KR20220137651A - Il-15 이종이량체를 발현하는 cho 세포 - Google Patents

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리차드 가브리엘
토마스 요스토크
유스튀나 요체프크추크
유르스 울리히 로리히
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 CHO 세포주에서 생산된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체 및 상기 이종이량체의 생산 방법 및 상기 이종이량체를 사용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

IL-15 이종이량체를 발현하는 CHO 세포
본 개시내용은 고유한 글리코실화 프로파일을 갖는 인간 인터류킨 15(human interleukin 15: IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체 및 이러한 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2021년 1월 27일자로 작성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 PAT058680-WO-PCT_SL.txt이고, 크기가 37,833바이트이다.
사이토카인인 인터류킨-15(IL-15)는 인체의 많은 세포가 생산하는 림포카인의 4가지 알파-나선 번들 패밀리의 구성원이다. IL-15는 선천성 면역계와 적응성 면역계의 활동, 예를 들어, 침입하는 병원체에 대한 기억 T 세포 반응의 유지, 아폽토시스의 저해, 수지상 세포의 활성화 및 자연 살해(NK) 세포 증식 및 세포독성 활성의 유도를 조절하는 데 중추적인 역할을 한다.
IL-15 수용체는 다중 사이토카인 수용체에 의해 공유되는 3가지 폴리펩티드, 유형-특이적 IL-15 수용체 알파("IL-15Rα"), IL-2/IL-15 수용체 베타(또는 CD122)("β") 및 공통 감마 쇄(또는 CD132)("γ")로 구성된다. IL-15Rα는 다양한 세포 유형에 의해 발현되는 것으로 생각되지만, 반드시 β 및 γ와 함께 발현되는 것은 아니다. IL-15 신호전달은 IL-15Rα, β 및 γ의 이종이량체 복합체를 통해; β 및 γ의 이종이량체 복합체를 통해, 또는 비만세포에서 발견되는 소단위, IL-15RX를 통해 일어나는 것으로 나타났다.
IL-15는 가용성 단백질이지만, 내인성 IL-15는 주로 여러 종류의 부속 세포에 의해 발현되거나 획득되는 막-결합 형태로서 발생하기 때문에 혈청 또는 체액에서 쉽게 검출되지 않는다. 예를 들어, IL-15 mRNA는 조혈 계통 및 비-조혈 계통의 세포에서 검출되지만, T 세포는 IL-15를 생성하지 않는다. 그 대신, IL-15는 IL-15Rα에 결합하여 T 세포상의 세포-표면 복합체를 형성한다. IL-15는 수용체의 세포외 도메인의 엑손 2에서 "스시 도메인"을 통해 높은 친화도로 IL-15Rα에 특이적으로 결합한다. 트랜스-엔도좀 재순환 및 세포 표면으로의 이동 후에, 이들 IL-15 복합체는 Jak/Stat 경로를 통해 IL-15-매개된 신호전달을 유도하는, IL-15R βγ 저-친화도 수용체 복합체를 발현하는 방관자 세포를 활성화시키는 특성을 획득한다. 수용체의 막투과 도메인의 바로 원위에 있는 세포외 도메인의 절단 부위에서 절단된, IL-15Rα("sIL-15Rα")의 야생형 가용성 형태가 발견되었다. 종양 괴사 인자-알파-전환 효소(TACE/ADAM17)는 이 과정에 관여하는 프로테아제로서 밝혀져 있다.
면역계에서의 다각적인 역할에 기초하여, IL-15 매개된 기능을 조절하기 위해 고안된 다양한 요법이 연구되었다. 최근 보고는 IL-15가 sIL-15Rα 또는 스시(sushi) 도메인과 복합체를 형성할 때 면역 개선 기능을 유지한다는 것을 시사한다. 재조합 IL-15 및 IL-15/IL-15Rα 복합체는 다양한 전임상 모델에서 기억 CD8 T 세포 및 NK 세포의 팽창을 상이한 정도로 증진시키고 종양 거부를 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 마우스 모델에서 IL-15 또는 IL-15/IL-15Rα 복합체 함유 작제물의 종양 표적화는 동종 종양이 이식된 면역적격성 동물에서 또는 인간 종양 세포주가 주입된 T 세포 및 B 세포-결핍 SCID 마우스(NK 세포를 보유)에서 항종양 반응을 개선하였다. 개선된 항종양 활성은 IL-15 함유 모이어티의 증가된 반감기뿐만 아니라 종양 세포 표면에서의 IL-15의 교차-제시(trans-presentation)에 의존하여 종양 내에서 NK 및/또는 CD8 세포독성 T 세포 확장을 개선하는 것으로 고려된다. 이와 같이, IL-15를 발현하도록 조작된 종양 세포는 또한 T 세포 및 NK 세포 모집, 증식 및 기능을 개선시킴으로써 확립된 종양의 거부를 촉진하는 것으로 보고되어 있다(문헌[Zhang et al, (2009) PNAS USA. 106:7513-7518]; 문헌[Munger et al, (1995) Cell Immunol. 165(2):289-293]; 문헌[Evans et al, (1997) Cell Immunol. 179(1):66-73]; 문헌[Klebanoff et al, (2004) PNAS USA. 101(7):1969-74]; 문헌[Sneller et al, (2011) Blood.118(26):6845-6848]; 문헌[Zhang et al, (2012) J. Immunol. 188(12):6156-6164]).
당단백질로 알려진 올리고당 쇄를 함유하는 단백질의 생물학적 활성은 단백질의 통합 구조뿐만 아니라 단백질에 공유적으로 부착된 올리고당의 특성에 의존한다는 것은 널리 인식되어 있다. 글리코실화는 단백질의 용해도, 단백질 분해 공격 및 열 불활성화에 대한 내성, 4차 구조, 활성, 표적화, 항원성, 기능적 활성 및 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 포유동물의 글리코실화 패턴은 일반적으로 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Fukuda et al. (1994), Molecular Glycobiology, IRL Press, New York]에 기재되어 있다. 시알산 N-아세틸뉴라민산(NANA)은 N- 및 O-연결 글리칸의 주요 구성성분이다. 시알산은 단백질 치료제의 반감기를 유지하는 데 중요한 것으로 밝혀져 있다. 탈시알화된(desialylated) 당단백질 또는 과소시알화된(under-sialylated) 당단백질은 혈장에서 반감기를 상당히 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 고유한 글리코실화 프로파일을 갖는 IL-15/IL-15Rα 복합체를 생산하는 것이 유리하다.
고유한 글리코실화 프로파일을 갖는 IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 조성물이 본 명세서에 개시되어 있다. N-아세틸뉴라민산(NANA)은 N- 및 O-연결 글리칸의 주요 구성성분이다. NANA는 인간에서 단백질의 글리코실화 사건 내에서 뉴라민산의 우세한 형태인 반면 다른 포유동물은 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)과 같은 다른 유도체도 포함할 수 있다. NANA는 N-글리칸 및 O-글리칸의 코어 구조에 여러 방식으로 연결될 수 있다. 우세하게, α(2, 8)와 같은 다른 연결이 존재하지만 주로 후속 당류에 대한 α(2, 3) 및 α(2, 6) 연결을 찾을 수 있다. 인간 세포, 예를 들어, 인간 배아 신장(HEK) 세포는 주로 α(2, 6) 연결된 시알화를 생성하는 반면, 많은 생산 세포주, 예를 들어, 포유동물 세포주, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주는 α(2, 3) 연결된 시알화를 생성한다.
CHO 세포에서, 효소 자체에 대한 유전자는 씨.그리세우스(C.griseus)에 존재하지만, 코어 글리칸 구조(베타-갈락토사이드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1)에 대한 알파(2,6) 연결된 NANA 확장을 생성하는 역할을 하는 효소는 CHO 세포에서 불활성이거나 발현되지 않는 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Chung et al. (2017) Biotechnol. J. 12:1600502] 참조). 본 발명은 CHO 세포에서 생산된 IL-15/IL-15Rα 복합체가 인간 세포주에 의해 생산된 IL-15/IL-15Rα 복합체와 비교하여 상이한 글리코실화 패턴을 갖는다는 예상치 못한 발견에 기초한다. 또한, CHO 세포에서 생성된 IL-15/IL-15Rα 복합체에서 알파(2,6) 연결 유형 글리칸이 관찰되었다. 이 글리코실화 패턴은 보통 인간 세포주에서 발현되는 단백질에서 관찰되기 때문에 고유하고, 놀라운 것이다. 예를 들어, 그것은 인간 글리코실화 형태에 더 가깝기 때문에 예상되는 CHO 패턴과 비교하여 면역원성이 적은 직접적인 이점을 제공한다. 예를 들어, 비인간, 잠재적 면역원성 글리코에피토프, 예컨대, N-글리콜릴뉴라민산은 CHO 세포에서 생성된 IL-15/IL-15Rα에 본질적으로 존재하지 않는다. 또한 글리코실화는 생체내에서 사이토카인의 반감기 및 이의 분포에 영향을 미쳐서, 글리코실화된 IL-15/IL-15Rα 복합체의 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다.
한편, HEK 세포 유래 IL-15/IL-15Rα 복합체는 낮은 공정 강건성, 낮은 수율, 생산 공정에서 동물 유래 원료의 사용, 제한된 분해능을 갖는 복잡한 분석 특징 및 최근에 검출된 IL-15Rα 내의 스플라이스 변이체의 존재로 인해서 추가 개발을 위해서 최적인 것으로 간주되지 않는다. IL-15Rα 스플라이스 변이체는 독성을 유발할 수 있다. 또한, 추가 종의 존재는 환자에게 투여될 활성 IL-15/IL-15Rα 복합체의 정확한 양을 결정하기 어렵고 약물의 효력에 영향을 미친다. 바이러스 오염에 대한 감수성은 HEK 세포를 사용한 재조합 바이오의약품(biopharmaceuticals) 생산에서 잠재적인 위험으로 간주된다. 따라서, CHO 세포가 IL-15/IL-15Rα 복합체를 생산하는 데 더 최적인 것으로 간주되는데, 그 이유는 그것이 더 안전하고, 바이러스 오염에 대해 덜 민감하며, 훨씬 더 높은 수율을 갖기 때문이다.
따라서, 본 개시내용은 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 복합체는 FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA3G3S1, FA2F1G2S2, FA3G2S2 및 FA3G3S3을 포함하는 N-연결된 글리칸을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 5의 서열을 갖고, IL-15Rα는 서열번호 6, 7, 10, 12, 14 또는 21의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, N-연결된 글리칸은 적어도 약 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20% 또는 22.5%의 FA2G2S1을 포함한다. 일부 실시형태에서, N-연결된 글리칸은 적어도 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 25%의 FA2G2S1를 포함한다.
일부 실시형태에서, N-연결된 글리칸은 적어도 약 10%, 20%, 30% 또는 40%의 FA2G2S2를 포함한다. 일부 실시형태에서, N-연결된 글리칸은 적어도 약 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5%, 30%, 32.5%, 35%, 37.5% 또는 40%의 FA2G2S2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드 복합체는 O-연결된 글리칸을 포함한다. 일부 실시형태에서, 글리칸 중 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%는 코어-1 O-연결된 글리칸이다.
일부 실시형태에서, 코어-1 O-연결된 글리칸은 대부분 일시알릴화되고/되거나 이시알릴화된다.
추가로 본 명세서에는 O-연결된 글리칸 및 N-연결된 글리칸 둘 다를 갖는 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 복합체의 O-연결된 글리칸은 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%의 글리칸을 갖고, 이것은 코어-1 O-연결된 글리칸 구조를 갖고; 폴리펩티드 복합체는 FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA3G3S1, FA2F1G2S2, FA3G2S2 및 FA3G3S3을 포함하는 N-연결된 글리칸을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 5의 서열을 갖고, IL-15Rα는 서열번호 6, 7, 10, 12, 14 또는 21의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, N-연결된 글리칸은 적어도 약 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20% 또는 22.5%의 FA2G2S1을 포함한다. 일부 실시형태에서, N-연결된 글리칸은 적어도 10%, 20%, 30% 또는 40%의 FA2G2S2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 코어-1 O-연결된 글리칸은 대부분 일시알릴화되고/되거나 이시알릴화된다.
추가로 본 명세서에는 비-인간 세포에서 생산된 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체가 개시되며, IL-15/IL-15Rα 이종이량체는 α(2,6) O-연결된 시알릴화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 세포는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 실시형태에서, CHO 세포는 매트립타제(matriptase)의 기능을 손상시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체는 O-연결된 글리칸을 포함하고, 글리칸 중 적어도 90% 또는 95%는 코어-1 O-연결된 글리칸이다. 일부 실시형태에서, O-글리칸 중 약 15%는 α(2,6)-연결된 시알릴화를 갖는다.
추가로 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 복합체 중 어느 하나 또는 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
추가로 본 명세서에는 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 비-인간 세포가 개시되며, 세포에 의해서 발현되는 IL-15 및 IL-15Rα는 이종이량체를 형성하고, 이종이량체는 α(2,6)-연결된 시알릴화를 포함한다.
추가로 본 명세서에는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법이 개시된다.
추가로 본 명세서에는 IL-15/IL-15α 이종이량체를 발현하는 세포를 생산하는 방법이 개시되며, 이 방법은, (a) 비-인간 세포를 제공하는 단계; (b) 비-인간 세포에 2개의 벡터를 동시에 형질주입하고 - 상기 2개의 벡터는 IL-15Rα 및 IL-15 둘 다를 암호화하는 제1 벡터 및 IL-15Rα의 일부를 암호화하는 제2 벡터를 포함함 -, 형질주입된 세포를 배양하는 단계; (c) 단계 b)로부터의 세포에 IL-15를 암호화하는 제3 벡터를 형질주입하고, 형질주입된 세포를 배양하는 단계; 및 (d) IL-15/IL-15α 이종이량체를 발현하는 개별 클론을 단리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-인간 세포는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 실시형태에서, CHO 세포는 매트립타제 유전자의 기능을 손상시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, IL-15Rα는 서열번호 12의 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-15는 서열번호 5의 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-15 Rα의 일부는 IL-15Rα의 가용성 부분이다. 일부 실시형태에서, IL-15Rα의 가용성 부분은 서열번호 10의 서열을 갖는다.
추가로 본 명세서에는 IL-15/IL-15 Rα 이종이량체의 생산 방법이 개시되며, 이 방법은 (a) 상기에서 생산된 세포를 IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 발현 및 IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 분비를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계 및 (b) 세포 배양물로부터 상기 IL-15/IL-15α 이종이량체를 단리시키는 단계를 포함한다.
추가로 본 명세서에는 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 개시되고, 폴리펩티드 복합체는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해서 생산되고, 폴리펩티드 복합체는 IL-15Rα 쇄 스플라이싱 변이체를 갖지 않는다.
일부 실시형태에서, IL-15Rα 쇄 스플라이싱 변이체는 I1에서 G159까지에 걸쳐 있는 159개의 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, CHO 세포는 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변형된다.
도 1a 내지 도 1c는 pBW1697, pBW1703 및 pBW1916의 벡터 맵을 도시한다. 벡터 pBW1697 (a)은 IL-15 및 IL-15Rα의 발현을 위한 유전자를 포함하고; pBW1703 (b)은 IL-15Rα의 발현을 위한 유전자를 포함하고, (c) pBW1916은 IL-15의 발현을 위한 유전자를 포함한다. 3개의 플라스미드 모두 벡터의 선형화에 사용되는 SwaI 부위를 포함한다.
도 2a 내지 도 2c는 안정성 연구의 시작 및 끝에서 IL-15/IL-15Rα(C009)를 생산하는 세포의 노던 블롯 분석을 도시한다. 세포의 IL-15 (a), 프로펩티드를 갖는 IL-15 자체의 SP (b) 및 IL-15Rα (c) mRNA 발현을 노던 블롯으로 분석하였다. 0.5 내지 10 kb RNA 래더(ladder)를 레인 M에 로딩하고, 모체 CHO-MaKo 세포로부터의 대조군 RNA를 레인 P에 로딩하였다. (a) IL-15 mRNA의 예상 1 kb 밴드 크기가 검출되었다. (b) 프로펩티드를 갖는 IL-15 자체의 SP mRNA의 예상 1 kb 밴드 크기가 검출되었다. (c) IL-15Rα mRNA의 예상 1 kb 밴드 크기가 검출되었다. 모체 세포에 대해서는 어떠한 신호도 감지되지 않았다.
도 3a 내지 도 3c는 안정성 연구의 시작 및 끝에서 IL-15/IL-15Rα(C009)를 생산하는 세포의 서던 블롯 분석을 도시한다. 세포로부터의 게놈 DNA를 제한 효소 MfeI로 분해하고, IL-15 유전자 서열을 표적으로 하는 프로브 So465 (a), IL-15 자체의 SP + 프로펩티드 서열을 표적으로 하는 프로브 So466 (b) 및 IL-15Rα 유전자 서열을 표적으로 하는 프로브 So467 (c)을 사용하여 서던 블롯으로 분석하였다. DNA 래더(Molecular DNA Marker VII, Roche)를 레인 M에 로딩하였다. 레인 1 내지 3은 모체 CHO-MaKo 세포로부터의 MfeI-분해 게놈 DNA를 함유하였고, 게놈당 5개의 카피에 스파이크된 MfeI-분해 pBW1697(레인 1), pBW1703(레인 2) 및 pBW1916(레인 3)을 갖거나, 갖지 않았다(레인 4). (a) IL-15 단편에 대한 1.9 kb의 예상 밴드 크기는 pBW1697(레인 1), pBW1916(레인 3) 및 안정성의 시작 및 끝(레인 5 및 6)에서 검출된다. (b) IL-15 자체의 SP + 프로펩티드 단편에 대한 1.9 kb의 예상 밴드 크기는 pBW1697(레인 1)로부터 검출되며, 안정성의 시작 및 끝(레인 5 및 레인 6)에서 어떠한 밴드도 검출되지 않는다. (c) IL-15Rα 단편(IL-15Rα FL)에 대한 2.5 kb의 예상 밴드 크기는 pBW1697(레인 1)로부터 검출되고, 2 kb(IL-15Rα 졸)의 밴드 크기는 pBW1703(레인 2)로부터 그리고 안정성의 시작 및 끝(레인 5 및 레인 6)에서 검출된다. 모체 세포에 대해서는 어떠한 신호도 검출되지 않을 수 있다.
도 4는 안정성의 시작 및 끝에서 IL-15/IL-15Rα(C009)를 생산하는 세포의 트랜스진 카피 수를 도시한다. IL-15/자체의 SP(검정색 열), IL-15Rα/UTR12SP(진회색 열) 및 IL-15/UTR12SP(밝은 회색 열) 유전자 카피 수(반수체 게놈당)는 IL-15/IL-15Rα 및 CHO-MaKo 모체 세포를 생산하는 세포에 대한 qPCR에 의해 측정되었다.
도 5a 및 도 5b는 α 2,3- 및 α 2,6-연결 시알산 차이를 도시한다. 패널 A는 6'시알릴락토스의 에틸-에스테르화를 나타내고, 패널 B는 3'-시알릴락토스에 대한 락톤의 형성을 나타낸다.
도 6은 het IL-15의 O-글리칸 분포를 도시한다.
도 7은 코어 1형 구조를 도시한다.
도 8은 코어 2형 구조를 도시한다.
도 9는 het IL-15의 MS 스펙트럼을 도시한다.
도 10은 het IL-15를 생산하는 HEK 및 CHO의 N-글리칸 프로파일을 도시한다.
도 11은 het IL-15를 생산하는 HEK의 N-글리칸 프로파일을 도시한다.
도 12는 het IL-15를 생산하는 CHO의 N-글리칸 프로파일을 도시한다.
도 13은 글리칸의 개별 빌딩 블록에 대한 명명법을 도시한다.
도 14는 용량 축소 및 확장 연구 설계를 도시한다.
도 15는 HEK293 배치 및 CHO 배치의 크로마토그래피 프로파일을 도시한다.
일반론
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 상세한 설명 전체에 걸쳐 특정 용어가 정의된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
용어
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 다음의 용어 및 어구는 다음의 의미를 갖는다:
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 상기 물품의 문법적 목적물 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 하나)을 지칭한다.
용어 "또는"은, 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용되고, "및/또는"과 상호 호환적으로 사용된다.
"약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정확도를 고려하여, 측정된 양에 대해 허용되는 오차의 정도를 의미할 것이다. 예시적인 오차의 정도는 주어진 값 또는 값의 범위의 20퍼센트(%) 이내, 통상적으로 10% 이내, 보다 전형적으로 5% 이내이다.
