TW202142558A - Cho細胞表現的het il-15 - Google Patents
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Abstract
本發明關於在CHO細胞系中產生的IL-15/IL-15Rα異二聚體,以及產生該異二聚體之方法和使用該異二聚體之治療方法。
Description
本揭露關於包含人介白素15(IL-15)多肽和具有獨特糖基化譜的人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽之多肽複合物,以及產生這種多肽之方法。
細胞介素介白素-15(IL-15)係由體內許多細胞產生的四α-螺旋束淋巴因子家族之成員。IL-15在調節先天性和適應性免疫系統的活性方面發揮關鍵作用,例如維持記憶T細胞對入侵病原體的反應、抑制細胞凋亡、激活樹突狀細胞、以及誘導自然殺手(NK)細胞的增殖和細胞毒性活性。
IL-15受體由三條多肽組成,即類型特異性IL-15受體α(「IL-15Rα」)、IL-2/IL-15受體β(或CD122)(「β」)以及由多種細胞介素受體共有的常見γ鏈(或CD132)(「γ」)。認為IL-15Rα係由多種細胞類型表現,但不一定與β和γ結合。已證實IL-15傳訊通過肥胖細胞上發現的IL-15Rα、IL-15Rβ和IL-15Rγ的異二聚體複合物;β和γ的異二聚體複合物,或IL-15RX亞基而發生。
IL-15係可溶性蛋白,但內源性IL-15在血清或體液中不易檢測到,因為它主要以由幾種類型的輔助細胞表現或獲得的膜結合形式存在。例如,雖然在造血細胞譜系和非造血細胞譜系的細胞中都檢測到IL-15 mRNA,但是T
細胞不產生IL-15。而是,IL-15與IL-15Rα結合,在T細胞上形成細胞表面複合物。IL-15通過受體的胞外結構域的外顯子2中的「壽司(sushi)結構域」以高親和力特異性結合至IL-15Rα。在跨內體循環和遷移回細胞表面之後,該等IL-15複合物獲得對表現IL-15Rβγ低親和力受體複合物的旁觀者細胞進行活化,從而通過Jak/Stat路徑來誘導IL-15介導的傳訊的性質。已觀察到IL-15Rα的野生型可溶性形式(「sIL-15Rα」),該sIL-15Rα在緊鄰受體跨膜結構域遠側的胞外結構域中的切割位點處被切割。所牽涉的腫瘤壞死因子α轉換酶(TACE/ADAM17)係作為該過程所涉及的蛋白酶。
根據其在免疫系統中的多方面作用,已探究了被設計用於調節IL-15介導的功能的多種療法。最近的報導表明,IL-15在與sIL-15Rα或壽司結構域複合時維持其免疫增強功能。重組IL-15和IL-15/IL-15Rα複合物已顯示出在不同程度上促進記憶CD8 T細胞和NK細胞的擴增,並增強多種臨床前模型中的腫瘤排斥。此外,在小鼠模型中含有IL-15或IL-15/IL-15Rα複合物的構建體的腫瘤靶向,使移植有同源腫瘤的具有免疫能力的動物或注射有人腫瘤細胞系的T細胞和B細胞缺陷型SCID小鼠(保留NK細胞)中的抗腫瘤反應得以改善。增強的抗腫瘤活性被認為取決於含IL-15部分的半衰期增加以及IL-15在腫瘤細胞表面上的反式呈遞,這導致了增強的NK和/或CD8細胞毒性T細胞在腫瘤內的擴增。同樣,還報導了被工程化以表現IL-15的腫瘤細胞藉由增強T細胞和NK細胞募集、增殖和功能來促進已建立的腫瘤的排斥(Zhang等人,(2009)PNAS USA.[美國國家科學院院刊]106:7513-7518;Munger等人,(1995)Cell Immunol.[細胞免疫學]165(2):289-293;Evans等人,(1997)Cell Immunol.[細胞免疫學]179(1):66-73;Klebanoff等人,(2004)PNAS USA.[美國國家科學院院刊]101(7):1969-74;
Sneller等人,(2011)Blood.[血液]118(26):6845-6848;Zhang等人,(2012)J.Immunol.[免疫學雜誌]188(12):6156-6164)。
應當認識到,被稱為糖蛋白的含有寡糖鏈的蛋白質的生物活性不僅取決於蛋白質之整體結構,還取決於共價附接於蛋白質的寡糖之特性。糖基化可以影響蛋白質的溶解性、對蛋白水解攻擊和熱滅活的抗性、四級結構、活性、靶向、抗原性、功能活性和半衰期。通常,哺乳動物的糖基化模式描述於Fukuda等人(1994),Molecular Glycobiology[分子糖生物學],IRL出版社(IRL Press),紐約,藉由引用併入本文。唾液酸N-乙醯神經胺酸(NANA)係N-和O-連接的聚糖之主要成分。已顯示唾液酸對於維持蛋白質治療劑的半衰期很重要。已知的是,去唾液酸化或唾液酸化不足的糖蛋白具有顯著降低的血漿半衰期。因此,產生具有獨特糖基化譜的IL-15/IL-15Rα複合物係有利的。
本文揭露了具有獨特糖基化譜的IL-15/IL-15Rα異二聚體之組成物。N-乙醯神經胺酸(NANA)係N-和O-連接的聚糖之主要成分。NANA係人類蛋白質糖基化事件中神經胺酸之主要形式,而其他哺乳動物也可能包括其他衍生物,例如N-羥乙醯神經胺酸(NGNA)。NANA可以幾種方式連接到N-和O-聚糖的核心結構。儘管存在其他連接,例如α(2,8),但主要地是與後續糖的α(2,3)和α(2,6)鍵。人類細胞,例如人類胚胎腎(HEK)細胞,主要產生α(2,6)連接的唾液酸化,而許多生產細胞系,例如哺乳動物細胞系(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系),產生α(2,3)連接的唾液酸化。
在CHO細胞中,已報導負責產生核心聚糖結構(β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶1)的α(2,6)連接的NANA延伸的酶係無活性的或未在CHO細胞中表現的(參見例如Chung等人(2017)Biotechnol.J[生物技術雜誌].12:1600502)-儘管該酶本身的基因存在於灰倉鼠(C.griseus)中。本發明基於出人意料的發現,即與人類細胞系產生的IL-15/IL-15Rα複合物相比,CHO細胞產生的IL-15/IL-15Rα複合物具有不同的糖基化模式。此外,在CHO細胞產生的IL-15/IL-15Rα複合物中觀察到α(2,6)鍵型聚糖。這種糖基化模式係獨特且令人驚訝的,因為它通常在人類細胞系表現的蛋白質中觀察到。與預期的CHO模式相比,它更接近人類糖基化形式,提供了直接的好處,例如免疫性較低。例如,CHO細胞產生的IL-15/IL-15Rα中基本上不存在非人類、具有潛在免疫性的糖表位,例如N-羥乙醯神經胺酸。此外,糖基化可能影響體內細胞介素的半衰期及其分佈,因此影響糖基化的IL-15/IL-15Rα複合物的治療效果。
另一方面,HEK細胞衍生的IL-15/IL-15Rα複合物由於工藝穩健性低、產量低、生產過程中使用動物源性原材料、解析度有限而複雜的分析表徵、以及最近檢測到的IL-15Rα剪接變體的存在等原因,被認為不是進一步開發的最佳選擇。IL-15Rα剪接變體可能引起毒性。此外,另外種類的存在使得難以確定向患者投與的活性IL-15/IL-15Rα複合物的準確量,並影響藥物的效力。當使用HEK細胞產生重組生物藥物時,對病毒污染的敏感性也被認為係潛在的風險。因此,CHO細胞被認為係產生IL-15/IL-15Rα複合物的更佳選擇,因為它們更安全,對病毒污染不那麼易感,並且產量更高。
因此,本揭露關於包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽之多肽複合物。在一些實施方式中,多肽複合物包含N連接的聚糖,該N連接的聚糖包含FA2G2、FA2G2S1、FA2G2S2、FA3G3S1、
FA2F1G2S2、FA3G2S2、和FA3G3S3。在一些實施方式中,IL-15多肽具有SEQ ID NO:1或5的序列,IL-15Rα具有SEQ ID NO:6、7、10、12、14或21的序列。
在一些實施方式中,N連接的聚糖包含至少約10%、12.5%、15%、17.5%、20%或22.5%的FA2G2S1。在一些實施方式中,N連接的聚糖包含至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%的FA2G2S1。
在一些實施方式中,N連接的聚糖包含至少約10%、20%、30%、或40%的FA2G2S2。在一些實施方式中,N連接的聚糖包含至少約10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、32.5%、35%、37.5%、或40%的FA2G2S2。
在一些實施方式中,多肽複合物包含O連接的聚糖。在一些實施方式中,至少80%、85%、90%或95%的聚糖係核心-1 O連接的聚糖。
在一些實施方式中,核心-1 O連接的聚糖主要是單唾液酸化的和/或二唾液酸化的。
本文另外揭露了多肽複合物,該多肽複合物包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽,該多肽複合物具有O連接的聚糖和N連接的聚糖兩者。在一些實施方式中,該多肽複合物的O連接的聚糖具有至少約80%、85%、90%或95%的聚糖,該聚糖具有核心-1 O連接的聚糖結構;並且該多肽複合物包含N連接的聚糖,該N連接的聚糖包含FA2G2、FA2G2S1、FA2G2S2、FA3G3S1、FA2F1G2S2、FA3G2S2、和FA3G3S3。在一些實施方式中,IL-15多肽具有SEQ ID NO:1或5的序列,IL-15Rα具有SEQ ID NO:6、7、10、12、14或21的序列。
在一些實施方式中,N連接的聚糖包含至少約10%、12.5%、15%、17.5%、20%或22.5%的FA2G2S1。在一些實施方式中,N連接的聚糖包含至少
