlar el nivel o la fuerza de la respuesta inmunitaria en el sujeto contra uno o más serotipos del VHB.
La vacuna puede ser una vacuna de ADN. Se describen vacunas de ADN en las patentes estadounidenses N° 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055 y 5,676,594, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. La vacuna de ADN puede comprender además elementos o reactivos que impiden que se integre al cromosoma.
La vacuna puede ser un ARN de la proteína central del VHB y/o de la proteína del antígeno de superficie del VHB. La vacuna de ARN se puede introducir en la célula. a. Proteína central del VHB La vacuna de la presente invención puede comprender una proteína central del VHB. La proteína central del VHB es diana para la supresión viral inmunológica mediante la inducción de 1) las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL) , 2) las respuestas de los linfocitos T auxiliares y/o 3) las respuestas de los linfocitos B o preferentemente todas las antemencionadas , para presentación cruzada .
La Tabla 2 presenta las similitudes entre los genotipos para el antígeno central de los genotipos VHB-A, VHB-B , VHB-C, VHB-D y VHB-E con las proteínas centrales del VHB de consenso, a las que se hace referencia en el cuadro como "VHB-M-core". Para algunas modalidades, la construcción M Core del VHB se diseñó para tener aumentos de homologías para las dianas de núcleos del VHB. Las similitudes en los genotipos para el antígeno central con construcción de M-Core- diseñada aumentaron las homologías para las dianas de núcleos del VHB. Todos los genotipos deben representarse en una vacuna terapéutica de inmunidad universal para el VHB.
Tabla 2 Porcentaje de identidades de las proteínas centrales del VHB - - - - - - El antígeno puede comprender epítopos de proteínas centrales que los vuelven particularmente eficaces como inmunógenos frente a los cuales se puede inducir respuestas inmunitarias anti-VHB. El antígeno del VHB puede comprender el producto de traducción de longitud total, una variante de este, un fragmento de este o una combinación de estos.
El antígeno central del VHB puede comprender una proteína de consenso. El antígeno central de consenso del VHB induce respuestas de un alto valor de anticuerpos y linfocitos T específicos para el antígeno, tanto a nivel sistémico como en el hígado. Como tal, se proporciona una respuesta inmunitaria protectora al hígado mediante vacunas que comprenden el antígeno central de consenso del VHB. Por consiguiente, cualquier usuario puede diseñar una vacuna de la presente invención para que incluya un antígeno central de consenso del VHB para proporcionar tratamiento inmunológico y/o protección al hígado.
Particularmente en la respuesta inmunitaria inducida, el antígeno central de consenso del VHB estimula los esplenocitos, específicamente los linfocitos T CD4+ y CD8+, para que segreguen o produzcan cantidades similares de interferón gamma (INF-g), pero diferentes cantidades de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Resulta interesante que la respuesta inmunitaria inducida es diferente en el bazo que en el hígado. En el bazo, los linfocitos T CD8+ producen más INF-g y TNF-a que los linfocitos CD4+, sin embargo, en el hígado ocurre lo contrario. En otras palabras, los linfocitos CD4+ producen más INF-g y TNF-a que los linfocitos CD8+ en el hígado. Adicionalmente, en el hígado, se produce más IgA específico para el antígeno que IgG y la respuesta inmunitaria protectora, sorpresiva e inesperadamente, incluye una respuesta CTL específica para el antígeno, que no causa daño hepático. Por consiguiente, una vacuna de la presente invención que comprende un antígeno central de consenso del VHB puede administrarse en la periferia para establecer una especificidad para el antígeno dirigida al hígado para eliminar las células infectadas con VHB sin causar daño o inflamación al hígado.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas centrales del VHB de consenso son las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. La SEQ ID NO:1 codifica una proteína central de consenso del VHB. La SEQ ID NO:3 codifica la proteína central de consenso del VHB unida a una líder IgE La SEQ ID NO:5 codifica la proteína central de consenso del VHB unida a la líder IgE y a una etiqueta HA.
Algunas modalidades se relacionan con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas idénticas u homologas a la proteína de consenso del VHB, fragmentos inmunogénicos de la proteína de consenso del VHB y fragmentos de las proteínas homologas. Pueden proporcionarse tales moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen hasta 95 % de identidad con la longitud total de las secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso, hasta 96 % de identidad con la longitud total de las secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso, hasta 96 % de identidad con la longitud total de las secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso, hasta 97 % de identidad con la longitud total de las secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso, hasta 98 % de identidad con la longitud total de las secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso y hasta 99 %.
Asimismo, también se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican los fragmentos inmunogénicos establecidos en la presente y los fragmentos inmunogénicos de proteínas idénticas a las proteínas establecidas en la presente.
Algunas modalidades se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas que tienen 95 % de homología con las secuencias que codifican ácidos nucleicos en la presente. Algunas modalidades se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas que tienen 96 % de homología con las secuencias que codifican ácidos nucleicos en la presente. Algunas modalidades se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas que tienen 97 % de homología con las secuencias que codifican ácidos nucleicos en la presente. Algunas modalidades se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas que tienen 98 % de homología con las secuencias que codifican ácidos nucleicos en la presente. Algunas modalidades se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas que tienen 99 % de homología con las secuencias que codifican ácidos nucleicos en la presente. En algunas modalidades, las moléculas de ácidos nucleicos con secuencias de codificación descritas en la presente que son homologas con una secuencia de codificación de una proteína consenso descrita en la presente incluyen secuencias que codifican una secuencia líder IgE unida al extremo 51 de la secuencia de codificación que codifica las secuencias de la proteína homologa descritas en la presente.
Algunas modalidades se relacionan con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas con un porcentaje particular de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la proteína de consenso central del VHB de longitud completa, fragmentos inmunogénicos de la proteína de consenso central del VHB y fragmentos inmunogénicos de las proteínas de consenso centrales del VHB. Pueden proporcionarse tales moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen hasta 80 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 85 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso de longitud completa, hasta 90 de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 91 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 92 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 93 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 94 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa, hasta 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso central del VHB de longitud completa. Asimismo, también se proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican los fragmentos inmunogénicos establecidos en la presente y los fragmentos inmunogénicos de proteínas con porcentajes de identidad similares, tal como se indicó anteriormente, a las proteínas centrales del VHB establecidas en la presente.
Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 80 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 83 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 85 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 90 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 91 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 92 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 93 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 94 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína inmunogénica que tiene 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican la proteína central del VHB de longitud completa de la presente. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico con secuencias de codificación descritas en la presente que son homologas con una secuencia de codificación de una proteína central del VHB de consenso descrita en la presente incluyen secuencias que codifican una secuencia líder IgE unida al extremo 5' de la secuencia de codificación que codifica las secuencias de la proteína homologa descritas en la presente.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico carece de una secuencia de codificación que codifique una secuencia líder. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico carece de una secuencia de codificación que codifique la líder IgE.
Algunas modalidades se relacionan con fragmentos de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. Los fragmentos pueden ser de al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. Los fragmentos pueden ser al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idénticos a los fragmentos de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. Los fragmentos pueden ser al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad a los fragmentos de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. En algunas modalidades, los fragmentos incluyen una secuencia que codifica a una secuencia líder, tal como por ejemplo, una líder de inmunoglobulina, tal como la líder IgE. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de secuencias de codificación que codifiquen una secuencia líder. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de secuencias de codificación que codifiquen una secuencia líder, tal como por ejemplo, la líder IgE.
Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína central del VHB de consenso es SEQ ID NO:2. La secuencia de aminoácidos de la proteína central del VHB de consenso unida a la líder IgE es la SEQ ID NO:4. Particularmente, en la SEQ ID NO:4, la líder IgE se une al extremo amino de la proteína central del VHB de consenso. La secuencia de aminoácidos de la proteína central del VHB de consenso unida al líder IgE y una etiqueta HA es SEQ ID NO:6. En la SEQ ID NO:6, la líder IgE y la etiqueta HA se unen a los extremos amino y carboxi, respectivamente, de la proteína central del VHB de consenso.
Algunas modalidades se relacionan con proteínas que son homologas a las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 95 % de homología con las secuencias de proteína de consenso, tal como se establece en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 96 % de homología con las secuencias de proteína de consenso, tal como se establece en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas, inmunogénicas que tienen 97% de homología con las secuencias de proteína de consenso, tal como se establece en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 98% de homología con las secuencias de proteína de consenso, tal como se establece en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 99% de homología con las secuencias de proteína de consenso, tal como se establece en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 O SEQ ID NO:6.
Algunas modalidades se relacionan con proteínas que son idénticas a las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 80 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 85 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 90 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 91 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 92 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 93 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 94 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 96 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 97 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 99 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.
En algunas modalidades, la proteína carece de una secuencia líder. En algunas modalidades, la proteína carece de la líder IgE. Los fragmentos de proteínas de consenso pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de una proteína de consenso. Pueden proporcionarse los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Los fragmentos de proteínas de consenso pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. En algunas modalidades, los fragmentos incluyen una secuencia líder, tal como por ejemplo, una líder de inmunoglobulina, tal como la líder IgE. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de una secuencia líder. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de una secuencia líder, tal como por ejemplo, la líder IgE.
Pueden proporcionarse fragmentos inmunogénicos de proteínas con secuencias de aminoácidos homologas a los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Tales fragmentos inmunogénicos pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las proteínas que son 95 % homologas a las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Algunas modalidades se refieren a fragmentos inmunogénicos que tienen 96 % de homología con los fragmentos inmunogénicos de secuencias de proteína de consenso en la presente. Algunas modalidades se refieren a fragmentos inmunogénicos que tienen 97 % de homología con los fragmentos inmunogénicos de secuencias de proteína de consenso en la presente. Algunas modalidades se refieren a fragmentos inmunogénicos que tienen 98 % de homología con los fragmentos inmunogénicos de secuencias de proteína de consenso en la presente. Algunas modalidades se refieren a fragmentos inmunogénicos que tienen 99 % de homología con los fragmentos inmunogénicos de secuencias de proteína de consenso en la presente. En algunas modalidades, los fragmentos incluyen una secuencia líder, tal como por ejemplo, una líder de inmunoglobulina, tal como la líder IgE. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de una secuencia líder. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de una secuencia líder, tal como por ejemplo, la líder IgE.
Pueden proporcionarse fragmentos inmunogénicos de proteínas con secuencias de aminoácidos idénticas a los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6. Tales fragmentos inmunogénicos pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las proteínas que son 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos que se establecen en las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. En algunas modalidades, los fragmentos incluyen una secuencia líder, tal como por ejemplo, una líder de inmunoglobulina, tal como la líder IgE. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de una secuencia líder. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de una secuencia líder, tal como por ejemplo, la líder IgE.
Tal como se hace referencia en la presente respecto a la unión de un péptido de señal o secuencia líder al N-terminal de una proteína, el péptido de señal/secuencia líder remplaza la metionina del N-terminal de una proteína que es codificada por el codón de inicio de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína sin una secuencia de codificación de péptido de señal. Por lo tanto, por ejemplo, la SEQ ID NO:4 es SEQ ID NO:2 con la secuencia líder/péptido de señal unida al N-terminal de la SEQ ID NO:2, es decir, la SEQ ID NO:4 es una proteína que comprende un péptido de señal unido al N-terminal de la SEQ ID NO:2. El primer residuo en la SEQ ID NO:2, "Xaa", normalmente es metionina cuando no hay ningún péptido de señal presente. Sin embargo, las proteínas que comprenden péptidos de señal unidos a SEQ ID NO:2, tal como SEQ ID NO:4, remplazan la metionina de residuo 1 en Xaa con el residuo que une el péptido de señal a una proteína. Por consiguiente, el residuo de N-terminal de la SEQ ID NO:2 puede ser cualquiera pero si se encuentra codificado por una secuencia de inicio es metionina. El enlace de la secuencia líder/péptido de señal en el N-terminal de la SEQ ID NO:2 normalmente elimina la metionina del N-terminal. Tal como se usa en la presente, se pretende que la SEQ ID NO:4 comprenda SEQ ID NO:2 con un péptido de señal/secuencia líder unido al N-terminal de SEQ ID NO:2, sin perjuicio de la supresión del residuo Xaa del N-terminal de SEQ ID NO:2. De manera similar, las secuencias codificantes para SEQ ID NO:4 comprenden secuencias codificantes para SEQ ID NO:2 con secuencias codificantes para un péptido de señal/secuencia líder unido al extremo 5' de las secuencias codificantes que codifican SEQ ID NO:2. El codón de inicio puede ser el "nnn" en las secuencias de codificación para la SEQ ID NO:2 pero se elimina cuando las secuencias de codificación para un péptido de señal/secuencia líder están unidas al extremo 5' de las secuencias de codificación que codifican la SEQ ID NO:2. Tal como se utiliza en la presente, se pretende que las secuencias de codificación para la SEQ ID NO:4 comprendan secuencias de codificación para la SEQ ID NO:2 con secuencias de codificación para un péptido de señal/secuencia líder unido al extremo 5' de las secuencias de codificación de SEQ ID NO:2 cuando ocurre nnn. Por lo tanto, por ejemplo, se pretende que SEQ ID NO:3 comprende SEQ ID NO:1 con secuencias codificantes para un péptido de señal/secuencia líder unido al extremo 5' de SEQ ID NO:1, en lugar del nnn. En algunas modalidades, el nnn es un codón de iniciación en el extremo 5' de SEQ ID NO:1. b. Antígeno de superficie del VHB La vacuna puede comprender un antígeno de superficie del VHB. En la presente se proporcionan antígenos de superficie del VHB capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos del VHB. Los antígenos de superficie pueden comprender epítopos de proteínas de superficie que los vuelven particularmente eficaces como inmunógenos frente a los cuales se puede inducir respuestas inmunitarias anti-VHB. El antígeno de superficie del VHB puede comprender el producto de traducción de longitud total, una variante de este, un fragmento de este o una combinación de estos.
El antígeno de superficie del VHB puede comprender una proteína de consenso. Los antígenos de superficie del VHB de consenso se generaron las secuencias de antígenos de superficie de aislados primarios del VHB ya sea del genotipo A o C. Particularmente, los antígenos de superficie del VHB de consenso incluye la proteína S o la combinación de la proteína S, pre-S2 y pre-Sl (Figuras 3 y 4). Se introdujeron sitios de escisión endoproteolíticos en los antígenos de superficie del VHB de consenso para proporcionar un plegamiento adecuado de proteínas y un mejor procesamiento de CTL. El uso de codones en los antígenos de superficie del VHB de consenso se modificó para reflejar la tendencia a los codones de los genes humanos. Adicionalmente, se evitaron las regiones de contenido GC muy alto (por ejemplo, mayores que 80 por ciento) y muy bajo (por ejemplo, menor que 30 por ciento) así como también motivos que actúan en cis, tales como cajas TATA internas, secuencias repetitivas y secuencias estructuradas. Se introdujo una secuencia Kozak en los antígenos de superficie del VHB de consenso para aumentar el inicio de traducción y se agregó una secuencia líder IgE para aumentar la expresión de proteínas.