용어 "질환" 및 "장애"는 병태, 특히 병리학적 병태를 지칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 특정 실시형태에서, 용어 "질환" 및 "장애"는 상호 호환적으로 사용되어 IL-15 신호전달에 의해 영향을 받는 질환 및/또는 면역 효과기 반응의 촉진에 의해 영향을 받는 질환을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 장애, 예를 들어, 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간의 감소 또는 개선, 또는 하나 이상의 요법의 투여로부터 얻은, 장애의 하나 이상의 증상(바람직하게는, 하나 이상의 식별 가능한 증상)의 개선을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 환자가 반드시 식별할 수 있는 것은 아닌, 증식성 장애, 예컨대 종양의 성장의 적어도 하나의 측정가능한 신체적 매개변수의 개선을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은, 예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 이들 둘 다로의 증식성 장애의 진행의 억제를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 종양 크기 또는 암성 세포 계수의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "요법들" 및 "요법"은 질환, 예를 들어, 암, 전염병, 림프구 감소증 및 면역결핍증 또는 이와 관련된 증상의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜(들), 방법(들), 조성물, 제형 및/또는 제제(들)을 지칭할 수 있다. 특정 실시형태에서, 용어 "요법들" 및 "요법"은 당업자에게 공지된 질환 또는 이와 관련된 증상을 치료, 관리, 예방 또는 개선하는데 유용한 생물학적 치료법, 지지적 치료법 및/또는 다른 치료법을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 수용체(예를 들어, 천연(native) IL-15Rα 또는 IL-15 수용체 βγ) 및 리간드(예를 들어, 천연 IL-15) 상호작용과 관련하여, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다" 및 유사한 용어는 리간드와 수용체 사이의 특이적 결합 또는 연합을 지칭한다. 바람직하게는, 리간드는 다른 분자보다 수용체에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 구체적인 실시형태에서, 리간드는 천연 IL-15이고, 천연 수용체는 IL-15Rα이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 리간드는 천연 IL-15/IL-15Rα 복합체이고, 천연 수용체는 βγ 수용체 복합체이다. 추가의 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 βγ 수용체 복합체에 결합하고, IL-15 매개된 신호전달을 활성화시킨다. 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어, 면역검정, BIAcoreTM, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의해 동정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 용어 "면역특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 항원(예를 들어, 에피토프 또는 면역 복합체)에 특이적으로 결합하고 또 다른 분자에 특이적으로 결합하지 않는 분자를 지칭한다. 항원에 특이적으로 결합하는 분자는, 예를 들어, 면역검정, BIAcoreTM 또는 당업계에 공지된 다른 검정에 의해 측정된 바와 같이, 보다 낮은 친화도를 갖는 다른 항원에 결합할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항원에 결합하는 분자는 다른 항원과 교차-반응하지 않는다.
"조합물" 또는 "와 조합하여"는 요법 또는 치료제가 동일한 시간에 투여되고/되거나 함께 전달을 위하여 제형화되어야 함을 암시하고자 하는 것은 아니지만, 이들 전달 방법은 본 명세서에 기재된 범주 이내에 있다. 조합물 형태의 치료제는 1종 이상의 다른 추가 요법 또는 치료제와 동시에, 그 전에, 또는 그에 후속하여 투여될 수 있다. 치료제 또는 치료 프로토콜은 임의의 순서대로 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 작용제는 그 작용제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 일정으로 투여될 것이다. 이 조합으로 사용되는 추가 치료제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 상이한 조성물로 별도로 투여될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 일반적으로, 조합되어 사용되는 추가의 치료제는 개별적으로 사용되는 수준을 초과하지 않는 수준으로 사용될 것으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 조합되어 사용되는 수준은 개별적으로 사용되는 수준보다 더 낮을 것이다.
용어 "항암 효과"는, 예를 들어, 종양 부피의 감소, 암세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암세포 증식의 감소, 암세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 먼저 암 발생의 예방에서의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "항종양 효과"는, 예를 들어, 종양 부피의 감소, 종양세포 수의 감소, 종양세포 증식의 감소, 또는 종양세포 생존의 감소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "암"은 비정상 세포의 급속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예는 본 명세서에 기재되어 있으며, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 대장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 용어 "종양" 및 "암"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어, 이들 둘 다의 용어는 고형 및 액상, 예를 들어, 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "암" 또는 "종양"은 악성, 뿐만 아니라 전암성 암 및 종양을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역 효과기" 또는 "효과기" "기능" 또는 "반응"은, 예를 들어, 표적 세포의 면역 공격을 증진하거나 촉진하는 면역 효과기 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 이의 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T세포 또는 NK세포의 특성을 지칭한다. T세포의 경우, 일차 자극 및 공동자극은 면역 효과기 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "효과기 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 특정된 서열, 또는 그것과 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어, 특정된 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다. 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제2 아미노산 서열내 정렬된 아미노산 잔기와 i) 동일하거나 또는 ii) 이의 보존적 치환인 아미노산 잔기의 충분한 수 또는 최소 수를 함유하여, 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능 활성을 가질 수 있도록 하는 제1 아미노산을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 참조 서열, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 공통 구조 도메인을 함유하는 아미노산 서열.
뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제2 핵산 서열에서 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드의 충분한 수 또는 최소 수를 함유하여, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통 기능 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 공통 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통 기능적 폴리펩티드 활성을 암호화하도록 하는 제1 핵산 서열을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 기준 서열, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 서열에 대하여 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열.
용어 "기능적 변이체"는 자연 발생 또는 야생형 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 자연 발생 또는 야생형 서열의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다.
서열 간의 상동성 또는 서열 동일성(이 용어들은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 갭이 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있으며, 비-상동 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 바람직한 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95% 및 더욱 바람직하게는 적어도 100%이다. 그리고 나서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등함).
상기 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수로서, 상기 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다.
2개 서열들 사이의 서열의 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 두 아미노산 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, 문헌[Needleman and Wunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)]의 알고리즘을 이용하여 결정되며, 이는 GCG 소프트웨어 패키지(NCBI에서 이용 가능함)의 GAP 프로그램 내에 포함된 것이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 특히 바람직한 매개변수 세트(및 달리 명시되지 않는 한 사용되어야 하는 것)는 12의 갭 페널티, 4의 갭 확장 페널티 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스이다.
두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내에 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller((1989) CABIOS, 4:11-17)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어, 다른 계열 구성원 또는 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드 길이 = 12로 수행되어 본 발명의 핵산(서열번호 2) 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이, Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개변수가 사용될 수 있다(NBCI에서 이용 가능).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "낮은 엄격성, 중간 엄격성, 높은 엄격성 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화하는"은 혼성화 및 세척 조건을 설명한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 수성 및 비수성 방법은 이 참고문헌에 기재되어 있으며, 어느 것이든 사용될 수 있다. 본 명세서에서 나타내는 특정 혼성화 조건은 하기와 같다: 1) 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서의 낮은 엄격성 혼성화 조건, 이어서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중 적어도 50℃(낮은 엄격성 조건에서는 세척물의 온도를 55℃로 증가시킬 수 있음)에서 2회 세척; 2) 약 45℃에서 6X SSC에서의 중간 엄격성 혼성화 조건, 이어서 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; 3) 약 45℃에서 6X SSC에서의 높은 엄격성 혼성화 조건, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; 및 바람직하게는 4) 매우 높은 엄격성 혼성화 조건은 65℃에서 0.5M 인산 나트륨, 7% SDS, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상 세척한다. 매우 높은 엄격성 조건(4)이 바람직한 조건이며, 달리 명시되지 않는 한 이것이 사용되어야 한다.
본 발명의 분자는 그의 기능에 실질적인 영향을 미치지 않는 추가의 보존적 또는 비-필수적 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "아미노산"은 아미노 작용기 및 산 작용기 모두를 포함하고 자연 발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는, 자연 또는 합성의 모든 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 예시적인 아미노산에는 자연 발생 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동족체; 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 전술한 임의의 것의 모든 입체이성질체가 포함된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-광학 이성질체 및 펩티드모방체를 모두 포함한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"(단일 쇄의 경우)은 본 명세서에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 개질된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 개질된 아미노산 중합체; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작을 포괄한다. 폴리펩티드는 자연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 진핵 또는 원핵 숙주로부터 재조합 기법에 의해 생산될 수 있거나, 합성 절차의 산물일 수 있다.
용어 "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 호환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드건 리보뉴클레오티드건, 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥이거나 이중-가닥일 수 있으며, 단일-가닥인 경우 암호 가닥 또는 비-암호(안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 개질될 수 있다. 핵산은 자연 발생하지 않거나 또는 비자연적 배열에서 또 다른 폴리뉴클레오티드에 결합되는 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성 기원의 재조합 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 그의 원래의 또는 천연 환경(예를 들어, 그것이 자연 발생이라면 자연 환경)으로부터 제거된 물질을 지칭한다. 예를 들어, 살아 있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만 인간의 개입에 의해 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 이것이 자연에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "글리칸"은 당인데, 이것은 당 잔기의 단량체 또는 중합체, 예컨대, 적어도 3개의 당일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다(예를 들어, α 1,3 아암 및 α 1,6 아암을 갖는다). "글리칸"은 자연 당 잔기(예를 들어, 글루코스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸 뉴라민산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 헥소스, 아라비노스, 리보스, 자일로스 등) 및/또는 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 2'-데옥시리보스, 포스포만노스, 6'설포 N-아세틸글루코사민 등)를 포함할 수 있다. 용어 "글리칸"은 당 잔기의 단독중합체 및 이종중합체를 포함한다. 용어 "글리칸"은 또한 당접합체의(예를 들어, 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸 등의) 글리칸 성분을 포함한다. 이 용어는 또한 당접합체로부터 절단되었거나 달리 방출되었을 글리칸을 포함하는 유리 글리칸을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "당단백질"은 하나 이상의 당 모이어티(즉, 글리칸)에 공유 연결된 펩티드 골격을 함유하는 단백질을 지칭한다. 당 모이어티(들)는 단당류, 이당류, 올리고당류 및/또는 다당류의 형태로 존재할 수 있다. 당 모이어티(들)는 당 잔기의 단일의 비분지형 쇄를 포함할 수 있거나 하나 이상의 분지형 쇄를 포함할 수 있다. 당단백질은 O-연결된 당 모이어티 및/또는 N-연결된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 다당류는 세린 또는 트레오닌(O-글리코실화된 폴리펩티드)의 OH기를 통해서 또는 아스파라긴(N-글리코실화된 폴리펩티드)의 아미드기(NH2)를 통해서 부착된다. 당단백질은 숙주 세포에 상동성이거나, 바람직하게는 그것을 발현하는 숙주 세포에 비상동성이고, 즉, 외인성이고, 예를 들어, CHO 세포에 의해서 생산되는 인간 단백질이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "당접합체"는 적어도 하나의 당 모이어티가 적어도 하나의 다른 모이어티에 공유 연결된 모든 분자를 포함한다. 이 용어는 예를 들어, N-연결된 당단백질, O-연결된 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸 등을 포함하는, 공유 부착된 당 모이어티를 갖는 모든 생물분자 모두를 구체적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "글리코실화 패턴"은 특정 샘플 상에 존재하는 글리칸 구조물의 세트를 지칭한다. 예를 들어, 특정 당접합체(예를 들어, 당단백질) 또는 당접합체의 세트(예를 들어, 당단백질의 세트)는 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 글리칸의 글리코실화 패턴을 참조한다. 글리코실화 패턴은 예를 들어, 글리칸의 실체, 개별 글리칸 또는 특정 유형의 글리칸의 (절대적 또는 상대적)양, 글리코실화 부위의 점유 정도 등 또는 이러한 매개변수의 조합을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다양한 양상이 하기에 추가로 상세하게 기재된다. 추가적인 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 기재된다.
글리코실화
용어 "글리코실화"는 폴리펩티드에 대한 다당류의 부착을 지칭한다. 바람직하게는, 다당류는 글리코시드 결합에 의해 함께 연결된 2 내지 12개의 단당류로 이루어진다. 당단백질은 O-연결된 당 모이어티 및/또는 N-연결된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 특정 글리코실화 부위에 부착된 당 모이어티의 구조 및 수는 다양할 수 있다. 이러한 당 모이어티는 예를 들어, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 푸코스, 자일로스, 글루쿠론산, 이두론산 및/또는 시알산일 수 있다.
용어 "N-연결된 글리코실화"는 아미노산 쇄의 아스파라긴 잔기에 대한 다당류의 부착을 지칭한다.
용어 "O-연결된 글리코실화"는 아미노산 쇄의 세린 또는 트레오닌 잔기에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다.
본 출원에서 상호 호환적으로 사용되는 용어 "당 프로파일" 또는 "글리코실화 프로파일"은 글리코실화된 폴리펩티드의 글리칸 성질을 기재한다. 이러한 특성은 바람직하게는 글리코실화 부위 또는 글리코실화 부위의 점유 또는 폴리펩티드의 글리칸 및/또는 비-당 부분의 실체, 구조, 조성 또는 양 또는 특정 당형태(glycoform)의 실체 및 양이다.
N-아세틸뉴라민산(NANA)은 N- 및 O-연결 글리칸의 주요 구성성분이다. NANA는 인간에서 단백질의 글리코실화 사건 내에서 뉴라민산의 우세한 형태인 한편, 다른 포유동물은 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)과 같은 다른 유도체를 또한 포함할 수 있다. NANA는 N-글리칸 및 O-글리칸의 코어 구조에 여러 방식으로 연결될 수 있다. 우세하게, α(2, 8)와 같은 다른 연결이 존재하지만 주로 후속 당류에 대한 α(2, 3) 및 α(2, 6) 연결을 찾을 수 있다. 인간 세포, 예를 들어, 인간 배아 신장(HEK) 세포는 주로 α(2, 6) 연결된 시알화를 생성하는 반면, 많은 생산 세포주, 예컨대, CHO 세포주는 α(2, 3) 연결된 시알화를 생성한다.
CHO 세포에서, 효소 자체에 대한 유전자는 씨.그리세우스에 존재하지만, 코어 글리칸 구조(베타-갈락토사이드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1)에 대한 알파(2-6) 연결된 NANA 확장을 생성하는 역할을 하는 효소는 CHO 세포에서 불활성이거나 발현되지 않는 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Chung et al. (2017) Biotechnol. J. 12:1600502] 참조). 본 발명은 CHO 세포에서 생산된 IL-15/IL-15Rα 복합체가 인간 세포주에 의해 생산된 IL-15/IL-15Rα 복합체와 비교하여 상이한 글리코실화 패턴을 갖는다는 예상치 못한 발견에 기초한다. 또한, CHO 세포에서 생성된 IL-15/IL-15Rα 복합체에서 알파(2-6) 연결 유형 글리칸이 관찰되었다. 이러한 글리코실화 패턴은 고유하다. 그것은 인간 글리코실화 형태에 더 가깝기 때문에 예상되는 CHO 패턴과 비교하여 직접적인 이점을 잠재적으로 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-15/IL-15Rα 이종이량체는 하기 표 1에 제시된 바와 같은 글리칸 종 중 하나 이상을 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
IL-15
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-15" 및 "인터류킨-15"는 천연 IL-15 또는 IL-15 유도체를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "천연 IL-15" 및 "천연 인터류킨-15"는 미성숙 또는 전구체 및 성숙 형태를 포함하는, 임의의 자연 발생 및 야생형 포유동물 인터류킨-15 아미노산 서열을 지칭한다. 천연 포유동물 인터류킨-15의 다양한 종의 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁 번호의 비제한적 예로는 NP_000576(인간, 미성숙 형태), CAA62616(인간, 미성숙 형태), NP_001009207(펠리스 카투스(Felis catus), 미성숙 형태), AAB94536(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 미성숙 형태), AAB41697(라투스 노르베기쿠스, 미성숙 형태), NP_032383 (무스 무스쿨루스(Mus musculus), 미성숙 형태), AAR19080(개), AAB60398(마카카 물라타(Macaca mulatta), 미성숙 형태), AAI00964(인간, 미성숙 형태), AAH23698(무스 무스쿨루스, 미성숙 형태) 및 AAH18149(인간)이 포함된다. 표 2의 서열번호 1에 제공된 바와 같이, 긴 신호 펩티드(밑줄표시) 및 성숙 인간 천연 IL-15(이탤릭체)를 포함하는 인간 IL-15의 미성숙/전구체 형태의 아미노산 서열. 일부 실시형태에서, 천연 IL-15는 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15의 미성숙 또는 전구체 형태이다. 다른 실시형태에서, 천연 IL-15는 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15의 성숙 형태이다. 구체적인 실시형태에서, 천연 IL-15는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15의 전구체 형태이다. 구체적인 실시형태에서, 천연 IL-15는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15의 성숙 형태이다. 일 실시형태에서, 천연 IL-15 단백질/폴리펩티드는 단리되거나 정제된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 용어 "천연 IL-15" 및 "천연 인터류킨-15"는 미성숙 또는 전구체 및 성숙 형태를 포함하는, 포유동물 인터류킨-15를 암호화하는 임의의 자연 발생 핵산 서열 또는 야생형 핵산 서열을 지칭한다. 다양한 종의 천연 포유동물 IL-15의 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁 번호의 비제한적 예로는 NM_000585(인간), NM_008357(무스 무스쿨루스) 및 RNU69272(라투스 노르베기쿠스)가 있다. 표 2의 서열번호 2에 제공된 바와 같이, 긴 신호 펩티드(밑줄표시)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙 인간 IL-15(이탤릭체)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 천연 인간 Il-15의 미성숙/전구체 형태를 암호화하는 뉴클레오티드 서열. 구체적인 실시형태에서, 핵산은 단리되거나 정제된 핵산이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15의 미성숙 또는 전구체 형태를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 핵산은 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15의 성숙 형태를 암호화한다. 구체적인 실시형태에서, 천연 IL-15를 암호화하는 핵산은 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15의 전구체 형태를 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 천연 IL-15를 암호화하는 핵산은 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15의 성숙 형태를 암호화한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "IL-15 유도체" 및 "인터류킨-15 유도체"는 하기를 지칭한다: (a) 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드; (b) 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드; (c) 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 아미노산 돌연변이(즉, 부가, 결실 및/또는 치환)를 함유하는 폴리펩티드; (d) 야생형 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화될 수 있는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드; (e) 적어도 20개의 연속적인 아미노산, 적어도 30개의 연속적인 아미노산, 적어도 40개의 연속적인 아미노산, 적어도 50개의 연속적인 아미노산, 적어도 100개의 연속적인 아미노산 또는 적어도 150개의 연속적인 아미노산의 야생형 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 단편을 암호화하는 핵산 서열에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및/또는 (f) 야생형 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 단편. IL-15 유도체는 또한 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 자연 발생 또는 야생형 성숙 형태의 아미노산 서열 및 이종 신호 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15 유도체는 천연 인간 IL-15 폴리펩티드의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 유도체는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 미성숙 또는 전구체 형태의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 유도체는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 성숙 형태의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 유도체는 예를 들어, 문헌[Zhu et al., (2009), J. Immunol. 183: 3598] 또는 미국 특허 제8,163,879호에 기재된 IL-15N72D이다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 유도체는 미국 특허 제8,163,879호에 기재된 IL-15 변이체 중 하나이다. 일 실시형태에서, IL-15 유도체는 단리되거나 정제된다.
바람직한 실시형태에서, IL-15 유도체는 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, ELISA, BIAcoreTM, 동시-면역침전법에 의해 측정된 바와 같이, IL-15Rα 폴리펩티드에 결합하기 위한 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 기능의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, IL-15 유도체는 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, 전기이동성 이동 검정, ELISA 및 다른 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, Il-15-매개된 신호 전달을 유도하기 위한 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 기능의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15 유도체는 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 리간드/수용체 결합 검정에 의해 평가되는 바와 같이 IL-15Rα 및/또는 IL-15Rβγ에 결합한다. 동일성 백분율은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 용어 "IL-15 유도체" 및 "인터류킨-15 유도체"는 하기를 지칭한다: (a) 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열; (b) 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; (c) 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 핵산 염기 돌연변이(즉, 부가, 결실 및/또는 치환)를 함유하는 핵산 서열; (d) 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 핵산 서열; (e) 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 단편에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에 혼성화하는 핵산 서열; 및/또는 (f) 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 단편을 암호화하는 핵산 서열. 구체적인 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15 유도체는 인간 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15 유도체는 인간 IL-15 폴리펩티드의 미성숙 또는 전구체 형태를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15 유도체는 인간 IL-15 폴리펩티드의 성숙 형태를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15 유도체는 예를 들어, 상기 Zhu 등의 2009년 문헌, 또는 미국 특허 제8,163,879호에 기재된 IL-15N72D를 암호화하는 핵산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15 유도체는 미국 특허 제8,163,879호에 기재된 IL-15 변이체들 중 하나를 암호화하는 핵산 서열이다.