10%、20%、30%、或40%的FA2G2S2。在一些實施方式中,核心-1 O連接的聚糖主要是單唾液酸化的和/或二唾液酸化的。
本文另外揭露了在非人類細胞中產生的分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體,其中該IL-15/IL-15Rα異二聚體包含α(2,6)O連接的唾液酸化。在一些實施方式中,非人類細胞係重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施方式中,改變CHO細胞以損害蛋白裂解酶之功能。
在一些實施方式中,分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體包含O連接的聚糖,並且其中至少90%或95%的聚糖係核心-1 O連接的聚糖。在一些實施方式中,約15%的O-聚糖具有α(2,6)連接的唾液酸化。
本文另外揭露了藥物組成物,該藥物組成物包含本文所述之多肽複合物的任一種或分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體的任一種。在一些實施方式中,該藥物組成物還包含藥學上可接受的載劑。
本文另外揭露了非人類細胞,該非人類細胞包含編碼人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽的核酸,其中由該細胞表現的IL-15和IL-15Rα形成異二聚體,並且其中該異二聚體包含α(2,6)連接的唾液酸化。
本文另外揭露了治療癌症之方法,該方法包括向有需要的受試者投與本文所述之藥物組成物。
本文另外揭露了產生表現IL-15/IL-15α異二聚體的細胞之方法,該方法包括:(a)提供非人類細胞;(b)同時用兩種載體轉染該非人類細胞,其中該兩種載體包含編碼IL-15Rα和IL-15的第一載體,和編碼IL-15Rα的一部分的第二載體,並培養轉染的細胞;(c)用編碼IL-15的第三載體轉染來自步驟b)的細胞,並培養轉染的細胞;以及(d)分離表現IL-15/IL-15α異二聚體的單個選殖。
在一些實施方式中,非人類細胞係重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施方式中,修飾CHO細胞以損害蛋白裂解酶基因之功能。在一些實施方式中,IL-15Rα具有SEQ ID NO:12的序列。在一些實施方式中,IL-15具有SEQ ID NO:5的序列。在一些實施方式中,IL-15Rα的該部分係IL-15Rα的可溶性部分。在一些實施方式中,IL-15Rα的可溶性部分具有SEQ ID NO:10的序列。
本文另外揭露了產生IL-15/IL-15Rα異二聚體之方法,該方法包括(a)在允許IL-15/IL-15Rα異二聚體表現和IL-15/IL-15Rα異二聚體分泌的條件下培養以上產生的細胞,以及(b)從細胞培養物中分離IL-15/IL-15α異二聚體。
本文另外揭露了多肽複合物,該多肽複合物包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽,其中該多肽複合物由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生,並且其中該多肽複合物不具有IL-15Rα鏈剪接變體。
在一些實施方式中,IL-15Rα鏈剪接變體包含從I1到G159的跨度的159個殘基。在一些實施方式中,改變CHO細胞以損害蛋白裂解酶之功能。
[圖1]顯示了pBW1697、pBW1703和pBW1916之載體圖。載體pBW1697(A)包括用於表現IL-15和IL-15Rα之基因;pBW1703(B)包括用於表現IL-15Rα之基因,以及(C)pBW1916包括用於表現IL-15之基因。所有三個質體都包括用於載體線性化的SwaI位點。
[圖2]顯示了在穩定性研究的開始和結束時,對產生IL-15/IL-15Rα(C009)之細胞的北方印漬分析。藉由北方印漬分析細胞的IL-15
(A)、具有原肽的IL-15自身SP(B)和IL-15Rα(C)之mRNA表現。將0.5-10kb RNA梯度裝載至泳道M,並將來自親本CHO-MaKo細胞的對照RNA裝載至泳道P。(A)檢測到IL-15 mRNA之預期的1kb帶大小。(B)檢測到具有原肽的IL-15自身SP mRNA之預期的1kb帶大小。(C)檢測到IL-15Rα mRNA之預期的1kb帶大小。沒有檢測到親代細胞的訊息。
[圖3]顯示了在穩定性研究的開始和結束時,對產生IL-15/IL-15Rα(C009)的細胞的南方印漬分析。用限制酶MfeI消化來自細胞的基因組DNA,並使用靶向IL-15基因序列的探針So465(A)、靶向IL-15自身SP+原肽序列的探針So466(B)和靶向IL-15Rα基因序列的探針So467(C)藉由南方印漬進行分析。將DNA梯度(分子DNA標記物VII,羅氏公司(Roche))裝載至泳道M。泳道1-3含有來自親本CHO-MaKo細胞的MfeI消化的基因組DNA,不含(泳道4)或含有加標的MfeI消化的pBW1697(泳道1)、pBW1703(泳道2)和pBW1916(泳道3)載體DNA,每個基因組有5個拷貝。(A)從pBW1697(泳道1)、pBW1916(泳道3)以及在穩定性研究的開始和結束(泳道5和6)時檢測到IL-15片段之預期的1.9kb帶大小。(B)從pBW1697(泳道1)檢測到IL-15自身SP+原肽片段之預期的1.9kb帶大小,在穩定性研究的開始和結束(泳道5和6)時均未檢測到帶。(C)從pBW1697(泳道1)檢測到IL-15Rα片段(IL-15Rα FL)之預期的2.5kb帶大小,從pBW1703(泳道2)以及在穩定性研究的開始和結束(泳道5和6)時檢測到2kb帶大小(IL-15Rα sol)。無法檢測到親代細胞的訊息。
[圖4]顯示了在穩定性研究開始和結束時產生IL-15/IL-15Rα(C009)的細胞的轉基因拷貝數。藉由qPCR測量產生IL-15/IL-15Rα的細胞和CHO-MaKo親本細胞的IL-15/自身SP(黑色柱)、IL-15Rα/UTR12SP(深灰色柱)和IL-15/UTR12SP(淺灰色柱)基因拷貝數(每個單倍體基因組)。
[圖5]顯示了α 2,3-和α 2,6連接的唾液酸區分。分圖A示出了6’唾液乳糖的乙基酯化,分圖B示出了3’唾液乳糖的內酯的形成。
[圖6]顯示了het IL-15的O-聚糖分佈。
[圖7]顯示了核心1型結構。
[圖8]顯示了核心2型結構。
[圖9]顯示了het IL-15的MS光譜。
[圖10]顯示了HEK和CHO產生的het IL-15的N-聚糖譜。
[圖11]顯示了HEK產生的het IL-15的N-聚糖譜。
[圖12]顯示了CHO產生的het IL-15的N-聚糖譜。
[圖13]顯示了聚糖各個構造單元的命名法。
[圖14]顯示了劑量遞增和擴展研究設計
[圖15]顯示了HEK293批次和CHO批次之層析圖。
一般事項
為了可以更容易地理解本發明,在整個具體實施方式中定義了某些術語。除非另外定義,否則本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域之普通技術者通常所理解的相同意義。
術語
除非另外聲明,否則如本文所用以下術語和短語意在具有以下意思:
如本文所用,冠詞「一個」和「一種」係指一個或多於一個(例如,至少一個)該冠詞的語法賓語。
除非上下文另有明確說明,否則術語「或」在本文中用於表示術語「和/或」並且可與術語「和/或」互換使用。
「約」和「大約」通常表示在給定測量的性質或精度的情況下測量的量之可接受的誤差度。示例性誤差度在給定值或值範圍的20%內,典型地在10%內,並且更典型地,在5%內。
術語「疾病」和「障礙」可互換使用,係指病症,特別是病理性病症。在某些實施方式中,術語「疾病」和「障礙」可互換使用,係指IL-15訊息轉導所影響的疾病和/或免疫效應子反應的促進所影響的疾病。
如本文所用,術語「治療(treat、treatment和treating)」係指由於一種或多種療法的投與而產生的障礙(例如,增殖性障礙)的進展、嚴重性和/或持續時間的減輕或改善,或者障礙的一種或多種症狀(較佳的是,一種或多種可辨別的症狀)的改善。在具體實施方式中,術語「治療(treat、treatment和treating)」係指增殖性障礙的至少一種可測量的物理參數(諸如腫瘤的生長)的改善,但該物理參數不一定是患者可辨別的。在其他實施方式中,術語「治療(treat、treatment和treating)」係指藉由例如穩定可辨別的症狀來物理地,或藉由例如穩定物理參數來生理地,或藉由兩者,抑制增殖性障礙的進展。在其他實施方式中,該等術語「治療(treat、treatment和treating)」係指減少或穩定腫瘤大小或癌細胞計數。
如本文所用,術語「療法」可以指可以用於預防、治療、控制或改善疾病(例如,癌症、感染性疾病、淋巴細胞減少和免疫不全,或與它們相關的症狀)的任何一種或多種方案、一種或多種方法、一種或多種組成物、一種或多種製劑和/或一種或多種藥劑。在某些實施方式中,術語「療法」係指生物療法、支持療法和/或其他可用於治療、控制、預防或改善與熟悉該項技術者已知的疾病或症狀相關的疾病或症狀的療法。
如本文所用,術語「特異性結合」、「特異性識別」和類似的術語在受體(例如,天然IL-15Rα或IL-15受體βγ)和配體(例如,天然IL-15)相互作用的語境中係指配體和受體之間的特異性結合或締合。較佳的是,配體對受體的親和力高於對其他分子的親和力。在具體實施方式中,配體係天然IL-15,天然受體係IL-15Rα。在另一個具體實施方式中,配體係天然IL-15/IL-15Rα複合物,天然受體係βγ受體複合物。在另一個實施方式中,IL-15/IL-15R複合物結合至βγ受體複合物並活化IL-15介導的訊息轉導。可以例如藉由免疫測定法(BIAcoreTM)或熟悉該項技術者已知的其他技術來鑒定特異性結合受體的配體。
