UA120909C2 - Коровий білок вірусу гепатиту b і поверхневий антигенний білок та вакцина, що їх містить - Google Patents

Коровий білок вірусу гепатиту b і поверхневий антигенний білок та вакцина, що їх містить Download PDF

Info

Publication number
UA120909C2
UA120909C2 UAA201503644A UAA201503644A UA120909C2 UA 120909 C2 UA120909 C2 UA 120909C2 UA A201503644 A UAA201503644 A UA A201503644A UA A201503644 A UAA201503644 A UA A201503644A UA 120909 C2 UA120909 C2 UA 120909C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
nucleic acid
sho
shi
Prior art date
Application number
UAA201503644A
Other languages
English (en)
Inventor
Девід Б Уейнер
Дэвид Б Уейнер
Цзянь Янь
Ніямекіє Обенг-Аджей
Ниямэкие Обенг-Аджей
Original Assignee
Дзе Трастіз Оф Дзе Юніверсіті Оф Пенсильванія
Дзэ Трастиз Оф Дзэ Юниверсити Оф Пенсильвания
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Трастіз Оф Дзе Юніверсіті Оф Пенсильванія, Дзэ Трастиз Оф Дзэ Юниверсити Оф Пенсильвания filed Critical Дзе Трастіз Оф Дзе Юніверсіті Оф Пенсильванія
Publication of UA120909C2 publication Critical patent/UA120909C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується вакцини для генерації імунної відповіді проти HBV у суб'єкта, яка містить послідовності нуклеїнових кислот, що кодують корові білки вірусу гепатиту В (HBV), поверхневі антигенні білки, їх фрагменти і комбінації, а також генетичні конструкти/вектори і вакцини, які експресують зазначені білкові послідовності. Також стосується способу застосування заявленої вакцини.

Description

Галузь техніки 0001) Цей винахід відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують корові білки вірусу гепатиту В (НВМ), поверхневі антигенні білки, їх фрагменти та комбінації, до корових білків вірусу гепатиту В (НВМ), поверхневих антигенних білків, їх фрагментів і комбінацій, до поліпшених НВУ-вакцин, до поліпшених способів індукції імунної відповіді на НВМ і до поліпшених способів профілактичної та/(або терапевтичної імунізації індивідуумів проти
НВУ.
Рівень техніки
І00021| Гепатит В є глобальною інфекцією, поширеною по всій земній кулі, яка призводить до розвитку цирозу, печінкової недостатності і гепатоцелюлярної карциноми. Значна кількість випадків гепатиту не повідомляється через безсимптомний характер захворювання. Тим не менше, повідомляється про близько 350 мільйонів хронічних випадків гепатиту В щороку.
Більша частина зараженого гепатитом населення перебуває в слаборозвинутих країнах і тих, що розвиваються. 0003 Вірус складається з чотирьох основних серотипів (аг, адм, ауг, аум), виходячи з антигенних епітопів, присутніх на його білкових оболонках. Виходячи з мінливості геномних послідовностей існує принаймні вісім генотипів (А-Н) вірусу гепатиту. Альтернативні генотипи
НВМ мають переважаючий географічний розподіл. 00041 У Таблиці 1 показаний географічний розподіл генотипів НВУ.
Таблиця 1
Географічний розподіл генотипів НВУ 77111111 ФА! Їаумл,айме |висока ОШАфрика:/77/7/7/7/7/://У)./С:(КН;Н С Ф бжші в / |в1вМ.ВЗ3 ф|айме 0 |висока |ДалекийСхід.7/:/ о: 77171711 184 7777 ау |висока |ДалекийСхід.7/:///:ГЗО 77717171. 182 7 файмз 0 |висока |ДалекийСхід.7/:///СС:СЗО 777777.7.7юЮИ. 163. фай |висока |Нова Гвінея, Тихоокеанський регіон: 77171711. |61.б2 ф|аубо// |висока |ДалекийСхід.7/:/ СГ 77717111 .|61503 ф|айме 0 ф|низька |ДалекийСхід.7//:/ СГ 77771717. 164 |аухз | низька / |Далекий Схід, Тихоокеанський регіон
СХИННННННЯ СУС УНН ЕС НН СЕНИК. нів ередземномор'я 77777717 .Щр2.03 ф|ауз 0 |висока О|повсьомусвту.д//://:2ССССССГО 11111111. |Невизначено Ц|айм3 низька |СхіднаЄвропа,Іспаня.їд /-:/ /:/ 77771717171711Щр2 ф|аум4 | низька |СхіднаЄвропа,іспаня, СШАД:/-/ЗЗГ'
Е 7777171- 77717171 (аум4 // |висока ОШАфрикїа:7/7/7/7/7/://Н./С:(К/|/|КбС С ихоокеанський регіон нини нин 11111110 (02 0 Ї|аум4 0 ф|низька |ЛатинськаАмерика.7/77/7/:////:ИН)/С(С 67777711 1-71 Їайме | низька |Європа, ПівнічнаАмерика.;/777/7/:Г/
НО 111-771 Ї(аума |низька О|ЦентральнаАмерика./77/7/:///:/ЛЖ)/СУА7 нн""'нкечнжиИН КИНОІОІУОЛООВВВИВИНТИЯИИКННИНИНИНВИВВВНИ
І0005) Геном НВМУ представлений кільцевою, в основному, дволанцюговою молекулою ДНК, один із ланцюгів якої довший, ніж інший... Дволанцюгова ділянка виникає внаслідок гібридизації короткого ланцюга, що складається приблизно з 3020 нуклеотидів, з більш довгим ланцюгом, що складається приблизно з 3320 нуклеотидів. Одноланцюгова ділянка на негібридизованих нуклеотидах більш довгого ланцюгу зв'язана з ДНК-полімеразою НВУ. Геномна ДНК НВУ і ДНК- полімераза НВУ містяться в нуклеокапсиді, утвореному численними молекулами корового білку
НВМ (НВсАЯд). Коровий білок НВМ огорнутий НВМ-поверхневим білком або антигеном (НВзАоЗ5) і ліпідними молекулами.
І0006| Геном НВУ містить чотири відкриті рамки зчитування (ОКР), які кодують сім різних білків: 1) ОКЕ, яка кодує ДНК-полімеразу НВУ, 2) ОКР, яка має два стартових кодони, причому послідовність, приєднана до другого стартового кодону, кодує коровий білок, а послідовність, яка містить додатковий ирзігеат стартовий кодон, кодує послідовність, названу рге-С; 3) ОВЕ, яка має три стартові кодони, причому один кодує поверхневий білок (5-білок; др27), один включає ирзігеат стартовий кодон, який кодує послідовність, названу рге-52 (дрЗб), а інший, який включає додатковий ирзігеат стартовий кодон, який кодує послідовність, названу рге-51 (др42); і 4) ОКЕ, яка кодує НВхАд, білок, функція якого менш зрозуміла (Фігура 1). Ці білки включають З поверхневі білки або антигени (НВзАд): ргезб1, рге52 і основний 5.
І0007| Особливості НВ5Адз» проілюстровані на Фігурі 2. Епітопи НВ5Ад», що беруть участь в експресії субтипів специфічності, розташовані в ділянці, яка включає дві зовнішні петлі молекул поверхневого антигену НВМ (тобто амінокислоти 110-180 5-білку), і зумовлюють антигенну різноманітність штамів НВМ. Ця ж ділянка містить невідому кількість епітопів, які визначають детермінанту "а" НВ5ЗАЯ, яка є спільною для всіх відомих штамів НВМ дикого типу.
І0008| Профілактичні вакцини та методи лікування НВУ-інфекції включають введення субвірусних частинок, виділених з плазми хронічних носіїв, або субвірусних частинок, що продукуються у вигляді рекомбінантних білків у стабільно трансфікованих еукаріотичних клітинних лініях. Субвірусні частинки являють собою вірусні білки і такі вакцини часто називають субодиничними вакцинами. Білки НВМ вводять індивідууму і вони стають мішенями для імунної системи індивідуума. У неінфікованих індивідуумів імунна відповідь на субодиничну вакцину захищає неінфікованого індивідуума від НВМ-інфекції. У інфікованих індивідуумів імунна відповідь, індукована вакциною, може мати терапевтичний ефект. 0009 Спізагі Е.У., Ат У Раїйої., 2000. 156:1117-1132 і Ритреиз Р. еї аї. Іпіегмігоїюду 2001. 44:98-114 розкрили геномну організацію НВУ. Оепу Р. і Р. 2оціт, Раїйоїодіє Віоіодіє 2010, Ацод, 58(4):245 53 обговорили діагностику і лікування вірусу гепатиту В. Міспе! М.С. ї Р. ТіоїІаї5,
Раїйпоїодіє Віоїодіе 2010, Ацд, 58(4):288 95 обговорили вакцини гепатиту В та їх захисну ефективність і терапевтичний потенціал. Публікація РСТ УУО2004026899 розкриває використання імуногену, що містить поліпептидну послідовність з амінокислотними послідовностями НВМ. Опублікована заявка РСТ УМО2008093976 розкриває НВМ-кодуючі послідовності, білки і вакцини, включаючи вакцину, яка містить рекомбінантний повнорозмірний поверхневий антиген НВУ і коровий антиген НВУ. Весь поверхневий антиген НВУ складається з трьох типів поверхневого білку (Ї білку, М білку і З білку). Опублікована заявка РСТ
УМО2009130588 розкриває НВУ-кодуючі послідовності, білки та вакцини, включаючи нуклеїнову кислоту, що кодує коровий антиген вірусу гепатиту В, кодон-оптимізованийдля експресії в організмі людини. Публікація РСТ М/О2010127115 розкриває доставку послідовностей НВМ з використанням рекомбінантних векторів.
І0010| Доступні вакцини НВМ демонструють деяку ефективність, але є дорогими у виробництві. Крім того, отримані з плазми субодиничні вакцини мають сумнівний профіль безпеки. Було вивчено кілька вакцинних підходів, в тому числі заснованих на застосуванні рекомбінантних живих векторів, синтетичних пептидів і ДНК-вакцин, які містять кодон- оптимізовані кодуючі послідовності білків НВУ. Ці підходи на сьогодні мають змінну обмежену ефективність. Крім того, через геномні відмінності деякі вакцини НВМ демонстрували позитивну ефективність у деяких географічних регіонах і обмежену ефективність в інших регіонах. 0011) Наявні в даний час вакцини на основі НВ5АЯд, отримані з дріжджів, трансфікованих
ДНК, що кодує 5-білок (наприклад, ЕМСЕКІХ-В, доступна від бтіййКіїпе ВіоіІодісаіїє, що знаходиться в Бельгії, і КЕСОМВІМАХ/НВ-МАХ Ії, доступна від МегсК 5 Со., що знаходиться в
США) не викликають реакцію у приблизно 5 95 -10 95 пацієнтів (С. Веїопі, Іттиподепісну ої
Перайів В массіпе іп їепт апа ргеїетт іпгапів. Асіа Раєдіайнса, 1998. 87: р. 336-338). Крім того, рівень резистентності до вакцинації зростає до 30 95 у літніх осіб, а імунітет проти НВМ може знизитися через кілька років після вакцинації. Також для досягнення повного захисту використовують багатократні дози. Для НВзАд-вакцини ЕМСЕРІХ-В існує проблема безпечності, оскільки ЕМСЕКІХ-В у три рази збільшує ризик запальної демієлінізації центральної нервової системи (ЦНС).
І0012| Решта НВз5Ад-вакцин, отриманих з клітин ссавців, використовують рге-51 та рге-52 додатково до 5-білку. Антигени рге-51 і рге-52 експресують високоіїмуногенні Т- і В-клітинні епітопи, і одна така вакцина викликає імунну реакцію у приблизно 80 95 індивідуумів, що не відповідають або слабко відповідають на вакцинацію (Кепаі-УМ/адпег, Р. еї аї., Сотрагаїме іттиподепісйу ої Ргеб/5 ПпПераїййів5 В массіпе іп поп-апа Іом/ гезропадегв (о сопмепійпаї! массіпе.
Массіпе, 2006. 24: р. 2781-9.).
ЇО013| Було вивчено безпосереднє введення послідовностей нуклеїнових кислот для (610) вакцинації проти захворювань тварин і людини і багато зусиль було зосереджено на ефективних і дієвих засобах доставки нуклеїнової кислоти з метою отримання необхідної експресії бажаних антигенів, що призводять до імунної відповіді, і, в кінцевому рахунку, до успіху цього способу.
І0014| ДНК-вакцини роблять можливим ендогенний антигенний синтез, який індукує СОВ8- гістосумісний комплекс, цитотоксичні Т-лімфоцити, рестриктовані | класом комплексу гістосумісності, які рідко отримують з субодиничними вакцинами. Крім того, антигенний синтез, який відбувається протягом тривалого періоду, може допомогти подолати низьку чутливість і усунути або зменшити потребу в бустер-ін'єкціях. Крім того, ДНК-вакцини, вочевидь, дуже стабільні і прості у виготовленні. 0015) ДНК-вакцини є безпечними, стабільними, простими для виготовлення і такими, що добре переносяться пацієнтами в доклінічних випробуваннях, що вказує на відсутність ознак інтеграції плазміди (Мапгіп, Т., еї аїЇ.,, Ріазтій ОМА таїагіа массіпе: (Ше роїепііаІ їог депотіс іптеагайоп айег іпігативзсціаг іпіесііоп. Нит Сепе Тег, 1999. 10(5): р. 759-68; Міспої!в, МУ МУ., єї аї.,
Роїепііа! ОМА массіпе іпіедгайоп іпіо Нові сеїЇ депоте. Апп М У Асай 5сі, 1995. 772: р. 30-9). Крім того, ДНК-вакцини добре підходять для повторного введення в зв'язку з тим, що ефективність вакцини не залежить від наявних попередньо титрів антитіл до вектора (СНанегдооп, М., ..
Воуег, апа О.В. М/вїіпег, Сепеїйс іттипігайоп: а пем/ ега іп массіпе5 апа іттипе Іпегарешціїісв.
ЕАБЗЕВ У, 1997. 11(10): р. 753-63|. Однак однією з основних перешкод для клінічного прийняття
ДНК-вакцин було зниження імуногенності при переході до більш великих тварин (ім, М.А. апа 9.8. Штег, Нитап сіїпіса! Іа! ої ріазтій ОМА массіпе5. Адм Сепеї, 2005. 55: р. 25-40.
Ї0016| Останні технологічні досягнення в розробці ДНК-вакцинного імуногену поліпшили експресію та імуногенність ДНК-вакцин шляхом кодон-оптимізації, РНК-оптимізації та додавання імуноглобулінових лідерних послідовностей (Апаге, 5., єї аї., Іпстєазед іттипе гезропзе еїїсіїєй ру ОМА массіпайоп мій а 5упіпеїййс дрі20 ведиепсе м/йй оріїтігед содоп изаде. У Мігої, 1998. 72(2)3: р. 1497-503; Оеті, Ї.., еї аїІ., Мийіріє еПесів ої содоп изаде оріїтігайоп оп ехргезвіоп апа іттиподепісйу ої ОМА сапаїдайїе массіпез5 епсодіпд Те питап іттипоавеїісіепсу міги5 їуре 1 Сад ргоїеїп. У Мікої, 2001. 75(22): р. 10991-1001; І адау, 0..., еї аї., Іттиподепісйу ої поме! сопхепвив-
Базед ОМА массіпе5 адаїпві аміап іпїмепга. Массіпе, 2007. 25(16): р. 2984-9; Егеїп, Ї., еї аї.,
Содоп оріїтіганйоп апа тАМА атріїйісайноп еПесіїмезу еппапсевз Ше іттиподепісйу ої (пе Нераїййів5
З0 С мігив попзігисішга! З/4А депе. Сепе Тег, 2004. 11(6): р. 522-33|, а також розробленої останнім часом технології систем доставки плазмід, такої як електропорація (Нігао, ГІ.А., єї аї.,
Іпігадепта|/зибсшапеоив5 іттипігайоп Бу еІесігорогайоп ітргоме5 ріазтій массіпе адеїїмегу апа роїепсу іп рід5 апа "тези5 тасадиев. Массіпе, 2008. 26(3): р. 440-8; І исКау, А., єї аї., ЕПесі ої ріаєтій ОМА массіпе дезідп апа іп мімо еіІесікорогайоп оп Ше гезийпд массіпе-5ресіїйс іттипе гезропбеб5 іп ппезиб тасадиев. у Мігої, 2007. 81(10): р. 5257-69; АНіеп, С., еї аїЇ., іп мімо еіесторогайоп еппапсе5 Ше іттиподепісйу ої Нераїйів С міки попвігисішга! З/4А ОМА Бу іпстеазед Іоса! ОМА иріаке, ргоїєїп ехргезвзіоп, іпйаттайоп, апа іпійгайоп ої СОЗ3-Т сеїЇв. У
Ітітипої, 2007. 179(7): р. 4741-53)|. Технологію електропорації іп мімо використовували у клінічних випробуваннях на людях для доставки протиракових препаратів, таких як блеоміцин, і в багатьох доклінічних дослідженнях на великій кількості видів тварин. Крім того, дослідження показали, що використання консенсусних імуногенів може значно розширити клітинну імунну відповідь порівняно з тільки нативними антигенами (мап, »., еї аІ., Еппапсей сеїшаг іттипе гезропзез еїїсей Бу ап епдіпеегейд НІМ-1 зибіуре В сопзепзивз-рбазей епмеіоре ОМА массіпе. Мо!
Тнег, 2007. 15(2): р. 411-21; НоїІапа, М., єї аї., Несопвігисіоп апа їшпсійп ої апсевіга! сепівг-ої- їгтеє пПитап іттипоавеїсієпсу мігив їуре 1 ргоївіп5. У Мігої, 2007. 81(16): р. 8507-14).
Ї0017| Антитіла та цитотоксичні Т-клітини (СТІ) до різних антигенів НВМ можуть брати участь у зниженні вірусного навантаження та очистки НВУ-інфікованих клітин з печінки. Основне завдання для сучасних вакцин-кандидатів полягає в індукції як гуморального, так і клітинного імунітету до множинних НВМУ-антигенів-мішеней і проти основних генотипів НВУ. Зберігається потреба в конструктах нуклеїнових кислот, які кодують білок НВУ, їі композиціях, придатних для індукції імунної відповіді проти НВУ. Зберігається потреба в ефективних вакцинах проти НВУ, які є економічно вигідними та ефективними. Зберігається потреба в ефективних вакцинах, які збільшують нейтралізуючі титри антитіл і викликають Т-клітинний компонент. Зберігається потреба в ефективних вакцинах проти НВУ, у тому числі тих, які ефективні проти штамів НВМ, що мають широкий спектр генотипів, і переважно в універсальній вакцині, яка буде ефективною глобально.
Суть винаходу (0018) Цей винахід стосується вакцини, що містить: (а) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше білків, вибраних з групи, що складається з: БЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 і (610) ЗЕО ІЮ МО:6; (5) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше білків, вибраних з групи, що складається з: БЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІО МО:14, білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:10, білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності 5ХЕО ІЮ МО:14; ї (с) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше білків, вибраних з групи, що складається з: 5ЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІО
МО:16, білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ
МО:12, і білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ
МО:16. Молекули нуклеїнових кислот можуть містити одну або більше нуклеотидних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: БЕО ІЮ МО:1, ЗЕО ІО МО:З3, 5ЕО ІЮО МО:5,
ЗЕО ІЮ МО:9, БЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ МО:13 і ЗЕО ІЮ МО:15.
ІЇ0019| Даний винахід також може поширюватись на вакцину, яка містить (а) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше білків, вибраних з групи, що складається з: БЕО
ІО МО:2, ЗЕО ІЮО МОС4 і ЗЕО ІЮО МО:6; (5) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше білків, вибраних з групи, що складається з: БЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:14, білку, який на 95 95 ідентичний по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:10, білку, який на 95 95 ідентичний по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:14; ї (с) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує один або більше білків, вибраних з групи, що складається з: БЕО
ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮО МО:16, білку, який на 95 95 ідентичний по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО:12, і білку, який на 95 95 ідентичний по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірній амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:16.
І0020| Вакцина може бути плазмідою, яка містить нуклеїнові кислоти, описані вище.
Молекули нуклеїнових кислот можуть бути включеними у вірусні частинки. Вакцина може додатково містити ад'ювантну молекулу. Ад'ювантом може бути 1-12, 11-15, І -28, СТАСК,
ТЕСК, тромбоцитарний фактор росту (РОСЕ), ТМЕРо, ТМЕВ, ЗМ-С5Е, епідермальний фактор росту (ЕСР), 1-1, 1-2, 11.-4, 1-5, 1-6, 1-10, 11-18, 11-21, 11-31, ІІ -33 або їх комбінація; і в деяких варіантах здійснення 1І--12, ІІ -15, ІІ -28 або КСАМТЕ5.
І0021| Даний винахід також стосується способу індукції імунної відповідді проти антигену
НВУ, що включає введення вакцини згідно з даним винаходом суб'єкту.
І0022| Даний винахід також стосується способу захисту суб'єкта від НВУ-інфекції, що включає введення вакцини згідно з даним винаходом суб'єкту. 0023) Даний винахід додатково стосується способу захисту суб'єкта, у якого діагностовано
НВуУ-інфекцію, що включає введення вакцини згідно з даним винаходом суб'єкту.
І0024| Даний винахід додатково включає вакцини, корисні для індукції імунної відповідді проти НВМ. Розробка імунотерапевтичної вакцини НВМ широкого спектру дії проти багатьох генотипів може бути забезпечена з допомогою терапевтичної ДНК-вакцини НВУ, яка базується на цілеспрямованій дії на універсальні консервативні кор-специфічні антигени НВУ.
Використання консенсусних НВУ-імуногенів індукує більш широкі клітинні відповіді та може бути корисним, щоб звести до мінімуму ступінь розбіжності послідовностей між різними штамами вірусу. (0025) Передбаченими в даному документі є білки, вибрані з групи, що складається з: білків, які містять 5ЕО 10 МО:2, білків, які на 9595 ідентичні по всій довжині амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО:2; фрагментів 5ЕО ІЮО МО 2; білків, які на 95 95 ідентичні фрагментам
ЗЕО І МО:2; 5ЕО ІО МО:4, білків, які на 95 95 ідентичні по всій довжині амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО:4; фрагментів 5ЕО ІЮО МО 4; білків, які на 95 95 ідентичні фрагментам
ЗЕО І МО4 5ЕО ІО МО:6б, білків, які на 95 95 ідентичні по всій довжині амінокислотній послідовності ФЕО 10 МО:6; фрагментів 5ЕО ІО МО:6; і білків, які на 95 95 ідентичні фрагментам
ЗЕО І МО:6.
І0026)| Передбаченим в даному документі є білок, вибраний з групи, яка складається з (а)
ЗЕО ІЮ МО:2; (Б) білку, що на 95 95 ідентичний по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірній послідовності, вказаній в 5ЕО ІЮО МО:2; (с) імуногенного фрагмента 5ЕО ІЮ
МО:2, який містить 20 або більше амінокислот 5ЕО ІЮ МО:2; і (д) імуногенного фрагмента білку, який на 95 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО:2, який містить 20 або більше амінокислот.
І0027| Також передбачені молекули нуклеїнових кислот, які містять послідовності, що кодують одну або більше молекул білку, вказаних вище. В деяких варіантах здійснення, молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: 5ЕО ІЮ
МО:1; послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 95 95 ідентична по всій довжині амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО:1; фрагмента 5ЕО ІЮО МО:1; послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 10) 95 95 ідентична фрагменту 5ЕО ІЮ МО:1; 5ЕО ІЮО МО:3; послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 95 95 ідентична по всій довжині амінокислотній послідовності 5ЕО 10 МО:3; фрагмента 5ЕО
ІО МО:3; послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 95 95 ідентична фрагменту 5ЕО ІЮ МОЗ;
ЗЕО ІЮ МО:5; послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 9595 ідентична по всій довжині амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО:5; фрагмента 5ЕО ІО МО:5; і послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 95 95 ідентична фрагменту 5ЕО ІЮ МО:5. (0028) Деякі аспекти винаходу передбачають способи індукування імунної реакції НВМ, що включають етап введення індивідууму молекул корового антигену НВМ та/або поверхневого антигену НВМУ та/або композицій.
І0029| Додаткові аспекти винаходу передбачають способи захисту індивідуума проти НВМ- інфекції. Способи включають етап введення вказаному індивідууму профілактично ефективної кількості молекул нуклеїнової кислоти, яка містить таку послідовність нуклеїнової кислоти, або композицій, причому послідовність нуклеїнової кислоти експресується в клітинах вказаного індивідуума та індукується захисна імунна реакція проти білку, який кодується вказаною послідовністю нуклеїнової кислоти.
І0О30| В деяких аспектах винаходу передбачені способи лікування індивідуума, інфікованого
НВУ. Спосіб включає етап введення вказаному індивідууму терапевтично ефективної кількості таких молекул нуклеїнових кислот та/або композиції.
ІЇ0031| Даний винахід передбачає в іншому аспекті молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить кодуючу послідовність, що кодує один або більше білків, вибраних з групи, яка складається з: (а) білку, що містить ЗЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО І
МО:16; (Б) білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ
МО:10, ЗЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІЮ МО:16; (с) імуногенного фрагмента білку, що містить 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮО МО:12, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІЮО МО:16, який складається з принаймні 20 амінокислот; і (4) імуногенного фрагмента білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО:14 або 5ЕО ІО
МО:16, який складається з принаймні 20 амінокислот.
Ї0032| Молекула нуклеїнової кислоти може містити одну або більше послідовностей, вибраних з групи, що складається з: (а) послідовності нуклеїнової кислоти, яка містить 5ЕО ІЮ
МО:9, 5ЕО ІЮО МО 11, 5ЕО ІЮ МО:13 або 5ЕО ІЮО МО:15; (р) послідовності нуклеїнової кислоти, яка на 98 95 ідентична по всій довжині амінокилотній послідовності 5ЕО 10 МО:9, 5ЕО ІЮ МО:11,
ЗЕО ІО МО:13 або 5ЕО ІЮ МО:15; (с) їх фрагментів, які містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує імуногенні фрагменти, які містять принаймні 20 амінокислот, що кодуються послідовністю 5ЕО 10 МО:9, 5ЕО ІО МО:11, БЕО ІЮ МО:13 або 5ЕО ІО МО:15; і (ад) їх фрагментів, які містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує імуногенні фрагменти, які містять принаймні 20 амінокислот білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності білку, що кодується послідовністю 5ЕО ІЮ МО:9, 5ЕО ІО МО:11, 5ЕО ІЮ МО:13 або
ЗЕО І МО:15. Молекула нуклеїнової кислоти може бути плазмідою. Молекула нуклеїнової кислоти може бути вектором експресії та послідовностями, які кодують вказаний один або більше білків, функціонально зв'язаними з регуляторними елементами. Молекула нуклеїнової кислоти може бути вкоюченою у вірусну частинку.
І0ООЗЗ| Деякі аспекти винаходу передбачають спосіб індукції імунної відповіді проти антигена
НВУ, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом суб'єкту. 00341 Деякі аспекти винаходу передбачають спосіб захисту суб'єкта від НВУ-інфекції, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом суб'єкту.
Ї0ООЗ5І Деякі аспекти винаходу передбачають спосіб захисту суб'єкта, у якого діагностовано
НВУ-інфекцію, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом суб'єкту.
ЇООЗ3б6| Даний винахід передбачає ще в іншому аспекті білок, вибраний з групи, що складається з: (а) ФЕО ІЮ МО:10, БЕО ІЮ МО:12, БЕО ІЮ МО: 14 або 5ЕО ІО МО 16; (Б) білку, який на 98 95 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності ЗЕО 10 МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12,
ЗЕО ІЮ МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО:16; (с) імуногенного фрагмента послідовності ФЕО ІЮ МО:10, 5ЕО
ІЮО МОМ2, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІЮ МО:16, який містить 20 або більше амінокислот; і (а) імуногенного фрагмента білку, який на 98595 ідентичний по всій довжині амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО 10 МО:14 або 5ЕО ІО МО:16, який містить 20 або більше амінокислот.
ЇОО37| Деякі аспекти винаходу передбачають вакцину, корисну для генерації імунної відповіді проти НВМ у суб'єкта, що містить: молекулу нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом і ад'ювантну молекулу. Ад'ювантом може бути 1-12, 11-15, І -28, СТАСК, ТЕСК, тромбоцитарний фактор росту (РОСЕ), ТМЕа, ТМЕВ, їМ-С5Е, епідермальний фактор росту (610) (ЕСРБ), 1-1, 1-2, 1-4, 1-5, 1-6, 1-10, 11-18, 1-21, 1-31, 1/-33 або їх комбінація; і в деяких варіантах здійснення, ІІ -12, ІІ -15, ІІ -28 або ВАМТЕЗ5.
Короткий опис графічних матеріалів
І0ООЗ8І Фігура 1 являє собою карту, яка показує організацію геному НВУ, що складається з чотирьох ОВЕ, які перекриваються.
І0ОЗ9| Фігура 2 ілюструє організацію і особливості поверхневих антигенів НВУ. 00401 Фігура З ілюструє ІЧЕЇ 5 і ендопротеолітичний сайт розщеплення в консенсусному поверхневому антигені НВУ. 0041) Фігура 4 ілюструє довгий консенсусний поверхневий антиген НВМ (ІНВЗ5) і малий консенсусний поверхневий антиген НВМ (ЗНВ5). 00421 Фігура 5 являє собою карту вектора рах1801 НервВ - Мсоге (5ЕО ІЮ МО:17). 00431 Фігура 6 являє собою карту вектора рах1802 НерВ рі НВ5-А (ЗЕО І МО: 18). (00441 Фігура 7 являє собою карту вектора рах1803 НерВ рі НВ5-С (5ЕО ІО МО:19). 00451 Фігура 8 являє собою карту вектора рах1804 НерВ реНВз5-А (5ЕО ІЮ МО:20). 00461) Фігура 9 являє собою карту вектора рах1805 НервВ ЗНВ5-С (5ЕО І МО:21).
І0047| Фігура 10 ілюструє філогенетичний аналіз консенсусної послідовності в порівнянні з індивідуальними генотипами А, В, С, С і Е. 0048) Фігури 11А і 118 демонструють результати експериментів з приводу експресії рМСоге.
Фігура 11А ілюструє результати протоколу трансляції іп міго. Фігура 118 ілюструє результати вестерн-блотингу. 00491 Фігура 12 являє собою графік, який ілюструє плазмідну карту і послідовність рМСоге.
І0ОО50) Фігура 13 ілюструє реакцію транскрипції/трансляції з використанням плазміди рмсСоге, в якій отриманий білок МСоге імунно осаджувався з анти-НА моноклональним антитілом і був розігнаний в гелі 5205-РАСЕ.
ІОО51) Фігура 14 ілюструє виявлення білку МСоге в тимчасово трансфікованих клітинах з використанням первинного моноклонального антитіла до НА-мітки з подальшим виявленням за допомогою -міченого анти-кролячого вторинного антитіла Бу дн 594. Також використовували
Ноесизі-фарбування для флуоресцентного мічення клітинного ядра. Експресія МсСоге здебільшого локалізувалась в цитоплазмі, як показано шляхом фарбування поза ядром. 0052) Фігура 15 ілюструє схему імунізації. Чотирьох мишей імунізували внутрішньом'язово 30 мкг рМсСоге. 0053) Фігура 16 ілюструє збільшену амплітуду секреції ІЕМ-у у СОвяж ії СО4-Т-клітинах з селезінок мишей Ваї!р/С, вакцинованих рМ-Соге. 0054) Фігура 17 ілюструє збільшену амплітуду секреції ІЕМ-у в СОв- і СО4-Т-клітинах з селезінок мишей Ваї!р/С, вакцинованих рМ-Соге. 00551 Фігура 18 ілюструє збільшену амплітуду секреції ТМЕ-са в СОвя ії СО4кТ-клітинах з селезінок мишей Ваї!р/С, вакцинованих рМ-Соге.
І0О56)| Фігура 19 ілюструє збільшену амплітуду секреції ТМЕ-4 в СОвж ії СО4--Т-клітинах з селезінок мишей Ваї!р/С, вакцинованих рМ-Соге.
І0О57| Фігура 20 ілюструє збільшену амплітуду секреції СО 107а в СОв'- і СО4-Т-клітинах з селезінок мишей Ваї!р/С, вакцинованих рМ-Соге.
І0О58) Фігура 21 ілюструє збільшену амплітуду секреції 7 СО 107а в СОв- ії СО4--Т-клітинах з селезінок мишей Ваї!р/С, вакцинованих рМ-Соге. 0059) Фігура 22 ілюструє середній відсоток НВсАд-специфічних СО4 або СО8 ІЕМ-ук, ТМЕ- са- секретуючих клітин від мишей Ваїр/с, імунізованих контролем рМмАХ або консенсусним коровим антигеном рмМсСоге.
І0О60О| Фігура 23 ілюструє середній відсоток НВсАд-специфічних СО4 або СО8 двічі позитивних продукуючих клітин від мишей ВаїБр/с, імунізованих контролем рмАХ або консенсусним коровим антигеном рмесоге.
І0О61) Фігура 24 ілюструє інтерферон-гамма Т-клітинну відповідь у печінці мишей Ваїр/С, вакцинованих рмМ-Соге. (0062) Фігура 25 ілюструє інтерферон-гамма Т-клітинну відповідь у печінці мишей Ваїр/С, вакцинованих рмМ-Соге. 0063) Фігура 26 ілюструє Т-клітинну відповідь фактора-х некрозу пухлини у печінці мишей
Ва!р/С, вакцинованих рмМ-Соге. (0064) Фігура 27 ілюструє Т-клітинну відповідь фактора-сх некрозу пухлини у печінці мишей
Ва!р/С, вакцинованих рмМ-Соге.
І0О65| Фігура 28 ілюструє відсоток НВсАд-специфічних СО4 їі СО8 ІЕМ-ую, ТМЕ-ах продукуючих клітин у печінці мишей ВаїБр/с, імунізованих контролем рМмАХ або консенсусним коровим антигеном рмМесоге. (610) ІЇ0О6б| Фігура 29 ілюструє середній відсоток НВсАд-специфічних СО4 або СО8 двічі позитивних продукуючих клітин у печінці мишей Ваїр/с, імунізованих контролем рМАХ або консенсусним коровим антигеном рмесоге.
І0067| Фігура 30 ілюструє продукцію антиген-специфічних антитіл у спленоцитах. Значення являють собою середнє ж стандартну помилку середнього. Значущість визначали згідно з 1- тестом Ст'юдента. 0068) Фігура 31 ілюструє дані аналізу ЕГІЗРОТ.
І0069| Фігура 32 ілюструє частоту НВсАд-специфічних ІЕМ-у плямоутворюючих одиниць (ЗЕ) на мільйон спленоцитів після стимуляції клітин селезінки імунізованих мишей. 00701 Фігура 33 ілюструє дані експериментів з використанням С5РЕ-мічених клітин для порівняння елімінації оброблених пептидом клітин-мішеней іп мімо з допомогою СОВ8 Т-клітин у вакцинованих і невакцинованих тварин. 0071) Фігура 34 ілюструє специфічний цитоліз іп мімо. Дві групи мишей, імунізованих рмМах (контроль) або рМсСоге, отримували СЕБ5Е-мічені клітини-мішені (СЕБЕНі пульсували з нерелевантним пептидом або СЕБЕНі пульсували з епітоп-специфічним пептидом) через хвостову вену. СЕБЕ-мічені клітини, відновлені та проаналізовані з допомогою ЕАС5Б, використовували для визначення відсотка цитолізу. 00721 Фігура 35 ілюструє порівняння відсотка проліферації СОЗ3-004- клітин і СОЗ3-СО8 к, оброблених вектором рМах (контроль) або плазмідою рМСоге, яка експресує МСоге НВУ. 00731 Фігура 36 ілюструє відсоток проліферації СО4 і СОВ8 Т-клітин.
І0074| Фігури 37А і 37В ілюструють порівняння анти-НВМ кору ІдсС;і і ІА в серійному розведенні сироватки від тварин, оброблених вектором рМах (контроль) або плазмідою рМсСог, яка експресує МСоге НВУ.
І0075| Фігура 38 ілюструє НВсАд-специфічну гуморальну імунну відповідь, викликану рМсСоге, в сироватці та спленоцитах. Значення являють собою середнє ж стандартну помилку середнього. Значущість визначали згідно з Ї-тестом Стьдента.
І0076| Фігура 39 ілюструє НВсАд-специфічну гуморальну імунну відповідь, викликану рмМсСоге, в сироватці та спленоцитах. Значення являють собою середнє х стандартну помилку середнього. Значущість визначали згідно з Ї-тестом Стьдента. 00771 Фігура 40 ілюструє відсоток ТМЕ-а і ІЕМ-у з СО4-- ії СОв8 ж клітин селезінки і печінки.
І0078| Фігура 41 ілюструє дані експериментів з визначення того, чи впливає кліренс, індукований імунізованими мишами, на печінку, шляхом вимірювання рівнів АЇ т в сироватці.
І0079| Фігура 42 ілюструє імунофарбування відділів печінки, взятих через три дні після гідродинамічної ін'єкції РВ5, рМСоге (НВсАд) або рМ53/4А (НСМ М53-4А) від наївних мишей і мишей, які були імунізовані рМсоге. Кліренс набагато вищий для рМсСоге-імунізованої печінки порівняно з М5З3/4а-трансфікованою контрольною печінкою. Експресію РМсоге або М5З3/4а виявляли з допомогою антитіла до НА (білі/світло-сірі клітини).
І0О80| Фігура 43 ілюструє результати через З дні після трансфекції, в які клітини було проаналізовано з приводу експресії маркера дегрануляції, експресії СО107а та ІЄМ-уж після стимуляції пептидами НВсАд. 00811 Фігура 44 ілюструє рівні АЇ Т в сироватці в день 3, 6 і 12 після трансфекції, рівні були виміряні і не довели підвищення у релевантних вакцинованих тварин. (00821 Фігура 45 ілюструє загальні клітинні імунні відповіді у мавп, імунізованих малою (тобто рМСоге, рень А і рень С), довгою (тобто рМСоге, рІНЬ А і рінь с) їі довгою « 1-12 (тобто рмМсСотге, рІ-НЬ А, рі-НЬ С і рі -12) вакцинами. 0083) Фігура 46 ілюструє кор-специфічні клітинні імунні відповіді у мавп, імунізованих малою (тобто рМСоге, роНЬ А і рень С), довгою (тобто рМСоге, рРІЕНЬ А і рі Нь С) і довгою « 1-12 (тобто рМсСоге, рі -НЬ А, рі НЬ С і риП--12) вакцинами. 0084) Фігура 47 ілюструє клітинні імунні відповіді, спеціфічні до поверхневого антигену А, у мавп, імунізованих малою (тобто рМСоге, рень А ї рень С), довгою (тобто рМСоге, рІНЬ А і рінЬь с) і довгою « 1І-12 (тобто рМСоге, рі НЬ А, рі НЬ С і ри -12) вакцинами. 00851 Фігура 48 ілюструє дані аналізу ЕГІБРОТ клітинних імунних відповідей, специфічних до поверхневого антигену С, у мавп, імунізованих малою (тобто рМСоге, рень А їі рень с), довгою (тобто рМмСоге, рІНЬ А і р -НЬ С) і довгою « 1-12 (тобто рМСогє, рРІНБ А, рІ НЬ С і рті-- 12) вакцинами. 0086) Фігура 49 ілюструє загальні клітинні імунні відповіді у мавп, імунізованих малою (тобто рМСоге, рень А і рень С), довгою (тобто рМСоге, рІНЬ А і рінь с) їі довгою « 1-12 (тобто рмМсСотге, рІ-НЬ А, рі-НЬ С і рі -12) вакцинами.
І0087| Фігура 50 ілюструє порівняння рівнів анти-НВМ антитіл у серійному розведенні сироватки від мавп, імунізованих малою (тобто рМСоге, рень А і роНнНЬ С), довгою (тобто 60 рмМСоге,рРІНБ А Її рі НЬ С) і довгою «ІІ -12 (тобто рМСоге, рі НЬ А, рі НЬ С і ри -12) вакцинами.
І0О88| Фігура 51 ілюструє порівняння рівнів анти-НВМ антитіл в серійному розведенні сироватки від тварин, імунізованих довгою «іІЇ-12 (тобто рМсоге, рІНЬ А, рі НЬ С ї ри -12) вакциною.
І0089)| Фігура 52 ілюструє ДНК-конструкт поверхневого антигену НВМ і його експресію. (А)
Філогенетичний аналіз консенсусних послідовностей НВ: генотипів А і С порівняно з природним
НВ». Консенсусні послідовності вказані зірочками. (В) Схематична діаграма НВз5-генних вставок в ДНК-плазміди. р НВ5 і реНВ5 являють собою великі і маликі білкові антигени НВ5. Білки ргеб1, ргеб52 і основний 5-білок приєднані до ендопротеолітичних сайтів розщеплення. (С)
Виявлення ріНВ5 і раеНВ5 з допомогою внутрішньоклітинного фарбування трансфікованих клітин КО моноклональним антитілом і поліклональною мишачою сироваткою.
І0090| Фігура 53 ілюструє, що рі НВ5 і 5НВ5 викликають потужні гуморальні та Т-клітинні відповіді у ВАЇВ/с5. По п'ять мишей лінії Ваірб/с на групу імунізували в трьох різних експериментах і проаналізували їх з приводу індукції як гуморальної, так і клітинної відповіді. (А)
НВз5-специфічні Ідо реакції, виміряні через один тиждень після кожної імунізації. Стрілка вказує на час імунізації. (В) Загальні реакції ІЕМ-у, викликані кожним конструктом до синтетичних ргебз1/52 та основного З пептидів. (С) Характеристика НВз5-специфічних імуногенних детермінант з допомогою використання окремих пептидів НВ: в 16 і 12-матричних пулах І НВ: і
ЗНВ: відповідно. Це вказує на розширення клітинно-опосередкованої імунної відповіді.
І00911 Фігура 54 ілюструє специфічний цитоліз іп мімо. Різні групи мишей, імунізовані або рмМах (контроль), або будь-яким з чотирьох конструктів НВ5, отримали СЕ5Е-мічені клітини- мішені (СЕЗЕЇЮ, пульсуючі з нерелевантним пептидом, або СЕЗЕпПі, пульсуючі з епітоп- специфічним пептидом) через хвостову вену. Брали СЕЗЕ-мічені клітини, а аналізували з допомогою ЕАС5 (флуоресцентно-активований клітинний сортинг) використовували для кількісної оцінки відсотка цитолізу. 0092) Фігура 55 ілюструє, що вакцинний коктейль НВс/НВз викликає стійкі імунні реакції. (А)
НВз5-спеціфічні реакції антитіл з сироваток від мишей, імунізованих вакцинним коктейлем
НВ5/НВс в різні моменти часу імунізації (стрілка). (В) Відповіді ІЕМ-у після стимуляції спленоцитів ех мімо від мишей, імунізованих коктейлем НВз5/НВс. Імунізовані миші відповідали як на корові, так і поверхневі антигенні пептиди.
І0093| Фігура 56 ілюструє, що антиген-спеціфічні СО8 Т-клітини викликають продукцію противірусних цитокінів. Внутрішньоклітинне фарбування анти-вірусних цитокінів після ех-мімо стимуляції спленоцитів від мишей ВАЇ В/с з різних імунізованих груп (Таблиця 3). Лімфоцити фарбували антитілами до СОЮЗ, 204, СОв8, ІЄМ-у, ТМЕ-а, 1-2 ії С0О107а. Ці дані представлені 4 мишами з кожної групи в З різних експериментах.
І0094| Фігура 57 ілюструє імуногенність у приматів крім людини. П'ять макак-резусів імунізували внутрішньом'язово ронНВ5/рмСоге, ріНВ5/рМСоге або ріНВз5/рмсСогекріЇ-12 (Таблиця 4), а потім з допомогою електропорації. Мавпи отримали три щеплення. (А) Високі титри антитіл до НВ5 спостерігалися тільки після 2 щеплення. (В) Відповіді ІЕМ-у вимірювали один раз перед першою імунізацією і через 2 тижні після кожної імунізації. (С) Багато позитивних
НВ» матричних пептидних пулів спостерігалось у більшості мавп з різних груп, підтверджуючи широкі Т-клітинні відповіді у імунізованих макак. (0) Внутрішньоклітинне фарбування (ІЕМ-у,
ТМЕ-а, 1-2) РВМС» після останньої імунізації показує продукування НВ: і НВс-специфічних антивірусних цитокінів як в СО4, так і в СО8.
І0095| Фігури 58А-580 ілюструють безпеку терапевтичної НВМ-вакцини у макак-резусів.
Зразки аналізували перед вакцинацією (рге), після третьої вакцинації (Зга), перед четвертою вакцинацією (рге4ій), після четвертої вакцинації (411). Була помилка аналізу на лужну фосфатазу після третьої вакцинації. Нормальний діапазон для всіх вимірювань зображений пунктирними лініями. (А) Лужна фосфатаза в сироватці. (В) Рівні аланінамінотрансферази (А! Т) в сироватці. (С) Рівні аспартатамінотрансферази (А5БТ) в сироватці. (0) Рівні загального білірубіну в сироватці. (Е) Рівні креатиніну в сироватці. (Є) Рівні азоту сечовини в сироватці крові.
І0096| Фігури 59А-590 ілюструють анотацію послідовностей для чотирьох плазмід НВ».
Послідовності лідера ІДЕ, ендопротеолітичного сайту розщеплення і С-кінцевої НА-мітки підкреслені. Чотири НВ» плазміди: великий поверхневий білок генотипу А (рі НВ5-А) (А) і малий поверхневий білок (реНВ5-А) (В) і великий поверхневий білок генотипу С (рі НВ5-С) (С) і малий поверхневий білок (рЗНВ5-С) (0).