IL-15 유도체 핵산 서열은 IL-15 폴리펩티드의 성숙 및 미성숙 형태를 포함하는, 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-15 유도체 핵산은 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 잠재적 스플라이스 부위 및 불안정성 요소(예를 들어, A/T 또는 A/U 풍부한 요소)를 제거하여, 포유동물 IL-15 RNA 전사체의 안정성을 증가시키는 돌연변이를 함유하는 포유동물 IL-15 RNA 전사체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, IL-15 유도체 핵산 서열은 WO2007/084342에 기술된 코돈-최적화 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, IL-15 유도체 핵산 서열은 표 2의 서열번호 4의 코돈-최적화 서열이다(상기 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 표 2의 서열번호 5에 제공됨).
바람직한 실시형태에서, IL-15 유도체 핵산 서열은 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, ELISA, BIAcoreTM, 동시-면역침전법에 의해 측정된 바와 같이, IL-15Rα에 결합하기 위한 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 기능의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, IL-15 유도체 핵산 서열은 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, 전기이동성 이동 검정(electromobility shift assay), ELISA 및 다른 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, IL-15-매개된 신호 전달을 유도하기 위한 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 기능의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15 유도체 핵산 서열은 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 리간드/수용체 분석에 의해 평가되는 바와 같이 IL-15Rα 및/또는 IL-15Rβγ에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.
IL-15Rα
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-15Rα" 및 "인터류킨-15 수용체 알파"는 천연 IL-15Rα, IL-15Rα 유도체, 또는 천연 IL-15Rα 및 IL-15Rα 유도체를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "천연 IL-15Rα" 및 "천연 인터류킨-15 수용체 알파"는 미성숙 또는 전구체 및 성숙 형태 및 자연 발생 아이소폼을 포함하는, 임의의 자연 발생 및 야생형 포유동물 인터류킨-15 수용체 알파("IL-15Rα") 아미노산 서열을 지칭한다. 다양한 천연 포유동물 IL-15Rα의 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁 번호의 비제한적인 예로는 NP_002180(인간), ABK41438(마카카 물라타), NP_032384(무스 무스쿨루스), Q60819(무스 무스쿨루스), CAI41082(인간)을 포함한다. 표 2의 서열번호 6에 제공된 바와 같이, 신호 펩티드(밑줄표시) 및 성숙 인간 천연 IL-15Rα(이탤릭체)를 포함하는 천연 전장 인간 IL-15Rα의 미성숙 형태의 아미노산 서열. 표 2의 서열번호 7에 제공된 바와 같이, 신호 펩티드(밑줄표시) 및 성숙 인간 천연 가용성 IL-15Rα(이탤릭체)를 포함하는 천연 가용성 인간 IL-15Rα의 미성숙 형태의 아미노산 서열. 일부 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 미성숙 형태이다. 다른 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 성숙 형태이다. 특정 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 자연 발생 또는 야생형 가용성 형태이다. 다른 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 전장 형태이다. 구체적인 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 미성숙 형태이다. 또 다른 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 성숙 형태이다. 특정 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 자연 발생 또는 야생형 가용성 형태이다. 다른 실시형태에서, 천연 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 전장 형태이다. 일 실시형태에서, 천연 IL-15Rα 단백질 또는 폴리펩티드는 단리되거나 정제된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 용어 "천연 IL-15Rα" 및 "천연 인터류킨-15 수용체 알파"는 미성숙 또는 전구체 및 성숙 형태를 포함하는, 포유동물 인터류킨-15 수용체 알파를 암호화하는 임의의 자연 발생 헥산 서열 또는 야생형 핵산 서열을 지칭한다. 다양한 종의 천연 포유동물 IL-15Rα의 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁 번호의 비제한적 예로는 NM_002189(인간), EF033114(마카카 물라타) 및 NM_008358(무스 무스쿨루스)가 있다. 표 2의 서열번호 8에 제공된 바와 같이, 신호 펩티드(밑줄표시)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙 천연 인간 IL-15Rα(이탤릭체)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 천연 인간 IL-15Rα의 미성숙 형태를 암호화하는 뉴클레오티드 서열. 표 2의 서열번호 9에 제공된 바와 같이, 신호 펩티드(밑줄표시)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙 인간 천연 가용성 IL-15Rα(이탤릭체)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 천연 가용성 인간 IL-15Rα 단백질 또는 폴리펩티드의 미성숙 형태를 암호화하는 뉴클레오티드 서열. 구체적인 실시형태에서, 핵산은 단리되거나 정제된 핵산이다. 일부 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 미성숙 형태를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 성숙 형태를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 가용성 형태를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 전장 형태를 암호화한다. 구체적인 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 전구체 형태를 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 성숙 형태를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 가용성 형태를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 자연 발생 핵산은 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 전장 형태를 암호화한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "IL-15Rα 유도체" 및 "인터류킨-15 수용체 알파 유도체"는 하기를 지칭한다: (a) 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드; (b) 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드; (c) 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 아미노산 돌연변이(즉, 부가, 결실 및/또는 치환)를 함유하는 폴리펩티드; (d) 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드; (e) 적어도 20개의 연속적인 아미노산, 적어도 30개의 연속적인 아미노산, 적어도 40개의 연속적인 아미노산, 적어도 50개의 연속적인 아미노산, 적어도 100개의 연속적인 아미노산 또는 적어도 150개의 연속적인 아미노산의 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드의 단편을 암호화하는 핵산 서열에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드; (f) 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 단편; 및/또는 (g) 본 명세서에 기재된 특정 IL-15Rα 유도체. IL-15Rα 유도체는 또한 자연 발생 또는 야생형 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 성숙 형태의 아미노산 서열 및 이종 신호 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 미성숙 형태의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 성숙 형태의 유도체이다. 일 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 가용성 형태이다. 즉, 특정 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 포유동물 IL-15Rα의 가용성 형태를 포함하며, 상기 가용성 형태는 자연 발생이 아니다. IL-15Rα 유도체의 다른 예는 본 명세서에 기재된, 천연 인간 IL-15Rα의 절단된 가용성 형태를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 정제되거나 단리된다.
바람직한 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, ELISA, BIAcoreTM, 동시-면역침전법에 의해 측정된 바와 같이, IL-15 폴리펩티드에 결합하기 위한 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 기능의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, 전기이동성 이동 검정, ELISA 및 다른 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, IL-15-매개된 신호 전달을 유도하기 위한 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 기능의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 검정된 바와 같이 IL-15에 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 용어 "IL-15Rα 유도체" 및 "인터류킨-15 수용체 알파 유도체"는 하기를 지칭한다: (a) 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열; (b) 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; (c) 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 핵산 돌연변이(즉, 부가, 결실 및/또는 치환)를 함유하는 핵산 서열; (d) 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 핵산 서열; (e) 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 단편에 높은, 중간 또는 전형적인 엄격성 혼성화 조건 하에 혼성화하는 핵산 서열; (f) 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 단편을 암호화하는 핵산 서열; 및/또는 (g) 본 명세서에 기재된 특정 IL-15Rα 유도체를 암호화하는 핵산 서열. 구체적인 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15Rα 유도체는 인간 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15Rα 유도체는 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 미성숙 형태를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15Rα 유도체는 인간 IL-15Rα 폴리펩티드의 성숙 형태를 암호화하는 자연 발생 또는 야생형 핵산 서열의 유도체이다. 일 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15Rα 유도체는 가용성인 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15Rα 유도체는 천연 포유동물 IL-15Rα의 가용성 형태를 암호화하는 핵산 서열을 지칭하며, 상기 가용성 형태는 자연 발생이 아니다. 일부 실시형태에서, 핵산과 관련하여 IL-15Rα 유도체는 인간 IL-15Rα의 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 지칭하며, 상기 인간 IL-15Rα의 유도체는 자연 발생이 아닌 IL-15Rα의 가용성 형태이다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα 유도체 핵산 서열은 단리되거나 정제된다.
IL-15Rα 유도체 핵산 서열은 IL-15Rα 폴리펩티드의 성숙 및 미성숙 형태를 포함하는, 천연 IL-15Rα 폴리펩티드를 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-15Rα 유도체 핵산은 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 잠재적 스플라이스 부위 및 불안정성 요소(예를 들어, A/T 또는 A/U 풍부한 요소)를 제거하여, IL-15Rα RNA 전사체의 안정성을 증가시키는 돌연변이를 함유하는 IL-15Rα RNA 전사체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 특정 실시형태에서, IL-15Rα 유도체 핵산 서열은 표 2의 서열번호 11, 13의 코돈-최적화 서열이다(상기 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 각각 표 2의 서열번호 12, 14에 제공됨).
구체적인 실시형태에서, IL-15Rα 유도체 핵산 서열은 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, ELISA, BIAcoreTM, 동시-면역침전법에 의해 측정된 바와 같이, IL-15에 결합하기 위한 천연 포유동물 IL-15Rα 폴리펩티드의 기능의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, IL-15Rα 유도체 핵산 서열은 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, 전기이동성 이동 검정, ELISA 및 다른 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, IL-15-매개된 신호 전달을 유도하기 위한 천연 포유동물 IL-15Rα의 기능의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα 유도체 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 측정된 바와 같이 IL-15에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.
인간 IL-15Rα의 자연 발생 또는 야생형 가용성 형태가 본 명세서에 기재된다. 인간 IL-15Rα의 절두된, 가용성 형태인 특정 IL-15Rα 유도체가 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 이들 특정 IL-15Rα 유도체 및 인간 IL-15Rα의 자연 발생 또는 야생형 가용성 형태는 부분적으로 인간 IL-15Rα의 단백질분해 절단 부위의 동정에 기초한다. IL-15Rα의 글리코실화에 기초하여 규명된 IL-15Rα의 가용성 형태가 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.
인간 IL-15Rα의 단백분해 절단은 천연 전장 인간 IL-15Rα의 미성숙 형태의 제공된 아미노산 서열에서 볼드체이고 밑줄표시된 잔기(즉, Gly170 및 His171) 사이에 발생한다:
Figure pct00005
따라서, 일 양태에서, 인간 IL-15Rα의 가용성 형태(예를 들어, 인간 IL-15Rα의 정제된 가용성 형태)가 본 명세서에 제공되며, 여기서 인간 IL-15Rα의 가용성 형태의 아미노산 서열은 천연 막-결합 인간 IL-15Rα의 단백질분해성 절단 부위에서 종결된다. 특히, 인간 IL-15Rα의 가용성 형태(예를 들어, 인간 IL-15Rα의 정제된 가용성 형태)가 본 명세서에 제공되는데, 여기서 인간 IL-15Rα의 가용성 형태의 아미노산 서열은 PQG(여기서, G는 Gly170임)로 종결된다(표 2의 서열번호 20). 특정 실시형태에서, 인간 IL-15Rα의 가용성 형태(예를 들어, 인간 IL-15Rα의 정제된 가용성 형태)가 본 명세서에 제공되며, 이는 표 2의 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, (i) 표 2의 서열번호 7과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하고; (ii) 아미노산 서열 PQG(표 2의 서열번호 20)로 종결된 폴리펩티드인 IL-15Rα 유도체(예를 들어, IL-15Rα 유도체의 정제된 및/또는 가용성 형태)가 본 명세서에 제공된다. 다른 특정 실시형태에서, 인간 IL-15Rα의 가용성 형태(예를 들어, 인간 IL-15Rα의 정제된 가용성 형태)가 본 명세서에 제공되며, 이는 표 2의 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표 2의 서열번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드인, IL-15Rα 유도체(예를 들어, IL-15Rα 유도체의 정제된 및/또는 가용성 형태)가 본 명세서에 제공되며, 선택적으로, IL-15Rα 유도체의 가용성 형태의 아미노산 서열은 PQG(표 2의 서열번호 20)로 종결한다.
일부 실시형태에서, 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα의 IL-15Rα 유도체가 본 명세서에 제공되며, 상기 IL-15Rα 유도체는 가용성이며, (a) IL-15Rα 유도체의 C-말단에서의 마지막 아미노산은 아미노산 잔기 PQGHSDTT(표 2의 서열번호 15)로 구성되고; (b) IL-15Rα 유도체의 C-말단에서의 마지막 아미노산은 아미노산 잔기 PQGHSDT(표 2의 서열번호 16)로 구성되고; (c) IL-15Rα 유도체의 C-말단에서의 마지막 아미노산은 아미노산 잔기 PQGHSD(표 2의 서열번호 17)로 구성되고; (d) IL-15Rα 유도체의 C-말단에서의 마지막 아미노산은 아미노산 잔기 PQGHS(표 2의 서열번호 18)로 구성되고; 또는 (e) IL-15Rα 유도체의 C-말단에서의 마지막 아미노산은 아미노산 잔기 PQGH(표 2의 서열번호 19)로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 IL-15Rα 유도체의 아미노산 서열은 표 2의 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 이들 IL-15Rα 유도체는 정제된다.
또 다른 양태에서, IL-15Rα의 글리코실화 형태(예를 들어, IL-15Rα의 정제된 글리코실화 형태)가 본 명세서에 제공되며, IL-15Rα의 글리코실화는 당업자에게 공지된 기술에 의해 평가된 바와 같은 IL-15Rα의 질량(분자량)의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 또는 20% 내지 25%, 20% 내지 30%, 25% 내지 30%, 25% 내지 35%, 30% 내지 35%, 30% 내지 40%, 35% 내지 40%, 35% 내지 45%, 40% 내지 50%, 45% 내지 50%, 20% 내지 40%, 또는 25% 내지 50%를 차지한다. IL-15Rα의 글리코실화가 차지하는 IL-15Rα(예를 들어, 정제된 IL-15Rα)의 질량(분자량)의 백분율은 예를 들어, 제한 없이 겔 전기영동 및 겔의 정량적 농도측정법 및 IL-15Rα의 글리코실화 형태(예를 들어, IL-15Rα의 정제된 글리코실화 형태)의 평균 질량(분자량)과 IL-15Rα의 비글리코실화 형태(예를 들어, IL-15Rα의 정제된 비글리코실화 형태)의 비교를 사용하여 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15Rα(예컨대, 정제된 IL-15Rα)의 평균 질량(분자량) 은 시나핀산을 기질로 사용하여 CovalX HM-1 고 질량 검출기가 장착된 Voyager De-Pro에서 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 사용하여 측정될 수 있으며, IL-15Rα의 글리코실화 형태(예를 들어, IL-15Rα의 정제된 글리코실화 형태)의 질량을 IL-15Rα의 비-글리코실화 형태(예를 들어, IL-15Rα의 정제된 비-글리코실화 형태)의 질량과 비교하여, 글리코실화가 차지하는 질량의 백분율을 결정할 수 있다.
또 다른 양태에서, IL-15Rα의 글리코실화 형태가 본 명세서에 제공되며, 상기 IL-15Rα는 소정의 아미노산 잔기에서 글리코실화(N-글리코실화 또는 O-글리코실화)된다. 특정 실시형태에서, 하기 글리코실화 부위 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 모두에서 글리코실화된 인간 IL-15Rα가 본 명세서에 제공된다: (i) IL-15Rα에서 아미노산 서열 NWEL T ASASHQPPGVYPQG(표 2의 서열번호 22)의 위치 5에서의 트레오닌에 대한 O-글리코실화; (ii) IL-15Rα에서 아미노산 서열 NWELTA S ASHQPPGVYPQG(표 2의 서열번호 22)의 위치 7에서의 세린에 대한 O-글리코실화; (iii) IL-15Rα에서 아미노산 서열 ITCPPPM S VEHADIWVK(표 2의 서열번호 22)의 위치 8에서의 세린, 또는 IL-15Rα에서 아미노산 서열 ITCPPPM S VEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(표 2의 서열번호 23)의 위치 8에서의 세린에 대한 N-글리코실화; (iv) IL-15Rα에서 아미노산 서열 ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(표 2의 서열번호 24)의 Ser 18에 대한 N-글리코실화; (v) IL-15Rα에서 아미노산 서열 ITCPPPMSVEHADIWVKSY S LYSRERYICNS(표 2의 서열번호 24)의 위치 20에서의 세린에 대한 N-글리코실화; (vi) IL-15Rα에서 아미노산 서열 ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLY S RERYICNS(표 2의 서열번호 24)의 위치 23에서의 세린에 대한 N-글리코실화; 및/또는 (vii) IL-15Rα에서 아미노산 서열 ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICN S (표 2의 서열번호 24)의 위치 31에서의 세린에 대한 N-글리코실화. 구체적인 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 천연 인간 IL-15Rα이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα의 IL-15Rα 유도체이다. 일부 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 천연 가용성 인간 IL-15Rα, 예컨대 표 2의 서열번호 7 또는 10이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 인간 IL-15Rα의 가용성 형태인 IL-15Rα 유도체이다. 특정 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 정제되거나 단리된다.
IL-15/IL-15Rα 복합체
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-15/IL-15Rα 복합체"는 서로 공유결합 또는 비공유결합된 IL-15 및 IL-15Rα를 포함하는 복합체를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, IL-15Rα는 당업계에 알려진 기술, 예를 들어, KinEx A 검정, 플라스몬 표면 공명(예를 들어, BIAcoreTM 검정)에 의해 측정한 바와 같이, IL-15에 대해 비교적 높은 친화도, 예를 들어, 10 내지 50 pM의 KD를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 당업계에 잘 알려진 검정, 예를 들어, 전기이동성 이동 검정, ELISA 및 다른 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, IL-15 매개된 신호 전달을 유도한다. 일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 βγ 쇄에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 세포로부터 단리된다.
IL-15 수용체의 βγ 소단위에 결합하고, IL-15 신호전달(예를 들어, Jak/Stat 신호전달)을 유도하고, IL-15-매개된 면역 기능을 증강시키는 복합체가 본 명세서에 제공되며, 상기 복합체는 인터류킨-15 수용체 알파("IL-15Rα")에 공유결합 또는 비공유결합된 IL-15를 포함한다("IL-15/IL-15Rα 복합체"). IL-15/IL-15Rα 복합체는 βγ 수용체 복합체에 결합할 수 있다.
IL-15/IL-15Rα 복합체는 천연 IL-15 또는 IL-15 유도체 및 야생형 IL-15Rα 또는 IL-15Rα 유도체로 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 상기 기술된 천연 IL-15 또는 IL-15 유도체 및 IL-15Rα를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 표 2의 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 천연 IL-15 또는 IL-15 유도체 및 IL-15Rα를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 상기 기술된 천연 IL-15 또는 IL-15 유도체 및 IL-15Rα의 글리코실화된 형태를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 천연 IL-15 또는 IL-15Rα 유도체 및 야생형 가용성 IL-15Rα(예를 들어, 천연 가용성 인간 IL-15Rα)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 IL-15 유도체 및 IL-15Rα 유도체로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 천연 IL-15 및 IL-15Rα 유도체로 구성된다. 일 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 IL-15Rα의 가용성 형태이다. IL-15Rα의 가용성 형태의 특정 예가 상기 기재되어 있다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα의 가용성 형태는 천연 IL-15Rα의 막투과 도메인 및 임의로 천연 IL-15Rα의 세포내 도메인을 갖지 않는다. 또 다른 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 IL-15Rα의 세포외 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 엑손 2를 포함하는 세포외 도메인의 단편이다. 일부 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 엑손 2를 포함하는 세포외 도메인의 단편 및 엑손 3에 의해 암호화되는 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 엑손 2 및 IL-15Rα 힌지 영역 또는 이의 단편을 포함하는 세포외 도메인의 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, IL-15Rα는 표 2의 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, IL-15Rα 유도체는 천연 IL-15Rα를 절단하는 내인성 프로테아제에 의한 절단을 억제하는 세포외 도메인 절단 부위에서의 돌연변이를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα의 세포외 도메인 절단 부위는 알려진 이종성 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 절단 부위로 대체된다. 이러한 이종 프로테아제 절단 부위의 비제한적인 예는 푸린(furin) 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 Arg-X-X-Arg(표 2의 서열번호 25); 및 트롬빈 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 A-B-Pro-Arg-X-Y(표 2의 서열번호 26)(A 및 B는 소수성 아미노산이고, X 및 Y는 비-산성 아미노산임) 및 Gly-Arg-Gly를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, IL-15는 예를 들어, WO 2007/084342호 및 제WO 2010/020047호; 및 미국 특허 제5,965,726호; 제6,174,666호; 제6,291,664호; 제6,414,132호; 및 제6,794,498호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, IL-15의 발현을 증진시키도록 최적화된 핵산 서열에 의해 암호화된다.
특정 실시형태에서, 표 2의 서열번호 22, 23 및 24를 참고하여, 상기에 기재된 글리코실화 부위 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 전부에서 글리코실화되는 인간 IL-15Rα를 포함하는 IL-15/IL-15Rα 복합체가 본 명세서에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 천연 인간 IL-15Rα이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 자연 발생 또는 야생형 인간 IL-15Rα의 IL-15Rα 유도체이다. 일부 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 천연 가용성 인간 IL-15Rα, 예컨대 표 2의 서열번호 7 또는 10이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 글리코실화된 IL-15Rα는 인간 IL-15Rα의 가용성 형태인 IL-15Rα 유도체이다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 정제되거나 단리된다.