如本文所用,術語「免疫特異性結合」和「特異性結合」在抗體的語境中係指特異性結合抗原(例如,表位或免疫複合物)但不特異性結合另一種分子的分子。如藉由例如免疫測定法(BIAcoreTM)或本領域已知的其他測定法所測定,特異性結合抗原的分子可以以較低的親和力結合其他抗原。在一個具體實施方式中,結合抗原的分子不與其他抗原交叉反應。
所謂「組合」或「與......組合」並不旨在暗示療法或治療劑必需同時投與和/或將該等療法或治療劑配製用於一起遞送,儘管該等遞送方法也在本文所述之範圍內。組合中的治療劑可以與一種或多種其他另外的療法或治療劑同時、在其之前或之後投與。該等治療劑或治療方案可以以任何順序投與。通常,每種藥劑將以針對該藥劑確定的劑量和/或日程表投與。還應理解,該組合中使用的另外的治療劑可以按單一組成物一起投與或按不同組成物單獨投與。通常,預期組合中使用的其他治療劑的以不超過它們單獨使用時的水平使用。在一些實施方式中,組合中使用的水平將低於單獨使用的水平。
術語「抗癌作用」係指可以藉由各種手段顯現的生物學作用,包括但不限於例如腫瘤體積減少、癌細胞數量減少、轉移數量減少、預期壽命延
長、癌細胞增殖減少、癌細胞存活率降低、或改善與癌症相關的各種生理症狀。「抗癌作用」還可以藉由肽、多核苷酸、細胞和抗體首先預防癌症發生的能力來顯現。
術語「抗腫瘤作用」係指可以藉由各種手段顯現的生物學作用,包括但不限於例如腫瘤體積減少、腫瘤細胞數量減少、腫瘤細胞增殖減少、或腫瘤細胞存活率降低。
術語「癌症」係指以異常細胞的快速和不受控制的生長為特徵的疾病。癌細胞可以局部或通過血流和淋巴系統擴散到身體的其他部位。本文描述了各種癌症之實例,並且包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、大腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。術語「腫瘤」和「癌症」在本文中可互換使用,例如,這兩個術語包括實體和液體,例如彌散或循環腫瘤。如本文所用,該術語「癌症」或「腫瘤」包括惡化前以及惡性癌症和腫瘤。
如本文所用的術語「免疫效應子」或「效應子」「功能」或「反應」係指增強或促進靶細胞的免疫攻擊的功能或反應,例如免疫效應細胞的功能或反應。例如,免疫效應子功能或反應係指促進靶細胞的殺傷或抑制生長或增殖的T或NK細胞的特性。在T細胞的情況下,初級刺激和共刺激係免疫效應子功能或反應之實例。
術語「效應子功能」係指細胞的特化功能。例如,T細胞的效應子功能可為細胞溶解活性或輔助活性(包括細胞介素的分泌)。
本發明之組成物和方法涵蓋具有指定序列,或與指定序列基本上相同或相似的序列(例如,與指定序列具有至少85%、90%、95%同一性或更高同一性的序列)之多肽和核酸。在胺基酸序列的語境中,術語「基本上相同」在本文中用於指這樣的第一胺基酸:它含有i)與第二胺基酸序列中的比對胺基酸
殘基相同的,或ii)為第二胺基酸序列中的比對胺基酸殘基的保守置換的足夠或最小數量的胺基酸殘基,以使得第一胺基酸序列和第二胺基酸序列可以具有共同結構域和/或共同功能活性。例如,含有與參考序列(例如,本文提供的序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的共同結構域之胺基酸序列。
在核苷酸序列的語境中,術語「基本上相同」在本文中用於指這樣的第一核酸序列:它含有與第二核酸序列中比對的核苷酸相同的足夠或最小數量的核苷酸,以使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列編碼具有共同功能活性的多肽,或編碼共同結構多肽域或具有共同功能多肽活性。例如與參考序列(例如,本文提供的序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。
術語「功能性變體」係指與天然存在或野生型的序列具有基本上相同的胺基酸序列,或由基本上相同的核苷酸序列編碼,並且能夠具有天然存在或野生型的序列的一種或多種活性的多肽。
如下所述進行序列之間的同源性或序列同一性(該等術語在本文中可互換地使用)的計算。
為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性,出於最佳比較目的對序列進行比對(例如,在第一胺基酸和第二胺基酸或第一核酸序列和第二核酸序列的一者或二者中引入空位以用於最佳比對,並且出於比較目的,非同源序列可以忽略)。在一個較佳的實施方式中,出於比較目的而比對的參考序列之長度為參考序列之長度的至少70%、較佳的是至少80%、更較佳的是至少90%、95%、甚至更較佳的是至少100%。然後比較對應的胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中
的對應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時,則該等分子在該位置係相同的(如本文所用,胺基酸或核酸「同一性」等同於胺基酸或核酸「同源性」)。
將空位的數量和每個空位的長度考慮在內,兩個序列之間的百分比同一性係該等序列共有的相同位置的數量的函數,需要引入該等空位以進行兩個序列的最佳比對。
兩個序列之間的序列比較和百分比同一性確定可以使用數學演算法來完成。在一個較佳的實施方式中,使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]48:444-453)演算法(該演算法已併入GCG套裝軟體中的GAP程式中(可從NCBI獲取)),使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的空位權重和1、2、3、4、5或6的長度權重來確定兩個胺基酸序列之間的百分比同一性。在又一個較佳的實施方式中,使用GCG套裝軟體中的GAP程式,使用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、70或80的空位權重和1、2、3、4、5或6的長度權重來確定兩個核苷酸序列之間的百分比同一性。一組特別較佳的參數(以及除非另外指定否則應該使用的參數)係Blossum 62得分矩陣,其中空位罰分為12,空位延伸罰分為4,移碼空位罰分為5。
可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS[生物科學中的電腦應用]4:11-17)的演算法(該演算法已併入ALIGN程式(版本2.0)中),使用PAM120權重殘基表、12的空位長度罰分和4的空位罰分來確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的百分比同一性。
本文所述之核酸序列和蛋白序列可以用作「查詢序列」來對公共數據庫進行搜索,從而例如鑒定其他家族成員或相關序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]215:403-10的NBLAST和XBLAST程式(版本2.0)來進行該等搜索。可以用NBLAST程式(得分=100,字長=12)來進行BLAST核苷酸搜索,以獲得與本發明之核酸(SEQ ID NO:2)分子同源的
核苷酸序列。可以用XBLAST程式(得分=50,字長=3)來進行BLAST蛋白質搜索,以獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402中所述使用空位BLAST(Gapped BLAST)。當使用BLAST和空位BLAST程式時,可以使用相應程式(例如,XBLAST和NBLAST)(可從NBCI獲取)的默認參數。
如本文所用,術語「在低嚴格性、中等嚴格性、高嚴格性或非常高嚴格性條件下雜交」描述了雜交和洗滌的條件。用於進行雜交反應的指導可見於Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學實驗室指南],John Wiley & Sons,N.Y.[約翰‧威立父子出版公司,紐約](1989),6.3.1-6.3.6。在該參考文獻中描述了水性和非水性方法,並且可以使用任一種。本文涉及的特定雜交條件如下:1)低嚴格性雜交條件:在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃下雜交,然後在0.2X SSC、0.1% SDS中至少50℃下洗滌兩次(對於低嚴格性條件,洗滌的溫度可以增加至55℃);2)中等嚴格性雜交條件:在6X SSC中約45℃下雜交,然後在0.2X SSC、0.1% SDS中60℃下洗滌一次或多次;3)高嚴格性雜交條件:在6X SSC中約45℃下雜交,然後在0.2X SSC、0.1% SDS中65℃下洗滌一次或多次;以及較佳的是,4)非常高嚴格性雜交條件是0.5M磷酸鈉、7% SDS,65℃下,然後在0.2X SSC、1% SDS中65℃下洗滌一次或多次。非常高嚴格性條件(4)係較佳的條件以及除非另外指明否則應該使用的條件。
應當理解,本發明之分子可以具有另外的保守或非必需胺基酸置換,該等置換對分子的功能沒有實質性影響。
術語「胺基酸」旨在包括所有無論是天然的還是合成的分子,該等分子包括胺基官能基和酸官能基二者,並且能夠包括在天然存在的胺基酸的聚合物中。示例性胺基酸包括天然存在的胺基酸;它們的類似物、衍生物和同
類物;具有變體側鏈的胺基酸類似物;以及任何前述中的任一者的所有立體異構物。如本文所用,術語「胺基酸」包括D-光學異構物或L-光學異構物和肽模擬物。