Докладний опис
І0097| Винахід стосується високооптимізованих полівалентних синтетичних імуногенів вірусу гепатиту В (НВУ), що викликають утворення антитіл і клітинно-опосередкований імунітет проти (610) НВМ-поверхневих (НВ5) і НВМ-корових (НВс) антигенів. Ці плазміди, які кодують найбільш поширені генотипи вірусу, індукують зв'язуючі антитіла до НВ5-антигенів і збуджують надійний клітинний імунітет (СМІ) до обох НВс і НВ» антигенів. Плазміди незалежно викликають широкі крос-реактивні Т-клітинні відповіді і відповіді 3 високим титром антитіл, а також вакциноіїндуковану цитотоксичну активність. Плазмідні коктейлі, що містять обидва поверхневі антигени, індукують сильну і широку клітинну імунну відповідь з кількох антигенних епітопів, зокрема, широку перехресну реактивність між генотипами А і С вірусу. Оптимізовані плазмідні коктейлі, що кодують антигени НВ: і НВс, індукували сильну гуморальну і клітинну відповідь, націлену на 5-антиген, і спричиняли різні мультиепітопні реакцій, пов'язані з очищенням інфікованих гепатоцитів. (0098) Зокрема, даний винахід належить до вакцин проти вірусу гепатиту В (НВУ), які можуть бути використані для захисту людини від НВУ-інфекції і забезпечити терапевтичні переваги індивідууму з діагнозом НВУ-інфекції. Такі вакцини також можуть бути використані для індукції імунної відповіді проти антигену НВМ. НВУ-вакцини згідно з даним винаходом містять одну або кілька молекул нуклеїнових кислот. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти кодує один або кілька консенсусних корових білків НВМ. Консенсусні корові білки НВМ отримують з послідовностей корових білків генотипів А, В, С, О ії Е НВУ, і, отже, консенсусні корові білки НВМ є унікальними. Молекули нуклеїнових кислот можуть також кодувати один або більше імуногенних фрагментів консенсусних корових білків НВУ.
Ї0099| Крім того, молекули нуклеїнових кислот можуть кодувати один або більше консенсусних поверхневих антигенів НВМУ. Консенсусні поверхневі антигени НВМ отримують з послідовностей поверхневих антигенів з ізолятів генотипу А НВУМ, їі, отже, консенсусні поверхневі антигени НВМ є унікальними. Консенсусні поверхневі антигени НВМ також можуть бути отримані з послідовностей поверхневих антигенів з ізолятів генотипу С НВУ, даючи унікальні поверхневі антигени НВУ. Молекули нуклеїнової кислоти можуть також кодувати один або більше імуногенних фрагментів консенсусних поверхневих антигенів НВУ.
І00100| Вакцина згідно з даним винаходом може включати будь-яку комбінацію молекул нуклеїнових кислот, що кодують консенсусний коровий білок НВУ, та/або молекули нуклеїнових кислот, що кодують консенсусний поверхневий антиген НВУ. Вакцина також може включати будь-яку комбінацію молекул нуклетових кислот, що кодують імуногенні фрагменти консенсусного корового білку НВУ, та/або молекул нуклеїнових кислот, що кодують імуногенні фрагменти консенсусного поверхневого антигену НВУ. 00101) Ці комбінації корового білку НВМ і поверхневого антигену НВМ дивно і неочікувано індукують виражену диференційну імунну відповідь на коровий білок НВМ і поверхневий антиген
НВУ. Іншими словами, сила імунної відповіді на коровий білок НВМ і поверхневий антиген НВМ відрізняється в залежності від конкретної комбінації, що вводиться суб'єкту. Відповідно, будь- який користувач вакцини згідно з даним винаходом може створити вакцину, яка містить певну комбінацію, щоб викликати бажану імунну відповідь у суб'єкта, якому вводять таку розроблену вакцину. Таким чином, будь-який користувач може адаптувати вакцину згідно з даним винаходом, щоб контролювати рівень імунної відповіді у суб'єкта.
І00102| Вакцина згідно з даним винаходом широко застосовується для різних типів НВМ завдяки унікальним послідовностям консенсусного корового білку НВМУ і поверхневого антигену
НВУ.
ІЇ00103| Вакцина згідно з даним винаходом може додатково включати одну або кілька молекул нуклеїнових кислот, як описано вище, і один або кілька білків, що кодуються такими молекулами нуклеїнових кислот. 1. Визначення
І00104| Термінологія, використана в цьому документі з метою опису конкретних варіантів здійснення, не призначена для обмеження. Як використовується в даному описі і прикладеній формулі винаходу, форми однини включають посилання на множину, якщо з контексту явно не випливає інше. 00105) Для читання числових діапазонів в даному документі, кожне проміжне число між ними з тим самим ступенем точності явно передбачене. Наприклад, для діапазону 6-9, числа 7 і 8 розглядаються на додаток до 6 і 9, а для діапазону 6,0-7,0, числа б,0, 6,1,6,2,6,3, 6, 4, 6,5, 6,6, 6,7, 6.8, 6,9,6.9 і 7,0 явно чином передбачені. 00106) "Ад'ювант", як використовується в даному документі, означає будь-яку молекулу, додану до ДНК-плазмідних вакцин, описаних у цьому документі, для підвищення імуногенності антигенів, кодованих ДНК-плазмідами і кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот, описаними в цьому документі нижче.
І00107| "Антитіло", як використовується в даному документі, означає антитіло класів Ідс, (610) І9М, ІдЧА, дО або ІЧзЗЕ, або фрагменти, або їх фрагменти або похідні, включаючи Раб, Е (аб У 2,
ЕО і одноланцюгові антитіла, діатіла, біспеціфічні антитіла, біфункціональні антитіла і їх похідні.
Антитіло може являти собою антитіло, виділене зі зразка сироватки ссавця, поліклональне антитіло, афінно очищене антитіло або їх суміші, які мають достатню специфічність зв'язування з потрібним епітопом або послідовністю, отриманою з нього. 00108) "Кодуюча послідовність" або "кодуюча нуклеїнова кислота", як використовується в даному документі, означає нуклеїнові кислоти (РНК або ДНК-молекули), які містять нуклеотидну послідовність, що кодує білок. Кодуюча послідовність може додатково включати сигнали ініціації і термінації, функціонально пов'язані з регуляторними елементами, в тому числі з промотором і сигналом поліаденилювання, здатними контролювати експресію в клітинах людини або ссавців, яким вводять нуклеїнову кислоту.
Ї00109| "Комплемент" або "комплементарний", як використовується в даному документі, означає нуклеїнову кислоту, може означати спарювання основ між нуклеотидами або нуклеотидними аналогами молекул нуклеїнових кислот за Уотсоном-Кріком (наприклад, А-Т/О і
С-о) або Хугстеном.
ІЇ00110| "Консенсус" або "консенсусна послідовність", як використовується в даному документі, означає поліпептидну послідовність, засновану на аналізі вирівнювання декількох субтипів конкретного НВУ-антигену, такого як коровий або поверхневий антиген НВУ. Можуть бути отримані послідовності нуклеїнових кислот, які кодують консенсусну поліпептидну послідовність. Вакцини, що містять білки, які містять консенсусні послідовності та/або молекули нуклеїнових кислот, які кодують такі білки, можуть бути використані для індукування імунітету проти широкого спектру субтипів або серотипів конкретного антигену НВУМ.
Ї00111)| "Електропорація", "електропермеабілізація" або "електро-кінетичний енхансмент"
СЕР"), як використовується в даному документі взаємозамінно, означає використання імпульсу трансмембранного електричного поля для утворення мікроскопічних пор в біомембранах, внаслідок чого біомолекули, такі як плазміди, олігонуклеотиди, міРНК, ліки, іони і вода, можуть проникати через клітинну мембрану. 00112) "Фрагмент", як використовується в даному документі щодо послідовності нуклеїнової кислоти, означає послідовність нуклеїнової кислоти, або її частину, яка кодує поліпептид, здатний викликати імунну відповідь у ссавця та, перехресно реагувати з повнорозмірним антигеном штаму НВМ дикого типу. Фрагменти можуть бути фрагментами ДНК, вибраними з принаймні однієї з різних нуклеотидних послідовностей, які кодують білкові фрагменти, викладені нижче.
ІЇ00113| "Фрагмент" або "їмуногенний фрагмент" щодо поліпептидних послідовностей означає поліпептид, здатний викликати імунну відповідь у ссавця, який перехресно реагує з повнорозмірним антигеном штаму НВМ дикого типу. Фрагменти консенсусних білків можуть містити принаймні 10 96 принаймні 2095 принаймні 30 96 принаймні 40 95 принаймні 50 95 принаймні 6095 принаймні 7095 принаймні 8095 принаймні 9095 або принаймні 9595 консенсусного білку. В деяких варіантах здійснення, фрагменти консенсусних білків можуть містити принаймні, 20 амінокислот або більше принаймні 30 амінокислот або більше, принаймні, 40 амінокислот або більше принаймні 50 амінокислот або більше принаймні 60 амінокислот або більше принаймні 70 амінокислот або більше принаймні 80 амінокислот або більше принаймні 90 амінокислот або більше принаймні 100 амінокислот або більше принаймні 110 амінокислот або більше принаймні 120 амінокислот або більше принаймні 130 амінокислот або більше принаймні 140 амінокислот або більше принаймні 150 амінокислот або більше принаймні 160 амінокислот або більше принаймні 170 амінокислот або більше принаймні 180 амінокислот або більше принаймні 190 амінокислот або більше принаймні 200 амінокислот або більше принаймні 210 амінокислот або більше принаймні 220 амінокислот або більше принаймні 230 амінокислот або більше, або принаймні 240 амінокислот або більше консенсусного білку. (00114) Як використовується в даному документі, термін "генетичний конструкт" належить до молекул ДНК або РНК, які містять нуклеотидну послідовність, що кодує білок. Кодуюча послідовність включає сигнали ініціації і термінації, функціонально зв'язані з регуляторними елементами, включаючи промотор і сигнал поліаденилювання, здатні контролювати експресію в клітинах індивідуума, якому вводять молекулу нуклеїнової кислоти. Як використовується в даному документі, термін "експресуюча форма" відноситься до генних конструктів, що містять необхідні регуляторні елементи, функціонально зв'язані з кодуючою послідовністю, яка кодує білок, і забезпечують експресію кодуючої послідовності в клітині індивідуума.. (00115) Термін "гомологія", як використовується в даному документі, стосується ступеня комплементарності. Може бути часткова гомологія або повна гомологія (тобто ідентичність).
Частково комплементарну послідовність, яка принаймні частково інгібує гібридизацію повністю 10) комплементарної послідовності з нуклесновою кислотою-мішенню, називають з допомогою функціонального терміну "по суті гомологічна". При використанні щодо послідовності дволанцюгової нуклеїнової кислоти, такої як кКДНК або геномний клон, термін "по суті гомологічні», як використовується в даному документі, відноситься до зонду, який може гібридизувати з ланцюгом послідовності дволанцюгової нуклеїнової кислоти в умовах пониженої жорсткості. При використанні щодо послідовності одноланцюгової нуклеїнової кислоти термін "по суті гомологічні" як використовується в даному документі, стосується зонду, який може гібридизувати з (тобто є комплементом) матричною послідовністю одноланцюгової нуклеїнової кислоти в умовах пониженої жорсткості. 00116) "Ідентичні" або "ідентичність", як використовується в даному документі в контексті двох або більше нуклеїнових кислот або поліпептидних послідовностей, означає, що послідовності мають певний відсоток залишків, які є однаковими в межах певної ділянки.
Відсоток може бути розрахований шляхом оптимального вирівнювання двох послідовностей, порівняння двох послідовностей у зазначеній ділянці, визначення числа положень, в яких ідентичні залишки присутні в обох послідовностях з отриманням числа співпадаючих положень, ділення числа співпадаючих положень на загальну кількість положень в зазначеній ділянці, і множення результату на 100 для отримання відсотка ідентичності послідовностей. У тих випадках, коли ці дві послідовності мають різну довжину або в результаті вирівнювання отримують один або кілька розташованих у шаховому порядку кінців і певна ділянка порівняння включає тільки одну послідовність, залишки однієї послідовності включені в знаменник, але не у чисельник розрахунку. При порівнянні ДНК і РНК, тимін (Т) ії урацил (0) можна вважати еквівалентними. Ідентичність може бути розраховано вручну або з допомогою комп'ютерного алгоритму послідовностей, такого як ВІ А5Т або ВІ АБ5Т 2.0. (00117) "Імунна відповідь", як використовується в даному документі, означає активацію імунної системи хазяїна, наприклад, ссавця, у відповідь на введення антигену, такого як консенсусний антиген НВУ. Імунна відповідь може бути у вигляді клітинної або гуморальної відповіді, або того й іншого. 00118) "Нуклеїнова кислота" або "олігонуклеотид" або "полінуклеотид", як використовується в даному документі означає принаймні два нуклеотиди, ковалентно зв'язані один з одним. Опис одного ланцюга також визначає послідовність комплементарного ланцюга. Таким чином, нуклеїнова кислота включає також ланцюг, комплементарний до описаного одного ланцюга.
Багато варіантів нуклеїнової кислоти можуть бути використані з тією ж метою як і певна нуклеїнова кислота. Таким чином, нуклеїнова кислота включає також по суті ідентичні нуклеїнові кислоти і їх комплементи. Один ланцюг забезпечує зонд, який може гібридизуватись з послідовністю-мішенню в жорстких умовах гібридизації. Таким чином, нуклеїнова кислота також включає зонд, який гибрідизується в жорстких умовах гібридизації. 00119) Нуклеїнові кислоти можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими, або можуть містити ділянки як дволанцюгової, так і одноланцюгової послідовності. Нуклеїнова кислота може являти собою ДНК, як геномні, так і КДНК, РНК або гібрид, у якому нуклеїнова кислота може містити комбінації дезоксирибо- і рибонуклеотидів, і комбінації основ, включаючи урацил, аденін, тимін, цитозин, гуанін, інозин, ксантин гіпоксантин, ізоцитозин та ізогуанін. Нуклеїнові кислоти можуть бути отримані методами хімічного синтезу або рекомбінантними способами. (00120) Термін "функціонально зв'язаний", як використовується в даному документі, означає, що експресія гену знаходиться під контролем промотора, з яким він просторово зв'язаний.
Промотор можна розташувати в положенні 5 "Чирвзігеат) або 3' (дом/пбзігеат) гену під його контролем. Відстань між промотором і геном може бути, приблизно такою ж, як відстань між цим промотором і підконтрольним йому геном, в гені, з якого походить промотор. Як відомо в даній галузі техніки, зміна цієї відстані може забезпечуватися без втрати функції промотора.
І00121| "Промотор", як використовується в даному документі, означає синтетичну або природну молекулу, яка здатна надавати, активувати або посилювати експресію нуклеїнової кислоти в клітині. Промотор може включати одну або більше конкретних послідовностей, що регулюють транскрипцію, щоб додатково підсилити експресію та/або змінити просторову експресію та/або тимчасову експресію нуклеїнової кислоти. Промотор може також містити дистальні енхансерні або репресорні елементи, які можуть розміщуватися на відстані до кількох тисяч пар основ від стартового сайту транскрипції. Промотор може бути отриманий, зокрема, з таких джерел як, вірусні, бактеріальні, грибкові, з рослин, комах і тварин. Промотор може регулювати експресію генного компонента конститутивно, або диференційовано щодо клітини, тканини або органу, в якому відбувається експресія або щодо стадії розвитку, при якій відбувається експресія, або у відповідь на зовнішні подразники, такі як фізіологічні стреси, патогенні мікроорганізми, іони металів або індукуючі агенти. Репрезентативні приклади (610) промоторів включають промотор бактеріофагу 77, промотор бактеріофагу Т3, промотор 5Рб,
ГАС, промотор Іас-оператора, (ас-промотор, пізній промотор 5М40, ранній промотор 5М40, промотор КБЗМ-ІТК, промотор СММ ІЕ, ранній промотор 5М40 або пізній промотор 5М40 і промотор СММ ІЕЕ.
І00122| "Сигнальний пептид" і "лідерна послідовність" використовуються в даному документі взаємозамінно і відносяться до амінокислотної послідовності, яка може зв'язуватися з аміно- кінцем білку НВУ, описаного в даному документі. Сигнальні пептиди/лідерні послідовності, як правило, направляють локалізацію білка. Сигнальні пептиди/лідерні послідовності, що використовуються в цьому описі, переважно сприяють секреції білку з клітини, в якій він продукується. Сигнальні пептиди/лідерні послідовності часто відщеплюються від іншої частини білку, часто згадуваного як зрілий білок, при секреції з клітини. Сигнальні пептиди/лідерні послідовності приєднуються до М-кінця білку. 00123) "Жорсткі умови гібридизації", як використовується в даному документі, означають умови, за яких перша послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, зонд) гібридизується з другою послідовністю нуклеїнової кислоти (наприклад, мішенню), такою як у складній суміші нуклеїнових кислот. Жорсткі умови залежать від послідовності і відрізнятимуться за різних обставин. Жорсткі умови можуть означати температуру для конкретної послідовності, нижчу за точку плавлення (Тт) приблизно на 5-10 С при певних іонній силі і рН. Тт може бути температурою (при певних іонній силі, рН їі концентрації нуклеїнової кислоти), за якої 50 Фо зондів, комплементарних мішені, гібридизуються з послідовністю-мішенню в рівновазі (так як послідовності-мішені присутні в надлишку, при Тт, 50 90 зондів зайняті в рівновазі). Жорсткі умови можуть бути такими, при яких концентрація солі становить менше ніж приблизно 1,0 М іона натрію, наприклад, приблизно 0,01-1,0 М концентрація іона натрію (або інших солей) при
РН від 7,0 до 8,3, а температура становить принаймні приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, приблизно 10-50 нуклеотидів) і принаймні приблизно 60 С для довгих зондів (наприклад, більше ніж приблизно 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть бути також досягнуті при додаванні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Для селективної або специфічної гібридизації позитивний сигнал може становити принаймні від 2 до 10 разів фонової гібридизації. Приклади жорстких умов гібридизації включають наступне: 50 95 формамід, 5- кратний З55С і 195 505, інкубація при 42 "С, або, 5х 550, 195 5О5, інкубація при 65 С, з промиванням в 0,2 х 55С і 0,1 956 505 при 65 76. 00124) "Практично комплементарні", як використовується в даному документі, означає, що перша послідовність принаймні на 60 95, 65 5, 70 90, 75 95, 80 Фо, 85 95, 90 Фо, 95 Уо, 97 9о, 98 Фо або 99 95 ідентична комплементу другої послідовності по ділянці з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 або більше нуклеотидів або амінокислот, або що дві послідовності гібрідизують в жорстких умовах гібридизації. (00125) "Практично ідентичні", як використовується в даному документі, означає, що перша послідовність принаймні на 60 95, 65 Зв, 70 Зо, 75 в, 80 У, 85 95, 90 9, 95 95, 97 Уо,, 98 96 або 99 95 ідентична по ділянці з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40,45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 або більше нуклеотидів або амінокислот або відносно нуклеїнових кислот, якщо перша послідовність, по суті, доповнює склад другої послідовності. 00126) "Субтип" або "серотип": як використовується в даному документі, взаємозамінні, і щодо НВМ означає генетичні варіанти НВМ, при яких один субтип розпізнається імунною системою окремо від іншого субтипу.
І00127| "Варіант", використовуваний в даному документі у зв'язку з нуклеїновою кислотою, означає (І) частину або фрагмент зазначеної нуклеотидної послідовності; (І) комплемент зазначеної нуклеотидної послідовності або її частини; (І) нуклеїнову кислоту, яка по суті ідентична зазначеній нуклеїновій кислоті або її комплементу; або (ІМ) нуклеїнову кислоту, яка гібрідизується в жорстких умовах з вказаною нуклеїновою кислотою, її комплементом, або послідовності, по суті, ідентичні їй. (00128) "Варіант" щодо пептиду або поліпептиду, який відрізняється за амінокислотною послідовністю вставкою, делецією або консервативним заміщенням амінокислот, але зберігає принаймні одну біологічну активність. Варіант може також означати білок з амінокислотною послідовністю, яка по суті ідентична вказаному білку з амінокислотною послідовністю, яка зберігає принаймні одну біологічну активність. Консервативне заміщення амінокислоти, тобто заміна амінокислоти іншою амінокислотою з подібними властивостями (наприклад, гідрофільністю, ступенем і розподілом заряджених ділянок), визнається в рівні техніки, як правило, таким, що включає незначні зміни. Ці незначні зміни можуть бути визначені, зокрема, 10) при розгляді індексу гідропатичних амінокислот, як відомо в даній галузі. Куїе еї аї., У). Мої. Віо|.
157:105-132 (1982). Індекс гідропатичних амінокислот. Гідропатичний індекс амінокислоти визначається їїгідрофобністю і зарядом. Як відомо в даній галузі техніки, амінокислоти з подібними індексами гідропатичності можуть бути заміщеними і як раніше зберігати функцію білка. В одному аспекті, амінокислоти, що мають індекси гідропатичності - 2 заміщуються.
Гідрофільність амінокислот може бути також використана для виявлення заміщень, які могли б дати білки, що зберігають біологічну функцію. Розгляд гідрофільності амінокислот в контексті пептиду дозволяє розрахувати найбільшу локальну середню гідрофільність цього пептиду, корисний вимір, який, як повідомлялося, добре корелює з антигенністю та імуногенністю. Патент
США Мо 4554101, включений до даного документу у повному обсязі шляхом посилання.
Заміщення амінокислот, що мають аналогічні величини гідрофільності, може призвести до пептидів, що зберігають біологічну активність, наприклад, імуногенність, як відомо в даній галузі. Заміщення можуть бути виконані з амінокислотами, які мають значення гідрофільності в межах ж 2 відносно один одного. Як індекс гідрофобності, так і значення гідрофільності амінокислот залежать від конкретного бічного ланцюга цієї амінокислоти. Відповідно до цього спостереження, амінокислотні заміщення, які сумісні з біологічною функцією, як мається на увазі, залежать від відносної подібності амінокислот і, зокрема, бічних ланцюгів цих амінокислот, як виявлено з допомогою гідрофобності, гідрофільності, заряду, розміру і інших властивостей.
І00129| "Вектор", як використовується в даному документі, означає послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить точку початку реплікації. Вектор може бути вірусним вектором, бактеріофагом, бактеріальною штучною хромосомою або штучною хромосомою дріжджів.
Вектор може бути ДНК- або РНК-вектором. Вектор може бути самовідтворюваним екстрахромосомним вектором, і переважно являє собою плазмідну ДНК. 2. Вакцини
І00130)| Даний винахід стосується вакцини проти гепатиту В. Вакцина проти гепатиту В (НВМ) може містити нуклеїнову кислоту, що кодує коровий антиген НВУ, поверхневий антиген НВМ або їх комбінацію; коровий антиген НВУ, поверхневий антиген НВУ або їх комбінації, або комбінацію (1) нуклеїнової кислоти, що кодує коровий антиген НВМ та/або поверхневий антиген НВУ, і (2) корового антигену НВМ та/або поверхневого антигену НВМ, або (3) їх комбінації. Коровий антиген НВМ може містити консенсусний білок, отриманий з амінокислотних послідовностей капсидних білків від різних генотипів НВУ. Аналогічним чином, поверхневий антиген НВМ може містити консенсусний білок, отриманий з амінокислотних послідовностей поверхневих антигенів від декількох генотипів НВУ. Такий коровий білок НВМУ і консенсусні поверхневі антигени НВМ є унікальними і мають схожість з коровими і поверхневими антигенами, відповідно, в цілому по декільком генотипам НВМУ. Таким чином, вакцина згідно з даним винаходом застосовна до декількох типів НВМ і підходить для поширених популяцій. Крім того, вакцина згідно з даним винаходом може бути пристосована до конкретних нуклеїнових кислот, що кодують консенсусний коровий білок НВМ, консенсусний поверхневий білок НВМ або їх комбінацію.
Іншими словами, вакцина згідно з даним винаходом може бути призначена для контролю рівня або сили імунної відповіді у суб'єкта проти одного або кількох серотипів НВУ.
ІЇ00131| Вакцина може бути ДНК-вакциною. ДНК-вакцини розкриті в патентах США Мо 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 5962428, 5981505, 5580859, 5703055 і 5676594, які включені до даного опису повністю шляхом посилання. ДНК-вакцина може додатково містити елементи або реагенти, які інгібують її інтеграцію в хромосому. 00132) Вакцина може бути РНК капсидних білка НВУ та/або білком поверхневого антигену
НВУ. РНК-вакцина може бути введена в клітину. а. Коровий антиген НВМ 00133) Вакцина згідно з даним винаходом може містити коровий білок НВУ. Коровий білок
НВУ є мішенню для імунно опосередкованого вірусного кліренсу, викликаючи 1) цитотоксичні Т- лімфоцітні (СТІ) відповіді, 2) Т-хелперні відповіді та/або 3) відповіді В-клітин або, переважно всі вищевказані для перехресної презентації. 00134) Таблиця 2 показує схожість між генотипами корового антигену з генотипів НВМУ-А,
НВвУ-В, НВУ-С, НВУ-0 і НВУ-Е з консенсусним коровим білком НВУ, названим в графі як "НВУ-
М-соге". Для деяких варіантів здійснення конструкт М-Соге НВМ був розроблений для збільшення гомології для широкого кола корових мішеней НВУ. Подібності генотипів для корового антигену з розробленим конструктом М-Соге збільшили гомології для широкого кола корових мішеней НВМ. Всі генотипи мають бути представлені в універсальній імунній терапевтичній вакцині для НВУ.
Таблиця 2
Відсоток ідентичності корових білків НВМУ відсоток ідентичності 17112131 415161 171 1962962 )| 97,08 | 956 | 9854 | 1-НВМ-А-СопСо 2 139 | юю | 100 | 956 / 934 | 96,7 | 2-НВМ-В-СопСо відхилення. 31339101 | 956 934 | 967 || НВ Сопсов 4 122145 | 45 | | 978 | 97,8 || АНВМ-О-СопСоге 145 69 | 69 | 22 | | 956 || 5-НВМ-ЕСопСоє 6 | 717 34 | 34 | 22 | 45 | || бнвУ-М-Соє 1717112 | 31141561 00135) Антиген може містити епітопи корового білку, які роблять їх ефективними, зокрема, як імуногенів, проти якого анти-НВМУ імунні відповіді можуть бути індуковані. Антиген НВМ може 5 містити непроцесований продукт, його варіант, його фрагмент або їх комбінацію.
ІЇ00136| Коровий антиген НВМ може містити консенсусний білок. Консенсусний коровий антиген НВМ індукує антиген-специфічну Т-клітину і високий титр антитіл як системно, такі в печінці. Таким чином, захисна імунна відповідь забезпечується в печінці з допомогою вакцин, що містять консенсусний коровий антиген НВМ. Відповідно, будь-який користувач може створити вакцину згідно з даним винаходом, яка включає консенсусний коровий антиген НВУ, щоб забезпечити імунну терапію та/або захист печінки.
І00137| Зокрема, в індукованій імунній реакції, консенсусний коровий антиген НВМ стимулює спленоцити, зокрема СО4- клітини і СО8- клітини, секретувати або виробляти аналогічні кількості інтерферону-гамма (ІМЕ-у), але різні кількості фактора некрозу пухлини-альфа (ТМЕ-а).
Цікаво, індукована імунна відповідь є різною в селезінці і печінки. В селезінці, СО8-- клітини продукують як ІМЕ-у, так і ТМЕ-й4 більше, ніж СО4- клітини, проте в печінці відбувається зворотне. Іншими словами, СО4-- клітини продукують як ІМЕ-у, так і ТМЕ-а більше, ніж Сов клітини в печінці. Крім того, в печінці продукується більше антиген-специфічних ІдА ніж Ідс, а захисна імунна відповідь дивно та несподівано включає антиген-специфічну відповідь СТІ, яка не викликає пошкодження печінкиВідповідно, вакцина згідно з даним винаходом, що містить консенсусний коровий антиген НВМ, може бути доставлена на периферію, щоб налагодити антиген-специфічне націлювання в печінку для очищення або усунення НВУ-інфікованих клітин без пошкодження або запалення печінки.
ІЇ00138| Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують консенсусні корові білки НВМ, являють собою 5ЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО І МО:З і 5ЕО І МО:5. 5ЕО І МОС1 кодує консенсусний коровий білок НВУ. 5ЕО ІЮ МО:З кодує консенсусний коровий білок НВУ, приєднаний до лідеру
ІМЕ. 5ЕО ІО МО:5 кодує консенсусний коровий білок НВУ, приєднаний до лідеру ІЗЕ і НА-мітки.
Ї00139| Деякі варіанти здійснення належать до послідовностей нуклеїнових кислот, кодуючих білки, ідентичні або гомологічні консенсусному білкунвуУ, імуногенному фрагменту з консенсусного білку НВУ, та їх імуногенних фрагментів гомологічних білків. Такі молекули нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають до 95 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності в консенсусній послідовності, аж до 96 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності в консенсусній послідовності, до 96 9» ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності в консенсусній послідовності, до 97 Фо ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності в консенсусній послідовності, до 98 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності в консенсусній послідовності і до 9995 можуть бути надані. Крім того, послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі імуногенні фрагменти, вказані в даному документі, і імуногенні фрагменти білків, ідентичних білкам, вказаним в даному описі, також надаються. 00140) Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 95 956 гомологію з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 9695 гомологію з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 9795 гомологію з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 98 95 гомологію з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 9995 гомологію з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. В деяких варіантах здійснення, молекули нуклеїнових кислот з кодуючими послідовностями, описані в даному документі, які гомологічні кодуючій послідовності консенсусного білку, розкритого в даному документі, включають послідовності, кодуючі послідовність ІДЕ, приєднану до 5'-кінця кодуючої послідовності, яка кодує гомологічні білкові послідовності, описані в цьому документі.
І00141| Деякі варіанти здійснення належать до послідовностей нуклеїнових кислот, кодуючих білки з визначеним відсотком ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового консенсусного білку НВМУ, імуногенний фрагмент з корового консенсусного білку НВМ і імуногенні фрагменти корових корових консенсусних білків
НВУ. Такі молекули нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають до 80 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВМ, до 8595 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 90 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 91 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВМ, до 92 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 93 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 94 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВМ, до 9595 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 96 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 97 9о ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВМ, до 9895 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВУ, до 99 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірної корової консенсусної послідовності НВМ можуть бути надані. Крім того, послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі імуногенні фрагменти, вказані в цьому документі, і імуногенні фрагменти білків з аналогічним відсотком ідентичності, як вказано вище, з коровими білками НВУ, викладеними в даному документі, також передбачені. 00142) Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 80 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВУ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 8395 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВУ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 85595 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 90 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 91 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку
НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 92 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білюку НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 93 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВУ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 9495 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВУ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових 10) кислот, які кодують імуногенний білок, який має 95595 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВМУ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 96 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 97 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку
НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 9895 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білюку НВМ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенний білок, який має 99 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності непроцесованого корового білку НВУ, що кодується послідовностями нуклеїнових кислот згідно з даним документом. В деяких варіантах здійснення, молекули нуклеїнових кислот з кодуючими послідовностями, описаними в даному документі, які гомологічні кодуючій послідовності консенсусного корового білку НВМ, розкритого в даному документі, включають послідовності, кодуючі послідовність ІДЕ, приєднану до 5'-кінця кодуючої послідовності, яка кодує гомологічні білкові послідовності, описані в цьому документі.
І00143| В деяких варіантах здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти вільна від кодуючої послідовності, яка кодує лідерну послідовність. В деяких варіантах здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти вільна від кодуючої послідовності, яка кодує лідер ІЗЕ. (00144) Деякі варіанти здійснення належать до фрагментів ЗЕО ІЮ МО:1, 5ЗЕО ІО МО:З і 5ЕО
ІЮ МО:5. Фрагменти можуть складати принаймні 1095 принаймні 1595 принаймні 20 95 принаймні 25 96 принаймні 30 о принаймні 35 95 принаймні 40 96 принаймні 45 95 принаймні 5095 або принаймні 55 95, принаймнідою, принаймні, 60 95 принаймні 6595 принаймні 70 95 принаймні 75 95 принаймні 80 95 принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 від послідовностей 5ЕО ІЮ МО, 5ЕО
ІО МОЗ ї ЗЕО ІО МО:5. Фрагменти можуть бути принаймні на 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95, принаймнібо, принаймні, 9895 або принаймні 9995 ідентичними фрагментам послідовностей 5ЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮО МО:З і БЕО ІЮ МО:5. Фрагменти можуть бути принаймні на 80 95 принаймні 85 95 принаймні 90 9о, принаймнідо, принаймні, 91 9о принаймні 92 9о принаймні 93 95 принаймні 94 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 ідентичними фрагментам послідовностей 5ЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:З і 5ЕО ІЮ
МО:5. В деяких варіантах здійснення, фрагменти включають послідовності, які кодують лідерну послідовність, таку як, наприклад, імуноглобуліновий лідер, такий як лідер ІДЕ. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від кодуючих послідовностей, які кодують лідерну послідовність. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від кодуючих послідовностей, які кодують лідерну послідовність, таку як, наприклад, лідер ІДЕ. 00145) Крім того, амінокислотна послідовність консенсусного корового білку НВМ являє собою ЗЕО ІЮ МО:2. Амінокислотна послідовність консенсусного корового білку НВУ, приєднана до лідера ІДЕ, являє собою 5ЕО ІЮ МО:4. Зокрема, в 5ЕО ІО МО:4, лідер ІДЕ приєднаний до аміно-кінця консенсусного корового білку НВМ. Амінокислотна послідовність консенсусного корового білку НВУ, приєднана до лідера ІДЕ і НА-мітки, являє собою ЗЕО ІЮ МО:6. Вп 5ЕО ІО
МО:6, лідер ІЗЕ і НА-мітка приєднані до аміно-кінця і карбокси-кінця, відповідно, консенсусного корового білку НВУ. (00146) Деякі варіанти здійснення належать до білків, які гомологічні ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ
МО:4 і ЗЕО ІЮО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 95 95 гомологію з консенсусними білковими послідовностями, як вказано в 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІЮО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 96 95 гомологію з консенсусними білковими послідовностями, як вказано в 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО 4 або 5ЕО ІЮО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 97 95 гомологію з консенсусними білковими послідовностями, як вказано в 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО 4 або 5ЕО ІЮО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 98 95 гомологію з консенсусними білковими послідовностями, як вказано в 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО 4 або 5ЕО ІЮО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 99 95 гомологію з консенсусними білковими послідовностями, як вказано в ЗЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 або ЗЕО ІЮ МО:6.
І00147| Деякі варіанти здійснення належать до білків, які ідентичні ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІО 10) МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 8095 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО
ІО МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 8595 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 90 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕБЕО ІЮ МО:4 або 5БО ІЮ МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 91 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 92 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 93 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮО МО:4 або 5ЕО ІЮ МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 94 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІЮ МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 95 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІЮ МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 96 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 97 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 98 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 99 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІЮ МО:6. (00148) В деяких варіантах здійснення, білок вільний від лідерної послідовності. В деяких варіантах здійснення, білок вільний від лідера ІДЕ. Фрагменти консенсусних білків можуть містити принаймні 10 96 принаймні 1595 принаймні 20 95 принаймні 2595 принаймні 30 Фо принаймні 3595 принаймні 4095 принаймні 4595 принаймні 5095 або принаймні 55 965, принаймнібо, принаймні, 60 9о принаймні 65 95 принаймні 70 95 принаймні 75 95 принаймні 80 Фо принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 96 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 консенсусного білку. Імуногенні фрагменти послідовностей 5ЕО ІЮ
МО:2, БЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6 можуть бути надані. Імуногенні фрагменти можуть містити принаймні 10 96 принаймні 15 96 принаймні 20 95 принаймні 25 95 принаймні 30 956 принаймні 3595 принаймні 4095 принаймні 4595 принаймні 5095 або принаймні 55 95, принаймніоб, принаймні, 60 96 принаймні 65 95 принаймні 70 95 принаймні 75 96 принаймні 80 95 принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІОЮО МО:4 або 5ЕО ІЮ МО:6. В деяких варіантах здійснення, фрагменти включають лідерну послідовність, таку як, наприклад, імуноглобуліновий лідер, такий як лідер ІДЕ. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від лідерної послідовності. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від лідерної послідовності, такої як, наприклад, лідер ІЧЗЕ. 00149) Імуногенні фрагменти білків з амінокислотними послідовностями, гомологічними імуногенним фрагментам послідовностей 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮО МО:4 або 5ЕО ІЮО МО:6 можуть бути надані. Такі імуногенні фрагменти можуть містити принаймні 1095 принаймні 15 95 принаймні 20 95 принаймні 25 95 принаймні 30 96 принаймні 35 95 принаймні 40 95 принаймні 4595 принаймні 50 95 або принаймні 55 95, принаймнідо, принаймні, 60 95 принаймні 65 95 принаймні 70 96 принаймні 75 о принаймні 80 95 принаймні 85 956 принаймні 90 95 принаймні (610) 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 білків, які на 95 95 гомологічні послідовностям 5ЕО І МО:2, 5БЕО ІО МО:4 або 5ЕО ІЮ МО:6. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 96 95 гомологію з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 97 96 гомологію з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 98 95 гомологію з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 99 95 гомологію з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. В деяких варіантах здійснення, фрагменти включають лідерну послідовність, таку як, наприклад, імуноглобуліновий лідер, такий як лідер ЩЕ. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від лідерної послідовності. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від лідерної послідовності, такої як, наприклад, лідер ІЗЕ. 00150) Імуногенні фрагменти білків з амінокислотними послідовностями, ідентичними імуногенним фрагментам послідовностей БЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 і БЕО ІЮ МО:6 можуть бути надані. Такі імуногенні фрагменти можуть містити принаймні 10 95 принаймні 15 95 принаймні 2095 принаймні 2595 принаймні 3095 принаймні 35905 принаймні 4095 принаймні 4595 принаймні 50 95 або принаймні 55 95, принаймнібо, принаймні, 60 95 принаймні 65 95 принаймні 7095 принаймні 75905 принаймні 8095 принаймні 8595 принаймні 9095 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 білків, які на 80 95, 85 9, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 95965, 9695, 97 95, 9895, 99 95 ідентичні по всій довжині амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО 10 МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:6. В деяких варіантах здійснення, фрагменти включають лідерну послідовність, таку як, наприклад, імуноглобуліновий лідер, такий як лідер ЩЕ. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від лідерної послідовності. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від лідерної послідовності, такої як, наприклад, лідер ІЗЕ. 00151) Як вказано в даному описі відносно приєднання сигнального пептиду або лідерної послідовності до М-кінця білку, сигнальний пептид/лидерна послідовність заміняють М-кінцевий метионін білку, який кодується старт-кодоном послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, без кодуючих послідовностей сигнального пептиду. Таким чином, наприклад, 5ЕО ІЮ
МО:4 являє собою 5ЕО ІО МО:2 з сигнальним пептидом/лідерною послідовністю, приєднаними до М-кінця послідовності ФЕО І МО:2, тобто 5ЕО ІЮО МО:4 є білком, що містить сигнальний пептид, приєднаний до М-кінця послідовності «ЕО ІЮ МО:2. Перший залишок у ЗЕО ІЮО МО: 2, "Хаа", як правило, є метионіном за відсутності сигнального пептиду. Однак, білки, які містять сигнальні пептиди, приєднані до 5ЕО ІЮО МО: 2, такі як 5ЕО ІО МО: 4, замінюють залишок 1 метионіну в Хаа залишком, який приєднує сигнальний пептид до білку. Відповідно, М-кінцевий залишок послідовності 5ЕО 10 МО: 2 може бути будь-яким, але якщо він кодується послідовністю ініціації, то це метионін. Зв'язок сигнального пептиду/лідерної послідовності з М- кінцем на 5ЕО ІЮО МО: 2, як правило, виключає М-кінцевий метионін. Як використовується в даному документі, передбачається, що ЗЕО І МО: 4 містить 5ЕО ІЮО МО: 2 з сигнальним пептидом/лідерною послідовністю, зв'язаною з М-кінцем на 5ЕО ІЮ МО: 2, незважаючи на усунення М-кінцевого Хаа-залишку послідовності БЕО ІЮ МО: 2. Аналогічним чином, кодуючі послідовності для ЗЕО І МО: 4 містять послідовності що кодують ЗЕБЕО ІЮ МО: 2 з послідовностями, що кодують сигнальний пептид/лідерну послідовність, що приєднуються до 5'- кінця послідовностей, які кодують ЗЕО ІЮ МО: 2. Ініціюючий кодон може бути "ппп" в кодуючих послідовностях для 5ЕО ІЮ МО: 2, але він елімінується, коли кодують послідовності сигнального пептиду/лідерної послідовності, зв'язаних з 5'-кінцем кодуючих послідовностей, які кодують 5Е0
ІО МО: 2. Як використовується в даному документі, передбачається, що кодуючі послідовності для 5ЕО ІЮО МО: 4 містять кодуючі послідовності для 5ЕО ІЮ МО: 2 з кодуючими послідовності для сигнального пептиду/лідерної послідовності, приєднаної до 5'-кінця кодуючої послідовності
ЗЕО ІО МО: 2, де зустрічається ппп. Таким чином, наприклад, передбачається, що 5ЕО ІЮО МО: З містить ЗЕО ІЮ МО: 1 з кодуючими послідовностями для сигнального пептиду/лідерної послідовності, приєднаної до 5'-кінця послідовності 5ЕО ОО МО: 1 замість ппп. В деяких варіантах здійснення, ппп є кодоном ініціації на 5'-кінці послідовності 560 ІЮ МО: 1. р. Поверхневий антиген НВМ
І00152| Вакцина може містити поверхневий антиген НВМ. У цьому документі передбачені поверхневі антигени НВУ, здатні викликати імунну реакцію у ссавців проти одного або більше серотипів НВУ. Поверхневі антигени можуть містити епітопи поверхневих білків, які роблять їх ефективними, зокрема, в ролі імуногенів, проти яких анти-НВМ імунна реакція може бути (610) викликана. Поверхневий антиген НВМ може містити непроцесований трансляційний продукт,
його варіант, його фрагмент або їх комбінацію. 00153) Поверхневий антиген НВМ може містити консенсусний білок. Консенсусні поверхневі антигени НВМ отримують з послідовностей поверхневих антигенів первинних ізолятів генотипу
А або В НВУ. Зокрема, консенсусні поверхневі антигени НВМ включають 5-білок або комбінацію
З-білку, рге-52 і рге-51 (Фігури З ії 4). Ендопротеолітичні сайти розщеплення вводяться в консенсусні поверхневі антигени НВМ для забезпечення правильного білкового фолдингу і кращого СТІ -процесування. Використання кодонів в консенсусних поверхневих антигенах НВ було модифіковане, щоб усунути кодонне зміщення людських генів. Крім того, вдалося уникнути ділянок з дуже високим (наприклад, більше, ніж 80 відсотків) або дуже низьким (наприклад, менше, ніж 30 відсотків) вмістом СС, де знаходилися цис-діючі мотиви, такі як внутрішні ТАТА- бокси, повторні послідовності і структуровані послідовності. Послідовність Козак ввели в консенсусні поверхневі антигени НВУ для підвищення ініціації трансляції. 00154) Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує консенсусні поверхневі антигени НВУ, являє собою 5ЕО ІЮ МО:9, 5ЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ МО 13, і 5БО ІЮ МО:15. 5ЕО ІЮО МО:9 кодує білок довгого консенсусного поверхневого антигену НВУ, отриманий з генотипу А, і включає 5- білок, рге-52 і рге-51 (ІНВ5-А). 5ЕО ІО МО:11 кодує білок довгого консенсусного поверхневого антигену НВУ, отриманий з генотипу С, і включає 5-білок, рге-52 і рге-51 (І НВ5-С). 5ЕО ІЮ
МО:13 кодує білок короткого консенсусного поверхневого антигену НВУ, отриманий з генотипу
А, і включає 5-білок (ЗНВ5»-А). 5ЕО ІЮ МО:15 кодує білок короткого консенсусного поверхневого антигену НВУ, отриманий з генотипу С, і включає 5-білок (ЗНВ5-0).
ЇО0155| Деякі варіанти здійснення належать до послідовностей нуклеїнових кислот, кодуючим білки, ідентичні по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусних поверхневих антигенів НВУ, імуногенним фрагментам консенсусних поверхневих антигенів НВМ та імуногенним фрагментам ідентичних білків. Таким чином, молекули нуклеїнових кислот, що кодують білки, які мають до 95 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності з послідовністю поверхневого консенсусного антигену НВУ, до 96 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності з послідовністю поверхневого консенсусного антигену НВУ, до 96 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності з послідовністю поверхневого консенсусного антигену НВУ, до 97 925 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності з послідовністю поверхневого консенсусного антигену НВУ, до 9895 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності з послідовністю поверхневого консенсусного антигену
НВМ ї до 99595 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності з послідовністю поверхневого консенсусного антигену НВМ можуть бути надані. Крім того, послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі імуногенні фрагменти, викладені в даному описі, і імуногенні фрагменти білків, ідентичних по всій довжині амінокислотної послідовності білкам поверхневого антигену НВУ, викладеним в даному документі, також передбачені. 00156) Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 95 9» ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот поверхневих антигенів НВМ згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 96 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот поверхневих антигенів НВМ згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 97 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот поверхневих антигенів НВМ згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 98 9» ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот поверхневих антигенів НВМ згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 99 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності з кодуючими послідовностями нуклеїнових кислот поверхневих антигенів НВМ згідно з даним документом. В деяких варіантах здійснення, молекули нуклеїнових кислот з кодуючими послідовностями, розкритими в цьому документі, які ідентичні по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючої послідовності білку консенсусного поверхневого антигену НВУ, розкритого в даному документі, включає послідовності, кодуючі послідовність ІДЕ, приєднану до 5-кінця кодуючої послідовності, яка кодує ідентичні білкові послідовності, розкриті в цьому документі.
І00157| Деякі варіанти здійснення належать до послідовностей нуклеїнових кислот, кодуючи білки з певним відсотком ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності (610) непроцесованого консенсусного білку поверхневого антигену НВМ та імуногенних фрагментів консенсусних білків поверхневого антигену НВУ. Такі молекули нуклеїнових кислот, що кодують білки, які мають до 80 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВМ, до 8595 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 90 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 91 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 92 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 93 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 94 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 95 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 96 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 97 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 98 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВУ, до 99 95 ідентичності по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусної послідовності непроцесованого поверхневого антигену НВМ можуть бути надані. Крім того, послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі імуногенні фрагменти, викладені в цьому описі, та імуногенні фрагменти білків зі схожим відсотком ідентичності, як вказано вище, з білками поверхневих антигенів НВМУ, викладеними в цьому описі, також передбачаються. 00158) Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 80 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВМУ згідно з цим документом.
Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 83 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВМ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 85 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 90 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВМУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 91 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 92 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 93 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 94 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 9595 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВМУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 96 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 97 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 98 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВУ згідно з цим документом. Деякі варіанти здійснення 10) належать до молекул нуклеїнових кислот, які кодують імуногенні білки, які мають 99 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючих послідовностей непроцесованих поверхневих антигенів НВМ згідно з цим документом. В деяких варіантах здійснення, молекули нуклеїнових кислот з кодуючими послідовностями поверхневих антигенів
НВМУ, розкритих в цьому документі, ідентичні по всій довжині амінокислотної послідовності кодуючої послідовності білюу консенсусного поверхневого антигену НВУ, розкритого в цьому документі, включають послідовності, кодуючі послідовність ІДЕ, приєднану до 5-кінця кодуючої послідовності, яка кодує ідентичні білкові послідовності, рокриті в цьому документі.
Ї00159| В деяких варіантах здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти вільна від кодуючої послідовності, яка кодує лідерну послідовність. В деяких варіантах здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти вільна від кодуючої послідовності, яка кодує лідер ІЗЕ. 00160) Деякі варіанти здійснення належать до фрагментів послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9,
ЗЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮ МО:13 ї 5ЕО 10 МО:15. Фрагменти можуть складати принаймні 10 принаймні 15 95 принаймні 20 95 принаймні 25 95 принаймні 30 бо принаймні 35 95 принаймні 40 95 принаймні 4595 принаймні 5095 або принаймні 55 95, принаймнібс, принаймні, 60 95 принаймні 65 95 принаймні 70 95 принаймні 7595 принаймні 80 95 принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 9595 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 послідовності ФЕО ІЮ МО:9, 5ЕО ІО МО:11, 5ЕО ІЮ МО:13 або 5ЕО ІО МО:15. Фрагменти можуть бути принаймні на 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95, принаймніос, принаймні, 98 95 або принаймні 99 95 ідентичними фрагментам послідовностей ЕС ІЮ МО:9, 5ЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ
МО:13 або 5ЕО ІЮ МО:15. Фрагменти можуть бути принаймні на 80 95 принаймні 85 95 принаймні 90 95, принаймні», принаймні, 91 95 принаймні 92 95 принаймні 93 95 принаймні 94 95 принаймні 9595 принаймні 9695 принаймні 9795 принаймні 9895 або принаймні 99595 ідентичними фрагментам послідовностей 5ЕО 10 МО:9, 5ЕО ІЮ МО-11, 5ЕО ІО МО: 13 або 5ЕО І МО:15. В деяких варіантах здійснення, фрагменти включають послідовності, які кодують лідерну послідовність, таку як, наприклад, імуноглобулінів лідер, такий як лідер ІЧЕ. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від кодуючих послідовностей, які кодують лідерну послідовність. В деяких варіантах здійснення, фрагменти вільні від кодуючих послідовностей, які кодують лідерну послідовність, таку як лідер ІЗЕ. 00161) Крім того, амінокислотні послідовності консенсусних поверхневих антигенів НВМУ,
І НВ5-А, І НВ5-С, 5НВз5-А і БНВ»з-С являють собою 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО:14 і
ЗЕО ІЮ МО:16, відповідно. 00162) Білки можуть бути ідентичними послідовностям ЗЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО
ІЮО МО:14 або 5ЕО ІЮ МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 95 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 96 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 97 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 98 95 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають 9995 ідентичність по всій довжині амінокислотної послідовності консенсусних білкових послідовностей згідно з даним документом.
ІЇ00163| Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які ідентичні послідовностям 5ЕО 10 МО:10, 5ЕО 10 МО:12, 5ЕО ІО МО: 14 або 5ЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 80 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО 10 МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або
ЗЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 85595 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО
ІО МО:10, 5ЕО ІЮ МО 12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 90 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО 10 МО210, 5ЕО 10 МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО:16.
Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 9195 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО
ІО МО-12, 5ЕО ІО МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних 10) білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 9295 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО І МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 93 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО 10 МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або
ЗЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 94595 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО
ІО МО:10, 5ЕО ІЮ МО 12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 95 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО 10 МО210, 5ЕО 10 МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО:16.
Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 9695 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО
ІО МО-12, 5ЕО ІО МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 9795 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО І МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 98 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО 10 МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО: 14 або
ЗЕО ІО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних білків, які мають амінокислотну послідовність, яка на 99595 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірним консенсусним амінокислотним послідовностям, вказаним в 5ЕО
ІО МО:10, БЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІО МО: 14 або 5ЕО ІО МО:16.
І00164| Фрагменти консенсусних білків можуть містити принаймні, 10 95 принаймні 15 95 принаймні 20 95 принаймні 25 95 принаймні 30 96 принаймні 35 95 принаймні 40 95 принаймні 4595 принаймні 50 95 або принаймні 55 95, принаймнідо, принаймні, 60 95 принаймні 65 95 принаймні 70 96 принаймні 75 о принаймні 80 95 принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 консенсусного білку.
Можуть бути забезпечені імуногенні фрагменти послідовностей ЗЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12,
ЗЕО ІО МО:14 ії БЕО ІЮ МО:16. Імуногенні фрагменти можуть містити принаймні, 10 95 принаймні 1595 принаймні 2095 принаймні 2595 принаймні 3090 принаймні 35905 принаймні 40 95 принаймні 45 95 принаймні 50 95 або принаймні 55 95, принаймнідо, принаймні, 60 95 принаймні б5 95 принаймні 7095 принаймні 7595 принаймні 80 9о принаймні 8595 принаймні 90 95 принаймні 9595 принаймні 9695 принаймні 9795 принаймні 9895 або принаймні 99 95 послідовності 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮО МО:14 або 5ЕО ІО МО:16.
ІЇ00165| Можуть бути забезпечені імуногенні фрагменти білків з амінокислотними послідовностями, ідентичними імуногенним фрагментам послідовностей 5ЕО ІЮ МО:10, 5БЕО ІЮ
МО:12, ЗЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІЮ МО:16. Такі імуногенні фрагменти можуть містити принаймні 1095 принаймні 1595 принаймні 2095 принаймні 2595 принаймні 30905 принаймні 3595 принаймні 40 95 принаймні 45 95 принаймні 50 95 або принаймні 55 95, принаймніб», принаймні, бО бо принаймні 6595 принаймні 7095 принаймні 7590 принаймні 8095 принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 білків, які на 98 95 ідентичні по всій довжині амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:10,
ЗЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІО МО:16.
Ї00166| Можуть бути забезпечені імуногенні фрагменти білків з амінокислотними послідовностями, ідентичними імуногенним фрагментам послідовностей 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО І
МО:12, ЗЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІЮ МО:16. Такі імуногенні фрагменти можуть містити принаймні 1095 принаймні 1595 принаймні 2095 принаймні 2595 принаймні 30905 принаймні 3595 принаймні 40 95 принаймні 45 95 принаймні 50 95 або принаймні 55 95, принаймніб», принаймні, бО бо принаймні 6595 принаймні 7095 принаймні 7590 принаймні 8095 принаймні 85 95 принаймні 90 95 принаймні 95 95 принаймні 96 95 принаймні 97 95 принаймні 98 95 або принаймні 99 95 білків, які на 98 95 ідентичні по всій довжині амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:10,
ЗЕБЕО ІЮ МО:12, 5ЕБО ІЮ МО:14 або 5Е6О ІЮО МО:16. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 9695 ідентичність з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним винаходом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 97 95 ідентичність з імуногенними фрагментами 10) консенсусних білкових послідовностей згідно з даним винаходом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 98 95 ідентичність з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним винаходом. Деякі варіанти здійснення належать до імуногенних фрагментів, які мають 99 95 ідентичність з імуногенними фрагментами консенсусних білкових послідовностей згідно з даним винаходом. с. Комбінація корових і поверхневих антигенів НВУ
І00167| Вакцина може містити комбінацію корових і поверхневих антигенів НВУ, як описано вище. Ця комбінація антигенів НВМ здатна викликати імунну відповідь у ссавця на один або більше серотипів НВМ. Вакцина може бути розроблена з урахуванням або мати певну комбінацію антигенів НВУ, які, в свою чергу, забезпечують можливість контролювати рівень або силу імунної відповіді у ссавця. 00168) Комбінації можуть містити одну або більше нуклеїнових кислот, що кодують (1) НВМ-
М-Соге, І НВ5-А, ЗНВ5-А, І НВ5-С, і ЗНВ5-С; (2) НВУ-М-Соге, І НВз5-А, ЗНВ5-А і І НВ5-С; (3) НВУ-
М-Соге, І НВз5-А, і 5НВ5-А; (4) НВУ-М-Соге і І НВ5-А; (5) НВУ-М-Соге, ЗНВ5-А, І НВ5-С, і ЗНВ5-О; (6) НВУ-М-Сотге, І НВ5-С, і 5НВ5-С; (7) НВУ-М-Соге і 5НВ5-С; (8) НВУ-М-Сотге, І НВз5-А, І НВ5-С, і 5НВ»5-О; (9) НВУМ-М-соге, І НВ5-А, і БНВ5-С; (10) НВУ-М-Соге і БНВ5-С; (11) НВУ-М-Сотге, І НВз5-А,
ЗНВЗ5-А, і ЗНВ5-С; (12) НВУ-М-Сотге, І НВ5-А, і 5НВ5-С; (13) НВУ-М-Соге, ЗНВз5-А, і ЗНВ»ь-С; (14)
І НВ5-А, 5НВз-А, І НВз5-С, і ЗНВ5-С; (15) І НВ5-А, ЗНВЗ5-А, і І НВ5-С; (16) І НВ5-А і ЗНВ5-А; (17)
ЗНВз5-А, І НВв-С, і 5НВ5-С; (18) І НВ5-С і 5НВ5-С; (19) І НВ5-А, І НВз5-С, і ЗНВ5-С; (20) І НВ5-А і
ЗНВБ-С; (21) І НВ5-А, 5НВЗз-А, і ЗНВ5-С; (22) І НВз5-А і ЗНВ5-С; (23) 5НВз5-А і ЗНВ»-С; (24) НВУ-
М-Соге і ЗНВ5-А; (25) НВУ-М-Соге, І НВ5-А і І НВ5-С; або (26) І НВ5-А і І НВ5-0. 00169) Приклади реалізації винаходу належить до вакцини, включаючи одну або більше нуклеїнових кислот, що кодують НВМ-М-Соге, І НВ5-А і І НВ5-С. Інший ілюстративний варіант здійснення належить до вакцини, включаючи одну або більше нуклеїнових кислот, що кодують
НВУ-М-Соге, 5НВз5-А і 5НВ»-С. Ще один варіант здійснення належить до вакцини, включаючи одну або більше нуклеїнових кислот, що кодують НВМ-М-Соге, І НВз5-А і І НВ5-С і ад'ювант, такий як 1-12. 00170) Комбінаційна вакцина також містить один або більше консенсусних корових білків
НВМ та/або білок поверхневого антигену НВМ у вигляді однієї або декількох білкових субодиниць, одну або більше убитих вірусних частинок, що містять один або більше консенсусних корових білків НВУ та/або білок консенсусного поверхневого антигену НВУ, або одну або більше ослаблених вірусних частинок, що містять один або більше консенсусних корових білків НВМ та/або білок поверхневого антигену НВМ. Ослаблена вакцина може бути ослабленою живою вакциною, убитою вакциною і вакцинами, які використовують рекомбінантні вектори для доставки чужорідних генів, які кодують один або кілька консенсусних корових білків
НВМ та/або білок поверхневого антигену НВУ, а також субодиниці і глікопротеїнові вакцини.
Приклади ослаблених живих вакцин, тих, які використовують рекомбінантні вектори для доставки чужорідних антигенів, субодиничних вакцин і вакцин глікопротеїнів, описані в патентах
США Мо: 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310 668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5453364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319, 6589529, кожен з яких включений до даного опису шляхом посилання. й. Вакцинні продукти і плазміди
І00171| Вакцина може містити конструкти нуклеїнової кислоти або плазміди, які кодують корові білки НВУ, поверхневі антигени НВУ, і комбінації корові білюи НВМ/поверхневі антигени.
Передбаченими в цьому документі є генетичні конструкти, які можуть містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує коровий антиген НВУ, описаний в цьому документі, включаючи консенсусні білкові послідовності, послідовності, гомологічні консенсусним білковим послідовностям, фрагменти консенсусних білкових послідовностей і послідовності, гомологічні фрагментам консенсусних білкових послідовностей. Крім того, передбаченими в цьому документі є генетичні конструкти, які можуть містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поверхневий антиген НВМ, описаний в цьому документі, послідовності, гомологічні консенсусним білковим послідовностям, фрагменти консенсусних білкових послідовностей і послідовності, гомологічні фрагментам консенсусних білкових послідовностей. Генетичний конструкт може бути присутнім в клітині у вигляді функціонуючої екстрахромосомальної молекули. Генетичний конструкт може бути лінійною мініхромосомою, включаючи центромери, теломери або плазміди, або косміди.
І00172| Генетичний конструкт може також бути частиною геному рекомбінантного вірусного вектора, включаючи рекомбінантний аденовірус, рекомбінантний аденовірус асоційований вірус (610) і рекомбінантний вірус осповакцини. Генетичний конструкт може бути частиною генетичного матеріалу в ослаблених живих мікроорганізмах або рекомбінантних мікробних векторів, які живуть в клітинах. 00173) Генетичні конструкти можуть містити регуляторні елементи для експресії генів, що кодують послідовності нуклеїнової кислоти. Регулюючі елементи можуть бути промотором, енхансерним ініціюючим кодоном, стоп-кодоном або сигналом поліаденилювання. 00174) Послідовності нуклеїнових кислот можуть скласти генетичний конструкт, який може бути вектором. Вектор може бути здатним експресувати антиген в клітині ссавця в кількості, ефективній для індукції імунної відповіді у ссавця. Вектор може бути рекомбінантним. Вектор може містити гетерологічну нуклеїнову кислоту, що кодує антиген. Вектор може бути плазмідою.
Вектор може бути корисним для трансфекції клітин нуклеїнової кислоти, що кодує антиген, який культивують з трансформованою клітиною-господарем і витримують в умовах, в яких експресія антигену має місце.
ІЇ00175| Кодуючі послідовності можна оптимізувати для стабільності і високих рівнів експресії. У деяких випадках, кодони вибирають так, щоб зменшити утворення вторинної структури РНК, такої як та, що формується за рахунок внутрішньомолекулярного зв'язку. (00176) Вектор може містити гетерологічну нуклеїнову кислоту, що кодує антиген, і може додатково містити ініцюючий кодон, який може розташовуватися по ходу транскрипції антигенкодуючої послідовності, і стоп-кодон, який може розташовуватися проти ходу транскрипції антигенкодуючої послідовності. Кодон ініціації і стоп-кодон може розташовуватися в рамці з антигенкодуючою послідовністю. Вектор може також містити промотор, який функціонально зв'язаний з антигенкодуючою послідовністю. Промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю, що кодує антиген, може бути промотором з вірусу мавп 40 (5М40), вірусу пухлини молочної залози миші (ММТМ), промотором вірусу імунодефіциту людини (НІМ), промотором, таким як промотор довгого кінцевого повтору (ІТК) вірусу бичачого імунодефіциту (ВІМ), промотором вірусу Молоні, промотором вірусу пташиного лейкозу (АГМ), промотором цитомегаловірусу (СММ), промотором, таким як безпосередньо ранній промотор СММУ, промотором вірусу Епштейна-Барра (ЕВМ) або промотором вірусу саркоми Рауса (К5М).
Промотор може бути також промотором людського гену, такого як людський актин, міозин людини, гемоглобін людини, людський м'язовий креатин або металотіонеін. Промотор може бути також тканиноспецифічним промотором, таким як м'язово або шкірно специфічним промотором, природним або штучним. ци або шкіри конкретного промотора, природні або синтетичні. Приклади таких промоторів описані в публікації патентної заявки США Мо
О0520040175727, зміст якої включений до даного опису у всій своїй повноті.
І00177| Вектор може також містити сигнал поліаденилювання, який може розташовуватися проти ходу транскрипції послідовності, що кодує коровий білок НВУ. Сигнал поліаденилювання може бути сигналом поліаденилювання 540, сигналом поліаденилювання ІТК, сигналом поліаденилювання бичачого гормону росту (БОН), сигналом поліаденилювання людського гормону росту (ПОН) або сигналом поліаденилювання р-глобіну. Сигнал поліаденилювання 5М40 може бути сигналом поліаденилювання з вектору рСЕРА (Іпмігодеп, Зап Оіедо, СА).
І00178| Вектор може також містити енхансер, розташований проти ходу транскрипції послідовності, що кодує консенсусний коровий білок НВУ, або послідовності, що кодує білок консенсусного поверхневого антигену НВУ. Енхансер може бути необхідним для експресії ДНК.
Енхансер може бути людським актином, людським міозином, людським гемоглобіном, людським м'язовим креатином або вірусним енхансером, таким як енхансер з СММ, НА, К5М або ЕВУ.
Енхансери функції полінуклеотиду описані в патентах США Мо 5593972, 5962428, а також УМО 94/016737, зміст кожного з них у повному обсязі включено шляхом посилання. 00179) Вектор може також містити точку початку реплікації від ссавців, щоб підтримувати вектор екстрахромосомально і продукувати кілька копій вектора в клітині. Вектор може бути рмМАХ1І, рСЕР4 або рЕЕРА4 від Іпмігодеп (Зап Оіедо, СА), який може містити точку початку реплікації вірусу Епштейн-Барра і кодує ділянку ядерного антигену ЕВМА-1, які можуть продукувати високого копіювання епісомну реплікацію без інтеграції. Вектор може бути рМАХ1 або варіантом рмах!1 із змінами, таким як варіантна плазміда, описана в даному документі.
Варіантною плазмідою рмМах!1 є варіант з 2998 пар основ скелетної векторної плазміди рРМАХ1 (Іпийгодеп, Сагізрбайа СА). Промотор СММ розташований біля основ 137-724. Промотор/сайт примування Т7 розташований біля основ 664-683. Кілька сайтів клонування розташовані біля основ 696-811. Сигнал поліаденилювання бичачого гормону росту розташований біля основ 829-1053. Ген стійкості до канаміцину знаходиться біля основ 1226-2020. Точка початку реплікації рос розташована біля основ 2320-2993. 00180) Виходячи з послідовності рМАХ1, доступної від Іпмігодеп, наступні мутації можуть 10) бути виявлені в послідовності рМАХІ, яка використовується як скелет для плазмід 1-6,
зазначених у цьому документі: 001811) С»с24 (00182) СТ 001831 Ах - (00184) СТ
І00185| сьо 00186) Пари основ 2, З їі 4 змінюються від АСТ до Сто в скелеті, проти ходу транскрипції промотора СМУ.
ІЇ00187| Скелетом вектора може бути рАМО242. Вектор може бути типом 5 вектора аденовірусу, дефектного по реплікації (Аа5). (00188) Вектор може також містити регуляторну послідовність, яка може добре підходити для експресії генів в клітинах ссавців або людини, в які вводять вектор. Консенсусна кодуюча послідовність НВМ може містити кодон, який може дозволити більш ефективну транскрипцію кодуючої послідовності в клітині-хазяїні.
ІЇ00189| Вектором може бути рЗЕ420 (Іпмйгодеп, Зап Оіедо, Саїй), яка може бути використана для продукування білку в Е5сПегіспіа соїї (Е. соїї). Вектором також може бути рУЕБЗ2 (Іпмігодеп, Зап Оіедо, Саїйї.), яка може бути використана для продукування білку в штамах дріжджів Засспаготусе5 сегемізіае. Вектором також може бути повна бакуловірусна експресійна система МАХВАС "м (Іпмігодеп, Зап Оієдо, Саїїйї.), яка може бути використана для продукування білку в клітинах комах. Вектором також може бути рсОМА | або рсОМАЗ (Іпмігодеп, Зап Оіедо, Саїй.), які можуть бути використані для продукування білку в клітинах ссавців, таких як оваріальні клітини китайського хом'яка (СНО). Вектором можуть бути вектори експресії або системи для продукування білку з допомогою рутинних технологій і легко доступних вихідних матеріалів, включаючи ЗатбгооК еї аї., МоїІесціаг Сіопіпд і І арогаюгу
Мапиа!ї, Зесопа Еа., Соїй Зргіпд Нагрог (1989), які включені в повному обсязі у вигляді посилання.
І00190| В деяких варіантах здійснення вектор може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО:17, ЗЕО ІЮ МО:18, 5ЕО ІЮ МО:19, ЗЕО ІЮ МО:20 або ЗЕО ІЮО МО:21. 5ЕО ІЮ
МО:17 кодує консенсусний коровий білок НВМ, а ЗЕО ІЮ МО5:18-21 кодує консенсусний поверхневий антиген НВМУ. Карти векторів 5ЕО 10 МО5:17-21 показані на Фігурах 5-9, відповідно. е. Фармацевтичні композиції вакцини
І00191| Вакцина може бути у вигляді фармацевтичної композіції., Фармацевтична композиція може містити вакцину.
І00192| Фармацевтичні композиції можуть містити приблизно від 5 нанограмів до приблизно 10 мг вакцинної ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції згідно цьому винаходу містять приблизно від 25 нанограмів до приблизно 5 мг вакцинної ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 50 нанограмів до приблизно 1 мг ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 0,1 до приблизно 500 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 1 до приблизно 350 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 5 до приблизно 250 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 10 до приблизно 200 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 15 до приблизно 150 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 20 до до приблизно 100 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 25 до приблизно 75 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 30 до приблизно 50 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 35 до приблизно 40 мікрограмів
ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції містять приблизно від 100 до приблизно 200 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція містить приблизно від 10 мікрограмів до приблизно 100 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція містить приблизно від 20 мікрограмів до приблизно 80 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція містить приблизно від 25 мікрограмів до приблизно 60 мікрограмів ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція містить приблизно від 30 нанограмів до приблизно 50 мікрограмів
ДНК. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція містить приблизно від 35 нанограмів до приблизно 45 мікрограмів ДНК. В деяких переважних варіантах здійснення (610) фармацевтична композиція містить приблизно від 0,1 до приблизно 500 мікрограмів ДНК. В деяких переважних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно від 1 до приблизно 350 мікрограмів ДНК. В деяких переважних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно від 25 до приблизно 250 мікрограмів ДНК. В деяких переважних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно від 100 до приблизно 200 мікрограмів ДНК. 00193) В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом містять принаймні 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 нанограмів ДНК-вакцини. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції можуть містити принаймні 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 або 1000 мікрограмів ДНК-вакцини. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція може містити принаймні 1,5, 2, 2,5,3,3,5,4,4,5,5,5,5,6,6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 або 10 мг або більше
ДНК-вакцини.
І00194)| В інших варіантах здійснення фармацевтична композиція може містити аж до і включно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 нанограмів ДНК- вакцини. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція може містити аж до і включно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, зго, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 або 1000 мікрограмів
ДНК-вакцини. В деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція може містити аж до і включно 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5,4,4,5,5, 5,5,6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 або 10 мг ДНК-вакцини. 00195) Фармацевтична композиція може додатково містити інші агенти для цілей розробки відповідно до режиму введення, який буде використовуватися. У тих випадках, коли фармацевтичні композиції являють собою ін'єкційні фармацевтичні композиції, вони є стерильними, пірогенними і вільними від частинок. Переважно використовують ізотонічний препарат. Як правило, добавки для ізотонічності можуть включати хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу. У деяких випадках, кращими є ізотонічні розчини, такі як фосфатно- буферний розчин. Стабілізатори включають желатин і альбумін. У деяких варіантах здійснення в композицію додають агент для звуження судин.
ІЇ00196| Вакцина може додатково містити фармацевтично прийнятний наповнювач.
Фармацевтично прийнятний наповнювач може бути функціональними молекулами як наповнювачами, ад'ювантами, носіями або розріджувачами. Фармацевтично прийнятний ексципієнт може бути агентом для полегшення трансфекції, який може включати поверхнево- активні речовини, такі як імуностимулюючі комплекси (ІЗСОМ5), неповний ад'ювант Фрейнда, аналог ГР5, включаючи монофосфорилліпід А, мурамілпептиди, аналоги хінону, везикули, такі як сквален, і сквален, гіалуронова кислота, ліпіди, ліпосоми, іони кальцію, вірусні білки, поліаніони, полікатіони або наночастинки, або інші відомі агенти для полегшення трансфекції.
І00197| Полегшуючим трансфекцію агентом є поліаніон, полікатіон, в тому числі полі-Їі - глутамат (5), або ліпід. Полегшуючим трансфекцію агентом є полі-іІ -глутамат, і більш переважно полі-І -глутамат присутній у вакцині в концентрації менше б мг/мл. Полегшуючий трансфекцію агент може також включати поверхнево-активні речовини, такі як імуностимулюючі комплекси (ІЗСОМ5), неповний ад'ювант Фрейнда, аналог І Р5, включаючи монофосфорилліпід
А, мурамілпептиди, аналоги хінону і везикули, такі як сквален, і сквален і гіалуронова кислота також можуть вводитися в поєднанні з генетичним конструктом. В деяких варіантах здійснення,
ДНК-векторні вакцини можуть також включати полегшуючі трансфекцію агенти, такі як ліпіди, ліпосоми, в тому числі лецитин, ліпосоми або інші ліпосоми, відомі в даній галузі техніки, як 10) ДНК-ліпосомні суміші (див. наприклад, У/09324640), іони кальцію, вірусні білки, поліаніони,
полікатіони або наночастинки або інші відомі агенти для полегшення трансфекції. Переважно полегшуючим трансфекцію агентом є поліаніон, полікатіон, включаючи полі-І - глутамат (І 5), або ліпід. Концентрація агента трансфекції у вакцині становить менше 4 мг/мл, менше 2 мг/мл, менше 1 мг/мл, менше 0,750 мг/мл, менше 0,500 мг/мл, менше 0,250 мг/мл, менше 0,100 мг/мл, менше 0,050 мг/мл або менше 0,010 мг/мл. (00198) Фармацевтично прийнятний наповнювач може бути ад'ювантом. Ад'ювантом можуть бути інші гени, які експресуються в альтернативній плазміді або доставляються як білки в комбінації з вказаною вище плазмідою у вакцині. Ад'ювант може бути вибраним з групи, що містить: а-інтерферон (ІЄМ- с), В-інтерферон (ІЄМ-ВД), у-інтерферон, фактор росту тромбоцитів (РОСРБ), ТМЕа, ТМЕВ, ОМ-С5Е, епідермальний фактор росту (ЕСЕ), шкірний Т-клітинний провідниковий хемокін (СТАСК), епітеліальний тимус-експресований хемокін (ТЕСК), мукозо- асоційований епітеліальний хемокін (МЕС), ІС-12, 1-15, МНС, СО80,0086, включаючи 1-15, що має віддалену сигнальну послідовність і необов'язково включає сигнальний пептид від ІДЕ.
Ад'ювантом може бути 1І-12, 1-15, 1-28, СТАСК, ТЕСК, фактор росту тромбоцитів (РОСЕ),
ТМЕБа, ТМЕДВД, ЄМ-С5Е, епідермальний фактор росту (ЕСБЕ), 1-1, 1-2, 1-4, 11 -5, 1-6, 1-10, 11-18,
І -21, 1-31, 1-33 або їх комбінації. Прикладом здійснення ад'юванта є 1І--12. 001991 Інші гени, які можуть бути корисними ад'нтами, включають ті, що кодують: МОР-1,
МІР-Іа, МІР-1р, І -8, ВАМТЕЗ5, І -селектин, Р-селектин, Е-селектин, СЮО34, СІУСАМ-1, МаасАмМ-1,
ГЕА-1, МІ А-1, Мас-1, рі50.95, РЕСАМ, ІСАМ-1, ІСАМ-2, ІСАМ-3, 202, І ЕА-3, М-С5Е, (4-С5БЕ, І 4, мутантні форми 1-18, 2040, СО40І, васкулярний фактор росту, фібробластний фактор росту,
І/-7, фактор росту нервів, васкулярний ендотеліальний фактор росту, Ра5, рецептор ТМЕ, РІЇ,
Аро-1, роб, М/5І1-1, 083, ТВАМР, Аро-3, АІВ, ТАВО, МОаВЕ, ОН4, ОВО, КИТЕВ, ТВА -Р2,
ТВІСК2, ОНб, Сазравзе ІСЕ, Ров, с-імп, Зр-1, Ар-1, Ар-2, р38, рб5Аеї, муО88, ІВАК, ТААЕЄб, ІКВ,
Іпасіїме МІК, БАР К, БАР-1, МК, гени відповіді інтерферону, МЕКВ, Вах, ТЕАЇЇ., ТЕАЇЇ гес,
ТВА тесОВС5, ТВА -АЗ, ТВА -84, ВАМК, ВАМК ГІСАМО, Ох40, Ох40 ПІСАМО, МКИаг0, МІСА,
МІСВ, МКОагА, МКОа2В, МКаг2с, МКОгЕ, МКИагЕ, ТАРІ, ТАРА та їх функціональні фрагменти.
Ї. Способи доставки вакцини 00200) Передбаченим у цьому документі є спосіб доставки фармацевтичної композиції для забезпечення генетичного конструкту і білків корового білку НВМ та/або поверхневого антигену
НВУ, які містять епітопи, які роблять їх особливо ефективними імуногенами, проти яких імунна відповідь на вірусні НВМ-інфекції може бути викликана. Спосіб доставки вакцини, або вакцинація, може бути передбачений, щоб викликати терапевтичну та/"або профілактичну імунну відповідь. Процес вакцинації може генерувати у ссавця імунну відповідь проти множини генотипів НВУ. Вакцина може бути доставлена індивідууму, щоб модулювати активність імунної системи ссавця і підсилити імунну відповідь. Доставка вакцини може бути трансфекцією антигеном НА як молекули нуклеїнової кислоти, яка експресується в клітині і доставляється на поверхню клітини, на якій імунна система розпізнає і індукує клітинну, гуморальну або клітинну і гуморальну відповідь. Доставка вакцини може бути використана, щоб індукувати або викликати імунну відповідь у ссавця проти множини вірусів НВМ шляхом введення ссавцю вакцини, як описано в даному документі.
І00201| При доставці вакцини ссавцю, і слідом за цим вектора в клітини ссавця, трансфіковані клітини будуть експресувати і секретувати консенсусний коровий білок НВМ і консенсусний поверхневий антиген НВМ. Ці секретовані білки або штучні антигени, будуть визнані як чужорідні імунною системою, яка буде піднімати імунну відповідь, яка може включати: антитіла, отримані проти антигенів, і Т-клітинна відповідь саме проти антигену. У деяких прикладах, ссавець, щеплений вакцинами, обговорюваними в даному документі, матиме примовану імунну систему і при зараженні вірусним штамом НВМ примована імунна система дозволяє швидко очистити наступні віруси НВУ, будь то через гуморальну, або клітинну, або обидві системи. Вакцина може бути доставлена індивідууму, щоб модулювати активність імунної системи індивідуума, тим самим підвищуючи імунну відповідь. (00202) Способи доставки ДНК-вакцини описані в патентах США Мо 4945050 і 5036006, які включені до даного опису у всій своїй повноті шляхом посилання. 00203) Вакцина може бути введена в організм ссавця, щоб викликати імунну відповідь у ссавця. Ссавець може бути людиною, приматом крім людини, коровою, свинею, вівцею, козою, антилопою, бізоном, буйволом, пусторогим, оленем, їжаком, слоном, ламою, альпака, мишами, щурами або куркою, і, переважно людиною, коровою, свинею або куркою. 9. Доставка вакцини з ад'ювантами (00204) Фармацевтичні композиції, переважно вакцини, описані в даному документі, можуть бути введені в комбінації з білками або генами, що кодують ад'юванти, які можуть включати: а- (610) інтерферон (ІЕМ- с), В-інтерферон (ІЕМ-ДВ), у-інтерферон, 1-12, 11-15, 1-28, СТАСК, ТЕСК,
фактор росту тромбоцитів (РОСЕ), ТМЕа, ТМЕД, зМ-С5Е, епідермальний фактор росту (ЕСЕ),
І-1, 1-2, 1-4, 1-5, 1-6, 11-10, 11-12, 1-18, МСР-1, МІР-Іа, МІР-1Тр, І -8, ВАМТЕЗ5, І -селектин, Р- селектин, Е-селектин, СО34, СІУСАМ-1, МаасАМ-1, І ЕА-1, МІ А-1, Мас-1, рі50.95, РЕСАМ, ІСАМ- 1, ІСАМ-2, ІСАМ-3, 002, ГЕА-3, М-С5Е, (-С51Е, І -4, мутантні форми 1ІІ/-18, 26040, СО401, васкулярний фактор росту, фібробластний фактор росту, ІЇ/-7, фактор росту нервів, васкулярний ендотеліальний фактор росту, Газ, рецептор ТМЕ, РІ Аро-1, ро5, МУ5І-1, ОВ3,
ТАВАМР, Аро-3, АІВ, ГАВО, МОаВЕ, 084, ОВО, КІ ЕВ, ТВА -82, ТВІСК2, ОВ, Сазвразе ІСЕ,
Еов, с-ішп, 5р-1, Ар-1, Ар-2, р38, рб5Кеї, Мура88, ІКАК, ТЕАЕб, ІКВ, неактивний МІК, ЗАР К, ЗАР- 1, УМК, гени відповіді інтерферону, МЕКВ, Вах, ТКАЇГ, ТКАЇЇгес, ТААЇгтесОАС5, ТВАЇІ-ВЗ,
ТВА -В84, ВАМК, ВАМК ГІСАМО, Ох40, Ох40 ПІСАМО, МКОа2гО, МІСА, МІСВ, МКОагА, МКОИгВ,
МКО2С, МКО2Е, МКО2Е, ТАРІ або ТАР2 або їх функціональні фрагменти. В прикладах здійснення ад'ювантом є 1І--12.
Р. Спосіб генерації імунної відповіді на вакцину 00205) Вакцина може бути використана для генерації імунної відповіді у ссавця, у тому числі терапевтичної або профілактичної імунної відповіді. Імунна відповідь може генерувати антитіла та/або кілерні Т-клітини, які спрямовані на коровий антиген НВУ, поверхневий антиген
НВУ або їх комбінації. Такі антитіла і Т-клітини можуть бути виділеними. (00206) Деякі варіанти здійснення забезпечують способи генерації імунних реакцій проти корових білків НВУ, поверхневих антигенних білків НВМта їх комбінації, які включають введення індивідууму вакцини. Деякі варіанти здійснення забезпечують способи профілактичної вакцинації індивідуума проти НВУ-інфекції, які включають введення вакцини. Деякі варіанти здійснення забезпечують способи терапевтичної вакцинації індивідуума, який був заражений
НВУ, які включають введення вакцини. Діагностика НВМ-інфекції до введення вакцини може бути здійснена у встановленому порядку. і. Спосіб лікування вакциною
І00207| Вакцина може бути використана для отримання імунної відповіді у ссавця, яка захищає печінку. Імунна відповідь може створювати антиген-специфічну СТІ. відповідь, яка не викликає ушкодження або запалення печінки. У деяк варіантах здійснення, вакцина може бути доставлена до периферії для виклику антиген-специфічної імунної відповіді, націленої на печінку, щоб очистити або усунути НВУ-інфіковані клітини, не пошкоджуючи і не викликаючи запалення печінки. В деяких варіантах здійснення, лікування може включати доставку вакцини, що містить консенсусний коровий антиген НВМ, до периферії для створення антиген- специфічної імунної відповіді, націленої на печінку, щоб очистити або усунути НВМ-інфіковані клітини, не завдаючи шкоди або не викликаючи запалення печінки. 3. Шляхи введення (00208) Вакцину або фармацевтичну композицію можна вводити різними способами, в тому числі перорально, парентерально, під'язиково, черезшкірно, ректально, через слизову, місцево, шляхом інгаляції за допомогою трансбуккального введення, внутрішньоплеврально, внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревинно, підшкірно, внутрішньом'язово, інтраназально, , інтратекально і внутрішньосуглобовим способом або їх комбінаціями. Для застосування у ветеринарії, композиція може бути введена у вигляді відповідним чином прийнятної композиції відповідно до звичайної ветеринарної практики.
Ветеринар може легко визначити схему дозування і спосіб введення, який є найбільш підходящим для конкретної тварини. Вакцина може бути введена з допомогою традиційних шприців, безголкових ін'єкційних пристроїв, "пістолетів для бомбардування мікрочастинками" або іншими фізичними методами, такими як електропорація ("ЕР"), "гідродинамічний метод" або ультразвук.
І00209| Вектор вакцини може бути доставлений ссавцю з допомогою декількох добре відомих технологій, включаючи ін'єкції ДНК (такоже згадується як ДНК-вакцинація) з і без електропорації іп мімо, ліпосомально опосередковані, наночастинки, рекомбінантні вектори, такі як рекомбінантний аденовірус, рекомбінантний аденовірус асоційований вірус і рекомбінантний вірус коров'ячої віспи. Антиген НВМ може бути доставлений за допомогою ін'єкції ДНК і разом з електропорацією іп мімо. а. Електропорація
ІЇ00210| Вакцина або фармацевтична композиція можуть бути введені шляхом електропорації. Введення вакцини за допомогою електропорації плазмідами вакцини може бути здійснене з допомогою електропораційних пристроїв, які можуть бути сформовані для доставки до цільової тканини ссавця імпульсу енергії, ефективного для створення зворотних пор, що утворюються в клітинних мембранах, а кращим імпульсом енергії є постійний струм, подібний (610) заданому струму, введеному користувачем. Пристрій для електропорації може містити компонент електропорації і електродний вузол або вузол ручки. Компонент електропорації може включати і містити один або більше різних елементів електропораційного пристроїв, включаючи: контролер, генератор імпульсів струму заданої форми, тестер імпедансу, реєстратор сигналу, вхідний елемент, елемент створення звітів про стан, порт зв'язку, компоненти пам'яті, джерело живлення і вимикач живлення. Електропорація може бути здійснена з використанням іп мімо електропораційного пристрою, наприклад, системи СЕ 'ЕСТКАФ ЕР (Іпоміо Рпаптасецшііса!5,
Іпс., Віше ВеїЇ, РА) або електропоратора ЕІдеп (Іпоміо РпагтасеціїсаІ!5, Іпс.) для сприяння трансфекції клітин плазмідою.
І00211| Приклади електропораційних пристроїв і способів електропорації, які можуть сприяти в отриманні ДНК-вакцин згідно з даним винаходом, включають ті, які описані в патенті
США Мо 7245963, представленому Огаодпіа-АКІЇ, еї аї., патентній публікації США 2005/0052630, представленій тій, , еї аїЇ., зміст яких включено до даного опису шляхом посилання у всій їхній повноті. Інші пристрої для електропорації і методи електропорації, які можуть бути використані для полегшення доставки вакцин ДНК, включають ті, що передбачені в одночасно розглянутій і спільно належачій заявці на патент США, серійний номер 11/874072, поданій 17 жовтня 2007, яка претендує на пріоритет відповідно до 35 Ш5БС 119 (е) попередніх заявок США Мо 60/852149, поданої 17 жовтня 2006, і 60/978982, поданої 10 жовтня 2007, всі з них включені до даного опису у всій своїй повноті. (00212) Патент США Мо 7245963 від Огаодпіа-АКІЇ та інш. описує модульні електродні системи і їх застосування для полегшення введення біомолекули в клітини вибраної тканини в тілі або рослині. Модульні електродні системи можуть містити множину голчастих електродів; гіпотермічну голку; електричний з'єднувач, який забезпечує зв'язок від програмованого контролером імпульсу постійного струму до множини голчастих електродів; і джерело живлення. Оператор може захопити множину голчастих електродів, які розміщені на опорній конструкції, і міцно вставити їх в вибрану тканину в тілі або рослині. Біомолекули потім доставляються з допомогою підшкірної голки в вибрану тканину. Контролер програмованого імпульсу постійного струму активується і електричний імпульс постійного струму подається на множину голчастих електродів. Застосовуваний електричний імпульс постійного струму полегшує введення біомолекули в клітину між множиною електродів. Весь зміст патенту США М 7245963 включено до даного документу шляхом посилання.
І00213| Патентна публікація США 2005/0052630, представлена Сміт та інш., описує електропораційний пристрій, який може бути використаний, щоб ефективно полегшити введення біомолекули в клітини вибраної тканини в тілі або рослині. Електропораційний пристрій містить електрокінетичний пристрій ("ЕКО пристрій"), робота якого визначається програмним забезпеченням або прошивкою. Пристрій ЕКО випускає серію модулів програмованих імпульсів постійного струму між електродами в масиві на основі елементу управління користувача і введення параметрів імпульсу, і дозволяє зберігати і отримувати дані заданої форми сигналу. Електропораційний пристрій також містить змінний електродний диск, що має множину голчастих електродів, центральний канал вприскування для ін'єкційної голки і знімний направляючий диск. Весь зміст патентної публікації США 2005/0052630 включено до даного опису шляхом посилання.
І00214| Електродні масиви і способи, описані в патенті США Мо 7245963 і патентній публікації США 2005/0052630, можуть бути адаптовані для глибокого проникнення не тільки в тканини, такі як м'язи, але й в інші тканини або органи. Через конфігурацію матриці електродів ін'єкційна голка (для доставки вибраної біомолекули) також вставляється до упору в орган- мішень і ін'єкцію вводять перпендикулярно до цільової проблеми в ділянку, яка попередньо окреслюється електродами. Електроди, описані в патенті США Мо 7245963 і патентній публікації
США 2005/005263, переважно мають довжину 20 мм і 21 калібр.
ІЇ00215| Крім того, передбаченими в деяких варіантах здійснення, які включають електропораційні пристрої та використовують їх, є електропораційні пристрої, які є тими, що описані в наступних патентах: патент США Мо 5273525, виданий 28 грудня 1993, патент США Мо 6110161, виданий 29 серпня 2000, передбаченими в деяких варіантах здійснення, які включають електропораційні пристрої та використовують їх, є електропораційні пристрої, які Є тими, що описані в наступних патентах: патент США Мо 5273525, виданий 28 грудня 1993, патент США Мо 6110161, виданий 29 серпня 2000, патент США Мо 6 261 281, виданий 17 липня 2001, і патент
США Мо 6958060, виданий 25 жовтня 2005, і патент США 6939862, виданий 6 вересня 2005. Крім того, патенти, що стосуються предмета, представленого в патенті США 6697669, виданому 24 лютого 2004, який стосується доставки ДНКз використанням будь-якого з множини пристроїв, і в патенті США 7328064, виданому 5 лютого 2008, який стосується методу ін'єктування ДНК, (610) розглядаються в даному документі. Вказані вище патенти включені шляхом посилання у всій їхній повноті до даного документа. 4. Спосіб виготовлення вакцини (00216) Передбаченими в даному документі є способи одержання ДНК-плазмід, які містять вакцини, описані в даному документі. Плазміди ДНК після фінальної стадії субклонування в плазміду експресії ссавця можуть бути використані для інокуляції клітин культури в великомасштабному ферментаційному чані з використанням відомих методів в даній галузі техніки. (00217) ДНК-плазміди для використання з ЕР-пристроями згідно з даним винаходом можуть бути приготовані або виготовлені з використанням комбінації відомих пристроїв і методів, але, переважно вони виготовляються з використанням оптимізованої технології виробництва плазмід, описаної в опублікованій заявці США Мо 20090004716, яка була подана 23 травня 2007.
В деяких прикладах ДНК-плазміди, використані в цих дослідженнях, можуть бути отримані в концентраціях, що перевищують або дорівнюють 10 мг/мл. Технології виготовлення також включають або містять різні пристрої і протоколи, які, як правило, відомі фахівцям у даній галузі техніки, на додаток до тих, які описані в патенті США з серійним номером 60/939792, у тому числі ті, які описані в ліцензованому патенті, патент США Мо 7238522, який був виданий З липня 2007. Зазначені вище заявка і патент США з серійним номером 60/939792 і патент США Мо 7238522, відповідно, включені до даного опису у всій своїй повноті.
Приклади
І00218| Цей винахід далі ілюструється наступними прикладами. Слід розуміти, що ці приклади, які показують кращі варіанти здійснення даного винаходу, надані тільки для ілюстрації. Виходячи з наведеного вище обговорення та прикладів, фахівець у даній галузі може встановити суттєві характеристики цього винаходу і, не відступаючи від сутності й обсягу винаходу, може здійснити різні зміни й модифікації винаходу, щоб пристосувати його до різних застосувань та умов. Таким чином, різні модифікації винаходу на додаток до тих, які показані й описані в даному документі, будуть очевидні фахівцям в даній галузі з вищенаведеного опису.
Такі модифікації також підпадають під обсяг прикладеної формули винаходу.
Приклад 1
Коровий білок НВМ (00219) Консенсусний коровий білок НВУ, також іменований як НВМ модифікований, МСоге або конструкт М-Соге, був сконструйований з епітопних послідовностей від генотипів А, В, С, О і
Е НВУ. Послідовності капсидних білків НВМ від цих генотипів були відібрані для включення в конструкцію консенсусного кору, який може індукувати імунітет проти широкого спектру генотипів, тим самим забезпечуючи універсальну вакцину для НВУ. В деяких варіантах здійснення, модифікації конструкту М-Соге включали додавання лидерної послідовності ІДЕ. В деяких варіантах здійснення, білок М-Соге кодується з використанням кодонової оптимізації І
РНК-оптимізації для підвищеної експресії. 1. Конструювання і експресія консенсусного корового антигену 00220) Корові консенсусні нуклеотидні послідовності генотипу А, В, С, ОО ї Е НВМ були сконструйовані шляхом отримання консенсусних послідовностей корових генів кожного генотипу, а потім шляхом отримання консенсусної послідовності консенсусів всіх п'яти генотипів, таким чином уникнувши зміщення до сильно секвенованих генотипів. Крім того, послідовності були зібрані з різних країн, щоб уникнути відбору зразків сильно сиквенованих генотипів. Послідовності вирівнювали, використовуючи програмне забезпечення СІ ОБТАЇ Х для складання остаточної консенсусної послідовності НВсАЯд. Як показано на Фігурі 10, спостерігалась відносна близькість мультигенотипової консенсусної НВсАд-послідовності для всіх вибраних послідовностей з різних генотипів. (00221) Після отримання консенсусної послідовності було здійснено кілька модифікацій для збільшення рівнів експресії антигену з плазмід. Зокрема, було додано високоефективну лідерну послідовність ІДЕ і С-кінцеву НА-мітку, а конструкт було оптимізовано відносно РНК і кодону. Це привело до утворення послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність М-соге з ІДЕ- лідером і НА-міткою (ЗЕО ІЮ МО:5), яка розщеплюється ЕсоВіІ і Мої, і клонується у вектор експресії рмАХ (Іпмійгодеп) під контролем проміжного цитомегаловірусного промотора.
