CN101023177A - 非－整合型以及非－复制型慢病毒，制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非－整合型以及非－复制型重组慢病毒及其应用，尤其是用于制备体外，离体或体内转移基因的组合物。本发明可用于在任意哺乳动物的例如肝脏，肌肉，胰腺或中枢神经系统(包括眼球)组织或细胞中转移基因，并且尤其是用于治疗诸如例如，中枢神经系统，包括眼球失调的失调或病变。

Description

非-整合型以及非-复制型慢病毒，制剂及其应用

本发明描述了非-整合型以及非-复制型重组慢病毒及其应用，尤其是用于制备体外，离体或体内转移基因的组合物。本发明可用于在任意哺乳动物的例如肝脏，肌肉，胰腺或中枢神经系统(包括眼球)组织或细胞中转移基因，并且尤其是用于治疗诸如例如，中枢神经系统，包括眼球失调的失调或病变。

转移神经系统中的基因有许多应用价值，尤其是在实验(例如研究)以及治疗领域。因此，这种转移可以进行标记，毒性，特性，病理学模型的构建，缺陷的修复，治疗性产物(例如蛋白，RNAs等等)等的表达的研究。

已经考虑了现有技术中用于这种转移诸如利用病毒载体(逆转录病毒，AAV，腺病毒等)，质粒的注射，细胞移植，植入包胶的细胞等的不同方法。每一种的这些技术在效率，安全性，工业用途，选择性，稳定性等方面既有优点也有缺点。因此，病毒载体的应用在与病毒的自然感染特性相关的转换效率方面是有益的。

在这方面，来源于原癌逆转录病毒的很多逆转录病毒载体可以将转基因整合到靶细胞的基因组中，但是这些载体只能转导分裂细胞。这种局限性限制了他们在离体转移基因或向有丝分裂活跃的细胞的器官转移基因的应用。

为了克服这个障碍，已经开始考虑利用来源于慢病毒的载体。与目前研究的其它病毒载体有关的慢病毒载体提供了包括容易生产以及对其的生物学的认识逐渐提高的若干实用性的优点。这些载体被广泛用于实验性基因治疗方案范畴的基因转移。他们可高效地转导很多细胞类型，尤其是中枢神经系统的休眠细胞。实际上，慢病毒是能够向有丝分裂不活跃的细胞整合基因组的复合物逆转录病毒。这些慢病毒的实例是HIV-1，HIV-2，SIV，FIV，BIV，VISNA，CAEV以及EIAV病毒。然而，与逆转录病毒，尤其是慢病毒有关的一个缺点特别在于它们具有插入诱变的潜在危险，因为它们整合在转导细胞的染色质中，并且以明显优选的方式整合在编码序列中。到目前为止，这个缺点已经限制了这类载体在体内转移基因中的利用。

为了降低作为这些载体在临床上应用的主要障碍的插入诱变的危险，本发明的发明人开发了非整合型以及非复制型慢病毒载体。因此，这种新一代慢病毒载体的非整合型特性在生物安全方面，尤其是基因治疗方面有相当大的进步。这种载体可用于例如在不分裂的细胞中稳定表达转基因或其它核酸，或用于瞬时表达对其它转染方法乃至通过其它载体转导的方法有抗性的分裂细胞中的基因。

非-整合型载体是本领域已知的，最常见的是腺病毒载体以及疱疹病毒载体。然而，对于这些类型的载体而言，目前不存在可以批量获得不含全部复制型污染物的产物的生产方法。作为整合型载体，AAV载体尽管只以相对低频率(约10％)整合，但是受到可以被克隆的转基因的大小以及在插入位点引起的突变的限制。

因此本发明提供了对现有技术所存在的技术问题的解决方案，并提供了在神经系统中转移基因的新型手段以及载体。

本发明尤其涉及非-复制型以及非-整合型重组慢病毒的完善。

通常，本发明的慢病毒包含突变的整合酶以及特定的重组基因组。更优选地，本发明的慢病毒包含(i)含有如下序列的重组基因组，在LTR5’和3’慢病毒序列之间的慢病毒衣壳化psi序列，RNA核输出元件，转基因以及可能的启动子和/或辅助核输入RNA的序列，以及(ii)阻止所述基因组整合到宿主细胞的基因组的突变的整合酶。在本发明一个特定的实施方案中，重组基因组含有例如，序列5’LTR-psi-RRE-cPPT CTS-转基因-LTR3’。

本发明的另一个目的涉及含有本发明的慢病毒以及药用赋形剂的任意的药物组合物(包括疫苗组合物)。

本发明也涉及体外，离体以及体内转移特定细胞群中的靶基因的方法以及组合物，以及治疗失调，例如中枢神经系统，包括眼系统的失调。

本发明的另一个目的涉及如上定义的非-整合型以及非-复制型慢病毒在制备用于在哺乳动物细胞(优选人)中转移基因，优选地在来自受试者的中枢神经系统(包括眼球)的细胞中体外，离体或体内转移基因的组合物中的应用。

本发明的目的还涉及生产如上所定义的非-复制型和非-整合型慢病毒的任一方法，包括尤其是向细胞中导入包括如上所定义的存在合适的反式互补功能的重组基因组的载体质粒，尤其是编码以上定义的修饰的整合酶的慢病毒pol区域。该方法可以通过瞬时转染不同的反式互补和包膜质粒，或在辅助病毒存在下和/或在表达一种或多种互补蛋白的细胞系中实现。

本发明还涉及以稳定的方式表达优选慢病毒整合酶的细胞系，所述整合酶含有诱导所述整合酶的整合功能的丧失的突变。在本发明意义上的突变可以对应于整合酶的点突变和/或某些碱基的微删除。优选地对应于影响整合酶的碱性区域，C-末端区域(例如C-末端区域的碱性区域)和/或催化位点的一或多个点突变，所述突变的整合酶缺乏整合功能。

因此本发明的一个特定目的涉及制备非-复制型和非-整合型重组慢病毒的方法，所述方法包括利用非-整合型和非-复制型慢病毒载体系统转染细胞，所述载体系统含有：

a)反式互补质粒，缺乏任意psi衣壳化信号并含有慢病毒gag序列和编码无整合功能的整合酶的突变的慢病毒pol序列，所述质粒可能是删除了辅助基因诸如vif，nef，vpu和/或vpr，

b)包括启动子-env-PolyA序列的包膜质粒，和

c)慢病毒载体质粒，包括在慢病毒LTR5’和3’序列之间的重组基因组，慢病毒衣壳化psi序列，RNA核输出元件，转基因，和可能的启动子和/或辅助核输入RNA的序列，以及阻止所述基因组整合到宿主细胞基因组的突变的整合酶，所述载体缺乏慢病毒的任一编码序列，