IL-15 및 IL-15Rα 이외에, IL-15/IL-15Rα 복합체는 이종 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 분자는 단백질 안정성을 증가시킨다. 이러한 분자의 비제한적인 예는 생체내 IL-15 또는 IL-15Rα의 반감기를 증가시키는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), IgG 면역글로불린 또는 이의 단편의 Fc 도메인, 또는 알부민을 포함한다. 특정 실시형태에서, IL-15Rα는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) 또는 이의 단편의 Fc 도메인에 접합/융합된다. 구체적인 실시형태에서, IL-15RαFc 융합 단백질은 표 2의 서열번호 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, IL-15RαFc 융합 단백질은 문헌[Han et al., (2011), Cytokine 56: 804-810], 미국 특허 제8,507,222호 또는 미국 특허 제8,124,084호에 기재된 IL-15Rα/Fc 융합 단백질이다. 이종 분자를 포함하는 IL-15/IL-15Rα 복합체에서, 이종 분자는 IL-15 및/또는 IL-15Rα에 접합될 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 분자는 IL-15Rα에 접합된다. 또 다른 실시형태에서, 이종 분자는 IL-15에 접합된다.
IL-15/IL-15Rα 복합체의 성분은 비공유 결합 또는 공유 결합을 사용하여 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해 아미노산 서열을 병용함으로써) 직접 융합될 수 있고/있거나, 하나 이상의 링커를 사용하여 병용될 수 있다. IL-15/IL-15Rα 복합체를 제조하기에 적합한 링커는 펩티드, 알킬기, 화학적으로 치환된 알킬기, 중합체, 또는 둘 이상의 성분을 함께 결합할 수 있는 임의의 다른 공유 결합 또는 비공유 결합된 화학 물질을 포함한다. 중합체 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 아미노산 길이인 펩티드이다. 구체적인 실시형태에서, 링커는 IL-15가 IL-15Rα에 결합하는 능력을 보존하기에 충분히 길다. 다른 실시형태에서, 링커는 IL-15/IL-15Rα 복합체가 βγ 수용체 복합체에 결합하고 IL-15 신호 전달을 매개하는 작용제로서 작용하는 능력을 보존하기에 충분히 길다.
특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 전에(예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체와 세포를 접촉시키기 전에, 또는 IL-15/IL-15Rα 복합체를 대상체에게 투여하기 전에) 예비-커플링된다. 다른 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 전에 예비 커플링되지 않는다.
구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 당업계에 잘 알려진 검정, 예를 들어, ELISPOT, ELISA 및 세포 증식 검정을 사용하여 IL-15/IL-15Rα 복합체를 투여하지 않은 대상체의 면역 기능에 비해 대상체의 면역 기능을 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10%만큼 향상시키거나 유도한다. 구체적인 실시형태에서, 면역 기능은 사이토카인 방출(예를 들어, 인터페론 감마, IL-2, IL-5, IL-10, IL-12 또는 형질전환 성장 인자(TGF)-베타)이다. 일 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 NK 세포 증식이며, 이는 NK 세포(예를 들어, CD56)의 마커를 발현하는 세포의 수를 검출하기 위해 예를 들어, 유세포 검정에 의해 분석될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 항체 생산이고, 이는 예를 들어, ELISA에 의해 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 예를 들어, 세포독성 검정 또는 당업계에 잘 알려진 다른 검정에 의해 분석될 수 있는 효과기 기능이다.
구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체에 의해 강화된 면역 기능의 예는 림프구의 증식/증대(예를 들어, 림프구의 수 증가), 림프구의 세포자멸의 억제, 수지상 세포(또는 항원 제시 세포)의 활성화 및 항원 제시를 포함한다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체에 의해 강화된 면역 기능은 CD4+ T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 헬퍼 T 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포), B 세포(예를 들어, 플라스마 세포), 기억 T 세포, 기억 B 세포, 수지상 세포(미성숙 또는 성숙), 항원 제시 세포, 대식세포, 비만 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 종양-상주 T 세포, CD122+ T 세포 또는 자연 살해 세포(NK 세포)의 개수 또는 활성화의 증식/증대이다. 일 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 림프구 전구세포의 개수를 증식/증대시킨다. 일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 CD4+ T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 헬퍼 T 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포), B 세포(예를 들어, 플라스마 세포), 기억 T 세포, 기억 B 세포, 수지상 세포(미성숙 또는 성숙), 항원 제시 세포, 대식세포, 비만 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 종양-상주 세포, CD122+ T 세포 또는 자연 살해 세포(NK 세포)의 수를 음성 대조군(예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체와 함께 처리, 배양 또는 접촉하지 않은 각각의 세포의 수)에 비해, 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배 또는 그 초과만큼 증가시킨다.
구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 스타필로코커스 장독소 B(SEB)에 의해 활성화된 전혈 상에서의 IL-2의 발현을 증가시킨다. 예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체는 SEB 단독으로 사용될 때 IL-2의 발현과 비교하여 IL-2의 발현을 적어도 약 2, 3, 4 또는 5배 증가시킨다.
IL-15/IL-15Rα 복합체의 생산
IL-15 및/또는 IL-15Rα를 암호화하는 핵산은 포유동물 세포, 박테리아, 효모 및 바이러스에서의 발현을 위해 핵산 작제물에 삽입될 수 있다. IL-15 및 IL-15Rα는 (예를 들어, 바이시스트로닉 핵산 작제물을 사용하여) 동일한 핵산 작제물로부터 또는 (예를 들어, 모노시스트로닉 핵산 작제물을 사용하여) 상이한 핵산 작제물로부터 재조합적으로 발현될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15 및 IL-15Rα는 IL-15 및 IL-15Rα의 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 단일 핵산 작제물로부터 재조합적으로 발현될 수 있다.
핵산 작제물은 IL-15 및/또는 IL-15Rα의 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 전사 조절 요소(들)를 포함한다. 전사 조절 요소는 전형적으로 암호 서열에 대해 5'이며, IL-15 및/또는 IL-15Rα를 암호화하는 핵산의 전사를 지시한다. 일부 실시형태에서, 천연 IL-15 및/또는 천연 IL-15Rα 유전자의 전사를 조절하기 위해 자연계에서 발견되는 하나 이상의 전사 조절 요소를 사용하여 전사를 조절한다. 다른 실시형태에서, 천연 IL-15 및/또는 천연 IL-15Rα 유전자에 이종인 하나 이상의 전사 조절 요소를 사용하여 전사를 조절한다. 당업자에게 공지된 임의의 전사 조절 요소(들)이 사용될 수 있다. 전사 조절 요소(들)의 유형의 비제한적인 예는 구성적 프로모터, 조직-특이적 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 전사는 포유동물(일부 실시형태에서는, 인간) 전사 조절 요소(들)에 의해 적어도 부분적으로 제어된다. 구체적인 실시형태에서, 전사는 강력한 프로모터, 예를 들어, CMV에 의해 적어도 부분적으로 제어된다. 일부 양태에서, 유도성 프로모터가 사용될 수 있다.
핵산 작제물은 IL-15 및/또는 IL-15Rα의 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 전사 후 조절 요소(들)를 포함한다. 후-전사 조절 요소는 암호 서열의 5' 및/또는 3'이며, IL-15 및/또는 IL-15Rα를 암호화하는 RNA 전사체의 전사의 후-전사 조절을 지시한다.
또 다른 양태에서, 핵산 작제물은 예를 들어, 국제 공개 번호 WO1994/12650 및 WO2001/68882에 기재된 바와 같이, 유전자의 현존 조절 영역을 다른 유전자로부터 단리된 조절 서열 또는 신규한 조절 서열로 대체하는 유전자 표적화 벡터일 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 내인성 IL-15 및/또는 IL-15Rα 유전자의 조절 영역을 변경시킴으로써, 내인성 IL-15 및/또는 IL-15Rα의 생산을 증가시키도록 숙주 세포가 조작될 수 있다.
선택된 핵산 작제물은 IL-15 및/또는 IL-15Rα를 발현시키는 데 사용되는 전사 조절 요소 및 숙주 세포의 강도를 제한 없이 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 핵산 작제물은 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 벡터, 파지, 인공 염색체 등일 수 있다. 일 양태에서, 벡터는 임의의 적합한 수단(형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 인산 칼슘-침전, 직접 마이크로인젝션 등)에 의해 적절한 숙주 세포에 도입되어, 이들은 형질전환시킬 수 있는 에피솜 또는 비-상동적으로 통합된 벡터일 수 있다.
핵산 작제물은 숙주 세포에서 IL-15 및/또는 IL-15Rα의 일시적 또는 안정한 발현을 위한 플라스미드 또는 안정한 통합 벡터일 수 있다. 안정한 발현을 위해, 벡터는 표적 부위 또는 무작위 염색체 부위에서 염색체 통합을 매개할 수 있다. IL-15 및/또는 IL-15Rα를 발현시키는 데 사용될 수 있는 숙주 세포-벡터 시스템의 비제한적인 예는 바이러스(예를 들어, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 등)에 의해 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들어, 바큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아 또는 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물; 및 선택 마커를 사용하여 형질전환에 의해 생성된 안정한 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 작제물은 네오마이신(neo), 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr) 및 하이그로마이신(hyg)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 선택가능한 마커 유전자를 포함한다.
핵산 작제물은 모노시스트로닉 또는 멀티시스트로닉일 수 있다. 멀티시스트로닉 핵산 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과, 또는 2 내지 5, 5 내지 10 또는 10 내지 20개의 유전자/뉴클레오티드 서열의 범위를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 바이시스트로닉 핵산 작제물은 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, IL-15) 및 제2 유전자 및 (예를 들어, IL-15Rα)를 이 순서로 포함할 수 있다. 이러한 핵산 작제물에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 유도되는 반면, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 cap-의존성 스캐닝 기전에 의한 것이고, 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 cap-독립적 기전, 예를 들어, IRES에 의한 것이다.
상기 양태를 실시하기 위한 기술은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 조작 및 생산의 통상적인 기술을 사용할 것이며, 이는 당업자에 의해 일상적으로 실시된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition; DNA Cloning, Volumes I and II (Glover, Ed. 1985)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (Gait, Ed. 1984)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (Hames & Higgins, Eds. 1984)]; 문헌[Transcription and Translation (Hames & Higgins, Eds. 1984)]; 문헌[Animal Cell Culture (Freshney, Ed. 1986)]; 문헌[Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)]; 문헌[Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, Eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (각각 Wu & Grossman 및 Wu, Eds.), (Mayer & Walker, Eds., 1987)]; 문헌[Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London, Scopes, 1987)], 문헌[Expression of Proteins in Mammalian Cells Using Vaccinia Viral Vectors in Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2 (Ausubel et al., Eds., 1991)] 참조.
구체적인 실시형태에서, IL-15 또는 IL-15Rα를 암호화하는 핵산 작제물은 동일한 숙주 세포 또는 상이한 숙주 세포 내로 공동-형질감염되거나 형질감염될 수 있다. 선택적으로, 선택가능한 마커 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물이, 형질감염된 세포를 선별하기 위해 동일한 세포에 형질감염될 수도 있다. IL-15 및 IL-15Rα를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물이 상이한 세포에 형질 감염된 경우, 상이한 세포에 의해 발현되는 IL-15 및 IL-15Rα는 단리되고 상기에 기재된 IL-15/IL-15Rα 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에 서로 접촉될 수 있다. 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 인산 칼슘-침전, 직접 마이크로인젝션 및, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 바이러스에 의한 감염을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술은 숙주 세포를 핵산으로 형질감염시키거나 형질도입시키는데 사용될 수 있다.
재조합 IL-15 및 IL-15Rα 폴리펩티드의 장기간, 고수율 생산을 위해, 안정한 세포주가 생성될 수 있다. 예를 들어, 동일한 또는 별도의 핵산 작제물 상에 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있는 세포주는 본 명세서에 기재된 핵산 작제물을 사용하여 형질전환될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 동시형질감염에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다. 벡터의 도입 후에, 세포가 선택적 배지로 전환하기 전에 부유 배지에서 1일 내지 2일 동안 성장하게 하여 도입된 핵산을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수가 되게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클론은 세포 유형에 적합한 당업계에 공지된 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포주는 무혈청 배지에서 성장하도록 적응되었다. 일 실시형태에서, 세포주는 진탕 플라스크에서 무혈청 배지에서 성장하도록 적응되었다. 일 실시형태에서, 세포주는 교반 또는 회전 플라스크에서 성장하도록 적응되었다. 특정 실시형태에서, 세포주는 현탁액에서 배양된다. 특정 실시형태에서, 세포주는 부착성이 아니거나 비부착성 세포로서 성장하도록 적응되었다. 특정 실시형태에서, 세포주는 저 칼슘 조건에서 성장하도록 적응되었다. 일부 실시형태에서, 세포주는 저 혈청 배지에서 성장하도록 배양되거나 적응된다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 고-수율 생산의 특히 바람직한 방법은 미국 특허 제4,889,803호에 기술된 바와 같이, 연속적으로 증가하는 수준의 메토트렉세이트를 사용하여, DHFR-결핍 CHO 세포에서 디하이드로 폴레이트 리덕타제(DHFR) 증폭의 사용을 통한 방법이다. 상기 세포로부터 수득된 폴리펩티드는 글리코실화된 형태일 수 있다.
일 실시형태에서, 세포주는 천연 인간 IL-15 및 천연 가용성 인간 IL-15Rα의 안정한 이종이량체를 발현하도록 조작되고, 정제된 후 인간에게 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 안정성은 IL-15 및 IL-15Rα 둘 다를 재조합으로 발현하는 세포주로부터 생산될 때 증가한다.
구체적인 실시형태에서, 숙주 세포는 IL-15 및 전장 IL-15Rα를 재조합으로 발현한다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 숙주 세포는 IL-15 및 IL-15Rα의 가용성 형태를 재조합으로 발현한다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 숙주 세포는 IL-15 및 세포 표면으로부터 절단되지 않고 세포와 결합되어 유지되는 IL-15Rα의 막 결합된 형태를 재조합으로 발현한다. 일부 실시형태에서, IL-15 및/또는 IL-15Rα(전장 또는 가용성 형태)를 재조합으로 발현하는 숙주 세포는 또한 다른 폴리펩티드(예를 들어, 사이토카인 또는 이의 단편)를 재조합으로 발현한다.
특정 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 IL-15Rα 폴리펩티드 이외에 IL-15 폴리펩티드를 재조합으로 발현한다. IL-15 및/또는 IL-15Rα를 암호화하는 핵산은 IL-15 및 IL-15Rα의 단리 및 정제를 위해 다량으로 IL-15 및 IL-15Rα를 재조합으로 발현하는 포유동물 세포를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 바람직하게는 IL-15 및 IL-15Rα는 복합체로서 회합된다. 일 실시형태에서, 다량의 IL-15/IL-15Rα 복합체는 대조군 세포(예를 들어, IL-15, IL-15Rα, 또는 IL-15 및 IL-15Rα 둘 다를 재조합으로 발현하도록 유전적으로 조작되지 않은 세포, 또는 공 벡터를 포함하는 세포)에 의해 내인성으로 발현된 IL-15/IL-15Rα 복합체의 양보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배 또는 20배 초과 더 높은 세포에 의해 발현되는 IL-15/IL-15Rα 복합체의 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 기술(예를 들어, ELISA)에 의해 측정된 약 0.1 pg 내지 25 pg, 0.1 pg 내지 20 pg, 0.1 pg 내지 15 pg, 0.1 pg 내지 10 pg, 0.1 pg 내지 5 pg, 0.1 pg 내지 2 pg, 2 pg 내지 10 pg, 또는 5 내지 20 pg의 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 기술(예를 들어, ELISA)에 의해 측정된 약 0.1 pg 내지 0.25 pg/일, 0.25 pg 내지 0.5 pg/일, 0.5 pg 내지 1 pg/일, 1 pg 내지 2 pg/일, 2 pg 내지 5 pg/일, 또는 5 내지 10 pg/일의 IL-15를 발현한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα는 IL-15Rα의 가용성 형태이다. 구체적인 실시형태에서, IL-15Rα는 안정한 이종이량체에서 IL-15와 회합된 IL-15Rα의 가용성 형태이고, 이는 수율을 증가시키고 생체활성 이종이량체 IL-15/가용성 IL-15Rα 사이토카인의 생산 및 정제를 단순화한다.
재조합 단백질 생산 및 정제 방법을 사용하여 재조합 IL-15 및 IL-15Rα가 정제될 수 있으며, 이는 당 기술분야, 예를 들어, 국제 공개 제WO 2007/070488호에 공지되어 있다. 간략하게, 폴리펩티드는 세포내, 세포질 주위 공간에서 생성되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해물 또는 상청액은 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 이온 교환 컬럼 상에서의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™(겔 여과 물질; Pharmacia Inc.(미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토 초점 맞춤, SDS-PAGE 및 황산 암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 가능하다.
일부 실시형태에서, IL-15 및 IL-15Rα는 상이한 세포에 의해 합성되거나 재조합으로 발현되고, 후속하여 단리되고 조합되어 대상체에게 투여하기 전에 시험관내 IL-15/IL-15Rα 복합체를 형성한다. 다른 실시형태에서, IL-15 및 IL-15Rα는 상이한 세포에 의해 합성되거나 재조합으로 발현되고, 후속하여 단리되고 원위치 또는 생체내 IL-15/IL-15Rα 복합체와 대상체에게 동시에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 및 IL-15Rα는 동일한 세포에 의해 함께 합성되거나 발현되며, 형성된 IL-15/IL-15Rα 복합체가 단리된다.
핵산의 발현을 위해 선택된 숙주 세포는 세포의 의도된 용도에 의존할 것이다. 세포가 예를 들어, 세포가 IL-15 및/또는 IL-15Rα를 내인성으로 발현하는 세포와 유사하게 글리코실화하는지 여부와 같은 요소들이 숙주 세포를 선택하는데 고려될 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물에 의해 암호화되는 단백질(들)을 발현하는데 사용될 수 있는 숙주 세포의 비제한적인 예는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 일차 세포, 불멸화 세포, 식물 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포주이다. 포유동물 세포주의 예는 COS, CHO, HeLa, NIH3T3, HepG2, MCF7, HEK 293, HEK 293T, RD, PC12, 하이브리도마, 프리-B 세포, 293, 293H, K562, SkBr3, BT474, A204, M07Sb, TFβ1, Raji, 주카트(Jurkat), MOLT-4, CTLL-2, MC-IXC, SK-N-MC, SK-N-MC, SK-N-DZ, SH-SY5Y, C127, N0 및 BE(2)-C 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 발현을 위한 숙주로서 입수 가능한 다른 포유동물 세포주는 당업계에 알려져 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에서 입수 가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다.
CHO 세포
중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 치료 용도를 위한 글리코실화된 폴리펩티드의 생산을 위해서 가장 일반적으로 사용된다. 이들 세포는 정의된 글리코실화된 프로파일을 생산하고, 유전적으로 안정적이고, 높은 생산성의 세포주를 생산하는 것을 가능하게 한다. 추가로, CHO 세포는 무혈청 배지에서 높은 세포 밀도로 배양되어 안전하고 재현 가능한 생물 공정을 발달시킬 수 있다. 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 CHO 세포를 사용하는 경우 직면하는 하나의 주요 문제는 "클리핑(clipping)"이라고도 지칭되는 세포 배양 배지에서 발현 및 분비된 관심 폴리펩티드의 단백질분해 저하다.
일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 예를 들어, 매트립타제 유전자의 기능성 발현을 감소시키거나 제거하여, 상기 세포에 의해서 발현되고 세포 배양 배지로 분비된 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질분해 절단("클리핑")을 유의하게 감소시킴으로써 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변형된 CHO 세포주에 의해서 생산된다. 따라서, 상기 세포에서 매트립타제의 효과를 손상시키는 것은 매트립타제의 효과가 손상되지 않은 상응하는 척추동물 세포와 비교하여 분비된 재조합 IL-15/IL-15Rα 복합체의 클리핑을 감소시킨다. 매트립타제를 사용하여, 재조합 방식으로 발현되고 분비된 폴리펩티드의 클리핑을 담당하는 주요 프로테아제가 식별되었다. 매트립타제의 효과를 손상시키기 위해 척추동물 세포를 변경하는 것은 세포 배양 배지에서 재조합 방식으로 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑을 감소 또는 제거함으로써 관심 폴리펩티드의 재조합 생산을 상당히 개선할 수 있게 한다. 따라서, IL-15/IL-15Rα 복합체의 수율이 증가된다.