La secuencia de ácido nucleico que codifica los antígenos de superficie del VHB de consenso son las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:15. La SEQ ID NO:9 codifica una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso larga derivada del genotipo A y que incluye la proteína S, pre-S2, y pre-Sl (LHBs-A). La SEQ ID NO:11 codifica una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso larga derivada del genotipo C y que incluye la proteína S, pre-S2 y pre-Sl (LHBs-C). La SEQ ID NO:13 codifica una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso corta derivada del genotipo A y que incluye la proteína S (SHBs-A). La SEQ ID NO:15 codifica una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso corta derivada del genotipo C y que incluye la proteína S (SHBs-C).
Algunas modalidades se relacionan con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas idénticas en la longitud total de la secuencia de aminoácidos de los antígenos de superficie del VHB de consenso, los fragmentos inmunogénicos de los antígenos de superficie del VHB de consenso y los fragmentos inmunogénicos de proteínas idénticas. Por lo tanto, pueden proporcionarse moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen hasta 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de antígeno de superficie del VHB de consenso, hasta 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de antígeno de superficie del VHB de consenso, hasta 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de antígeno de superficie del VHB de consenso, hasta 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de antígeno de superficie del VHB de consenso, hasta 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de antígeno de superficie del VHB de consenso y hasta 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de antígeno de superficie del VHB de consenso. De manera similar, se proporcionan las secuencias de ácido nucleico que codifican los fragmentos inmunogénicos que se establecen en la presente y los fragmentos inmunogénicos de proteínas idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de antígeno de superficie del VHB que se establecen en la presente.
Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de la presente. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico con secuencias de codificación que se describen en la presente que son idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de codificación de una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso descrita en la presente incluyen secuencias que codifican una secuencia líder IgE unida al extremo 5' de la secuencia de codificación que codifica las secuencias de proteínas idénticas descritas en la presente.
Algunas modalidades se relacionan con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas con un porcentaje particular de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la proteína de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, fragmentos inmunogénicos de la proteína de consenso del antígeno de superficie del VHB y fragmentos inmunogénicos de las proteínas de consenso del antígeno de superficie del VHB. Pueden proporcionarse tales moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen hasta 80 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 85 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 90 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 91 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 92 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 93 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 94 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa, hasta 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso del antígeno de superficie del VHB de longitud completa. De manera similar, también se proporcionan las secuencias de ácido nucleico que codifican los fragmentos inmunogénicos que se establecen en la presente y los fragmentos inmunogénicos de proteínas con porcentajes similares de identidad, tal como se indicó anteriormente, con las proteínas de antígeno de superficie del VHB que se establecen en la presente.
Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 80 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 83 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 85 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 90 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 91 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 92 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 93 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 94 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. Algunas modalidades se relacionan con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas inmunogénicas que tienen 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias que ácido nucleico que codifican el antígeno de superficie del VHB de longitud completa de la presente. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico con secuencias de antígeno de superficie del VHB de codificación que se describen en la presente que son idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de codificación de una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso descrita en la presente incluyen secuencias que codifican una secuencia líder IgE unida al extremo 5' de la secuencia de codificación que codifica las secuencias de proteínas idénticas descritas en la presente.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico carece de una secuencia de codificación que codifique una secuencia líder. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico carece de una secuencia de codificación que codifique la líder IgE.
Algunas modalidades se relacionan con fragmentos de las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:15. Los fragmentos pueden ser al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15. Los fragmentos pueden ser al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idénticos a los fragmentos de las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15. Los fragmentos pueden tener al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad a los fragmentos de las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO:15. En algunas modalidades, los fragmentos incluyen una secuencia que codifica a una secuencia líder, tal como por ejemplo, una líder de inmunoglobulina, tal como la líder IgE. En algunas modalidades, los fragmentos carecen de secuencias de codificación que codifiquen una secuencia líder En algunas modalidades, los fragmentos carecen de secuencias de codificación que codifiquen una secuencia líder, tal como la líder IgE.
Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos de los antígenos de superficie del VHB de consenso, LHBs-A, LHBs-C, SHBs-A y SHBs-C, son las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:16, respectivamente.
Las proteínas pueden ser idénticas a las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 95 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 96 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 97 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 98 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con las proteínas inmunogénicas que tienen 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de proteína de consenso de la presente.
Algunas modalidades se relacionan con proteínas que son idénticas a las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 80 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 85 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 90 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 91 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 92 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 93 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 94 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 O SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 96 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 97 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 O SEQ ID NO:16.
Algunas modalidades se relacionan con proteínas inmunogénicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es 99 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de consenso de longitud completa, tal como se establecen en las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:16.
Los fragmentos de proteínas de consenso pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de una proteína de consenso. Pueden proporcionarse los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:16. Los fragmentos inmunogénicos pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO : 14 o SEQ ID NO : 16 .
Pueden proporcionarse fragmentos inmunogénicos de proteínas con secuencias de aminoácidos idénticas a los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16. Tales fragmentos inmunogénicos pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las proteínas que son 95 % idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16.
Pueden proporcionarse fragmentos inmunogénicos de proteínas con secuencias de aminoácidos idénticas a los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16. Tales fragmentos inmunogénicos pueden comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 % o al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de las proteínas que son 95 % idénticas a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16. Algunas modalidades se relacionan con fragmentos inmunogénicos que tienen 96 % de identidad con los fragmentos inmunogénicos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con fragmentos inmunogénicos que tienen 97 % de identidad con los fragmentos inmunogénicos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con fragmentos inmunogénicos que tienen 98 % de identidad con los fragmentos inmunogénicos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. Algunas modalidades se relacionan con fragmentos inmunogénicos que tienen 99 % de identidad con los fragmentos inmunogénicos de las secuencias de proteína de consenso de la presente. c. Combinación de los antígenos de superficie y centrales del VHB La vacuna puede comprender una combinación de antígenos de superficie y centrales del VHB como se describió anteriormente. Esta combinación de antígenos del VHB es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos del VHB. La vacuna se puede diseñar o preparar para que tenga una combinación particular de antígenos del VHB, lo que a su vez, proporciona capacidad de controlar el nivel o la resistencia de una respuesta inmunitaria en el mamífero.
Las combinaciones pueden comprender uno o más ácidos nucleicos que codifican (1) VHB-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C, y SHBs-C; (2) VHB-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, y LHBs-C; (3) VHB-M-Core, LHBs-A, y SHBs-A; (4) VHB-M-Core y LHBs-A; (5) VHB-M-Core, SHBs-A, LHBs-C, y SHBs-C; (6) VHB-M-Core, LHBs-C, y SHBs-C; (7) VHB-M-Core y SHBs-C; (8) VHB-M-Core, LHBs-A, LHBs-C, y SHBs-C; (9) VHB-M-core, LHBs-A, y SHBs-C; (10) VHB-M-Core y SHBs-C; (11) VHB-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, y SHBs-C; (12) VHB-M-Core, LHBs-A, y SHBs-C; (13) VHB-M-Core, SHBs-A, y SHBs-C; (14) LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C, y SHBs-C; (15) LHBs-A, SHBs-A, y LHBs-C; (16) LHBs-A y SHBs-A; (17) SHBs-A, LHBs-C, y SHBs-C; (18) LHBs-C y SHBs-C; (19) LHBs-A, LHBs-C, y SHBs-C; (20) LHBs-A y SHBs-C; (21) LHBs-A, SHBs-A, y SHBs-C; (22) LHBs-A y SHBs-C; (23) SHBs-A y SHBs-C; (24) VHB-M-Core y SHBs-A; (25) VHB-M-Core, LHBs-A y LHBs-C; o (26) LHBs-A y LHBs-C.
Una modalidad de ejemplo se refiere a una vacuna que incluye uno o más ácidos nucleicos que codifican VHB-M-Core, LHBs-A y LHBs-C. Otra modalidad de ejemplo se refiere a una vacuna que incluye uno o más ácidos nucleicos que codifican VHB-M-Core, SHBs-A y SHBs-C. Aun otra modalidad de ejemplo se refiere a una vacuna que incluye uno o más ácidos nucleicos que codifican VHB-M-Core, LHBs-A y LHBs-C, y un adyuvante tal como IL-12.
La vacuna combinada también comprende una o más proteínas centrales del VHB de consenso y/o una proteína de antígeno de superficie del VHB en forma de una o más subunidades proteicas, una o más partículas virales inactivas que comprenden una o más proteínas centrales del VHB de consenso y/o una proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso, o una o más partículas virales atenuadas que comprenden una o más proteínas centrales del VHB de consenso y/o una proteína de antígeno de superficie del VHB. Las vacunas atenuadas pueden ser vacunas vivas atenuadas, vacunas inactivadas y vacunas que utilizan vectores recombinantes para la administración de genes exógenos que codifican uno o más proteínas centrales del VHB de consenso y/o de proteínas de antígeno de superficie del VHB, así como también vacunas de subunidades y glicoproteínas. Los ejemplos de vacunas vivas atenuadas, aquellas que utilizan vectores recombinantes para la administración de antígenos extraños, vacunas de subunidades y vacunas de glicoproteínas se describen en las patentes estadounidenses N.°: 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 y 6,589,529, que se incorporan en la presente mediante esta referencia. d. Construcciones de vacunas y plásmidos La vacuna puede comprender construcciones de ácido nucleico o plásmidos que codifican las proteínas centrales del VHB , los antígenos de superficie del VHB y las combinaciones de las proteínas centrales/antígenos de superficie del VHB. Se proporcionan en la presente construcciones genéticas que pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno nuclear del VHB que se describe en la presente, lo que incluye las secuencias de la proteína consenso, secuencias homologas a las secuencias de la proteína consenso, fragmentos de secuencias de la proteína consenso y secuencias homologas a fragmentos de secuencias de la proteína consenso. Adicionalmente, se proporcionan en la presente construcciones genéticas que pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno nuclear del VHB que se describe en la presente, lo que incluye las secuencias de la proteína consenso, secuencias homologas a las secuencias de la proteína consenso, fragmentos de secuencias de la proteína consenso y secuencias homologas a fragmentos de secuencias de la proteína consenso. La construcción genética puede estar presente en la célula como una molécula extracromosómica funcional. La construcción genética puede ser un minicromosoma lineal que incluye centromeros, telómeros o plásmidos, o cósmidos.
La construcción génica también puede ser parte de un genoma de un vector viral recombinante, lo que incluye un adenovirus recombinante, un virus asociado al adenovirus recombinante y a la vaccinia recombinante. La construcción génica puede ser parte del material genético en organismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que viven en las células.
Las construcciones genéticas pueden comprender elementos reguladores para la expresión génica del ácido nucleico de las secuencias codificantes del ácido nucleico. Los elementos reguladores pueden ser un promotor, un potenciador, un codón de inicio, un codón de terminación o una señal de poliadenilación.
Las secuencias de ácido nucleico pueden formar una construcción genética que puede ser un vector. El vector puede ser capaz de expresar un antígeno en la célula de un mamífero en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el mamífero. El vector puede ser recombinante. El vector puede comprender ácido nucleico heterólogo que codifica el antígeno. El vector puede ser un plásmido. El vector puede ser útil para transfectar células con el ácido nucleico que codifica un antígeno, la célula hospedadora transformada se cultiva y mantiene en condiciones donde se produce la expresión del antígeno.
Las secuencias codificantes pueden optimizarse para la estabilidad y niveles elevados de expresión. En algunos casos, los codones se seleccionan para que reduzcan la formación de la estructura secundaria del ARN, como aquella que se forma debido a los enlaces intramoleculares.
El vector puede comprender un ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno y puede comprender adicionalmente un codón de iniciación, que puede ser anterior a la secuencia codificante de antígenos y un codón de terminación, que puede ser posterior a la secuencia codificante de antígenos. Los codones de inicio y de terminación pueden estar en el mismo marco que la secuencia codificante de antígenos. El vector también puede comprender un promotor que se encuentra unido operativamente a la secuencia codificante de antígenos. El promotor unido operativamente a la secuencia codificante de antígenos puede ser un promotor del virus del simio 40 (SV40), un promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), un promotor del virus de inmunodeficiencia humana (V1H), como el promotor del virus de inmunodeficiencia bovina (BIV) de repetición terminal larga (LTR), un promotor del virus de Moloncy, un promotor del virus de la leucosis aviar (ALV), un promotor del citomegalovirus (CMV), como el promotor temprano inmediato del CMV, un promotor del virus de Epstein Barr (EBV) o un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV). El promotor también puede ser un promotor de un gen humano, como la actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o metalotioneína humana. El promotor también puede ser un promotor de tejido específico, tal como un promotor de un músculo o piel específico, natural o sintético. Los ejemplos de los promotores se describen en la publicación de la solicitud de patente estadounidense número US20040175727, cuyo contenido se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
El vector también puede comprender una señal de poliadenilación, que puede ser posterior a la proteína central del VHB que codifica la secuencia. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación SV40, señal de poliadenilación LTR, señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (bGH), señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano (hGH) o señal de poliadenilación de la b-globina humana. La señal de poliadenilación SV40 puede ser una señal de poliadenilación de un vector pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
El vector puede comprender también un potenciador anterior de la secuencia de codificación de la proteína central del VHB de consenso o secuencia de codificación de la proteína de antígeno de superficie del VHB de consenso. El potenciador puede ser necesario para la expresión del ADN. El potenciador puede ser una actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o un potenciador viral, como uno de CMV, HA, RSV o EBV. Las mejoras de la función de polinucleótidos se describen en la patente estadounidense N.° 5,593,972, 5,962,428 y W094/016737, cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
El vector también puede comprender un origen de replicación mamífero para mantener el vector extracromosómico y producir copias múltiples del vector en una célula. El vector puede ser pVAXl, pCEP4 o pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA), que pueden comprender el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región codificadora del antígeno nuclear EBNA-1, que puede producir una replicación episomal de alta reproducción sin integración. El vector puede ser pVAXl o una variante de pVaxl con cambios tal como el plásmido variante que se describe en la presente. El plásmido de la variante de pVaxl es una variante de 2998 pares de bases del plásmido del vector de estructura pVAXl (Invitrogen, Carlsbad CA). El promotor CMV está ubicado en las bases 137-724. El promotor/sitio de cebador T7 está ubicado en las bases 664-683. Los múltiples sitios de clonación se encuentran en las bases 696-811. La señal de poliadenilación de la GH bovina ocurre en las bases 829-1053 El gen de resistencia a la kanamicina está ubicado en las bases 1226-2020. El origen pUC se encuentra en las bases 2320-2993.