以及回收所产生的慢病毒。

发明详述

本发明描述了能够在任意哺乳动物细胞，尤其是人细胞中转移基因的非-整合型和非-复制型重组慢病毒。这些可以是分裂细胞或休眠细胞，属于中心器官或末梢器官，诸如肝脏，胰腺，肌肉，心脏等的细胞。本发明的一个特定目的涉及在神经系统(包括视觉系统)尤其是神经元中，星形胶质细胞并和视网膜细胞，以及癌性肿瘤中转移基因。这些慢病毒载体可用于体内转移和表达核酸序列，尤其是在神经系统中。

载体的一般结构

与其它逆转录病毒类似，慢病毒具有侧接两个LTR(长末端重复序列)序列的gag，pol和env基因。这些基因的每一个编码最初以单个前体多肽形式表达的多种蛋白。gag基因编码内部结构蛋白(衣壳和核衣壳)。pol基因编码反转录酶，整合酶和蛋白酶。env基因编码病毒包膜糖蛋白。此外，慢病毒基因组含有用于从核输出将被包装的病毒基因组RNA的顺式作用RRE(Rev效应元件)元件。LTR5’和3’序列用来促进病毒RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他的顺式作用序列。基因组的反转录(RNAt引物的键合位点)以及病毒RNA在颗粒中的衣壳化(Ψ位点)所需的序列与LTR5′相邻接。如果病毒基因组缺乏衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装在传染性病毒粒子中)所需的序列，基因组RNA将不会被主动包装。此外，慢病毒基因组含有诸如vif，vpr，vpu，nef，TAT，REV等的辅助基因。

用于基因转移应用的慢病毒载体的构建例如描述在美国专利5,665,577，EP 386 882，美国5,981,276，US 6,013,516或专利申请WO99/58701和W002/097104中。这些载体包括有缺陷的慢病毒基因组，即其中gag，pol和env基因至少之一已被灭活或缺失。

本发明的慢病毒载体是非-复制型和非-整合型重组慢病毒，即不能自主复制和特异性整合在转导的细胞中。尤其，本发明涉及含有重组基因组的非-复制型和非-整合型重组慢病毒，所述重组基因组在LTR5’和3’慢病毒序列之间含有慢病毒衣壳化psi序列，和RNA核输出元件，转基因以及可能的启动子和/或辅助核输入RNA的序列，以及阻止所述基因组整合到宿主细胞的基因组中的突变的整合酶。本发明的慢病毒可以包括，例如5’LTR-psi-RRE-cPPT CTS-转基因-LTR3’序列。

本发明的一个特定的目的涉及其中基因组优选缺乏任意编码慢病毒的序列的慢病毒。

本发明的慢病毒的一个重要特征是它们包含修饰的整合酶的事实。本发明第一次显示可以在用于表达转基因的条件下有效地产生整合特性改变的非-复制型重组慢病毒。修饰的整合酶的存在源于为了产生本发明的病毒使用修饰的pol序列以便产生无整合功能，但是对于细胞转导期间(所谓的1类突变)的载体循环的在前步骤没有任何显著的影响的整合酶。因此，所获得的载体具有游离体表型，以至于优选地，整合酶的突变不阻止基因组向核的发展，也不阻止其线形DNA基因组形式的逆转录，所述线形DNA基因组能因此成环(形成圆)。在本发明的意义上，1类突变优选地由一或多个点突变组成，优选地影响编码整合酶的碱性区域部分，C-末端区域(优选地C-末端区域的碱性区域)和/或的催化位点的核酸。点突变优选地对应于由另一个整合酶的编码序列替代氨基酸。优选地，突变在使整合酶无整合功能的意义上是非保守的。这种突变优选地选自产生无整合功能的整合酶，同时保存整合酶的其它功能，例如参与载体向核的发展的突变体。影响HIV-1并可以获得无整合功能的整合酶的突变的实例如下所列：

H12N，H12C，H16C，H16V，S81R，D41A，K42A，H51A，Q53C，D55V，D64E，D64V，E69A，K71A，E85A，E87A，D116N，D1161，D116A，N120G，N1201，N120E，E152G，E152A，D-35-E，K156E，K156A，E157A，K159E，K159A，K160A，R166A，D167A，E170A，H171A，K173A，K186Q，K186T(C-末端碱性区域的L区域)，K188T，E198A，R199C，R199T，R199A，D202A，K211A，Q214L(214和216属于C-末端碱性区域的Q区域)，Q216L，Q221L，W235F，W235E，K236S，K236A，K246A，G247W，D253A，R262A，R263A(C-末端碱性区域的N区)以及K264H。

影响催化位点的突变在HIV-1方面优选地与整合酶的氨基酸64，116和/或152有关。影响该慢病毒C-末端部分的突变优选地选自由AAH取代₂₆₂RRK基序，Q区域(Q214L和/或Q216L)，L区域(K186)和/或L区域中的取代。优选的突变由AAH取代₂₆₂RRK基序组成。

本发明的慢病毒通常包括具有5′LTR-psi-RRE-cPPT CTS-(启动子)-转基因-LTR3′序列的重组基因组。转基因通常置于启动子的控制下。一个和/或其它的还可以置于cPPT CTS元件的上游。

因此重组基因组包括可用于衣壳化以及用于转导的顺式作用病毒序列。有利地，它仅仅保留某些慢病毒序列，尤其是

-那些基因组衣壳化所需的序列(慢病毒来源的psi序列)；

-RNA核输出元件。后者优选地选自慢病毒基因组的REV效应元件(“REV应答元件的RRE序列)，尤其是VIH，例如VIH-1(存在于病毒RNA上，与REV调控元件相互作用的RRE序列)，Mason Pfizer猴病毒的CTE(“组成性输送元件”)，SIV，HIV-2或FIV核输出系统，或相当于任意其它逆转录病毒的元件(例如SIV，HIV2或FIV核输出系统)；

-辅助RNA核输入的序列，例如flap序列[cPPT-CTS区域(中心多嘌呤区域-中心终止序列)；参照Charneau等，Journal of Virology，1992，5月；WO 01/27304]，其可以有效地向核内输入逆转录本载体基因组；以及