Отриманий конструкт було названо рМСоге (5ЕО 10 МО:17). (00222) Випробування експресії іп міго були здійснені з використанням конструкту рМсоге і рМАХ, який використовували як контроль. Результати, що демонструють позитивну експресію, вказані на зображеннях гелів, показаних на фігурах 114А і 118. 00223) Крім того, білок НВсАд експресувався ДНК-плазмідою, трансфектованою рмМсотге, що містить коровий ген гепатиту В (Фігура 12). Експресію рМСоге виявляли, використовуючи 60 0 ТМТФ Оціск Соирієй Ехргеззіоп ої Тгапз5огірноп / Тгапвіайоп Зубіет, яка містить 355-метіонін
Зо
(Рготеда, Мадізоп, М/І). Синтезований генний продукт осаджували, використовуючи моноклональне антитіло до НА, направлене на закодований епітоп НА, клон НА-7 (5ідта-
Аїйгісп). Імунно осаджений білок піддали електрофорезу на 12 95 гелі 5ХО5-РАСЕ, а потім зафіксували і висушили. Синтезований білок зі вставкою радіоактивної 355 виявляли за допомогою авторадіографії. Цей аналіз трансляції іп міго на лізаті показав виявлюваний НВсАд при очікуваній молекулярній масі 28 кДа (Фігура 13).
І00224| Експресію було додатково підтверджено з використанням анти-НА міченого моноклонального антитіла за допомогою імунофлюоресцентного аналізу. Рабдоміосаркомні (КО) клітинні лінії трансфікували рМСоге, використовуючи ТОКВОРБЕСТ (Тпепто зЗсіепійс) згідно з інструкціями виробника. Спочатку клітини фіксували 2 95 формальдегідом, а потім аналізували з приводу експресії білка. Зафіксовані клітини інкубували з кролячою моноклональною НА-міткою (Іпмігодеп), розведеною "первинним стандартним розчином" (0,1 Фо
В5А, 0,2 95 сапоніну, 0,02 95 азиду натрію) протягом однієї години при кімнатній температурі.
Потім клітини інкубували з 594-міченим анти-кролячим вторинним антитілом Бугідн (Тпегто
Зсіепіййс) протягом 20 хвилин при кімнатній температурі Конфокальні зображення використовували для візуалізації НВсАд в цитоплазмі і навколо ядра трансфікованих КО-клітин, як показано на Фігурі 14. Профіль експресії підтвердив, що ДНК-плазміда, яка несе консенсусний коровий ген, може високо експресуватися в різних клітинах іп міго. Зокрема, зображення були отримані з використанням інвертованого конфокального мікроскопа 7еї55
Ахіомегі 100. Аналіз і кількісна оцінка інтенсивності Ффлюоресценції проводилися з використанням програмного забезпечення Ітаде У (МІН, КосКміе, МО). 2. Імунізація мишей (00225) Трансгенні миші С57ВІ /6 були розділені на дві групи по чотири миші в кожній і тричі імунізовані 20 мкг ДНК за допомогою електропорації з двотижневими інтервалами (група 1 - контрольний вектор рМАХ; група 2 - рМ-Соге). Мишей імунізували в день 0, день 14, день 28 та умертвляли в день 35. Селезінку, печінку і сироватку з вбитих тварин брали для дослідження. (00226) Крім того, щоб оцінити отримання Т і В-клітинних імунних відповідей, мишей Ва!р/с імунізували і вимірювали з приводу обох відповідей в різних периферичних тканинах. Миші отримали три внутрішньом'язові імунізаці по 30 мкг рМСоге або рмМах з подальшою електропорацією, як зазначено на імунізаційній схемі (Фігура 15). Зокрема, шести-восьми тижневі самки мишей Вар/с були придбані у даскзоп Іарогаюгієз. Тварин утримували відповідно до норм Маїйопаї Іпзійшевз ої Неайй апа Ше Опімегойу ої Реппзуїмапіа Іпвзійшіопа! Саге апа Обе Соттійеє (ПАСИОС). Для дослідження ДНК-імунізації вісім тварин розділили на дві групи. Кожна тварина в групі імунізації отримала в цілому по три імунізації ЗО мкг рМСоге з інтервалом у два тижні у великогомілковий (ТА) м'яз. Кожна імунізація супроводжувалася електропорацією іп омімо з пристроєм СЕГЇГЕСТКА для адаптивної постійнострумної електропорації (Іпоміо Рпагтасешііса!5, ВіІсе ВеїІ, РА). По два 0,2 амперних постійнострумових прямокутних імпульси були доставлені через трикутну З-електродну решітку, що складається з 26-каліберних твердих електродів з нержавіючої сталі, повністю занурених у м'яз. Кожен імпульс тривав 52 мілісекунди з 1-секундною затримкою між імпульсами.
І00227| Дослідження мишей Ваїр/с іп мімо показало підвищення амплітуди секреції фактора некрозу пухлини (ТМЕос), інтерферону гамма Т-клітин (ІЕМу) і СО107а в СО8 та С04 Т клітинах, вилучених з селезінки. Фігури 16 і 17 демонструють, що вакцинація мишей ВаїЇр/с рмМ-Соге підвищувала амплітуду секреції ІЕМУ в СО8- і Ср4жТ-клітинах селезінки. Фігури 18 і 19 демонструють, що вакцинація мишей ВаїБ/с рМ-Соге підвищувала амплітуду секреції ТМЕс в
Сов і С04Т-клітинах селезінки. Фігури 20 і 21 демонструють, що вакцинація мишей Ваїр/с рм-
Соге підвищувала амплітуду секреції СО 107а в СО8-- і Ср4-Т-клітинах селезінки. 00228) У додаткових експериментах, секрецію ІЕМ-у ії ТМЕ-а перевіряли в Т-клітинах. Для отримання спленоцитів для цих додаткових експериментів, мишей умертвляли через тиждень після останньої імунізації, а селезінки вилучали і поміщали в середовище К10 (середовище
ЕРМІ, збагачене 1095 ЕВ5 і їх антибіотиком-антимікотиком). Селезінки подрібнювали індивідуально, проціджували через 40 мкМ клітинний фільтр та обробляли 1 мл лізисного буферу АСК протягом 5 хвилин для лізису еритроцитів. Спленоцити ресуспендували в повному середовищі К10 і використовували для додаткових імунологічних аналізів.
І00229| Субпопуляцію спленоцитів ресуспендували в середовищі К10 в концентрації 107 на мл і по 100 мкл висівали на 96-лункову круглодонну планшету. 100 мкл середовища, що містить об'єднані пептиди рМсСоге або 10 нг/мл РМА (Зідта, 51. І оці5, МО, О5А), і 500 нг/мл іономіціну (СаіІріоспет, Момаріоспет, Га дойа, СА, ОБА) змішали як позитивний контроль або 0,1 95 диметилсульфоксид (Зідта, 91. І оці5, МО, ОА) як негативний контроль. Всі лунки містили по 5 (610) мкл/мл двох інгібіторів транспорту білків, брефелдин А (СоідіРійд) і моненсин (Соідівіор) (АЇЇ їот ВО Віозсіепсе). Клітини інкубували при 37 "С в 595 СбО»г протягом 5 годин і фарбували
ІПМЕ/ЮЕАО Ріїхаріє Оеай СеїЇ 5іаіп (Іпмігодеп) протягом 10 хвилин при 37 "С. Позаклітинне фарбування проводили, використовуючи антитіла, специфічні до мишачих СОЗ, СО04 ї СО8.
Спленоцити потім пермеабілізовували і промивали, використовуючи во
СУТОРІХ/СУТОРЕКМ "М ї РЕКМЛЛАЗН "М (ВО Віозсієпсе), відповідно. (00230) Внутрішньоклітинне фарбування цитокінів.
І00231| Внутрішньоклітинні цитокіни потім фарбували антитілами до мишачого інтерферону- гамма і фактору-альфа некрозу пухлини. Субпопуляцію лімфоцитів ресуспендували в середовищі К10 в концентрації 107 на мл і по 100 мкл висівали на 96-лункову круглодонную планшету. 100 мкл середовища, що містить об'єднані пептиди рМСоге, або 10 нг/мл РМА (Зідта, 51. І оці5, МО, ОА) і 500 нг/мл іономіціну (Саіріоспет, Момабіоспет, Іа доПа, СА, ОБА) змішали як позитивний контроль або 0,1 95 диметилсульфоксид (Зідта, 5. І оці5, МО, О5А) як негативний контроль. Всі лунки містили по 5 мкл/мл двох інгібіторів транспорту білків, брефелдин А (Соі|діРічцчд) і моненсин (Со|діхіор) (всі від ВО Віозсіепсе). Клітини інкубували при 37 "С в 595 СО» протягом 5 годин і фарбували ГІМЕ/0ЕАО Ріхабіе Оеай Сеї Зіаїіп (Іпмйгодеп) протягом 10 хвилин при 37 "С. Позаклітинне фарбування проводили, використовуючи антитіла, специфічні до мишачих СОЗ3, СО4 і СО8. Спленоцити потім пермеабілізували і промивали, використовуючи ВО Суфюїїх/Суїорегт М і Регт/л/Л/азп м (ВО Віозсіепсе), відповідно. Клітини потім фарбували внутрішньоклітинно антитілами до інтерферону-гамма, фактору-альфа некрозу пухлини, інтрелейкіну-2 і лізосомно-асоційованого мембранного білку 1.
І00232| Кон'юговані анти-мишачі антитіла використовували під час позаклітинного і внутрішньоклітинного фарбування, включаючи: СОЗ-фікоеритрин/Су/ (РЕ/Су7), СО4- перідинінхлорофіловий білок (РегСсР), СОв-аллофікоціанин (АРС), ІЕМ-у-АІеха Рішог 700, ТМЕ-а- флюоросцеїну ізотіоціанат (РІТС) ї І-2-фікоеритриноціанін (РЕ) (всі від ВО Віозсіепсе5, зап дове, СА).
І00233| Середня індукована НВсАд-специфічна ІЄМ-у Т-коїтинна відповідь була сильною при 2000 (5 210) ЗРО вна мільйон спленоцитів. Цікаво, що внутрішньоклітинне фарбування стимульованих спленоцитів показало, що клітини СО4- і СОвж- продукують майже подібну кількість антигенспецфічного ІЕМ-у, 0,74 і 0,94, відповідно, але різні рівні ТМЕ-йа з приблизно 0,3 9о і 1,5 95 клітин СО4-- і СО8, відповідно (Фігура 22). Аналогічна тенденція спостерігалася з клітинами, які були двічі позитивними для обох цитокінів. Спостерігалося менше двічі позитивних клітин СО4--, приблизно 0,2 95, в селезінці, ніж двічі позитивних клітин СОв',, які складають 0,7 95 (Фігура 23). (00234) Міграція НВМ специфічних Т клітин у печінку також була продемонстрована у тварин, яким вводили ДНК-вакцину рМСоге. Націлювання Т-клітин, специфічних до корового антигену
НВУ, з високою частотою і ефекторною функцією до печінки є метою для розвитку НВУ-імунної терапії. Після імунізації тварин умертвляли, а їх печінку видаляли і визначали міграцію НВМ- специфічних ефекторних Т-клітин в печінку. Результати показали, що вакцина рмсСоге приводить ефекторні Т-клітини в печінку іп мімо. Фігури 24 і 25 демонструють інтерферон-у Т- клітинну відповідь у печінці, а Фігури 26 і 27 демонструють імунну відповідь фактора а некрозу пухлини в печінці і підвищену реакцію, яка виникає в результаті вакцинації рМСоге. (00235) Консенсусний імуноген М-Соге, який кодується ДНК-конструктом рМСоге, приводить до строго врівноважених СО4-/СО8-Т-клітинних імунних відповідей. Індуковані Т-клітини рухаються до печінки з високою частотою і демонструють коректний еффекторний фенотип імунного кліренсу після НВМ-інфекції, підтримуючи подальший розвиток цієї імунної терапевтичної вакцини. (00236) Також досліджували здатність внутрішньопечінкових антиген-специфічних Т-клітин продукувати цитокіни після ДНК-імунізації. У кожну печінку шляхом безпосередньої ін'єкції вводили 1 мл РВ5 в печінкову вену кожної миші. Зокрема, вилучали печінку, подрібнювали і ресуспендували в 5 мл 44 95 ізотонічного РегсоїІ. Суміші заливали З мл 66 95 ізотонічного РегсоїЇ і центрифугували протягом 20 хвилин при 2000 оборотів в хвилину для градієнтного поділу.
Лімфоцити збирали і промивали 10 мл К10 і обробляли лізисним буфером АСК в міру необхідності. Як СО4, так і СО8 Т-клітини, виділені з печінки, продукували ІЕМ-у ії ТМЕ-а, коли стимулювалися пептидом НВсАд іп місто (Фігури 28 і 29). У той час як СО4 Т-клітини демонстрували високий відсоток подвійних продуцентів, СО8 демонстрували незначну кількість або відсутність ІЕМ-У-ТМЕ-аж- продукуючих клітин. Зате, більшість СО8 Т-клітин продукували або тільки ІЕМ-у або ТМЕ-а. У печінці спостерігалося накопичення НВсАд-специфічних Т-клітин на противагу селезінці. Відсоток НВсАд-специфічних СО4 двічі позитивних Т-клітин печінки в стані спокою був порівнянним з клітинами, які спостерігаються в селезінці. Більш того, (610) периферичні СО8 Т-клітини були переконливо кращими подвійними продуцентами, ніж резидентні СО8 Т-клітини печінки. Також спостерігалась антитіло-продукуюча здатності резидентних В-клітин печінки імунізованих мишей. Цікаво, що печінка як слизовий орган продукувала більше антиген-специфічних ІдА, ніж дос (Фігура 30), спостереження, яке раніше не досліджувалась.
І00237| На Фігурі 31 показані клітинні імунні реакції, викликані РМ-Соге з використанням твердофазового імуноферментного аналізу (ЕГІЗРОТ). Спленоцити стимулювали двома пулами 15-мірних пептидів, що охоплюють повну довжину рМсСотге і перекриваються 8 амінокислотами. 200000 спленоцитами в середовищі К10 засівали 9б-лункову планшету, покриту ТЕМ-у- захоплюючим антитілом (система К 4 0), стимулювали протягом ночі в присутності специфічного пептидного пулу при 37 "С в 595 СО». Клітини змили, а планшети інкубували протягом ночі з біотинильованим анти-мишачим ІЕМ-у-виявляючим антитілом (система КеО).
Стрептавідин-лужну фосфатазу й 5-бром-4-хлор-3'індолілфосфат р-толуїдинову сіль та нітросиній тетразолію хлорид використовували для виявлення плям. Плями підраховували, використовуючи автоматизований ЕГІЗРОТ-рідер (СТІ Іітйей). Як показано на Фігурі 31, імунізація рМСоге викликає сильні клітинні імунні реакції. Середнє НВсАд-специфічних ІЕМ-у Т- клітинних реакцій становило приблизно 2000 (ж 210) БЕ) на мільйон спленоцитів.
І00238| Аналіз ЕГІБРОТ використовували для подальшого дослідження ІЕМ-у. Зокрема, спленоцити стимулювали двома пулами 15-мірних пептидів, що охоплюють повну довжину рмМсСоге та перекриваються 8 амінокислотами. Всього було 33 індивідуальних пептиди, які були об'єднані випадковим чином з першими 17 пептидами в пул 1 і останніми 16 в пул 2. ІЧЗЕЇ. ї НА- мітка виключалися, щоб зробити пептид як можна більш ближчим до природного антигену. 200000 спленоцитами в середовищі К10 засівали на 96-лунковий планшет, покритий антитілами проти ІЕМ-у-захоплюючим антитілом (система К «5. 0), стимулювали протягом ночі в присутності специфічного пептидного пулу при 37 "С в 595 СО». Клітини змили, а планшети інкубували протягом ночі з біотинильованим анти-мишачим ІЄМ-у-виявляючим антитілом (система КУ).
Стрептавідин-лужну фосфатазу й 5-бром-4-хлор-3'індолілфосфат р-толуїдинову сіль та нітросиній тетразолію хлорид використовували для виявлення плям. Плями підраховували, використовуючи автоматизований ЕГІЗРОТ-рідер (СТІ. Гітйед). Спостерігалося, що через один тиждень після фінальної імунізації рМСоге-імунізовані миші демонстрували ознаки сильних
НВсАяЯд Т-клітинних реакцій, як було визначено за допомогою ІЕМ-у ЕГІЗРО Т-аналізу після стимуляції ех мімо. На Фігурі 32 показано, що домінантні епітопи зміщені в бік пептидного пулу 2.
ІЇ00239| Дослідження цитотоксичності іп омімо проводили, використовуючи мічення карбоксифлюоросцеїндіацетатсукцинімідним ефіром (СЕБЕ) у поєднанні з проточною цитометрією. Спленоцити отримували у мишей, які не використовувалися раніше в дослідах, і розподілили у дві популяції. Одна популяція, СЕЗЕ-сильно мічені, пульсувала з релевантним пептидом (наприклад, капсидними пептидами НВМ). Інша популяція, СЕ5Е-слабо мічені, пульсувала з нерелевантним пептидом (наприклад, М5З-пептидами НСМ). Об'єднували мічені, оброблені пептидом клітини і використовували в експериментах адоптивних пересадок, в яких проводили проточний аналіз. Об'єднані популяції оброблених, мічених клітин-мішеней вводили двом групам мишей, контрольній групі та імунізованій групі. Спленоцити виділяли від кожної групи мишей, а зразки аналізували на проточному цитометрі. Вимірювали кількість СЕБЕ. Як правило, в таких експериментах утворюється два піки, перший відповідає нерелевантному пептиду; другий відповідає імунізуючому пептиду на піці, що вказує більший СЕБЕ. (00240) Фігура 33 демонструє, що СО8 Т-клітина, індукована вакцинацією, може специфічно елімінувати клітини-мішені іп мімо. Результати демонструють, що зразки селезінки й печінки від мишей, що раніше не використовувалися в дослідах, містили майже рівні кількості клітин, які були на піках нерелевантного і релевантного пептидів, між тим, як результати показали, що серед імунізованих груп піки клітин, отриманих з селезінки й печінки, пульсуючі з релевантним пептидом, були значно меншими, ніж з нерелевантним пептидом. Ці дані демонструють, що клітини-мішені, оброблені НВМ-пептидом, специфічно елімінувались у мишей, імунізованих
НВуУ-вакциною, але не у неімунізованих мишей. Будь-яка елімінація клітин-мішеней, оброблених нерелевантним пептидом, якщо взагалі відбувалася, була такою ж у мишей, імунізованих НВМ- вакциною, та неімунізованих мишей і значно нижчою, ніж елімінація клітин-мішеней, оброблених
НВмМ-пептидом.
І00241| Здатність НВМ-специфічних СО8 Т-клітин, індукованих після ДНК-імунізації, специфічно елімінувати клітини-мішені іп мімо досліджувалася додатково. Людські СТІ, які мають мішенню коровий антиген, є важливими в сильному кліренсі НВМ в порівнянні з хронічною інфекцією. Через один тиждень після фінальної імунізації 4 мишам з кожної групи, імунізованим рМах або рМсСоге, адопційно пересаджували спленоцити-мішені, які пульсують з (610) НВсАЯ (релевантний) або НСУ-М53/4А (нерелевантний) пептидами. Коротко, спленоцити від мишей, що раніше не використовувалися в дослідах (наївні), фарбували або 1 мкМ, або 1 Нт
СЕБА 5Е (іпмігодеп). Потім мічені спленоцити покривали індикаторними пептидами (мкм) і по 107 клітин з кожної популяції внутрішньовенно вводили наївним або імунізованим мишам. Через 24 або 90 годин, клітини з селезінки і печінки виділяли й аналізували за допомогою проточної цитометрії. Відсоток лізису клітин підраховували наступним чином: 100 - (| (96 релевантного пептиду, що пульсує в інфікованих клітинах /9о нерелевантного пептиду, що пульсує в інфікованих клітинах)/ (93 релевантного пептиду, що пульсує в неінфікованих клітинах / Фо нерелевантного пептиду, що пульсує в неінфікованих клітинах)) х 100). За допомогою селекції на СЕ5Е-мічених спленоцитах, щоб простежити лізис клітин, спостерігалося, що рмМсСоге- вакциновані миші здатні індукувати сильний специфічний лізис антиген-пульсуючих клітин- мішеней, як показано на Фігурі 34. Середній відсоток лізису клітин, що спостерігається в селезінці, склав приблизно 83 95, тим часом, як середній відсоток лізису клітин в печінці склав 76965, демонструючи, що індуковані вакцинацією СТІ, які мігрують і утримуються в печінці, здатні викликати лізис НВМ-пептид-пульсуючих клітин-мішенейЦе було перше дослідження для демонстрації індукування НВсАд-специфічних СТІ. реакцій в печінці за допомогою будь-якого методу і, зокрема, за допомогою системної імунізації. Ці дані свідчать про те, що периферична імунізація може індукувати ефекторні клітини, які можуть мігрувати в печінку і викликати лізис клітини-мішені. (002421) Фігура 35 показує результати, отримані шляхом аналізу Т-клітинної проліферації з використанням СЕ5Е-мічення. Порівнювали відсоток проліферації клітин СО3-С004-- і клітин
СбО03-008х, оброблених вектором рМах (контроль) або плазмідою рМСоге, яка експресує МСоге
НВУ. Стисло, виділені спленоцити фарбували карбоксифлюоросцеїндіацетатом, сукциніміділовим ефіром (СЕБА-5Е) Сеї! Тгасег Кії (Іпийгодеп) згідно з інструкціями виробника.
Пофарбовані клітини тричі промивали сольовим розчином і стимулювали рмМсСоге- специфічними пептидами, що перекриваються. Клітини інкубували при 37 "С протягом 96 годин.
Через 48 годин, 50 95 культурального середовища видаляли й поміщали в свіже К10. На 4 день, клітини збирали і фарбували СОЗ, 204 і СО8-специфічними моноклональними антитілами (ВО
РПпагтіпдеп). Клітини фіксували РВ5 з 1 95 параформальдегідом (РЕА) і придбаним РАСсСзсаїїриг
Весіоп бісКіп5оп). Дані аналізували, використовуючи програму Ріомл)о. СЕБЕ низька та СЕБЕ середня популяція були визнані як проліферуючі клітини. Як показано на Фігурі 35, СОЗ3-СОвктТ- клітини, виділені з селезінки, проліферували більше порівняно з СЮО3-СО8--Т-клітинами. 00243) Подальші експерименти з аналізом Т-клітинної проліферації також використовували
СЕБЕ-мічення. Зокрема, виділені спленоцити фарбували карбоксифлюоросцеїндіацетатом, сукциніміділовим ефіром (СЕБА-5Е) Сеї! Тгасег Кії (Іпийгодеп) згідно з інструкціями виробника.
Пофарбовані клітини тричі промивали сольовим розчином і засівали в 9б6-лунковий О-донний планшет в загальному обсязі 200 мкл середовища, що містило НВсАд об'єднаних пептидів в концентрації 1 мкг/мл. Клітини інкубували при 37 "С протягом 96 годин. Через 48 годин, 50 95 культурального середовища відбирали й переносили в свіже К10. Різниця в продукуванні цитокінів між СО4 ії СО8 Т-клітинами, як описано вище, була порівнянна з їх максимальною проліферативною здатністю. Після 4 днів стимуляції антиген-специфічними пептидами СОв' Т- клітини, проліферували більше ніж в 2 рази вище, ніж СО4-- клітини (Фігура 36), демонструючи чітке СО8 Т-клітинне зміщення у відповідь.
І00244| На Фігурах 37А і 37В представлені дані ЕГІЗА, що демонструють порівняння антитіла до кору НВМ в серійному розведенні сироватки від тварин, оброблених вектором рМах (контроль) або плазмідою рМСоге, яка експресує МСоге НВУ. Коротко, високозв'зуючі планшети
ЕПЗА (Совіаг, Сопіпд, МУ) покривали 1 мкг/мл білку НВсАд в РВ5 при 4 "С протягом 24 годин, а потім промивали РВО-Туеєп і блокували РВ5, що містить 195 В5А, протягом 2 годин при кімнатній температурі. Серійно розведені зразки сироватки додали в лунки та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Після промивання зв'язане антитіло сироватки було виявлене за допомогою НЕР-міченого козячого анти-мишачого дос (Фігура 37А) або ІдА (Фігура 378). Кон'юговані з пероксидазою анттіла були виявлені з використанням тетраметилбензидину (бідта-АїЇдгісй) як субстрату, а ОО при 450 нм була виміряна за допомогою Мийізсап ЕГІЗА планшет-рідера. Спостерігали антиген-специфічну гуморальну відповідь у сироватках імунізованих мишей.
І(00245| Для подальшого вивчення імунної відповіді, індукованної у рМСоге-імунізованих мишей, антиген-специфічні да та ІА реакції аналізували за допомогою В-клітинного ЕП І5рої, а також в ЕГІЗА з використанням спленоцитів і сироваток, відповідно, зібраних після вакцинації.
Спленоцити виділяли й очищали, як описано вище. Для ЕГІ5А, високозв'язуючі планшети ЕГІЗА (Созіаг, Сопіпд, МУ) покривали 1 мкг/мл білку НВсАяЯ в РВ5 при 4 "С протягом 24 год., а потім 10) промивали 0,1 95 РВ5О-Гиуєеп, а потім блокували РВ5, що містить 1 95 В5А, протягом 2 годин при кімнатній температурі. Серійно розведені зразки сироватки додали в лунки і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Після промивання зв'язане антитіло сироватки було виявлене за допомогою НЕР-міченого козячого анти-мишачого Ідс або ІдА. Кон'юговані з пероксидазою антитіла були виявлені з використанням тетраметилбензидину (Зідта-Аїагісп) як субстрату, а ОО при 450 нм була виміряна за допомогою Мийізсап ЕІ ІЗА планшет-рідера.
Високий титр Ідс і ІдДА спостерігався в сироватці імунізованих мишей порівняно з контрольними тваринами (Фігура 38). В-клітинну відповідь, визначену за допомогою ЕГІЗрої в імунізованих мишей (Фігура 39) демонструє НВсАд-специфічні Ідс і ІА приблизно в 200 ЗР! і 100 5Е)Ш на мільйон клітин, відповідно. Це ілюструє активацію В-клітинного компартменту імунізацією рмСоге. Штучна плазміда НВсАд ефективно індукувала антиген-специфічні клітинні і гуморальні реакції після З імунізацій. (00246) Фігура 40 демонструє відсоток ТМЕ-а і ІЕМ-у з СЮО4-- ії СОв8-- клітин селезінки і печінки.
І00247| За відсутності невеликих модельних тварин для НВМ НВсАд був використаний для тимчасової трансфекції печінки мишей шляхом гідродинамічної ін'єкції. Печінки імунізованих мишей трасфікували рМСоге або НСМ М53/4А. Імуногістохімічне фарбування через три дні після трансфекції показало кліренс НВсАд-трансфікованих гепатоцитів порівняно з М5З3/4А- трансфікованими гепатоцитами. Рівні АТ в сироватці вимірювали для того, щоб гарантувати, що кліренс, індукований імунізованими мишами, не викликав пошкодження печінки. Результати на Фігурі 41 показали, що кліренс, індукований у імунізованих мишей, не не викликав пошкодження печінки. (00248) Пряма гідродинамічна ін'єкція була також застосована для тимчасової трансфекції печінки мишей. Тут печінки імунізованих або наївних мишей трансфікувались або рМсСоге, або нерелевантною плазмідою, що кодує антигени гепатиту С (НСМ М53/4А). Стисло, імунізованим мишамвнутрішньовенно вводили 100 мкг плазміди в 2 мл (близько 10 95 об'єму ваги миші) розчину Рінгера протягом 7 секунд для тимчасової трансфекції печінки. Експресію або кліренс плазміди визначали шляхом фарбування печінки моноклональними антитілами до НА.
Імуногістохімічне фарбування через три дні після трансфекції (Фігура 42) показало кліренс
НВсАд-трансфікованих гепатоцитів порівняно з М53З/4А-трансфікованими печінками тварин. СО8
Т-клітини, виділені у мишей, яким гідродинамічно вводився рМСоге, показали більш високу частоту ІЕМ-уї СО107ажт, маркера дегрануляції, порівняно з імунізованими печінками тварин, трансфікованих нерелевантною плазмідою (Фігура 43). (00249) Так як кліренс рМСоге-трансфікованих гепатоцитів, здається, включає дегрануляцію, вважалося, що лізис клітин може призвести до пошкодження печінки. Щоб дослідити, чи здатні імунізовані миші очищатися від трансфікованих гепатоцитів, не викликаючи значного пошкодження печінки, був використаний аналіз вимірювання активності ферменту аланінамінотрансферази (А! Т), щоб вказати на наявність пошкоджень печінки при підвищених рівнях ферменту в сироватці (Фігура 44). Зокрема, активність аланінамінотрансферази (АІТ) в сироватці вимірювали з використанням оптичної спектрофотометрії (еїапбіо І абогаюгу), на
ВіоТек Зупегау 2 мікропланшет-рідері. Результати представлені у вигляді одиниць на літр (Од./л) і являють собою кількість ферменту, який окислює один мкмоль/л МАОН в хвилину. Ці дослідження показали, що питомий кліренс НВсАд-трансфікованих гепатоцитів не підвищує рівні АТ у трансфікованих імунізованих тварин за межі нормального діапазону 5-30 Од./л (Фігура 44).
Приклад 2
Поверхневі білки НВУ 1. Конструювання НВ5ЗАд ДНК-вакцини (00250) Використання консенсусних імуногенів в контексті варіабельних патогенів з сильно мінливими антигенними послідовностями може бути ефективним в індукції більш прямої імунної відповіді на боротьбу з природною вірусною різноманітністю в порівнянні з імунізацією одним природним імуногеном. Вісімдесят дві послідовності великих поверхневих антигенів генотипу А гепатиту і сімдесят послідовностей великих поверхневих антигенів генотипу С гепатиту були зібрані з СепВапкК, а консенсусні послідовності генотип-специфічних поверхневих антигенів і малих поверхневих антигенів були отримані після виконання кількох вирівнювань. Програмне забезпечення Сіизаї! Х (версія 1.8), що використовується для створення декількох вирівнювань, використовували для створення консенсусної послідовності.
І00251| Були одержані ДНК-конструкти, які кодують тільки основний 5 або ргеб51/52 плюс основний 5 поверхневий білок оболонки НВМ з використанням консенсусних послідовностей, що кодують генотипи А або С, які є найбільш поширеними генотипами у світі (Фігура 52А, Фігури
БЗА-5903). Відмінність між імунними відповідями, викликаними конструктами, які кодують 10) непроцесовані НВ або тільки основний 5, досліджували з приводу того, як амінокінцевий домен в рге51 може сприяти вірусному прикріпленню і входженню, тоді як карбоксильнокінцевий ргеб2 може бути пов'язаний з інфекційністю. Конструкти тільки основного 5 були названі малими НВ (ЗНВ), тоді як плазміди, що містили рге51/52 були названі великими НВ (І НВ). (00252) Консенсусні поверхневі білки НВМ були розроблені з епітопними послідовностями з первинних ізолятів генотипу А НВМ, так що одержаний консенсусний білок мав ідентичність послідовності, що складала від 94,2 відсотків до 99,8 відсотків, з поверхневими білками первинних ізолятів генотипу А НВУ. Зокрема, були розроблені дві версії такого консенсусного білку (Фігура 4 і Фігура 528). Один включав білок 5, також згадується як ЗНВ5-А, в якому послідовність 5Е20 ІЮ МО: 13 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, а ЕО ІЮ МО: 14 являє собою амінокислотну послідовність. Другий включав білок 5, рге-52 і рге-51, також згадується як І НВ5-А, в якому послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, а 5ЕО ІЮО МО: 10 являє собою амінокислотну послідовність. (00253) Консенсусні поверхневі білки НВМ також були розроблені з епітопних послідовностей первинних ізолятів генотипу С НВУ, так що одержаний консенсусний білок мав ідентичність послідовності, що складала від 96,5 відсотків до 99,8 відсотків, з поверхневими білками первинних ізолятів генотипу С НВУ. Зокрема, були розроблені дві версії такого консенсусного білку (Фігура 4). Один включав білок 5, також згадується як ЗНВб-С, в якому 5ЕО ІЮ МО:15 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, а 5ЕО ІЮ МО:16 10 являє собою амінокислотну послідовність. Другий включав білок 5, рге-52 і рге-51, також згадується як І НВ5-С, в якому
ЗЕО ІЮО МО:11 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, а 5ЕО ІЮ МО:12 являє собою амінокислотну послідовність.
І00254| Після одержання консенсусних послідовностей великих і малих поверхневих антигенів консенсусних генотипів А або С проводили кодон-оптимізацію і РНК-оптимізацію. Для вказаних вище консенсусних поверхневих антигенів НВУМ, ендопротеолітичні сайти розщеплення були введені в консенсусні поверхневі антигени НВМ для забезпечення належного холдингу білку та кращого процесування антигена (Фігура 3). Використання кодонів в консенсусних поверхневих антигенах НВМ було модифіковане для того, щоб усунути кодонне зміщення генів людини. Крім того, вдалось уникнути ділянок з дуже високим (наприклад, більше, ніж 80 відсотківр або дуже низьким (наприклад, менше, ніж 30 відсотків) вмістом ОС, де розміщались цис-діючі мотиви, такі як внутрішні ТАТА-бокси, повторні послідовності та структуровані послідовності. Послідовність Козак ввели в консенсусні поверхневі антигени
НВУдля підвищення ініціації трансляції. Високоефективну лідерну послідовність ЇДЕ додали проти ходу транскрипції стартового кодону для підвищення та збільшення білкової експресії, як описано раніше (Уап еї аї., Массіпе (2008) 26:5210-5215) (дивись Фігури З і 528). Були синтезовані оптимізовані гени і підтверджені послідовності. 00255) Консенсусні НВМ-поверхневі антигени 5НВ5-А, І НВ5-А, ЗНВ»5-С і І НВ5-С були клоновані в вектор експресії для одержання конструктів реНЬ А (також згадується як реНбБ-А), рЕНнЬ А (також згадується як рі НЬр-А), рень С (також згадується як реНнбЬ-С) і рі НЬ С (також згадується як рі НЬ-С), відповідно (Фігура 4). Синтезовані гени великих і малих поверхневих антигенів генотипу А субклонували у вектор експресії РОХО001 в сайти Ватні і Хпої, тоді як синтезовані гени великих і малих поверхневих антигенів генотипу С субклонували у рОоХО001 в сайти ЕсСокКІ і МоїІ. Одержання плазміди НВсАд (рмМсСоге) описане в Прикладі 1. 2. Експресія комбінованих ДНК-вакцин НВзАа іп міїго
І00256| Клітинні лінії рабдосаркоми (КО) і карциноми печінки людини (Нер с2) трансфікували рі НВ5-А, рі НВ5-С, реНВзв-А і реНВ»ь-С, використовуючи ТигроРесі мМ (Тпегпгто
Зсіепійіс) згідно з інструкціями виробника. Для внутрішньоклітинного аналізу клітини промивали і фіксували, використовуючи Суїфоїїх/Суїорегпт КИ (ВО РІагМіпдеп, Зап Оіедо, СА) згідно з інструкціями виробника. Після фіксації клітини фарбували сироваткою від імунізованих мишей або мишачим моноклональним антитілом до поверхні вірусу гепатиту В (Арсат, Сатргіаде,
МА). Потім клітини фарбували вторинним анти-мишачим антитілом, кон'югованим з ізотіоціанатом флуоресцеїну (ВО Віозсіепсев, Зап дозе, СА). Клітини промивали і фіксували 2 Фо параформальдегідом. Пофарбовані і зафіксовані клітини були одержані на пристрої І 5К з використанням програмного забезпечення СейОиевзі (ВО Віозсіепсе5) і проаналізовані з використанням програмного забезпечення Ріоумліо (Тгее 5іаг, А5пІапа, ОК).
І00257| Після конструювання та оптимізації чотирьох конструктів експресія білку з кожної плазміди була підтверджена внутрішньоклітинним фарбуванням. Клітини КО або Нер 02 тимчасово трансфікували окремими конструктами або пустим вектором рехХоО001 як контролем.
Клітини фарбували внутрішньоклітинно через 48 годин з допомогою анти-НВ5Ад поліклональної мишачої виворотки або комерційно придбаного мишачого моноклонального антитіла. Експресія (610) була підтверджена з допомогою проточної цитометрії (Фігура 52С). Підвищені рівні експресії білку НВ5 спостерігались в клітинах, трансффікованих кожним конструктом, порівняно з клітинами, трансфікованими пустими векторами (рохо001).
Приклад З
Імуногенність окремих штучних НВ5зАд ДНК-плазмід в моделях на малих тваринах
І00258| Після дослідження експресії оцінювали здатність окремих плазмід індукувати антиген-специфічні гуморальні і клітинні реакції іп мімо. Самки мишей Ваїр/с віком шість - вісім тижнів було придбано у Чдаскзоп І арогайгіех. Тварин утримували згідно з нормами МаїіопаїЇ
Іпнзійшевз ої Неайй апа Ше Опімегзйу ої Репп5зуїмапіа Іпвійшіопа! Саге апа Ове СоттіШееє (ІАСИС).
Мишей Ваїр/с тричі імунізували внутрішньом'язово (ІМ) 15 мкг плазмід, які експресують малий або великий 5-антиген, або контрольною рОхХоО001 з 2-тижневим інтервалом в тижні на 0, 2 і 4 тижні. Кожна вакцинація відбувалась одразу після електропорації в ділянці інфекції, як описано вище (Нігао еї аї., Массіпе (2008) 26:440-448). 002591 Для імунізації всі ДНК розводили водою без нуклеази (Оіадеп, МаІепсіа, СА 91355).
Кожна тварина в групі імунізації в цілому отримувала по три внутрішньом'язові імунізації 15 мкг відповідної плазміди. Для комплексного вивчення кожна тварина отримала в цілому по 45 мкг
ДНК в обидва передні великогомілкові (ТА) м'язи. Кожна імунізація супроводжувалась електропорацією іп мімо пристроєм СЕГГЕСТКА для адаптивної електропорації постійним струмом (Іпоміо РпаптасешцшіісаІ5, Вісе ВеїЇ, РА). Імпульс постійного струму 0,2 ампер а генерувався через трикутну З-електродну решітку з електродіами з нержавіючої сталі 26 калібру, повністю зануреними у м'яз. Кожен імпульс тривав 52 мілісекунди з 1-секундною затримкою між імпульсами. Індуковані вакциною гуморальні відповіді були розглянуті вперше, оскільки попередні ДНК-вакцини не були здатними викликати виражені гуморальні імунні реакції. 1. Аналіз антитіл з допомогою ЕГІ5БА
І00260| ЕПІЗА проводили з метою аналізу антиген-специфічних реакцій Ідс: в сироватці, отриманій від мишей через 7 днів після кожної імунізації непроцесованим білком НВзАа в ролі антигена-мішені. Високозв'язуючі планшети ЕГІБА (Совіаг, Согпіпуд, МУ) покривали 1 мкг/мл рекомбінантного білку в РВ5 при 4 "0 протягом 24 годин, а потім промивали 0,1 95 РВ5-ТГмуеєп і блокували РВ5, що містив 1 95 В5А, протягом 2 годин при кімнатній температурі. Стерильно розведені зразки виворотки додавали в лунки та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Після промивання зв'язаний (Я виявляли з допомогою НКР-міченого козячого анти-мишачого дс. Кон'юговані з пероксидазою антитіла виявляли, використовуючи татраметилбензидин (5ідта-АїЇдгісп) як субстрат, а значення ОО при 450 нм вимірювали за допомогою Мийізсап ЕГІЗА планшет-рідера.
І00261| Обидва рі НВ: і раНВ: з будь-якого генотипу були високо імуногенними. Додаткова імунізації підвищила ці реакції з реакціями антитіл, демонструючи найбільше підвищення через два тижні після третьої імунізації (Фігура 53А). На противагу цьому, миші, імунізовані лише контрольною рОхХО001, демонстрували фоновий рівень реакції (до. Хоча деякі відмінності в амплітуді реакції (дО спостерігались в кожній групі, але поступове підвищення після кожної імунізації було постійним в межах груп. 2. 1ЕМ-у ЕГІЗРОТ 00262) Здатність конструктів рі НВ5-А, рі НВ5-С, рЗНВз»г-А і реНВ5ь-С індукувати клітинні імунні реакції досліджувалась з допомогою ІЕМ-у ЕГІЗРОТ. Підбираючи консенсусний кор НерВ, 15-мірні пептиди поверхневого антигену А і поверхневого антигену С синтезували з допомогою
Сепезогірі (Різсаїажау, МО) і ресуспендували в ОМ5О та об'єднували в пул при приблизній кінцевій концентрації 1 мкг/мл кожного пептиду. Клітинні реакції вимірювали, використовуючи
ІРМ-у ЕСіІброї (МартТесії, Змедеп) згідно з інструкціями виробника. Зразки брались в трьох повторностях з К10 (КРМІ 1640, що містило І-глутамін з 10 905 інактивованої нагріванням фетальної бичачої виворотки і 1 95 пеніциліну/стрептоміцину) і контролем РМА/ЛМ (РМА 0,1 мкг/мл та іономіцином 0,5 мкг/мл, Зідта Аїагіси, 5. Гоці5, МО). (00263) НВ5зАд-специфічні ІРМ-у секретуючі клітини проаналізували у відповідь на два пули штучних пептидів, одержаних з консенсусного великого поверхневого білку НВМ. Перший пептидний пул містив пептиди, що охоплювали ргеб1 і рге52 білки, тоді як другий пептидний пул складався з пептидів, які охоплювали основний 5-білок. Всі чотири консенсусних конструкти були здатні індукувати сильні реакції Т-клітин, а перехресна імунна реактивність спостерігалась в межах двох генотипів (Фігура 538). Хоча, разом ргеб5 білки майже однакові за розміром з основним 5-білком, спостерігалось епітопне зміщення в клітинноопосередкованих імунітетних (СМІ) реакціях відносно основного 5-білку. Ці результати вказують на те, що штучні ДНК- імуногени, які кодують непроцесований поверхневий антиген або лише основну 5-частину (610) поверхневого антигена НВУ, демонструють імуногенність, яка є достатньо різноманітною, щоб націлюватись на основні генотипи НВМ. Непроцесовані конструкти не продемонстрували суттєвих відмінностей в індукуванні Їдс до природного білку НВМ порівняно з більш короткими конструктами. 3. Картування поверхневих антигенних (15-мірних) пептидів НВМ
І00264| Після підтвердження амплітуди СМІ було досліджено рівень клітинних реакцій на генотип- специфічні мішені. Відповідно, проводили серію аналізів інтерферон-гамма ЕГІБРОТ проти різних пулів матриксних пептидів два комплекти пептидів. Два набори пептидів, що охоплюють білок І ВН5-А або І НВ5-С, кожний з яких містить 15 амінокислотних залишків, які перекриваються 8 амінокислотами, були синтезовані з допомогою Сепозсгірі (Різсаїамжау, МУ).
Для того, щоб відобразити імуно-домінантні епітопи, два комплекти пептидів об'єднали в 16 або 12 пулів великих і малих груп НВ5ЗАд відповідно. ІЕМ-у ЕГІЗрої аналіз здійснювали, як описано вище. Ці різні комплекти об'єднаних пептидів використовувались в матриксному аналізі для картування епітопів кожного конструкту. Реакції з більше, ніж 50 5БИ на мільйон клітин вважались позитивними.
І00265| Ці дані показують, що різні епітопні реакції були викликані цими штучними плазмідами поверхневого антигену у мишей лінії ВАС В/с. Спостерігались в 12 з 16 позитивних
ІНВ» матриксних пулів у рі НВ5-А-імунізованих мишей і 8 з 16 позитивних ГНВ5-С матриксних пулів у р НВ5-С- імунізованих мишей. Малі плазміди НВО показали більш високі кількості реакцій з р2НнНВ5ь-А-імунізованими мишами, відповідаючи на 9 з 12 5НВ5-А матриксних пептидів, в той час як рзнвВ5»-С-імунізовані миші демонстрували відповіді на всі матричні пули 5НВ5-С (Фігура 53С). Ці дані вказують на високий рівень перехресно реактивних клітинних реакцій, викликаних цими 4 НВз-конструктами. В результаті, ці генотип-специфічні консенсусні вакцини можуть бути здатними індукувати перехресно реактивні клітинні реакції проти різних первинних поверхневих антигенних ізолятів, які до 8 95 відрізняються від цих генотипів.
Приклад 4
Аналіз цитотоксичності і антиген-специфічних СТІ, виявлених в печінці та селезінці вакцинованих мишей (00266) Противірусні ефекторні СЮО8 Т-клітини індукують цитотоксичність, що являє собою клітинну активність для елімінування НВМ-інфікованих гепатоцитів. Здатність конструктів генерувати НВ5-специфічні СТІ в периферії, що можуть також бути рідними для печінки імунізованих мишей, оцінювали з допомогою аналізу цитотоксичності іп мімо. Спленоцити наївних мишей фарбували або 1 мкМ (висока), або 1 нМ (низька) СЕБА ЗЕ (Іпийгодеп, Сстапа
Ібїапа, МУ, О5А). Мічені спленоцити потім покривали вказаними пептидами (релевантними або нерелевантними пептидами) (1 мкМ) і по 107 клітинкожної популяції внутрішньовенно вводили наївним або імунізованим мишам. Через 90 годин, виділяли клітини з крові, селезінки або печінки та аналізували з допомогою проточної цитометрії. Відсоток лізису клітин розраховували наступним чином: 100 - (Ї (96 релевантного пептиду, який пульсує в інфікованих клітинах / Фо нерелевантного пептиду, який пульсує в інфікованих клітинах)/ (96 релевантного пептиду, який пульсує в неінфікованих клітинах / 96 нерелевантного пептиду, який пульсує в неінфікованих клітинах) х 100). (00267) Міграція НВМ-специфічних СТІ в печінку має важливе значення для внутрішньо печінкового елімінування інфікованих клітин. Антиген-специфічна елімінація адаптивно пересаджених спленоцитів-мішеней, які пульсували з штучними пептидами НВзЗАд, не спостерігалась. Середній відсоток лізису клітин-мішеней в селезінці у мишей, імунізованих конструктами ЗНВ»5, складав 39 95 і 48 95 для генотипу А і С, відповідно. Середня елімінація клітин-мішеней для конструктів ІНВ» склала 35 95 для генотипу А і 51 95 для генотипу С. Кліренс був сильним, але не настільки потужним, як реакція, що спостерігалась у мишей, які були імунізовані тільки коровою Ад-плазмідою, як описано в Прикладі 1, у яких 83 95 і 76 95 цільовий кліренс був відмічений в селезінці та печінці, відповідно. Демонстрація того, що СТІ, генеровані проти НВ», можуть усувати антиген-мішень в печінці, сприяючи тому, щоб вона підтримувала комбінацію НВ ії НВс для подальшого розширення клітинної сили та обмеження витоку.