Basándose en la secuencia de pVAXl, disponible en Invitrogen, se encontraron las siguientes mutaciones en la secuencia de pVAXl que se utilizó como la estructura principal para los plásmidos 1-6 establecidos en la presente: C>G241 en el promotor CMV C>T 1942 estructura principal, posterior a la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (bGHpolyA) A> - 2876 estructura principal, posterior al gen de la kanamicina C>T 3277 en la mutación del número de copia alta del origen de replicación pUC (Ori) (véase Nucleic Acid Research 1985) G>C 3753 en el propio extremo del pUC Ori anterior al sitio R ASeH Los pares de base 2, 3 y 4 cambian de ACT a CTG en la estructura principal, posterior del promotor CMV.
La estructura principal del vector puede ser pAV0242. El vector puede ser un vector del adenovirus tipo 5 de replicación defectuosa (Ad5).
El vector también puede comprender una secuencia reguladora, que puede ser adecuada para la expresión génica en una célula de mamífero o humana a la que se administra el vector. La secuencia de codificación del VHB de consenso puede comprender un codón, lo que puede permitir una transcripción más eficaz de la secuencia de codificación en la célula hospedadora.
El vector puede ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), el cual se puede usar para la producción de proteínas en Escherichia coli (E.coli). El vector también puede ser pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), el cual se puede utilizar para la producción de proteínas en cepas de levadura de Saccharomyces cerevisiae. El vector también puede ser del sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Calif.), el cual se puede usar para la producción de proteínas en células de insectos. El vector también puede ser pcADN I o pcADN3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), el cual se puede usar para la producción de proteínas en células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO). El vector puede ser vectores o sistemas de expresión para producir proteínas mediante téenicas de rutina y materiales de partida fácilmente disponibles, que incluyen Sambrook et ál., Molecular Cloning and Laboratory Manual , segunda ed. Coid Spring Harbor (1989), que se incorpora completamente mediante esta referencia.
En algunas modalidades el vector puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21. La SEQ ID NO:17 codifica una proteína central del VHB y la SEQ ID NOS:18-21 codifica un antígeno de superficie del VHB de consenso. Los mapas del vector de las SEQ ID NOS:17-21 se muestran en las Figuras 5-9, respectivamente. e. Composiciones farmaceuticas de la vacuna La vacuna puede estar en forma de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender la vacuna.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender aproximadamente 5 nanogramos y aproximadamente 10 mg del ADN de la vacuna. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden aproximadamente 25 nanogramos y aproximadamente 5 mg de ADN de la vacuna. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 50 nanogramos y aproximadamente 1 mg de ADN. En algunas modalidades, las composiciones f rmacéuticas contienen aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 1 y aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 5 y aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 10 y aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 15 y aproximadamente 150 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 20 y aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 25 y aproximadamente 75 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 30 y aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 35 y aproximadamente 40 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente 10 microgramos y aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente 20 microgramos y aproximadamente 80 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente 25 microgramos y aproximadamente 60 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente 30 nanogramos y aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente 35 nanogramos y aproximadamente 45 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 mmiiccrrooggrraammooss ddee AADDNN.. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 1 y aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 25 y aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 y aproximadamente 200 microgramos de ADN.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nanogramos del ADN de la vacuna. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895.900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos del ADN de la vacuna. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender al menos 1,5,, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9 ,5 o 10 nanogramos del ADN de la vacuna.
En otras modalidades, la composición farmacéutica puede comprender inclusive hasta 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 95 o 100 nanogramos del ADN de la vacuna. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender inclusive hasta 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 1 ), 115, 120, 125 , 130, 135, 140 , 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos del ADN de la vacuna. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender hasta 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 nanogramos del ADN de la vacuna.
La composición farmacéutica puede comprender además otros agentes a los fines de la formulación de acuerdo con el modo de administración que se utilice. En los casos en que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, estas son estériles, libres de pirógeno y libres de partículas. De preferencia, se utiliza una formulación isotónica. En general, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir clorhidrato de sodio, dextrosa, manitol, sorbítol y lactosa. En algunos casos, se prefieren las soluciones isotónicas tal como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina En algunas modalidades, se agrega a la formulación un agente de vasoconstricción.
La vacuna puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser moléculas funcionales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente que facilita la transíección, que puede incluir agentes activos en la superficie, tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona, vesículas tales como escualeno y escualeno, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas u otros agentes conocidos que facilitan la transfección.
El agente que facilita la transfección es un polianión, policatión, el cual incluye poli-L-glutamato (LGS) o lípido. El agente que facilita la transfección es poli-L-glutamato y, más preferentemente, el poli-L-glutamato está presente en la vacuna en una concentración menor de 6 mg/ml. El agente que facilita la transfección también puede incluir agentes activos en la superficie, como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y también se puede usar ácido hialurónico administrado junto con la construcción génica. En algunas modalidades, las vacunas del vector de ADN también pueden incluir un agente que facilita la transfección, como lípidos, liposomas, incluidos los liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la téenica, como una mezcla de ADN y liposomas (véase, por ejemplo, W09324640), iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas u otros agentes conocidos que facilitan la transfección. Preferentemente, el agente que facilita la transfección es un polianión, policatión, incluyendo poli-L-glutamato (LGS) o lípido. La concentración del agente de transfección en la vacuna es inferior a 4 mg/ml, inferior a 2 mg/ml, inferior a 1 mg/ml, inferior a 0,750 mg/ml, inferior a 0,500 mg/ml, inferior a 0,250 mg/ml, inferior a 0,100 mg/ml, inferior a 0,050 mg/ml o inferior a 0,010 mg/ml.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante. El adyuvante puede ser otros genes que se expresan en otro plásmido o se administran como proteínas en combinación con el plásmido mencionado anteriormente en la vacuna. El adyuvante se puede seleccionar del grupo que consiste en: a-interferón(IFN- a), b-interferón (IFN-b), y-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), TNFa, TNRb, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), quimiocina que atrae linfocitos T cutáneos (CTACK, por sus siglas en inglés), quimiocina expresada por el timo epitelial (TECK, por sus siglas en inglés), quimiocina epitelial asociada a las mucosas (MEC, por sus siglas en inglés), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86 lo que incluye IL-15 que presenta la secuencia de señal eliminada e incluye opcionalmente el péptido de señal de IgE. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNRb, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 o una combinación de estos. En una modalidad de ejemplo, el adyuvante es IL-12.
Otros genes que pueden ser adyuvantes útiles incluyen aquellos que codifican: MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta al interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, LIGANDO RANK, 0x40, LIGANDO 0x40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de estos, f. Métodos de administración de la vacuna En la presente se proporciona un método para administrar las formulaciones farmacéuticas con el fin de proporcionar construcciones genéticas y proteínas de la proteína central del VHB y/o antígeno de superficie del VHB que comprende epítopos que hacen que sean inmunógenos particularmente eficaces contra los cuales se puede inducir una respuesta inmunitaria frente a las infecciones virales del VHB. El método de administración de la vacuna, o la vacunación, se puede proporcionar para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica y/o profiláctica. El proceso de vacunación puede generar una respuesta inmunitaria en el mamífero contra múltiples genotipos del VHB. La vacuna se puede administrar a un individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del mamífero y potenciar la respuesta inmunitaria La administración de la vacuna puede ser la transfección del antígeno de HA como una molécula de ácido nucleico que se expresa en la célula y se administra a la superficie de la célula sobre la que el sistema inmunitario reconoció e indujo una respuesta celular, humoral o celular y humoral. La administración de la vacuna se puede utilizar para inducir o provocar una respuesta inmunitaria en mamíferos contra múltiples virus del VHB administrando la vacuna a los mamíferos como se indica en la presente.
Tras la aplicación de la vacuna a un mamífero y luego de que el vector se encuentre en las células del mamífero, los linfocitos transíectados expresarán y segregarán la proteína central del VHB de consenso y el antígeno de superficie del VHB de consenso. Estas proteínas segregadas o antígenos sintéticos serán identificados como extraños por el sistema inmunitario, que preparará una respuesta inmunitaria que puede incluir: anticuerpos hechos contra los antígenos y respuestas de la célula T específicamente contra el antígeno.
En algunos ejemplos, un mamífero vacunado con las vacunas que se indican en la presente tendrá un sistema inmunitario preparado y cuando se lo somete a prueba con una cepa viral del VHB, el sistema inmunitario preparado permitirá la supresión más rápido de los virus del VHB posteriores, ya sea a través de inmunidad humoral, celular o ambas. La vacuna se puede administrar a un individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del individuo y, por lo tanto, potenciar su respuesta inmunitaria.
Los métodos para administrar el ADN de la vacuna se describen en las patentes estadounidenses N.° 4,945,050 y 5,036,006, las cuales se incorporar en la presente en su totalidad mediante esta referencia.
La vacuna se puede aplicar a un mamífero para provocar una respuesta inmunitaria en él. El mamífero puede ser humano, primate no humano, vaca, cerdo, oveja, cabra, antílope, bisonte, búfalo de agua, bóvidos, ciervo, erizos, elefantes, llama, alpaca, ratones, ratas y gallinas, y preferentemente seres humanos, vaca, cerdo o gallina. g. Administración de la vacuna con adyuvantes Las composiciones farmacéuticas, preferentemente las vacunas que se describen en la presente, se pueden administrar en combinación con proteínas o genes que codifican adyuvantes, que pueden incluir: a- interf erón ( IFN-a) , b-interferón (IFN-b) , g- interf erón, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , TNFa, TNRb, GM-CSF, factor de crecimiento epidermico (EGF) , IL-1, IL-2 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95 , PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2 , LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4 , formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF , Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3 , TRAMP , Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 , DR5 , KILLER, TRAIL-R2 , TRICK2 , DR6 , Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2 , p38 , p65Rel, MyD88 , IRAK, TRAF6 , IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta al interf erón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec , TRAILrecDRC5 , TRAIL-R3, TRAIL-R4 , RANK, LIGANDO RANK, 0x40, LIGANDO 0x40 , NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1 o TAP2 o fragmentos funcionales de estos. En una modalidad de ejemplo, el adyuvante es IL-12. h. Método para generar una respuesta inmunitaria con la vacuna La vacuna se puede utilizar para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, lo que incluye una respuesta inmunitaria terapéutica oo pprrooffiillááccttiiccaa.. La respuesta inmunitaria puede generar anticuerpos y/o linfocitos T asesinos que son dirigidos al antígeno central del VHB, antígeno de superficie el VHB o combinación de estos. Los anticuerpos y linfocitos T se pueden aislar.
Algunas modalidades proporcionan métodos para generar respuestas in unitarias contra las proteínas centrales del VHB, proteínas del antígeno de superficie del VHB y la combinación de estos, los cuales comprenden la administración de la vacuna a un individuo. Algunas modalidades proporcionan métodos para vacunar en forma profiláctica a un individuo contra la infección por VHB, los cuales comprenden la administración de la vacuna. Algunas modalidades proporcionan métodos para vacunar en forma terapéutica a un individuo que se ha infectado con el VHB, los cuales comprenden la administración de la vacuna. El diagnóstico de la infección por VHB antes de la administración de la vacuna se puede realizar en forma sistemática. i. Método de tratamiento con la vacuna La vacuna se puede utilizar para generar una respuesta inmunitaria que protege al hígado en un mamífero. La respuesta inmunitaria puede generar una respuesta CTL específica para el antígeno que no causa daño o inflamación al hígado. En algunas modalidades, la vacuna se puede administrar en la periferia para establecer una respuesta inmunitaria específica para el antígeno que se dirige al hígado para quitar o eliminar las células infectadas por el VHB sin causar daño o inflamación al hígado. En algunas modalidades, el tratamiento puede incluir la administración de una vacuna que comprende un antígeno nuclear de consenso del VHB en la periferia para establecer una respuesta inmunitaria específica para el antígeno que se dirige al hígado para quitar o eliminar las células infectadas por el VHB sin causar daño o inflamación al hígado. 3. Vías de administración La vacuna o composición farmacéutica se puede administrar mediante distintas vías, las cuales incluyen la vía oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosal, tópica, mediante inhalación, mediante administración oral, intrapleural, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, intratecal e intraarticular o combinaciones de estas. Para uso veterinario, la composición se puede administrar como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración más adecuada para un animal en particular. La vacuna se puede aplicar con jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin agujas, "pistola génica para bombardeo con microproyectiles" u otros métodos físicos, tales como la electroporación ("EP"), "método hidrodinámico" o ultrasonido.
Se puede administrar al mamífero el vector de la vacuna mediante varias teenologías conocidas que incluyen la inyección de ADN (también denominada vacunación de ADN), con y sin electroporación in vivo, mediado por liposomas, facilitado por nanopartículas, vectores recombinantes como un adenovirus recombinante, virus asociado con adenovirus recombinante y vaccinia recombinante. El antígeno del VHB se puede administrar por inyección de ADN y junto con la electroporación in vivo. a. Electroporación La vacuna o composición farmacéutica se puede administrar mediante electroporación. La administración de la vacuna mediante electroporación se puede lograr usando dispositivos de electroporación que pueden estar configurados para administrar a un tejido deseado de un mamífero un pulso de energía eficaz para provocar que se formen poros reversibles en membranas celulares y preferentemente el pulso de energía es una corriente constante similar a una entrada de corriente preprogramada por un usuario. El dispositivo de electroporación puede comprender un componente de electroporación y un ensamblaje de electrodos o un ensamblaje de mango. El componente de electroporación puede incluir e incorporar uno o más de los distintos elementos de los dispositivos de electroporación que incluyen: controlador, generador de forma de onda de corriente, verificador de impedancia, registro de forma de onda, elemento de entrada, elemento informativo del estado, puerto de comunicación, componente de memoria, fuente de energía e interruptor de energía. La electroporación se puede lograr mediante el uso de un dispositivo de electroporación in vivo, por ejemplo el sistema EP CELLECTRA® (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) o el electroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) para facilitar la transfección de células por parte del plásmido.