-干涉包装的载体RNA的转录的可能修饰的LTR5’和3’。

重组基因组优选地删除了全部慢病毒编码序列，尤其是编码gag，pol以及env序列和vif，vpr，vpu和nef辅助基因的病毒基因。反式互补质粒优选保留tat以及rev基因。载体质粒优选可包括删除了U3增强子序列LTR3’(W099/31251)，以便改进转基因的表达以及载体的安全。

另一个靶可能是除整合酶突变之外的突变：位于DNA线性基因组末端的att序列。如果突变这些序列，整合酶对基因组的作用不再正确发生，并且不再整合。以线形DNA本身形式存在的基因组可以成环。

本发明的载体和质粒可以制备自属于不同种类的慢病毒，尤其是HIV-1，HIV-2，SIV，FIV，BIV，VISNA，CAEV和EIAV。尤其优选的血清型是HIV，尤其是HIV-1，FIV，EIAV和SIV。

转基因的序列可以置于所选择的启动子和/或增强子以及良好表达所述转基因所需的所有转录，转录后以及翻译后调控元件的控制下。

在本发明的意义上，术语“转基因”是指任意编码或非-编码核酸。可以是非-编码序列诸如，例如酶识别序列(特异性整合位点，显示对于蛋白具有特定亲和性的位点，等等)。优选是编码给定多肽或因此活化的RNA的序列。可以尤其是DNAc，DNAg，合成DNA，RNA，例如干扰物RNA，核酶等等，后者的组合。通常，转基因是包括编码所需的表达产物的序列的DNA。此外，转基因可以包括一或多个转录终止区域，通常是聚腺苷酸化信号。

转基因可以选自催化核酸(干扰物，反义，核酶)，自杀核酸(例如，编码毒素)或编码生物学活性肽的核酸，例如生长因子，营养因子，抗-血管生成因子，激素，细胞因子，抗体，受体，分化因子，集落刺激因子，抗-癌因子，酶，神经介质或其前体，等。

根据本发明的一个特定的实施方案，转基因编码例如以下营养因子：CNTF，NGF，NT3，NT4，FGF，PDGF，GDNF，等，或抗-血管生成因子或修复缺陷代谢活性或提供特定的代谢功能的酶，例如：TH，AADC，GTPC，β-葡糖苷酸酶等的酶。

根据本发明另一个特定的实施方案，转基因编码，例如，可以特异性抑制参与显性遗传病或由功能增益诱导的疾病的突变蛋白表达的干扰物RNAs(RNAi)，所述疾病例如为神经退行性疾病诸如突变的SOD(肌萎缩性侧索硬化)，APP，tau，早老素(presenilin)或BACE(阿兹海默氏症)蛋白，α-核突触蛋白(帕金森氏症)或亨丁顿舞蹈症(亨丁顿舞蹈症)。

转基因通常置于与转基因同源或异源的转录启动子，例如细胞，病毒，合成的，嵌合启动子等的控制下。所使用的启动子可以是组成性的或微弱或强烈组织特异性或遍在调节的，取决于2或3RNA聚合酶等。通常使用病毒启动子诸如CMV，RSV LTR，TK，等或优选细胞启动子，诸如PGK，Rho，EFlα等。可以使用特异性组织启动子。这些可以是例如ENO，GFAP，NSE启动子，RNA聚合酶III启动子诸如U6或H1启动子，有可能是修饰的，等等。用于指导转基因表达的启动子可以是例如，选自CMV，TK或RSV LTR基因的启动子的病毒启动子。

存在于包膜质粒中的启动子和/或存在于载体质粒中的启动子相同或者不同并且是细胞的或病毒的。

产生非-整合型以及非-复制型慢病毒载体

本发明的慢病毒载体可以不同的方法，由瞬时转染在稳定的细胞系中和/或通过辅助细胞制备。

根据尤其优选的实施方案，本发明的方法提供了最少三种质粒(参照图1)的组合以便产生重组病毒粒子或者重组慢病毒：

a)缺乏任意psi衣壳化信号并含有慢病毒gag序列以及编码无整合功能的整合酶的突变的慢病毒pol序列的反式互补质粒，所述质粒可能删除了vif，nef，vpu和/或vpr辅助基因，

b)包膜质粒，包括启动子-env-PolyA序列，以及

c)慢病毒载体质粒，包括重组基因组，可能是删除了LTR3′的启动子区域或者LTR3’U3增强子序列，包括慢病毒LTR5’和3’序列之间的慢病毒衣壳化psi序列，RNA核输出元件(优选HIV RRE或者来自任意其它逆转录病毒的等同元件)，转基因以及可能的启动子和/或辅助核输入(例如cPPT CTS序列)RNA的序列，以及阻止所述基因组整合到宿主细胞的基因组的突变的整合酶，所述载体缺乏慢病毒的所有编码序列，

以及回收慢病毒产物。

有利地，所使用的三种质粒不包括足以能够实现重组的所有同源序列。gag，pol和env编码核酸优选地可以是根据传统方法从可获自现有技术以及数据库，和实施例中列举的病毒基因的序列制备的DNA。

反式互补质粒提供了编码gag和pol慢病毒蛋白的核酸。这些蛋白来源于慢病毒以及优选地来源于VIH-1。质粒缺乏所有的衣壳化序列，包膜的编码序列，辅助基因，并且优选地还缺乏慢病毒LTRs。为此，编码gag和pol蛋白的序列被优选置于例如细胞，病毒等的异源启动子的控制下，所述启动子可以是组成性的或者较弱或者较强调控性的。优选为包括CMV-Δpsi-gag-pol-PolyA序列的反式互补质粒。该质粒可以表达所有形成除包膜糖蛋白以外的空病毒粒子所需的蛋白。该反式互补质粒优选包括TAT和REV基因。此外，该反式互补质粒还可以包括选自WPRE，APP5’UTR，TAU3’UTR和染色质隔离序列诸如MAR(基质连接区域)，SAR(支架连接区域)，scs和scs’(特殊的染色质结构)等的转录调节元件。优选地，其缺少vif，vpr，vpu和/或nef辅助基因。当然，gag和pol基因以及TAT和REV基因还可以由可能是分离的不同质粒携带。在这种情况下，使用若干反式互补质粒，每一个编码一种或多种所述蛋白。

反式互补质粒的pol序列中的突变由优选在影响碱性区域，羧基末端区域(例如C-末端区域的碱性区域)，和/或编码如上定义的整合酶序列的催化区域的一或多个点突变中的若干碱基的一或多个微缺失组成。

包膜质粒提供了可以产生所选择的包膜(env)糖蛋白的核酸。其缺乏任意psi衣壳化信号，gag或者pol编码序列，并且还缺乏慢病毒LTRs。其包括启动子-env-PolyA序列。