CHO 세포에서, 효소 자체에 대한 유전자는 씨.그리세우스에 존재하지만, 코어 글리칸 구조(베타-갈락토사이드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1)에 대한 알파(2-6) 연결된 NANA 확장을 생성하는 역할을 하는 효소는 CHO 세포에서 불활성이거나 발현되지 않는 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Chung et al 2017] 참조). 그러나, 본 개시내용의 CHO 세포에서 생산된 IL-15/IL-15Rα 복합체는 인간 세포주에 의해서 생산된 IL-15/IL-15Rα 복합체에 비해서 상이한 글리코실화 패턴을 갖는다는 것을 예기치 못하게 발견하였다. 또한, CHO 세포에서 생성된 IL-15/IL-15Rα 복합체에서 알파(2-6) 연결 유형 글리칸이 관찰되었다. 이러한 글리코실화 패턴은 고유하다. 그것은 인간 글리코실화 형태에 더 가깝기 때문에 예상되는 CHO 패턴과 비교하여 직접적인 이점을 잠재적으로 제공할 수 있다. CHO 세포주의 상세 사항은 본 명세서에 참고 문헌으로서 포함된 제WO2015/166427호에서 찾아볼 수 있다.
약제학적 조성물
IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 상기 조성물은 단위 투여 형태 제조에 사용될 수 있는 약제학적 조성물(예를 들어, 불순한 또는 비-멸균 조성물) 및 약제학적 조성물(즉, 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물을 포함한다. 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 유효량의 IL-15/IL-15Rα 복합체 또는 IL-15/IL-15Rα 복합체와 약제학적으로 허용 가능한 담체의 조합물을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 유효량의 1종 이상의 IL-15/IL-15Rα 복합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 부가적인 치료제, 예를 들어, 항암제, 항-바이러스제, 항염증제, 애주번트를 추가로 포함한다. 상기 치료제의 비제한적인 예는 하기에 제공된다.
구체적인 실시형태에서, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 동물에서, 특히 인간에 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 희석제, 애주번트(예를 들어, 프로인트 애주번트(완전 및 불완전) 또는 보다 바람직하게는 MF59C.1 애주번트), 부형제 또는 치료제와 함께 투여되는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 원료, 예컨대 땅콩 유, 대두유, 광유, 참기름 등의, 물 및 오일과 같은 무균 액체일 수 있다. 일 실시형태에서, 물은 약제학적 조성물이 정맥내 투여될 때 담체이다. 염분 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은 원한다면 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유제, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 임의의 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체에게 투여된 IL-15/IL-15Rα 복합체는 약제학적 조성물로서 투여된다.
일반적으로, IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하는 약제학적 조성물의 성분은 단위 제형 중에 예를 들어, 건조된 동결건조 분말, 또는 무수 농축액으로서, 활성제의 양을 표시한 기밀 용기, 예를 들어, 앰플 또는 봉지 내에 공급된다. IL-15/IL-15Rα 복합체가 주입에 의해 투여될 경우, 이는 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 식염수(예를 들어, PBS)를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. IL-15/IL-15Rα 복합체가 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 전 혼합될 수 있도록 멸균된 주사용 물 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 비경구(예를 들어, 피하, 정맥내, 종양내 또는 근육내) 투여를 포함하지만 이들에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 국소 또는 전신 비경구 투여, 예를 들어, 종양내 투여를 위해 제형화된다. 구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 각각 피하 또는 정맥내 투여를 위해서 제형화된다. 일 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 약제학으로 사용성인 용액 중에 제형화된다.
IL-15/IL-15Rα 복합체는 주사에 의해, 예를 들어, 볼루스 주입 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형물은 단위 투여량 형태, 예를 들어, 앰플 또는 다중-용량 용기에서, 첨가되는 보존제와 함께 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태일 수 있고, 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-비함유수로 사용 전에 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
치료 및 투여 요법
일 양태에서, 특정 용량 요법으로 복합체 IL-15/IL-15Rα 복합체를 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하는, IL-15-매개된 면역 기능을 증진시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. IL-15-매개된 면역 기능을 증진시키는 것이 특정 장애의 예방, 치료 및/또는 관리에 유익하기 때문에, IL-15/IL-15Rα 복합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 장애의 예방, 치료 및/또는 관리 방법이 본 명세서에 제공된다. IL-15-매개된 면역 기능을 증진시키는 것이 유익한 질환의 비제한적인 예는 암, 림프구감소증, 면역결핍증, 감염성 질환 및 상처를 포함한다.
일 실시형태에서, 대상체의 장애를 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, IL-15-매개된 면역 기능의 증진이 이러한 장애의 예방, 치료 및/또는 관리에 유익하고, IL-15/IL-15Rα 복합체의 동일한 용량을 치료 주기의 지속 기간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 용량은 0.1 ㎍/㎏ 및 0.5 ㎍/㎏의 범위이다. 일 실시형태에서, 용량은 0.25 ㎍/㎏ 및 1 ㎍/㎏의 범위이다. 구체적인 실시형태에서, 용량은 0.5 ㎍/㎏ 및 2 ㎍/㎏의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 1 ㎍/㎏ 내지 4 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 2 ㎍/㎏ 내지 8 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 0.1 ㎍/㎏, 0.25 ㎍/㎏, 0.5 ㎍/㎏, 1 ㎍/㎏, 2 ㎍/㎏, 4 ㎍/㎏, 5 ㎍/㎏, 6 ㎍/㎏, 8 ㎍/㎏이다. 구체적인 실시형태에서, 용량은 1 ㎍/㎏이다. 특정 실시형태에서, 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 6 내지 8, 5 내지 8, 또는 5 내지 10회 투여된다. 특정 실시형태에서, 용량은 5 내지 7일, 5 내지 10일, 7 내지 12일, 7 내지 14일, 7 내지 21일 또는 14 내지 21일 기간에 걸쳐, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 2 내지 4, 2 내지 5, 1 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 또는 6 내지 8회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 각각의 용량은 5 내지 7일, 5 내지 10일, 7 내지 12일, 7 내지 14일, 7 내지 21일 또는 14 내지 21일 기간에 걸쳐, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과 횟수로 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 각각의 용량은 적어도 1회 투여되고, 대상체는 3주 동안 주 1회 용량으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 대상체의 장애를 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, IL-15-매개된 면역 기능의 증진이 이러한 장애의 예방, 치료 및/또는 관리에 유익하고, IL-15/IL-15Rα 복합체를 비-투여 기간 전에 투여 주기로 적어도 1회, 2회, 4회 또는 6회 용량 요법으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 4주차에 투여하지 않고 3주 동안 주 1회 투여된다. 그 다음, 투여 주기가 반복된다.
대안적인 실시형태에서, 대상체의 장애를 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, IL-15-매개된 면역 기능의 증진이 이러한 장애의 예방, 치료 및/또는 관리에 유익하고, (a) 적어도 하나의 초기 저용량의 IL-15/IL-15Rα 복합체를 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 치료 주기의 지속 기간 동안 대상체에게 IL-15/IL-15Rα 복합체의 높은 용량을 연속적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 대상체의 암을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, (a) 치료 주기의 지속 기간 동안 초기 용량의 IL-15/IL-15Rα 복합체를 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 치료 주기의 지속 기간 동안 대상체에게 IL-15/IL-15Rα 복합체의 높은 용량을 연속적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 초기 용량은 0.1 ㎍/㎏ 및 0.5 ㎍/㎏의 범위이다. 구체적인 실시형태에서, 초기 용량은 0.25 ㎍/㎏ 및 1 ㎍/㎏의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 초기 용량은 0.5 ㎍/㎏ 및 2 ㎍/㎏의 범위이다. 구체적인 실시형태에서, 초기 용량은 1 ㎍/㎏ 내지 4 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 초기 용량은 2 ㎍/㎏ 내지 8 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 초기 용량은 약 0.25 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 초기 용량은 약 0.5 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 초기 용량은 약 1 ㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 초기 용량은 0.1 ㎍/㎏, 0.25 ㎍/㎏, 0.5 ㎍/㎏, 1 ㎍/㎏, 2 ㎍/㎏, 4 ㎍/㎏, 5 ㎍/㎏, 6 ㎍/㎏, 8 ㎍/㎏이다. 특정 실시형태에서, 초기 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 6 내지 8, 5 내지 8, 또는 5 내지 10회 투여된다. 특정 실시형태에서, 초기 용량은 5 내지 7일, 5 내지 10일, 7 내지 12일, 7 내지 14일, 7 내지 21일 또는 14 내지 21일 기간에 걸쳐, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 2 내지 4, 2 내지 5, 1 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 또는 6 내지 8회 투여된다. 특정 실시형태에서, 각각의 연속적으로 더 높은 용량은 이전 용량보다 1.2, 1.25, 1.3, 1.35, 1.4, 1.45, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 또는 6배 높거나, 이전 용량보다 1.2 내지 2, 2 내지 3, 2 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 4, 3 내지 6, 또는 4 내지 6배 높거나, 또는 이전 용량보다 2배 더 높다. 일부 실시형태에서, 각각 연속적으로 더 높은 용량은 이전 용량보다 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 또는 200% 더 높다. 구체적인 실시형태에서, 각각의 용량은 5 내지 7일, 5 내지 10일, 7 내지 12일, 7 내지 14일, 7 내지 21일 또는 14 내지 21일 기간에 걸쳐, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과 횟수로 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 각각의 용량은 적어도 1회 투여되고, 대상체는 2주간 주당 7일에 3회(예를 들어, 월요일, 수요일 및 금요일) 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체는 하기 유해 사례(adverse event), 예컨대 3 또는 4등급 혈소판감소증, 3 또는 4등급 과립구감소증, 3 또는 4등급 백혈구증가증(백혈구(WBC) > 100,000 mm3), 3 또는 4등급 WBC, 절대 림프구 수(ALC) 및/또는 절대 호중구 수(ANC) 감소, 림프구증가증 및 기관 기능장애(예를 들어, 간 또는 신장 기능장애)와 같은 유해 사례에 대해서 모니터링된다. 특정 실시형태에서, 용량이 증가하지 않으며, 용량이 동일하게 유지되거나, 대상체가 유해 사례, 예컨대 3 또는 4등급 혈소판감소증, 3 또는 4등급 과립구감소증, 3 또는 등급 백혈구증가증(백혈구 > 100,000 mm3), 3 또는 4등급 WBC, 절대 림프구 수(ALC) 및/또는 절대 호중구 수(ANC) 감소, 림프구증가증 및 기관 기능장애(예를 들어, 간 또는 신장 기능장애)와 같은 부작용을 경험하는 경우, 중지되거나 감소될 수 있다. 이들 실시형태에 따라, 대상체에게 투여된 IL-15/IL-15Rα 복합체의 용량은 유해 사례가 감소하거나 사라질 때까지 감소되거나 동일하게 유지될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 대상체의 장애를 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, IL-15-매개된 면역 기능의 증진이 이러한 장애의 예방, 치료 및/또는 관리에 유익하고, 0.25 ㎍/㎏ 내지 4 ㎍/㎏의 초기 용량을 포함하는 제1 주기로 시작하여 용량이 이전 용량보다 2 내지 3 배 증가하는 순차적 주기의 용량 요법으로 IL-15/IL-15Rα 복합체를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 각각의 용량은 용량을 다음 수준으로 상승시키기 전에 적어도 1회, 2회, 4회 또는 6회 투여되고, IL-15/IL-15Rα 복합체의 용량을 투여하고 특정 시간(예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체 용량의 투여 후 및 IL-15/IL-15Rα 복합체의 다른 용량의 투여 전 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 48시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 또는 약 48시간 내지 60시간) 후에 다음 수준으로 용량을 높이기 전에 대상체로부터 수득된 샘플(예를 들어, 혈장 샘플) 중의 유리 IL-15의 농도가 모니터링된다.
또 다른 실시형태에서, 대상체의 장애를 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, IL-15-매개된 면역 기능의 증진이 이러한 장애의 예방, 치료 및/또는 관리에 유익하고, IL-15/IL-15Rα 복합체를 다음의 순차 용량으로 용량 요법으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 0.25 ㎍/㎏; (ii) 0.5 ㎍/㎏; (iii) 1 ㎍/㎏; (iv) 2 ㎍/㎏; (v) 4 ㎍/㎏; 및 (vi) 8 ㎍/㎏. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 다음의 순차 용량으로 용량 요법으로 대상체에게 투여된다: (i) 1 ㎍/㎏; (ii) 2 ㎍/㎏; (iii) 4 ㎍/㎏; 및 (iv) 8 ㎍/㎏. 각각의 용량은 용량을 다음 수준으로 상승시키기 전에 투여 주기로 적어도 1회, 2회, 4회 또는 6회 투여되고, IL-15/IL-15Rα 복합체의 용량을 투여하고 특정 시간(예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체 용량의 투여 후 및 IL-15/IL-15Rα 복합체의 다른 용량의 투여 전 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 48시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 또는 약 48시간 내지 60시간) 후에 다음 수준으로 용량을 높이기 전에 대상체로부터 수득된 샘플(예를 들어, 혈장 샘플) 중의 유리 IL-15의 농도가 모니터링된다.
또 다른 실시형태에서, 대상체의 암을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, IL-15/IL-15Rα 복합체를 다음의 순차 용량으로 용량 요법으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 1 ㎍/㎏; (ii) 2 ㎍/㎏; (iii) 4 ㎍/㎏; 및 (iv) 8 ㎍/㎏, 여기서, 각각의 용량은 용량을 다음 수준으로 상승시키기 전에 투여 주기에서 적어도 1회, 2회, 4회 또는 6회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 주기적 투여 요법을 사용하여 IL-15/IL-15Rα 복합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 주기적 투여 요법은, (a) 대상체에게 0.1 내지 10 ㎍/㎏의 용량의 IL-15/IL-15Rα 복합체를 1 내지 3주의 제1 기간에 걸쳐서 1, 2 또는 3일마다 피하로 투여하는 단계; 및 (b) IL-15/IL-15Rα 복합체가 대상체에게 투여되지 않은 1주 내지 2개월의 제2 기간 후, 대상체에게 0.1 내지 10 ㎍/㎏의 용량의 IL-15/IL-15Rα 복합체를 1 내지 3주의 제3 기간에 걸쳐서 1, 2 또는 3일마다 피하로 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 특정 실시형태에서, 치료 주기에서 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 5, 1 내지 6, 2 내지 6, 1 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 6 내지 8, 5 내지 8, 또는 5 내지 10회 투여된다. 일부 실시형태에서, 용량은 5 내지 7일, 5 내지 10일, 7 내지 12일, 7 내지 14일, 7 내지 21일 또는 14 내지 21일 기간에 걸쳐, 1, 2, 3, 4, 6, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 5, 1 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 또는 6 내지 8회 투여된다. 특정 실시형태에서, 각각의 용량은 투여 주기당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 5, 1 내지 6, 2 내지 6, 1 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 6 내지 8, 5 내지 8, 또는 5 내지 10회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 각각의 용량은 5 내지 7일, 5 내지 10일, 7 내지 12일, 7 내지 14일, 7 내지 21일 또는 14 내지 21일 기간에 걸쳐, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 5, 1 내지 6, 2 내지 6, 1 내지 6, 3 내지 6, 4 내지 6, 6 내지 8, 5 내지 8 또는 5 내지 10회 투여된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 대상체는 주당 7일에 3회(예를 들어, 월요일, 수요일 및 금요일) 용량이 투여된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 하기 유해 사례, 예컨대 3 또는 4등급 혈소판감소증, 3 또는 4등급 과립구감소증, 3 또는 4등급 백혈구증가증(백혈구(WBC) > 100,000 mm3), 3 또는 4등급 WBC, 절대 림프구 수(ALC) 및/또는 절대 호중구 수(ANC) 감소, 림프구증가증 및 기관 기능장애(예를 들어, 간 또는 신장 기능장애)와 같은 부작용을 모니터링한다. 특정 실시형태에서, 용량이 증가하지 않으며, 용량이 동일하게 유지되거나, 대상체가 유해 사례, 예컨대 3 또는 4등급 혈소판감소증, 3 또는 4등급 과립구감소증, 3 또는 등급 백혈구증가증(백혈구 > 100,000 mm3), 3 또는 4등급 WBC, 절대 림프구 수(ALC) 및/또는 절대 호중구 수(ANC) 감소, 림프구증가증 및 기관 기능장애(예를 들어, 간 또는 신장 기능장애)와 같은 부작용을 경험하는 경우, 중지되거나 감소될 수 있다. 이들 실시형태에 따라, 대상체에게 투여된 IL-15/IL-15Rα 복합체의 용량은 유해 사례가 감소하거나 사라질 때까지 감소되거나 동일하게 유지될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라, 각각의 용량은 3주 동안 주 1회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라, 각각의 용량은 2주 동안 주 3회, 1회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라, 각각의 용량은 2, 3 또는 4주 동안 주 3회, 1회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라, 각각의 용량은 2, 3 또는 4주 동안 주 6회, 1회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라, 각각의 용량은 2, 3 또는 4주 동안 격일로 1회 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라, 각각의 용량은 2, 3 또는 4주 동안 매일 1회 투여된다.
특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체에게 피하 투여된다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체에게 정맥내 또는 근육내로 투여된다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체에게 종양내로 투여된다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체의 부위(예를 들어, 감염 부위)에 국소 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체로부터 수득된 샘플은 혈액 샘플이다. 구체적인 실시형태에서, 샘플은 혈장 샘플이다. IL-15의 기초 혈장 수준은 인간에서 약 1 pg/㎖, 원숭이(예컨대, 마카크)에서 약 8 내지 10 pg/㎖, 설치류(예컨대, 마우스)에서 약 12 pg/㎖이다. 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 대상체로부터 샘플을 수득할 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 강화된 면역 기능의 예는 림프구의 증식/증대(예를 들어, 림프구의 수 증가), 림프구의 세포자멸의 억제, 수지상 세포(또는 항원 제시 세포)의 활성화 및 항원 제시를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 강화된 면역 기능은 CD4+ T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 헬퍼 T 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포), B 세포(예를 들어, 플라스마 세포), 기억 T 세포, 기억 B 세포, 수지상 세포(미성숙 또는 성숙), 항원 제시 세포, 대식세포, 비만 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 종양-상주 T 세포, CD122+ T 세포 또는 자연 살해 세포(NK 세포)의 개수 또는 활성화의 증식/증대이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 림프구 전구세포의 개수를 증식/증대시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 CD4+ T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 헬퍼 T 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포), B 세포(예를 들어, 플라스마 세포), 기억 T 세포, 기억 B 세포, 수지상 세포(미성숙 또는 성숙), 항원 제시 세포, 대식세포, 비만 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 종양-상주 세포, CD122+ T 세포 또는 자연 살해 세포(NK 세포)의 수를 음성 대조군에 비해, 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배 또는 그 초과만큼 증가시킨다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 예를 들어, ELISPOT, ELISA 및 세포 증식 분석과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물을 투여하지 않은 대상체에서의 면역 기능에 비해, 대상체의 면역 기능을 적어도 0.2배, 0.5배, 0.75배, 1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 적어도 10배 증진 또는 유도한다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 당업계에 잘 공지된 검정, 예를 들어, ELISPOT, ELISA 및 세포 증식 검정법을 사용하여 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물을 투여하지 않은 대상체의 면역 기능에 대하여, 대상체의 면역 기능을 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10% 증진 또는 유도한다. 구체적인 실시형태에서, 면역 기능은 사이토카인 방출(예를 들어, 인터페론 감마, IL-2, IL-5, IL-10, IL-12 또는 형질전환 성장 인자(TGF)-베타)이다. 일 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 NK 세포 증식이며, 이는 NK 세포(예를 들어, CD56)의 마커를 발현하는 세포의 수를 검출하기 위해 예를 들어, 유세포 검정에 의해 분석될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 CD8+ T 세포 증식이고, 이는 예를 들어, 유동법에 의해 분석될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 항체 생산이고, 이는 예를 들어, ELISA에 의해 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-15 매개된 면역 기능은 예를 들어, 세포독성 검정 또는 당업계에 잘 알려진 다른 검정에 의해 분석될 수 있는 효과기 기능이다. 말초 혈액 림프구 수에 대한 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물의 하나 이상의 용량의 효과는 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 모니터링/평가될 수 있다. 포유동물에서의 말초 혈액 림프구 수는, 예를 들어, 상기 포유동물로부터 말초 혈액 샘플을 얻고, 예를 들어, FicollHypaque(Pharmacia) 구배 원심분리를 사용하여 혈장과 같은 말초 혈액의 다른 성분으로부터 림프구를 분리하고, 트립판 블루(trypan blue)를 이용하여 림프구를 계수함으로써 결정될 수 있다. 포유동물에서의 말초 혈액 T-세포 수는, 예를 들어, Ficoll-Hypaque(Pharmacia) 구배 원심분리법을 사용하여 혈장과 같은 말초 혈액의 다른 성분으로부터 림프구를 분리하고, T 세포를 FITC 또는 피코에리트린에 접합된 CD3, CD4 및 CD8과 같은 T-세포 항원에 대한 항체로 라벨링하고 및 FACS에 의해 T-세포의 수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 또한, T 세포(예를 들어, CD2+, CD4+, CD8+, CD4+RO+, CD8+RO+, CD4+RA+ 또는 CD8+RA+) 또는 NK 세포의 특정 하위세트에 미치는 영향은 FACS와 같은 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
IL-15 및/또는 PD-1의 혈장 수준은 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 혈장은 대상체로부터 수득된 혈액 샘플로부터 수득될 수 있고, 혈장 중의 IL-15 및/또는 PD-1의 수준은 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
병용 요법
IL-15/IL-15Rα와 조합하여 사용될 수 있는 다른 요법이 또한 본 명세서에 의해 제공된다. 일 양태에서, 유효량의 IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자 또는 IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방, 치료 및/또는 관리 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 사용된 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침윤성 단계와 무관하게 모든 유형의 암 성장 또는 발암 과정, 전이 조직 또는 악성 형질전환 세포, 조직 또는 기관을 포함함을 의미한다. 구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 동일, 반복 용량으로, 또는 대안적으로 증량 요법으로 피하 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 균등한 투여 요법에서 정맥내 주입으로서 투여된다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 대상체에게 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물을 투여하면 하기 중 1개, 2개 또는 3개 이상의 결과를 얻는다: (1) 종양 또는 신생물의 성장 감소; (2) 종양 형성의 감소; (3) 원발성, 국지적 및/또는 전이성 암의 근절, 제거 또는 통제; (4) 전이성 확산의 감소; (5) 사망률의 감소; (6) 생존율의 증가; (7) 생존 기간의 증가; (8) 완화된 환자 수의 증가; (9) 입원율의 감소; (10) 입원 기간 단축; 및 (11) 종양의 크기가 10% 초과, 또는 8% 초과, 또는 6% 초과, 또는 4% 초과 증가하지 않도록; 바람직하게는 2% 초과만큼 증가하지 않도록 종양 크기의 유지.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물을 암을 가진 대상체(일부 실시형태에서는 암 동물 모델)에 투여함으로써 당업계에 널리 공지된 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 음성 대조군을 투여한 암을 가진 대상체(일부 실시형태에서, 암에 대한 동일한 동물 모델에서)에서의 종양의 성장에 비해 종양의 성장을 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7 배 또는 적어도 10 배 저해하거나 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물을 암을 가진 대상체(일부 실시형태에서는 암 동물 모델)에 투여함으로써 당업계에 널리 공지된 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 음성 대조군 또는 단일 작용제로서의 항-PD-1 항체 분자 또는 IL-15/IL-15Rα를 투여한 암을 가진 대상체(일부 실시형태에서, 암에 대한 동일한 동물 모델에서)에서의 종양의 성장에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 종양의 성장을 저해하거나 감소시킨다.