Los ejemplos de dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden facilitar la administración de las vacunas de ADN de la presente invención incluyen los descritos en la patente estadounidense N.° 7,245,963 de Draghia-Akli, et ál., la publicación de patente estadounidense 2005/0052630 presentada por Smith, et ál., cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Otros dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que se pueden usar para facilitar la administración de las vacunas de ADN incluyen los que se proporcionan en la solicitud de patente estadounidense de titularidad copendiente y conjunta, N.° de serie 11/874072, presentada el 17 de octubre de 2007, que reivindica el beneficio según el título 35 del U.S.C, artículo 119(e) con respecto a las solicitudes provisionales estadounidenses, N.° de serie 60/852,149, presentada el 17 de octubre de 2006 y 60/978,982, presentada el 10 de octubre de 2007, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
La patente estadounidense N.° 7,245,963 de Draghia-Akli, et ál., describe los sistemas modulares de electrodos y su uso para facilitar la introducción de una bio olécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los sistemas modulares de electrodos pueden comprender múltiples electrodos de agujas; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona una conexión conductiva de un controlador de pulso de corriente constante programable a múltiples electrodos de aguja; y una fuente de energía. Un operador puede sujetar múltiples electrodos de aguja que se encuentran montados en una estructura de soporte e insertarlos con firmeza en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Luego, las biomoléculas se administran mediante la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. Se activa el controlador de pulso de corriente constante programable y se aplica el pulso eléctrico de corriente constante a múltiples electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la biomolécula en la célula entre múltiples electrodos. Se incorpora en la presente la totalidad del contenido de la patente estadounidense N.° 7,245,963.
La publicación de patente estadounidense 2005/0052630 presentada por Smith, et ál., describe un dispositivo de electroporación que puede usarse para facilitar eficazmente la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El dispositivo de electroporación comprende un dispositivo electrocinético ("dispositivo de EKD") cuyo funcionamiento está especificado por el software o firmware. El dispositivo de EKD produce una serie de patrones de pulso de corriente constante programable entre los electrodos en una disposición basada en el control del usuario y el ingreso de los parámetros de pulso y permite el almacenamiento y la adquisición de los datos actuales de la forma de onda. El dispositivo de electroporación también comprende un disco de electrodo sustituible que tiene una disposición de electrodos de aguja, un canal de inyección central para una aguja de inyección y un disco de guía extraíble. Se incorpora en la presente la totalidad del contenido de la publicación de patente estadounidense 2005/0052630.
El arreglo de electrodos y los métodos descritos en la patente estadounidense N.° 7,245,963 y la publicación de patente estadounidense 2005/0052630 puede adaptarse para la penetración profunda no solamente en los tejidos, tales como músculos, sino también otros tejidos u órganos. Debido a la configuración del arreglo de electrodos, la aguja de inyección (para administrar la biomolécula de elección) también se inserta completamente en el órgano diana y la inyección es administrada perpendicularmente al tejido diana, en el área que está predelineada por los electrodos. Los electrodos que se describen en la patente estadounidense N.° 7,245,963 y la publicación de patente estadounidense 2005/005263 son preferentemente de 20 mm de largo y 21 de ancho.
De manera adicional, en algunas modalidades que incorporan dispositivos de electroporación y usos de estos, se contemplan dispositivos de electroporación que son los que se describen en las siguientes patentes: Patente estadounidense 5,273,525 emitida el 28 de diciembre de 1993, Patentes estadounidenses 6,110,161 emitida el 29 de agosto de 2000, 6,261,281 emitida el 17 de julio de 2001 y 6,958,060 emitida el 25 de octubre de 2005 y la patente estadounidense 6,939,862 emitida el 6 de setiembre de 2005. Además, se contemplan en la presente las patentes que abarcan la materia proporcionada en la patente estadounidense 6,697,669 emitida el 24 de febrero de 2004, relacionada con la administración de ADN usando cualquiera de una diversidad de dispositivos, y la patente estadounidense 7,328,064 emitida el 5 de febrero de 2008, que describe un método de inyección de ADN. Las patentes mencionadas anteriormente se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. 4. Método para preparar la vacuna En la presente se proporcionan métodos para preparar los plásmidos de ADN que comprenden las vacunas que se tratan en la presente. Luego de la etapa de subclonación final en el plásmido de expresión de mamífero, se pueden usar los plásmidos de ADN para inocular un cultivo celular en un tanque de fermentación a gran escala usando métodos conocidos en la téenica.
Los plásmidos de ADN para utilizarse con los dispositivos de EP de la presente invención se pueden formular o fabricar usando una combinación de dispositivos y técnicas conocidas, pero preferentemente se fabrican utilizando una técnica optimizada de fabricación de plásmidos que se describe en una solicitud publicada estadounidense N.° 20090004716 que se presentó el 23 de mayo de 2007. En algunos ejemplos, los plásmidos de ADN usados en estos estudios se pueden formular en concentraciones superiores o iguales a 10 mg/mL. Las técnicas de fabricación también incluyen o incorporan varios dispositivos y protocolos que son conocidos comúnmente por los expertos en la técnica, además de los descritos en la solicitud estadounidense número de serie 60/939792, que incluyen los descritos en una patente autorizada, patente estadounidense N.° 7,238,522, que se emitió el 3 de julio de 2007. La solicitud y patente estadounidenses, N.° de serie 60/939,792 y la patente estadounidense N.° 7,238,522 respectivamente, anteriormente mencionadas, se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
EJEMPLOS La presente invención se ilustra también en los siguientes ejemplos. Se debería entender que estos ejemplos, en tanto indican modalidades preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ejemplo. A partir de la descripción anterior y de los ejemplos, un experto en la téenica puede determinar las características esenciales de la presente invención y, sin apartarse del espíritu y alcance de esta, pueden realizarse varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Por consiguiente, diversas modificaciones de la invención además de las que se muestran y describen en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que antecede. Se pretende también que las modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO 1 Proteína central del VHB Se diseñó una proteína central del VHB de consenso, también denominada construcción M-core o MCore, modificada por el VHB a partir de secuencias de epítopos de los genotipos del VHB A, B, C, D y E. Las secuencias de proteínas centrales del VHB de estos genotipos se seleccionaron para la inclusión en una construcción de un núcleo de consenso que induciría la inmunidad contra gran variedad de genotipos, proporcionando de este modo una vacuna universal para el VHB. En algunas modalidades, las modificaciones de la construcción M-core incluía la adición de una secuencia líder IgE. En algunas modalidades, la proteína M-core se codifica usando la optimización con codones y la optimización de ARN para una expresión mejorada. 1. Construcción y expresión del antígeno nuclear de consenso Se construyó una secuencia de nucleótidos de consenso centrales del genotipo A, B, C, D y E del VHB mediante la generación de secuencias de consenso de genes centrales para cada genotipo y luego se generó una secuencia de consenso de los cinco consensos de genotipos, por lo tanto, se evitó una tendencia hacia los genotipos muy secuenciados. Adicionalmente, se recolectaron secuencias de distintos países para evitar la tendencia al muestreo hacia los genotipos muy secuenciados. Las secuencias se alinearon usando un software clustal X para desarrollar la secuencia de consenso HBcAg final. Como se muestra en la Figura 10, se observó una relativa proximidad de la secuencia HBcAg de consenso de múltiples genotipos con respecto a todas las secuencias muestreadas a partir de distintos genotipos.
Después de que se generó la secuencia de consenso, se realizaron varias modificaciones para aumentar los niveles de expresión de antígenos a partir de los plásmidos . Particularmente, se agregó una secuencia líder IgE muy eficaz y una etiqueta HA de extremo C y se optimizó la construcción con ARN y codones. Esto dio lugar a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia M-core con líder IgE y etiqueta HA (SEQ ID N0:5), la cual se digirió con EcoRI y Notl y se clonó en el vector de expresión pVAX (Invitrogen) bajo el control del promotor inmediato-temprano del citomegalovirus. Luego, la construcción resultante se denominó pMCore (SEQ ID NO:17).
Se realizaron pruebas de expresión in vitro usando la construcción pMCore y pVAX, la cual se utilizó como control. Los resultados que muestran expresión positiva se representan en las imágenes de gel que aparecen en las Figuras 11A y 11B.
Adicionalmente, la proteína HBcAg se expresó al transfectar plásmido de ADN pMCore que contiene el gen central de la hepatitis B (Figura 12). Se detectó la expresión de pMCore usando la Expresión acoplada rápida TNT® del Sistema de Traducción/Transcripción que contiene 35S-metionina (Promega, Madison, WI). El producto génico sintetizado se inmunoprecipitó usando un anticuerpo monoclonal anti-HA que dirige un epítopo HA codificado, Clon HA-7(Sigma-Aldrich). La proteína inmunoprecipitada se sometió a electroforesis en un gel SDS-PAGE al 12 % y posteriormente se fijó y secó. La proteína sintetizada con incorporación de 35S radioactivo se detectó mediante autorradiografía. Este ensayo de traducción in vitro sobre lisados mostró HBcAg detectable en un peso molecular esperado de 28 kDa (Figura 13).
La expresión se confirmó adicionalmente usando un anticuerpo monoclonal anti-HA marcado mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Las líneas celulares del rabdomiosarcoma (RD) se transfectaron con pMCore usando TURBOFECT (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En primer lugar, las células se fijaron con formaldehído al 2 % y luego fueron sometidas a un ensayo para la expresión de proteínas. Las células fijadas se incubaron con etiqueta HA monoclonal de conejo (Invitrogen) diluido en "solución estándar primaria" (0,1 % de BSA, 0,2 % de saponina, 0,02 % de azida de sodio) durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón marcado con DyLight 594 (Thermo Scientific) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se utilizó imaginología confocal para visualizar HBcAg en el citoplasma y alrededor de los núcleos de las células RD transíectadas como se muestra en la Figura 14. El patrón de expresión confirmó que un plásmido de ADN que lleva el gen central de consenso podría expresarse en gran medida en distintas células in vitro. Específicamente, las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal invertido Zeiss Axiovert 100. Se realizaron el análisis y la cuantificación de intensidades de fluorescencia usando el software J de imágenes (N1H, Rockville, MD). 2. Inmunización de ratones Los ratones transgénicos C57BL/6 se separaron en dos grupos de cuatro ratones cada uno y usando electroporación se inmunizaron tres veces con 20 mg de ADN a intervalos bisemanales (grupo 1 - control del vector pVAX; grupo 2 pM-Core). Los ratones se inmunizaron en el Día 0, Día 14, Día 28 y se sacrificaron en el Día 35. Se extrajeron los bazos, hígado y sueros de los animales sacrificados.
Adicionalmente, y para evaluar la generación de respuestas inmunitarias de linfocitos B y T, se inmunizaron y se midieron los ratones Balb/c para ambas respuestas en varios tejidos periféricos. Los ratones recibieron tres inmunizaciones intramusculares de 3C^g de pMCore o pVax seguido de electroporación, como se muestra en el esquema de inmunización (Figura 15). Particularmente, se compraron ratones hembras Balb/c de ocho semanas de edad de Jackson Laboratories. Los animales se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones de los Institutos Nacionales de Salud de EE.UU. y del Institutional and Use Committee (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad de Pensilvania. Para los estudios de inmunización de ADN, se dividieron ocho animales en dos grupos. Cada animal en el grupo inmunizado recibió un total de tres inmunizaciones de 30 mg de p Core con dos semanas entre una y otra en el músculo tibiales anterior (TA) Cada inmunización estuvo acompañada se electroporación in vivo con el dispositivo de electroporación de corriente continua adaptativa CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). Se enviaron dos pulsos de onda cuadrada de corriente continua de 0,2 Amp a través de un arreglo triangular de 3 electrodos que consistía en electrodos sólidos de acero inoxidable de calibre 26 que se insertaron completamente en el músculo. Cada pulso tuvo una duración de 52 milisegundos con un lapso de 1 segundo entre pulsos.
Los estudios in vivo de cepas de ratones Balb/C indicaron la mejora en la magnitud de secreción del factor de necrosis tumoral (TNF-a), linfocito T de interferón gamma (IFN-g) y el CD107a en los linfocitos T CD4 and CD8 que se obtuvieron de los bazos. Las figuras 16 y 17 demostraron que la vacunación de los ratones Balb/c con pM-Core mejoró la magnitud de la secreción IFN-g en los linfocitos T CD4+ y CD8+ de los bazos. Las figuras 18 y 19 demostraron que la vacunación de los ratones Balb/C con pM-Core mejoró la magnitud de la secreción TNF-a en los linfocitos T CD4+ y CD8+ de los bazos. Las figuras 20 y 21 demostraron que la vacunación de los ratones Balb/C con pM-Core mejoró la magnitud de la secreción CD 107a en los linfocitos T CD4+ y CD8+ de los bazos.
En experimentos adicionales, se examinó la secreción IFN-g y TNF-a en los linfocitos T. Para extraer esplenocitos para experimentos adicionales, los ratones se sacrificaron una semana después de la última inmunización y se extrajeron los bazos y se colocaron en un medio RIO (medio RPMI complementado con FBS al 10 % y lx antibiótico-antimicótico). Los bazos se machacaron individualmente, se tiñeron con un colador celular de 40 mM y se trataron con una solución amortiguadora de lisis ACK durante 5 minutos para destruir los eritrocitos. Los esplenocitos se volvieron a suspender en un medio RIO y se utilizaron para ensayos inmunológicos adicionales.
Se volvió a suspender un subconjunto de esplenocitos en medio RIO a una concentración de 107 por mL y se coloraron 100mL en una placa de fondo redondo de 96 pocilios.100mL de medio que contiene péptidos agrupados pMCore o 10 ng/ml de PMA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) y 500 ng/ml de mezcla de ionomicina (Calbiochem, Novabiochem, La Jolla, CA, EUA) como control positivo o dimetil sulfóxido al 0,1 % (Sigma, St. Louis, MO, EUA) como control negativo. Todos los pocilios contenían 5 mL/mL de dos inhibidores de transporte de proteínas, brefeldin A (GolgiPlug) y monensina (Golgistop) (todos de BD Bioscience). Las células se incubaron a 37 °C en 5 % CÜ2 durante 5 horas y se tiñeron con Tinción de Células Muertas Fixables VIVAS/MUERTAS (Invitrogen) durante 10 min. a 37 °C. Se realizó la tinción extracelular usando anticuerpos específicos para ratón CD3, CD4 y CD8. Los esplenocitos se permeabilizaron luego y se lavaron usando BD CYTOFIX/CYTOPERM y PERM/WASH (BD Bioscience), respec ivamente.