现有技术中描述的假型VIH-1载体(包括不同于野生型包膜的包膜，例如来源于另一个病毒，或者是细胞来源，并且因此具有修饰的趋向性)包括水疱性口腔炎病毒(VSV)的包膜糖蛋白。该包膜具有诸如抗超速离心和具有非常广泛的趋向性的有益特性。与其他诸如典型的逆转录病毒(双向性和亲嗜性MLV逆转录病毒或者VIH gp120，也包括很多其他的病毒)的包膜不同，在超速离心后VSV糖蛋白是稳定的。因此可以用来浓缩病毒上清液并且可以获得高水平的感染。此外，这种包膜产生具有非常宽的趋向性的病毒粒子，尤其是在体外，能够感染许多细胞类型。该包膜的受体为存在于不同类型的多种细胞表面上的磷脂酰丝氨酸基序。

水疱性口腔炎病毒(VSV-G)的包膜(env)糖蛋白被优选用于本发明的上下文，但是可以使用任意其它的假类型以便更好地靶向某些细胞群。因此，包膜蛋白可以选自任意包膜病毒的包膜糖蛋白，例如弹状病毒包膜蛋白，更优选狂犬病毒，并且甚至更优选狂犬病病毒的血清群病毒：Rabies(RAB)，Duvenhague(DUV)，European蝠1型(EB-1)，European bat2型(EB-2)，Kotonkan(KOT)，Lagos bat(LB)，Obodhiang(OBD)，Rochambeau(RBU)，来自Mokola病毒(MOK)的血清群的病毒的包膜蛋白和这些包膜的任意嵌合组合。尤其优选Rabies和Mokola病。事实上它们在动物体内具有非常特异于神经系统(参照WO 02/097104)的趋向性。此外，这类包膜可以靶向细胞，尤其是靶向星形类型的胶质细胞。

在一个优选的实施方案中，本发明采用慢病毒载体，例如具有rabies或者Mokola病毒包膜的假型病毒VIH-1型。

本发明的载体质粒包括重组核酸，所述重组核酸含有LTR5’和3’psi元件之间的RRE(或者另一逆转录病毒的等价元件)，转基因以及可能的启动子和/或flap序列，cPPT CTS的。其例如可以包括序列5’LTR-psi-RRE-cPPT CTS-(启动子-)转基因-LTR3′。转基因的序列可能置于载体质粒内，在启动子和/或增强子，以及良好表达该基因所需的所有转录，转录后和转导后调控元件的控制下。这种质粒包括良好转导过程所需的顺式作用病毒序列。仅仅保留最初病毒的某些基因组衣壳化(慢病毒来源的psi序列)所需的某些序列，可能的flap序列(cPPT-CTS区域)，可以有效地核输入逆转转录本载体基因组和在包装之前能够转录载体的完整的LTR5′。此外，该载体可以删除了LTR3’U3增强子序列(WO 99/31251)。此外，删除了所有原始的病毒基因，尤其是编码gag，pol和env序列的病毒基因以及辅助基因(vif，nef，vpr和/或vpu)以便改进载体的安全性。

在本发明一个特定的实施方案中，位于线性基因组末端的att序列可被优选突变，并且可能被缺失，以便使整合酶作用于基因组更加困难。

为了分别促进包膜蛋白，载体基因组mRNA以及转基因的gag和pol表达，在反式互补质粒中，包膜质粒和载体质粒中使用的启动子是相同或者不同的启动子，优选自遍在或者特异性启动子，例如选自CMV，TK，RSV LTR病毒启动子和RNA聚合酶III启动子，诸如U6或者H1启动子。

本发明的慢病毒是遗传修饰的，因此某些天然传染性病毒的组成性基因被抑制以及被导入到靶细胞中的有益核酸序列取代。在将病毒融合到细胞膜以后，所述病毒将其核酸注入细胞中。然后将以这种方法转移的遗传物质转录并可能被翻译成宿主细胞内的蛋白。

本发明优选的载体系统含有：

a)反式互补质粒，缺乏任意psi衣壳化信号并含有慢病毒gag序列和突变的编码含有由AAH(在整合酶编码序列在C-末端区域的碱性区域)取代₂₆₂RRK基序，无整合功能的整合酶的慢病毒pol序列，所述质粒缺乏诸如vif，nef，vpu and/or vpr的辅助基因，

b)如上定义的包膜质粒，优选地包括病毒启动子并编码VSVG包膜，更优选CMV-VSV-G-PolyA序列，以及

c)慢病毒载体质粒，删除了LTR3’的启动子区域或者删除了LTR3’U3增强子序列，包括LTR5’和3’之间的psi元件，RRE，转基因以及可能的启动子和/或flap序列，cPPT CTS，所述载体缺乏所有的慢病毒(例如HIV-1)基因。

为了产生用于复制的非整合型和有缺陷的重组病毒，如上所述的质粒可以被导入到感受态细胞中，并收获所产生的病毒。所使用的细胞可以是任意的感受态细胞，尤其是真核细胞，尤其是来自哺乳动物，例如动物或者人类。他们可以是体细胞的或者胚胎的，干细胞或者分化细胞的来源。例如可以引用293细胞，成纤维细胞，肝细胞，肌(骨骼，心脏，平滑，血管等)细胞，神经细胞(神经元，神经胶质细胞，星形细胞)，上皮，肾，视细胞等等。它们还可以是蔬菜细胞，酵母或者原核细胞。它们还可以是由SV40 T抗原转化的细胞。

因此本发明是基于制备非-整合型和非-复制型重组慢病毒方法，包括用如上所述的质粒组合转染感受态细胞群，以及回收产生的载体。

因此本发明涉及产生能够体内表达转基因的非-整合型和非-复制型慢病毒的尤其优选的方法，包括通过如上所述的非-整合型和非-复制型慢病毒载体系统转染感受态细胞，所述慢病毒载体系统含有：

a)至少一种反式互补的质粒，缺乏任意的psi衣壳化信号，并含有gag序列和/或含有1类突变，例如能够，由编码的整合酶序列的碱性区域中和/或C-末端区域中的AAH取代₂₆₂RRK基序的pol序列，所述质粒缺乏任意的辅助基因，诸如vif，nef，vpu和/或vpr，

b)包膜质粒，包括(例如VSV-G)-PolyA(例如CMV-)包膜启动子序列，

c)载体质粒，可能删除了LTR3’U3增强子序列，包括5’和3’LTRs之间的psi元件，RRE，转基因和可能的启动子和/或flap序列，cPPT CTS，所述载体删除了慢病毒(例如HIV-1)的编码序列，