암성 질환의 예는 고형 종양, 혈액암, 연조직 종양 및 전이성 병변을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 고형 종양의 예는 다양한 기관계의 악성 종양, 예를 들어, 육종 및 암종(선암종 및 편평 세포 암종 포함), 예컨대 간, 폐, 유방, 림프, 위장관(예를 들어, 대장), 비뇨생식관(예를 들어, 신장, 요로상피 세포), 전립선 및 인두에 영향을 미치는 것들을 포함한다. 선암종은 대부분의 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함한다. 편평 세포 암종은 예를 들어, 폐, 식도, 피부, 두경부 영역, 구강, 항문 및 자궁 경부의 악성 종양을 포함한다. 일 실시형태에서, 암은 흑색종, 예를 들어, 진행된 병기의 흑색종이다. 전술한 암의 전이성 병변 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다.
본 명세서에 개시된 IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물을 사용하여 성장이 억제될 수 있는 예시적인 암은 전형적으로 면역요법에 반응하는 암을 포함한다. 치료를 위해 바람직한 암의 비제한적인 예로는 흑색종(예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장 암(예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선 암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 대장암 및 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암)이 포함된다. 또한, 난치성 또는 재발성 악성종양은 본 명세서에 기재된 병용 요법을 사용하여 치료될 수 있다.
치료받을 수 있는 다른 암의 예에는 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위-식도암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 메르켈 세포암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상샘암, 부갑상샘암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프구 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아의 고형 종양, 림프구 림프종, 방광암, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 신장 또는 요관 암, 신우 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 종양, 뇌간 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피암, 편평상피세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 암을 포함하는 환경적으로 유도된 암(예를 들어, 중피종) 및 상기 암의 조합이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, 암은 흑색종, 신장암, 결장암 또는 전립선 암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 전이성이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor: CPI), 예를 들어, 항 PD-1/PD-L1 및 항 CTLA-4로 이미 치료되었고, 반응하고, 진행되었다.
IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 하나 이상의 다른 요법, 예를 들어, 항암제, 사이토카인 또는 항-호르몬 작용제와 함께 투여되어 암을 치료 및/또는 관리할 수 있다. 항암제의 비제한적인 예가 하기에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 장애, 예를 들어, 대상체의 과증식 병태 또는 장애(예를 들어, 암)의 예방, 치료, 및/또는 관리 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 약 200 ㎎ 내지 500 ㎎, 예를 들어, 약 250 ㎎ 내지 450 ㎎, 약 300 ㎎ 내지 400 ㎎, 약 250 ㎎ 내지 350 ㎎, 약 350 ㎎ 내지 450 ㎎, 또는 약 300 ㎎ 또는 약 400 ㎎의 용량(예를 들어, 균일 용량)으로 주사에 의해(예를 들어, 피하 또는 정맥내) 투여된다. 투여 스케줄(예를 들어, 균일 투여 스케줄)은, 예를 들어, 주 1회 내지 매 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주마다 1회로 다양할 수 있다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 약 300 ㎎ 내지 400 ㎎의 용량으로 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 약 300 ㎎의 용량으로 3주마다 1회 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 약 400 ㎎의 용량으로 4주마다 1회 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 약 300 ㎎의 용량으로 4주마다 1회 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자는 약 400 ㎎의 용량으로 3주마다 1회 투여된다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라, 약제학적 조성물의 IL-15/IL-15Rα 복합체가 대상체에게 투여될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 하나 이상의 다른 요법, 예를 들어, 항-PD-1 항체 분자와 병용하여 투여된다. 병용 요법은 IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자의 동시 및 연속 투여를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 환자에게 동일한 날, 예를 들어, 동시에 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8시간 간격으로 투여되는 경우, 동시에 투여된다고 한다. 대조적으로, IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 환자에게 상이한 날 투여되는 경우, 연속적으로 투여된다고 하며, 예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 1일, 2일 또는 3일 간격으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에서, IL-15/IL-15Rα 복합체의 투여는 항 PD-1 항체 분자의 투여를 선행하거나 후속할 수 있다. 동시에 투여되는 경우, IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 동일한 약제학적 조성물 또는 상이한 약제학적 조성물 내에 존재할 수 있다.
IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 예를 들어, 암세포를 파괴하기 위한 엑스레이, 감마선 및 다른 방사선원을 포함하는 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 방사선 치료는 방사선이 원격 소스로부터 지향되는 외부 빔 방사선 또는 텔레테라피(teletherapy)로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 방사선 치료는 방사선원이 암 세포 또는 종양 괴상에 가까운 신체 내부에 배치되는 내부 요법 또는 근접요법(brachytherapy)으로서 투여된다. IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 또한 화학요법과 병용 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 방사선 요법 또는 화학요법 전, 도중 또는 후에 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 수술 전, 수술 중 또는 수술 후에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 암을 앓거나 암으로 진단받은 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 암에 걸리기 쉽거나 발병하기 쉬운 대상체에게 투여된다.
특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 0 내지 6개월, 6 내지 12개월, 1 내지 5세, 5 내지 10세, 10 내지 15세, 15 내지 20세, 20 내지 25세, 25 내지 30세, 30 내지 35세, 35 내지 40세, 40 내지 45세, 45 내지 50세, 50 내지 55세, 55 내지 60세, 60 내지 65세, 65 내지 70세, 70 내지 75세, 75 내지 80세, 80 내지 85세, 85 내지 90세, 90 내지 95세 또는 95 내지 100세인 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 인간 성인에게 투여된다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 수술, 화학요법 및/또는 방사선 치료를 받고 있거나, 받을 예정이거나 또는 받은 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 난치성 환자에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 난치성 환자는 표준 항암 요법에 내성인 환자이다. 특정 실시형태에서, 암을 가진 환자는, 암이 현저히 박멸되지 않고/않거나 증상이 현저하게 완화되지 않은 경우, 요법에 난치성이다. 환자가 난치성인지 여부의 결정은, 이러한 맥락에서 당 분야에서 받아들여지는 "난치성"의 의미를 사용하여, 치료의 효과를 평가하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체내 또는 시험관내에서 행해질 수 있다. 다양한 양태에서, 암을 가진 환자는 암성 종양이 감소하지 않았거나 증가된 경우에 난치성이다.
본 발명의 다른 방법은 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 대상체에게 본 명세서에 개시된 조합물, 예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자를 포함하는 조합물을 투여하여, 대상체가 전염병에 대해 치료되도록 하는 단계를 포함하는, 대상체에서 전염병을 치료하는 방법을 제공한다.
감염(예를 들어, 급성 및/또는 만성)의 치료에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물의 투여는 감염에 대한 자연 숙주 면역 방어를 자극하는 것에 더해, 또는 대신에, 통상적인 치료법과 병용될 수 있다. 감염에 대한 자연 숙주 면역 방어는 염증, 발열, 항체-매개된 숙주 방어, 림포카인 분비 및 세포독성 T-세포(특히 바이러스 감염 중)를 포함한 T-림프구-매개된 숙주 방어, 보체 매개된 용해 및 옵소닌화(촉진된 식균작용) 및 식균 작용을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 역기능 T-세포를 재활성화시키는 항-PD-1 항체 분자의 능력은 만성 감염, 특히 세포-매개된 면역이 완전한 회복에 중요한 것을 치료하는데 유용할 것이다.
항체 매개된 PD-1 차단제는 IL-15/IL-15Rα 복합체 투여에 대한 애주번트로서, 또는 IL-15/IL-15Rα 복합체 및/또는 백신과 병용하여 작용하여, 병원체, 독소 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 이 치료 접근법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예로는 현재 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 기존의 백신이 완전히 효과적이지 않은 병원체가 포함된다. 여기에는 HIV, 간염(A, B 및 C), 인플루엔자, 헤르페스, 지아디아, 말라리아, 레슈마니아(Leishmania), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas Aeruginosa)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. IL-15/IL-15Rα 복합체 및 PD-1 차단제에 의한 면역 시스템 자극은 감염의 과정에서 변이된 항원을 나타내는 HIV와 같은 약제에 의한 확립된 감염에 대해 특히 유용하다. 이러한 신규한 에피토프는 치료 시 이물질로 인식되어, 예를 들어, PD-1을 통한 음성 신호에 의해 완충되지 않는 강한 T 세포 반응을 유발한다.
질환, 예를 들어, 암, 전염병, 림프구결핍증, 면역결핍증 및 상처의 예방, 치료 및/또는 관리를 위해 IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항 PD-1 항체 분자와 병용하여 사용될 수 있는 다른 요법은 소분자, 합성 약물, 펩티드(환형 펩티드 포함), 폴리펩티드, 단백질, 핵산(예를 들어, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 삼중 나선을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 DNA 및 RNA 뉴클레오티드, RNAi 및 생물학적 활성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 포함), 항체, 합성 또는 천연 무기 분자, 유사 물질 및 합성 또는 천연 유기 분자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 요법의 특정 예는 면역조절제(예를 들어, 인터페론), 항염증제(예를 들어, 아드레노코르티코이드, 코르티코스테로이드(예를 들어, 베클로메타손, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 하이드로코르티손), 글루코코르티코이드, 스테로이드 및 비-스테로이드 항-염증제(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 디클로페낙 및 COX-2 저해제), 통증 완화제, 류코트리엔 길항제(예를 들어, 몬테루카스트, 메틸 크산틴, 자필루카스트 및 질류톤), 베타2-작동제(예를 들어, 알부테롤, 비테롤, 페노테롤, 이소테리, 메타프로테레놀, 피르부테롤, 살부타몰, 터부탈린 포름테롤, 살메테롤 및 살부타몰 터부탈린), 항콜린제(예를 들어, 이프라트로퓸 브로마이드 및 옥시트로퓸 브로마이드), 설파살라진, 페니실라민, 댑손, 항히스타민제, 항-말라리아 제제(예를 들어, 히드록시클로로퀸), 항바이러스제(예를 들어, 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 지도부딘, 아시클로비르, 간시클로비르, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘 및 리바비린), 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르 및 AZT) 및 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전 악티노마이신), 블레오마이신, 에리트로마이신, 페니실린, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC))을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
IL-15 기능/신호전달 및/또는 면역관문 변조에 의해 영향을 받는 질환의 예방, 관리 및/또는 치료에 유용한 것으로 알려졌거나 이에 사용되었거나 현재 사용되고 있는 요법이 IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자의 병용 요법과 병용하여 사용될 수 있다. 질환 또는 장애, 예를 들어, 암, 감염성 질환, 림프구 감소증, 면역결핍 및 상처를 예방, 치료 및/또는 조절하기 위해서 사용되어 왔거나 현재 사용될 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)에 관한 정보에 대해서는, 예를 들어 문헌[Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001]; 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999]; 문헌[Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996] 및 문헌[Physicians' Desk Reference (66th ed. 2012)]을 참조하기 바란다.
IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자의 병용 요법 이외에 사용될 수 있는 1종 이상의 다른 요법의 비제한적 예로는 면역조절제, 예컨대 화학치료제 및 비-화학요법 면역조절제를 포함한다. 화학치료제의 비제한적 예로는 메토트렉세이트, 시클로스포린 A, 레플루노미드, 시스플라틴, 이포스파미드, 탁산, 예컨대 탁솔 및 파클리탁솔, 토포이소머라제 I 저해제(예를 들어, CPT-11, 토포테칸, 9-AC 및 GG-211), 젬시타빈, 비노렐빈, 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 류코보린, 비노렐빈, 테모달, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 동족체 및 사이톡산이 포함된다.
생물학적 활성
일 양태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체 및/또는 항-PD-1 항체 분자는 예를 들어, 항체 반응(체액성 반응) 또는 세포 면역 반응, 예를 들어, 사이토카인 분비(예를 들어, 인터페론-감마), 헬퍼 활성 또는 세포성 세포독성일 수 있는 면역 반응을 증가시킨다. 일 실시형태에서, 증가된 면역 반응은 증가된 사이토카인 분비, 항체 생산, 효과기 기능, T 세포 증식 및/또는 NK 세포 증식이다. 이러한 활성을 측정하기 위한 다양한 검정은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA; 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds.), John Wiley and Sons, Inc. 1997]의 섹션 2.1 참조) 및 항원-특이적 T-세포를 식별하기 위한 "사량체 염색" 검정(문헌[Altman et al., (1996), Science 274: 94-96)] 참조), 혼합 림프구 표적 배양 검정(예를 들어, 문헌[Palladino et al., (1987), Cancer Res. 47:5074-5079] 참조) 및 시험관내에서 사이토카인 방출을 측정하는 데 사용될 수 있는 ELISPOT 검정(예를 들어, 문헌[Scheibenbogen et al., (1997), Int. J. Cancer 71:932-936] 참조)을 포함한다.
일부 양태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물에 의해 유도되거나 증진된 면역 반응은 당업계의 임의의 공지된 방법으로 분석한 바와 같이 음성 대조군, 또는 단일 제제로서 투여된 IL-15/IL-15Rα 복합체 또는 항-PD-1 항체 분자에 의해 유도된 면역 반응과 비교하여, 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배 또는 12배 증진되거나 증가된다. 특정 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물에 의해 유도된 면역 반응은 당업계의 임의의 공지된 방법으로 분석한 바와 같이 음성 대조군에 의해 유도된 면역 반응과 비교하여, 적어도 0.5 내지 2배, 적어도 2 내지 5배, 적어도 5 내지 10 배, 적어도 10 내지 50배, 적어도 50 내지 100배, 적어도 100 내지 200배, 적어도 200 내지 300배, 적어도 300 내지 400배, 또는 적어도 400 내지 500배 증진된다. 구체적인 실시형태에서, 면역 반응을 평가하기 위해 사용된 분석은 항체 생산, 사이토카인 생산 또는 세포의 세포독성의 수준을 측정하고, 상기 검정은 당업계에 잘 공지되어있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 측정하는데 사용되는 분석은 항체 또는 사이토카인 수준을 측정하는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 사이토카인 방출을 측정하는 ELISPOT 분석, 또는 세포독성을 결정하는 [51Cr] 방출 분석이다.
구체적인 실시형태에서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물은 스타필로코커스 장독소 B(SEB)에 의해 활성화된 전혈 상에서의 IL-2의 발현을 증가시킨다. 예를 들어, IL-15/IL-15Rα 복합체 및 항-PD-1 항체 분자는 IL-15/IL-15Rα 복합체, 항-PD-1 항체 분자 또는 아이소타입 대조군(예를 들어, IgG4)이 단독으로 사용되는 경우의 IL-2의 발현에 비하여 IL-2의 발현을 적어도 약 2, 3, 4 또는 5배 증가시킨다. IL-15/IL-15Rα 복합체가 항-PD-1 항체 분자의 투여 72시간 후에 투여되었을 때보다는, IL-15/IL-15Rα 복합체를 항 PD-1 항체와 동일한 날에 투여했을 때 첨가제 또는 상승 효과가 더욱 현저하였다.
일 실시형태에 있어서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물과 접촉된 암세포의 증식 또는 생존 가능성은 당업계의 임의의 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, CSFE, BrdU 및 방사성 티미딘 도입을 사용하여 측정한 바와 같이 음성 대조군, 또는 단일 제제로서 IL-15/IL-15Rα 복합체 또는 항-PD-1 항체 분자와 접촉할 때 암세포의 증식과 비교하여, 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7 배 또는 적어도 10 배 억제 또는 감소된다. 대안적으로, 세포 생존력은 세포 분해시 방출되는 안정한 세포질 효소인 젖산 탈수소 효소(LDH)를 측정하는 검정에 의해 또는 세포 용해시 [51Cr]의 방출에 의해 측정될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, IL-15/IL-15Rα 복합체와 항-PD-1 항체 분자의 조합물과 접촉된 암세포의 증식은 당업계의 임의의 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, CSFE, BrdU 및 방사성 티미딘 도입을 사용하여 측정한 바와 같이 음성 대조군, 또는 단일 제제로서 IL-15/IL-15Rα 복합체 또는 항-PD-1 항체 분자와 접촉된 암세포와 비교하여, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 억제 또는 감소된다.
상기 분석이 수행될 수 있는 암 세포주는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 괴사, 아폽토시스 및 증식 분석은 또한 일차 세포, 예컨대 조직 이식편에서 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 괴사성 세포는 뉴트럴 레드, 트립판 블루, 또는 ALAMARTM 블루와 같은 염료를 세포가 흡수할 수 있는 능력의 유무에 의해 측정된다(문헌[Page et al., (1993), Intl. J. of Oncology 3:473-476]). 이러한 분석에서, 세포는 염료를 함유하는 배지에서 배양되고, 세포는 세척되고, 염료의 세포 흡수를 반영하는 나머지 염료가 분광광도계로 측정된다. 또 다른 실시형태에서, 염료는 단백질에 대한 결합이 세포독성의 척도로서 사용될 수 있는 설포로다민 B(SRB)이다(문헌[Skehan et al., (1990), J. Natl Cancer Inst. 82:1107-12]). 또 다른 실시형태에서, MTT와 같은 테트라졸륨 염은 생존하는, 그러나 죽지 않은 세포를 검출함으로써 포유동물 세포 생존 및 증식을 위한 정량적 비색 분석에 사용된다(예를 들어, 문헌[Mosmann, (1983), J. Immunol. Methods 65:55-63] 참조).
다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 배양물의 부착된 및 "부유하는" 구획 모두에서 측정된다. 두 구획은 상청액을 제거하고, 부착된 세포를 트립신 처리하고, 원심분리 세척 단계(10분, 2000 rpm) 후 두 제제를 조합함으로써 수집된다. 현저한 양의 세포자멸사를 얻도록 술린닥(sulindac) 및 관련 화합물로 종양 세포 배양물을 처리하기 위한 프로토콜이 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Piazza et al., (1995) Cancer Research 55:3110-16] 참조). 이 방법의 특징은 부유 세포 및 부착 세포를 모두 수집하고, 세포자멸사를 관찰하기 위한 최적의 치료 시간 및 용량 범위를 확인하고 및 최적의 세포 배양 조건을 확인하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포자멸사는 DNA 단편화를 측정함으로써 정량된다. DNA 단편화의 정량적 시험관내 측정을 위한 상업적 측광 방법이 이용 가능하다. TUNEL(단편화된 DNA에서 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 검출함) 및 ELISA-기반 분석을 포함한 상기 분석의 예는 문헌[Biochemica, (1999), no. 2, pp.34-37(Roche Molecular Biochemicals])에 기재되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포자멸사는 형태학적으로 관찰될 수 있다.