Відсоток елімінації клітин-мішеней в печінці склав 45 95 і 66 95 для З5НВ5-А і ЗНВ5-С, і 60 95 і 74 95 в групах І НВ5-А і І НВ5-С (Фігура 54). Маючи вакциноспецифічний СТІ -трафік в печінку, орган, як відомо, пригнічує Т-клітинну відповідь та індукує толерантність, підкреслює ефективність конструктів в стимулюванні функціонального СМІ.
Приклад 5
Імуногенність НВЗАЯа-НВсАд ДНК-коктейлю
І00268| Оскільки імунізація кожною штучною НВ5ЗАд-плазмідою викликала широкі перехресно реактивні імунні відповіді, то відповіді були розширені за межі поверхневого (610) антигену для подальшого підвищення імуногенності відносно різних антигенів в межах вірусу.
Плазміди НВ» об'єднали з плазмідою, яка кодує НВсАд (рмМсСоге), для створення НВ5»-НВс ДНК- вакцинних коктейлів для імунізації з метою з'ясування того, чи підвищить коктейль клітинну реакцію шляхом збільшення кількості клітинних епітопів, які Т-клітина буде роспізнавати для елімінування, так як коровий антиген НВМ бере участь у вірусному кліренсі через індукцію
НВсАд-специфічних СТІ. реакцій. (00269) П'ять груп мишей, імунізованих вакцинними коктейлями тільки антигенів НВ5 або об'єднаних антигенів НВ5 і НВс. Кожна миша одержала по дві ін'єкції з наступною електропорацією в обох ТА. Мишей імунізували або коктейлями, що містили тільки поверхневі антигени (обох генотипів), або коктейлями, що містили як поверхневі антигени, так і консенсусну плазміду корового антигену (рМСоге), описану в Прикладі 17 (дивись Таблицю 3). Миші, імунізовані тільки НВ5АЯд, генерували високий титр до в своїх сироватках. Цікаво, схожі титри спостерігались в групі ЗНВ5-рМсСоге, проте були менш сильними в групі коктейлів І! НВ5-рРМСоге (Фігура 55А). Збільшення антигену-мішені, можливо, викликало деяке інгібування антитіл.
Таблиця З
Імунізаційні групи мишей для дослідження ДНК-коктейлів НВ5-НВс.
І00270| Для подальшого вивчення імунної відповіді, індукованої НВ5-НВс-імунізованими мишами, оцінювали продукування ІЄМ-у у кожної імунізованої групи. Середня кількість 5ЕО на мільйон спленоцитівдля груп, які не мали рМСоге, склала 689 і 666 для генотипу А і 1160 і 1312 проти пептидів генотипу С, відповідно. Крім того, додавання рМСоге в середньому збільшувало загальну кількість 5ЕО на мільйон спленоцитів на 400 точок проти генотипу С і в два рази реакцію, коли спленоцити стимулювали пептидами генотипу А (Фігура 558). (00271) СО8 Т-клітини, як відомо, є основними ефекторними клітинами, відповідальними за кліренс НВУ. Важливо визначити, який тип Т-клітин є причиною спостережуваного продукування
ІЕМ-у ї вивчити, чи можуть ці Т-клітини індукувати декілька противірусних функцій у відповідь на антигенне повторне зіткнення, вивільняючи інші противірусні цитокіни, такі як ТМЕ-а і 1--2 і маркери де грануляції, такі як СО107а. Здатність СО8 Т-клітин від імунізованих мишей індукувати ці цитокіни і маркери оцінювали після стимуляції ех мімо придатними пептидами.
Проточний аналіз з різними барвниками показав, що значний відсоток СО8 Т-клітин з кожної групи були поліфункціональними (тобто продукувалось декілька цитокінів), активовані СО8 Т- клітини у всіх групах (Фігури 56А-Е). Також спостерігалась антиген-специфічна індукція маркера лімфоцитної дегрануляції, СО107а, в цих СО8 Т-клітинах. СО8 Т-клітини з групи коктейлів НВ5-
НВс показали високу полі функціональну активність при стимуляції пептидом поверхневого антигену, що підтверджує синернічний ефект в СО8 Т-клітинних противірусних цитокінах, таких як ІЕМ-у ТМЕ-а і 1-2, і маркера дегрануляції, СО107а. Також спостерігалась індукція СТІ. через кліренс пересаджених антигенопульсуючих клітин. В той час як спостерігалось зменшення відповідей антитіл до НВ5 для коктейлів, включаючи конструкти ІНВ», коктейлі вакцин ЗНВ5- рмМсСоге підтримували гуморальні відповіді, виявлені у тварин, імунізованих тільки ЗНВ5.
Приклад 6
Імунізація макак-резус коктейлем, що індукує сильні клітинні НВс- і НВз5-специфічні і гуморальні НВ5-специфічні імунні реакції (00272) Ефективність ДНК-вакцини попередніх ДНК-конструктів була послідовно слабкою у великих тварин і людей. Сильні відповіді антитіл і Т-клітинні відповіді, стимульовані комбінацією ріНВ:» або рзНВ5 і рМсоге у мишей, приводять до оцінки імуногенності цих конструктів в моделі приматів крім людини (МНР), які більш точно імітують імунну відповідь людини. Ця перепона для імуногенності вакцини як більшого розміру та аутбредної МНСОС-популяції МНР, як правило, приводить до зниження або відсутності імуногеності порівняно з мишиними моделями. Для цих досліджень 1-12, Тп-1-провідний цитокін, був доданий для аналізу. Було показано, що 1-12 приводить СМІ, сприяючи примірюванню та експансії СО8 Т-клітин, при додаванні до імунізації як ад'юванта для підсилення імунної відповіді проти різних антигенів з різних патогенів. Цей ад'ювант збільшує Т-клітинні відповіді ДНК-вакцини у мишей, макак та людини.
1. Вакцинація
І00273| П'ятнадцять індійських макак-резусів були поміщені в Віодца! (КосКмійе, МО) відповідно до стандартів Американської асоціації по акредитації в галузі лабораторних тварин.
Резус-макаки були розділені на групи, причому кожна група складалась з 5 мавп. Дивись
Таблицю 4.
Таблиця 4
Групи імунізації приматів крім людини
І00274| Одній групі шляхом внутрішньом'язової (ІМ) доставки (також відомої як електропорація іп мімо) вводили вакцину, що містила 1,0 мг кожного з конструктів рМСоге, рень
А і р5НЬ С; цю групу назвали "малою" групою. Другій групі вводили шляхом ІМ доставки вакцину, яка містила 1,0 мг кожного з конструктів рМСоге, рЕНЬ А і рі нь С; цю групу назвали "довгою" групою. Третій групі вводили шляхом ІМ доставки вакцину, що містила по 1,0 мг кожного з конструктів рМСоге, рЕНЬ А ії ріНЬ С ії 0,4 мг рт -12 (плазміда, яка експресує оптимізований резус ІІ--12); цю групу назвали "довгою -12" або "рі НВ5-12" групою. Конструкт рій -12 кодує білок ІЇ/-12 макака-резус. ДНК була доставлена до одиничного сайту в чотириголовому м'язі з наступною ЕР іп мімо з допомогою пристрою постійного струму
СЕП ЕСТКАФ (Іпоміо Рпаптасеціїса!5, Вісе Веїї, РА) З імпульсами при 0,5 А постійного струму, тривалість імпульсу 52 мс та 1 с відпочинку між імпульсами. Тварин вакцинували в тижні 0, 4, 12 і 30. 2. Відбір проб (00275) Зразки брали у мавп перед імунізацією в тиждень 0, а також після кожної імунізації (тобто після тижнів 0, 4 і 12). У тварин брали кров через 2 тижні після кожної імунізації. Кров (20 мл в кожний момент часу) збирали в пробірки з ЕДТА, а РВМС виділяли із застосуванням стандартної процедури фіколл-гіпак з пробірками Ассизхріп (Зідта-Аїйагісп). Додаткові 5 мл крові збирали в пробірки для відділення плазми, а сироватку ділили на аліквоти для аналізу. (00276) Реакції з високим титром антитіл проти НВ5Ад спостерігались після двох імунізацій рЗнНВ5/рмсСоге, але не з рі НВ5/рМСоге. Ця відповідь була спів ставною з даними мишачого антитіла на Фігурі 55А. Відповідь на рі НВ5/рмсСоге піднялась після третьої імунізації. Ад'ювант
І/-12 підвищив титр антитіл імунізації коктейлем рі НВ5/рмсСоге вже після всього лишень двох імунізацій (Фігура 57А).
І00277| Клітинні імунні реакції від РВМСОС показують практично повну відсутність НВ5 або
НВО-специфічних відповідей після першої імунізації. Проте, відповіді спостерігались після другою імунізації та збільшувались після кожної наступної імунізації. Сильні відповіді вище 2000
ЗР на мільйон РВМС спостерігались у всіх групах після третьої імунізації і в значній мірі були направлені проти корового антигену. Додавання ад'юванта 1-12 підсилювало амплітуду Т- клітинної відповіді 1000 ЗРО на мільйон РВМС у порівняні з тільки коктейлем рі НВз/рмМСоге (Фігура 578). Для подальшого визначення широти клітинної відповіді були створені матриксні пули консенсусних корових пептидів для визначення кількості можливих епітопів. Реакції Т- клітин охопили декілька пептидних пулів з середньою відповіддю на 12 пептидних епітопів (Фігура 57С). Ці відповіді співпадають з отриманними раніше, як показано на малих модельних тваринах. Ці результати дозволяють припустити, що коктейлі здатні індукувати клітинну відповідь з сильною амплітудою і шириною, і що амплітуда цих відповідей може бути розширена шляхом додавання 1І--12. (00278) На Фігурах 45-48 показані клітинні імунні реакції, викликані вакцинами, введеними введеними в малій, довгій і довгій -12 групах. Аналіз імуноферментних плям (ЕГІ5РОТ) був використаний для визначення клітинної імунної відповіді, як описано вище в Прикладі 1. Як показано на Фігурах 45-48 Т-клітинна відповідь підвищувалась із кожною вакцінацією. Проте коровий антиген НВМ був більш імуногенним, ніж НВМ-поверхневий антиген А і НВУ- поверхневий антиген С. Ці дані також показують, що більш довгий консенсусний поверхневий антиген НВМ (тобто включає білок 5, ргеб52 і ргеез1і) є імуногенним як малий поверхневий антиген НВМ (тобто включає білок 5).
І00279| Подібно Фігурам 45-48, на Фігурі 49 показані клітинні імунні відповіді, викликані вакцинами, введеними в малих, довгих і довгатІЇ-12 групах, як виміряно з допомогою аналізу
ЕГІБРОТ, крім того були досліджені різні пули пептидів, що охоплюють коровий антиген, поверхневий антиген А і поверхневий антиген С. Знову ж таки, відповідь Т-клітин підвищувалась з кожною вакцинацією, додавання 1-12 посилювало клітинну імунну відповідь, а довгі і короткі консенсусні поверхневі антигени НВМ були аналогічно імуногенними.
І002801| На Фігурі 50 показані дані ЕГІЗА, які порівнюють відповіді антитіл проти НВМ для малих, довгих і довга їІ/-12 груп. ЕГІЗБА здійснювали як описано вище в Прикладі 1.
Спостерігалися антиген-спеціфічні гуморальні реакції в сироватці, одержаній від імунізованих мавп. Зокрема, вакцини, що включають довгий консенсусний поверхневий антиген (тобто 5- білок, рге52 і рге5з!) мають кращу реакцію антитіла, що може бути через додаткові епітопи, присутні у вакцині. (00281) На Фігурі 51 показані дані ЕГІЗА, які порівнюють відповіді антитіл проти НВМ для групи довга ж« 1-12 до імунізації (ргемас) і після імунізації в тиждень 0, тиждень 4 і тиждень 12 (тобто після 1-ї, після 2-ї і після третьої імунізації, відповідно). ЕГІЗА проводили, як описано вище в Прикладі 1. Дані на Фігурі 51 показують, що дві імунізації або дози необхідні для вимірного продукування антитіл. Крім того, значне підвищення відповіді антитіла до НВМУ спостерігали після третьої імунізації або дози.
Приклад 7 (002821) Як і в експериментах з мишами в Прикладі 5, спленоцити, тобто СО8 і 04 Т-клітини, були виділені від імунізованих макак резус в Прикладі 6 для дослідження рівнів ІМЕ-у і секреції
ТМЕ-а у відповідь на введення комбінації консенсусних корових і консенсусних поверхневих антигенів. СО8 і 204 Т-клітини були вивчені за допомогою поліфункціонального і фенотипового проточного аналізу, щоб вивчити секрецію фактора некрозу пухлини, гамма-інтерферону і сОр107а з цих СО8 ії СО04 Т-клітин, щоб визначити, чи мають СО8 і СО4 Т-клітини імунізованих мавп з Прикладу 6 подібні характеристики з мишачими СО8 і СО4 Т-клітинами, вивченими в
Прикладі 1. (00283) Для подальшого визначення функції клітинної імунної відповіді, внутрішньоклітинне фарбування противірусних цитокінів проводили після стимуляції корових і поверхневих антигенів з генотипів А ії С. Внутрішньоклітинне фарбування антитілами до противірусних цитокінів показало, що антиген-специфічне продукування противірусних цитокінів (ІЕМ-у, ТМЕ-а і
І -2) індукувалось в обох СО4 та СО8 Т-клітинах від імунізованих мавп. Фігура 570 показує, що після трьох імунізацій спостерігалися НВМ-спеціфічні СО4 і СО8 Т-клітинні реакції. Подібно результатам, показаним в ІЕМ-у ЕГІбЗрої, відповіді проти корового антигену домінували.
Додавання 1-12 посилювало загальну амплітуду відгуку, однак, як очікувалося, цей ефект був більш вираженим для СО8 Т-клітин. Індукція як СО4, так і СО8 відповідей, яка становить у середньому 1 95, припускає індукцію широкої імунної відповіді, що складається з ТИ і Тп2 імунітету і є сильно обнадійливою для просування цієї стратегії у випробуваннях на людях. (00284) Антитіла і Т-клітинні відповіді на антигени НВ: і НВс були аналогічні результатам, отриманим для мишей в Прикладі 5. Ці відповіді були ще більш вражаючими, коли 1-12, ТНп1 поляризаційний цитокіновий ад'ювант був доданий в коктейль рі НВе-рМСоге. Схоже, що рі НВЗ-рМсотге-41І -12 рецептура була досить ефективною як краща комбінація. Слід зазначити, що жоден вакцинний препарат не призвів до підвищення параметрів, пов'язаних з пошкодженням печінки.
Приклад 8
Аналіз функції печінки у нелюдиноподібних приматів після вакцинації з використанням панелей для хімічного анлізу крові з печінки
І00285| Оскільки клінічні дослідження пацієнтів, активно інфікованих НВУ, припустили можливість того, що Т-клітинна відповідь може бути пов'язана з патологією печінки протягом хвороби, то проводили попередній аналіз загальної безпеки цих полівалентних вакцин відносно функції печінки. Для того щоб дослідити функцію печінки, були проаналізовані рівні лужної фосфатази, аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази і загального білірубіну в сироватці вакцинованих тварин до імунізації, після третьої вакцинації і безпосередньо перед четвертою вакцинацією і після четвертої вакцинації. Панелі для хімічного аналізу крові постачались ІЮЕХХ Іарогайгіеє і містили лужну фосфатазу, аланінамінотрансферазу, аспартатамінотрансферазу та загальний білірубін. Результати цього аналізу показані на Фігурі 58. Відсутність підвищення лужної фосфатази, аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази і загального білірубіну в тестах на функцію печінки до, під час і після завершення періоду імунізації припускає, що індукція НВМ-специфічної імунної відповіді не викликала значної шкоди печінці вакцинованих тварин. (610) (00286) Взяті разом, ці дані підтверджують, що введення цього штучного ДНК-вакцинного коктейлю, який кодує сконструйовані антигени НВУ, в комбінації зі специфічною електропорацією призводить до сильних і різноманітних клітинних і гуморальних реакцій у мишей і МНР, уникаючи при цьому відчутної токсичності.
І00287| Зрозуміло, що наведений вище докладний опис і супроводжуючі приклади є тільки ілюстративними і не повинні розглядатися як обмежуючі обсяг винаходу, що визначений виключно доданою формулою винаходу і її еквівалентами. (002881) Різні зміни і модифікації розкритих варіантів здійснення будуть очевидні фахівцям в даній галузі техніки. Такі зміни ії модифікації, в тому числі, без обмеження, що стосуються хімічної структури, замісників, похідних, проміжних сполук, композицій, складів або способів використання винаходу, можуть бути зроблені без відступу від сутності і обсягу винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ТНЕ ТЕОЄТЕЕВ ОБ ОТНЕ ПШІУВЕВІТХ ОЖ РЕЮНОУ САНТА,
Меїпек, рамі. В.
Жап, бів
ОБапа-Ааієї, Мудштакує «ТО ж МОЛЕКУЛИ НУКЛЕЇНОВИХ: ХИСЛОТ, ЩО кОДУЮТЬ КОРОВИЙ БІЛОК ВІРУСУ
ТЕПАТИТУ В І ПОВЕРХНЕВИЙ АНТИГЕННИЙ БІЛОК, ТАК ВАКЦИНА, ЩО ЇХ МІСТИТЬ «130з шрувоя? мох «іайзх рРСТ/ОВБІЗАвОовІВ «141їх 2013-05-19 «Ї50» 08 137 633,365 «їз вата -па-19 «іпОм а «19705 Патевтна векшіж 3.5 «киїВх єйт1ух 55 «вій БИК. «іа» швтучва послідовність «з «8223» послідовність нуклеїнової кислоти М-сока «ЙО х «ері» їнші характеристики «ад (11.3 «203» понвлиє соббБю а, Є» 4 або г «00» Її пиппуасасся асссесасаа ззавсссодо чосасечсчу зассоссчая сгреседессо ва засчастєсть Єосссбссої чдсззчасскаеа ссзчасассо ссацеассоЄ ссасачаєая 120 чесстцяЯвна зсосссаачсв сідтацессю сабсасасач сессдсачсяа чассаєссса ї89 сдесчаздеся ачссчаєчас сскодесасс Сузуєсудва довасосядча ачасссочес вассоочасє сочсачеяес стасавоває ассавасаєче чссбчаачає ссудсааста 300 скасчуоскос асасссесса сстазсеекс чассазчаза осагЧссяча асассвЗчее
ЕСОЄссоЯоаса вобуЧаєсва аасссесоесе чесбасацчасє ссоссаасцєе сессатосту 420 адсасссєас ссдадасаас собудесссуєс ачасодадчеа чаздссосач задаздазос
Що ссессачесова часасозчач асбобсадачо ссозочедов чавзчасосса зпадоссастая 540 псосачсаст за 552 «їй й «ії» 183 «813» білок «-313» йтучна послідовність «ех «23» амінокисСлотна послідовність МоСоке «220» «арії» інші харакюверистики кйййж Ки: «223» Хаа може бути природною амінокислотою «абз З
Хаа Ар ІЛе дар Рко Тук цув піц Ре бтіу Аїа Тих уаії січ Бей ей ї но 10 ІБ
Зех Бра цей рхо бек Аво Ббе Ре Рхко бек Уві Яку Авр Цей ей Авр мВ) 25 за тТвЕ діа бек Аза гей тує Ако біз діа цей сій вег Рхо З1фа Нів Су 38 40 ав
Вех Рко Ні Нів ТЕ Аїа Пец бго ОТ Аїа І15 Тен Сує Ткробіу біз
ВЕ о пе Меб Тк пемз діа тТНу Ттро уві п1у бек Ап обец бі Авробго діа 65 ХО 75 во век Ахч Ар ем чаї уаї Бех Тух чаї Ав ТЕ АБО Меє с1іу Бреш Пув ве 30 5
Тїе Ака бій без пе Тер ВБе Нів І1е бек Сув це Тпх РБе БіУу Дука то 195 110 сії тих уаі цей сій Тук пед Чаї бек Бпе біу Уві Тк ті АхФ ТЕ 115 і29 п: вк рхо ліа Тут Ака рко РжОо Ав одіа ро Ії реп Бех Тих Пей БЕЗ 130 35 142 сій Трх То Уах Уві Аг Ага Ар б1у Акта бек Ро Ак АкЯ АКо Топ 125 їт50 155 во
Вхо Бек о Рго Аку Акт АхчЧ Аха бек бій бек Рго Ах Ага АхЯа Аха ек же І7О ї75 сСіп век Ака бій бек Зіп Сув 1850 «210 3 «а1ТЬз БОЇ «паз ДЕК «аїз вчозва послідовна сть «ВО» ««вшї» посліДОВНІСТЬ НУКЛЕЇНОВОЇ Кислоти ТОЖ лідера - Мм-сога «а0й0з 3 зсазастача ссгачасеоє Чдесоссдаса асозосєдсся бавочасоса сзасчвсаво
БО часосстаса зазааєссоз сцссвосуєа савсєасєда чевесебдсє сацсчасесо о кресесіссЯ басозаєсос чсСсозаєвеос зессачесасосо сабасазчача зчасссбазай їі8б вчесссосчачо ассасачесес сСсозссасвсв дссссоасодс аучссасось чеасрадаес о чацевчаєся ссосвоаассве ссчуостсода засзаєссод вачасрссечо сазесацене 3050 сеччсячУЯє сстасасцаа сассазсаба чдассбовзача себачсвасб чесоговее зо сасаєстссе чсескзасеве сочсодачаз ассссцстовз азсасссач чеЕсессссчче о чізсзазнНіса чаасосесос Ецестасада сспсоссзвасУ гесскавсся чачсвесова 85 сесчачасва седбуачтосу сасасчузас авачоссса чвачаазаве ссесачеесо зад авчасчдсеча засстсвуач ссссазчасод зазвачаєссоо азачссусча даусовасоє
БОЮ ча 503 «2105 4 «їі 00 «з1йз білок «213з штучна послідовність «205 «пі» амінокислетна послідовність ТЕ підера є М-Соже «00» й
Мес Авр о тТжр ТОК ТкБ ІЩЕ Пез вне Пец Уві АтТа Аза Аїа Ті Ата Чаї ії 5 їо 15
Нів бек АбБр І1їе Авр о РІО ТтТух бук сій БВе сіу Аза Тпх Маї біс Бей за 25 за
Гей о зеж Рпе спеа Ро бБеї АвроБце РБе Рко бек Уаі Ага Авр Сем пей
АвротТвж діа Бек Аза Пе Тук дкЯ ій Аза рей бій бек Ро іч Ні 5О в 218:
Сує Бек рхо Нів Ні ТБт Аїа пем Вк біп Аїа тіїє ей Сув Ткросіу е5 70 75 ва шо песо Меє тТрж о Бпемч Аїя Тех ТЕроМаї с1у бБесоАвп о їйєй 510 АВрорко в5 а З
Аїа Зех Аку Авр цей Узі Уах Бек тує Майї Авп ТІж Ап оМеб біу ей
Іа ТОБ 110
Був (18 Акч біл пев опей Тур орРНе Нів Т1іе Зех Сув Пец тцЕ ре сту ї15 20 і
Аха зі ТВ Ууаї рай бін Тук оцей; Уаї Заеї Бе 53у уаї Тр їТе Акч 130 135 щ40
Тих ко РКО Аза Тух Ака рРго Рго Авап діа Рто Іі Без бек Трх Пец 145 хво 155 155 рео бін тТнЕ тн оуаії Ууаї Ака Ак Ах біу Ак Бех Ро АхУ Аку Аху
ЩеБ вто 75
ТЕ Рко бек Ркго АкЧ Аха Ако Ак бек бій Бек Ро АКа АКЯ ак АТа їво їВ85 КО бек біт беж Аку сій Яек бій: Сув 195 га «Війх 5 «В1ї» 630 «-212» ДНК. «2132 штучна послідовність «Вей «3» послідовність нуклеїнової мислоти їв лідвра - М-Ссохе в НА Тад «кВ0бз 5 асоцасосча сссаодасьосг доосессозсяч чЧесассзсса савозчуасчса сауєчасаюо
БО І часосстаса авчавсссояч сассСассзра чавесозсєча ЯдсЕссосдсс сачечассес їі врЕССССКссЯ ЄЧсчаоддасов Яегодасесс чесаосусее сосбасацазча дассстадах ї9о задссссзане ассдсаассов гсассвсвса дососуєсззс азассасссе зтассоЗаче ва чацзссчасза ссссссссає ссозасовдоя аосаєсссуа аачасоссяс садосозвчає зо сетачвазчечє сссасобова сассаасаєяч дасосозаачв бссЯасевЯсе дссабачекс. зво сасаєсессє шсссцасове содссосова ассчесчетоз аа'зсссечс чвессссуче щи чЕЧЕаЧвіса дазсосвесое бБоссотасвца ссососсваса ссостатосї задсвесоку «во сссчачасна оссабудосоц сацасуаучс адаадсссся уаачаадаасо ссосацесоє вай зчасудсоза зчассссадад сессадуєча ааазчасоссо здадсесосча чачосадєою ап пастесосасч асогесспай сгвсзчеосза 53 «єевідз Є «»1ї2з 908 «2125 білок «213» штучна песлідовність «и» «23» аміносокиснотна послідовність їЧЕ пілера - М-Сука з НА Тай «дб» в
Мес Двр Тер ТНу Тер Ї118 Шей бе печ уаі Ата Аїа Аїа Тс Аг уаї 1 5 То 15
Ні Вех дер 112 Дер Ро Тук пуп бій Рпе біу Аза ТВх Уаї сії цей 20 5 зо
Тез беж Рпе їв) ро беж АвроБбБе Ре ро бех Уві Аке АвроПпем ем 35 40 45
Авротиж Аїа Бек Аїа Бей Тук ка пій діа ви Січ бдем орто сій Ніз ей
Сув бЗехт рко нів нів ТВх Аза їей Ака біт Аїа сте сей був Тюросгу
Бах а тв ва піц без Меє ТК їй Аза Таке тТкроуаї піу БЕК Дав пе сі) АБ РЕ 5 зо 5
А1а век дхд двроїво уаї уві Бей Тук уаї двпотйх деп мес Фу пей 100 105 ЖЖ лув ті дкч сів Бей без ТЕр Бе Нів Же бек Сув Тен Тих Ре сту т15 ї20 125
Аказ сій ТНК Уаї без бій Тукогеа Уві Бек Бе Я1у Узі Ткр їі Агу ї30 35 140
Тк вхо Ро Аіа тТук Ака Рхо ро Ави А1іа Рхо Ії6 цез беє ТЕ Гей 145 150 155 Іво
Бгто бій Тах тп Маї Чаї Атоа дка ба піу ха бек рКо Аха Аз дкЗ 165 ї7О 175
ТЕ ра Бек ркто Аку Аа Ахоа Агу век о Зіп Бах Рго дкУ Акоа АкУ Ага ї8о ше т50 бек сів беж Аа Зі Бек біп Сув Тук рко Тук Авроуаї вко Авротух 185 оо 205 їв «10» 7 «ії» 18 «їй» білок «813з штузна послідовність «ший «2235 ЇЧЕ лідерна смінокислотна послідовність «ап» 7
Мебс АБр оТкр тк Тжротів Бей ББе гей уа1ї Аіа Аїз Ата Тр вкч Уві ї ї 10 15
Ніє бек «10 В «ВЕР» З «гій» білою «віз» штучна послідовність «ух «223» амінокислотна послідовність НАсміки «вдо 8
Тух хо Тут Ар Маї Рхо Ав Тух АіЗ
Її 5 «ай» З «В1їз: 517 «їй дик «213 штучна послідовність «вв» «23» штучна (ПНвВеЕ-А) «ап» 8 чаабсезсса ссзсачаєкаЯа часевеачаєє ссзбсосваз Єсуєстассує басвсзуцея во свсссоааада чессаЗзеессо зазассгадча аазазцсасач дпсассвасої чазоезкесое 120 аабсесстссоо усе ссс вдассаєсач ссудассося осстосзЗсчо азассссзає іїво айбсстчась Чачассксвй сссвассава чассассоас сизсвоастай ссагаєочзча аа чЕсЯдафцекЕ бедууассачя ассзаєссссс сессазсадеч зчасессода соцоатересо 00 сачасрсазчу чоавессозас савсачеочаче ассассссас ссссорчсвач сассазсача 3659 сачрссодчас чссвуссває сссвавсьса сбсасссесгас чадасачеса сесссвоЧчее що вавчсачча васусачаєс свссачсча засаасасаз ссстсссасса чассосссаз 280. дасоссоуаа счсасочасс чсасесосся чдесочачаса добесксбуя сассасбзає 540 пебцдсассла арарсуєссвое ссасСассвЯє ссзаєстсока стезчзассяч звчаєсссеса оо ассдаасозад чсадаєачаз чсчовасаву чазваєаєсв ссусазааеє собоззасою сЕЧессеасос суусаузсвоаЗ меЕбсрЕвБсБу седаєссяста ЄсосечЧасаає бессрачсюв тео пссцасачес засчовосач сосздасксс сседоусозса зсосссабавя сосзачасая та аазссстсзаа ссссвасосое сзассвіссю ссяасаауее Зссссосває обасесадає наб
Касвоавсяча сасасссуса асучессакс асевосотУє сезсесвасє декукЧчееку ашерсссас счдсасьосі сзассаєсво часасуєвас сазсссасос сеєдаєтесь
Зб чччессасса ссасаєссас аззассссас зазчасссася стассесрас ссаччоачаас 1020 авасасзЕвсс сазбсасаєсва ссосвсвана сссзосчака зазаєсцчсас арасаєссяе 1080 ассоссвасо ссебооаєс сзссавоавас сезбеаччанс ЗассвачеУє чазчессса 1140
Еадасечадес Сосбодсяаее зсбсассова садесСеовац дассдацчево басоабекщо 1369 ствссосдбса єЕСстачасдчав очедагсастов зачессазос Бодгарсссавиє сесчесесса 17360 сесабссссс гостеассває сеєобЕКсУЄ ссобоооєсс асаєсєєдаєа асссзчах 1317 «вій» 10 к211ї5 431. «Вій» білою «213з штучна послідовність «8205 «823» штучна ЗПШНВЕ-А) «ВІ» То
Меє Аврв ото Так о Тхр Т1е Пеб вве Бей ту АТ Аза Аїв Тих Аха Уа ї 5 10 І5
Нів Бек піу сіу Ткр бек бек Бу Руо Ака був біу Мей Ту тиж Ав 5 30
Бец беж Ууаї Ркго Авп оРко рей Зі РНе Ре срко Авр о Ні б1ій Печ Авр з ру! «5 ро Аїіа Бе сіу діа Авип бет дви АБ ро Двр о Тер Авр оре дв РКО
БО 55 бо ї1їе Був Авр Ні Тур Бгто авіа Аїа Аве) бЗіп Мах Зіу Уві зіу Аза ре 65 7 75 во сі Рко біу ев Таро Рхо РБко Нів біу сту Т1« цем с1іу ТюкБ бек Рхо
ВЗ я З5 бів Аза сіп б1іу г1іе пей Тахо ТНх уаі бек ТВ їзє ро Бко Вхо Аза 100 105 116
Бех ТОІх зяв Ака Сіп бек бі Ак біп рко Тахо Рко Те Зах ро БЕо її 120 5 пез АжхЯ Авр Бех НівБ РО ЧІП Аїа Ата Зіу Ахя Пув Ат Аку Зек Меє 130 ї35 120 біп о Тхр о вап обеїс ТВ АТа Бпе Нів бій Аїа Пес 010 Авр ро АкУ Уа 145 750 155 150
Ага щіу це Тух Рре Рто АїТа біу пі1у Бек о Зекх Бех БІіу Ту Уаї Аво 165 ї76 175
Рхо Діа рРго деп Іїе діа бек Ні Ії Бек Бех Ії бек Аїз дка ТЕ
Іво а 155 сСіу дер РКО чаї Тих Ав АкчЧч Зі ду пу Атч Ажо век Меє сві Авоп 195 20о 208
Іїє ту Бек б1у Рре пен піу Рго ей цей Маї без Бій Азїа йіу вп 210 215 вий вне пей іо їТнЕ Аку її ец Тс Т1іє БРго бів Бех Пец Авр о бек ТЕ 225 239 235 240
Тув о Тву Беж БемоАви ва Пец сіу ту Беж Рго Уві Су Шей зу сій аво рих
Ав бе сій бек РЕО Тк о Бет Авпонів ВВЕ РКО Тк бЗеб Су ро го 250 255 ТО
Ії Сув рко Біу Тухк Аа Тк» Меб Суав Пец АДкрЯа Аж Ре їіє ї1е Ре а 289. 295
Тем БНе т11е бе Печ їм Сув Бей Тіе ББе жд без Уаї Пбей йей Ар зав 295 зо
Тук сін біу Мес Ппейп Бго Уді Сув Рхб Пец Ті Ро Зіу бек ТнНкЕ ТЕ 305 за Злив зво
ТпхобЗех Тк біу рРео Сув був Тх Сув Тік ТВкК о Бко Аза біп ЗКУ дБ 355. 330 335
Бек Меє Рраоржо беж Сув Сув Суш Тр оПув рхОо Те Аевр о а1іу Ави Суб 340 зах 350
Твх Суюш тіе РКО Т16 Рез Бек Бех Ткр АтТа Ве Аза був Тух цей Тер за5 зва зав
Сіш тур Аїа Бек о уаї Ак рце беж Ттр Сей Зеж печу пез Уаї Рко рве 370 375 380
Маї біп Тжр Ре Уа)! З1іУ Пей Зер рко Тахо Уаї Тгроїви бек Аза тТіе з за 395 ств! тТтр Ме: Меб Тур Тух Тхр сі Рко ек пей Тух бех їїе Чаї бек рко 05 з10 а15 гне її рхо пев цей орто 116 Ре Рре Суб реч тер Уаї Тук 16 «90 425 30 «210» 11 «211» 1319 «гій» ДЕК «213» штучна послідовність «220 «Вй3з» шжучна (Шива с) «005 ТЕ чазесусса ссасучассч часабочакс ссочееєксвач боечососечє васссасУєа сасезазудеа уасезесакс азвассптаув сазчувасач дсвсставсят чаасесцосе аа зайсстстцч забссЕсвес счассассву сбдааатессе сскссччсоас баасвсбаве їВо ваєссачасс дЧдоцастссва сссосзаєаза чассвосочс сзавоасава бсавцкоде зай чесаччачевс ссоЗассачу сестасассос сстсаєззся чассочоссзоЗз асазсссссе зо саччстсачя чддассссоас сасауєссоса доасссосаєс ссссобасавяу бассвасаєчу 360 сазссачацаєс чссадосаас сссеабвьсь севсоссбоа дуддасаєьса сссбсвазео «о ачаччсачза зосозачааз сасоасаасаз засадсасса ссєсосаєса зЗадсаєстаєвоа 80 засссассчев гочсчазчаасс зрассстеса чесддачаса асссстстоз засозсчаас вій вссчссоссвяа саасвассес сосваєсває бсзакксоссє сбсззЗасаче ачасссечес вБОо0 ссевзассоза чсачазазач содсссався чЧааачсасса сассстачесс сссудчаєса о штассучрас сосаччсачяч ссбеКебсса сбдасєсеачав Соссчасаає Сеспссачеоєс 720 ссзчасвазсс часодассва сссозааєсьо ссдзчсддся ссоскассва сссаддчаєсва 7 васссвсаца чіссвасасо авзассасади сссастсссо чесессосває сечзесссЧас ао сассустада Естесстоса асозессаєс звсссокає бтасссвоаєь чдетесдаеово зай вкстеустеас качевостосе додвссассво зоваасуєссос сечессоссос собдесуєсв з60 соччасесста стассацбас соезчасесскеає аадвсисзчса ссабкссачеє ссададчасс 1059 гесасовксо совбсвреасга сЕЧезссвав сптоачечасоа чЧазагсдтас всзасасрсоса таво ахссосачеє сссчаФчесс счсасчавсє сезбдачаое дудесазчевє дедервесса 1140 теадссдадчес вассдчесуєс сессозбосва пессссоссо чесозссвос пасозсбосо 1200 скедачечеса Соссодасчає чсазсаосод зочессачос себасдавсає сесоастасса 1250 рессгаасеає Едсрассавв ссбстсстас ссасодасеє асасеісєзаєса ачезассас іїі318 «410» 18 -21їз азу «312» білок «13» штучна послідовність «ЙО» «233» штучна (БНВа-с) «ап» 18
Меб двр тер тк Тер о Ії6 Пер РП цей чаї діа дів Аза Тож зго хуаї 1 5 13 15 нів Бех сіу сіу Тр Зеїх зе Пув рого дач бін біу Меб Ту так дев
Бе) 25 30 їєюв бек Уві Бо Авй Бко Пе йпіу Бпе Рре Рго Дво Нів пір ей Ав 35 40 45 го Аїа Ре БіУу Ала Ав бех АБ Ав орко Авроїхр Авр Ре Авп орга 50 5Б БО
Авт оБув Авр БКів Тур Ро ЗРч Аза Авпобій Уді б1у Аза сту Аїа Ре о 75 ва сіу Рко сіу Бпе ТВж Рто Ро Нів Сіу біу Гез пем б1іу Ттгр бек рго в; за 95 стіп Атчїа сій Зіу 18 їв оТвЕ Тит уаї Рко дів АТа ро рхо Рко дів 135 105 10
Звк тиж Ав дкч сів Зех 1Уу Ака бів ру ТЕ оржо їі с Зек РКО ро 155 То 125
Без Ака АвровВег Нів рРко б5іп Азїа Акчобіу Ага Пув Ака Аха беж Мебс їзЗо ї35 148
ЗіпоткроАво бах Те Тит Ре Нів біп Аза пебз пев Аврорго Аха Уві 145 150 155 160
Аха йпіу бе» тТук Ре рхо Аза сіу біу бек бек бет плу ТВжх Уаї Ав ла 7 175
ВБко Уаі Рко Таж ТпЕ Аіз век то Іїє бек бек її Рпе бек Ака ТЕ 180 185 90 сСіу Анр вхо Аа Рко Ав Ах у Ака Пує АкУ Аго бек Меб біс Бех 195 20 ов
ТВх Таж Вес біу Ре Пез піу Бо Пе без уаї еп бів іа біу Ре 219 215 220
Не цей Гей Тв Ака ї1іеє пев Так їі Бко Зіп Бек їв Авродеж Тер 3 235 240 жЖтв ТЕ БЕК Без Ав ває Пео бсіу зіу діа Рхо Сх Сув орко зву же 845 250 ев
Авп беж біп бех Ріо ТйПг Бек Ав нів бех Ріо Тих Бек Сув РКО Рг 260 265 27 тїе Суав РКО спіу Тук АК Тр Мей Сув бецп АкЯ Аа Рце І18 ї18 ває 75 280 5
Гей РБе І1е ем опе) ей о Сув цеш 1іе Бпе цеп цею Уві беч Пец Авр 250 255 300
Тух сіл біу Мек Пец бро Уві Сув ро Гей цей рхо ту Те бек Тих 305 ЗО ЗІ5 385 тис овет Тих аТу Рко Сув дув Так Сув ТБ ї16е РтОо Аїа біп Ту ТП а ЗО 335 бек Ме Бе Бо Бех Сув Суш Сув ТВх Пує Ро Беж Авр бІу АвпосСув 340 345 35
Тнт Сув Ії Рхо І1є Рго Бек Бек Тхр Аіа Ріє Аіа Ака Ре пец Тор з ЗЕ з8 піз Тхр Аїа Бех Узі Акч Ре бБех Тхр Пево беж ем пев чаї рко ве ато 375 380 уаї зта Ткр РБе уаї сіу бе» бек РЕО ТНр оУаї Тхр пемй бек Уа) те 385 390 335 203
Ткр Мес Мебс Хр Тук Тхр шіу рРко бек Бей Тук Ав її без бек рко 405 І 415 вве Гей Ро Без Бем Бко І1е рРБе Ре Сує Пес ТЕроуУаі Тухк Т1е че аз 430 «вх 15 «віїх 753 «вій дик «-213з5 штучна послідовність. ев «223» щтучна (їБИВвВ-ді «а їз чЗаасссассоа Ссабодаєсу часеєцаасе сбЯсссскуч СечсвасоЯє Басасузуєя бо сассссоваа всвссасасбс боасаєсссся здчасобссас сзасоссоса ччссодавсс таб
СеЕКссостова сазооваєссс зассассосс сазссассяа асачевоавтя Засаєссссу їн аасстсстда чедодачесо соассбассра дувсадзасео ссеазадесс сасссссває 240 сасесгссва ссвассуоссе сествтсеце ссзаоачебасс сетозчаєсаєя ссбрасозацча. зо сЕсвгсаєве єссецЕссає сосбаседеву счсосчавссює вкссастаЯЕ чесбчевозчас
Зо паїсваччаса Єдегассває сечессаєву абвроссоздеа зсассасзає ссосгасссцде ад сесечбазоз саєдевссаєс асогоасосач допавсазцсвя Сас ссавс всчстасеює во авпсавассося ссавсссава счЧкасавцс зсрсссавссс ссазсбесста сасесссоозою за зачевсесас чачачеЕсачс азЧчсчичедча сссеасцєс поазчессасу сасаЧсоссои апо чессачссяї СжогчЧачсесї чадсоссаасе сбссочеовае содссаєсва часова
БО баскоауаччс ссадесссуєа сссассує Ссассаєсса сСесосовцеє уссявессЕе 789 вссвассбаЕ чачестасає сєсакаассо ода 7ва: «-210з ій «Вії» 43 слів Білок «813» штузна послідовність «Ов «833з штучна («БНВЕ-А) к«цОбз ї4
Мак АвротТЕр Тк ТЕр ї1іє ей Ріпа Пем Уаї Аза діа Акта Тв Ака Уві
КЗ 5 То. 15
Ніє Беж сій; Два ГТіе ТНК Бек БіУу Ре цей Біу рхб пез Бей Узі Гей 20 2 Зо бів Аза сіу Бе Ріе їем Бей Тв о Аку Ті Пей ТНх ї1іе Рко бів ех 35 БВ 5
Бей АвроБет Ткр оТтр ТВу бек їй Ави Бе цец біу біу Бек Рго Уай б
Сув ев біу біп Аво бек біп Бак ро Так Бек Авп Нів бек рко Твк
БЕ 70 8 о бвт був рЕз рко тів Сув рхко сіу Тух Аа Ткр о Меє Су цеч Ака Аху це 9ва ав
Ре І1їе 118 Ре Гей Ріє Ї16 Цей пев йеш Су Пем І1е вБбе Пец деч 100 105 тко
Чаї ем їец Аар о Тук біп З1у Меб пец РКО Маіїі Сув Рус рец Тіє Рко 115 185. і55 сіу Бех їх Трк ТВ бех Так біу рхо Сув Пув Тр Сув ТВх о тТЬХ го 139 135 149
Аіїя бів обіу Ав обеж Ме Бе рРко Зек оСув Сув Сув ТВкК був вро ТЕ 145 1560 т55 ї60
Авросіу Авті Сув ТВЕ Су тіє рРЕо їі рто чек Беж Тур АТа рре Аза 1655 173 175
Був Тук цей Тур біз Ткр Аза Зех уаї йка Рпе бек Тгр Без бек Бей 180 ї55 1850 іти уві рко Ре Чаї біп ЖТкроБпе Уаї біу ем бек рко Тк Таз тер 155 200: 05 їец Бек Аіїа 112 тЕр о Мес Ме тТЕр тут ткр біу Руо Бек цею тук яех жо; 5 ай
Іїе Чаї веб во рРПе ТІ Рус їецй рей вкКо ї11е РМне ве Сув Цей Ткр аа 23) 35 кс нв) чаї тую її «війю 15. «Тіз ла «12з ДНК «-йї32 жтучна послідовність «8305 «223з штучна (Б5НВв-С) «ОО» 5 чавсвсзсеса ссассочаєта часассозчассе ссассссбад соедссоссяєс васасовасо
ЗО. савссговав зсасавсосбе бзассссосУ сасоссскас сзсіоссося асо 129 вЕсссостда сасоеваєссс зассасссса сасссассзч асадесозся чассачеста ї8О зассссспач чдоечазасосс басаєцссса зайсачаасс стсзадачессо сасебсосавах 240 сасссксста совастУссс сосстзеовоє сосаозссавсв чабавакчке себусоецченаа: зо гесаєсабвте гсссчЯкстає сссосвсобва Едссвцаєвє сессассддб десгстодає зво табссвасодая вЧесоасосаб стдсссвссє ссассаддав ссосвассас азасасадає «й шсусагавза себосассве бсссзсвсас сазаєссачка абЕессве акзсвастсас ее асазавассає січаєсчааав ссзсасссає асоссваєсс ссеазчососта часов ваяесє
Ззаа ачасероесоє ЗзодвазсаЧас саЧвавасяас сесесосочео сагбобеєдев часасессса ой зчиссазчсячє євассдаесі чадсессаса чсзсдасвЯє созєсаєста чЧаєвзаєооу вва гассодоачеє стаєссваса бавбаєссске ссвссаєвво єдосассаєт уоовзавсьве 720 сскЕкоссває задсстасає стзврезаса чосає 55 «різ 18: «2112: 24 «пїійз білок «13» штучна посСліудовнасть «ох «23» штучна Ії5НвВвВ-с) «03» 16
Меє Ав Тер ТК тр тів Бей РБе Беч уаї АтБа Атїа Авіа Тр ка Уві і 5 ЗО 15
Нів бек сіро бек ТП Тв бек Сіу Рпе пам ту Рко цец пей Уві ей 2 5 30 сій Аїа зіу вВце РНе Тез без жМЕ Ата ї1іе їй тик тів ро бЗ1іб0 ек
Суд: зай ах їжу йБр бек то Ттр ТПЕ бех Бей дво Ре цен бі 01У Аза Бко ТЕ бо
Су о Бжо З1іу бій Ава бек біп Зех Рго тп чЗек Авип Нів бек Рко сте ав то 75 о бо бех Сув Ро Ро Тіе Суб Рко сту Тух Ага ТюЕр Меб Су рей Ажхе Аго 85 9 35
Ре тіє І16 Рре цей РНе ті Бей Пец оце); Суб рей І16 РБе цей цей 102 ОБ 310
УЗ Пе без АвБроТтТУхХ сів о біу Меб їз Рг Уаї Сув Ро Бей Бевз вКо і5 120 125
Зіу Так бек Тих Тих бек ТВу йіу ко Сув бу ТЬБкЕ Суд ТНК їТ18е рРго 1390 У35 110