Tinción de citocinas intracelulares Las citocinas intracelulares se tiñeron luego con anticuerpos para ratón interferón gamma y factor alfa de necrosis tumoral. Se volvió a suspender un subconjunto de esplenocitos en medio RIO a una concentración de 107 por mL y se colocaron 100 mL en una placa de fondo redondo de 96 pocilios. 100 yL de medio que contiene péptidos agrupados pMCore o 10 ng/ml de PMA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) y 500 ng/ml de mezcla de ionomicina (Calbiochem, Novabiochem, La Jolla, CA, EUA) como control positivo o dimetil sulfóxido al 0,1 % (Sigma, St. Louis, MO, EUA) como control negativo.
Todos los pocilios contenían 5 mL/mL de dos inhibidores de transporte de proteínas, brefeldin A (GolgiPlug) y monensina (Golgistop) (todos de BD Bioscience) . Las células se incubaron a 37 °C en 5 % CO2durante 5 horas y se tiñeron con Tinción de Células Muertas FixablesVIVAS/MUERTAS (Invitrogen) durante 10 min. a 37 °C. Se realizó la tinción extracelular usando anticuerpos específicos para ratón CD3, CD4 y CD8. Los esplenocitos se permeabilizaron luego y se lavaron usando BD CYTOFIX/CYTOPERM™ y PERM/WASH” (BD Bioscience), respectivamente. Las células se tiñeron luego de forma intracelular con anticuerpos para interferón gamma y el factor alfa de necrosis tumoral, interleucina 2 y proteína de membrana asociada lisosómica 1.
Los anticuerpos anti-ratón conjugados se utilizaron durante la tinción extracelular e intracelular que incluye: CD3-ficoeritrina/Cy7 (PE/Cy7), proteína peridinina-CD4 clorofila (PerCP), CD8-aloficocianina (APC), IFN-y-Alexa Fluor 700, TNF-a-isotiocianato de fluoresceína (FITC) e IL-2-ficoeritrina cianina (PE) (todos de BD Biosciences, San José, CA).
El promedio de respuesta inducida de linfocitos T IFN-g específico para HBcAg fue marcado a 2000 (± 210) SFU por millón de esplenocitos. Resulta interesante que la tinción intracelular de los esplenocitos estimulados reveló que tanto las células CD4+ como las CD8+producen casi la misma cantidad de IFN-yespecífico para el antígeno, 0,74 y 0,94, respectivamente, pero producen niveles diferentes de TNF-a con aproximadamente 0,3 % y 1,5 % de células CD4+ y CD8+, respetivamente (Figura 22). Se observó una tendencia similar con células que eran doble positivas para ambas citocinas. Hubo menos células CD4+doble positivas, aproximadamente 0,2 % en el bazo que células CD8+ doble positivas, lo que hace un promedio de 0,7 % (Figura 23).
También se demostró la migración de linfocitos T específicas del VHB al hígado en los animales que fueron administrados con la vacuna de ADN pM-Core. El direccionamiento de linfocitos T específicos para el antígeno central del VHB con alta frecuencia y función efectora para el hígado representa una meta para el desarrollo de una terapia inmunitaria contra el VHB. Después de la inmunización, los animales se sacrificaron y se extrajeron sus hígados, y se determinó la migración de linfocitos T efectores específicas para el VHB. El resultado muestra que la vacuna pM-Core conduce a los linfocitos T efectores hacia al hígado in vivo. Las figuras 24 y 25 demuestran una respuesta del hígado de linfocitos T interferón-g y las Figuras 26 y 27 demuestran una respuesta inmunitaria del hígado del factor-a de necrosis tumoral, y la respuesta elevada que resulta de la vacunación con pM-Core.
El inmunógeno de consenso M-core codificado por la construcción de ADN pM-core lleva a respuestas inmunitarias de linfocitos T CD4+/CD8+ muy balanceadas. El tráfico de linfocitos T inducidas hacia el hígado con mucha frecuencia muestra el fenotipo efector correcto para la supresión inmunitario luego de la infección por VHB que apoya el desarrollo adicional de esta vacuna inmunitaria terapéutica.
También se examinaron las capacidades de producción de citocina de los linfocitos T específicos para el antígeno intrahepático después de la inmunización. Cada hígado se impregnó al inyectar directamente 1 mL de PBS en la vena hepática de cada ratón. Particularmente, los hígados se extrajeron, se machacaron y se volvieron a suspender en 5 mL de Percoll isotónico al 44 %. Las mezclas se sustentaron con 3mL Percoll isotónico al 66 % y se centrifugaron durante 20 minutos a 2 000 rpm para la separación del gradiente. Los linfocitos se recolectaron y se lavaron en 10 mi RIO y se trataron con solución amortiguadora ACK según sea necesario. Tanto los linfocitos T CD4 y CD8 aisladas del hígado producen IFN-g y TNF-a cuando son estimuladas in vitro con el péptido HBcAg (Figuras 28 y 29). Mientras que los linfocitos T CD4 mostraron un porcentaje alto de productores dobles, las CD8 mostraron muy pocas o ninguna célula productora de IFN-y+TNF-a+. En cambio, la mayoría de los linfocitos T CD8 produjo solamente IFN-g o TNF-a. Se observó un enriquecimiento de linfocitos T CD4 específicos para HBcAg en el hígado, el cual fue contrario al del bazo. El porcentaje de T CD4 específicos para HBcAg doble positivos en el hígado restante fueron comparables a los que se observaron en el bazo. Además, se confirmó que los linfocitos T CD8 periféricos eran mejores productores dobles que los linfocitos T CD8 que residen en el hígado. También se observaron las capacidades de producción de anticuerpos de los linfocitos T residentes en el hígado a partir de ratones inmunizados. De manera interesante, el hígado como un órgano de la mucosa produjo mayor IgA específico para el antígeno que el IgG (Figura 30), una observación que no ha sido estudiada previamente.
La Figura 31 muestra respuestas inmunitarias celulares inducidas por pM-Core usando un ensayo (ELISPOT) por inmunoabsorción ligado a enzimas. Los esplenocitos se estimularon con dos conjuntos de péptidos de 15 mer que abarcan toda la longitud de pMCore y que se superponen por 8 aminoácidos. Se colocaron sobre una placa 200 000 esplenocitos en medio RIO, en una placa de 96 pocilios recubierta con anticuerpo de captura IFN-g (Sistema R&D) y se estimularon en presencia de un conjunto específico de péptidos a 37 °C en 5 % de CO2. Las células se lavaron y las placas se incubaron durante la noche con anticuerpo de detección IFN-g de anti-ratón biotinilado (sistema R&D). Posteriormente se utilizaron fosfatasa de estreptavidina-alcalina, sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilfosfato y cloruro de nitroazul de tetrazolio para desarrollar manchas. Las manchas se contabilizaron usando un lector ELISPOT automático (CTL Limited). Como se muestra en la Figura 31, la inmunización con pMCore podría inducir fuertes respuestas inmunitarias celulares. El promedio de respuestas de linfocitos T de IFN-g específico para HBcAg fue de aproximadamente 2000 (± 210) SFU por millón de esplenocitos.
Se utilizó el ensayo ELISPOT para seguir examinando el IFN-g. Particularmente, los esplenocitos se estimularon con dos conjuntos de péptidos de 15 mer que abarcan toda la longitud de HBcAg y que se superponen por 8 aminoácidos. En total hubo 33 péptidos individuales que se agruparon en forma aleatoria, los primeros 17 péptidos incluidos en el conjunto 1 y los últimos 16 péptidos en el conjunto 2. El IgELs y la etiqueta HA fueron excluidos para hacer que el péptido estuviera lo más próximo posible al antígeno natural. Se colocaron sobre una placa 200000 esplenocitos en medio RIO, en una placa de 96 pocilios recubierta con anticuerpo de captura IFN-g (R&D System) y se estimularon durante la noche en presencia de un conjunto específico de péptidos a 37 °C en 5 % de CO2. Las células se lavaron y las placas se incubaron durante la noche con anticuerpo de detección IFN-g de anti ratón biotinilado (R&D System). Posteriormente se utilizaron fosfatasa de estreptavidina-alcalina, sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilfosfato, y cloruro de nitroazul de tetrazolio para desarrollar manchas. Las manchas se contabilizaron usando un lector ELISPOT automático (CTL Limited). Se observó que una semana después de la inmunización final, los ratones inmunizados con pMCore mostraron evidencia de fuertes respuestas de linfocitos T tal como se identificó en el ensayo ELISPOT IFN-g luego de la estimulación ex vivo. La Figura 32 mostró que los epítopos dominantes tienen inclinación hacia el conjunto de péptidos 2 Se realizaron estudios de ensayo de citotoxicidad in vivo usando marcado de áster succinimidil de carboxifluoresceína diacetato (CFSE) combinado con cito etría de flujo. Se evaluó la división celular entre células de poblaciones celulares. Los esplenocitos se aislaron de los ratones sin tratamiento y se dividieron en dos poblaciones. Una población, muy marcada por CFSE, mostró una pulsación con péptidos relevantes (por ejemplo, péptidos centrales del VHB) La otra población, poco marcada por CFSE, mostró una pulsación con péptidos irrelevantes (por ejemplo, péptidos NS3 del VHC). Los linfocitos tratados con péptidos marcados se combinaron y se utilizaron en experimentos de transferencia adoptiva en los cuales se llevó a cabo el análisis de flujo. Las poblaciones de células diana marcadas y tratadas se administraron a dos grupos de ratones, un grupo de control y un grupo inmunizado. Los esplenocitos se aislaron de cada grupo de ratones y se ejecutaron las muestras en un citómetro de flujo. Se midió la cantidad de CFSE. Normalmente, en los experimentos, se forman dos picos, el primero es el péptido irrelevante; el segundo es el péptido inmunizador en el pico que indica mayor CFSE.
La Figura 33 demuestra que los linfocitos T CD8 inducidos por vacunación pueden eliminar específicamente células diana in vivo. Los resultados demuestran que las muestras del bazo e hígado de los ratones sin tratamiento contenían casi la misma cantidad de células que se encontraban en los picos de péptido irrelevante y péptido relevante, mientras que los resultados mostraron que entre los grupos inmunizados, los picos para las células derivadas de aquellos con pulsaciones de péptido relevante fueron considerablemente menores que las de péptido irrelevante. Estos datos demuestran que las células diana tratadas con el péptido del VHB se eliminaron específicamente en ratones inmunizados con la vacuna para el VHB pero no en los ratones no inmunizados. Toda supresión de células diana tratadas con el péptido irrelevante, si llegara a ocurrir, fue la misma en ratones inmunizados con la vacuna del VHB y en ratones no inmunizados y considerablemente menor que la supresión de las células diana tratadas con el péptido del VHB.
Se examinó adicionalmente la capacidad de los linfocitos T CD8 específicos para el VHB inducidos luego de la inmunización del ADN para eliminar específicamente las células diana in vivo. Los CTL humanos que dirigen al antígeno objetivo son importantes en la supresión aguda del VHB frente a la infección crónica. Una semana después de la inmunización final, 4 ratones de cada uno de los dos grupos, inmunizados con pMCore o pVax, se transfirieron en forma adoptiva con esplenocitos diana que mostraron pulsaciones con péptidos HBcAg (relevantes) o HCV-NS3/4A (irrelevantes). Brevemente, los esplenocitos de ratones sin tratamiento se tiñeron con ?mM o InM CFDA SE (Invitrogen). Los esplenocitos marcados se recubrieron luego con los péptidos indicados (ImM) y se inyectaron en forma intravenosa células 107 de cada población en ratones inmunizados o sin tratamiento. Luego de 24 o 90 horas, las células del bazo e hígado se aislaron y se analizaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de destrucción se calculó de la siguiente manera: 100 - ([(% de péptido relevante con pulsaciones en infectados/% de péptido irrelevante con pulsaciones en infectados)/(% de péptido con pulsaciones en no infectados/% de péptido irrelevante con pulsaciones en no infectados)] x 100). Al regular los esplenocitos marcados con CFSE para hacer el seguimiento de la destrucción, se observó que los ratones vacunados con pMCore fueron capaces de inducir una fuerte destrucción específica de células diana con pulsaciones de antígenos como se muestra en la Figura 34. El porcentaje promedio de destrucción en el bazo fue de aproximadamente 83 % mientras que el porcentaje en el hígado fue de 76 %, lo que muestra que los CTL inducidos por la vacuna que migran y son retenidos en el hígado, son capaces de destruir las células diana con pulsaciones de péptidos del VHB. Este fue el primer estudio que mostró la inducción de respuestas de CTL específicas para HBcAg en el hígado, mediante cualquier método y específicamente mediante la inmunización sistémica. Estos datos proporcionaron pruebas de que la inmunización periférica puede inducir a las células efectoras que pueden migrar al hígado y disolver las células diana.
La Figura 35 muestra los datos recolectados del Ensayo de Proliferación de linfocitos T usando marcado de CFSE. Se comparó el porcentaje de proliferación de células CD3+CD4+ y CD3+CD8+ tratadas con vector pVax (control) o con plásmido pMCore que expresa M-core de VHB. Brevemente, los esplenocitos aislados se tiñeron con el Kit Tracer Cell (Invitrogen) de éster de succinimidilo carboxifluoresceína de diacetato (CFDA-SE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos teñidas se lavaron tres veces con solución salina y se estimularon con los péptidos superpuestos específicos para pMCore. Las células de incubaron a 37 °C durante 96 horas. Luego de 48 horas, se quitó 50 % del medio de cultivo y se sustituyó con RIO fresco En el día 4, las células se extrajeron y se tiñeron con anticuerpos monoclonales específicos para CD3, CD4 y CD8 (BD Pharmingen). Las células se fijaron con PBS con 1 % de paraformaldehído (PFA) y se obtuvieron en un FACScalibur (Becton Dickinson). Los datos se analizaron usando el programa FlowJo. La población con CFSE bajo y CFSE medio se consideró como células proliferativas. Como se muestra en la Figura 35, los linfocitos T CD3+CD8+ del bazo proliferaron más en comparación con los linfocitos T CD3+CD4+.
Experimentos adicionales con el ensayo de linfocitos T también utilizaron el marcado CFSE. Particularmente, los esplenocitos aislados se tiñeron con el Kit Tracer Cell (Invitrogen) de áster de succinimidilo de carboxifluoresceína diacetato (CFDA-SE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos teñidos se lavaron tres veces con solución salina y se colocaron en una placa de 96 pocilios con fondo en U en un volumen total de 200 mE de medio que contiene péptidos HBcAg agrupados en una concentración de ^g/mL. Las células de incubaron a 37 °C durante 96 horas. Luego de 48 horas, se quitó el 50 % de los medios de cultivo y se sustituyó con RIO fresco. La diferencia en la producción de citocina entre los linfocitos T CD4 y CD8, tal como se trató anteriormente, fue comparable con su capacidad de proliferación final. 4 días después de la estimulación con péptidos específicos para el antígeno, los linfocitos T CD8+ proliferaron 2 veces más que las células CD4+ (Figura 36) demostrando una tendencia clara de linfocitos T CD8 en la respuesta.