「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基替換的取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族已在本領域中進行了定義。該等家族包括具有以下側鏈的胺基酸:鹼性側鏈(例如,離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如,天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如,甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如,丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如,蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)以及芳香族側鏈(例如,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」(如果是單鏈的)在本文中可互換使用,係指任何長度的胺基酸的聚合物。聚合物可為直鏈或支鏈的,它可以包含經修飾的胺基酸,並且它可以被非胺基酸中斷。該等術語還涵蓋已經修飾的胺基酸聚合物;例如,二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作,諸如與標記性組分軛合。多肽可以從天然來源分離,可以藉由重組技術從宿主真核或原核宿主產生,或者可為合成過程的產物。
術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「多核苷酸序列」和「多核苷酸」可互換使用。它們係指任何長度的聚合形式的核苷酸,即去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或它們的類似物。多核苷酸可為單鏈的或雙鏈的,如果是單鏈的,多核苷酸可為編碼鏈或非編碼(反義)鏈。多核苷酸可以包括經修飾的核苷酸,諸如甲基化的核苷酸和核苷酸的類似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在聚合後進一步修飾,諸如藉由與標記性組分軛合來修飾。核酸可為重組多核苷酸,或基因組、cDNA、半合成或合
成來源的多核苷酸,它們在自然界中不存在或以非天然排列連接至另一個多核苷酸。
如本文所用,術語「分離的」係指從其原始或天然環境(例如其天然存在的天然環境)中移除的材料。例如,不分離存在於活動物中的天然存在的多核苷酸或多肽,而是分離藉由人為干預從天然系統中的一些或所有共存材料中分出的相同多核苷酸或多肽。此類多核苷酸可為載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可為組成物的一部分,並且仍然是分離的,因為這種載體或組成物不是其天然存在的環境的一部分。
如本文所用,術語「聚糖」係糖,其可為糖殘基的單體或聚合物,例如至少三種糖,並且可為直鏈或支鏈的(例如,具有α 1,3臂和α 1,6臂)。「聚糖」可包括天然糖殘基(例如葡萄糖、N-乙醯胺基葡萄胺糖、N-乙醯神經胺酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或修飾的糖(例如2'-氟核糖、2'-去氧核糖、磷酸甘露糖、6'磺基N-乙醯胺基葡萄胺糖等)。術語「聚糖」包括糖殘基的均聚物和雜聚物。術語「聚糖」還涵蓋糖軛合物(例如,糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等的)的聚糖成分。該術語還涵蓋游離聚糖,包括已經從糖軛合物切割或以其他方式釋放的聚糖。
如本文所用,術語「糖蛋白」係指含有與一個或多個糖部分(即,聚糖)共價連接的肽主鏈的蛋白。一個或多個糖部分可以呈單糖、二糖、寡糖和/或多糖的形式。一個或多個糖部分可包含糖殘基的單個非支鏈或可包含一個或多個支鏈。糖蛋白可以含有O連接的糖部分和/或N連接的糖部分。多糖經由絲胺酸或蘇胺酸的OH基團(O糖基化多肽)或經由天冬醯胺的醯胺基團(NH2)(N糖基化的多肽)的任一附接。該糖蛋白可以與宿主細胞同源,或者較佳的是與表現它的宿主細胞異源,即外源的,例如由CHO細胞產生的人類蛋白。
如本文所用,術語「糖軛合物」涵蓋其中至少一個糖部分與至少一個其他部分共價連接的所有分子。該術語特別涵蓋具有共價連接的糖部分的所有生物分子,包括例如N連接的糖蛋白、O連接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等。
如本文所用,術語「糖基化模式」係指存在於特定樣本上的一組聚糖結構。例如,特定的糖軛合物(例如,糖蛋白)或糖軛合物的組(例如,糖蛋白的組)將具有糖基化模式。在一些實施方式中,參考細胞表面聚糖的糖基化模式。糖基化模式可以表徵為,例如,聚糖的身份、單個聚糖或特定類型的聚糖的量(絕對或相對)、糖基化位點的佔據度等,或該等參數的組合。
下面進一步詳細描述了本發明之各個方面。另外的定義在整個申請書中陳述。
糖基化
術語「糖基化」係指多糖與多肽的附接。較佳的是,多糖由藉由糖苷鍵連接在一起的2-12個單糖組成。糖蛋白可以含有O連接的糖部分和/或N連接的糖部分。附接到特定糖基化位點的糖部分的結構和數目可為可變的。這樣的糖部分可為例如N-乙醯基葡萄胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、木糖、葡糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。
術語「N連接的糖基化」係指多糖與胺基酸鏈的天冬醯胺殘基的附接。
術語「O連接的糖基化」係指碳水化合物部分與胺基酸鏈的絲胺酸或蘇胺酸殘基的附接。
術語「糖譜」或「糖基化譜」在本申請中互換地使用,描述了糖基化多肽的聚糖性質。該等特性較佳的是糖基化位點,或糖基化位點的佔有率,或多肽的聚糖和/或非糖部分的身份、結構、組成或數量,或特定糖型的身份和數量。
N-乙醯神經胺酸(NANA)係N-和O-連接的聚糖的主要成分。NANA係人類蛋白質糖基化事件中神經胺酸之主要形式,而其他哺乳動物也可能包括其他衍生物,例如N-羥乙醯神經胺酸(NGNA)。NANA可以幾種方式連接到N-和O-聚糖的核心結構。儘管存在其他連接,例如α(2,8),但主要地是與後續糖的α(2,3)和α(2,6)鍵。人類細胞,例如人類胚胎腎(HEK)細胞,主要產生α(2,6)連接的唾液酸化,而許多生產細胞系(如CHO細胞系),產生α(2,3)連接的唾液酸化。
在CHO細胞中,已報導負責產生核心聚糖結構(β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶1)的α(2-6)連接的NANA延伸的酶係無活性的或未在CHO細胞中表現的(參見例如Chung等人(2017)Biotechnol.J[生物技術雜誌].12:1600502)-儘管該酶本身的基因存在於灰倉鼠(C.griseus)中。本發明基於出人意料的發現,即與人類細胞系產生的IL-15/IL-15Rα複合物相比,CHO細胞產生的IL-15/IL-15Rα複合物具有不同的糖基化模式。此外,在CHO細胞產生的IL-15/IL-15Rα複合物中觀察到α(2-6)鍵型聚糖。這種糖基化模式係獨特的。與預期的CHO模式相比,它更接近人類糖基化形式,潛在地提供了直接的好處。
在一些實施方式中,本揭露內容之IL-15/IL-15Rα異二聚體具有一種或多種如下表1所示的聚糖種類。
IL-15
如本文所用,術語「IL-15」和「介白素-15」係指天然IL-15或IL-15衍生物。如本文所用,術語「天然IL-15」和「天然介白素-15」在蛋白質或多肽的上下文中係指任何天然存在或野生型哺乳動物介白素-15胺基酸序列,包括未成熟形式或前體形式和成熟形式。各種天然哺乳動物介白素-15之胺基酸序列的GeneBank登錄號之非限制性實例包括NP_000576(人,未成熟形式)、CAA62616(人,未成熟形式)、NP_001009207(家貓(Felis catus),未成熟形式)、AAB94536(褐家鼠(Rattus norvegicus),未成熟形式)、AAB41697(褐家鼠,未成熟形式)、NP_032383(小家鼠(Mus musculus),未成熟形式)、AAR19080(犬)、AAB60398(獼猴(Macaca mulatta),未成熟形式)、AAI00964(人,未成熟形式)、AAH23698(小家鼠,未成熟形式)和AAH18149(人)。天然人IL-15的未成熟/前體形式的胺基酸序列包含長訊息肽(底線)和成熟人天然IL-15(斜體),如表1中的SEQ ID NO:2所提供。在一些實施方式中,天然IL-15係天然存在或野生型哺乳動物IL-15的未成熟形式或前體形式。在其他實施方式中,天然IL-15係天然存在或野生型哺乳動物IL-15的成熟形式。在具體實施方式中,天然IL-15係天然存在或野生型人IL-15的前體形式。在另一個實施方式中,天然IL-15係天然存在或野生型人IL-15的成熟形式。在一個實施方式中,天然IL-15蛋白/多肽係分離的或純化的。
如本文所用,術語「天然IL-15」和「天然介白素-15」在核酸的上下文中係指編碼哺乳動物介白素-15的任何天然存在核酸序列或野生型核酸序列,包括未成熟形式或前體形式和成熟形式。用於各種天然哺乳動物IL-15之核苷酸序列的GeneBank登錄號之非限制性實例包括NM_000585(人)、NM_008357(小家鼠)和RNU69272(褐家鼠)。編碼天然人IL-15的未成熟/前體形式的核苷酸序列包含編碼長訊息肽的核苷酸序列(底線)和編碼成熟人天然IL-15的核