Аіїа Зіпв сбіу Тйк оЗек Мес Бре рРко Бек Сув Сув Сув Ток Пув РКО Бех ії45 150 155 140
Аве З1у Аа був Тих Суб ті ро їїе рРко беж беж Ткр Аза Рпе АїТа 155 170 175 дІЗ Рпе Гев Ткросілї Тер ліва Бех Уаї Акч ВБе Бех тТкр лец Бек Без 180 185 130
Бпецп уаї ржо вре уаї 105 Ткр орпе ві сіу Пец бек ржОо ТтТпЕ Уаї Тер 155 зва 258 їеш Беж Уві Тіє Ткр Мес Мес Тер о Ттукх Тжтр біу вжо Бех бев ТУую КАвип 210 215 220 тїфа рей бек рко РвБе Пец ре ей бе) ро Тїе ВБПе рве Сув цеп Тер 285 30 235 2АВ чУуаї Бук тів «В810з 17 «аїїз ЗБАВ «2ї2з ДНК «З» штучна послідовнуєть ей «айїж штучна (рахівОпї нерв - МСоже) «а» 17 часєсессос засосассоз ссазасасає зсзссзасає бааєсаєсов севоеєскаєра 0 агассваєсв актасудвочє сасбасвеса сачессаєав вгоуачекоє чоЗсеіасвев 129 асегсасостїа забодосссас орозсстозос дессвасчас сессусссає счаогфссває 18 засчасттає зскЕсссабач Єзассесавк ачузасесЕс сассцасаво засада 244 сЕВсЕєвсою сазасьзсос асебчадеває асаксадаєа бабсасасчє савабасусс 00 сссбасточас ЧЕсзасзасоа чсвялакоаЧчос суєсгадсає сакцессаде асзсовосее 360 ассоазаєсісє сссасссозе ачсасаєсса сесасрадчіс абсечссвсса ссабадбоаа 42а чсчассЕсаа саасасакєсв абасчсЯсдеа асвосачеЕ часссавасчая чарссссвац 880 ксЕссасессесо асечасцеса абскючачсвк ЗЕ цеЯсає сдадарсаве суааеесесс за завасяєсчє заозассссо сососассзас ссазасояас зусачаска басачсоеа
Боа засставраса зусачачсьо стачстаас беазазавссо ассчексСасє чзскевесяа 60 австазсасу всеосастаса чачазвосса воассжастазч сзссосвавек Саваетеоаце тав ассчачекся закссяссвс часчучассза зсосадассс суєсссвчЯає аасочссеуєе 7во засазацеєче асачоечасає осчасосстас вааазавсЕсу дочерасоч заавссаскя ве заспссебос ссачочассЕ српессобсс зецоеЧадасс сассодчаєас суссадеоцюс вав седеасачеч вочсосточа авадесссовЯ свосчсачос сесвссвсво аздсссбаса зво свзадцдесаєсь жссоасвчача суазассуЗаєу вссссчоса сстазЗЕсЗч вачезвасока пазо чаззассссяч ссвоассзззча ссточочасо состатуєча асассавсає чочесссдаве їо80 агссоцсаас ЄчЧчосасчасе ссасассоссс касебувссе ссочдесзаче азссобаєсо чаасасстза собссссоца оса зЧабс здайсоссос сбзостасвя вссососває 126 чесессеассе сазесазсосе дессуачаса ассчсЧаєсе дсвадасаааа сауазавессо
Та ачвачвачаа сесосаздесс сазасладсач ачасстсача десссвчдся Зачавчасоо 1379 сасвассосч азчацчессачва сбашссссас часаБассся асгасассга звсссчачесе їз8о0 ачаччдесся ссбаавссоя оСазЕсаЯсос Бсзчастоаєує сБесбадсвуа ссачесаєсе ї455 часах ссссососає зессссеєсе ассссдоаваая зЗсассвеєст басгассесе
БОЮ
Єсстдагбаваа агозодаває счсаєсясає саебсєдвазчса заєзвсаєссе сасесвачад ї5БО чесоччучечя часвадасає саазестачаз чассоЗаавч асавсадесва ззаєзссочо 1620 засоссачсоог зсбссасзас сбсбассдоч сазобсссабо засадсавас дзассдааає їі6850 гоассацосоч чзчдсдсосстос зЗзусзазчссо чдавадесссу саззуєсазає боздасбеачесе ї745 жЕсксзссасс вазЗзвоссча сзадочсвзач завсовачесс сзассвачач асазавечат
ЕВОО чабсаЯасссся сасевзекова саазаєоадає Соесавсчсасу ббосеозусе чесроавзаУУ ї85О0 зачазассвЕЄ судскавсуає Сосусасває зуасвассооя сбасссвчакє десутезрає 1520 жссучстаєс ачсчсовучая сасосяааеео вБеЕсБетсва чассувесвя сосоезсоюоє тзай їчЧавзкчаасі дсвачасзаа ссеазсасЗає бассчечася чдассаосвеу паса есее 2849 зсорачосає чсоссдасаєс чссасгацаЗз соучааслозча ссочевнсса сбозасава 2190 геассозЗаса зчассесекЯ єсасєсссаєс ЕСЯсвсобус совзцаваява Єссаксасод 82150 сеЗзаєдсзає создсячека сазбасцєсва агссодстас свусссаєво дассассаваз аа0 сцЧазватсаєтсз сагочачсоа зтсасзаєкс счасачавсо сазссЕкчсо чассвачася 2289 акосдчасза ададсвссяз чадсесосдс садссудасє чеєсодосача ссбзацасда 2340 чсасдссодча содсддачає сесоєбсасда сссасоддсов соссЕочоссяа ссдчавсаєса -499 сУучсозЗасааа Созссессее сосозчаєсса ссЗассосча ссадсосузчає чсосачасе гав черассасоза сасачсасеа чесзсссчва всасєЕчоєса здачессцазо чзасзазвеЗеч 2529 скудесясве ссгсотассо сасоЗзсассе ссдсксоссва сЕсчсацесдое зесасссосс а50 аксоасесксс совозачево сессезаєса сСсаасуєесаз саассвоста абасочваєє 25)
ЕЕсЕСоввас дсасебасос чзасарсссас асезсаєсаса засадсасесв сесозучава 2700 кугчсчсоада асесосаск Усвассвкс сбааасасає ссзаакасоає аєссусєсає тео лачасвасаа сссссасаавз сасєссваса агазсасзєя ссзаваєсссо асессеаасе 2820 сававучасс сазаєдааца ссссссседча Євабстсаєя вассававеос сЕєзаєсді зи 28850 чБЕЄссеТЕс сассчачече садасссече аззазазаєс взхастчаєеове стсЗадаєсес 2549
Ессе сесу соасоасаасоє ЗсЕчсЕбасЯ засаваанав севссчсосво садочка зо
Ессе цосЯа чабовазазес бвассазесесЕ ЕСЕ сСсзват чказсччеЕ бсачсачаче зво чсачасассвя загассзсес кІссасЕУва зесоабачева зусововась гбзачавосе
ЗО
Сасвчсасся ссбасавасс ссзсссрасс авісстеаєта осяусачосо стдпсвусоа 3180 счасазвчсеос соссосссзост ячЗзекучассо вачасзчасау рассачаста ачасасваєсу 240 поссадоастіса зоссдоасачаво счрссасаса чоссачстса чадезавасоча сосбасассда засво встоачаєве сбасаєозеа ачссасцача аазсзесаса ссеЕсссЧава чдавоававеще 3360 здчасазисає ссечченачса чссазучесоя васаччасас сусасєцаччя ачесессвоу 3425 чачавасуссо созвасскееЕ асаєисосоє сачувесодо сассуседаєс соувааєснесЯ за астсевуєса сочсссабсяо дудаосзозає сстасачава засчссачса асасядсебе 3540
ЕЕрасодчссє СедечессЕв чсссостсє сосссвсаєо сее зах «ніж ІВ «Ві» айва «12 ДНК «дії» штучна послідовнуієть «ай» «вел» штучна (рохіног Нера роьнвв-А) «ПО» 18 часкстеЕсос часогасчач ссазчаєаєас ясасечасає єзаНєбаєсяа ссгазссвЕва 60 асачсависа асгасоачезче сассвнаскса гачессактає асзцдачссео чезессасата 129 асЕєасочса аасСадсссає ссозсічасо зсссвасчаєс собсчессає Гчасуєсаве ї8о аасчасоабває чебсссастнуа Сазсуссває аусдзасевсс саєскдаєсоаєс засаачсада 245 сктасгтасяаєч сазастчуссе асттозсвас ясассвачсо гассвасасачс саячрасусес зо сестасєзчас досвасчаса чсавасчасс сассврдЗсає сасасссачі асаєзаєссьс зей асозоавссЕс сосасттачс адсасаєстса сабабсвчєс ассодссасса совбозеях ава чсччсЕсваза базбасаєса абцазчсзсоаз абадсзчесе здасксасоясу засосссвах зво
Ккерссассос аєтовосясся абсочазсосв ассстодсас сааааєсаво дачасевесс зай завасассяс азсвасьсся ссоссвссцяас дсзаасодаєс осчсасусася сасодсоцдеа 00 заєссасаса ачсачацосе ЕсСЕсоссаає Бачачаассос асбзсввасьі счессаксда 6650 зассвасася асгсаосаєв содчачассса ачстачсетач сабессадась СаачсесоЧе 78 асслпазекся Забсодесас сасозчаєссод вессадчаєкс собсссвуце сассодесасе 789 зпасацесас акссачодчеч сксуссссса даасссзаза адчасароаду сассавсеєу вай ачсчечссса зксссссозце чесевессса дассассвзс гучассесоао векочасаса зб зассссааса акссоуасєу чаасскодас осзассазач ассастчасо азсачеваао зей тавчссдчва єсодазчетЕ соуасовода седассосеос срсасадечя часесвоауе 1050 базчсоссостс асозсесачач сассоссдасс асвасовося стассссасс ссстдсавазче їо8о ассаасвуде взасссочасч ссавуєсавсс созасовсас сассососося взаасвоасосво 1140 ссрсачасса уаздосауєсва «соачачассь асчсазсоча арачсасаєче ссессатсва 1280 чЧчасстасазя ассоссодасоаї зсадедчасто вассссесвз ссзчзаоацдова сЕссосовуЄ 1260 асечесавсс сьзсассяаза баєсоассесо сасаєсачєсє савсєсобає бозаассуцда 1320 часоссчсча ссзасоаучеа садзазчача сасазсасаз зудзасаєсае сссаачассо 1380 стодчассвсес кчссачьсос чдсаччсазас тсссесгоас суаєссвсає себсчасавеє т4«о соксавзвсаєс сччасвескч Ясзоассаве ссявасеесос сососчзевУу ссосясясос
ЕЗОО ссрзчддчасаца асссесаЗач ссобассесоа авссакессо саасазеавсЯа сесусесчаєс
Е5БО счсесаччсс асСсечаєчаво жочсосасов счасесаєса Ск соскУЄЄ СасесочевоУ ї852О 6б сЕЧчеЯсосбуа Ессе Зусоссасва дастаєсяачя чсасдобосс васекчессс 15850 ссчейссско засоасрас сасаєстаса завассоскусба зоасскоасво басссобусе 1740 саччччааса ссасчсеЕссс ассатоаогаї сусасвавас ссастчаєча авзастасаса
Іво тасасссосса бессбачесеес ссчочсеВесо чосавуєаєс скачав я дасавсеока
І850 зачЕЕсЕсСаЄ дастнасюсє чегодуаосс кбезресаче очесСкосчоч ассцачесое т980 ассасссосо соссососсаб ссадаєзчаєя гоубасбоуц сасосацесє зравесавье 19580 чеаЕстосає бсаєсососс зсгассвасс ссоєсєсЯвс госазасоса сабстчаєва 2045 сгсцчацісса чазчазоссЯє ссваассово бавесадесе сзастеабоасо Сесбадевае
Ал сачссаєсссу ЄБоссесюосс ссососссоаєа сесссссеча сссбодвасю копсассосо 2169 ассчЕссЕсс сосвзаєзаав Єдвазчавасє чсвссусасе честчачесач с раксассоє 288 аксссочзача ясчацасаче зсадеасаяс вазодочачасу асбоддавов сазезусаче 2880 сасчссодаа абдезаєсося ссссасоасв Єссастосчає зас Басця асачсваася 2350 зассдуваєсс зссазссоду суссссскеа чбавачбгоЯ Заачссскчс завасааасе 200 зак ачекЕЕ обсассуссв азчасеєває чеасссачовяу збсвадсетео дашозацзаора зава свозазєдває агсзссєсос аєдассдвас аязакадаєс дсзсдсачяє Бобосочесв 25БІО сСЕєцачсода зчазчассасес вдаставдаєє сдоадсоасааса часвавсоячс гдобстрозеу 2580 сссосабЯєв сездусечеса чдсясадчасоє дессуУєкос єЕссуєссааа аосзчасовое 2549 ссузсзсссс чаасозасса сазчасанод свасачсзасє асечсчасву досасдаєсад 2790 чек сессо сосачссява сесзасЯасвЯа ссассовадс дачавудчас гсУдесБассає 2760 гаддсзваче чосочцеачсвач дассоссвсюЕ саєсьсаєсть басесссуєсс дазчавдавває 2820 ссаєсаєаце 5засосазія сецчсечосоус абасосства ссозастасс Соссовстов з28во ассасосвачсе узааовссяс агсдвосуву сапабастсу загодавуєе чок са ча вісаччасзча сссозассва зассвсосеачя зЗасссасчусс взесавнвасса гео ссвамче 3985
Ксаваччочач свзсассоЗас часчачаєс ссчссзечас соведчечає честасесаю 3060 счавасаєссає счсчозазає аасечекЕсс сгочаєсссає счассчраас содссозасу з120 счдозоасся ссасозоачас асачезссяч сквсобусада сассассзва дадеерозея зІво чечаасоаас буассесьвес сбсабасЕЕс асоудсассою састоєсочає беусадеорва зай гсчссосека сещестсске часчачевссе сечаавкає свасастісас азбвосстаа 3300
ЄасадзвавеЕв бвбосссваса сассвоєдся Збассесаса ссосабєасаз здедосаєсве 335 гсчччузавс дспсосочав сессесакссу ЄсСсзЕЕсосс сСавасасвивб сазасСаєчеа заго
Ессастсатч ачасазсвас ссочасадає чеБЕсвзасаа бедчевсасас гаававевесях
Заяо ск саасес зЗазаччабсся здасовадає секхессдає заєсссзсаа севаваєеся 3540 врвасссово соч вос асоідацчезіс ачасоссяаса чзазаачаєся ваеачавЕсЕое заоо сЕдацаєсссє СЕС свас зсобаввсосзя стостсасваа зсавайаааас сассасвасе за00 ачедасозчес соасссцчосаз збсвачаєесс ассавссосе ссбесовача бадесСоюсєе 3790 сачсвадоасяа саЗасассав асаскосесь сссзУсчсач сечсазскад дивасевеюе зво савчазогсої чзсазасвсесус стасасассє сусесіясба абссечесас сзабачекас зва сЧссзоасцЯдо часавачсссЯє чБебрассча зсссосесссз асасчвкаче тассезчасая засо сасусачеча ссаоддесдаа осдоозучео фодсасасво сссзасстсоч адсузасуве зво обасасеодаа соовзаєвасс сасазсодєдча зсевнічЧачая адсзссабує гтессбцазаа або чачайгаччся часвачсаксс сазсаансю саучассуча всазчаздазе чсасзвсюра ово чеЕєЄссасач зчозавсячсох чабассесса пачсостово аозасессосе всссокчасе
Зіка кБаовасуєсоав СЕКЕБОсууВЕ дсссуссвуч зз9досдааче ссакочаява асчссауева 4300 часячссЕь ссеасочессс счачЧОовессвя соч ЧсЕсасасає сс иа «ша» ОО «нії» ашНна «віз НК «21ії3з» штучна ПпОоСслЛідевнІСсті «фай» «223» штучна (рохівоЗ Нере рінвв-сІ «00» ІЗ чассссєсує чаєакасодо ссачасаєсас чдедеєдасає ссаєсаєсса стазбсаєта во збсассваєсса астасзаояає саббвоссса сазсставає абоцазтксс зсассвсаєа 120 асгкасоцтва вааесодеессоас стос уаєс зчессовасзас сссесуєсссає Єдаасовбсав та заєчасаєає ФжЕССсССсСабат баасуссавс ачдачассввс сабсосатяєс азасчЧазс ува ай ссаєссасох Савзаскасос асесдсєевує асаїсзаєьз сабсабаєаєс сававасасес зо сестаєтстсас сгсвассаєз усавасоЧес сдсестечеасє басчсосаче асаєчаєссях
ЗБО акчачасссе сессасєкоаче ачдбасабсса сосассваЧсо ассаЯасбасса ссаєацчеває чевасЕЕсоч саорасаоса зсоззчсесоад акгачсосове дасссасачу сасвсссзач яз ссессассссо зебавозсса асссачачсесс чЕссреадоас саадаєсаво здавав еос ай вазакаєссзї йаасавессосЯа сессавсхтзЗас зчсавакоачас сЯбсаачсзсе басоцедада о жк ссасата зусачазесвс собочесзас Бачаздаасос ассозсссасе сассСтаксзча 56 забсаасаєсч асссастата дадачаєсста вассчоаская собебавасєє базасссаоє 78 асссачокоз дчасесаєтач сосваасасза содзакссес сассабодає годасвсзча таб сЕсБоКЕсс пдоссоссдес дсаасссцсо кзсасрсвча дусасчкса бсазваасска засасуагає дадсассаас созазбасас ссавбссєсс зазасвовБс сосодвссавсс зво аескодаєсс сесеррсоце чстаасуста асаавєссача стдачасьсо васссозака зво ачаассасбса чессочазчся авбсозаасва Зачсазчезас спесчавоса зчоссвасас 7020 соссосксассч оочассзсса даасочссоо сбсзоачссса адачасоссо ассасвчєос 1985 сазсачетос асссоссоса воасассваса чзасазесасод асуссачеса ассессвесе ї140 сгссасессб уаадзаслеє сасосссссвоай сеззадчсва даздосзцзса восабоасвує 1205 чоавасадсає басевсосає саддсассос єпдасссаса сдбусдаууа Стагассевс 12659 сачеодуада сачеєссесс зуазосЗзсца асоссяєосо азсааскцес Бососаавсв
Ехо чиЕссавсвсс оссгсоадаса зддацасосса сеоссвассз зчосвчааза аоадозессва 7380
Сазчзааацеас сСасасссоуч сбосоацає сассустсзє одокасадоса дасевосово 1440 счесдчаєссва аабссокоааса зсссоссазе сссточасасч ЄБодсачаєс адсстовасе ї5пО сосечачеча сасоссвасе бусссаочас адчаасьсеса чачессаваса бсазассата кхБоО чоссссасвссс сЕдбсссота абосесоску зсбассцчсока чабабасева сайсччєсеса 1629 бсавсскссту зесЕассеву стчстесосо кчасвескеЕ дебуцвоссва сбоуаєтаєсо 16450 адочааєчиє дессеусссяас ссесечсвчс сачучасевс гастассачі ассозасеве 17480 чеЕаачзасата сассастісса чессачпоучча собосаеавс ссособобсдо сассосатов ї800 айсостазчеоа соЗаваєссцчу асаєдсавсо саассосова сесекоазасс Сссасасаве 1859
Есесбасоада згдоадссаве чЕдеЯевсЕв сасодсгдая собасбоачсЯ сесебезбео 19850 ачссзссцЕ садоссаєсв ссбасочзЕеає сгесечачеЯє саєссзчаєо асакадвасе ї58о сачазчсссазч собяасакаає збоссавсає сасссссчеє астассдоса вЕссессссе 2049 чЕссзЗкчУуче стасавегуа хаазоччоса сксаазчеста Зачузчоссче ссваавассесде 0 стчассачосе суассЗсасо сссеваєсоє сачссасова безббсзссо сроссссаса 2180 ссекссвсза ссссоцвачя газссасеосо ассЯякеосЕс Ссбзагазаа сувачавасе 2а8о чеассасаєє чЕссчачсач чЄдесасссє ассссочучеа Ччеуасасове чоаозасває тво зазчасачазча ассоздаача Сваєвасазєя сабоуссуаозч абосузеоааа сессаведеє 2380 жскасобччеє чес а асазчодазчоз авсочававе чдосасоесоаза чочессоска чеавазссаз зЗвазсеоссує азаазсаввсоє чаазачевое соодссоса зачавогавЕ 2450 часрювачоза вбсвачевєсоє Чатссаазача свуЗаєсуваз абсасвесас асчасвовас 2529 засаєдзасо усасасааує Єессеуусся ссгаазсода Зазассьвевс зЗассаєдаєсе ччасасзаса Часавссовяс счосссоаса созосесеЯсе соучссоеєса дсасацчецор ее зессдаожев ЕКЕсЯсЄсСаат ассчаєстоає осачедосоє одаасоваєссу садзасчазче 2700 сацдсасоалес ассагоачесое ассасчасоу чечссссіса сосачссобо сроцчасасса зле гсассозаче адаасточас сочосоассає тачасазаді песозчачева чассссосра 820 пакесссаосо соасЕсссасо дадзааззсає ссзбсаєсзчсе ссакчсзаба садсацеваю 280 абзосчсетеяя бсосчастасс гчсссавісвея йосассваче чааасаєсво дсодвУсаао за сасчсвсвсч часочавчсс аччЧЕсСскЧєся зесазввсіся ЄсічЧасоза зпачевеовч 3000 дасвоусосс адссоваєсту сЕсоссвадс ЕСаадосову сабоусеснає досоаудаєо зве ссассуєдає ссасучечає дескосеЕсас совасаєсає дадсадааааЕ чдасецесеве 3120 ссочатсссає счассобсодо саспобсачаса содсадасся сбассаодчає асазсозєосча 3180 сттасссясча тассеасстоза азс ачея чсчзасачас соаассосес стсавбассое зай асоціабсус састоссаяє ссусадозса Ксасовеста Есусетвеве часчаубеесе 3300 тпЕЧавссас свасоссєає австтосстча госачвасте стсостасоа сасссасчео зо чсассксаса ссусатасач чсззсасуЕ гсооадааає чсасоасочаав ссессавста 3зава
ЕстаЕСЕссс сзавсасаєсо сайлабаєаса сесосссаса вдасваєсває ссгрдасваяс заА8О0 ассссдасєла сзоасвоичкУє байавсессав сс свасвс асавачзассо вучечаацчає авБай зиск єсЄчає пассссасда севзаазссоє бсзасесцає ВЕК СЯЕеоС асрзвусяве 3650 ачасоссчса Ззааачаєса вазаясссес седасаєоссє Су ЕсСстує чечкавсста зБО гЕЧоссдеваа асаапзааво сСапрсоєсбсаєсс ваасасвсаЧчее Бабссзесад абссзачацчеє 1750 ассластсво кссссчавоєч Савскозевос садсауачся сачзаєтассяа абзссвсосе з7во ссрачецбач ссасазссас зоссзссассї савдавзсексє чевчеасоце сбасавасеє зо сассесасса зсеорассає сачсзассос сасСовасаче Забава осо свссаз зЗа00 чосеачаєссав ачассвсао с бассозаєва часасачсЯа соозассяаа соадазадеео з чсчсасасаз сессвзсссоч азсзазсчас стасавсосуава осуазчасаос сзсадсуєоа 2029
Ччесагдвава ачсчосасцє сосссзавуз чауазачася авсачававо сус азчеву щово сачччесуча всазоцчачазчс зсасчуасчча асесссадаз чазавсчссї забавосеосв. 140 гашсокакос чзачЕссесдис асосссзасє садассдссвза сЕЕсраєчає чопсоесрачя 3250 заЗасччазеє скасбцчаазаа асоссвоєсвая супсчессввЕ бвасудессс соЧаськека ж-БО сечасосвес зебсасаєеє со зна «вій» 80 «215 ЗБ «йт2з ДЕК «ШІіЗ» штучна послідовність «Ех «23» Штучна («рОхіІвоЯ МНерв венвЕи-А) «400» о частсстссяс часчбассазу ссазчабасаєс чезЗзесчЧасає єцчассаєсоа ссавссакта. во асзчсазрса вісасддцчає састацеєтеса бвЗсосабає зкодацчесво дезчсгасава то астсасазса азсаоссочс сбоаЗссЯваєс ссесаводаєс ососассові счасчссаає хво засдасоесає чЧессссасаа базсоссаас адоазасевесс саєєдчасосс вагодцубада дао ссрасссвсяч банасгасос асстазчсадче асассазасу єассвктасас сазубасуєс 990 сестаєтоаєс чорразтчаса чдбаавсучес сазсосчцеав басассоссаче асаєсцаєоєе 3650 аєддчасскє сстасесоуо ачсавсабсга согассачес агсассаєса ссаєцуаєчає 430 чсучЕЕссчя сачеасаєса асодоасотсч асачезяСеє засесасачу дакссссдає 480 сскссвасосо ассдасуєся асчозачьє зсЕссодсва свзаваєсяас чодасеєсес
Бай вазаєуссоє азасавссосся соссат с час чеавасачас уусачзчечея басозооччода
БО чесстасаса азсачаосос сспачосаас садачазсюяс ассасстбасо сУуссьтвесяча во заксзаєвсех асссастаба дададасссв аустеачесає сесЄсавасє Євадевса 725 ассчачесоч часесдосає сасузчасечЧ вестаЯдаєто єдсссстаче часкассчеє 780 асасязчасоеєс ассораззаа бассасаєсс ччавссссоч часосстосу часассасгад «и чсеедацсесє єкосасесас авчавбссва васбтасєссос ацссассоза сазесбочвея зо асассоботча асссссвоюоа сзчзсазксев честчксваз дасадаасве севдаррось
Зв асссссаасо асбсессазсе сазсечесосо сббаєсєдес сазастаося сідав вовк: ваво ссосоозачає Єсвбсавеве ссобоєебавс ссасвостає ЗесобФавесЄ собуссочка їова ссессочаст аксачавсає чсроссвасе Бассосаєсов сбсссоцсадч бсассаєваєсєе тав ребассзасо собабайчуає асусассаса ссбусссача зааасазсає зро бссавев 1200 касозвсдса ссваавсссас сзчабсЗааає ЄдсСасявраса Єсесавбсос седстосвках 1260 цпесексоеста ачсассвоєа довуєочася восабуссає БЕбовсодзосе чачессосьо ізо чЕчсссЕссоа сосазсучес бесоЗаЗосе ачссосавсва Бебадовасо созссакесаєч 1380 акчаєуєччє асучачачес Сазесечсає сссабодтає сассаєссво деосоесусва ї4а40 сезассевев сссососува чабсвасаєс совсвастсо ваксоададчу ясссясссва 1560 асссосечає сазссвсодс гасчссЕссЄ яЗсродссваує сабстякеяає бБочосесреє
І550 сесчечссЕЕ сесбуассоє зоазазсабсосс ассоссасста СесЕЕссоса абсапвааїзад їі5Б2и зчзазаєсчеає сасаєсассс заасавасас саєсегаєсєс созаччасає доасобадева і680 зЗасачсаачеа соучазчаа зЗчдаздасває ассвоасаєяа осдачаавкеє. чесачаосоє 1740 асозчессосба сокоаЧчасочее ссСасддасаяч сааусовасс зчавесессв зебдсучее ї800 соскссоазсайа зчЕсодозач сестадсавач базасечуас дчасЕссстоя седсесавуда 1885 ссчаєчасу саздачаєса азстсєдчаєс зачачасеазоа асозоачаєся сстсоасасов. їТч20 жедаасаача содассусас зеазчебевс содссчесся часадазача совбебсочоє 1586 асовосдусю зсазасвазса аксоусвасе седаєассос сусассссае свавсацеде ацас азчалсЯдссе сочсЕслЕВсес Чссвадаєсся аосстесссозч васосгаває чавсочсаваа 19 зсзаздпсацде десочоегаєся гЗдсравесса сапсозясоє Ббесебасася зсбавУскся 150 асоссоссає Єдаацдсдоча зуодассоюе бассаєсова саавокоссу чодсадчаєс 2220 косбавсаве Есассстосс соБоассозаа зазсассосає сасодесдає зусвасоасодчо 2289 здассосасво зоссаавссся дсосасссасое сасссзассв сеовацозава саєсясявов 2350 азчечачсзся бастсзччасса чаеазоссачес теасслаєса зваєчассса зчасчавааче 2400 вусазчччес сусчесацчес зазсхесеся ссаччсссва зчсзазчсаво спобааедасо 2460 азпчаксосчг ссувсссає ччассчаєдесе дессСосслав євесаєчаса ззазавоцее 2549 асісЕсССсвЯЧ асссаєсуає бусодссецче садасаваде созсеессвЕ саздасатау
ЗВО счЕсчЯдсрас сесзесчасаєе дсровазчаде Кесдесочсяа абозассдає сесвесскся ай ззессссасуч бассуссясє сстзчаєсссче аздсосатсяс ссксссасезо себссезпаса 700 васссЕКстЯ аассассває посбасаабЕ ЕссечасЧея бас ресе ссгасосабе зЗзка тасесечіає сссасассуєс абасазчсач сассессовфу ззааасесчо Зсозаавосес 2820 сзЕБЕЕЕста скЕСсссаваа свасаєссава бассосавсся сеосаєсчачас азбазоснеоц во акадасчстс сазсаасацче асдсчстава вссесаєеее сварссвава заасегадоє зо
Чвадесессв вБЕСЧагавкс совВЕцассва забососсва счбаваасеев сесбосаєьоу збо ачсабссачас сссзтачача адчассдавоач асосссЕсаа чаєсссексєе ссобасасає 3060 давогасваес седсавасав ааааассвос черастадоея чвЕацЗЕссесе сассздаєсса
Зо ачачосасса асссескссєс сазвоачсавасо соачсЕссваас адачсцсаза гассвавтає
ЗзІ8о счЕссесога чеЕЧезассас асстадасса ссеаессссвая дасссрабач сасодостає заао асасстсасі сртдстваєссс собгасеаує сосоцєсасо адсадосдаєа азбсасяеех 3300 ассоачеєсУ часссзачас завсазчесаос зсчабзаччсся свосоечеся доссавочо 3360 зазіссесзе асасвусоса чсссззачсод ваасазвасстає вссааасєсча чакассосаєса з42о чечечассса сдваавачсс ссасосвєссо сзвадодача авадсязчаса чдабабссаче за8о азвасодсацча чссучвнасад чдадЧассдоевси чачччачевв ссасчуадудава зосчсссоадеа з549 кссесасвнує сосассчаз сссцчесасоє ссчазесава соссчвоссЕє сабдавцеве 365 чЧеЕсазаусод судачессає дзазазасоає сазсзасуся зессесесає зас ссес9да збо сЕКсЕцесСоЯсЯ согсесасос асахтасесво 3590 «їж тії «1» 3729 «а» ДНЕ «5135 штучна послідоввість «ах «233» штучна (рохіво5 Нерв внвв-с) «5005 41 цасЕссессус засзсасчад ссачасасає чзочдеецасає Євзаєсассза срачрсаска
БО асазцсвасса ассасузеце сасбачесса Єазсссакає абезачевсо дезссасаса. 128 асікассчіа загопзчесосЯе сідчесечасо зсосавнсчас сссоасессаАе счасчєсває тво азаєзасобсає чіЕсссвбад сзасчссаає взчаассссе саєсдчасаєо васзоусчеав о сктасєсасоу баааскчессо асссоусауе зсассовачса Сассабабсуєс свзачеасоасо запо зссгастоавос чЕсваасцаєсо дсавасучсе сасобоадсає багбчасссаці асаєдасове
Зв айбчачасусс ссбасссодс аздсасаєста сасаєсачьс вссостаєта бсаєсозєчає зо зсочусЕссЯзч сачіасаєса збузчасуєча асазсудесЕ зЗасссасоцча даєссссаад «80 гссссассосо аброасоєса абдоцачее зЕсссоудсво сваваєсвас одадаєсьсос або ззазечЧчЕссєь аасвассссу ссссассбддає дсазааєчозе зосадасосе сасоазсадоча 20О секекасаса зосвоазассо Есідуссвзає гадададосс ассзсесаєт досебабезда ево васрсзаєасс асссассата чччачассса аочсчеассвч ссасвсавассь саачосссачЕ че ассуачюссчя часосастач Сосазсаєтя Счдааессесє сассаєучає содасаєава 780
ЕЕсвасЕсої зУуссусссс дОзасводач Басаесссда задбасазос сбучеввев во кчадсесосст чЧосодссссо сазцусзаччЄ бессесгасї дасасчавсс січастаєто оо сасвассасс здчасачссаа Ббочассоваєсс Созавосссосє зпоачевчачасс тсобасавоеєе зво сачзасадаа сеісссасау сесассєсся абсастстсос бассаваєбас ссосостаєсь 1050 цесосадстя сачзаєсочаєс гщдсоссасуча часссассає ЄвссссЯєсЕ вссссчессає їо85 сосасссчає сЕссстасреа чіассзсвеч яскассвчадеа васчзеечесо честясесе 1449 тасгчсосада авсоссваєсо зсаацсасаяч дссосезезЗа Часевасвясво акесесаЯсьу 1300 мччачассач вес вссок ссарасЕЯЕ цезсававос абокчаєода вассицсаове 12655 чсассссаає Ссосачессс сезотоссся сбазцеесос чецачачсач чесазсоєУє її десевсссова деечЕсвсва сбддсоссоє єечЕссваєа ЗЕЕсассоазс сечавцссесва ї380 скорабачеє сфсссцссасо созчаєваєсєче зусассодач дчесвавесску бабвабаєся 1449
Бабсвєсасе ЄседссаєссЯ сбдссваассе сессссасоє Чкозеєссас асстзаєаву сдасссеся забссбаЗазо чесеабстаз восочесаає свассссзає сатоасеЄвее 1550 азчетоссаче савстоссбає сечесоссес сосасоассюк собезЧасссі счавачечеос т650 асссссвося СссЕБЕссра агзанавдчач зазаседезе ссаєсвоясоє чазевочеае тево сакжстаєсс содеччесяя зоасосодсач дасадсваасу доздазоасса одаводсаве 1740 зчсазчсаст сбузачасоує часазчаоскос взсчзссоста сесадесЗаєс стаБодасаз 1800 сазассзаєс ЗаваєсоЯсса чосозозсцо соссозасаа чассцочава ссссасаваз т186б саззссзаає часбЕсісд содосазадя соссавачсу саацсдааєса адесревсуаєе 1929 азацчачасзоазч акцаццчаєстп вБСеєсоасаєча єплдадсваса бочакєсосво здеаозосеоево та80 суцсосоассоа чобочдадвою ссассодасв асуассооас всевасачаса абседесуєсх 27246 стчасрчссзе сесчсгссоач сечЕсвоасоас вздечасасоо ячЕБеБЕЕсЄ адесвзауаєєся 210 всссчЕссач ЕЧСССсЗаає чЧевссдсаву асувассацо Зсдаскався сеУссодюса 260 садасзяцчеЗс ссосвцсоса зстасоассса асуссаєсає булачсусов адазлассадо 2220 счссасечдя сззачсосся чуздсазааєє Єсобоабсвзес БсассвсЯсю ссеуссеваа ах о вачдсабессає сасззсстзчвє чоаарасоде чессосаєвс дсевЧаєссу зссаостосс 340 саєсесцаєсєса ссвадсдава сассосаєсо васазасасоа хасссудавоа чЧазассячес 3400 гечЧчссчасса ачаєчасстя дасзчаавчасс вусазочась сЯсассачос чавссоавеса гава ссадеасссовза зчозчазчсасая ссодасочез задассьсЯє сасавсосав засувка 2529 чевЕдссцчаа бабсавєцосо дааваєдассо чес ссовда асусаєсдає собоцесзсс
БНО счЧЧЕссуче очассячесвкає садуасасаз сУсссаасбас ссзєчасасс чсезаачадо 2640 тсачзеЧасла агадастчяс сасстсссса соассссасач саебодесеоє сосдактецде та ачезсабсде сесссавроче оскесссоасу аосвБесесса аасбассаас щшеостаслаєх а
Бескаабсоєа дасте собс ссгасосаве сагосодсає єсовсассус агасасуєда 2823 сасстсвсоу соаваєчічо зсадаасссс басссессса кссссссзава сзсасссава 288о
Басасаєсся сесвтуадас забавссстя ябазаєзссос сзаєлаєадо зсятоассааа 2840 асЕксасосо бвасєсазаа зааєстасогє зчавзчасссве ЄЕсЗабваєс ссвсдассаа. зо0о аакесесстава сЯакааоссЕє секеосбсасгта ззоуєсацзаєс сссзсачааа зчабсавася зодео зЕСЕЕсСвЕса чаксессЕБЕЄ бросгоасосає засссусвас ссосвавсав вазаассдос: 3120 зстассачсч зЕччЕстЯ ссодчаєса алачетасов асссєсекко сааазуусавс
ЗВО кеачеКссозоо ачачсасаца Сассвавеас Баекосьесев зсасачесяас азбвваоцеса 3240 ссассксаву вассскаграз сассдсеотас всасссодев срдстааєос баскассаває з300 спЧсвасідеє ассучочасба адссугатеє сассдазаксСЯ дасссазчає чатачекасе за ччаснасасоя садсосльсояз зссчаасзач адоасссчкас асасачоссаа чеесочачоч зЗазо засавсссас ассоаастов часасогавба зЗсчезачека їдчазцалачоу ссасцевссо 3480 счазосуаза ваччсзччаса учсасссяс аачочасача зссодвасазч чазвасовсає а5БаО чазучачисє ссзачадава асудсегучса Есессбавєаче севассччас сЕсдсовеее зебо сечасстовач сессаатвсЕ содєцасастс зксадоазчаоя садоавосєстає чадавазосв: зва сассзасчеу чсосЕкесас ЗзЗсеосваде сествЯсвоЯ осссвеяесо аваєце осв

Claims (22)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Вакцина, призначена для генерації імунної відповіді проти НВУ у суб'єкта, яка містить: (а) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: БЕО ІЮ МО:10, амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО:10, і амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:10; або
(Б) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: 5ЕО ІЮ МО:12, і амінокислотної послідовності, яка на 95 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:12, амінокислотної послідовності, яка на 96 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕСО 10 МО:12, амінокислотної послідовності, яка на 97 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:12, амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕ 10 МО:12, їі амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:12.
2. Вакцина за п. 1, яка додатково містить: (с) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: ЗЕО ІЮ МО:2, 5БЕО ІЮ МО:4 і БЕО ІЮ МО:6.
3. Вакцина за п. 2, яка містить: (а) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: 5ЕО ІЮ МО:10, і амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині амінокислотної послідовності ЗЕБЕО ІО МО:10, ї амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:10; (5) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: 5ЕО ІО МО:12 і амінокислотної послідовності, яка на 95 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО:12, і амінокислотної послідовності, яка на 96 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:12, амінокислотної послідовності, яка на 97 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності ЗЕБЕО 10 МО:12, амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО:12, і амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині повнорозмірній амінокислотній послідовності 60 ІЮ МО:12, і (с) молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮО МО:4, і БЕО ІЮ МО:6.
4. Вакцина за п. 3, яка відрізняється тим, що молекули нуклеїнової кислоти містять одну або більше нуклеотидних послідовностей, вибраних з групи, що складається з: (а) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:10, яка містить нуклеотидну послідовність як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:9; (Б) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:12, яка містить нуклеотидну послідовність як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:11; і (с) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕБО ІЮ МО:4 і 5ЕО ІЮ:б, яка містить нуклеотидну послідовність як зазначено в 5ЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:З і БЕО ІО МО:5 відповідно.
5. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що молекулою нуклеїнової кислоти є плазміда.
6. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що молекула нуклеїнової кислоти включена у вірусну частинку.
7. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що додатково містить ад'ювант.
8. Вакцина за п. 7, яка відрізняється тим, що ад'ювантом є 1-12, ІІ -15, ІІ -28 або КАМТЕЗ5.
9. Спосіб індукції імунної відповіді проти антигену НВУ, що включає введення вакцини за п. 1 суб'єкту.
10. Спосіб захисту суб'єкта від НВУ-інфекції, що включає введення вакцини за п. 1 суб'єкту.
11. Спосіб лікування суб'єкта, у якого діагностовано НВМ-інфекцію, що включає введення вакцини за п. 1 суб'єкту.
12. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, яка складається 3: (а) амінокислотної послідовності, що містить зХЕО ІЮ МО:10; (р) амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині БЕО ІЮ МО:10; (с) амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині ЗЕО ІО МО:10; (ад) амінокислотної послідовності, яка містить ЗЕО ІЮ МО:12; (є) амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині ЗЕО ІЮО МО:12; і (І) амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині ЗЕО ІЮО МО:12.
13. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, що містить одну або більше послідовностей, вибраних з групи, що складається з: 10) (а) нуклеотидної послідовності, що містить 5ЕО ІЮ МО:9;
(р) нуклеотидної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині 5ЕО ІЮ МО:9; (с) нуклеотидної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині ЗЕО 10 МО:9; (ад) нуклеотидної послідовності, яка містить ХЕО ІЮ МО:11; (є) нуклеотидної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині 5ЕО ІО МО:11, Її (Ї) нуклеотидної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині ЗЕО ІЮ МО:11.
14. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, яка відрізняється тим, що молекулою нуклеїнової кислоти є плазміда.
15. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, яка відрізняється тим, що молекулою нуклеїнової кислоти є вектор експресії і нуклеотидна послідовність, що кодує одну або більше амінокислотних послідовностей, функціонально зв'язана з регуляторним елементом.
16. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, яка відрізняється тим, що молекула нуклеїнової кислоти включена у вірусну частинку.
17. Спосіб індукції імунної відповіді проти антигену НВМ, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти за п. 12 суб'єкту.
18. Спосіб захисту суб'єкта від НВМ-інфекції що включає введення молекули нуклеїнової кислоти за п. 12 суб'єкту.
19. Спосіб лікування суб'єкта, у якого діагностовано НВМ-інфекцію, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти за п. 12 суб'єкту.
20. Білок, який містить амінокислотну послідовність, вибраний з групи, що складається 3: (а) ЗЕО ІОЮО МО:10 або 5ЕО ІЮ МО:12; і (Б) амінокислотної послідовності, яка на 98 95 ідентична по всій довжині 5ЕО ІЮ МО:10 або 5ЕО ІО МО:12; і (с) амінокислотної послідовності, яка на 99 95 ідентична по всій довжині зЕО ІЮ МО:10 або 5ЕО ІО МО:12.
21. Вакцина для індукції імунної відповіді проти НВУ у суб'єкта, що містить: молекулу нуклеїнової кислоти за п. 12 і ад'ювант.
22. Вакцина за п. 21, яка відрізняється тим, що вказаним ад'ювантом є 1І-12, 1-15, І -28 або ВАМТЕЗ5.
ВИ. пиві уч ши. ї й нн ль к їв Б з Б.Я ї БУ с: Й Є. що К Мов Б чі жен фігура
. порох МО ОО ОО ЕХ ща ; Й, її ЇЇ ЇЇ ЇЇ УК ВЕ Ж а х ОО: ва кре кання Оу с. вдо Ї кв: Ос
000. нн. її с . с с КН ша вон нн є нн, о - вон Вк нс о З М и УМ нн Ен о» ОБ, о ОО ВОМ УКХ ОКО
Є... - є и ус с її о о С» о Со и ЗО КУ Я КОП ОО ОХ о драм НН ОО, о с
1 . п; Б В . 5555. ОВ ПОВ с о. ВОМ М ОО 5 о ня С,» В С,» . с 55555555, ОО ОХ ОО С щ о» ще с т» ооо 3 її ВВ ж. с З нн є о . о» КО : ах 5. п. о.- дк
5. НН с ї М 5: ЕЕ о. ї о. АК х ОО я ОО я ОО ОО КВ п о о о а ОМ я ОО ОБУ ММК пон ХК З КВ Ен лен с нн с о ОО Б ОМ ОК З о. с о. я і,» с КК
НН.» : Д Д ДД Г БД ДБ М І ого г ' «сг "В? «г ягтютюинЦ МОМ Хе Фігура » ех : дк ок є ок: ЖК й ТЗ й х їчеві ді ке наша і С ИН : ; і: і: і: щи Знарпротеолітячний сайт х й, ї х. КІ щі позшейплення Фігура З ргезі ргеб5? 5 Її РОН) Фігура 4 Арно рик ЧИ 7 ж ЩІ ши ї 7. г Я ами Її ТУ що в ВИ Е : я го хну, Вени Ц век ех ; й й хх я Я МУК рОХІВОЇ Нерв «-МСоге ; ШИ г що І й х. беЯогі ь ЗЕМ ВЬо. І . у св) Канаміцин шо шо й Й Ше х х Нерй рис се у АРКИ) ВОНрА Фігура 5 и ве Ше Й ; ; ог Ше о ще КЕ у; МИ лотя хе Е | в Баня Мейо Мей ізвяг) | рохівВОг Не й й "Я ше Черв рінЕ Прохеенн він . Ох НІС ка із Пе. . : Мейїзщі зиаміцим но У . ! АБ Я Б ЕЕ. х х й пенею . . г Ба; х й х 11 Ка пи ж і аб У Є ню ВО ; І в й н- Зиейагий ВА ве Нерв інве - КВОТ ря Вей 5-А динею Й по зо ігува 6
І Зоре - мищї всей ОД я щі во М Ку і з рраневй Е й ее і я «о Вівнів я як у у ї ще я ме уд дош і рох і18о3 ерв оіНВв- е і оКоежКцеви . Щі з К х ж х В і жену їх ху й. ЕЕ. щі ази Канаміцен ть н, ха песо) ьо І Кк Ващніоово з 0 ення з ДН ях вЕнВа БОНН ра м А еово) ай НЕотЯ МК Фігура 7 рн С о УА 12 -й шо к Ж 7 - 8 х ще х 4 - в о шин ж Нерв ь Я : т У шк і їв А й нт Му ще ж.