Las Figuras 37A y 37B muestran datos ELISA que presentan una comparación del anticuerpo central del anti-VHB en dilución en serie de los sueros de los animales tratados con el vector pVax (control) o con el plásmido pMCore que expresa M-core de VHB. Brevemente, las placas ELISA de gran unión (Costar, Corning, NY) se recubrieron con 1 mg/ml de proteína HBcAg recombinante en PBS, a 4 °C durante 24 horas y luego se lavaron con de PBS-Tween y se bloquearon con PBS que contiene 1 % de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se suero diluido en forma serial se agregaron a los pocilios y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente Luego del lavado, se detectó el anticuerpo de suero unido mediante IgG de anti-ratón de cabra marcada con HRP (Figura 37A) o IgA (Figura 37B). Los Abs conjugados con peroxidasa se detectaron usando tetrametilbencidina (Sigma-Aldrich) como sustrato y se midió el OD a 450 nm con el lector de placas ELISA de escaneo múltiple. Se observó la respuesta humoral específica para el antígeno en sueros recolectados de ratones inmunizados.
Para explorar adicionalmente la respuesta inmunitaria inducida en ratones inmunizados con pMCore, se analizaron las respuestas IgA e IgG específicas para el antígeno mediante ELISpot de linfocitos B, así como también en ELISA, usando esplenocitos y sueros, respectivamente, recolectados después de la vacunación. Los esplenocitos se aislaron y se purificaron como se describió anteriormente. Para los ELISA, las placas ELISA de gran unión (Costar, Corning, NY) se recubrieron con 1 pg/ml de proteína HBcAg en PBS, a 4°C durante 24 horas y luego se lavaron con 0,1 % de PBS-Tween y se bloquearon con PBS que contiene 1 % de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se suero diluido en forma serial se agregaron a los pocilios y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego del lavado, se detectó el anticuerpo de suero unido mediante IgA o IgG de anti-ratón de cabra marcado con HRP . Los anticuerpos conjugados con peroxidasa se detectaron usando tetra etilbencidina (Sigma-Aldrich) como sustrato y se midieron los valores OD a 450 nm con el lector de placas ELISA de escaneo múltiple. Se observó una elevada titulación IgG e IgA en los sueros de los ratones inmunizados en comparación con los animales de control (Figura 38). El ELISpot de células B de ratones inmunizados (Figura 39) demuestra IgG e IgA específico para HBcAg a aproximadamente 200 SFU y 100 SFU por millón de células, respectivamente. Esto ilustró la activación del compartimento de linfocitos B mediante la inmunización con pMCore. El plásmido HBcAg sintético indujo eficazmente las respuestas humorales y celulares específicas para el antígeno después de 3 inmunizaciones.
La Figura 40 presenta el porcentaje de TNF-a e IFN-g de las células hepáticas y del bazo CD4+ y CD8+.
En ausencia de un modelo animal pequeño para el VHB, se utilizó HBcAg para transfectar en forma temporal el hígado del ratón a través de la inyección hidrodinámica. Los hígados de los ratones inmunizados se transíectaron con pMCore o HCV NS3/4A. La tinción inmunohistoquímica tres días después de la transfección mostró la supresión de hepatocitos transíectados con HBcAg en comparación con los transíectados con NS3/4A. Se midieron los niveles de ALT en los sueros para asegurar que la supresión inducido por los ratones inmunizados no causó ningún daño al hígado. Los resultados en la Figura 41 mostraron que la supresión inducido por los ratones inmunizados no causó ningún daño al hígado.
También se utilizó la inyección hidrodinámica directa para transfectar el hígado de los ratones en forma temporal. Aquí, los hígados de los ratones inmunizados o sin tratamiento se transíectaron con pMCore o plásmido irrelevante que codifica los antágenos de la hepatitis C (HCV NS3/4A). Brevemente, los ratones inmunizados fueron inyectados en forma intravenosa con lOC^g de plásmido en 2 mL (aproximadamente 10 % de volumen del peso del ratón) de solución de Ringer durante un lapso de 7 segundos para transfectar al hígado en forma temporal. La expresión o aclaramiento del plásmido se determinó mediante la tinción del hígado con anticuerpos monoclonales anti-HA. La tinción inmunohistoquímica tres días después de la transfección (Figura 42) mostró la supresión de hepatocitos transíectados con HBcAg en comparación con los transíectados con NS3/4A. Los linfocitos T CD8 aislados de los ratones inyectados hidrodinámicamente con pMCore en la Figura 43 mostraron una mayor frecuencia de IFN-y CD107a+, un marcador de degranulación, en comparación con los hígados de los animales transf ectados con el plásmido irrelevante.
Dado que la supresión de los hepatocitos transf ectados con pMCore parece involucrar la degranulación, se consideró que la destrucción puede ocasionar daño al hígado. Para examinar si los ratones inmunizados eran capaces de aclarar los hepatocitos transf ectados sin inducir un daño significativo al hígado, se utilizó un ensayo para medir la actividad de la enzima alanina aminot ransf erasa (ALT, por sus siglas en ingles) para indicar la presencia de daño hepático cuando se presenten niveles elevados de enzimas en los sueros (Figura 44) . Particularmente, se midió la actividad del suero alanina aminotransf erasa (ALT) usando un ensayo basado en la absorbancia (Stanbio Laboratory) en un lector de microplacas BioTek Synergy 2. Los resultados se presentan como unidades por litro (U/L) y representan la cantidad de enzimas que oxidan ^mol/L de NADH por minuto. Estos estudios mostraron que la supresión específica de los hepatocitos transf ectados con HBcAg no aumentó los niveles de ALT en animales inmunizados transf ectados más allá del intervalo normal de 5-30U/L (Figura 44) .
EJEMPLO 2 Proteínas de superficie del VHB 1. Diseño de la vacuna de ADN de HBsAg El uso de inmunógenos de consenso en el contexto de patógenos variables con secuencias antigénicas muy variables puede ser eficaz al inducir una respuesta inmunitaria más directa para combatir la diversidad viral natural en comparación con la inmunización con un inmunógeno natural único. Se recolectaron ochenta y dos secuencias del antígeno de superficie grande del genotipo A de la Hepatitis y setenta secuencias del antígeno de superficie grande del genotipo C de la Hepatitis del GenBank, y se obtuvieron secuencias de consenso del antígeno de superficie pequeña y del antígeno de superficie grande después de realizar múltiples alineaciones. Se utilizó el software Clustal X (versión 1.8) para crear múltiples alineaciones que se usan para generar una secuencia de consenso.
Se generaron construcciones de ADN que codifican la S principal sola o la preSl/S2 más la S principal de la proteína de envoltura de superficie del VHB usando las secuencias de consenso que codifican los genotipos A o C, los cuales son dos de los genotipos más comunes del mundo (Figura 52A, Figuras 59A-59D). La diferencia en respuestas inmunitarias provocadas por las construcciones que codifican la HBs de hebra completa o la S principal solo examinada como dominio de terminal amino de preSl puede ayudar a la entrada y acoplamiento viral mientras que el extremo terminal carboxilo de preS2 puede estar relacionado con la infectividad. Las construcciones principales solamente de S se denominaron HBs pequeñas (SHBs) mientras que los plásmidos que contenían el preSl/S2 se denominaron HBs grandes (LHBs).
Las proteínas de superficie del VHB de consenso se diseñaron a partir de secuencias de epítopos de aislados primarios del genotipo A del VHB, de modo que la proteína de consenso resultante tuvo identidades de secuencia de 94,2 por ciento a 99,8 por ciento con las proteínas de superficie de los aislados primarios del genotipo A del VHB. Particularmente, se diseñaron dos versiones de la proteína de consenso (Figura 4 y Figura 52B). Una incluía la proteína S y también se la conoce como SHBs-A, en la cual la SEQ ID NO:13 es la secuencia de ácido nucleico y la SEQ ID NO:14 es la secuencia de aminoácidos. La segunda incluía la proteína S, pre-S2, y pre-Sl, y también se la conoce como LHBs-A, en la cual la SEQ ID NO:9 es la secuencia de ácido nucleico y la SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoácidos.
Además, las proteínas de superficie del VHB de consenso se diseñaron a partir de secuencias de epítopos de los aislados primarios del genotipo C del VHB, de modo que la proteína de consenso resultante tuvo identidades de secuencia de 96,5 por ciento a 99,8 por ciento con las proteínas de superficie de los aislados primarios del genotipo C del VHB. Particularmente, se diseñaron dos versiones de la proteína de consenso (Figura 4). Una incluía la proteína S y también se la conoce como SHBs-C, en la cual la SEQ ID NO:15 es la secuencia de ácido nucleico y la SEQ ID NO:16 es la secuencia de aminoácidos. La segunda incluía la proteína S, pre-S2 y pre-Sl, y también se la conoce como LHBs-C, en la cual la SEQ ID NO:11 es la secuencia de ácido nucleico y la SEQ ID NO:12 es la secuencia de aminoácidos.
Luego de generarse las secuencias de consenso del antígeno de superficie pequeña y grande del genotipo A o C de consenso, se realizó la optimización de codones y la optimización del ARN. Para los antígenos de superficie del VHB de consenso, se introdujeron sitios de escisión endoproteolíticos en los antígenos de superficie del VHB de consenso para proporcionar un plegamiento adecuado de proteínas y un mejor procesamiento de antígenos (Figura 3). El uso de codones en los antígenos de superficie del VHB de consenso se modificó para reflejar la tendencia a los codones de los genes humanos. Adicionalmente, se evitaron las regiones de contenido GC muy alto (por ejemplo, mayores que 80 por ciento) y muy bajo (por ejemplo, menor que 30 por ciento) así como también motivos que actúan en cis, tales como cajas TATA internas, secuencias repetitivas y secuencias estructuradas. Se introdujo una secuencia Kozak en los antígenos de superficie del VHB de consenso para aumentar el inicio de la traducción. Se agregó una secuencia líder de IgE muy eficaz antes del codón de inicio para mejorar y aumentar la expresión de proteínas, tal como se describió previamente (Yan et ál . , Vaccine (2008) 26:5210-5215) (véanse las Figuras 3 y 52B). Los genes optimizados se sintetizaron y se verificó la secuencia.
Los antígenos de superficie del VHB de consenso SHBs-A, LHBs-A, SHBs-C y LHBs-C se clonaron en un vector de expresión para proporcionar las construcciones pSHb A (también conocida como pSHb-A), pLHb A (también conocida como pLHb-A), pSHb C (también conocida como pSHb-C) y pLHb C (también conocida como pLHb-C), respectivamente (Figura 4). Se subclonaron los genes del antígeno de superficie pequeña y grande del genotipo A sintetizado en el vector de expresión pGXOOOl en los sitios BamHI y Xhol , mientras que se subclonaron los genes del antígeno de superficie pequeña y grande del genotipo C sintetizado en pGXOOOl en los sitios EcoRI y Notl. La generación del plásmido HBcAg (pMCore) se describió en el Ejemplo 1. 2. Expresión in vitro de múltiples vacunas de ADN del HBsAg.
El rhadomiosarcoma (RD) y las líneas celulares del carcinoma de hígado humano (Hep G2) se transíectaron con pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A y pSHBs-C usando TurboFect™ (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el ensayo intracelular, las células se lavaron y se fijaron usando el kit Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen, San Diego, CA) de acuerdo con sus instrucciones. Luego de la fijación, las células se tiñeron con sueros de ratones inmunizados o anticuerpo monoclonal de ratón para la superficie del virus de la hepatitis B (Abcam, Cambridge, MA) Luego, las células se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína conjugado con anti-ratón secundario (BD Biosciences, San José, CA). Las células se lavaron y se fijaron con 2 % de paraformaldehído. Las células fijadas y teñidas se obtuvieron en un instrumento LSR usando el software CellQuest (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
Luego de la construcción y optimización de las cuatro construcciones, se confirmó la expresión de proteínas de cada plásmido mediante tinción intracelular. Las células RD o Hep G2 se transíectaron de forma transitoria con construcciones individuales o con un vector pGXOOOl vacío como control. Las células se tiñeron de forma intracelular 48 horas después usando sueros de ratón policlonal anti-HBsAg o un anticuerpo monoclonal de ratón disponible comercialmente. La expresión se confirmó usando citometría de flujo (Figura 52C). Se observaron niveles aumentados de expresión de proteína HB en linfocitos transfectados con cada construcción con respecto a los linfocitos transfectados con vectores vacíos (pGXOOOl).
EJEMPLO 3 Inmunogenicidad de los plásmidos de ADN del HBsAg sintético individual en modelos de animales pequeños.
Luego de los estudios de expresión, se evaluó in vivo la capacidad de los plásmidos individuales de inducir respuestas celulares y humorales específicas para el antígeno. Se compraron ratones hembras Balb/c de seis a ocho semanas de edad de Jackson Laboratories. Los animales se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones de los Institutos Nacionales de Salud de EE.UU. y del Institutional Care and Use Committee (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad de Pensilvania. Se les dio a los ratones balb/c una inmunización intramuscular (IM) tres veces por día, cada dos semanas, en las semanas 0, 2 y 4 con 15 mg de plásmidos que expresan el antígeno S grande o pequeño o un control pGXOOOl. Cada vacunación fue seguida inmediatamente de electroporación al sitio de infección, tal como se describió previamente (Hirao et ál . , Vaccine (2008) 26:440-448).