본 개시의 하나 이상의 실시형태의 상세사항이 상기 첨부된 설명에 제시된다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태는 복수의 지시어를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 공보는 달리 표시되지 않는 한 해당되는 경우에 참고로 원용된다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 보다 완전히 예시하기 위해 제시된다. 이 실시예는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 개시된 대상의 범위를 제한하는 것으로 어떤 방식으로든 해석되지 않아야 한다.
특정 실시형태, 인용 및 참고문헌
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 범위가 한정되지 않는다. 실제로, 당업자에게는 본 명세서에 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구 범위의 범주 내에 속한다.
특허 출원, 특허 및 과학 출판물을 비롯한 다양한 참고문헌이 본 명세서에 인용되어 있고; 이러한 각각의 참고문헌의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
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실시예
실시예 1: CHO 세포주에서 hetIL-15의 생산
중국 햄스터 난소(CHO) 모체 세포주 CHO-MaKo를 사용하여 IL-15/IL-15Rα 이종이량체("hetIL-15"라고도 지칭됨)를 생산한다. CHO-MaKo 세포주는 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN) 기술을 사용하여 CHO-C8TD에서 매트립타제 유전자의 표적화된 결실에 의해서 유래되었다. 프로테아제 매트립타제는 CHO 세포에서 다양한 재조합 치료 단백질의 분해에 관여하는 것으로 밝혀졌다. CHO-C8TD는 WCB070625로부터의 모체 세포주 CHO-K1PD의 단일 바이알로부터 유래되었다. CHO-K1PD는 원래 ATCC(카탈로그 번호 CCL-61.3)로부터 얻어진 CHO-K1 세포주로부터 유래되었다. CHO-MaKo 세포주의 상세 사항은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 WO2015/166427호에서 찾을 수 있다.
전기천공에 의해서, 선형화된 벡터 pBW1697(IL-15(인터류킨 15) 및 IL015Rα(인터류킨 15 수용체 알파)을 암호화함) 및 IL-15Rα를 암호화하는 pBW1703을 CHO-MaKo 세포에 공동형질주입시켰다. 2일의 회복 단계 후, 형질주입된 세포 풀을 몇 주 동안 메토트렉세이트(MTX)가 보충된 저엽산염 배지에서 배양하여 재조합 세포를 선택하였다. IL-15 발현을 증가시키기 위해서, 회수된 세포 풀을 전기천공에 의해, IL-15를 암호화하는 선형화된 벡터 pBW1916으로 형질주입시켰다. 2일의 회복 단계 후, 형질주입된 세포 풀을 메토트렉세이트(MTX) 및 퓨로마이신이 보충된 저엽산염 배지에서 몇 주 동안 배양하여 FACS에 의해 단일 세포가 분류된 재조합 세포를 선택하였다. 선택된 클론을 생물반응기 성능, mRNA 크기 및 온전성(노던 블롯에 의함), 트랜스진 카피 수(qPCR에 의함), 발현 카세트의 크기 및 온전성(서던 블롯에 의함) 및 서열 검증(NGS에 의함)과 관련하여 추가로 특징규명하였다.
pBW1697, pBW1703 및 pBW1916의 벡터 지도는 도 1에 제시되어 있다. 표 3은 최종 발현 작제물 및 발현 카세트의 개요를 제공한다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 2종의 상이한 IL-15 발현 카세트를 사용하였다: pBW1697에서, 29 aa의 천연 신호 펩티드(자체의 SP) 및 114 aa IL-15 쇄 앞의 19 aa의 천연 프로펩티드 서열은 오픈 리딩 프레임(ORF)에 포함된다. pBW1916에서, IL-15 쇄는 소위 UTR12 신호 펩티드(UTR12 SP)와 조합된다.
IL-15Rα는 또한 2개의 상이한 ORF로부터 발현되었다. pBW1697에서, 이의 천연 신호 펩티드(자체의 SP)가 있는 전장 수용체(IL-15Rα FL)를 사용한다. pBW1703에서 IL-15Rα의 가용성 버전은 UTR12 SP로 발현된다.
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실시예 2. IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 생산
IL-15/IL-15Rα는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의해 생산된다. 생산은 생물반응기에서 표준 유가식(fed-batch) 생산 공정을 사용하여 수행된다.
마스터 세포 은행으로부터의 하나의 동결된 바이알을 해동시키고, 확장 배지에 현탁시킨다. 일련의 진탕 플라스크 계대를 수행하여 접종물의 부피를 확장시켰다. 접종물 부피 및 생존 세포 밀도가 충분히 높을 때(생존 세포 밀도 대략 4.8×106개 세포/㎖, 생존율 90% 초과), 접종물을 제1 시드 반응기로 옮긴다.
이전 단계로부터의 접종물을 확장 배지를 함유하는 제1 시드 생물반응기로 옮기고, 회분식 방식으로 추가로 배양한다. 생존 세포 밀도가 충분할 때(생존 세포 밀도 대략 5.4×106개 세포/㎖), 배양물을 사용하여 제2 시드 생물반응기를 접종한다.
제1 시드 생물반응기로부터의 배양물을 확장 배지를 함유하는 제2 시드 생물반응기로 옮기고, 회분식 방식으로 추가로 배양한다. 생존 세포 밀도가 충분할 때(생존 세포 밀도 대략 5.6×106개 세포/㎖), 배양물을 사용하여 생산 생물반응기를 접종한다.
생산 생물반응기를 유가식 모드로 작동시킨다. 단계 3의 배양물을 생산 배지를 함유하는 생산 생물반응기로 옮긴다. 2개의 공급 용액을 사용한 공급을 생물반응기 실행 전체에 걸쳐 수행한다. 두 공급물 첨가는 대략 2×106개 세포/㎖의 생존 세포 밀도에서 시작된다. 약 12.5×106개 세포/㎖의 생존 세포 밀도에서, 배양 온도는 36.5℃에서 33.0℃로 이동한다. 세포 생존율이 75% 이하로 떨어지거나 생산 시작 후 대략 14일이 지나면 수거를 시작한다. 대량 수거물의 각각의 로트를 바이오버든(bioburden) 및 외래 작용제(adventitous agent)에 대해 모니터링한다.
정제 공정은 바이러스 불활성화/제거를 위한 2개의 단계, 즉 낮은 pH 인큐베이션 및 나노여과를 포함한다. 최종적으로 생성물을 농축하고, 최종 완충액에서 정용여과한다.
실시예 3. O-글리칸 조성의 결정
O-글리칸을 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석기(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry: MALDI-MS)로 분석하였다. 이러한 목적으로, O-연결된 글리칸을 환원성 베타-제거 방법에 의해 단백질로부터 화학적으로 절단하고, MS 검출 전에 과메틸화(permethylation)에 의해 유도체화한다. MS 데이터에 기초하여, 식별 및 반-정량적 결과를 생성한다. 모든 5개 배치에서 주요 글리칸 종의 실체 및 상대적 풍부도를 표 4에 요약한다.
도 6은 막대 차트 형태의 다양한 종의 분포를 시각화한다.
상이한 세포주로부터 유래된 hetIL-15 배치들 사이에서 O-글리칸 변이체 및 분포의 관련 차이가 관찰된다. HEK293 배치는 약 50%의 코어 2 유형 변이체(C2G, C2S1, C2GS1, C2GS2)를 함유한다. 이들은 CHO 유래 배치에서 미량 수준으로만 검출된다. HEK293 배치(각각 약 50% 대 약 15%)에 비해 CHO 배치에서 더 높은 수준의 코어 1 일-시알릴화된 변이체(C1S1)가 검출되었다. 모든 배치의 전체 시알화 수준은 매우 높다(97% 초과). 관찰된 차이로 인해서, HEK293 및 CHO 세포에서 유래된 배치는 일반적인 O-글리칸 조성과 관련하여 대등하지 않은 것으로 간주된다.
도 7은 코어 1 유형 O-글리칸 형태("C1")의 기본 구조를 도시한다. 다른 글리칸 잔기(예를 들어, 시알산)를 사용한 확장은 표 4(예를 들어, C1S1, C1S2)에 열거된 바와 같이 더 복잡한 구조로 이어진다. 코어 1 구조 모티프는 분석된 모든 배치에 존재한다. 하기 도 8은 코어 2 유형 O-글리칸 형태("C2")의 기본 구조를 도시한다. 다른 글리칸 잔기를 사용한 확장은 표 4(예를 들어, C2S1, C2GS1)에 열거된 바와 같이 더 복잡한 구조로 이어진다. 이 구조는 HEK293 배치에서만 관련 수준으로 검출되었다.
Figure pct00014
O-글리칸을 시알산의 연결 유형과 관련하여 추가로 특징규명하였다. 베타 제거 방법에 의해 단백질을 화학적으로 절단한 후, 에틸에스테르화에 의한 유도체화를 수행하였다. 에틸에스테르화 후 O-연결된 글리칸의 MS 분석은 시알산 연결 정보(α2, 3 또는 α2, 6)를 제공하며, 정성적 기반 만으로 수행하였다.
HEK293 및 CHO 배치 둘 다는 2가지 유형의 시알산 연결(α2, 3 및 α2, 6)을 나타낸다. 이것은 인간 세포(HEK293)에서 발현되는 단백질에 대해 예상되지만, CHO 세포에서 발현되는 단백질에서는 흔하지 않다. 하기 도 9는 CHO 임상 배치 BC0001의 질량 스펙트럼을 나타낸다. α2, 6 연결된 시알산의 상대적 강도는 α2, 3 연결된 시알산의 더 지배적인 변이체에 비해 약간 낮다.
시알산 프로파일 및 함량을 역상 크로마토그래피에 의해 평가하였다. 화학적 절단 및 형광 표지 후, 시알산을 구배 용리에 의해 컬럼에서 분리시키고, 형광 검출에 의해 정량화하였다.
N-아세틸뉴라민산은 인간 당단백질에서 우세한 시알산이다. N-글리콜리뉴라민산은 인간이 아닌 당단백질에서 발견되며 바람직하지 않다. 따라서 N-글리콜리뉴라민산에 대한 높은 비율의 N-아세틸뉴라민산이 바람직하다.
HEK293 배치는 매우 높은 비율을 나타낸다. 이러한 배치에서 N-글리콜리뉴라민산의 양은 무시할 수 있는 것으로 간주될 수 있다.
CHO 배치는 200 초과의 높고 대등한 비율을 나타낸다. 이는 0.5% 미만의 바람직하지 않은 N-글리콜리뉴라민산이 이들 샘플에 존재함을 나타낸다.
실시예 4. N-글리칸 조성의 결정
N-글리칸을 hetIL-15 이종이량체로부터 효소적으로 절단하고, RapiFluor™ 기술을 사용하여 형광 표지 및 3차 아민으로 유도체화하였다. 정제 후, 표지된 N-글리칸을 MS(질량 분광분석기)와 커플링된 형광 검출을 사용하여 HILIC(친수성 상호반응 액체 크로마토그래피; Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)로 분석하였다.
도 10의 크로마토그램은 하나의 HEK293 유래 배치 및 하나의 CHO 유래 배치의 오버레이를 나타낸다. 2개의 상이한 세포주로부터 유래된 CHO 배치들 간에 N-글리칸 집단 및 분포의 상당한 차이가 관찰된다. 주요 N-글리칸 종은 상이하며, HEK293 배치의 프로파일은 이질적인 분포를 나타내는 반면 CHO 배치의 프로파일은 더 균질하다.
모든 5개 배치에서 주요 N-글리칸 종의 실체 및 상대적 피크 면적을 표 5에 요약한다.
도 11의 크로마토그램은 3개의 HEK293 배치의 오버레이를 나타낸다. 3개의 배치의 전체 탄수화물 패턴 및 주요 형태의 순위 순서는 유사하고, 관찰된 차이는 예상된 배치 간 변동성 내에 있다. 주요 종은 갈락토실화(FA2B/FA2/FA3/FA4)와 관련이 있지만, 높은 수준의 시알릴화가 관찰되었다. 다수의 다양한 시알화된 글리칸이 낮은 수준에서 검출되었다. 비푸코실화(afucosylated) 글리칸 및 높은 만노스 글리칸과 같이 약동학 또는 면역원성에 잠재적인 영향을 미치는 종은 검출되지 않았다.
도 12의 크로마토그램은 2개의 CHO 배치의 오버레이를 나타낸다. 2개의 배치의 탄수화물 패턴은 매우 유사하다. 2개의 주요 시알화된 종(FA2G2S2 및 FA2G2S1)이 N-글리칸 집단의 대략 60%에 기여한다. 비푸코실화 글리칸 및 높은 만노스 글리칸과 같이 약동학 또는 면역원성에 잠재적인 영향을 미치는 종은 검출되지 않았다.
Figure pct00015
실시예 5. 전이성 암을 가진 성인에서 IL-15/IL-15Rα 복합체 단독 또는 항-PD-1 항체 분자와의 조합물의 단계1/1b 연구
본 실시예는 고형 종양 및 림프종을 가진 인간 환자에게 CHO 세포주에 의해서 생산된 피하(SC) 재조합 이종이량체 IL-15/IL-15Rα 복합체(hetIL-15)를 단독 투여하거나, 또는 항-PD-1 항체 분자와 병용 투여한 것의 안전성, 내약성, 용량-제한 독성(DLT) 및 최대 내약 용량(MTD)을 측정하기 위한 연구를 기술하였다.
목표
이러한 I/Ib상 연구의 목적은 CHO 세포주에 의해 생산된 이종이량체 IL-15/가용성 IL-15Rα 복합체(hetIL-15)("CHO hetIL-15"로 지칭됨)의 안전성 프로파일을 결정하고, 그것을 항-PD-1 항체와 안전하게 조합될 수 있는지를 결정하고 그리고 추가 연구를 위한 적절한 용량 및 스케줄을 결정하기 위한 것이었다. 또한, 본 연구는 CHO hetIL-15의 약동학적 프로파일을 단일 작용제로서 및 항-PD-1 항체와 조합하여 특징규명하고, 예비 항종양 활성을 식별할 것이다.
1차 목적은 이전에 면역 관문 저해제(CPI)에 반응하였고, 진행하였던(이차 내성 환자) 고형 종양 및 림프종을 갖는 환자에서 단일 작용제로서 그리고 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15의 안전성, 내약성을 특징규명하는 것이다.
2차 목적은, 1) CHO hetIL-15 및 항-PD-1 항체의 예비 항종양 활성을 평가하는 것; 및 2) 단일 작용제로서 그리고 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15의 약동학(PK) 및 항-PD-1 항체의 PK를 특징규명하기 위한 것이다.
연구 설계
이것은 항 PD-1/CPI 요법에 대한 이전 반응을 얻은 후 진행되었던 진행성 고형 종양 및 림프종이 있는 대상체에서 피하 투여된 CHO hetIL-15 단독 및 항-PD-1 항체와의 조합의 I/Ib상, 공개 표지, 전역, 다기관 연구이다. 이전 반응은 방사선학적 완전 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)으로 정의된다. 가장 최근 요법에 CPI가 포함된 경우 6개월 이상 지속되는 안정적인 질환(SD)이 있는 대상체도 포함될 것이다. 연구는 용량 증량과 용량 확장의 두 파트로 이루어진다. 증량 부분 동안 2개의 개별 아암을 조사할 것이다: 1) 단일 작용제로서의 CHO hetIL-15의 평가. 항-PD-1 항체는 첫 번째 질환 재평가의 항-PD-1 항체 및 2) C1D1에서 시작하는 조합물로 CHO hetIL-15 및 항-PD-1 항체의 투여에 추가될 수 있다.
환자 집단
본 연구는 이전에 CPI(항 PD-1/PD-L1 및/또는 항 CTLA 4)로 치료되었고 이전에 반응하였고 진행하였던 18세 이상의 남성 및 여성 환자에서 수행할 것이다. 이전 반응은 초기 방사선학적 CR/PR(확증적 스캔이 필요하지 않음) 또는 가장 최근 요법에 CPI가 포함된 경우 SD가 6개월 이상 지속되는 것이다. 용량 증량 동안, 본 연구는 진행성 고형 종양 및 림프종 환자에서 수행될 것이다. 확장 동안, 흑색종 환자에서 연구를 수행한다.
주요 포함 기준
1. 18세 이상의 남성 또는 여성 환자.
2. 표준 요법 후 문서화된 진행이 있는 조직학적으로 확인되고 문서화된 진행성 고형 종양 및 림프종(수술 또는 방사선요법으로 치료할 수 없는 국소 진행성 및 전이성 질환이 있는 것 포함) 또는 연구자의 의견으로 적절한 표준 요법이 없는 대상체.
증량: 이전에 CPI(항 PD-1/PD-L1 및/또는 항 CTLA-4)로 치료되었고 이전에 반응하였고 진행하였던 환자. 이전 반응은 초기 방사선학적 CR/PR(확증적 스캔이 필요하지 않음) 또는 가장 최근 요법에 CPI가 포함된 경우 SD가 6개월 이상 지속되는 것이다.
확장: 이전에 CPI(항 PD-1/PD-L1 및/또는 항 CTLA-4)로 치료되었고 이전에 반응하였고 진행하였던 흑색종 환자. 이전 반응은 방사선학적 CR/PR(확증적 스캔이 필요하지 않음) 또는 가장 최근 요법에 CPI가 포함된 경우 SD가 6개월 이상 지속되는 것이다.
주요 배제 기준
1. 임의의 이전의 IL-15 치료를 받은 적이 있는 환자.
2. 연구 약물(들)의 임의의 성분 및 기타 mAb 및/또는 이들의 부형제에 대한 중증 과민성반응 이력.
3. 원발성 CNS 종양 환자는 제외된다. 연구 시작 전 2주에 증상이 있는 CNS 전이 또는 국소 CNS-유도 요법(예컨대, 방사선 요법 또는 수술) 또는 코르티코스테로이드 용량 증가를 필요로 하는 CNS 전이의 존재. 증후성 뇌 전이를 치료받은 환자는 (치료 전 4주 동안 그리고 연구 시작 전) 신경학적으로 안정적이고, 임의의 연구 치료 투여 전 적어도 2주 동안 프레드니손 또는 균등물의 용량이 1일 10 ㎎ 이하여야 한다.
4. 연구 치료의 첫 번째 용량의 7일 이내의, 부신 기능부전 상황에서 대체 용량 스테로이드 이외의, 전신 만성 스테로이드 요법(10 ㎎/일 초과의 프레드니손 또는 균등물) 또는 임의의 면역억제 요법. 국소용, 흡입용, 비강 및 안과용 스테로이드는 허용된다.
5. 본 연구에서 치료되는 것 이외의 악성 질환. 예외는 피부의 기저 세포 암종 또는 잠재적으로 치유력이 있는 요법을 받은 피부의 편평 세포 암종 또는 원위치 자궁경부암 또는 기대 수명에 영향을 미치지 않는 기타 종양을 포함한다.
유효성 평가
고형 종양의 경우 문헌[Seymour et al. (2017) Lancet Oncol; 18:e143-e152] 및 림프종의 경우 문헌[Cheson et al (2014) J. Clin. Oncol. 32(27):3059-67]에 기재된 바와 같은 RECIST1.1, iRECIST에 따른 종양 평가. 스크리닝 시, 치료 시작 28일 이내에 영상 평가를 수행할 것이다(주기 1 제1일 전 제-28일 내지 제-1일). 모든 대상체는 흉부, 복부 및 골반의 IV 조영제와 함께 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔을 받을 것이다. 목 질환의 임상적 증거가 있는 경우, IV 조영제를 사용하여 목의 CT를 또한 수행할 것이다. 알려진 CNS 질환이 있는 대상체의 경우 기준선에서 뇌의 영상화가 필요할 것이다. 자기 공명 영상(MRI)을 사용하여 CT에 의해서 적절하게 영상화되지 않는 질환 부위를 평가할 것이다. 대상체가 조영제를 견디지 못하는 경우, 조영제 없이 CT를 수행할 수 있다. MRI는 IV 조영제가 없는 CT가 적절하지 않은 질환 부위를 평가하는 데 사용할 수 있다. 눈에 보이는 피부 병변 및 쉽게 만져지는 종양은 자 또는 캘리퍼스를 사용하여 신체 검사에 의해서 측정할 수 있으며, 컬러 사진을 촬영할 것이다. 초음파는 반응을 목적으로 질환 부위를 측정하는 데 사용되어서는 안 된다.
결과 측정
약동학을 기준선 및 치료 시 CHO hetIL-15 및 항-PD-1 항체의 혈청 농도에 의해 평가한다.
단일 작용제로서 그리고 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15에 대한 주기 1(28일)에서 용량 제한 독성(DLT)의 발생률.