Ше х Я І з га вий її я че І Ей І де 5 Я: ра й чу и г чне) он с й в рА ої що на ха, її и 5-й МЯ БУ 3 Х.
ак нен у щ- о; й В Є 2 Е | « БУ У й З. х Й БУ Мк і у в ше «ов У рсхІ805 чі кан ь Нед х лк її ва З 259 зв З ьо В с на " - і рий щ кет І. ке | щи і Не пи : | І | хх рев і ще х х 2 . х КІ о Ех х ЕНН х д г. щ х Ме Гу Я Ф х і у "тн БАЧ х Ся і я як є ВІВ ве 5 г: й С Ко Щ яке в:
Х .
х. В х ча х Ж А. ТО с С х ОК о ч у СУС ж Х З й х ; кое КК Б КУ й с ЧК ся Її -й КМ х ї Я х р й І М я Я ЩЕ ЩА зконе секкм Ж хе СЯ я ї Е ех сУхххх дж я в Не у Ж З МКК Кк шо. а Б їз и й М Х М ой З х й Я еПОК зжЖх Б б й З а т г СУ Я що м й й ее У С ней З не Й т, цех й «Кт ІЗ «: Зх о ї а ОХ УНК й З дк Ця -й х ї Фе х а КАХ с ши мазки ей - З ком Ж Новик й - р Б о Ве Пан ой шо ї -Е а ух 5-3 ах Я т 7 Щі й -й Що я і Зо Ше й - ще -й і в » ? Ше я Кк їх й КУ яю й Ж 5 за ККУ - У з 5 я БО БАН КУ ЕКЗ КЗ Я ЖЕ х я КЗ Я Б Е З щ о Бе Х У феєю ен з. деки. Фігу Ф що Р че ях ше КО ння ОО З ї в ОО АКА що ОО В. ОХ с о зе ж о. о х з КИ с п о ЯМА я ше С ОО :
Ж. пдкнек кВ Зх 0 с Є сх і рчнй о У о ТА 5 ОККО ЖК Ох х Фігура 11А
Ф т ях У СУ Ї х ях и ХО 5 о з ІЗ и КК -- ПО в Х бе КІ. -ев с ХОМ с ЗО т КК НВ в Її я " . в о о я іі од меню ВК |і З ей. рогу; Фігура у нон ! панна ; Е ЕЕ 5 є: ї Мак 7 іван Ж коркових пупок Ес Оох М І М ді КЕ -: щитка З НА мука З . ! У шина щи МАМ : Ь шо Фігура 12 х щ Б СЕС КК Є Ж вже р;
ьо. ща Оу З а шу щох сх Богу як : ч Фігура 13 ТЕ Анта-нід Наклаження Ме 55 3. Б.
Фігура 14 Тиждень с ОБ СО х. и КК КК КК В Умертвіння х З Ж г З імунізація Ме імунізація ЩО Баунізація ЩеЗ 2 с Фігура 15
Негативна Позитивна знак АНА Кк дп КАК КАК КАНАДА АК ААААКАнАкя пд АНА А дл КАК ун дна ї Н і ; сеї ї хі : КОКО. НІ АК ик Не - ВИК КЕ У ПОМ КММВК их 11 в ц ов тя НІ Я 3 а : т 1: х ОКХ оно ВИН т і і Мих НЕ СУМ ші БУ ії Її СД НЕ СМ НЕ і і: Тл Не | і : : П ОЗ ож Е Н ї ї З Н Е Е Н Х і ї Б : Ї Н ! 1 і ! і ! Е 1 ШЕ ше і Е ! Е Е Ї : 1 жо: ї Ї ї ме жи ши ові ' Н я : пз і Н утекти флору веж вна омииинин мииалн ма і їй Я са АХ Сея се чу і й ще Не що 5 че че че 1 м З лкдіджаналякжкжчк жк ЖАННА КАК АКА ВАК АНКНААКААА КАНА КАХ КЕКЖАКАНАКАААААКАКАЖААААНАК КАКАААК АТАКА КАН НААН КАКАААКХАКАКАКА КАКАО ЩО с Ему Фігура 168 А кв іСсторінка 1 3 8ї Кововий пул Корознй пулог рн ту туту тт ножів потрі чуття кюоететтнн, ї Н і і «й Н : ТЕ Е ї я і ВЕ Н 1 : В. ї : :
ї . кеш її Я » . х Й і у пи и її Де я ті КЕКВ НЕ В НЕ ВОЛКОВ Кі Її В На З НК й й Еш В НК НЯ і ТА і ? М оо ЗИ ШНННИ й НН І ЖЕ : пт 1: ї МЕ, х т я лож А 15 ї си 1 щи 4 ЛаДЕИ ит ї Ї З : ії -і ї ті 3 і ї Н 2 і я і і ! 5 Н і і ї і і - 1 : 7 : роя : о Е Н їх Н ї і скажу Ї З і ї Е ОВ | і і : і і - Е а і ше ! шк Е : дека. з важ кекс ом м м ес зма а жен Мутулв течі рути кр х хх їх С з КІ х Н й че в че 5 щи ще заА ї Зала АлАДАМАК КА А ККААМААААХААААХАААКККААМАХКАКАААААААААААААААААКАХ КА АААКАХ А АЛАНА АААААЛАХАХАХАААКААКААКАКААААХАААААААКАААААААААААААНААНАААААНААНААНААКНААККАМААКАНКАН КК КАМААНАККАКАІД ігура 16, продовження ; - іСтерінка 2 3 2 ж З Ж с лк Е же і23 і ро а Х ; 485 5-3 у мМ В 1 ук Е Й 5 весно 5 ок не Ж пк ж Ж ня В Ж 7 як я і Ко ве жів Е КЗ ен клани СЯ В КО кожних - «джек ооо
Бо. і я ва ї В м їх вій ми я х ще хі Ще хх хо БЯ Е У ж . Ся Бся п хх 5, п нн І шо оо «оЕКф тю снео ; га ще ен мок дак ЕК щ й . ще шо ще | - МНаївні певне - Навні зщнне ш як Фігура 17 Незтиена Пазитевна пен в прю і Н х З і у І « 4 г, фени ники каш полин Я Е НУ Б ї ОНИ ше ї МК з ща з о ї ши їн. М, ї МО НН НЯ ї хе ВК За З З ше ШИ ; К. на ня і ї ПДК ї 4 УП З і і Пат : ї І - МИТА, В ї ще -4 МипацаличненийнциЙ щи не фипдиценикакицеяой ї Ме і ї Е і Я Н 4 ї Її 1 Н Е ї ЕН Е 5 Н ї Н ї ї і ! ! З ! ії 1 ї 3 ї щ Е ЧО ї і ЯЗ оз і З Пруту ту риму ру ю рити Зоре ртуттю ее у ртуттю титр нан ан а а а я є 0 Фігура 18 іїСторінка 1 з 2
Корови пря Корсвнии пп Я дну АЖАК АКА НААН А АК ЖАКА А А Ач чн. пи и а Е : : ї АА ї х КЯ г щи он і х КК х Ж шт КЗ Кося че «а Є | Шон ІЗ че ее т. С я ПІК х 3 " Що Осо . 3 Оу Б ще в . х ї КУ ГО 7 Х Х ЗАВ З КЗ З З ЗИ ї ї ТЯ ї ІЗ ОНИ Х і ПИ х Ву я ТО ОККУ т ІЗ х УИЛЕМеТ я х ї і Я ЕЗ аж ї х ї ще З нена ща су Хегнннннняняння няння ї ше: ї 7 х ІЯ ІЗ ї : Х х ! ї : ї ї ї т І х ї сг с. : ї З М І ї Ж ї ва ШИ Її ев ше ОКУ : 3 З Ж ї ї х Е ї ; ; х ї х й ї Ж М ї з3 | її ї ї х М кас в во о м в о вас в кни Бека нн сі в які Мн ка Знаний ї - аж - - ка ай й с-м - ї М 5 В й щ й во Бе щи ЩЕ ї ї ї ї З ї нн МОЛ ЛОВ ЛП ЛО ОЛОВО ЖНЕЕ х й Вігура 18. продовження Ходи ка МУ «є М іторВінка хз хх -- Ж х Ж ро т пе с ХУ Я - Ка КУ о. Я ги За в зд ко зв ре ж є їх 5 5 тк тим іон Б що Ж скмкедионотих Х з А з ж ле ВВ : -- їв ддгсоюреєююня З Е й у Х ча кн хх Н й 45 І Ж : ш т ї й Я 5 пен: пкосмнннння її кжжжжжфкюютких Е Н с «4 ще й ї ід шо вч укечевиснмх «а с шк Бя СНИ йе Е я яд ІЗ Б й вк -
-. зання ся о ее у дід (ЛАКААХ А ААКАААААААА АЛАНА АААААККААААААНАЛНА Ф па З СУ, 4 д : - ш Натані пакет НАй Наївн ррсоки хах Фігура 19 і, с. л ч Негативна Позитив і і ї КО Ес Н БИ З ї З і ї А ї і Н ї : ї СУ 4 ї її Н : оди Я Е сип з : з пи ПЕВ ті Й ОКА. 1 ї ох 0 КК їі Н . КК її Н о НЕ я Появі ит ЕВ ЕВ і М ОО 0. ГА це КО щи КУМ ЕІ ї ї ЕТ ЗО т. ь ал Ті 1 й ООН Я М ті Н Х ТОМАХ 1 З їй До ИНА Я п і - НИ ті м ЗО ИТИ У . 2: Н х Ач Ії З М А ан ї т Н ї ПН Ії 3 я б ТВ. Н 4 ЗАМКОВИХ где 4 ЕЕ Дн селелендтнемичичниії че ин ї і нн: яп і їй і мех хе У ї І і
СО . і З Й у і 3 і ї і ї Е ї Н ї Е- 4 : 4 З ї ! ї Н зай : М З я і я Н Н їх З К Н К 1 Е | Е і 1 і і : -4 і є Я 3 й : ї і З Н я і 1 : ї ї жує юц у уч тмм у чтує чуму єтя джу ут ему у м ум у ух і вору т зереур мере уенпрчуєтрмир тус 1 У як А, У як Ох Ко ЩЕ 1 гу я «д й мк щ че з сук зго і іУ НЕ ГУ їх НЕ З У г іже 59 З З З Н ін п о в в п п в п в в п в в су ту сх з кю жк уз й срата Фігура 29 Каревнй пул ка ву хо ва хх х пришни Вул х рент Кк нка п КАК кда нд Кн ення днннчтніетен очно ит Кот ун чт тя онн ї ! ї ! че ї 2 ІЗ зд Тож і ее НИЗ і 4 ! ї Н ін и й і тофу єт рчкуєтн їх шо СК ЧИ І 1 КІ ТЕ х . и я НН і - КН ем У Ти я ВЕК, Й НН Рос пк МК В ДН НН й НН і ШО и 1 ТОК ЖЖ Но хз р -к ПАТИКА т у НУ і Ж. й ї М оо й 1 й ЛЮД: Не 1 ОЕМ ВН Н о На З М 4 и У що! ост Ахі 1 ОУН 1 ЗУ І кажу г ї Ку і НЕжК МЕ ля Е Її 3 1 ії Н ї З Н : і і Н 1 Я х В. Н І що і і і: зи ї шо і р ве Н і 3 і ї ї І й Н і Н Н ї Н З В ї ї Н і как Н - і й і що і і ще ЕІ Н дути мутттутучнр ту муу тиру Уедрреттувтр еру и крук ут ї ск Ух ї й х «з е ї її «хх же З чл Кч «МЕ - «Ух щи : Кх «а хи хх Кк КЗ ЗЕ у КУ г Н нн п в п а Ка а я тома Фігура 2 созота ігура 20, продовження (Сторінка 2 3 2 ря -к де х їх а у «- Е У їх т З В КЗ ку ск ге А с КЗ ї но | х с. ек я і а В ря дк. косе Е ч Я ХЕ з КУ Е: Е й Ж 5 з не жи т 5 й Ме ке - в пиши сани І Х: Ку з чх З я хенд я Е к КЗ Я косою г ще к-е Ш хз х че ХХХ КЮКюКих.
Ж З з кох в х вх нин вил а 5 Е МЛМ М ;; М В ск Кін сх є У мм т щ наївні ІК Ж Наївні Й Б г ач Ваз кУ Ж Же У ро ус реся Ноя га ще їх Ж ог Еви Ід -2 ж Фігура 21 пен нн нн нн кн и нн ї я ї ї і Ї : щи 1 х Ж тт х ї - ї ї ї Ек ї : ї є; ї 3 Е 5 т іо прабауц і ВЕ ї : сао я КОНЯМ їх УВІ 3 : 1 ї МІД ЕЗ В піші у гЯ БЕК дека ї чу ї ї ДОМ ЕЕ Я ії В ЛІВИЙ 5 х хі Одне.
Й Н шт отих ї Кс НН ї ї п ооо: ЗаНе - їх пн ЕН и ї КОЖ ПИ Ж К ОКХ ї ОА ЗУ ХХ, не НИК о НЯ жк КК ї ОІВ УК з КОХ ОК КК х ТО І, З: МН Же п ОК МЕ ї х Коли ІБ ЗООККК КОВО КІ х : ія ЩШІОММЕУМУТ Ж МОХ М х Н КАХ КЯ КОТ КК о КК вп КК КК ВМ сен У у УНК НКИ ВЖК ВИК МАК МК о ДЕК ТЕК ЕИ мин ї ЕЗ зе 1 КЗ яжюютк, З она Я їх плен кА у хе ка джек ї ї хх х сн м хх : Ж фістхуою цех в ЩО Ж. тяж Ї З мож зе ЮК ще ОХ Ще ; ния я Ї ВУ ХО «8 М я Ж х ї й ВУ Ж Ооло Б ї З Я ІЕУ Її о ЇЯ ; х х " 3 я ї я ї Ї х х ЯК ОО Ж ХХ ї х й Х (З КЗ ї Кк. хо ОБЖ Ж я х М М ше : ї кіш В КАК ї що ще с дих 1 З се х У : З їх ж Х Ж ї З Ух МВ й М; ї Я ее У ТМ : Е Б : ЯКУ Її я ЕЗ ЕХ х В і З КК 5 ОХ ї ІЗ ОХ х с Н 3 У ВЕУ с: ЗВ І: МК Х КОХАВ і З МЕ У ЯКУ ї С В Б ї З Ж х ЖЕ ї ї Б су МЕ : З БУК З З ЗН А р но пе о ї сжаеА НУК, В я ї 3 я мит Х дими т ї УТХЛЕТЕКХ т т ПЕОМ ою Соми, ї Ь Еш НУ ож: КУ ее Х ТММ ую я Х « й ся і в Хо я хх г ої 1 ї Б У т як З 1 Б р. - В Ж Її ої 1 ї ее. ї їкд 3 КЗ ї кВ ї : іч ї ї - ї КУ ї ЛІД ї х х У Хот дя МІ що Її з Уж Зо СО КІ З Кя КО уОоа Кх Ж х : пу ЖЖ Є Н 3 зх Я ов ; І пої не с А Н З М В а ЗВО КУ ії Ва Х - сні : З ря г Зх ї Б ії ЗО х КК : З : З Ж КОХ ї Ж Її Ж Х ХХ.
У У х ЩО ї в 1 КК Ку Й Н З Я Ку З ї Ж : 5 З З : і ЕС М: й і БК Х СК і В Я В БО Її ї ТМ ХЕ Км Н 1 я КЗ ж ї ї СУ Х тез и Зх т КІ схов» х 1 Х ЗХ Зах ї З З й : ї шк Х Я ї КЗ 7 КЗ їх Ї 1 їх ХЕ Н 3 В БУ : вони ПЕК ЩК Кен ення Де КЛІК Фігура 22
ОО Я МУ і : КВ нок ; ВОК е ИКОКИК КК КК КАК пики ї ех х и а Май ж ВЕЖ 1 ще хе 5 ов ня жй МОДИ МИХ М В З Ов я он ИН ду ВІ г ХО КВК ЕК КК ї ня х Ж 5 В ВЗ МІОМИ К у хи ї ЕВ ех Од ї БІ : І ОВ Ж З їх п й їх х т п ї з Щі І іх 5 ек 5 З ЩІ жи - Ку як : ПЕ . Кк ї ШО ЖОИх : мтс у 3 Б «п р й З дк Е 5 їі: ЩЕ пр ую ї Ка где Пи п й й Зк ї І ххх : х З ходи кВ КК їх ХЕ У се ОК ооо ММК Ба х долити у ПЕК Лек х жур 5 їх ща КА В що поні ВКА СО ЗО ї щ- ; 5 У 0 ПО оо о ОК ванн їх Ол ПЖх ве В ВК хе ЯК :. й ТОК ОУ ЗО ШК В 3 Х ще й БО КОМ КЯ ЩЕ КО по й : і ше Я ХЕ ЩО ОА ОК Кум ще дек Зх Ж КОМ ВУ У ох -шХ У 7 ше З я : ру МК: у Є ї
ЩЕ. Б ще ; ї КН ХЕ ї З ХЕ З : ОО І. с ТЕ ї ЩІ БЕК З х аю ХЕ І - ЗО І ї В Ї х В Ка ІЗ ї ї Земна . щ в : ЕЕ ВОЗ ї ск зкнк же В п Ж ЗМК соди ки Ку МУ ВЕ КИ і ї пк А ЕМ і: ск Ж Її МК Ви Мк ЖК ; осокою двоіканони Мк мн В ЩО КК п ка я ло ки и ик ки юка мк ик ис ук кв вк о і тую Ха ПК ло й МА КК КК ІЗ ше ВУХ ни ; ЗОЗ
КІВ. нн БЮ Тех ; не «В ї ше: им пах с В нн ква Х Й МОУ ге ; В : и ЕО ї вв З ї З М х я І т ї З ї МИНЕ: ще З ї А ЕЗ ш : ЩЕ Е . ех ГУК ї І ї й З : ї і її ше с | о спек ек х ТМхххххиимки че 3 Щі Я чо: М хз 5 в М х Цех он можккхх І кор КО ї КЗ Що кому ВОК КК Конні Кн кк і ххх ОНКО Зк х 5 ПО В ТЕМ КК СОННА х хо ІК хх ЗО ТК. А см о екон ХХ БА с: 00 к- ПЕЖО ОВ ОК МК УК ОО ЖЕ ще З й ПО КК ПК ХО Най х хо Ще З МОХ Сх 5 ІК ЕК МОХ МКК Й х М х ЖЕ до ОУН о КО АК КЗ КОХ І ММ БО ММК ТО КО 7 КЗ ща З я ї ІЕМ З ОКО ЕХ ТЕ ЕЙ ем ї а я СОЯ сх їх ше Н НЕОох Же й х її : і пр ВХ ї Я ; 5 Що ха 5 ЕЯУ У ї Що АВ т З У ве ї ЩЕ Ма ї ї ЕВ КХ ї тя ЖЖ 2 ї Ж онко х С Що З З о о МН З З сл нн с х КЕ ж х х ВО КК КО срок екевння УК, и й о дннннник МКК я ОКО ММ км ДВ «АК СКОБ ІК ВК і : і і у К а вуах півні йони пін зн нн ни нон т ї Не г 5 1 ще : ке ІЗ
К і. У ДК ККУ ТК ККУ КК КУ ККУ коки їх ! : її с ї ЕЕ б бо в о ВХ Я У в ВХ г ОКОМ у ! 3 с ще З ОО МОХ З хх КУ іх ЕХ тА х ї х3 КО 3 її КЕ ї : : ЕН МКК КК КИ АК МАК ВИК КІ МИ КК ЖЖ ККУ КАК КИ Ж КК М КЗ З - ЕЯ х З Ку ї ї : : ; вжзУ я ї Е ! З Е ї х . іа : й о Бе вне не ин нн о нки ж нн нон І ; і «3 «в вий В Не ів їй НЕ Фігура 24 (Сторінка 1 3 ак В ої вМмсСоге п в в п ОХ ше й З ДК КК КК КК УК КМУ КК КК КК КК КК : у : її ФВ о я А и ИН: і ке о. п Бк и - в
НН . В а ОО р ке ШО ж р їй ї З и А Х не Її аж Е НО ї Я у і йо су со; аку; шах вн нь нн нн в ма вн Мн зн нн х х т ЗХ т ІЗ да З ру К: зах щої са «2 В НЕ НЕ БЕ НЕ Фігура 24, продовження (Сторінка 2 3 4)
Ров. КОНННЛЬ ов в кв и в и в в во ввн З із ї ї ше : зад ї їв у НІ Е їх я ї х І х ї З фо Ж о оо КК ху дк ор ккеї с. х т їх ї хї 4 КУ х КУ «ка У ї ї НКУ : Е. те тин М ух 5 В її ДМК Ки КК НК шо ДК ї 3 В що її. і ово т
М . п 0. аз . а ше Ж ош В їх . о вн Ко шо хх є ше 0 БО її Ве В В ОК КК КК НН ї 5 їх ї ї КЕ х КУ - 5 зак х ї 16 х ;
ії. ХЕ т й ж : КЗ 3 то х ші ші шини: шини шини ше - 3 Е КУ х а Ів Ів ІФ Ів Фігура 24, продовження (Сторінка 53 4 як як х Ж Е 5 х - ї соансом ву. я " - ДЗ Еноя - СОЗНСаВЕНях йо в В Х ух 4 с й їх є о ВА а - : с 5 : е У Я; УЗ хі. Бай Ж З К те ЕХ ок Е же СЯ гу й у рез док й й Я дві шо 0 В що З 5 ВО: АКА сим ЩЕ : я Кк й що МК я решения Еш о Вам жо ВО й ж Бо ; З док й й я : лока меми ВД й Ес - чу І с з пкзх ВУКсере птах В Фігура 25
НИ хм. вУАХ на нн в по а п а х х Я Кк вк Е: їв че ї З 5 КУ х : ! ї ІЗ З ЗАКО ККККАКК ККНХКА Км КАК тю : нк 5 ї 3 шк . ї 3 хо КОВО, ОК ХВОЯ хх х - МО ОХ ХХ Ж Од ГЖЗ З : По ВОК В КК ї хе : шо ш г ше 5 ОО Ва що Мк ії ш . . ї п х З х 5 ї : У З т х : їх ж З 2 ї її Що КУ . З г: Не 5 : Я х х ї 7 дув тур я трюк рт тю ретрт терюттртяї В НЕ І НЕ ІВ Фігура 26 (Сторінка з
В ана все ДОК КК ОО КК КОКО ОО ОО ОК КОКО юю Ком, В і І :ї Хх і - ї із Моя і З Н -3 Е ІЗ ІУ Кк ІЗ х хх х щі гЗ : З : 3 і: ї ї х Її 3 і ї У о Я Х гЗ КУ Е ї її ЖК ж їх ХХ зх Ко й х їх НО о : й Пе З ХЕ ; ще 5 ЗА пд ЩЕ Е ї же - ї 1 ше ЦИ МКК МКК. шиком З : т й ОКО х сх Ка ТК ХУ я Б ЖЕ нання Я Б. - ЗХ Б пок ак. я а пт соя ШИМИ, ЕМО, К Н ОКО СОЯ ОСКІЖОК ше ! її 3 ку Б . ПК М Ж тот ХЕ яки ; х ВН З он ТОЖ їх З ї мету В АК о в я : З : : 32 ї х т х 5 х їх З ІЗ Нео х хе Ух ТЕ хх А Хе Ки Ми Ки. ІЗ Х х і ї ве 5 В х В 3 3 І о х ї ї ІЗ їх А 3 т Х. ни: ї Б ї х 3 ЗМ їх Не - ІЗ Я З ! : З ї ї р.
Р. ї : м х 3 р; ї ї 3 Н ї З й Х Х : В ОХ і ГУ 7 Х х Бу с шк ше сяк ня зах З КУ уся В ГК ці ЕВ ІВ Фігура 26 продовження ітовінка 2
Бо5, Контроль ДК УК КК КК У КАК КК КК КВ КО КК КК КК КК КА КК МКМ их хх З ї оо . . . ! т А ! ї й Ох х її Я шо «сив КВ ВЕ : в: Її Ма в ша З 5 - ЩО ТЕ : шу г я її шк ще т - у Бе х ЩЕ що . о. шЖшх МК І : пре яя тв НО ОО нн і 5 ЕВ х З ІЗ : Е 3 ІЗ з х ЕЗ НЕ З ї Ех - ї в . ну ІЗ нн нн шо р ж ц 3 ; щу х вк ІФ не в Фігура 26, продовження (Сторінка з з 3 Е ж х КЕ : ї ВАН ЗКУ Ж МНН НЯ КУ а В : ВИД З Ж зе о в х З як хз І Жов г: ОК » шо За 5 з ся Ще еліожіжсчстутієдетегчюою їх і я а й й са і УНИ пон ннкнкяктнх ау й я ва ї ко х ул. Ж веж ов й Ж ре нн ж Ж ши , Я ши век - ще КОВІ ; плн нн ДАК ККАККК, Б а ; , ж вух ВМСоге ж рузх МС оте Фігура 57
Ж. же С «Кк А ОА В усе ЕККК КК КК КК КК Ка а ДЕКО КК М КЕ КК Ки КУ т хх й 1 Х отож У Ко їх КУ й й джек КУ х 8 ше 1 Х ко ве ШУ вою о М Фу димхи о Ку З хи ї ї хх дк ки В І ї х МАЕ вея СЯ тя ко і Х ТЕН МЕ виш й : й х с БІ В Її пн СХ ї ї ї хх Те кт й В То ох с МНЕ НН ї х КУ вч ке ж х х Ж З Х Сн ХНУ 1 х КУ Ваш хе с Ка оо Б кОНИЕ: КК : ї водо СУМ Ж КЗ ем Ж. ВПО Кви ї х т С КУ кА ЖЕ Б їх ПО в КИ ІЗ ї з їх ЕХ ї щ й ких З КВ їх 5 З їх ЖОЖ ї З Ко Х о Я ї КЗ Мо Х ВК: ї їх ХО ХЕ Я ї ї ЖК х З: : х У х ЗО ї ву ях КУ Я Я В Е С їх ЖОВ ї 5 щХ х ЗО : їх ХО Х дО ї їх ж: Х ЖК: ї і У ЕЗ Є ї ї я. в ЗМ ГУ МЕ Х Ку ї гу ЗХ й що КЕ 7 кн нн вин нн ння ІЗ й КК, Х ДЕК, Її У сажа. З Во ї Жозе яка Мовою дих Кк Її В кое ОЦЯ шення ї х ЖК з ХМ у ї В с см Ж Х как ої І Ме» т х ЯЗ Кн У ї 5 ХНН КВ Ку т х ЧИМ г й : х : ІНШЕ З Ох її 1 З : Е жо. І Кз ЕЗ пе щи ЕЗ БО : З я кВ кт З г ож З СК і З я ях ст х х ох КЗ "ВН ї З ие їх хоай ї КЗ З Ко Х ве : Е; : х пох З ща ХЕ Сх Ж ККУ Її 5 З х КК я Же х ОУМЯ х КІ ї їх х КО ї й х МУ х З ї КУ ех З В ОХ В їх ї щ З БО Ї З Ех 5 о ЗД х Ж МУК З З ї й : гу ш ї ї гу : х - Х їх : й КУ : х гу - ї КЗ Х : х ЕЗ ї З Х : : дока жи. м упак Ух, Я ЕК Ка ой ХК КИМЕЖ Фігура 28 ВЕ как АХ ВН "Ж подххххуут м у ум КМ КК КК ХХХ Му му м КАК УК УК УК КК КК У ХХ М ХК УК МКК КК КАХ МИ КМ УКХ КК КК ККУ У Яни м п пово в о 55 х хе кухкше Мах ск кр ІЗ хо що дек ї г МК Е жи Ж МЕ Ух Се с я КВ : ЕЕ я НКЮ : НН це т душе КЕ ЕК та Ж й. . . крою .
У . Е ї - од Ж. ї : Як З х х не гм Ко 3 Ще : ї Ен и :
Ме. З х її ве ЗК од ї хх хї х В «Ж вк ЕК Я БУ: х ще ЖОВ ї - їх ож о По ЖЖ ї і; ї пжх їх КК я х х В М ж пк СОУ я МО днк ї що ЩО преююювкнвюя х КК о ОК Зх: я Кк і; хз ки ОХ "Ех о ен І МОЯ с КК М ЗХ СЕК ва ТО КИ хх в же п ВТ ЕУшня МЕ КК: В їх У В й ПО: хі ЕЕ п В х - МІ М ІЗ х. х ОК КО ВНУ КК МК ЗК ВВ х ї о Х ЩЕ хх Мо ЗО Я - ї Б їх 7 а У ї МО Око ох СО З Я ОКХ МОВО ЕВ я ї їх Бах СОНЯ ї ОО Ж хх ї х В Я ї
ШЕ. і ї що Е Е З ще к хе х | | Е їх ІЗ Ї хо ї ї 55 ХЕ ке г х Мо ду ї де ща ї ще ї : 1 се ЯК ї. М ЖИМ ЕЖУ Му У х Не хх КК ї КЕ ОВК із У ТЕ м щ З ІЗ КНх КУ ще В М ї Ха КЕ х нн М НІ І ожини, КК А ск СК СІ Р Кех сте ОКХ ВО Матова щи З х ся ПЕ і п та ї т ж Ж ВЦВК Я З ОЦК КОХ ї их з і со Е о о В Е Щ і ІЗ її С Е т х їх їх У ї ІВ і ї ЕЗ хх У 3 Щ х Е Х хо ї Х ї їх Я Од З - Же х ко З ЩІ сн з ОКУ х я Ох що п ож ОДИН о КО х як Я Пе Ке УХХх: сумки ХК ДК ОК ану ОН ИН ОМ о ННЯ х Ко КОВО к я ще Сн УК КВ Я зай х хе ЦК ЕХ ОХ У ТЕКА ОХ ХО СО Ж х ях й ОХ ОО Я ДЕК ХХХ Зо ЯН КУ хе ПВ ОК ОМ ІЩЕ хм ПК У Х й ВОК З з У КК ООН Х се З ХОМ ШЕВО СПАВ Х ОК х
Зк. З ЖК : М КК Ки ї х ЗХ 55 до І ОВК ї х же 5 ко БУ тлю1 ТЕКИ х х
ЖК. З : ЩА ее - х ХЕ гу Х. Щ х х Б 5 З Во х Е х й ЖЕ Е БУ КУ КУ ЗЕ є ЦЕ х х ж а во ї з в. ЖЛЕМЕКЕ В КЕ: М І З ках ОХ ХКЕ М, я х ВОК МЕ ОЗ КЗ те ОВ в в СК а ВВ В В о ко В В В Ки Я Не, Я а ЕЕ Фігура 23
Е ! ши г ЗХ же Кг Кф Ка ч ще й : " ВУСом - у ї ЕВ с у г ПОН. З ЩЕ : с : | с ві З вне З В осі БУ ОБ я що Б 5 ї 5 Б ж Ще: ЗВО. ОК о ЯК с З Е і «В -е пе нен 0 ж НЕ Ен що шк паку х я Фігура 30 : впрях Я і | шу ї
В. : 5 і бе : БО : ге : зе: т ЗУ і ШІ : С Е З Е ЕВ во ве БО ее Мі і Зо ЗЕ 5 Зх Її ИН : се С З Я : ви ї КЕ В: ОО: З Н ої : ЕЕ ше. :
в. : ше ще ! жо і ВХ М ща ща Е шою. шо ше шк шк ї і З С я 5 Е й і шк кН З : ! й НЕ ше і Я ї - ЗЕ -- КВ КО КОКО Я і : Мчвкі вузи вузюЗ вузи Я ВМО рома ммс рога Е : і Х З й : Фігура 1
Жільки НАВ НБЕМУ Пазмуввний ЗО 0 ВВ пув середевчше Пут 0 Пув Ж о контролх вом о к. пл» ав зх я ово . . ше щ т. г х ЖИМ З ах ть з х с й СЯ Що шо їх З І мн и НН м й й х КУ З ьчу Я | ще че Ки Фігура 32 Наївні миші ДиНКамуцізевов депо ооо Кі В ооо іно в ом ТВОЯ ЗОеТоСТ кКівінп о ой ооо ооо ие Крок Ко оосооо вв е со ос із ще Черває . ш Пепезннкю: ванни і . щш шої Бала м ще Кай НЕ. п щ Щі ії 8083 Пе йон шо щі Й інн В нн шо шщ ШЕ шив шо неп ння ЩЕ Є ЕНН Бе Х В х Я ОДИН ЕК щ ще Щ ї ї З Печінка |і шк з ШЕ МЕ М Фігура 3
Наївні мин ДНиК-еувізавамі МУ КАУ У ВМ УМ АУМХ ч КУ КУ а В ї З Селезінна ватний . .
і. | зантний | й г ше У з ашшш. ей і ї ПУ Ж ї " : х 5 : ї яз . З 12 Печівка І . . в г Я ще що І ша що ї і ї ! а і; сосок вовк ЛИЖАХ ММ їх Коко и МУ Ух УМУУММУХ Мк Е Е х. й фігура 54
В Н : ї ї ! МЕ і : : їх - - ! г У ПЕ : х МО КИЕВ ї : ї ЕК ї ї ІЗ ПОМ К : : ї ОО ї р 0 : Н ЗО Я ТЖЖ ОКХ 1 БЖ ее і : : ОМ і Я ї Я : Бо : : ВХ : Кен : Н ОХ А я 1 5 ЗЕ Ї 2 Я ї МОХ : З : ї о : у ї ї ММ : -Я ї ІЗ КОНИКИ До ще р «ак і : МО ЖрУк Я ке ток ИН ї Ре БУХ КОКОН ци Я з ШЕ 5 ЯН їх ї 3 ЗО : : Я Ов В : ІЗ "В Н ї 3 ПОМ: ї Ох оон : РО ВО : : ї ОК: : і : КЕ Її ї І В еВ : : У ОО. ї о ї ОО.
А ох ооо вв вах ОБ : ї ї ВМ ен: : і Н ПОМ НоВ т ОО Н З ї ВО ! ОО я : І їх с.
ХО. ї "еВ р : : ї ВО Хек : ! Н Н БУ с : Іа Н М. о ОВ.
Я 7 сф с У ії с о 0 Е ШЕ с 0: : ї ї ОО КА КОН ї ї її сфе ОКОКОКВВ ВВ ання КО ВВ киежтююк : р о о о СМС СсОЗеСодь Фігура 55
Ш ен ВУВХ шої ре ШИ смсСовз й . Б що Бо ек ОО о
М о. СПО» НО Фігува 36 ока : : «х ї Яососє Зоо а : ів щ пооідн ГУ Я ж в і ї ох сс Н ши ше Ше м м м ж С Не є В МН . сш ши ши ше ШИ КУ ши и и - ке 5 : Фігува УА Б : ОБ 5 і Її ї йо з соя посооооооюх Мою оо кро В омооююми і В кон нн КН В В М ОК В В СТ : ! 5 єФ аб а : З в «З : ше шк ши и и я С А : Й о мо КЕ а «З на 3 що і . мини: ни С : й о Ба ! ну я шо я : : Фігура 573 - : З я ї акне о : Ж. й 3 вч ЩОМОї бк Що КУ Ме ЕК Я ЕІ КН жо рН Бак ме КА я хі шо в вв Я "кох пок од ооо М ОК меш ово во дод ши НИ ПУ ше Ох М В й М М МОВ о в НН НН НИ пн І и и А із Е Фігура 38
- . ТЕ Я курва ж | Ва Сене ж а гЗ : дО | -е я . 1 ве . о КЕ Як ж зд В дО хх ІК ї сли З дя ПОООЕООНН Я ї- Я сн пов я ші о ЇВ «вве, я се нн пиши я ще мА Фігура 39 ю й шо : око о щтщеа ШЕ | о ШУ С ре Божі я ше ше о.
т г.
ОД . що і ї В ше дики ! ше 0 г: ав її о о Фігура 40
: : В ж День З Е що 1 4 і вдень З х ї ї ЩЕ хе КЕ ї якої і Ох д : го ї яДденвій Е: : З ОК Е ! ої ско тОА і о. я Я в 17 що о : В : - ОО 5 і ; : Я Ї що І щЩ ; РН й щх о : ДО о п - п. о. і УДЕ її щ.
БО М 00000 : шш: Е о с 0: ; КА Я ОХ ОКХ ООН ОО ее ЗО : шк с о. о. о п ! ї Од З ОБОВ ОВ ВОК ОО ї 3 ї о. с с ї і : КО МОЖЕ ХО ЗХ БК КК ЕМО ї : що о 0 щ с і Н ї МОХ жо МК о 5 о п : З Ї ОХ ДОК ОКО ПАК я Н З : п о 0 ОКО у Н і ва п ЩО 5 ОКО 3 Н ММА канти джут АКА ЦК с: ЗИ ї
Зі слу дока ої. - чу ї Меїмуніевані імунізовані в, М и
В. ММ МО м М ОО В МО ОО нн и М В паР 0555 Меєввитена ВІ 3 о с НН о в и М я си а а М М М 777 пдродннамненеван ве Я 8 Гаролинамечн ін скован Межа У осв В В В 5 Я ММ и М М М в и МН КОЛ ВВ Ки ШИ ШИ ДИН ОО и М НН МОМ и НО В я МО и ММ В НН: МБ а а а М ІМ о Пародинамчно в еван ОМС Пдродкнамачне іН'явоа НЕ МС Фігура 42
- ж Мо ід ї о . оте Ще - ши ОК " ж ро ї о шо ! Як НК ИН Е ее зво КЗ щ т Е я В, з з шк, Ії ОА ХЕ Й Фігура 43 Е в е КО навні ше ще несе мана З Ш й І ОО Е ї В я я Її не с А Е жк - ЩЕ ве Км ик о З НК ОК о ши: чОх г о Ук шнек и Ше Ук НК ШЕ ско КЕ Ж ТЕО - (ЗЕ 5 ЗБ ші: | "ШЕ. шк іі Як шо тя Фх чя я А дю фея Мадяй овгий вгий Но -15 СОС ; й х Довти сви з З | : Ководий - : : : БОЇ Поверхнений антен й - 4 ї ! Е й Паверхнавиє литаген Я - -ї . . «2 Е ко З Ше: 5 - З Ж она я ВЕ ж ї М щЕ В дочку | о о в : с о ШЕ ЕЕ дофоо дреоо вв ше хе їх зи ж я ЯОХ я а с свй ЗКоКЕКе кове З о а в ИН НЯ ой Кк Ко ак КИ кА А ее я «А ай че а и шк и в й Я Ов ши В М ах я кій дк -х Я с як «ек Фігура 45 Маяни Доагив о Довга за Коровнй Воля . . - В дян с щ- . ни ; м. шк с. я 0 її о "о нні її ше їж В жом и ни З НИ Ка й ай «8 Кй А а Ка Ж хе а - ши а в не і НИ НЕК у ши а ШЕ, В М М СЕ й си іх -е ек - Фігува 45
Мали ДяивлиВ Довж В.-ТЕ КА а Я 5 досавоввя якою ; З ї Що Поверхневня антиген А - МО ї : т | ! їй МО | х З «ММК х ; с та ! ж чх . - й Ж . : шо в Ба. Я З Ов я Кк. КИ ий Шу Ку й я Ку я Ку - я" ж ка и и хх Ж Я к- чі я я б Фнура 47 Вод Малий Довгий Довгий я Ц.-3Х З З я Її х і Поверхневня антмген Є для : мо З
Бо . . : Б ей і :
Е . . о00є З ще З Я я З Ж: сі ХЕ З З ук З ох Ж Пн ст вик вна вин ши шен ни нн и й КИ ДИН жо осв у йо ж км ек ки ай а ек « си ак НИ я ВДНЯ Кк С а ее хх г т й іч «й «ее Фігура 48
Малий синий злегий В.-й -
АК . ! ом Е : о. Коровий 2 ск сей ; як: Сх В й й ще : не і: пПошерквения внтяген а З ї ; 5 о. ГПрмерроквеави вмунуєн В шо Є : : З Я ; !
й. ХУ З ко : о ОХ Поверхневий зніцтен З хокееії 5 я БУ Понорхвевави амтятен са "ЕЖ 5 ХУ Я ХК М ж ЖК о о с не: Е КЕ МО оо їх | КЕ МО -к У жах Б Б Ж б лухю о 5. 0 ЕВ Е В сх 5 й «Бкріонврт сш А се ши п я ЖК ножа обадою ух ООН. оо АК оо ки АЙ шу а а и и и а М Кк Є ов о о ее , І є ЕН Я а Кк Я - ї як Фігура 49 після З С ; ще «ве Довгий є На Її ї Ве щЕ «еще Довгий -Я Ж ЖЕ - З т жає МапиЙ гу я: ож Ок За ОО Б вк ЗЕ З ща БУ с сх ХО, : Х їж Же мот Ж х ЗК ХК кл оевх у: ПЕК ох З Фігура 50
Довгий З 12 надозу У хх Е: ! т зей Перед ваквинацією Х х Х їх п п і од Дива ної : Ко ; З ЖЖ шо же . ї 1 5 ЯК Гуру Зої 2 ни ШИ т.