苷酸序列(斜體),如表2中的SEQ ID NO:2所提供。在具體實施方式中,核酸係分離的或純化的核酸。在一些實施方式中,核酸編碼天然存在或野生型哺乳動物IL-15的未成熟形式或前體形式。在其他實施方式中,核酸編碼天然存在或野生型哺乳動物IL-15的成熟形式。在具體實施方式中,編碼天然IL-15的核酸編碼天然存在或野生型人IL-15的前體形式。在另一個實施方式中,編碼天然IL-15的核酸編碼天然存在或野生型人IL-15的成熟形式。
如本文所用,術語「IL-15衍生物」和「介白素-15衍生物」在蛋白質或多肽的上下文中係指:(a)與天然哺乳動物IL-15多肽具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽;(b)由與編碼天然哺乳動物IL-15多肽的核酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性之核酸序列編碼的多肽;(c)相對於天然哺乳動物IL-15多肽,含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個胺基酸突變(即,添加、缺失和/或取代)的多肽;(d)由如下核酸編碼的多肽:該等核酸可以在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼天然哺乳動物IL-15多肽的核酸雜交;(e)由這樣的核酸序列編碼的多肽:該核酸序列可以在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼至少20個連續胺基酸、至少30個連續胺基酸、至少40個連續胺基酸、至少50個連續胺基酸、至少100個連續胺基酸、或至少150個連續胺基酸的天然哺乳動物IL-15多肽的片段的核酸序列雜交;和/或(f)天然哺乳動物IL-15多肽的片段。IL-15衍生物還包括包含哺乳動物IL-15多肽的天然存在或野生型成熟形式的胺基酸序列和異源性訊息肽胺基酸序列的多肽。在具體實施方式中,IL-15衍生物係天然人IL-15多肽的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15衍生物係天然存在或野生型人IL-15多肽的未成熟形式或前體形式的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15衍生物係天然存在或野生型人IL-15多
肽的成熟形式的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15衍生物係例如Zhu等人,(2009),J.Immunol.[免疫學雜誌]183:3598或美國專利案號8,163,879中所述之IL-15N72D。在另一個實施方式中,IL-15衍生物係美國專利案號8,163,879中所述之IL-15變體中的一者。在一個實施方式中,IL-15衍生物係分離的或純化的。
在較佳的實施方式中,IL-15衍生物保留了天然哺乳動物IL-15多肽結合IL-15Rα多肽的功能的至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%,如藉由本領域熟知的測定法(例如,ELISA、BIAcoreTM、免疫共沈澱)所測量的。在另一個較佳的實施方式中,IL-15衍生物保留了天然哺乳動物IL-15多肽誘導IL-15介導的訊息轉導的功能的至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%,如藉由本領域熟知的測定法(例如,電泳遷移率變動測定法、ELISA和其他免疫測定法)所測量的。在具體實施方式中,IL-15衍生物結合至IL-15Rα和/或IL-15Rβγ,如藉由例如本領域熟知的配體/受體結合測定法所評估的。可以使用熟悉該項技術者已知的和上文所述之任何方法來確定同一性百分比。
如本文所用,術語「IL-15衍生物」和「介白素-15衍生物」在核酸的上下文中係指:(a)與編碼哺乳動物IL-15多肽的天然存在或野生型核酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的核酸序列;(b)編碼與天然哺乳動物IL-15多肽的胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽的核酸序列;(c)相對於編碼哺乳動物IL-15多肽的天然存在或野生型核酸序列,含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個核酸鹼基突變(即,添加、缺失和/或取代)的核酸序列;(d)在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼哺乳動物IL-15多肽的天然存在或野生型核酸序列雜交的核酸序列;(e)在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼哺乳動物IL-15多肽的天然存在或
野生型核酸序列的片段雜交的核酸序列;和/或(f)對編碼哺乳動物IL-15多肽的天然存在或野生型核酸序列的片段進行編碼的核酸序列。在具體實施方式中,IL-15衍生物在核酸的上下文中係編碼人IL-15多肽之天然存在或野生型核酸序列的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15衍生物在核酸的上下文中係編碼人IL-15多肽之未成熟形式或前體形式的天然存在或野生型核酸序列的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15衍生物在核酸的上下文中係編碼人IL-15多肽的成熟形式的天然存在或野生型核酸序列的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15衍生物在核酸的上下文中係編碼例如Zhu等人(2009;同上)或美國專利案號8,163,879中所述之IL-15N72D的核酸序列。在另一個實施方式中,IL-15衍生物在核酸的上下文中係編碼美國專利案號8,163,879中所述之IL-15變體中的一者的核酸序列。
IL-15衍生物核酸序列包括編碼天然哺乳動物IL-15多肽(包括IL-15多肽的成熟形式和未成熟形式)的密碼子優化的核酸序列。在其他實施方式中,IL-15衍生物核酸包括編碼哺乳動物IL-15 RNA轉錄物的核酸,該哺乳動物IL-15 RNA轉錄物含有這樣的突變:該突變消除了潛在的剪接位點和不穩定性元件(例如,富含A/T或A/U的元件)而不影響增加哺乳動物IL-15 RNA轉錄物的穩定性的胺基酸序列。在一個實施方式中,IL-15衍生物核酸序列包括WO 2007/084342中所述之密碼子優化的核酸序列。在某些實施方式中,IL-15衍生物核酸序列係表2中的SEQ ID NO:4中之密碼子優化的序列(由這種核酸序列編碼的胺基酸序列如表2中的SEQ ID NO:5所提供)。
在較佳的實施方式中,IL-15衍生物核酸序列編碼保留了天然哺乳動物IL-15多肽結合IL-15Rα的功能的至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的蛋白質或多肽,如藉由本領域熟知的測定法(例如,ELISA、BIAcoreTM、免疫共沈澱)所測量。在另一個較佳的實施方式中,IL-15衍生物
核酸序列編碼保留了天然哺乳動物IL-15多肽誘導IL-15介導的訊息轉導的功能的至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的蛋白質或多肽,如藉由本領域熟知的測定法(例如,電泳遷移率變動測定法、ELISA和其他免疫測定法)所測量的。在具體實施方式中,IL-15衍生物核酸序列編碼結合至IL-15Rα和/或IL-15Rβγ的蛋白質或多肽,如藉由例如本領域熟知的配體/受體測定法所評估的。
IL-15Rα
如本文所用,術語「IL-15Rα」和「介白素-15受體α」係指天然IL-15Rα、IL-15Rα衍生物、或天然IL-15Rα和IL-15Rα衍生物。如本文所用,術語「天然IL-15Rα」和「天然介白素-15受體α」在蛋白質或多肽的上下文中係指任何天然存在或野生型哺乳動物介白素-15受體α(「IL-15Rα」)胺基酸序列,包括未成熟形式或前體形式和成熟形式以及天然存在同種型。各種天然哺乳動物IL-15Rα之胺基酸序列的GeneBank登錄號之非限制性實例包括NP_002180(人)、ABK41438(獼猴)、NP_032384(小家鼠)、Q60819(小家鼠)、CAI41082(人)。天然全長人IL-15Rα的未成熟形式之胺基酸序列,其包含訊息肽(底線)和成熟人天然IL-15Rα(斜體),如表2中的SEQ ID NO:6所提供。天然可溶性人IL-15Rα的未成熟形式之胺基酸序列,其包含訊息肽(底線)和成熟人天然可溶性IL-15Rα(斜體),如表2中的SEQ ID NO:7所提供。在一些實施方式中,天然IL-15Rα係天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的未成熟形式。在其他實施方式中,天然IL-15Rα係天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的成熟形式。在某些實施方式中,天然IL-15Rα係哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型可溶性形式。在其他實施方式中,天然IL-15Rα係天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的全長形式。在具體實施方式中,天然IL-15Rα係天然存在或野生型人IL-15Rα多肽的未成熟形式。在另一個實施方式中,天然IL-15Rα係天然存在或野生型人IL-15Rα多肽的成熟形式。在某些實施方式中,天然IL-15Rα係人