실험실 매개변수, 활력 징후 및 심전도(ECG)의 변화를 포함하는 유해 사례(AE) 및 중증 유해 사례(serious adverse event: SAE)의 발생률 및 중증도.
다른 평가는 하기를 포함한다:
1. 종양 침윤 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 수 및 세포독성 활성의 변화 및 T 세포 클론의 존재비의 변화 평가.
2. 기준선 및 치료 중 종양 생검에 대한 서열결정. IHC에 의한 종양 생검에 대한 PD-L1 발현 및 CD8+ T 세포의 평가.
3. 기준선 및 치료 중 종양 샘플에 대한 유전자 발현 프로파일링.
4. 기준선 및 치료 중 혈장 샘플로부터의 순환 유리 종양 DNA의 DNA 서열결정
5. 활성화/증식 마커, 혈액 내 T 세포 및 NK 세포 하위세트 상의 관문 저해제 및 혈장 중의 가용성 면역 인자의 수준 및/또는 발현의 기준선으로부터의 변화 평가.
연구 치료
용량 증량 및 용량 확장
MTD에 도달하거나 조합물에 대해 더 낮은 RD가 확립될 때까지 환자는 단일 작용제로서 그리고 항-PD-1 항체와 조합하여 CHO hetIL-15로 치료될 것이다. 용량 증량은 EWOC 원칙에 따라 적응형 BHLRM에 의해 안내되어 미래 연구 대상체에서 용량 제한 독성(DLT) 위험을 통제한다. 용량 증량 부분 동안 2개의 개별 투여 아암이 평가될 것이다:
아암 1) CHO hetIL-15 단일 작용제(대상체는 첫 번째 질환 재평가 후에 항-PD-1 항체를 시작하도록 허용될 것임)
아암 2) C1D1에서 시작하는 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15.
도 14는 평가될 잠정적인 용량 수준을 제공한다. 연구 과정에서 추가 및/또는 중간 용량 수준을 추가하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들어, 주기의 첫 2주 동안 hetIL-15를 주 1회 또는 2회 투여하는 것과 같이, hetIL-15의 대체 투여 일정을 평가할 수 있다. 안전성, PK 및/또는 PD를 더 잘 이해하기 위해 MTD 아래의 임의의 용량 수준에서 코호트를 추가할 수 있다.
치료 기간은 주기 1의 제1일(C1D1)에 시작될 것이다. 각각의 치료 주기는 28일로 구성될 것이다. CHO hetIL-15는 주 1회, 3주 사용/1주 휴지기로 피하 투여된다. 항-PD-1 항체가 제공되는 경우, 그것은 각각의 주기의 제1일에 1회 400 ㎎의 고정 용량으로 정맥내 투여될 것이다.
이 시험에 등록된 대상체의 경우, 단독 또는 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15의 시작 용량은 주 1회, 3주 사용/1주 휴지기 스케줄로 2 ㎍/㎏ 피하(SC)이다. 항-PD-1 항체의 시작 용량은 400 ㎎ Q4W i.v.일 것이다. 대체 투여 스케줄이 탐색될 수 있고, 프로토콜은 임의의 새로운 스케줄(들)을 반영하도록 수정될 것이다.
전임상 모델에서, IL-15 치료 단독은 IFN-γ를 유도하고, 항종양 효과를 갖지만 이러한 항종양 활성은 CD8+ T 세포에서 PD-1의 상향조절로 인해 제한될 수 있다. 관문 저해제, 예컨대, PD-1 및 CTLA-4 저해제의 첨가는 IFN-γ 발현을 추가로 증가시키고, CD8+ T 세포에서 PD-1의 발현을 감소시켜 생존을 증가시킨다(문헌[Yu et al (2010) Clin Cancer Res; 16(24):6019-28], 문헌[Yu et al (2012) Proc Natl Acad Sci USA; 109(16):6187-92]). 더욱이, 예비 임상 데이터는 CPI에 반응하는 대상체가 IL-15의 더 높은 기준선 수준을 갖는다는 것을 나타내었다. 흑색종, NSCLC 및 유방암에서 CD8+ T 세포 종양 침윤은 또한 IL-15 및 NK 유전자 특징의 더 높은 수준과 상관관계가 있다. 따라서, IL-15 효능제인 CHO hetIL-15와 PD-1 저해제인 항-PD-1 항체의 조합물은 상승작용적일 수 있고, 특히 이전에 관문 저해에 반응하였고 그 후에 재발되었던 대상체 집단에서, 항종양 반응을 추가로 향상시킬 수 있다.
추가 작용제는 CHO hetIL-15 ± 항-PD-1 항체와 조합될 수 있고, 다른 적응증은 연구의 확장 부분에서 고려될 수 있다. 이러한 추가 병용 요법 및/또는 적응증은 추후 프로토콜 수정과 함께 이러한 시험에 추가되는 경우에만 탐색될 것이다.
연구의 용량 확장 부분은 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15에 대해 MTD 및/또는 RD가 확인되면 시작될 것이다. 확장 군의 주요 목표는 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15의 안전성 및 내약성을 추가로 평가하는 것이다. 확장 군의 2차 목표는 CPI 재발 흑색종 대상체에서 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15의 항종양 활성을 평가하는 것이다.
임시(provisional) 용량 수준
표 6 및 표 7은 이 시험 동안 평가될 수 있는 CHO hetIL-15에 대한 시작 용량 및 임시 용량 수준을 설명한다. 항-PD-1 항체 용량은 400 ㎎ Q4W로 고정된다. 시작 용량 수준 1을 제외하고, 실제 용량 수준은 사용 가능한 독성, 약동학 및 약력학 데이터를 기반으로 결정될 것이다.
Figure pct00016
Figure pct00017
용량-제한 독성의 정의
용량-제한 독성(DLT)은 DLT 기간(28일) 내에 발생하는 유해 사례 또는 비정상적인 실험실 값으로 정의되는데, 여기서 단일 작용제로서의 CHO hetIL-15 또는 CHO hetIL-15/항-PD-1 조합물에 대한 관계는 배제될 수 없고, 주로 질환, 질환 진행, 병행 질병(inter-current illness) 또는 병용 의약과 관련되지 않는다. 표 8은 DLT에 대한 기준을 열거한다. 국립 암 연구소의 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events: NCI CTCAE) 버전 5.0이 모든 평가에 사용된다. 용량 증량 결정을 위해서, DLT가 고려되고 BHLRM에 포함될 것이다.
Figure pct00018
바이오마커
바이오마커 분석은 분자 및 세포 수준에서 단일 작용제로서 또는 항-PD-1 항체와 조합된 CHO hetIL-15의 효과를 조사하고, 마커의 변화가 노출 및 임상 결과와 어떻게 관련될 수 있는지를 결정하기 위해서 사용될 것이다. 또한, hetIL-15에 대한 내성 기전뿐만 아니라 효능의 잠재적인 예측 마커가 또한 탐색될 것이다.
[표 1]
Figure pct00019
Figure pct00020
[표 2]
Figure pct00021
CHO hetIL-15는 NK 및 CD8+ T 세포를 촉진하고 항종양 면역을 증가시킬 것이며, CHO hetIL-15 및 항-PD-1 항체 병용 요법은 종양 성장을 저해할 것이라고 예상된다.
실시예 6 CHO 세포에 의해 생산된 hetIL-15는 HEK293에 의해 생산된 hetIL-15와 비교하여 IL-15Rα 쇄 C-말단 스플라이싱 변이체를 갖지 않는다.
HEK293 및 CHO hetIL-15에 대해서 크기별 이질성을 펩티드 매핑, SDS-PAGE(천연 및 환원 조건), SEC, RP-HPLC 및 질량 분광 분석에 의해 비교하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, HEK293 배치 및 CHO 배치의 크로마토그래피 프로파일은 상당히 상이하다. HEK293 배치는 CHO 배치에 존재하지 않는 스플라이싱 변이체의 존재로 인해 이중 IL-15Rα 피크를 나타낸다. 스플라이싱 변이체의 위치는 IL-15 수용체 피크의 C-말단 영역에 존재한다. HEK293 및 CHO 배치는 4개의 IL-15 피크 분포 및 IL-15Rα 및 IL-15의 피크 면적 비율과 관련하여 매우 유사하다. 피크 면적 비율은 IL-15Rα 및 IL-15의 화학량론을 모니터링한다: 비율 2.0은 두 쇄의 1:1 몰 비율에 상응한다.
IL-15Rα 쇄의 스플라이싱 변이체는 159개 잔기(I1-G159)(하기에 나타냄)로 이루어진 HEK293 배치에서만 검출되었으며, 이는 펩티드 매핑에 의해 결정되었다:
Figure pct00022
본 명세서에 기술된 실시예 및 양태가 오직 예시적인 목적을 위한 것이고, 이의 견지에서 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함된다는 것이 이해된다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 군의 관점에서 기재되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 마쿠쉬 군의 구성원의 하위군의 관점에서 또한 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 각각이 개별적으로 참조에 의해 포함된 것과 동일한 정도로 전문이(또는 문맥이 언급한 바와 같이) 참조에 의해 명확하게 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> CHO CELL EXPRESSED HET IL-15 <130> PAT058680-WO-PCT <140> <141> <150> 62/970,485 <151> 2020-02-05 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 2 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agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240 acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt 300 caccaaaggc cagcgccacc ctccacagta acgacggcag gggtgacccc acagccagag 360 agcctctccc cttctggaaa agagcccgca gcttcatctc ccagctcaaa caacacagcg 420 gccacaacag cagctattgt cccgggctcc cagctgatgc cttcaaaatc accttccaca 480 ggaaccacag agataagcag tcatgagtcc tcccacggca ccccctctca gacaacagcc 540 aagaactggg aactcacagc atccgcctcc caccagccgc caggtgtgta tccacagggc 600 <210> 10 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro 115 120 125 Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr 130 135 140 Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly 165 170 <210> 11 <211> 2140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 11 cctggccatt gcatacgttg tatccatatc ataatatgta catttatatt ggctcatgtc 60 caacattacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg 120 ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 180 cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 240 tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 300 cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 360 atggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 420 ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 480 tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 540 tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 600 ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 660 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata 720 gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg ggcgcgcgtc gacgctagca agaaatggcc 780 ccgaggcggg cgcgaggctg ccggaccctc ggtctcccgg cgctgctact gctcctgctg 840 ctccggccgc cggcgacgcg gggcatcacg tgcccgcccc ccatgtccgt ggagcacgca 900 gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac tcccgggagc ggtacatctg caactcgggt 960 ttcaagcgga aggccggcac gtccagcctg acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat 1020 gtcgcccact ggacgacccc ctcgctcaag tgcatccgcg acccggccct ggttcaccag 1080 cggcccgcgc caccctccac cgtaacgacg gcgggggtga ccccgcagcc ggagagcctc 1140 tccccgtcgg gaaaggagcc cgccgcgtcg tcgcccagct cgaacaacac ggcggccaca 1200 actgcagcga tcgtcccggg ctcccagctg atgccgtcga agtcgccgtc cacgggaacc 1260 acggagatca gcagtcatga gtcctcccac ggcaccccct cgcaaacgac ggccaagaac 1320 tgggaactca cggcgtccgc ctcccaccag ccgccggggg tgtatccgca aggccacagc 1380 gacaccacgg tggcgatctc cacgtccacg gtcctgctgt gtgggctgag cgcggtgtcg 1440 ctcctggcgt gctacctcaa gtcgaggcag actcccccgc tggccagcgt tgagatggag 1500 gccatggagg ctctgccggt gacgtggggg accagcagca gggatgagga cttggagaac 1560 tgctcgcacc acctataatg agaattcgat ccagatctgc tgtgccttct agttgccagc 1620 catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 1680 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 1740 tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 1800 ctggggatgc ggtgggctct atgggtaccc aggtgctgaa gaattgaccc ggttcctcct 1860 gggccagaaa gaagcaggca catccccttc tctgtgacac accctgtcca cgcccctggt 1920 tcttagttcc agccccactc ataggacact catagctcag gagggctccg ccttcaatcc 1980 cacccgctaa agtacttgga gcggtctctc cctccctcat cagcccacca aaccaaacct 2040 agcctccaag agtgggaaga aattaaagca agataggcta ttaagtgcag agggagagaa 2100 aatgcctcca acatgtgagg aagtaatgag agaaatcata 2140 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atggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 420 ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 480 tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 540 tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 600 ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 660 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata 720 gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg ggcgcgcgtc gacgctagca agaaatggcc 780 ccgaggcggg cgcgaggctg ccggaccctc ggtctcccgg cgctgctact gctcctgctg 840 ctccggccgc cggcgacgcg gggcatcacg tgcccgcccc ccatgtccgt ggagcacgca 900 gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac tcccgggagc ggtacatctg caactcgggt 960 ttcaagcgga aggccggcac gtccagcctg acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat 1020 gtcgcccact ggacgacccc ctcgctcaag tgcatccgcg acccggccct ggttcaccag 1080 cggcccgcgc caccctccac cgtaacgacg gcgggggtga ccccgcagcc ggagagcctc 1140 tccccgtcgg gaaaggagcc cgccgcgtcg tcgcccagct cgaacaacac ggcggccaca 1200 actgcagcga tcgtcccggg ctcccagctg atgccgtcga agtcgccgtc cacgggaacc 1260 acggagatca gcagtcatga gtcctcccac ggcaccccct cgcaaacgac ggccaagaac 1320 tgggaactca cggcgtccgc ctcccaccag ccgccggggg tgtatccgca aggccacagc 1380 gacaccacgt aatgagaatt cgcggatatc ggttaacgga tccagatctg ctgtgccttc 1440 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1500 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 1560 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 1620 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgggtacc caggtgctga agaattgacc 1680 cggttcctcc tgggccagaa agaagcaggc acatcccctt ctctgtgaca caccctgtcc 1740 acgcccctgg ttcttagttc cagccccact cataggacac tcatagctca ggagggctcc 1800 gccttcaatc ccacccgcta aagtacttgg agcggtctct ccctccctca tcagcccacc 1860 aaaccaaacc tagcctccaa gagtgggaag aaattaaagc aagataggct attaagtgca 1920 gagggagaga aaatgcctcc aacatgtgag gaagtaatga gagaaatcat a 1971 <210> 14 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 14 Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 35 40 45 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 65 70 75 80 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp 85 90 95 Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr 100 105 110 Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu 115 120 125 Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala 130 135 140 Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr 145 150 155 160 Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser 165 170 175 Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln 180 185 190 Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 195 200 205 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Pro Gln Gly His Ser Asp Thr 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Pro Gln Gly His Ser Asp 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Pro Gln Gly His Ser 1 5 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Pro Gln Gly His 1 <210> 20 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Pro Gln Gly 1 <210> 21 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro 115 120 125 Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr 130 135 140 Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 165 170 175 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr 1 5 10 15 Pro Gln Gly <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys <210> 24 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 20 25 30 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> Any amino acid <400> 25 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Any hydrophobic amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> Any non-acidic amino acid <400> 26 Xaa Xaa Pro Arg Xaa Xaa 1 5 <210> 27 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 27 Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 35 40 45 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 65 70 75 80 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp 85 90 95 Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr 100 105 110 Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu 115 120 125 Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala 130 135 140 Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr 145 150 155 160 Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser 165 170 175 Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln 180 185 190 Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Pro Lys Ser 195 200 205 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 210 215 220 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 225 230 235 240 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 245 250 255 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 260 265 270 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 275 280 285 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 290 295 300 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 305 310 315 320 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 325 330 335 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 340 345 350 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 355 360 365 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 370 375 380 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 385 390 395 400 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 405 410 415 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 420 425 430 Ser Pro Gly Lys 435 <210> 28 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 28 Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 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Claims (34)

  1. 폴리펩티드 복합체로서, 인간 인터류킨 15(human interleukin 15: IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드 복합체는 FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA3G3S1, FA2F1G2S2, FA3G2S2 및 FA3G3S3을 포함하는 N-연결된 글리칸을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  2. 제1항에 있어서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 5의 서열을 갖고, IL-15Rα는 서열번호 6, 7, 10, 12, 14 또는 21의 서열을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 N-연결된 글리칸은 적어도 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20% 또는 22.5%의 FA2G2S1을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 N-연결된 글리칸은 적어도 10%, 20%, 30% 또는 40%의 FA2G2S2를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  5. 폴리펩티드 복합체로서, 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드 복합체는 O-연결된 글리칸을 포함하고, 상기 글리칸 중 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%는 코어-1 O-연결된 글리칸인, 폴리펩티드 복합체.
  6. 제5항에 있어서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 5의 서열을 갖고, IL-15Rα는 서열번호 6, 7, 10, 12, 14 또는 21의 서열을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 코어-1 O-연결된 글리칸은 일시알릴화되고/되거나 이시알릴화된, 폴리펩티드 복합체.
  8. 폴리펩티드 복합체로서, 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하되,
    상기 폴리펩티드 복합체는 O-연결된 글리칸을 포함하고, 상기 글리칸 중 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%는 코어-1 O-연결된 글리칸 구조를 갖고,
    상기 폴리펩티드 복합체는 FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA3G3S1, FA2F1G2S2, FA3G2S2 및 FA3G3S3을 포함하는 N-연결된 글리칸을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  9. 제8항에 있어서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 5의 서열을 갖고, IL-15Rα는 서열번호 6, 7, 10, 12, 14 또는 21의 서열을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 N-연결된 글리칸은 적어도 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20% 또는 22.5%의 FA2G2S1을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  11. 제8항에 있어서, 상기 N-연결된 글리칸은 적어도 10%, 20%, 30% 또는 40%의 FA2G2S2를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  12. 제8항에 있어서, 상기 코어-1 O-연결된 글리칸은 주로 일시알릴화되고/되거나 이시알릴화된, 폴리펩티드 복합체.
  13. 비-인간 세포에서 생산된 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체로서, 상기 IL-15/IL-15Rα 이종이량체는 α(2,6) O-연결된 시알릴화를 포함하는, 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 비-인간 세포는 재조합 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포인, 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 CHO 세포는 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변경된, 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체.
  16. 제13항에 있어서, 상기 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체는 O-연결된 글리칸을 포함하고, 상기 글리칸 중 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%는 코어-1 O-연결된 글리칸인, 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 O-글리칸 중 약 15%는 α(2,6)-연결된 시알릴화를 갖는, 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체.
  18. 폴리펩티드 복합체 또는 제13항의 단리된 IL-15/IL-15Rα 이종이량체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
  20. 비-인간 세포로서, 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하되, 상기 세포에 의해서 발현되는 IL-15 및 IL-15 Rα는 이종이량체를 형성하고, 상기 이종이량체는 α(2,6)-연결된 시알릴화를 포함하는, 비-인간 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 비-인간 세포는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 비-인간 세포.
  22. 제20항에 있어서, 상기 CHO 세포는 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변형된, 비-인간 세포.
  23. 암의 치료 방법으로서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제18항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  24. IL-15/IL-15α 이종이량체를 발현하는 세포를 생산하는 방법으로서,
    (a) 비-인간 세포를 제공하는 단계;
    (b) 비-인간 세포에 2개의 벡터를 동시에 형질주입하고 - 상기 2개의 벡터는 IL-15Rα 및 IL-15 둘 다를 암호화하는 제1 벡터 및 IL-15Rα의 일부를 암호화하는 제2 벡터를 포함함 -, 상기 형질주입된 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 단계 b)로부터의 세포에 IL-15를 암호화하는 제3 벡터를 형질주입하고, 상기 형질주입된 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) IL-15/IL-15α 이종이량체를 발현하는 개별 클론을 단리시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 비-인간 세포는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 CHO 세포는 매트립타제 유전자의 기능을 손상시키도록 변형된, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 IL-15Rα는 서열번호 6, 12 또는 14의 서열을 갖는, 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 IL-15는 서열번호 1 또는 5의 서열을 갖는, 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 IL-15 Rα의 일부는 IL-15Rα의 가용성 부분인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 IL-15Rα의 가용성 부분은 서열번호 7, 10 또는 21의 서열을 갖는, 방법.
  31. IL-15/IL-15 Rα 이종이량체의 생산 방법으로서,
    (a) 제24항에 의해서 생산된 세포를 IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 발현 및 IL-15/IL-15Rα 이종이량체의 분비를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계 및
    (b) 상기 세포 배양물로부터 상기 IL-15/IL-15α 이종이량체를 단리시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. 폴리펩티드 복합체로서, 인간 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩티드 및 인간 인터류킨 15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드 복합체는 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해서 생산되고, 상기 폴리펩티드 복합체는 IL-15Rα 쇄 스플라이싱 변이체를 갖지 않는, 폴리펩티드 복합체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 CHO 세포는 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변경된, 폴리펩티드 복합체.
  34. 제32항에 있어서, 상기 IL-15Rα 쇄 스플라이싱 변이체는 I1에서 G159까지에 걸쳐 있는 159개의 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
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