以及回收慢病毒产物。

还可以从产生一或多种如上所述的整合酶上突变的gag，env和/或pol蛋白的衣壳化细胞系制备本发明的慢病毒。

为此，在一个特定的实施方案中，本发明的方法包括在表达所选择的env蛋白的细胞系中转染上述的两种质粒(载体质粒以及反式互补质粒)。用于制备该细胞系的细胞例如是上述的感受态细胞。

根据另一个实施方案，使用的细胞系还表达env蛋白，gag蛋白和/或慢病毒pol蛋白，后者包括1类突变。在这种情况下，该方法包括简单转染载体质粒。

如上所述，所产生的慢病毒优选来源于VIH-1，VIH-2，SIV，FIV，BIV，VISNA，CAEV或者EIAV病毒。

在细胞系中尤其优选从已知具有非常强烈的重组性的母鸡淋巴瘤建立的DT40细胞系和Cos 7细胞系(来自通过SV40抗基因的方法无限增殖的猴肾细胞)。它们还可以是HCT116，DLD1(从获自结肠癌的细胞建立的人细胞系)，LF1(人胚胎肺成纤维细胞)，LL1(人胚胎皮肤成纤维细胞)，TK6(人成淋巴细胞系)，HaCaT(人角质细胞)，U937(人单核细胞)，HCT15，SW480，Colo320，Co115，EB，Hbl100，Rat-1，PC12(大鼠光色细胞瘤)等细胞系。这给出了作为实例的非-详细列举。本领域已知的其它细胞系可以在本发明的上下文选择和使用，对其没有特定的限制。

为了实现本发明的方法，可以通过本领于技术人员已知的任一技术将质粒导入细胞中，取决于所研究的细胞类型。通常，将细胞和载体系统与合适的装置(微孔板，盒，管，袋等)接触足以使载体系统或者质粒转移到细胞中的时间段。通常，通过磷酸钙沉淀，电穿孔或者利用一或多种便于转染的化合物，诸如脂类，聚合物，脂质体以及肽等将载体系统或者质粒导入细胞中。优选磷酸钙沉淀。在任一改造的培养基，诸如RPMI，DMEM，能够在缺乏胎牛血清的情况下进行培养的特异性培养基中培养细胞。

本发明的一个特定目的还涉及以稳定的方式表达包括一或多个影响碱性区域，其C-末端区域(例如C-末端区域的碱性区域)和/或其催化位点的一或多个点突变的慢病毒整合酶的细胞系，所述整合酶缺乏整合功能，本发明还涉及利用这类细胞系体外制备非整合型和非-复制型重组慢病毒。

因此本发明的一个目的涉及通过实施本发明的方法获得的细胞和利用本发明的细胞，细胞系或者细胞群制备用于实现人或者动物的治疗性，疫苗或者外科治疗方法的细胞组成。

本发明还涉及用于实现体外或者离体修饰细胞的基因组的方法的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的载体。

应用

本发明的病毒和细胞系可用于例如优选在不分裂的细胞表达转基因或者其它核酸，或者用于在对其它转染乃至通过其它载体转导的方法有抗性的分裂细胞中瞬时表达基因。

令人惊讶地，本应用显示以这种方法获得的慢病毒载体能够转导不同的细胞类型，诸如，例如视网膜细胞，星形细胞，其它胶质细胞或者神经元。可以由本发明载体靶向的神经细胞的其它亚群例如是小神经胶质细胞，内皮细胞或者寡树突细胞。在涉及在眼睛中转移基因的一个特定应用中，本发明的载体可以是例如具有Mokola包膜的假型，以便能够选择性转入色素上皮细胞。

这种非-整合型和非-复制型慢病毒载体是用于改进基因转移的安全及效率：通过突变整合酶，载体不再结合到靶细胞的基因组中，因此消除了插入诱变的危险。此外，flap序列(cPPT-CTS)可能插入载体中可以显著改进核输入DNA基因组，能够显著表达转基因，在有丝分裂后的细胞中稳定，以及在繁殖细胞中瞬时存在。

本发明的非整合型慢病毒载体的可能应用有若干类型并包括：

-基因治疗，即在任意哺乳动物细胞，尤其是人细胞中基因转移。这些可以是分裂细胞或者休眠细胞，属于中心器官或者末梢器官，诸如肝脏，胰腺，肌肉，心等等的细胞。优选地在休眠细胞(不分裂)，尤其是在中枢神经系统的细胞，尤其是脑，骨髓以及眼球的细胞中转移基因，例如在治疗神经退行性病变或者视网膜疾病的范围内，在用于瞬时表达的分裂细胞中转移基因(例如：抗肿瘤自杀策略，用于治疗脊髓外伤的轴突排斥策略)。基因治疗能够表达蛋白，例如神经营养因子，酶，转录因子，受体等。此外，能够实施“寡核苷酸”策略(反义或者干扰物RNAs，核酶等)，

-细胞治疗，即在祖细胞中表达分化因子，用于在移植或者离体转导细胞之前将细胞定向到所选择的目标以便它们在移植所述细胞之前表达有益的因子。

本发明的一个特定的目的涉及利用本发明的非整合型和非-复制型慢病毒用于制备将基因体外，离体或者体内转移到受试者的中枢神经系统(包括眼球)中的组合物。

本发明的另一个特定的目的涉及利用这类慢病毒用于制备治疗影响中心或者末梢器官的疾病，例如神经系统(包括眼球)的疾病的组合物。

根据它们含有的转基因，本发明的非-整合型和非-复制型慢病毒可用于生产用于治疗，例如神经退行性疾病，尤其是阿兹海默氏症，帕金森氏症，亨丁顿舞蹈症疾病，SLA或者SMA，年龄相关的黄斑变性(DMLA)，眼睛变性或者中枢神经系统的创伤(中风，癫痫症，脊髓的损坏或者创伤等等)，影响中枢神经系统的疾病(粘多糖症，等等)，成胶质细胞瘤或者星形细胞瘤，影响神经系统的新陈代谢病(粘多糖症，Charcot-Marie，等等)或者影响眼球的疾病(DMLA，色素视网膜炎，青光眼等等)的药物组合物。