IL-15Rα多肽的天然存在或野生型可溶性形式。在其他實施方式中,天然IL-15Rα係天然存在或野生型人IL-15Rα多肽的全長形式。在一個實施方式中,天然IL-15Rα蛋白或多肽係分離的或純化的。
如本文所用,術語「天然IL-15Rα」和「天然介白素-15受體α」在核酸的上下文中係指編碼哺乳動物介白素-15受體α的任何天然存在核酸序列或野生型核酸序列,包括未成熟形式或前體形式和成熟形式。各種天然哺乳動物IL-15Rα之核苷酸序列的GeneBank登錄號之非限制性實例包括NM_002189(人)、EF033114(獼猴)和NM_008358(小家鼠)。編碼天然人IL-15Rα的未成熟形式之核苷酸序列,其包含編碼訊息肽的核苷酸序列(底線)和編碼成熟人天然IL-15Rα的核苷酸序列(斜體),如表2中的SEQ ID NO:8所提供。編碼天然可溶性人IL-15Rα蛋白或多肽的未成熟形式之核苷酸序列,其包含編碼訊息肽的核苷酸序列(底線)和編碼成熟人可溶性天然IL-15Rα的核苷酸序列(斜體),如表2中的SEQ ID NO:9所提供)。在具體實施方式中,核酸係分離的或純化的核酸。在一些實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的未成熟形式。在其他實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的成熟形式。在某些實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的可溶性形式。在其他實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型哺乳動物IL-15Rα多肽的全長形式。在具體實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型人IL-15多肽的前體形式。在另一個實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型人IL-15多肽的成熟形式。在某些實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型人IL-15Rα多肽的可溶性形式。在其他實施方式中,天然存在的核酸編碼天然存在或野生型人IL-15Rα多肽的全長形式。
如本文所用,術語「IL-15Rα衍生物」和「介白素-15受體α衍生物」在蛋白質或多肽的上下文中係指:(a)與天然哺乳動物IL-15多肽具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽;(b)由與編碼天然哺乳動物IL-15Rα多肽的核酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性之核酸序列編碼的多肽;(c)相對於天然哺乳動物IL-15Rα多肽,含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個胺基酸突變(即,添加、缺失和/或取代)的多肽;(d)由如下核酸序列編碼的多肽:該核酸序列可以在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼天然哺乳動物IL-15Rα多肽的核酸序列雜交;(e)由這樣的核酸序列編碼的多肽:該核酸序列可以在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼至少20個連續胺基酸、至少30個連續胺基酸、至少40個連續胺基酸、至少50個連續胺基酸、至少100個連續胺基酸、或至少150個連續胺基酸的天然哺乳動物IL-15多肽的片段的核酸序列雜交;(f)天然哺乳動物IL-15Rα多肽的片段;和/或(g)本文所述之特定的IL-15Rα衍生物。IL-15Rα衍生物還包括包含哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型成熟形式的胺基酸序列和異源性訊息肽胺基酸序列的多肽。在具體實施方式中,IL-15Rα衍生物係天然人IL-15Rα多肽的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15Rα衍生物係天然存在或野生型人IL-15多肽的未成熟形式之衍生物。在另一個實施方式中,IL-15Rα衍生物係天然存在或野生型人IL-15多肽的成熟形式的衍生物。在一個實施方式中,IL-15Rα衍生物係天然哺乳動物IL-15Rα多肽的可溶性形式。換句話說,在某些實施方式中,IL-15Rα衍生物包括天然哺乳動物IL-15Rα的可溶性形式,其中那些可溶性形式不是天然存在的。IL-15Rα衍生物的其他實例包括本文所述之天然人IL-15Rα的截短的可溶性形式。在具體實施方式中,IL-15Rα衍生物係純化的或分離的。
在較佳的實施方式中,IL-15Rα衍生物保留了天然哺乳動物IL-15Rα多肽結合IL-15多肽的功能的至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%,如藉由本領域熟知的測定法(例如,ELISA、BIAcoreTM、免疫共沈澱)所測量。在另一個較佳的實施方式中,IL-15Rα衍生物保留了天然哺乳動物IL-15Rα多肽誘導IL-15介導的訊息轉導的功能的至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%,如藉由本領域熟知的測定法(例如,電泳遷移率變動測定法、ELISA和其他免疫測定法)所測量的。在具體實施方式中,IL-1SRα衍生物結合至IL-15,如藉由本領域熟知的方法(例如ELISA)所評估。
如本文所用,術語「IL-15Rα衍生物」和「介白素-15受體α衍生物」在核酸的上下文中係指:(a)與編碼哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型核酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的核酸序列;(b)編碼與天然哺乳動物IL-15Rα多肽的胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽的核酸序列;(c)相對於編碼哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型核酸序列,含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個核酸突變(即,添加、缺失和/或取代)的核酸序列;(d)在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型核酸序列雜交的核酸序列;(e)在高嚴格雜交條件、中等嚴格雜交條件或典型嚴格雜交條件下與編碼哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型核酸序列的片段雜交的核酸序列;(f)對編碼哺乳動物IL-15Rα多肽的天然存在或野生型核酸序列的片段進行編碼的核酸序列;和/或(g)編碼本文所述之特定IL-15Rα衍生物的核酸序列。在具體實施方式中,IL-15Rα衍生物在核酸的上下文中係編碼人IL-15Rα多肽的天然存在或野生型核酸序列的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15Rα衍生物在核酸的上下文中係編碼人IL-15Rα
多肽的未成熟形式之天然存在或野生型核酸序列的衍生物。在另一個實施方式中,IL-15Rα衍生物在核酸的上下文中係編碼人IL-15Rα多肽的成熟形式的天然存在或野生型核酸序列的衍生物。在一個實施方式中,IL-15Rα衍生物在核酸的上下文中係指編碼可溶的哺乳動物IL-15Rα多肽的衍生物的核酸序列。在某些實施方式中,IL-15Rα衍生物在核酸的上下文中係指編碼天然哺乳動物IL-15Rα的可溶性形式的核酸序列,其中該可溶性形式不是天然存在的。在一些實施方式中,IL-15Rα衍生物在核酸的上下文中係指編碼人IL-15Rα的衍生物的核酸序列,其中該人IL-15Rα的衍生物係非天然存在的IL-15Rα的可溶性形式。在具體實施方式中,IL-15Rα衍生物核酸序列係分離的或純化的。
IL-15Rα衍生物核酸序列包括編碼天然IL-15Rα多肽(包括IL-15Rα多肽的成熟形式和未成熟形式)的密碼子優化的核酸序列。在其他實施方式中,IL-15Rα衍生物核酸包括編碼IL-15Rα RNA轉錄物的核酸,該IL-15Rα RNA轉錄物含有這樣的突變:該突變消除了潛在的剪接位點和不穩定性元件(例如,富含A/T或A/U的元件)而不影響增加IL-15Rα RNA轉錄物的穩定性的胺基酸序列。在某些實施方式中,IL-15Rα衍生物核酸序列係表2中的SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13中的密碼子優化的序列(由這種核酸序列編碼的胺基酸序列分別如表2中的SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14所提供)。
在具體實施方式中,IL-15Rα衍生物核酸序列編碼保留了天然哺乳動物IL-15Rα多肽結合IL-15的功能的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的蛋白質或多肽,如藉由本領域熟知的測定法(例如,ELISA、BIAcoreTM、免疫共沈澱)所測量。在另一個較佳的實施方式中,IL-15Rα衍生物核酸序列編碼保留了天然哺乳動物IL-15Rα誘導IL-15介導的訊息轉導的功能的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%(如藉由本領域熟知的測定法(例如,電泳遷移率變動