Para las inmunizaciones, todos los ADN se diluyeron usando agua sin nucleasas (Qiagen, Valencia, CA 91355). Cada animal en el grupo inmunizado recibió un total de tres inmunizaciones intramusculares de 15 pg del plásmido adecuado Para estudios combinados, cada animal recibió un total de 45 pg de ADN en ambos músculos tibiales anteriores (TA). Las inmunizaciones estuvieron seguidas de electroporación in vivo con el dispositivo de electroporación de corriente continua adaptativa CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). Se enviaron dos pulsos de onda cuadrada de corriente continua de 0,2 Amp a través de un arreglo triangular de 3 electrodos que consistía en electrodos sólidos de acero inoxidable de calibre 26 que se insertaron completamente en el músculo. Cada pulso tuvo una duración de 52 milisegundos con un lapso de 1 segundo entre pulsos. En primer lugar se examinaron las respuestas humorales inducidas por vacunas, ya que las vacunas de ADN más antiguas no fueron consistentes en la generación de respuestas de anticuerpos significativas. 1. Ensayo ELISA de anticuerpos Se llevó a cabo un ELISA para analizar las respuestas IgG específicas para el antígeno en los sueros recolectados de ratones 7 días después de cada inmunización, usando una proteína de HBsAg de hebra completa recombinante como antígeno diana. Las placas ELISA de gran unión (Costar, Corning, NY) se recubrieron con 1 mg/ml de proteína recombinante en PBS, a 4 °C durante 24 horas y luego se lavaron con 0,1 % de PBS-Tween y se bloquearon con PBS que contiene 1 % de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se suero diluido en forma serial se agregaron a los pocilios e se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego del lavado, se detectó IgG unido por IgG de anti-ratón de cabra marcado con HRP. Los anticuerpos conjugados con peroxidasa se detectaron usando tetrametilbencidina (Sigma-Aldrich) como sustrato y se midieron los valores OD a 450 nm con el lector de placas ELISA de escaneo múltiple.
Ambos pLHBs y pSHBs de cualquier genotipo fueron muy inmunogénicos. La inmunización adicional estimuló estas respuestas con respuestas de anticuerpos que muestran la mejora máxima dos semanas después de la tercera inmunización (Figura 53A). Por el contrario, los ratones inmunizados con el control pGXOOOl únicamente mostraron nivel de fondo de respuestas IgG. Sin embargo, se observaron algunas diferencias en la magnitud de las respuestas IgG en cada grupo y la mejora progresiva después de cada inmunización fue consistente dentro de los grupos. 2. IFN-g ELISPOT La capacidad de las construcciones pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A y pSHBs-C de inducir respuestas inmunitarias celulares se examinó mediante IFN-g ELISPOT. Se sintetizaron los péptidos centrales de consenso HepB coincidentes, el antígeno A de superficie y el antígeno C de superficie de 15 meros mediante Genescript (Piscataway, NJ) y se volvieron a suspender en DMSO y se agruparon en una concentración final de aproximadamente 1 mg/mL para cada péptido. Se midieron las respuestas celulares usando IFN-g ELISpot (MabTech, Suecia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se ejecutaron por triplicado con un RIO (RPMI 1640 que contiene L-glutamina con 10 % de suero fetal bovino inactivado y 1 % de penicilina/estreptomicina) y un control PMA/IM (PMA 0,1 pg/mL e ionomicina 0,5 mg/mL, Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
Las células que segregan IFN-g específico para HBsAg se analizaron en respuesta a dos conjuntos de péptidos sintéticos que se desarrollan a partir de una proteína de superficie del VHB grande de consenso. El primer conjunto de péptidos contenía péptidos que abarcan las proteínas preSl y preS2, mientras que el segundo conjunto de péptidos estaba compuesto por péptidos que abarcan el proteína S principal. Las cuatro construcciones de consenso fueron capaces de inducir fuertes respuestas de linfocitos T y se observó reactividad inmunitaria cruzada dentro de los dos genotipos de la Figura 53B. Si bien, juntas, las proteínas preS son casi similares en tamaño a la proteína S principal, hubo una inclinación de los epítopos en las respuestas de inmunidad mediada por células hacia la proteína S principal. Estos resultados indican que los inmunógenos de ADN sintético que codifican la longitud completa o solamente la parte S principal del antígeno de superficie del VHB muestran una inmunogenicidad que es lo suficientemente distinta para dirigir los genotipos principales del VHB. Las construcciones de longitud completa no mostraron una diferencia significativa en la inducción de IgG para una proteína natural del VHB con respecto a las construcciones más cortas. 3. Mapeo de péptidos (15 meros) del antígeno de superficie del VHB Luego de confirmar la magnitud de CMI, se investigó la amplitud de las respuestas celulares frente a los objetivos específicos para el genotipo. Por consiguiente, se llevaron a cabo conjuntos de ensayos ELISpot interferón-gamma contra varios conjuntos de péptidos de la matriz. Se sintetizaron dos agrupaciones de péptidos que abarcan la proteína LBHs-A o LBHs-C, cada una contiene 15 residuos de aminoácidos que se superponen por 8 aminoácidos mediante GenScript (Piscataway, NJ). Con el fin de mapear los epítopos inmunodominantes, se agruparon dos agrupaciones de péptidos en 16 o 12 conjuntos para los grupos HBsAg grandes o pequeños, respectivamente. Se llevó a cabo el ensayo IFN-g ELISpot tal como se describió anteriormente. Estas distintas agrupaciones de péptidos agrupados se utilizaron en un ensayo de matriz para mapear los epítopos de cada construcción. Las respuestas por encima de 50 SFU por millón de células se consideraron positivas.
Estos datos ilustran que las distintas respuestas epitópicas fueron inducidas por estos plásmidos del antígeno de superficie sintético en ratones BALB/c. Se observaron 12 de 16 conjuntos de matriz LHBs-A positiva en ratones inmunizados con pLHBs-A, y 8 de 16 conjuntos de matriz LHBs-C positiva en ratones inmunizados con pLHBs-C. Los plásmidos HBs pequeños mostraron más veces de respuestas con ratones inmunizados con pSHBs-A, lo que responde a 9 de 12 conjuntos de péptidos de matriz SHBs-A, mientras que los ratones inmunizados con pSHBs-C mostraron respuestas a todos los conjuntos de matriz SHBs-C (Figura 53C). Estos datos indican un alto grado de respuestas celulares de reacción cruzada amplia inducidas por estas 4 construcciones HBs. Como resultado, estas vacunas de consenso específicas para el genotipo pueden ser capaces de inducir respuestas celulares con reactividad cruzada frente a varios aislados de antígeno de superficie primarios que son hasta 8 % divergentes en estos genotipos.
EJEMPLO 4 Ensayo de citotoxicidad y CTL específico para el antígeno visto en el hígado y bazos de los ratones vacunados.
Los linfocitos T CD8 efectores antivirales pueden inducir la citotoxicidad, la cual es una actividad celular para eliminar los hepatocitos infectados con el VHB. Se evaluó la capacidad de las construcciones para generar CTL específicos para HBs en la periferia, los cuales pueden ser también el hogar para el hígado de los ratones inmunizados, usando un ensayo de citotoxicidad in vivo. Los esplenocitos de los ratones sin tratamiento se tiñeron con ImM (alto) o InM (baj o) CFDA SE ( Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) . Los esplenocitos marcados se recubrieron luego con los peptidos indicados (péptidos relevantes o irrelevantes) ( ?mm) y se inyectaron en forma intravenosa de 107 células de cada población en ratones inmunizados o sin tratamiento . Luego de 90 horas , las células de la sangre , bazo e hígado se aislaron y se analizaron mediante citometría de fluj o . El porcentaj e de destrucción se calculó de la siguiente manera : 100 - ( [ ( % de péptido relevante con pulsaciones en infectados/% de péptido irrelevante con pulsaciones en infectados) / ( % de péptido con pulsaciones en no infectados/% de péptido irrelevante con pulsaciones en no infectados) ] x 100 ) .
La migración de los CTL específicos para el VHB hacia el hígado es esencial para la supresión intrahepática de las células infectadas. Se observó la supresión específica para el antígeno de esplenocitos diana transferidos adoptivos que se pulsaron con péptidos sintéticos HBsAg. El porcentaje promedio de destrucción de células diana en el bazo para los ratones inmunizados con construcciones SHBs fue de 39 ¾ y 48 % para el genotipo A y C, respectivamente. El promedio de supresión de células diana para las construcciones LHBs fue de 35 % para el genotipo A y de 51 % para el genotipo C. La supresión La supresión fue potente pero no tan potente como la respuesta que se observó en los ratones que se inmunizaron con el plásmido Ag central solo, tal como se describe en el Ej emplo 1 en el que 83 % y 76 % de la supresión la supresión diana se notó en el bazo y el hígado, respectivamente . La demostración de que los CTL generados contra los HBs pueden dirigir la supresión la supresión de antígenos en el hígado es alentadora porque apoya la combinación de HBs y HBc para expandir adicionalmente la potencia y escape límite. El porcentaje de supresión de celulas diana en el hígado fue de 45 % y 66 % para SHBs-A y SHBs-C, y de 60 % y 74 % en los grupos LHBs-A y LHBs-C (Figura 54) . El hecho de tener tráfico de CTL específicos para la vacuna hacia el hígado, un órgano que se sabe que suprime las respuestas de linfocitos T e induce la tolerancia, hace resaltar la eficacia de las construcciones al inducir CMI funcional .
EJEMPLO 5 Inmunogenicidad del cóctel de ADN HBsAg-HBcAg Dado que la inmunización con cada plásmido HBsAg sintético provocó respuestas inmunitarias con reactividad cruzada amplia, las respuestas se extendieron más allá del antígeno de superficie para mej orar adicionalmente la inmunogenicidad contra distintos antígenos dentro del virus. Los plásmidos HBs se combinaron con el plásmido que codifica HBcAg (pMCore) para crear cócteles de vacuna de ADN HBs -HBc para que la inmunización determine si el cóctel mejorará la respuesta celular al aumentar la cantidad de epítqpos inrnunitarios que reconocerá el linfocito T para eliminar, ya que el antígeno central del VHB está involucrado en la supresión la supresión viral a través de la inducción de respuestas de CTL específicos para HBcAg .
Cinco grupos de ratones se inmunizaron con cócteles de vacuna de antígenos HBs solamente o de antígenos combinados de HBs y HBc. Cada ratón recibió dos vacunas seguidas de electroporación en ambos TA. Los ratones se inmunizaron con cócteles que contienen antígenos de superficie solamente (ambos genotipos) o con cócteles que contienen tanto antígenos de superficie como el plásmido del antígeno central de consenso (pMCore), que se describe en el Ejemplo 1 (véase la Tabla 3). Los ratones inmunizados solamente con HBsAg generaron una elevada titulación de IgG en sus sueros. Resulta interesante que se observaron titulaciones similares en el grupo SHBs-pMCore pero fueron menos contundentes en el grupo del cóctel LHBs-pMCore (Figura 55A). El aumento en el direccionamiento de antígenos puede haber ocasionado alguna inhibición de anticuerpos.
Tabla 3 Grupos de inmunización para estudios en ratones del cóctel de ADN HBs-HBc.
Para explorar adicionalmente la respuesta inmunitaria obtenida de los ratones inmunizados con HBs-HBc, se evaluó la producción de IFN-g de cada grupo inmunizado. El promedio SFU por millón de esplenocitos para los grupos sin pMCore fue de aproximadamente 689 y 666 peptidos para el genotipo A y de 1160 y 1312 contra los del genotipo C, respectivamente. Además, la adición de pMCore en promedio aumentó el total de SFU por millón de esplenocitos en 400 manchas contra el genotipo C y se duplicó la respuesta cuando los esplenocitos se estimularon con los péptidos de genotipo A (Figura 55 B ) .
Es sabido que los linfocitos T CD8 son las principales células efectoras responsables de la supresión del VHB . Es importante determinar qué tipo de linfocito T es responsable de la producción observada de IFN-g y determinar si estos linfocitos T pueden inducir múltiples funciones antivirales al liberar otras citocinas antivirales, tales como TNF-a e IL-2, y marcadores de degranulación tal como CD107a. Se evaluó la capacidad de los linfocitos T CD8 de ratones inmunizados para inducir citocinas y marcadores después de la estimulación ex vivo con los péptidos adecuados. El análisis de flujo multicolor reveló que un porcentaje significativo de linfocitos T CD8 de cada grupo eran linfocitos T CD8 activados y polifuncionales (es decir, producían múltiples citocinas) dentro de todos los grupos (Figuras 56A-56F). También se observó la inducción específica para el antígeno del marcador de degranulación de linfocitos, CD107a, en estos linfocitos T CD8. Los linfocitos T CD8 de los grupos de cóctel HBs-HBc mostraron una actividad polifuncional mayor cuando se los estimuló con los péptidos del antígeno de superficie, lo que confirma un efecto sinérgico en las citocinas antivirales de los linfocitos T CD8 como IFN-y, TNF-a e IL-2, y el marcador de degranulación CD107a. Además se observó la inducción de los CTL mediante la supresión la supresión de células pulsadas del antígeno transferido. Si bien hubo una reducción en las respuestas del anticuerpo a HBs para los cócteles, lo que incluye las construcciones LHBs, los cócteles de vacunas SHBs-pMCore mantuvieron las respuestas humorales detectadas en los animales inmunizados únicamente con SHBs.
EJEMPLO 6 Inmunización de macacos Rhesus con cócteles induce fuertes respuestas inmunitarias específicas para HBs humoral y específicas para HBc y HBs La potencia de la vacuna de ADN de construcciones de ADN previas ha sido consistentemente débil en animales más grandes y en humanos. Las fuertes respuestas de linfocitos T y del anticuerpo provocadas por la combinación de pLHBs o pSHBs y pMCore en ratones llevó a la evaluación de la inmunogenicidad de estas construcciones en un modelo de primate no humano (NHP, por sus siglas en inglés), la cual es muy similar a la respuesta inmunitaria humana. Esto es un obstáculo para la inmunogenicidad de las vacunas ya que el tamaño más grande y la población MHC exógama de NHP, normalmente da como resultado inmunogenicidad reducida o no existente en comparación con los modelos de ratón. Para estos estudios, se agregó IL-12, una citocina que conduce Thl para ser analizada. Se ha demostrado que IL-12 conduce CMI al colaborar con el cebado y expansión de linfocitos T CD8 cuando se lo agrega a una inmunización como un adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria contra diferentes antígenos de varios patógenos. Este adyuvante aumenta las respuestas de los linfocitos T de la vacuna de ADN en los ratones, en macacos y en humanos. 1. Vacunación Se alojaron quince macacos rhesus de la India en Bioqual (Rockville, MD) de acuerdo con las normas de la Asociación Americana para la acreditación del cuidado de los animales de laboratorio. Los monos macacos rhesus se distribuyeron en grupos, donde cada grupo tenía 5 monos. Véase la Tabla 4.