根据本发明的一个特定的实施方案，非-整合型和非-复制型重组慢病毒被用于生产用于治疗色素视网膜炎的药物组合物。术语“色素视网膜炎”用于指特征在于由细胞程序性死亡的杆状和圆锥状细胞(视网膜的神经细胞)渐进变性的眼睛紊乱的异类群。每3,000人的发病率为1个，这是失明的主要原因。色素上皮细胞和光感受器细胞的转导是这类病变决定性的益处。基因置换策略使光感受器或者色素上皮的转导成为必需，而神经元保护策略可以受益于色素上皮的转导。事实上，这种方法的益处在于不修饰神经细胞，但是仅仅修饰随后将合成可扩散的营养因子，诸如GDNF，并将其分泌在围绕待保护的光感受器周围的区域的色素上皮。

本发明的另一个目的是组合应用若干慢病毒以便在神经系统的细胞中转移和表达若干核酸。组合应用可以包含顺序施用不同的病毒，或者同时施用。

如上所述，本发明可以在神经细胞中运输和表达多核酸，例如催化核酸(干扰物，反义，核酶等)，编码生长因子，营养因子，细胞因子，集落刺激因子，抗-癌因子，毒素，酶，神经介质或者其前体等的核酸。

含有本发明的慢病毒的药物组合物可以通过合适的包膜糖蛋白经脑内或者系统地施用于患者，取决于假慢病毒型的特定的趋向性。因此可以是脑内，例如纹状体内给药到海马或者黑质(black substance)，静脉内，动脉内，阴道内给药，或者施用到视网膜下间隔等。优选的注射法是脑内注射并注射到视网膜下间隔。

组合物优选以10²和10¹⁰之间，通常10³和10⁸之间的水平施用用于转导(由细胞转导分批稀释的载体原种测定的水平)的有效颗粒，或者用约10⁵和10¹³之间个拷贝[载体RNA基因组的由定量反转录PCR(聚合酶链式反应)或者由与载体RNA基因组有关的DNA链的定量PCR测定的水平]的基因组等价物施用组合物。慢病毒可以配制在任意适合的溶液，诸如盐，等渗，缓冲溶液中，可能连同稳定剂，诸如同基因白蛋白或者任意其它的稳定蛋白，甘油等，以及佐剂因子诸如聚凝胺或者DEAE葡聚糖等等。本发明的其它优点在下列实施例中将进行更详细的描述，所述实施例是说明性而非限制性的。

附图说明

图1：用于通过转染如下三种质粒产生慢病毒载体的系统：携带在人巨细胞病毒(hCMV)启动子调控下的GFP转基因以及干扰核输入的中心flap序列[中心聚嘌呤区域-中心终止序列(cPPT-CTS)]，与REV调控元件相互作用的RRE(REV效应元件)序列以及psi衣壳化序列(ψ)的载体质粒，缺失启动子序列的LTR3’U3区域(ΔU3)；反式互补质粒，其在CMV启动子调控下表达VIH-1(GAG和POL)复制周期的早期阶段所必需的蛋白以及调控元件并且缺失ψ序列；包膜质粒，其在CMV启动子调控下表达水疱性口腔炎病毒(VSV-G)的包膜糖蛋白。

图2：表达由非-整合型慢病毒载体转导细胞系(293T和HeLa)后获得的GFP。转导的百分比由在不同剂量(每孔微升体积)的IN_WT CMVGFP整合型和IN_N CMV GFP非-整合型慢病毒载体存在下温育细胞72小时后经FACS测定的。

图3：处理AZT细胞后由IN_WT CMV GFP整合型和IN_N CMV GFP非-整合型慢病毒载体抑制转导。在10μM自身的载体或AZT载体存在下温育293T细胞72小时后由FACS测定转导的百分比。

图4：用IN_WT CMV GFP整合型和IN_N CMV GFP非-整合型慢病毒载体转导细胞系(293T和MT4)后的时间内表达GFP。由转导(MOI 5)后3天，6天，9天和12或15天由FACS(A：293T，B：MT4)测定GFP⁺细胞的百分比。注有“but”的点：分析之前进行5mM丁酸钠处理24小时的细胞。

图5：GFP在来自通过IN_WT CMV GFP整合型或I_N CMV GFP非-整合型慢病毒转导后的大鼠皮质初级胚胎神经元中的表达

A：对在对照(非-转导的)神经元，转导(放大x20)后3、9和16天由整合型(IN_WT)载体转导或通过非-整合型(IN_N)载体转导的神经元中的表达的免疫细胞化学分析。

B：IN_WT和IN_N组中的皮层神经元的转导百分比。该测定一式三份并且表示为平均值±标准误差(SEM)。

C：对在对照(非-转导的)神经元，转导(加强x10)后3、15和25天由整合型(IN_WT)载体转导或由非-整合型(IN_N)载体转导的神经元中的表达的免疫细胞荧光分析。

图6：

注射到小鼠纹状体中后体内GFP的表达。将IN_N CMV GFP(A)或IN_WT CMV GFP(B)载体立体定位注射在小鼠纹状体中后10天切除脑，用带有20μm厚切口的恒冷切片机切割并进行免疫组织化学分析来揭示GFP的存在。cc：胼胝体，str：纹状体。放大率(x2.5，x5或x20)标在各相片上。

图7：

注射到小鼠纹状体中后体内GFP的表达。将INN CMV GFP载体立体定位注射到小鼠纹状体中10天后切除脑，用带有20μm厚切口的恒冷切片机切割，并且免疫组化荧光后用共焦显微镜分析。

A：CFP/GFAP共-标记：表达GFP的星形细胞(放大x40)。

B：CFP/NeuN共-标记：表达GFP的神经元(放大x16)。

图8：

A：视网膜下注射66ng p24的INN CMV GFP非整合型慢病毒载体后的大鼠体内GFP的表达。注射后2周对平面设置的视网膜进行荧光显微术(x2.5)照相。

B：视网膜下注射2.5μg p24的INN CMV GFP非整合型慢病毒载体后的狗的体内GFP的表达。注射后1月被监视的狗的荧光的血管造影。

实验部分

首先，使用用于产生慢病毒载体(p8.91 INWT和p8.91 INN质粒)的反式互补质粒中的整合酶序列(与血球凝集素融合的)、突变的或非-突变的整合酶序列。然后由在人巨细胞病毒(hCMV)的早熟病毒启动子调控下表达绿色荧光蛋白(GFP)并携带正常(INWT CMV GFP载体)或突变(INN CMV GFP)整合酶的VIH-1产生了载体的原种。最后进行关于INNCMV GFP载体控制神经细胞内GFP转基因表达的效率的研究，首先是体外的，然后则是进行体内的研究。