測定、ELISA和其他免疫測定法)所測量)的蛋白質或多肽。在具體實施方式中,IL-15Rα衍生物核酸序列編碼結合至IL-15的蛋白質或多肽,如藉由本領域熟知的方法(例如ELISA)所評估的。
本文描述的是人IL-15Rα的天然存在或野生型可溶性形式。本文還描述了作為人IL-15Rα的截短的可溶性形式的特定IL-15Rα衍生物。該等特定IL-15Rα衍生物和人IL-15Rα的天然存在或野生型可溶性形式部分基於人IL-15Rα的蛋白水解切割位點的鑒定。本文還描述了IL-15Rα的可溶性形式,該等可溶性形式基於IL-15Rα的糖基化來表徵。
人IL-15Rα的蛋白水解切割發生在殘基(即,Gly170和His171)之間,該等殘基以粗體顯示並在所提供的天然全長人IL-15Rα的未成熟形式之胺基酸序列中以底線表示:MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA KNWELTASAS HQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVEMEAMEALPVT WGTSSRDEDL ENCSHHL(表2中的SEQ ID NO:6)。
因此,在一個方面,本文提供了人IL-15Rα的可溶性形式(例如,人IL-15Rα的純化的可溶性形式),其中人IL-15Rα的可溶性形式的胺基酸序列終止於天然膜結合的人IL-15Rα的蛋白水解切割位點。具體而言,本文提供了人IL-15Rα的可溶性形式(例如,人IL-15Rα的純化的可溶性形式),其中人IL-15Rα的可溶性形式的胺基酸序列以PQG(表2中的SEQ ID NO:20)終止,其中G為Gly170。在一個特定實施方式中,本文提供了人IL-15Rα的可溶性形式(例如,人IL-15Rα的純化的可溶性形式),該可溶性形式具有表2中的SEQ ID NO:7所示
的胺基酸序列。在一些實施方式中,本文提供了IL-15Rα衍生物(例如,IL-15Rα衍生物的純化形式和/或可溶性形式),該IL-15Rα衍生物係一種多肽,該多肽:(i)與表2中的SEQ ID NO:7具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性;並且(ii)以胺基酸序列PQG(表2中的SEQ ID NO:20)終止。在其他特定實施方式中,本文提供了人IL-15Rα的可溶性形式(例如,人IL-15Rα的純化的可溶性形式),該可溶性形式具有表2中的SEQ ID NO:10的胺基酸序列。在一些實施方式中,本文提供了IL-15Rα衍生物(例如,IL-15Rα衍生物的純化形式和/或可溶性形式),它是與表2中的SEQ ID NO:10具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽,並且視需要,其中IL-15Rα衍生物的可溶性形式的胺基酸序列以PQG(表2中的SEQ ID NO:20)終止。
在一些實施方式中,本文提供了天然存在或野生型人IL-15Rα的IL-15Rα衍生物,其中IL-15Rα衍生物係可溶性的,並且:(a)IL-15Rα衍生物的C末端的最後幾個胺基酸由胺基酸殘基PQGHSDTT(表2中的SEQ ID NO:15)組成;(b)IL-15Rα衍生物的C末端的最後幾個胺基酸由胺基酸殘基PQGHSDT(表2中的SEQ ID NO:16)組成;(c)IL-15Rα衍生物的C末端的最後幾個胺基酸由胺基酸殘基PQGHSD(表2中的SEQ ID NO:17)組成;(d)IL-15Rα衍生物的C末端的最後幾個胺基酸由胺基酸殘基PQGHS(表2中的SEQ ID NO:18)組成;或(e)IL-15Rα衍生物的C末端的最後幾個胺基酸由胺基酸殘基PQGH(表2中的SEQ ID NO:19)組成。在某些實施方式中,該等IL-15Rα衍生物的胺基酸序列與表2中的SEQ ID NO:21的胺基酸序列具有至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。在一些實施方式中,該等IL-15Rα衍生物係純化的。
在另一個方面,本文提供了IL-15Rα的糖基化形式(例如,IL-15Rα的純化糖基化形式),其中IL-15Rα的糖基化占IL-15Rα的品質(分子量)的至
少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、或20%至25%、20%至30%、25%至30%、25%至35%、30%至35%、30%至40%、35%至40%、35%至45%、40%至50%、45%至50%、20%至40%、或25%至50%,如藉由熟悉該項技術者已知的技術所評估的。IL-15Rα的糖基化所占的IL-15Rα(例如,純化的IL-15Rα)的品質(分子量)的百分比可以使用例如但不限於以下步驟來確定:凝膠電泳和凝膠的定量光密度測定,並且比較IL-15Rα的糖基化形式(例如,IL-15Rα的純化糖基化形式)與IL-15Rα的非糖基化形式(例如,IL-15Rα的純化非糖基化形式)的平均品質(分子量)。在一個實施方式中,IL-15Rα(例如,純化的IL-15Rα)的平均品質(分子量)可以使用在配備有CovalX HM-1高品質檢測器的Voyager De-Pro上使用芥子酸作為基質進行的MALDI-TOF MS譜來確定,並且可以將IL-15Rα的糖基化形式的品質(例如,IL-15Rα的純化糖基化形式)與IL-15Rα的非糖基化形式的品質(例如,IL-15Rα的純化非糖基化形式)進行比較,以確定糖基化所占的品質的百分比。
在另一個方面,本文提供了IL-15Rα的糖基化形式,其中IL-15Rα在某些胺基酸殘基處係糖基化(N-糖基化或O-糖基化)的。在某些實施方式中,本文提供了在以下糖基化位點中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或全部處糖基化的人IL-15Rα:(i)IL-15Rα中的胺基酸序列NWELTASASHQPPGVYPQG(表2中的SEQ ID NO:22)的第5位蘇胺酸的O-糖基化;(ii)IL-15Rα中的胺基酸序列NWELTASASHQPPGVYPQG(表2中的SEQ ID NO:22)的第7位絲胺酸的O-糖基化;(iii)IL-15Rα中的胺基酸序列ITCPPPMSVEHADIWVK(表2中的SEQ ID NO:22)的第8位絲胺酸的N-糖基化,或IL-15Rα中的胺基酸序列ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(表2中的SEQ ID NO:23)的第8位絲胺酸的N-糖基化;(iv)IL-15Rα中的胺基酸序列ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(表2中的SEQ ID NO:24)的Ser 18
的N-糖基化;(v)IL-15Rα中的胺基酸序列ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(表2中的SEQ ID NO:24)的第20位絲胺酸的N-糖基化;(vi)IL-15Rα中的胺基酸序列ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(表2中的SEQ ID NO:24)的第23位絲胺酸的N-糖基化;和/或(vii)IL-15Rα中的胺基酸序列ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNS(表2中的SEQ ID NO:24)的第31位絲胺酸的N-糖基化。在具體實施方式中,糖基化的IL-15Rα係天然人IL-15Rα。在其他具體實施方式中,糖基化的IL-15Rα係天然存在或野生型人IL-15Rα的IL-15Rα衍生物。在一些實施方式中,糖基化的IL-15Rα係天然可溶性人IL-15Rα,諸如表2中的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10。在其他實施方式中,糖基化的IL-15Rα係作為人IL-15Rα的可溶性形式的IL-15Rα衍生物。在某些實施方式中,糖基化的IL-15Rα係純化的或分離的。
IL-15/IL-15Rα複合物
如本文所用,術語「IL-15/IL-15Rα複合物」係指包含彼此共價或非共價結合的IL-15和IL-15Rα的複合物。在較佳的實施方式中,IL-15Rα對IL-15具有相對高的親和力,例如如藉由本領域已知的技術(例如,KinEx A測定法、電漿表面共振法(例如,BIAcoreTM測定法))測量的KD為10至50pM。在另一個較佳的實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物誘導IL-15介導的訊息轉導,如藉由本領域熟知的測定法(例如,電泳遷移率變動測定法、ELISA和其他免疫測定法)所測量的。在一些實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物保留了特異性結合βγ鏈的能力。在具體實施方式中,IL-15/IL-I5Rα複合物從細胞中分離。
本文提供了結合至IL-15受體的βγ亞基,誘導IL-15訊息轉導(例如,Jak/Stat訊息轉導)和增強IL-15介導的免疫功能的複合物,其中該等複合物
包含共價或非共價結合至介白素-15受體α(「IL-15Rα」)的IL-15(「IL-15/IL-15Rα複合物」)。IL-15/IL-15Rα複合物能夠結合至βγ受體複合物。