ЕЕ. і ЗНО Пішла За жк Ж жо ЕВ па З ЩЕ ек Бе З З. ще - зе Зах З Ж МО сам Ск 1 ща Еш У розведення фігура 5 мие зеножии Я індх овоча ЕУНН: У г ; у І Н й Я ОР й В Шк ск х ї ! ї Я й х Я Ка дов Х ТЯ хх Ко ЯК о У я ук й шко о Я ше я ше с везе Й че Н дон і Мч :ч й ж ЗУ ї Анти з ОСС с НЯ ЗМ В жк ех я Я БЕ : ча У, Я ек ех У Шо че с я С х к с ї са У у, ми іч й Ве о: МВВ нхктанн тях х пи й х що Я а о ще ши ух їж ме ру Кк в ї х шк : й Кк дея 5 : донна я В Фігура 52А
; дак дах де і 10 175 як Дон ох МАО ОМ о о о нен ДН КК В КК ВК ЕК, Ніну 5 Б в М М М М Ех В и я ши ОКО о М В т а Пс су г хох Бай у КК КК с о т КК КК в КК Я В Н І: Е Е ! І: ї Її ї Її Ї В ї ї Ж Ж я ьо ж юБЕ5 Зндопротеовітичний «Вайт розвценнення А ВОВК ооо ооо о в вени: 000 з ще зіни Кн в в в в В Фігура 5283
Поліквонаньна мішванч; м
Ї. З З у іга У ача пеанОокплонанйьне сироватка антитінео МИМО МУМК ММК ЗМ МИ х ї ПОМ К о и КЕНЕ КВК КО М Кн ву Ох х її ще ї й Ж: І с КУ З голка ік мк іх не КЕ Я х Ш пі ІЗ ІТИ ЧИМ КИТ ТОЛЬ З я: ї їх г Е; Ме ЕН ща: х Ж: ї Ку я х Х В: в ГУ як: з х ж З гЗ Я З їх тс Е х НН ї х ЩЕ Дак х х І Е х вне У Жим Х т. пИплИ х Зк оккквке : ЯН о Тени ПНЯ х ї Шо ОБО а ОБ КОКО х Жх 5 х КЗ МЕ їх не . . їх . ЧЕТ КН лине чкований гу ве В З З ї ВОБМ КН: транеднкований ї 25 ї г г ї х ІЗ ХЕ із ї х х її х х їх ї їх ок : гУ І Ж З
К. ОК ІЗ Х У. хх ї х ШЕ я : в ОА, 5 Химия х 5 З во ї ПУХ В ВВ во о Бон їх ТЕ х. ЖК ДЕМКУК НК СХ КК ї Ей | . їй й ее ; ї ДЕ ! ї їй : ДОМІ транефнкований КЕ ТЕХ ІЗ х КЕ З ; ї ГЕН ї х Ех х В х ї х Я. З х. в У, ї Х З х ї КУ їх г У КЕ ї Х х КУ Я ІЗ У КЗ 5 КЗ х КУ х ГУ гу Я х ЕЗ Хо хе З м х З Ох 3 Ж о Х ХК Ка Ж х її и ОО о У х ЕЕ 3 й Вин В зх ї гу ій ї х їг ІЗ З ТІх ІЗ СОКУ дих. ; 5 й ї І й Ж: У УК УФ 555 с х х їх Е УНН леввефнований ї Її у : ї НЕ: ї с Е; З ВЕ хх х й їх З В У Ї Е Х З х З Зх х х ЩЕ з ІЗ В: З Ї ж У Х х ї й СЕЗ таку ІЗ В З Зм ї п ОО х х 7 ЩЕ У о УК ОО своя Х. хх - ія ж 8 в ОО ооо и ес ї т, | ЕІ. ж й гу ЕНН З ВІ ЕХ х 3 ї х ІЗ к хх З хх З : 1 ц Е х «а БК М скит її З х Х вч ї х ВЕН А транофнованив В Б ШЕ ї г КН З щ 1 х КУ КУ ї в. БЕ х ї 5 й В З я З З її ї В Кі й Ї З НЕВШЕ Х ен НК ой Х В Кк х ЕЗ М М М М З з се х ТРОКОЕКВВК КОКО о в о Хх х жу З ХХ 5 Х
Е. НЕК ! ї їв ; х ЕН ІЗ їх ЕЯКУ х «Не х ШЕНЬ: ї ї щі ї
ВЕК. суквнсфріовання Р т ї х ЕЕ ї М Ех х со ї ї КЕ ГУК ІЗ х З 1 ЕЗ х ЕК х ї З х КЕ І х ї РУ Хі х й І 3 Х Ж х В Е хе З Ще го х З ХуккукккккКккк м ммумиМ ЇХ З ж й х ТК КММАММММ ММ Па КЕ о нн МомеМММм Мав гео о МооКллвККи мае Гута ма Фо дух Я Протимишачий СЕНС Фігура 526 о Наше в вн а НИ ЖОВЕННеК в вана кт вне у: 3 5 ж ! ; ! ; КЕ ще КЯ се ше: - її сум КУ і се х ї Ж є м - пе ож 5 х же й Я і: і Ж Ж «дк Те ї Е: ще ще ; ра 25 « Ж за со ен З ШЕ: Е ЕЙ . : З я ж, береш ; х: ати» ди Ї и пе пи ик Я Еш од жи їі КК Дос З АК мк дк ше ай веж жк НЕ есте НН КО Я Ясон х ОКХ Й як ВК х нав ше ни НИ ЕК рних ання нн когуох я деснеж тре є і, я ч сецреесе р й ту ж х їх ж М - те У їх їх Б Тижні тижні Фігура 53А Пестиди генотВН А Пентида енотвну Є ВВ ККУ плн Як ик МЖК ЧИ од ККУ Х ам мк МІХ окон о Е МАМ НОВ ММ СХ З ей Я - : р Е « тв Н Ух в Ї ух ОМ км як ВОЮ і -о В ЩН т шен т рН ГУ ж КЕ Н жо 13. 1 - що і хх ох рі : ОЖ ЕН КЗ Б її : що їі Ж т 5 я оон Ба З я ща а 1 Н ЕН -ощо БКК і т КУ де ЧЗМХЕ її Еш: ее Гі ме М ї: 1 а - КІ ко Й х т: її її ЗУ вк З Ті не ка їі ря З НЕ 3 їі Н ї : Ин ИН и НЕ М і: ; ж ше ШЕ ши ни ШЕ : і 14 ті їі Ї їі і іі Рі Її У і ДІ В: З : ЩЕ її Н : що і ЕІ і НЕ ШЕ : і не я І НН ї н зей 5 ЕН і дХ Кз їх Ки ке Б я ки КЕ ж їз як КОЗй КЗ х ще ЯЗ а УК ях КЗ З шк не ККУ а Ж З З я ї КУ З З ще й ши нн ИН Б миши и су Фігува 53 тки ОЕМ й ск ж ВК КК, ще що КЗ хв МОМКЖЕМХ. Кк х ча зх: м НН шо ї до ВЕЖУ : У її щх з В охо щ їх о ЗЕ - й КОЖ ХЕ Я ї- УКХ 3: ЕЖЗ ше Я т їх - с о ОО МЕ т їж ши . с зє ОЗ її Її іх ще як ЗЕ гу Кк БУ М їх МАО КЗ ж 5 їх ГУ щ 5 КК и ТЕ ї3
Но . З З ще щ СУ хх КОХ «Ж ря 7. Я ЖЕО 2 їж ла ЕНН Б "З роя ТЕО Ж її М Х хІ Бе н ОО к ХХ Ох ТЕ ЗНУ КУУИШЕУ як кщ її ше ЖЕ ОООУ: хх Ох ОХ - ЕКО Ж її У їх т МЕ У ОКУ ТУ Ж ОО ш КЕОЗЇ ЩО ОО м ЕКЗ ЩЕ МЕ Од ТІ ТЕО ЇЕ го З я ОЇ їх її ХЕ що ОЇ 3 хх до. ЕЕ КУ МО ЩЕ па хх І 5 хх ЕВ КУ її т ЗО Ж ТК ХК ак щи Щ КЕ ке ЩЕ ОБ ОО Ж З АХ й: я МК жк кю кююья : її її ЕКО Б КеОЗЕ т КУ ЗКУ КеЗ т пн . ЖЕ ХЕ МОХ ВХ їх їх АБ її ТЕ. ж Вовк ик ши. ОВ УЗ 3 ххх о: Тї У КУ д Де ие Сх т ХХ хх їОоВ їх ЗЕ 5ЮОЖЮ її: КК ух: Ж Ж й їх Хобро ЖЖ БК ОЖЕ жу ТЕ ек хх 3 Ех ре х ОО ух ЖЕО т З с хо жов моні ожнк зннн Занная: Іл 35 3 ХК ОК я 5 ж СК и Ь; уроаююу СН 3 Ох ВЕ хх ш Ж Ж ;; у; Око МОЗ п о ще МОЖ ОМ Ка
Ук. СОЯ МІУ Е Зк ТТ че схе й ВШ неже Ме х. ЕК ПІД МН Др оскжжх ОК с що Ж фе ія жеожу й з Ме Ся вк сл я ВК ЖВ ко яке В и ши В о сх Я - Е Я х КІ му К ЖЕ Х Мох «Ж Як ву БО МОВ 3 У ЗЕ х що хх ха КЕ се м Я ШОЕ хх СТУК йе ек «їх ГУЗННИ ЗУ щі 3: Мк КЕ ІЗ ОВ щ що хро М ї8 що хх ЗК Я ЕХ Я ху х Му КЕ ся ж Ж їх: ХЕ п хх й Ж її КУН ХЕ ЩІ її ка В КО ЗЕ ЯЕНІ І: Я все ж ЕЖУ ЕЕ Щ З 35 53 її вон шини СЕ пон ШЕ ЯЗ ж ЇХ ж екю МОЇ ОО ія - І ЗШ НЕК: ДК юю ОО КЕ КК чн Ж о ІЗ ОЖв ОЗ В 7 Ку ЕК У Кен тн нен ння р хх ТІ Ж М ж Ж 3 де жа п Я х нс У Ж ОО МОЖ її Ех я В ж в ій де ЕК К ОНИ КО МО З ж в 5 Є сна нн Шк Не З ЛОВІ А Я Х ВУ Ж щооводх жа; ен свя зви її ї3 Ж ОБЖ ОБУ КЗ зх Ко юки. ИН ре Пуй НВ Б за Ка ве вьа Му осо Ї З оф те я х: Х хх Еш ЩО п ї ж і В ї ж В з
Я х. хе к с Ох У ; нов : їх с : ж Е Же . Оу З ЖК КЕ 5 53 о. зе: 3 ме ох Е ї іш ш ше ще жі І; ре ЕЕ ггЯ Ек шо. ЕЕ і "7 і | ї ЕЕ: ЕО5 кі ккаквкйа вки ікиюжев : смаки ЖК Зак кова хо аю в я и в я ж фі їх ! І - З ЕЖЗ ще: І ВЗ . | чи Я В: пул Шан Б : Її ї З Ж в УК 33 35 « в АВ х ї ї З шо ж ї гу Ко дах : : «ЯШЕ ЕНН Бо КЕ ї п Ж х жо Ж їх ЕНН Я КЗ СЕЗ Ох ЕН ш Ж. щи БОБ НІ БОБ о вов Бон - Ка Х Ж: | ЗЕ З З ї З СЕ г ї Е сш шини я А Я Ши НЕ ЕЕ | ши - З 1 БОБ : і й ОБО і. ефе кв кою те. джек жому еф ЩЕ: ї Х З м З ТЕ ІЗ ЗЕ Я : -ї : ху 5 х СЕК . Як З х Пув Фігура 5 (прод.
каві Печінки - ВЕ же КВ ах ; ЗМ мс М хе жк Зх ше, Ж Ще Х Я х т нини Ж ЕЗ З у З З х хх р з ; Боже ках 7 З ож т-хах Кі КЕ ой Жоози днем і Ж Еш Ко осот хо 5 ' ї що 00 ре мо М че В рев їв у званою знав засо зар ї їг х ой пан зок зом зовано зааанан І їж й як х, Я ск д щ КО й що о Е" де в Мою а - Б зе МЕ - -Е У хх Фігура 54 за Група і ченю й хх Група З хе СПуУМЛЕКЯ С не і я о у ше я з . ві ЩЕЗ мк й вкя й г я ї Ген х х К: й я . г й БО. Е шен Х ї : с Х | хо й
5. КО - | ке Бах В. а З КОС х | 3 в. З - 5 | - : Я ШЕ Ї шк: 5, щі ен З в ; кучем оо о І хх у Ох УЖ ля сви» т СИ що в НН З ж ни и З КН З Тижні Тижні Фігура 5ББ5А
ДІВ Тек - ГеБНК вот о Я ДОрОмневняИ В еНеУХ а В а очко ВГ вними Є ВЕ Кор ту В ково кпян о ее з Не хлжИиМ лу 2 КО куровик пуп Ко коровийцв ККУ Кк т ов НЕ З вочк , ; 4 5 в : | ВЗ Е ї ве : ш В М і ж Б ТМ З Б вх Як ЕВ : ж СУ її її я й Ям й Е ізаох З ІЗ ве ж о ТЕ що ми НВ жо дах їй те й р Ко як а ч й що гне ме ще МИ НЯ Же Ге Я КЕ ях в М Ех ши ОО ШЕ шо ж я ще що і : ше шк що то тоха па я Ел ЕЯНеК га Е 3 яко шк ме те х хх кою їх 5 їх Ф ще ще Ф 2 З Ф ОЗ ох х в Ше - З Ж" х- Же де У М «ке «Й о «Й «Е З ки «е «г «Кк х Фігура 558 лина нини: мин не я шингпет Дімфовихи бе ї е па ! Ї ВО КО 3 ; е 1 5 З о, ЇВ НЕ і ш В етннм ок кі. с с Сн Ж х : Е у 5 їх є С с ІЗ Ф ї нн а нн ння Ерос коак, совосхх : З в й Фігура 5бА ссаж ; і хаті Гаупа ї- больки Дахи се. а пу ек,
ТЕ. Кг сом» КЗ Іще а Ко аа ПОН КК КУ КК КТК КВК КК к ї Ве кекси М ніше дян В КЕ МОМ ОС Кн г я МК о і З хх й ТО ОД : г То І ІОВ ВІКУ щи її : ЦЕ 532 Х к їх ї . З оо М ВК МИ - І МУКУ с х Ма Ех в ї п КК СВ З У ; КК Мен М УКХ ї Ме М Ко Ка 3 КЕ і; у х її х. ЩІ т її куму уки С. хЕ ее ді їх Їх : ПІ МУ ЩщЩщ Мак щ ЖИМ х йо ; ч Ж ІКТ. . ЩЕ з Я щ я х і; " У НІ : її з Ж в; ЕХ х ХУ ЩІ ЕЗ Б Ж ія х НУ УК М . Щщ п Ж чи ї МУ Я ШІ її т Ж т. я КК оо Ме нн НН НТ я З Н п Б ОМ мезо КЕ Її ЗО феєю ЗИ змен минн джує й Б дк» 3 з «ща. ЕЕ і ЩЕ й І г і ух ДЕ ї і Ош ММ укия КН Е3Я ї - п ІІ - х ку Мп У 1 їі п: КВ ке. КЕ дув ще х КК В Ед ТО БО КЕ Код Й я І: Муки Е М і ІК На х канат ої г З ще КО Ж Хкнкнкнтодденнннн У ЕХ й А КЕ Н ве У ох ЩЕ Но ЕУ М ЖЕ М о У Ж ра гу
В. ЖЖ т : БУ ЕКЗ ВЗ ще З х ВО ї ЗД : ї ЦЯ Вч Я опиннниинннн НК ния, й АННИ пк х А А сек ІЕЕКККЕНВ ВК НК ВН КК ВЕК КН ВК ВЕК КН В КН В ЕК Кк ї В р В ОНИ феекюкююнму Ж Кк ї пох : М пе х Мо ї хе жому М ЩЕ Е ДЗ по й шани ША сш шк ШЕ МН ех У Й ї Б її ва Зв З ЗЕ КЕ З ! ЩЕ же ЕН і НЕ АЗ КУ Кому БЕ І : 3 - НЕ ен ї Я її х. пі У м ух. - КЕ іх хе. ЩА Кк : М Ху М нка Кох іКонеенхєЕ КЕ В я с Ж з щ що " " БУ в Б У Її БК: Ки ТІВ х З їх й т я ЖЕ ТЕЖ: В о ЩІ - БУ о в ЛІЛЕ ТІ КО Щ Щ Ж ІВ вт ї пн, НН НН НН рух Фігура 5ЕВ служ МУ у ск -ї сі З Група 5 - ЗНА ВОНО
Ктх. - и до й сок У Вях ще ; Ной ї. ГМО ЗУ КИКиЯ ссж Я їх БУ Ка «Ж Хе Кх із ЕКЗ ча нн на НК А А НН Н ї : і дних М Ак юу Х дккккнкаккдкккн. В КЕ ї З ОБ що « Е ск М Ї 3 Ї 5 х УЗН ЕН» ЯН. МАЕ ОК ї : М Зі с -Е ще - НЕ ШЕ НУ Бій Мов; кв т МЕ Бі же ун ї х Ко її З. 5 ххх я х ще Щи. ни, хх Е КУА, и КУ Я ОС с 2 ї КЗ ЕІ Хе ач ХХ й вх т они З г; БУ Ї БщЯ І е ї гру . ді г х : В В їЕ нн Б ї Пет ми А) ЕН Е: їх ОК КО СВ ; З й и Ж В хе з хх В ТТ ІЗ ни Ах З я 25 ХА 3 ТА х ги БОЖУ гу - їК ре щ 7. ї ки ЗХ М І че ЩІ ит їх М МЕ. В й КЕ ЩІ сли. Х Кум У УМ У У УУХУ МУКУ Мф КМ УМХ УКХ КУМ УК УУМУХ ДУХУ УМ У УК уми КЕ Ї З дення ІВ докт ххх и ї -5х. її кю Х КУ І У ІЗ М 5 її хи де ях ї ру ї В ху НЯ КУ їх ' ї-Е 3 їх т ЩО ї - її ККУ Я їх х Б «в їх Кк ХХ ї :х В х Бо ТМ х МЕ чу пд 1 їх дай В 7 їх І ее 3 пе НИ жк 15 г НУ КОЕй Х ОО с ї Ан ТО КЕ сени В в 1 ОМ НЕ ооо Я - х З ГУ Б ІХ о «Ж х пенетнВ С и В ЩО Ш КУ ЩІ Ж 3 х Ух Ї М З НУ Бай І ХО ЩЕ я їх й (А МЕ БІ ях І «Ж ЩЕ в ЕЗ М КЗ КУ КЕ С ЦІ «СХ х СЯ ЖЕ У ЩщЩ ЗХ. в Б х БУ БО Ко - ЩІ йо КІ ї З їх ХО. Бе ТЕХ З хі ї ДЕ Ду ТММ УНК КУМ КУМ ЕК М УК х Пн ТЕ ТМ Х М ї ЕН 0 дим ЩЕ дуотооюкнкискнн демчкнкмннккння Я су ї ок тадщі В ї Ії ІЗ І 3 1 Мо х ї хо ХІу ХХХ її о ВО ІЗ МЕ Фа ов з де МОБ ї ОВ і; ї де 8 ІК ли ще НЕ ЕК ї : гою ЩО УХ Б - 5 5 Хе ХЕ З ся ї У Тех у Ід ї ЗАВ х їн ОВ о ЩО у з : КК ня Я М х Хе онкнї НУ я ІВ ї МЕ ни ї Я й КУ у Б: ЗНУ дже омннкнн В Я х хх КУ х НІ с ЖЕ. Ж 5 Щи Конеемоує х З НУ ук ЩЕ ВУ ах 3 І х З пі Б. її з Ки ж ЕІ КЗ с п х їх їх п: ли м Б НІ : ТІ Ж НУ ТЕ З М в НУ - ІК цій У . З тм ж юю юю ж мм мив чесне же ж ОВ Фігура 58С госЯ ї я ВАШ ос зле м й о, Група З ОЗНА ОВ ЕМ щ- см? ІБ ЖЕК а В а он вн В ВК вовк п вп о кв ІК ОК Її ї ЗЕ АН: Кон КЗ нини ТЕ ї но хг Її ма РН ДПУ нннния у М режи СХ ТЕ ї 2 ЕЕ я ї Сх КО ї г й хї Я ооодхояю ої жу ОК ко МНН НИК : : ЖК шої х її ї Х ї г ІЗ ї Е ху ї Я яку КИ ТЕ З 4 КУ КЕ хх ц її: й й Ян : ї Е З КЕ Моск «хі ек їх а ПИШУ Я сих щН І КО хх БА І жах 1 ЩЕ. їК Дн ЕЕ с Кен їх Н У КУ р: ї Х ІН Е З КЕ : с ї В . і Є їх ї її Хоккнкккн М У ї ігенотиий А й Я ЕЯ Во х «Ж Ку ВЗ ї . я я ЕН Бо Мк Ь З їх То Ї т М ї: - КЕ ЩЕ КЕ Б ї ш МК Е . Кк в КЕ Ше ІЗ г ОХ Я - Ух ф Я х. АНА А АААМНАНН АНА ААААААА НАА А ААнню ЕЕ КК еко КК ДАК АКА АК АК АК ву КВК тк ксрнекнекноя В ї - ЕЕ: кока: вені па У ся У Кк ж М З ок їх ї Кк х 8-х "ве І В ТЕ ше КК ї Її Зх ті й й ро ї щ ЕЕе Хей КВ сої ВК їК 5.3, СХ 1: Ве де М ЗК їх КЕ Б гу ох ся їК ЗК ХК З) Ку Кн М : ЕН ї я їх о Її вт В ЩЕ ВЕ Кене М Ко. іенотии С) БУ ща Е ч КЕ ВУ КЕ Б Н й й ях х ОМ ЩІ ї. К АК ї КУ ЗБ їх а М я її З ї В КЕ Е - Б АХ КЕ ВЕеЯ І В Как ЕЯ у и ех ї м і о с ке с ок ск ех Он в в З п М ї КЕ дееюнюютя днк ЗЕ иа: М ох «дах ї т ЖЕ Теща : 5. ї жи я 11 В ВМ Її я Мена НН ї : їжа: пи Ті Ага З ї ЕЕ Ме о фу ; ЕК Ь 5-1 ЗУ СК ЩІ Кошти Б ЗОМ х ЕЕ Хо дк: У Ку х Хосе же, Ку Б Я й ІЗ г ІК КЕ Я Ї а ЩІ й х й ї ї ї 1 іЄ 1 х у 5 У КУ ре Жак м, . х іКомеевесує! й Е Е Кох НІ о ї що і Ко У х БУ НІ КК КЕ Я і В КО ШЕУ Бе В ЗОНУ ек і 3 ІЖщХ « НК У Мх их «ДЕ 3 7 ях ох Фігура 560 Грува 4 ДСНЕВНА З ВЕННВАС І вМСОгО ува ж ВЕРБНУ ЧА Я ВЕРН Я ВА ОО х кВ ; є хо рик Я жк ЗХ еру З Х РУЯ Ве ТЕ я КНУ В А АЛАНА АНА ОА А А А А А А ААА А А А АААААААААААААА АААААААААн вв п ВЕ БК дивне спол й ІЗ І ун 1 пен укл к ї оце 259 ї г В іонна ї х Шок ї що ЕЕ -О-ОЇ ще 1 3 ТЕ Її ГУ схо 8. х КК, я ХХ. Ж Х ї Ух : зга ОА Юр В М Ген о о ем - КК КС: як 3
З. ОА и ї ВІД ЩІ ЯКУ тя ЗКУ ща ї рН М і; Ох, ГК ее М їх ге ОТ ЕХ їх. м хх ї п: ії ОКУ и Мекки ТК, Б: : В з ІЗ К УК д й г
СУ . М Хх я Б ії їх же 5 п Я з Уе е Я Ж щі В дико кни ї. 3 ішнотни й г Е: р. еВ ШЕ В її М х її К їй НЯ ЩІ ще ї ки з І Є М ох НЯ лу 3 Кк ЩО й й ЕН МУ І СН З У КО ВН КВК НК р ет ВК КК КК І УМ дао 5 г з х іо ї : ТЕ он дм ккхкккмоКі укАККАКАХК шен ши: ши Ши ШЕ: ? Б, Е 1 Ес НН З НЕ ЕН а НН: НЕ Я З ще КЕ Ху ї ММ РЕ Ха ЦЕ га (І МЕ ку Якдея У КОЗА г Ковннй ЗЕ: в и ВИН інн ден: ї Зх На Ма В ї БУ МЕ Е З . Гу Ж ЕК ня сна Б З я : З Ж КУ ЧЕ їй ї З пенотни її ще І Ж Б Б НК. Кк ХК М - щ Бе її с 3 КЗ її І КК; М С Кк Ж МЕх Щщ сх щі т. 5 : ОК ЕЕ в о НН ШУ 3 нн в МН НН НН НУ інв кн пп, в, Он СОСОК Б Н й ЕН фот ЩЕ днини думи, У г Й «я СЯ до ск є ДІ ЗЕ 13 ї 5 Мосс ВОЗІ НН о Зх НИ НН НК і - МЕ НН 3 Мо ожкх с 3 Кк Хана ЦІ ср як Зм м ДЕННЯ З на сх 3 че Кк ще МЕ Б ЩЕ Хлумау ї г33 Коня ІА х М АК о : ТВ. ? ях І "З З й хх ї РОК НІ ЇХ З З щ-З з БО ІЗ Й й 5 : ЩІ ще З ЖК о ОК З ; зрмух І щ ке А ВЕ (Конкенеу ЕК ЕЕ: М хо НІ Б: ЗЕ щЕ ; й ЕН БУ ш ТУ ЦЕ в З ЦЕ На З В КУ Но - ї Бе ї і КЕ КЕ НУ ро БЕ Б Щ 27 З он у НН нн на в З В А о о ооо Ех Фігура 56Е
Група й - ЗВ х І ку ох жи зупа 8 - ЗНО В-А г ОНИ рМСОв х ТЕМ КЕН Дао Ше твЕча що ! ФУУУУУМУ УМ УМ УВУ УХ с Й ще сок а й ТКУ ооо вс зрос о ан й х я В й : ЗМ ММ МКМ мм Е й : йй І ще Й деку В йо т. ДЕД КУМ КК Кк ник ш ше Еш р ша КЕ ВУ ї ЯН Їх п НЕННЯ с ї т ще хщо ех Я ікла Е ше ки ші Ше І ША ШН. ваг нале ; й д ТЕ 5 ЗД ше: ко Комуни З іенкнийд; с З ї В дн Бі ве : В В З Б У нти Б ї Її Ж М я ж : В Ух ї Ї КО В З о Ж В як 3 и се НВ ОН: ще щ- : ; В КН ВЕ нКН М ВН ПВ а Е Е ще Е Я І дон тес, ру МО соки Енн нн А: ЕЕ НИ МО ЕК Ди: ВШ ЗНА НН нн ке нку Мел БО ож АБ ша с Я Н Ве ЕТО
Щ і. шк, ші нн. З с дк ре З ж У г З З То сх Ї йенотни 0 З г щ ООН Кер З З Х В Б НУ нянні х ї и Б НІ МА Щ ХЕ щ ва Її щ З І Й ЦП Е її ВОЗ ї ВІ У В й Ж Є т хЖ 3 Ккеке кв Все ЗА Ж й с. ко і ї о в я ІК ща 5 : г КАК х З В ї » Я я пен нини Кв ннния ск с Її же її нен В пні ті ВаВедй БО ОО ЗИ зи БАК г ї Мк аванс НВода т ко ЯКЕ м пон м МНН СЕ зі її : ї Медея ж еВ с. З консенсуе Е. Е і ЩЕ Ї ЖЕ ен " ї : З З Щ пуху Е : : й В ЩЕ Е п Ж г ше х ХХ ї - ї 5 їх ще пока НА НННН В що В ни,чп,ас,МиншинУч ж СВ Фігура 56 з Гек ие Щ препа З о - як Ж Група щей ек х ко а чех Боян я і че ша ШИ Б жея с а в жь Ф ще - Ех хе ой з Е ще Ес
ІН. ее ОК Ж шо : У я - ве жо о І жу х Пр МОВ ем ВВ ооо, м я м я с я З З ; х Ку «о « ее А й : : « « фі ТА
Група Д Група В Група Є ще : : і - д й й Я-е й | І - НОВА Ук я З Кот З ж З хх з з КЕ х я З КК с: З КОНЯ ис в ою я БЕ: ЩЕ СІ щ З ЩО. -е ши ЗУ ЖК х Ж В х Ж ЖК рах З КАК З КВК ; КК
ОВ. ш о. В і КК : КАК ї ОА мех Е З КЗ КЕ З БАХ КЕ: о КО іх З Бо; Б я З ОККО КЕ: АХ Ж: т у Ж х зда. ЖК Х КУ З как р я В Б. З як С. ж ща теж ть ЗА ще ьБА ож Фігура 578 же з ШО: й Я Ж «ох з. ОО г 2 вмів "нн я Я ши. ЗЕ Ж т З ії хз Б в г ря : Ку 281 ХМ щі юю вч ХХ тож в. ж Жх Бон х ре » РУ їх а 3 Я ї Ж Ка Ж ще о Я, Ж ов З в Ж коном Я Я Б кож ре Ж ЕЕ й 5 ї Ж хх вх х шо у ча К-я й: Я Ж в, Ок г З безе з З аж 5 ХВ ва ж а Я я ке Ж - Кен ж. Уа на ек ж зв ке ик х Ех о а бачае ВВ ВВ тні кож ож ож ох в Ж КМ хе се зво М ЗМ Я ва ле и НИ В М НЕ ЗХ уп МУЛ ДЕ. пу наптидх пуд пштти дн о о нн Зно о з А А он ЕЕ Труха її ЗМизани 5 Пиочиєові шатра пути ї Ткоксаха очна ах ах Її ох о Ко о о о о вою КОНУС 5 ПОН го о о о о и КЕШ Б НТ ОВЕН Зо еВ ово Зоо в в Ох ЗОВ о о В пи На ЕН М НН КОМОД а ВН о Зо о і о Ко о о Ко у Ко кон я на нн а ОБ МІК ПК ох зн м в ї гр І КУ ї тав ВК Я КУ ї Н ї Н ї : Коожще зала і жк Її ї ї з. ї : зах ї т док ка хх ї жа ї и нн М а ОО ЕЗОрО ох совок Зоо око оо во оо ооо ово ав Ір и ЗК ооо о о Зо о Ко о КО оо о Ко о о оо Ко оо ооо оо по а В ВІЛЛИ ИИИИ МВП ВИ КИМ ЕК ТИНИ ПИ ИН ОТИТ Б ЖИПЛИПИМИИЙИПИ ПИ ВИПИТИ КИЛИМИ ПИТИ ан В Фігура 5765
С хх Е ОВ Зк г Ме Ж е Е 8 ОТ
5. 28 в З М хв рорукововий У ех. - ОТ НЯ ДО Поверхневий витиген А х секр хх ВІ Поверхньви 38 гЯ 35 пу еко г І УЕ еВЯневий янтван о ж ХХ ОО Е Ох и 555 МОХ чення Е МО оч Еш ВО х : Х ОО Е БВ ПКУ зер ооовозй КН Шен Еш я. З «2 то Є ок щ «Ж - К ж у. Ж що «й У ка й: їх Ж с й - фігура 570 Печінка А хо Не:
(З . 233 х се що й ока Ек ж жж юка жюююююткю КК еня І мллжмуу щ Е до ХХ У у. ДЕК ж й шежстекуу кт и МІНУТАХ у. З ий дя й КУ диеже і Емма оюв тт стю Зх я ох 7 уд ча Ся б олюекиюи вк у до й Том, Зк ВЕ Ж Ям ей ше Ж вх Я Я х дім дик й с КИ ас ха г ще Уа поси секфв п соня хі Ве айс дер вия роса. СВОЮ ли пюмам соя єю . я Ки ї З х ЩО ем дюн А чххя сю я Кен ж р мое Ки чути я УкиМоТЛЬМих х х х 5 х пуття деКаМЕ З пхж ПАЮ - В Е х ЕЗ іу х Я мон нини ванн І х й х г: 5 х й г Е їх В де с х й Ж ВЕ хЕ ГУ Я ш гу дк . ї У іУ Е ї х г щини ук В й 7 їй М х ке джлжкутктткя МОбмакохкх дер ю кю . й ; х т ДИТ ЕЗНИ Ї и пет, Е ве Ж х сюлжтх зжклкхжажаючькя дж и чали ЗК, фо Я щі . даюмм х бе вхо роя Ех : оон З їй уки ОВК ЗЕ двний повинен ПО брендом Же фея пре ОО Ж Ким З реве дих соя п Ше вок Ов и пи ни ДО КОХ Б пес нн ЗМ БЕК МД ВИ АК я НК 8 5 З ІЧ Косова спаси полова шо Й х ХЕ ГУ й Е х х х ще З хх КЕ їЕ х х У 5 ДУ дня КТ км ую х Х Е Кз 5 г З хх т Ка кома ій КУ Е х В х Ім ді Х Я гу -Я х х КЗ Фігура 58 ірі5 РЕМ ; 1 МОЖ АВР У ДААТВУНОСО УУ5ЗКРЕКОМО ТОВ УВМРЬО РЕРОНСКОРА СОДМОММРОМУ ВІ ВЕМЧРКОНУЧИ ААМСВОУСАК РОСТ РНОВ ПОХУЧРОАЛСКО ВТ УВІ РАЯТМН СВО будо Савт роздеплення ши 181 ДеТРІШЕВ Ю ПЕНРОДЕОяК НЕЯМОУМОТА КМОДІОЮВЕУ ВОЦУКРАСОВ ЕВОТУМЕАРИ Кі Саит ровіщеплення нН--
ТВ АВНІЗНЯД НИМ УТМНЄ ДКЕКЕМЕМТ ОКОМ САКЕ МТВ ОА щіЯятімчтоваРУССООМОЦя ТОММаиТВО КРУ ВУЄМ СПІМАВИКЬЕ ВІСКІ,
З ОТ МОР УСРР ТУТОВСКТСТ ТРАВОМЗМЕВ ВОСИТКВ ТМ МСТОНРОя
ЗВ' УУДКАКУЦА ВУХ АВУКЕ ВАВ МКУ І ЗВ ТААЛВАХ ЗИМУ АНОВО УББ,
Д21 ЧЕВСБАУт І ВІНОК ХУ
Фігура БА ; 5 1 МОЖУ М АДАТКУНОЕВМ ПОСКЦОРЦ МО АСКК ВАР ЗУУУУ ТЯМ БІ ББРУСЦЮВОМУ СОКТМЕВ ВОРОТА УЧ НВКЦЕ СИС ДАНОЮ ТМ БРУСВЦНВОВ ТЕТЕТОРОКЕ СТТРАСИЗНОМ ЕВБСССТКРТ ООМСТСРІВ ЗУУМАКАКТ У 151 БУТАБУКЕ ЗВУТЬ ВОК К УСІ УСТ чу ОА УМ УЄ АЮ БУГУ ВЕК ВЧ КС РЖИ БЕ ЮА фігура 598
Вреці ТЕТУ У ААУ УКБОККВО СВО ТМОЗУРМРІ ОЗ ЕРИ РА РУЧНУ А ВЕБЕМЕОНУуУР САРА ШЕСТИ ВНОЮ ОМВО ТТ УЮААРО РАВТМИОКНХ : о Рея Сайт рожневиення рення осоки 1ЕБОРТЕРЕВ ОСБМНеОАНОНЕ ВЕК ОУУМО ТЕНи У ВЕ УКРА ТУМРУВТ пайт розщавзнення -ж-щ-щ-- ТЗ ТАВРО МТА КККНОМЕВТТ ВОКЕР ДАТ ВО ОБАу З УТІМ СОУ АВТСРОЗОМОМОа ІБН КРУ КУМ СІК БД КІ ЗУ УС УС І ТЗТОКОК Стас ВИК БОТИ МОСТОМ ва ЗБ АГА ЦАВУУ УКУС УКУСУ У БИ ТУ М ВУ! УУММУЄ ТАКІ УМ ВеЕЕтТ ЯВКУ БЕ НО ОД Фігура 59С цк 5 УМО КУ дАДТЕУНВЕВ ТК РЦ УЦР ВЕЛЕС БАЛА ВІЧЕ ВІ ВАРТОРОСМЯ ОШЕТОМНЕРТ БСВРЕЮРОХВ УУМСЬКАЕІЕ СЯЬСНЕ ЦОЛЬОЖОСМ ТТ ЦРУСТ РОТ ЗТ ТЯ ЧРОСКТ СТРАСКУТ ЗМ КВБСОСТКРЕ ОССОМОТОТВІР З5УАРАВКЦА НИ ААУ ВУД, ВУ РЕМ ОКО ПАМ УАМУВА КАВИ ЗУ ОРКЬ ВЕРЕС МУ Зі МУ (БО Бк Лі Фігура 550
UAA201503644A 2012-09-19 2013-09-19 Коровий білок вірусу гепатиту b і поверхневий антигенний білок та вакцина, що їх містить UA120909C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/622,965 US9238679B2 (en) 2011-02-11 2012-09-19 Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
PCT/US2013/060618 WO2014047286A1 (en) 2012-09-19 2013-09-19 Hepatitis b virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120909C2 true UA120909C2 (uk) 2020-03-10

Family

ID=48945721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201503644A UA120909C2 (uk) 2012-09-19 2013-09-19 Коровий білок вірусу гепатиту b і поверхневий антигенний білок та вакцина, що їх містить

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9238679B2 (uk)
EP (1) EP2897640B1 (uk)
JP (3) JP6795303B2 (uk)
KR (3) KR102581951B1 (uk)
CN (2) CN107337719B (uk)
AU (1) AU2013318022B2 (uk)
BR (1) BR112015005987A2 (uk)
CA (2) CA2882839C (uk)
EA (2) EA036030B1 (uk)
HK (2) HK1210702A1 (uk)
MX (2) MX363671B (uk)
NZ (1) NZ705526A (uk)
PH (1) PH12015500308A1 (uk)
SG (2) SG10201702325UA (uk)
UA (1) UA120909C2 (uk)
WO (1) WO2014047286A1 (uk)
ZA (1) ZA201501639B (uk)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2827080C (en) 2011-02-11 2022-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis b virus core protein and vaccine comprising the same
CN118063563A (zh) 2016-04-06 2024-05-24 华盛顿大学 用于乙型肝炎病毒（hbv）的使用hbv核心抗原的治疗性疫苗
EP3481433B1 (en) * 2016-07-05 2024-07-03 University of Massachusetts Aav2-mediated gene delivery of sfasl as a neuroprotective therapy in glaucoma
CN106421774B (zh) * 2016-09-08 2019-05-28 中国科学院生物物理研究所 PreS1用于制备乙肝疫苗以及治疗慢性乙型肝炎的用途
CA3037682A1 (en) * 2016-09-21 2018-03-29 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Optimized synthetic consensus inmunogenic compositions targeting fibroblast activation protein
TWI775868B (zh) 2017-06-05 2022-09-01 日商比科爾股份有限公司 用於對ｈｂｖ產生免疫反應之類病毒粒子
CN117866990A (zh) * 2017-11-16 2024-04-12 华盛顿大学 使用HBV包膜蛋白的HBV PreS1和/或PreS2和/或S-HBsAg区域的治疗乙型肝炎病毒（HBV）的疫苗
US20220047695A1 (en) * 2018-12-21 2022-02-17 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Compositions comprising self-assembling vaccines and methods of using the same
KR102175170B1 (ko) * 2019-02-19 2020-11-05 대한민국 HBV enhancer 억제인자 ACK1을 포함하는 B형 간염 치료용 조성물
MA56523A (fr) * 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Combinaison de vaccins contre le virus de l'hépatite b (vhb) et d'anticorps anti-pd-1 ou anti-pd-l1
MX2022003658A (es) 2019-09-30 2022-04-25 Gilead Sciences Inc Vacunas contra el virus de la hepatitis b (vhb) y metodos para tratar el vhb.
CN111494616A (zh) * 2020-04-27 2020-08-07 重庆医科大学附属永川医院 一种新冠病毒免疫增强型基因疫苗及其制备方法
CN116768983A (zh) * 2020-10-28 2023-09-19 王立良 一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的蛋白、编码基因、重组腺相关病毒及其应用
WO2023133509A2 (en) * 2022-01-08 2023-07-13 Carogen Corporation Multi-antigen therapeutic vaccines to treat or prevent chronic hepatitis b virus infection
CN117903323B (zh) * 2024-01-19 2024-08-06 珠海市人民医院 用于靶向降解乙肝病毒s蛋白的药物制剂及用途

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5077044A (en) 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US5643579A (en) 1984-11-01 1997-07-01 American Home Products Corporation Oral vaccines
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US5223424A (en) 1985-09-06 1993-06-29 Prutech Research And Development Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence
US4790987A (en) 1985-11-15 1988-12-13 Research Corporation Viral glycoprotein subunit vaccine
US5310668A (en) 1986-06-20 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine
US5242829A (en) 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
IL86583A0 (en) 1987-06-04 1988-11-15 Molecular Eng Ass Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof
US5294441A (en) 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
US5387744A (en) 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
US5112749A (en) 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
JP3044062B2 (ja) 1989-03-08 2000-05-22 ヘルス・リサーチ・インク 組換えポックスウイルス宿主選択系
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
AU645489B2 (en) 1989-03-31 1994-01-20 Washington University Vaccines containing avirulent phoP-type microorganisms
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
US5294548A (en) 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5462734A (en) 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5240703A (en) 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
US6034298A (en) 1991-08-26 2000-03-07 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US5955088A (en) 1992-02-03 1999-09-21 Cedars-Sinai Medical Center Pharmaceutical compsition of herpes simplex virus type-1 (HSV-1), glycoproteins
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
NZ262582A (en) 1993-01-26 1997-10-24 David B Weiner Compositions and methods for delivery of genetic material
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
AU700371B2 (en) 1993-06-07 1999-01-07 Genentech Inc. Hiv envelope polypeptides
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US6156319A (en) 1994-07-25 2000-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Soluble herpesvirus glycoprotein complex vaccine
NL9401820A (nl) 1994-11-02 1996-06-03 Meyn Maschf Inrichting voor het bewerken van aan zijn poten opgehangen gevogelte.
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5650309A (en) 1995-05-16 1997-07-22 The Regents Of The University Of California Viral vectors
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
CA2266656A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
DE69835761T2 (de) 1997-04-03 2007-09-13 Electrofect As. Verfahren zum verabreichen von pharmazeutischen präparaten und nukleinsäuren an den skelettmuskel
CZ299473B6 (cs) 1997-06-30 2008-08-06 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Nukleová kyselina a elektrické pole jako sdruženýprodukt pro prenos nukleové kyseliny do bunek prícne pruhovaného svalstva
EP2428249B1 (en) 1998-07-13 2015-10-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
US6589529B1 (en) 1998-10-30 2003-07-08 Children's Hospital Medical Center Rotavirus subunit vaccine
US6740323B1 (en) 1999-11-24 2004-05-25 Chiron Corporation HBV/HCV virus-like particle
WO2001038358A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Chiron Corporation Hbv/hcv virus-like particle
AU2001252458A1 (en) 2000-05-05 2001-11-20 Martin Bachmann Molecular antigen arrays and vaccines
JP3543326B2 (ja) 2001-08-30 2004-07-14 ソニー株式会社 情報処理装置および方法、情報処理システム、情報配信装置、記録媒体、並びにプログラム
DE60234375D1 (de) 2001-09-14 2009-12-24 Cytos Biotechnology Ag VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
DK1490100T3 (da) 2002-03-28 2012-03-12 Brenntag Biosector As Kombinerede DNA/proteinvaccinepræparater
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
CN100381463C (zh) 2002-09-18 2008-04-16 中国人民解放军免疫学研究所 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途
US20040175727A1 (en) 2002-11-04 2004-09-09 Advisys, Inc. Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
CA2567324C (en) 2003-05-30 2012-01-03 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
NZ570709A (en) 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
DE10339927A1 (de) * 2003-08-29 2005-03-24 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen
KR20050026681A (ko) * 2003-09-09 2005-03-15 학교법인 포항공과대학교 서방성 미립구 형태의 ｉｌ-12 면역증강제를 포함하는백신 조성물
US20060024670A1 (en) 2004-05-18 2006-02-02 Luke Catherine J Influenza virus vaccine composition and methods of use
JP2008500364A (ja) * 2004-05-25 2008-01-10 キメラコア， インコーポレイテッド 自己集合性ナノ粒子薬物送達システム
CN101421402A (zh) * 2006-01-11 2009-04-29 分子作物育种代理有限公司 产生转基因禾本科细胞和植物的方法
DK2399602T3 (en) * 2006-06-02 2015-02-23 Int Aids Vaccine Initiative HIV-1 clade-A CONSENSUS SEQUENCES, ANTIGENS AND TRAN GENES
WO2008089144A2 (en) 2007-01-12 2008-07-24 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Improved dna vaccination protocols
KR100836745B1 (ko) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 Ｈｂｖ 백신 및 그의 제조 방법
US8748373B2 (en) * 2007-02-21 2014-06-10 Fox Chase Cancer Center Hepatitis B virus compositions and methods of use
PT2153260T (pt) 2007-05-23 2017-04-24 Vgxi Inc Composição que compreende uma alta concentração de moléculas biologicamente ativas e processos de preparação da mesma
US20090214593A1 (en) 2007-08-16 2009-08-27 Tripep Ab Immunogen platform
US8138318B2 (en) * 2007-09-13 2012-03-20 Abbott Laboratories Hepatitis B pre-S2 nucleic acid
KR101686942B1 (ko) 2008-01-11 2016-12-28 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 뎅기 바이러스 다중 서브타입에 대항하는 신규한 백신
EP2331123A4 (en) * 2008-07-24 2012-11-07 Aduro Biotech COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEPATITIS C
WO2010016071A2 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Swati Subodh Identification of genomic signature for differentiating highly similar sequence variants of an organism
WO2010042751A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
JP5753090B2 (ja) * 2008-10-29 2015-07-22 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 改良型ｈｃｖワクチンおよびその使用方法
EP2358733B1 (en) * 2008-11-17 2015-07-08 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Antigens that elicit immune response against flavivirus and methods of using same
CN101502650B (zh) 2009-03-10 2011-12-28 邢益平 密码子优化的乙型肝炎核酸疫苗
WO2010127115A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) Modified immunization vectors
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
CN101954093A (zh) * 2010-09-14 2011-01-26 中国人民解放军第二军医大学 乙型肝炎核酸疫苗及其构建方法
CA2827080C (en) * 2011-02-11 2022-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis b virus core protein and vaccine comprising the same
AU2012214394B2 (en) * 2011-02-12 2016-08-11 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis B infection

Also Published As

Publication number Publication date
PH12015500308B1 (en) 2015-04-20
JP2019163286A (ja) 2019-09-26
KR20150056611A (ko) 2015-05-26
EP2897640B1 (en) 2022-03-23
HK1210702A1 (en) 2016-05-06
HK1246318A1 (zh) 2018-09-07
MX2019003615A (es) 2019-07-18
CN107337719A (zh) 2017-11-10
EA202090759A2 (ru) 2020-07-31
CN104640565B (zh) 2017-09-05
US9675690B2 (en) 2017-06-13
JP2015530410A (ja) 2015-10-15
US20130209395A1 (en) 2013-08-15
AU2013318022B2 (en) 2017-03-09
JP6795303B2 (ja) 2020-12-02
CA2882839C (en) 2022-07-05
ZA201501639B (en) 2016-01-27
EP2897640A1 (en) 2015-07-29
SG11201502113YA (en) 2015-05-28
JP7050310B2 (ja) 2022-04-08
PH12015500308A1 (en) 2015-04-20
MX363671B (es) 2019-03-29
KR102382942B1 (ko) 2022-04-05
KR20220045080A (ko) 2022-04-12
US9238679B2 (en) 2016-01-19
EP2897640A4 (en) 2016-09-07
MX2015003489A (es) 2015-06-22
BR112015005987A2 (pt) 2017-08-08
EA036030B1 (ru) 2020-09-16
KR102581951B1 (ko) 2023-09-22
CN107337719B (zh) 2022-01-04
CA3158935A1 (en) 2014-03-27
SG10201702325UA (en) 2017-04-27
US20160114030A1 (en) 2016-04-28
NZ705526A (en) 2016-01-29
CN104640565A (zh) 2015-05-20
WO2014047286A1 (en) 2014-03-27
EA202090759A3 (ru) 2020-10-30
AU2013318022A1 (en) 2015-03-19
JP2022084800A (ja) 2022-06-07
KR20230141895A (ko) 2023-10-10
EA201590597A1 (ru) 2015-11-30
CA2882839A1 (en) 2014-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120909C2 (uk) Коровий білок вірусу гепатиту b і поверхневий антигенний білок та вакцина, що їх містить
KR20210092762A (ko) 아프리카 돼지 열병 바이러스에 대한 면역원성 조성물
EP1090033B2 (en) Particles of hcv envelope proteins: use for vaccination
EP3094652B1 (en) Novel vaccines against hpv and hpv-related diseases
JP2023524054A (ja) ベータコロナウイルスの予防と治療
KR102375328B1 (ko) Tert 면역원성 조성물 및 이를 이용한 치료 방법
US20240226291A9 (en) Combination of novel vaccines against zika virus and dna antibody constructs for use against zika virus
AU2021201586A1 (en) DNA antibody constructs and method of using same
CN101072585A (zh) 产生免疫应答的组合方法
JP2002500502A (ja) 合成ｃ型肝炎遺伝子
CN113666990A (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
US20230212267A1 (en) Dna antibody constructs for use against sars-cov-2
KR20230042222A (ko) 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(sars-cov-2) 폴리펩티드 및 백신 목적을 위한 이의 용도
KR20200001671A (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물
EP2892561A1 (en) Hiv vaccine compositions and methods
Kumar et al. Immunogenicity testing of a novel engineered HIV-1 envelope gp140 DNA vaccine construct
Fournillier et al. Modulation of immune responses to hepatitis C virus envelope E2 protein following injection of plasmid DNA using single or combined delivery routes
US20240010739A1 (en) Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes
CN117177763A (zh) 用于增强疫苗接种期间的t细胞启动的病毒构建体
Ghorbani et al. Comparison of antibody-and cell-mediated immune responses after intramuscular hepatitis C immunizations of BALB/c mice
KR20220041079A (ko) B형 간염 바이러스(hbv) 백신 및 항-pd-1 항체의 조합
KR20210021008A (ko) 생체내 번역후 변형을 위한 조성물 및 방법
Bosch-Camós et al. Identification of Promiscuous African Swine Fever Virus T-Cell Determinants Using a Multiple Technical Approach. Vaccines 2021, 9, 29
US20240181044A1 (en) Glycan modified spike receptor binding domain nanoparticles and method of use thereof as a coronavirus disease 2019 (covid-19) vaccine
CN116744966A (zh) Dna编码的用于抵抗sars-cov-2的抗体