体外载体的表征

GFP转基因的体外表达

为了评价非-整合型慢病毒载体转导细胞系以及表达转基因的能力，将293T，HeLa和MT4细胞在存在不同量INWT CMV GFP和INNCMV GFP载体的条件下进行培养。通过INWT CMV GFP整合型载体转导72小时后，特定百分比的细胞表达了GFP(通过FACS分析)。同样，通过INN CMV GFP载体转导72小时后FACS分析证明了GFP+细胞(图2)。第一个结果表明其中整合酶已经失活的载体有良好的转导效率。

假转导分析

在制备过程中，慢病毒载体的原种被质粒DNA污染，尤其是被pTrip CMV GFP载体质粒和转染细胞中的相同质粒产生的GFP蛋白污染。这两种成分可产生假阳性细胞，其中的GFP并非来自逆转录载体基因组的表达。因此，这些GFP+细胞没有被转导，而是“假转导”。

为了证明GFP+细胞不是来自假转导机制，在存在或缺乏任意叠氮基-脱氧胸苷(AZT)的条件下，在逆-转录酶(RT)抑制剂的辅助下转导293T细胞。事实上，用AZT处理仅仅抑制GFP的表达，如果后者由细胞转导产生。在存在AZT时观察的GFP+细胞的百分比相当于假转导的百分比。以20感染多重度(MOI)转导293T细胞后，观察到40.7％(±1.5)的GFP+细胞具有INWT CMV GFP整合型载体，用INN CMV GFP非-整合型载体的为28.0％(±1.9)。在10μM AZT存在下，转导细胞的百分比分别下降到5.8％(±0.1)和4.9％(±0.4)(图3)。因此RT抑制使降低GFP+的百分比成为可能，无论其是通过INWT CMV GFP整合型载体还是通过INN CMV GFP载体转导的。因此在缺乏任意逆-转录酶抑制剂的情况下观察到的大多数GFP+细胞被两种类型的载体有效地转导并且不产生假转导机制。

分裂细胞中表达的稳定性

为了验证携带突变IN-HAN整合酶的颗粒的游离基因特性，对不同HeLa，293T和MT4细胞系转导直至15天后的GFP表达进行分析。用5MOI的突变体INN CMV GFP载体，整合型INWT CMV GFP对照或非-整合型CMV GFP腺病毒对照转导细胞。扩增各批次的转导细胞12到15并且每72小时通过FACS进行分析。收获最后细胞前的24小时，其中的一些用5mM丁酸钠处理以评价次乙酰化对GFP表达的可能的影响。获得的结果显示于图4中。

随着时间，当这些细胞是用INWT CMV GFP整合型对照载体转导时，表达GFP的293T或MT4细胞的百分比相对稳定，在293T细胞中至终点时百分比稍微有所下降(图4)。然而，在实验结尾用丁酸钠处理细胞使得293T GFP+细胞的百分比回到最初测定的水平成为可能，并且此表明调节转基因表达的启动子被重激活并且显示载体随着时间整合到所分析细胞群体中的稳定性。在用非-整合型腺病毒对照载体转导的细胞中，在连续分裂过程中阳性细胞的百分比显著地下降以致转导后15天消失。在这种情况下，转导后15天用丁酸钠处理不能够使回复到最初的GFP+细胞百分比成为可能(图4B)。此结果可通过细胞分裂过程中腺病毒基因组的渐进稀释来解释。作为染色体外的成分，在细胞周期过程中载体基因组不能像基因组DNA一样被复制。随每一有丝分裂，载体基因组的一个拷贝因此仅仅被送到两个子代细胞的一个中，并且理论上表达转基因细胞的百分比随着各细胞周期被除以2。

通过携带突变体整合酶的载体转导的细胞的表达显示了接近于用腺病毒载体转导后观察到的分布图。实际上，GFP+细胞的百分比随着时间降低(图4)并且通过用丁酸钠处理细胞不能恢复到最初水平。这些结果表明，在腺病毒载体转导的情况下，在最初转导的细胞中的INNCMV GFP载体的基因组由于各细胞分裂被连续稀释而消失。

休眠细胞中GFP转基因表达的稳定性

GFP+细胞的百分比随着时间减少反映了载体基因组的不稳定性以及在转导细胞核中的降解。为了验证此假说，在通过两个类型载体转导神经元后研究其GFP转基因的表达。事实上，初级神经元(胚胎大鼠皮质)在培养中不分裂。用INN CMV GFP载体转导这些细胞后，GFP表达持续至少16天(图5A和5B)。在不同时间用WT载体与用N载体转导获得的免疫活性细胞的百分比间没有观察到显著性差异(2因素ANOVA，重复测定，p＝0.9321)。其他的实验使得表明转导后的转基因表达持续高达25天成为可能(图5C)。

游离基因形式因此在转导细胞的核中是相对稳定的并能够在休眠细胞中表达转基因至少25天。此结果支持了分裂细胞中GFP表达在由于每一有丝分裂稀释游离型载体基因组而不是通过降解从而随着时间减少的假说。

GFP转基因的体内表达

小鼠纹状体中的表达

为了测定整合酶-缺陷的慢病毒载体在体内转导细胞中的效率以及是否能够表达GFP转基因，将INN CMV GFP载体注射到小鼠纹状体中。注射10天后，可显示GFP表达。注射之后此表达持续至少1个月的时间。此结果证实了非整合型载体启动以及维持转基因在SNC细胞中表达的效率(图6)。为了鉴定转导细胞的表型，在邻近的切口上一方面通过GFP/GFAP免疫组化荧光(胶质原纤维酸性蛋白，星形细胞标记)以及另一方面通过GFP/NeuN(神经元标记)进行共-标记。用共焦显微镜分析玻片后，可观察到大多数为具有GFAP标记的GFP的萤光杂染原位分析(图7A)以及极少为具有NeuN标记的GFP的萤光杂染原位分析(图7B)。这些结果表明在体内具有VSV包膜假型的INN CMV GFP载体优选转导星形细胞。

在视网膜中的表达

评价非-整合型慢病毒载体转导视网膜色素上皮细胞的能力。为此，将载体注射到大鼠以及狗的视网膜下。初步的结果表明GFP在大鼠中至少表达9周且在狗中至少表达3个月(图8)。继续评价在这两个系统中表达的稳定性。通过发明人以前获得的结果表明慢病毒载体注射在大鼠视网膜下后主要转导色素上皮细胞。

通过近距离研究眼睛，在某些狗中观察到低水平的毒性。这些毒性不依赖注射剂量，以及载体本身，并且好象是通过外科手术作用在注射的时侯诱导的。更广泛的组织学分析将使得更清楚地了解刺激这些成为可能。