Tabla 4 Grupos de inmunización de primates no humanos A un grupo se le administró por vía intramuscular (IM) (también conocida como electroporación in vivo) una vacuna que incluye 1,0 mg de cada construcción pMCore, pSHb A y pSHb C. A este grupo se lo conoce como grupo "reducido". A un segundo grupo se le administró por vía intramuscular (IM) una vacuna que incluye 1,0 mg de cada construcción pMCore, pLHb A y pLHb C. A este grupo se lo conoce como grupo "grande". A un tercer grupo se le administró por vía intramuscular una vacuna que incluye 1,0 mg de cada construcción pMCore, pLHb A y pLHb C, y 0,4 mg de prhIL-12 (IL-12 rhesus optimizado con plásmido expresado); a este grupo se lo conoce como el grupo "grande + IL-12" o grupo "pLHBs+12". La construcción prhIL-12 codifica la proteína IL-12 del macaco Rhesus. El ADN se administró a un único sitio en los cuádriceps seguido de EP in vivo con el dispositivo de corriente continua CELLECTRA® (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) con tres pulsaciones a una corriente continua de 0,5 A, a una longitud de pulso de 52 ms y un 1 s de descanso entre las pulsaciones. Los animales se vacunaron en las semanas 0, 4, 12 y 30. 2. Colección de muestras Las muestras se extrajeron de los monos antes de la inmunización en la semana 0 y también después de la inmunización (es decir, luego de las semanas 0, 4 y 12). Los animales se purgaron 2 semanas después de cada inmunización. La sangre (20 mL en cada punto de tiempo) se recolectó en tubos EDTA y se aislaron las PBMC usando un procedimiento estándar Ficoll-Hypaque con tubos Accuspin (Sigma-Aldrich). Se recolectaron 5 mL de sangre adicionales en tubos de coagulación y los sueros se dividieron en alícuotas para el análisis.
Se observaron elevadas respuestas del anticuerpo de titulación contra HBsAg después de dos inmunizaciones con pSHBs/pMCore pero no con pLHBs/pMCore. Esta respuesta fue comparable con los datos del anticuerpo de ratón de la Figura 55A. La respuesta contra pLHBs/pMCore se estimuló después de la tercera inmunización. El adyuvante IL-12 mejoró la titulación del anticuerpo de la inmunización del cóctel pLHBs/pMCore tan pronto como después de dos inmunizaciones (Figura 57A).
Las respuestas inmunitarias celulares de las PBMC mostraron poca o ninguna respuesta específica para HBs o HBc después de la primera inmunización. Sin embargo, se observaron respuestas después de la segunda inmunización y se estimularon después de cada inmunización posterior. Se observaron fuertes respuestas de más de 2000 SFU por millón de PBMC en todos los grupos después de la tercera inmunización y se dirigieron mayoritariamente contra el antígeno central. La adición del adyuvante IL-12 mejoró la magnitud de la respuesta de linfocitos T de 1000 SFU por millón de PBMC, en comparación con el cóctel pLHBs/pMCore solo (Figura 57B). Para definir adicionalmente la amplitud de la respuesta celular, se crearon conjuntos de matriz de los péptidos centrales de consenso para determinar la cantidad de epítopos posibles. Las respuestas de los linfocitos T se extendieron por los múltiples conjuntos de péptidos con un promedio de respuesta de 12 epítopos de péptido (Figura 57C). Estas respuestas son consistentes con aquellas que se observaron previamente en los modelos de animales pequeños. Estos resultados sugieren que los cócteles son capaces de inducir respuestas celulares con una fuerte magnitud y amplitud y que la magnitud de estas respuestas se puede mejorar por la adición de IL-12.
Las figuras 45-48 muestran las respuestas inmunitarias inducidas por las vacunas administradas a grupos reducidos, grandes y grandes+IL-12. Se utilizó un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT) para determinar las respuestas inmunitarias celulares tal como se detalló anteriormente en el Ejemplo 1. Como se muestra en las Figuras 45-48, se estimuló la respuesta de linfocitos T con cada vacunación. Sin embargo, el antígeno central del VHB fue más inmunogénico que el antígeno A de superficie del VHB y que el antígeno C de superficie del VHB. Los datos también demuestran que el antígeno de superficie del VHB de consenso más largo (es decir, incluye la proteína S, pre-S2 y pre-Sl) es tan inmunogénico como el antígeno de superficie del VHB de consenso (es decir, incluye la proteína X).
De forma similar a las Figuras 45-48, la Figura 49 muestra las respuestas inmunitarias celulares inducidas por las vacunas administradas a los grupos pequeños, grandes y grandes+IL-12, tal como se midió en el ensayo ELISPOT, sin embargo, se examinaron los distintos conjuntos de péptidos que cubren al antígeno central, antígeno A de superficie y al antígeno C de superficie. Nuevamente, se estimuló la respuesta de linfocitos T con cada vacunación, la adición de IL-12 mejoró la respuesta inmunitaria celular, y los antígenos de superficie del VHB de consenso largo y corto fueron similarmente inmunogénicos.
La Figura 50 muestra los datos ELISA comparando las respuestas del anticuerpo anti-VHB para los grupos reducido, grande y grande+IL-12. Los ensayos ELISA se realizaron como se detalló anteriormente en el Ejemplo 1. Se observaron respuestas humorales en los sueros recolectados de los monos inmunizados. Particularmente, las vacunas que incluyen el antígeno de superficie de consenso largo (es decir, la proteína S, pre-S2 y pre-Sl) tienen una mejor respuesta al anticuerpo, lo que puede deberse a los epítopos extras presentes en la vacuna.
La Figura 51 muestra los datos ELISA que comparan las respuestas del anticuerpo anti-VHB para el grupo grande+IL-12 antes de la inmunización (prevac) y después de la inmunización en la semana 0, semana 4 y semana 12 (es decir, pos 1.a, pos 2.a y pos 3.a, respectivamente). Los ensayos ELISA se realizaron tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Los datos en la Figura 51 demostraron que se necesitan 2 inmunizaciones o dosis para una producción de anticuerpos medible. Además, se observó una estimulación significativa en la respuesta del anticuerpo anti-VHB después de la tercera inmunización o dosis.
EJEMPLO 7 De forma similar a los experimentos con ratones en el Ejemplo 5, se aislaron los esplenocitos, es decir, linfocitos T CD4 y CD8 de los monos Rhesus inmunizados del Ejemplo 6 para examinar los niveles de secreción de INF-g y TNF-a en respuesta a la administración de la combinación de antígenos de superficie de consenso y centrales de consenso. Los linfocitos T CD4 y CD8 se estudiaron mediante el análisis de flujo polifuncional y fenotípico para examinar la secreción del factor de necrosis tumoral, interferón gamma y CD107a de estos linfocitos T CD4 y CD8 para determinar si los linfocitos T CD4 y CD8 de los ratones inmunizados del Ejemplo 6 tienen características similares a las de los linfocitos T CD4 y CD8 de ratón que se estudiaron en el Ejemplo 1.
Con el fin de definir adicionalmente la función de la respuesta inmunitaria celular, se realizó una tinción intracelular para citocinas antivirales después de la estimulación con antígenos de superficie y centrales de los genotipos A y C. La tinción intracelular con anticuerpos para citocinas antivirales reveló que la producción específica de antígenos de las citocinas antivirales (IFN-y, TNF-a e IL-2) se indujo en ambas linfocitos T CD4 y CD8 de los monos inmunizados. La Figura 57D muestra que luego de tres inmunizaciones, se observaron ambas respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicas para el VHB. De forma similar a los resultados vistos con IFN-g ELISpot, dominaron las respuestas contra el antígeno central. La adición de IL-12 mejoró la magnitud general de la respuesta, sin embargo, como se esperaba, este efecto fue más pronunciado en los linfocitos T CD8. La inducción de ambas respuestas CD4 y CD8 que promedian 1 % sugiere la inducción de una respuesta inmunitaria amplia que consiste en la inmunidad Thl y Th2 y es muy alentadora para el avance de esta estrategia en los ensayos con humanos.
Las respuestas de los linfocitos T y del anticuerpo para ambos antígenos HBs y HBc fueron similares a las de los resultados generados con ratones en el Ejemplo 5. Estas respuestas fueron aún más impactantes cuando se agregó IL-12, un adyuvante de la citocina polarizadora Thl al cóctel pLHBs-pMCore. Parece que la formulación pLHBs-pMCore + IL-12 fue muy eficaz como combinación preferida. Cabe destacar que ninguna formulación de vacuna dio lugar a un incremento de los parámetros asociados con el daño al hígado.
EJEMPLO 8 Análisis de la función del hígado en primates no humanos después de la vacunación usando paneles químicos de sangre del hígado Dado que los estudios clínicos de pacientes que se encuentran activamente infectados con el VHB han sugerido la posibilidad de que una respuesta de linfocitos T puede estar asociada a la patología del hígado durante la enfermedad, se realizó un análisis preliminar de la seguridad total de estas vacunas multivalentes con respecto a la función hepática. Con el fin de examinar la función hepática, se analizaron los niveles de fosfatasa alcalina, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y bilirrubina total en suero de los animales vacunados antes de la inmunización, después de la tercera inmunización y apenas antes de la cuarta inmunización y después de la cuarta inmunización. Los paneles químicos sanguíneos fueron ejecutaron por IDEXX Laboratories e incluyeron fosfatasa alcalina, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y bilirrubina total. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 58. Una falta de elevación de la fosfatasa alcalina, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y bilirrubina total en las pruebas de función hepática antes, durante y después de completar el período de inmunización sugirió que la inducción de respuestas inmunitarias específicas para el VHB no provocaba daño significativo contra el hígado de los animales vacunados.
En forma conjunta, los datos apoyan que la administración de este cóctel de vacuna de ADN sintético que codifica los antígenos del VHB diseñado en combinación con electroporación específica lleva a fuertes respuestas humorales y celulares distintas en ambos ratones y NHP mientras que se evita la toxicidad total.
Se entiende que la descripción detallada anterior y los ejemplos adjuntos son meramente ilustrativos y no deben considerarse como taxativos para el alcance de la invención, la cual se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
Varios cambios y modificaciones a las modalidades descritas serán evidentes para los expertos en la téenica. Tales cambios y modificaciones que incluyen, de modo no taxativo, aquellos relacionados con las estructuras químicas, sustituyentes, derivados, intermediarios, síntesis, composiciones, formulaciones o métodos de uso de la invención, se pueden realizar sin alejarse del espíritu y alcance de esta.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

RE I VIND I CAC I ONE S Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una vacuna caracterizada porque comprende: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:10 y una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO:14; o (b) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:16, una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:12 y una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO:16.
2. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende adicionalmente: (c) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.
3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:10 y una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO:14. (b) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:16, una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEQ ID NO:12 y una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO:16 y (c) una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.
4. La vacuna de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las moléculas de ácido nucleico comprenden una o más secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:15.
5. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico es un plásmido.
6. La molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de ácido nucleico se incorporan en partículas virales.
7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende adicionalmente una molécula adyuvante.
8. La vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el adyuvante es IL-12, IL-15, IL-28 o RANTES.
9. Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB, caracterizado porque comprende administrar una vacuna de conformidad con la reivindicación 1 a un sujeto.
10.Un método para proteger a un sujeto de la infección por VHB caracterizado porque comprende administrar una vacuna de conformidad con la reivindicación 1 a un sujeto.
11.Un método para proteger a un sujeto que ha sido diagnosticado con la infección por VHB caracterizado porque comprende administrar una vacuna de conformidad con la reivindicación l a un sujeto.
12.Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia codificante que se selecciona del grupo que consiste en: una proteína que comprende la SEQ ID NO:2; una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO:2; un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos de 20 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 95 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos de 20 aminoácidos.
13.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un péptido de señal unido al N-terminal de las proteínas.
14.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6. 15.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una o más secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l; una secuencia de ácido nucleico que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; fragmentos de esta que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 20 aminoácidos codificados por la SEQ ID N0:1; y fragmentos de estos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 20 aminoácidos de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por la SEQ ID NO:l. 16.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un péptido de señal unido al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico. 17.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID N0:1; SEQ ID NO:3; y SEQ ID NO:5. 18.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico es un plásmido. 19.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque es un vector de expresión y las secuencias que codifican la una o más proteínas están unidas operativamente a elementos reguladores 20.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque se incorpora en una partícula viral. 21.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 60 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 60 aminoácidos. 22.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 120 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 120 aminoácidos. 23.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 180 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 180 aminoácidos. 24.Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 a un individuo. 25.Un método para proteger a un individuo de la infección por el VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 a un individuo. 26.Un método para proteger a un individuo al que se le ha diagnosticado infección por el VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 a un individuo. 27.Una proteína seleccionada del grupo caracterizada porque consiste en: (a) SEQ ID NO:2; (b) una proteína que es 95 % idéntica con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de longitud completa tal como se establece en la SEQ ID NO:2; (c) un fragmento inmunogénico de la SEQ ID NO:2 que comprende 20 aminoácidos o más de la SEQ ID NO:2; (d) un fragmento inmunogénico de una proteína que es 95 % idéntica con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que comprende 20 aminoácidos o más. 28.La proteína de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 60 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 60 aminoácidos. 29.La proteína de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 120 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 120 aminoácidos. 30.La proteína de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 180 aminoácidos; y un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 que tiene al menos 180 aminoácidos. 31.Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27 a un sujeto. 32.Un método para proteger a un sujeto de la infección por el VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27 a un sujeto. 33.Un método para proteger a un sujeto que se le ha diagnosticado infección por el VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27 a un sujeto. 34.Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) una proteína que comprende la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16; (b) una proteína que es 98 % idéntica con respecto a toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16; (c) un fragmento inmunogénico de una proteína que comprende la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 que tiene al menos 20 aminoácidos; y (d) un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 que tiene al menos 20 aminoácidos 35.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 O SEQ ID NO:15; (b) una secuencia de ácido nucleico que es 98 % idéntica con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) fragmentos de estas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 20 aminoácidos codificados por la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; y (d) fragmentos de estas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 20 aminoácidos de una proteína que es 98 % idéntica con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de una protelna codificada por la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:
15. 36.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico es un plásmido. 37.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque es un vector de expresión y las secuencias que codifican la una o más proteínas están unidas operativamente a elementos reguladores. 38.La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque se incorpora en una partícula viral. 39.Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34 a un sujeto. 40.Un método para proteger a un sujeto de la infección del VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34 a un sujeto. 41.Un método para proteger a un sujeto al que se le ha diagnosticado infección por VHB, caracterizado porque comprende administrar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34 a un sujeto. 42.Una proteína caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16; (b) una proteína que es 98 % idéntica con respecto a toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16; (c) un fragmento inmunogénico de la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16 que comprende 20 o aminoácidos o más; y (d) un fragmento inmunogénico de una proteína que es 98 % idéntica con respecto a toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:16 que comprende 20 aminoácidos o más. 43.Una vacuna útil para generar una respuesta inmunitaria contra el VHB en un sujeto caracterizada porque comprende: una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34 y una molécula adyuvante. 44.La vacuna de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el adyuvante es IL-12, IL-15, IL-28 o RANTES .
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