治疗性转基因在动物模型中的表达

为了验证非-整合型慢病毒载体在临床应用中的作用，所述载体在表达治疗性转基因的效率，在视网膜下注射RD10大鼠后测验得自神经胶质细胞的神经营养因子(GDNF)，所述RD10大鼠为色素视网膜炎模型。术语“色素视网膜炎(RP)”是指由于杆状和圆锥(视网膜的神经细胞)细胞的程序性死亡而具有退行性眼睛失调的异类组。具有三千分之一的发病率，这是失明的只要导致原因。色素上皮细胞和感光体的转导在这类病变中是决定性的。基因置换策略使光感受器或色素上皮的转导成为必需，神经保护策略可受益于色素上皮的转导。事实上，此方法具有不修饰神经细胞而仅仅修饰合成扩散性的神经营养因子，诸如GDNF，且将其分泌在待保护的光感受器的周围的色素上皮细胞的好处。

实验室实验表明整合型慢病毒载体对于在正常小鼠中通过视网膜下注射色素上皮细胞转导是有效的。

如上所述的结果表明了本发明能够在啮齿类和大动物的中枢神经系统(脑和视网膜)中体外、离体以及体内表达转基因的非-整合型慢病毒载体的效率和治疗潜能。

Claims (24)

1.含有重组基因组的非-复制型和非-整合型重组慢病毒，包括LTR 5′和3′慢病毒序列之间的慢病毒衣壳化psi序列，RNA核输出元件，转基因以及可能的启动子和/或辅助核输入RNA的序列，以及阻止所述基因组整合到宿主细胞的基因组的突变的整合酶。

2.权利要求1的慢病毒，其特征在于所述慢病毒选自VIH-1，VIH-2，SIV，FIV，EIAV，BIV，VISNA和CAEV。

3.权利要求1或者2的慢病毒，其特征在于整合酶的突变由一或多个点突变组成。

4.权利要求3的慢病毒，其特征在于点突变影响整合酶的碱性区域，C-末端区域和/或催化位点。

5.权利要求4的VIH-1慢病毒，其特征在于影响碱性和/或C-末端区域的点突变是由AAH基序取代₂₆₂RRK基序。

6.权利要求4的VIH-1慢病毒，其特征在于影响催化位点的点突变选自64，116和/或152位氨基酸突变。

7.上述权利要求任一项的慢病毒，其特征在于基因组缺乏任意的慢病毒编码序列。

8.上述权利要求任一项的慢病毒，其特征在于RNA核输出元件包括VIH-1的REV效应元件(RRE序列)。

9.上述权利要求任一项的慢病毒，其特征在于辅助核输入RNA的序列是cPPT CTS。

10.上述权利要求任一项的慢病毒，其特征在于转基因是催化核酸(干扰物，反义，核酶)自杀核酸或者编码生物学活性多肽，例如生长因子，营养因子，激素，细胞因子，抗体，受体，分化因子，集落刺激因子，抗癌剂，毒素，酶，神经介质或者其前体的核酸。

11.以稳定反式表达慢病毒整合酶的细胞系，所述慢病毒整合酶包括一或多个影响其C-末端区域和/或其催化位点的点突变，所述整合酶缺乏全部的整合功能。

12.权利要求11的细胞系在体外制备非-整合型和非复制型重组慢病毒中的应用。

13.制备权利要求1到10任一项的慢病毒的方法，其特征在于包括通过载体系统转染细胞从而获得包括如下序列的非-整合型和非-复制型慢病毒：

a)反式互补质粒，缺乏任意psi衣壳化信号并含有慢病毒gag序列和编码无整合功能的整合酶的突变的慢病毒pol序列，所述质粒可能是删除了vif，nef，vpu和/或vpr辅助基因，

b)包括启动子-env-PolyA序列的包膜质粒，和

c)慢病毒载体质粒，包括重组基因组，所述重组基因组含有在LTR5’和3’序列之间的慢病毒衣壳化psi序列，RNA核输出元件，转基因，和可能的启动子和/或辅助核输入RNA的序列，以及阻止所述基因组整合到宿主细胞基因组的突变的整合酶，所述载体缺乏慢病毒的任一编码序列，

以及回收所产生的慢病毒。

14.权利要求13的方法，其特征在于反式互补质粒的pol序列中的突变由影响编码的整合酶序列的碱性区域，C-末端区域和/或催化位点的一或多个点突变组成。

15.权利要求13或者14的方法，其特征在于反式互补质粒进一步包括选自WPRE，APP 5’UTR，TAU 3’UTR，隔离序列的转录调节元件。

16.权利要求13到15任一项的方法，其特征在于包膜质粒的包膜蛋白选自VSV-G，狂犬病病毒血清群的病毒的包膜蛋白：Rabies(RAB)，Duvenhague(DUV)，European bat 1型(EB-1)，European bat 2型(EB-2)，Kotonkan(KOT)，Lagos bat(LB)，Obodhiang(OBD)，Rochambeau(RBU)，Mokola病毒的血清群的病毒的包膜蛋白(MOK)以及这些包膜的任一的嵌合的组合物。

17.权利要求13到16任一项的方法，其特征在于存在于包膜质粒中的启动子和/或载体质粒中的启动子是相同或者不同的，并且是细胞或者病毒的启动子。

18.权利要求17的方法，其特征在于启动子或者所使用的启动子是选自PGK，Rho和EF1α启动子的细胞启动子。

19.权利要求17的方法，其特征在于启动子或者所使用的启动子是选自CMV，TK，RSV LTR基因的启动子或者RNA聚合酶III的U6或H1启动子的病毒启动子。

20.权利要求13到16任一项的方法，其特征在于慢病毒载体质粒缺乏启动子区域或者LTR3’U3增强子序列。

21.权利要求1到10任一项的非-整合型和非-复制型慢病毒在制备用于在受试者的中枢神经系统中体外，离体或者体内转移基因的组合物中的应用。

22.权利要求21的应用，用于制备治疗神经系统(包括眼球)的疾病的组合物。

23.权利要求22的应用，用于治疗神经退行性疾病(帕金森氏症，亨丁顿舞蹈症，阿兹海默氏症，SLA，SMA，DMLA等)，中枢神经系统的创伤(脊髓的创伤，中风等)，影响神经系统的新陈代谢病(粘多糖症，Charcot-Marie，等)或者影响眼球的疾病(色素视网膜炎，青光眼等)。

24.药物组合物，含有权利要求1到10任一项的慢病毒以及药用赋形剂。

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