IL-15/IL-15Rα複合物可以由天然IL-15或IL-15衍生物和天然IL-15Rα或IL-15Rα衍生物組成。在某些實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物包含天然IL-15或IL-15衍生物和上文所述之IL-15Rα。在具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物包含天然IL-15或IL-15衍生物和具有表2中的SEQ ID NO:10之胺基酸序列的IL-15Rα。在另一個實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物包含天然IL-15或IL-15衍生物和上文所述之IL-15Rα的糖基化形式。
在具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物包含天然IL-15或IL-15Rα衍生物和天然可溶性IL-15Rα(例如,天然可溶性人IL-15Rα)。在另一個具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物由IL-15衍生物和IL-15Rα衍生物組成。在另一個實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物由天然IL-15和IL-15Rα衍生物組成。在一個實施方式中,IL-15Rα衍生物係IL-15Rα的可溶性形式。上文描述了IL-15Rα的可溶性形式的具體實例。在具體實施方式中,IL-15Rα的可溶性形式缺乏天然IL-15Rα的跨膜結構域,以及視需要天然IL-15Rα的胞內結構域。在另一個實施方式中,IL-15Rα衍生物係天然IL-15Rα的胞外結構域或其片段。在某些實施方式中,IL-15Rα衍生物係天然IL-15Rα之胞外結構域(含有壽司結構域或外顯子2)的片段。在一些實施方式中,IL-15Rα衍生物包含天然IL-15Rα的胞外結構域(含有壽司結構域或外顯子2)的片段,以及由外顯子3編碼的至少一個胺基酸。在某些實施方式中,IL-15Rα衍生物包含天然IL-15Rα的胞外結構域(含有壽司結構域或外顯子2)的片段,以及IL-15Rα鉸鏈區或其片段。在某些實施方式中,IL-15Rα包含表2中的SEQ ID NO:10的胺基酸序列。
在另一個實施方式中,IL-15Rα衍生物包含胞外結構域切割位點中的突變,該突變抑制切割天然IL-15Rα的內源性蛋白酶所進行的切割。在具體實施方式中,IL-15Rα的胞外結構域切割位點被異源性的已知蛋白酶識別和切割的切割位點替換。該等異源性蛋白酶切割位點之非限制性實例包括由弗林蛋白酶識別和切割的Arg-X-X-Arg(表2中的SEQ ID NO:25);以及由凝血酶蛋白酶識別和切割的AB-Pro-Arg-X-Y(表2中的SEQ ID NO:26)(A和B係疏水性胺基酸,X和Y係非酸性胺基酸)和Gly-Arg-Gly。
在另一個實施方式中,IL-15由經優化以增強IL-15的表現的核酸序列編碼,該優化例如使用WO 2007/084342和WO 2010/020047;和美國專利案號5,965,726;6,174,666;6,291,664;6,414,132;和6,794,498中描述的方法產生可與靶抗原結合的Avimer。
在某些實施方式中,本文提供了包含人IL-15Rα的IL-15/IL-15Rα複合物,該人IL-15Rα在上文以及參考表2中的SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所述之糖基化位點中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或全部處被糖基化。在具體實施方式中,糖基化的IL-15Rα係天然人IL-15Rα。在其他具體實施方式中,糖基化的IL-15Rα係天然存在或野生型人IL-15Rα的IL-15Rα衍生物。在一些實施方式中,糖基化的IL-15Rα係天然可溶性人IL-15Rα,諸如表2中的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10。在其他實施方式中,糖基化的IL-15Rα係作為人IL-15Rα的可溶性形式的IL-15Rα衍生物。在某些實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物係純化的或分離的。
除IL-15和IL-15Rα之外,IL-15/IL-15Rα複合物可以包含異源性分子。在一些實施方式中,異源性分子增加了蛋白質穩定性。此類分子之非限制性實例包括聚乙二醇(PEG)、IgG免疫球蛋白的Fc結構域或其片段、或增加IL-15或IL-15Rα的體內半衰期的白蛋白。在某些實施方式中,IL-15Rα軛合/融合至免
疫球蛋白(例如,IgG1)的Fc結構域或其片段。在具體實施方式中,IL-15RαFc融合蛋白包含表2中的SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的胺基酸序列。在另一個實施方式中,IL-15RαFc融合蛋白係Han等人,(2011),Cytokine[細胞介素]56:804-810,美國專利案號8,507,222或美國專利案號8,124,084中所述之IL-15Rα/Fc融合蛋白。在包含異源性分子的那些IL-15/IL-15Rα複合物中,異源性分子可以軛合至IL-15和/或IL-15Rα。在一個實施方式中,異源性分子軛合至IL-15Rα。在另一個實施方式中,異源性分子軛合至IL-15。
IL-15/IL-15Rα複合物的組分可以使用非共價鍵或共價鍵來直接融合(例如,藉由肽鍵來組合胺基酸序列),和/或可以使用一個或多個連接基來組合。適用於製備IL-15/IL-15Rα複合物的連接基包括肽、烷基基團、化學取代的烷基基團、聚合物、或能夠將兩種或更多種組分結合在一起的任何其他共價鍵合的或非共價鍵合的化學物質。聚合物連接基包括本領域已知的任何聚合物,包括聚乙二醇(PEG)。在一些實施方式中,連接基係長度為1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個胺基酸的肽。在具體實施方式中,連接基足夠長以保持IL-15結合IL-15Rα的能力。在其他實施方式中,連接基足夠長以保持IL-15/IL-15Rα複合物結合βγ受體複合物以及充當介導IL-15訊息轉導的促效劑的能力。
在特別的實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物在本文所述之方法中使用之前(例如,在使細胞接觸IL-15/IL-15Rα複合物之前或在將IL-15/IL-15Rα複合物投與於受試者之前)預先偶合。在其他實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物在用於本文所述之方法之前未預先偶合。
在具體實施方式中,相對於未投與IL-15/IL-15Rα複合物的受試者中的免疫功能,IL-15/IL-15Rα複合物增強或誘導受試者中的免疫功能達至少
99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%,使用本領域熟知的測定法(例如,ELISPOT、ELISA和細胞增殖測定法)所測定的。在具體實施方式中,免疫功能係細胞介素釋放(例如,干擾素-γ、IL-2、IL-5、IL-10、IL-12或轉化生長因子(TGF)-β)。在一個實施方式中,IL-15介導的免疫功能係NK細胞增殖,它可以例如藉由流動式細胞分析術(檢測表現NK細胞的標記物(例如,CD56)的細胞數)來測定。在另一個實施方式中,IL-15介導的免疫功能係抗體產生,它可以例如藉由ELISA來測定。在一些實施方式中,IL-15介導的免疫功能係效應子功能,它可以例如藉由細胞毒性測定法或本領域熟知的其他測定法來測定。
在具體實施方式中,由IL-15/IL-15Rα複合物增強的免疫功能之實例包括淋巴細胞的增殖/擴增(例如,淋巴細胞數量的增加)、淋巴細胞凋亡的抑制、樹突狀細胞(或抗原呈現細胞)的活化和抗原呈遞。在特定實施方式中,由IL-15/IL-15Rα複合物增強的免疫功能係CD4+ T細胞(例如,Th1和Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如,細胞毒性T淋巴細胞、α/β T細胞和γ/δ T細胞)、B細胞(例如,漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、樹突狀細胞(未成熟或成熟)、抗原呈現細胞、巨噬細胞、肥胖細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、腫瘤駐留T細胞、CD122+ T細胞或自然殺手細胞(NK細胞)的數量的增殖/擴增或活化。在一個實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物增加淋巴細胞先驅細胞的增殖/擴增或數量。在一些實施方式中,相對於陰性對照(例如,未用IL-15/IL-15Rα複合物處理、未與IL-15/IL-15Rα複合物一起培養或未與IL-15/IL-15Rα複合物接觸的相應細胞的數量),IL-15/IL-15Rα複合物使CD4+ T細胞(例如,Th1和Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如,細胞毒性T淋巴細胞、α/β T細胞和γ/δ T細胞)、B細胞(例如,漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、樹突狀細胞(未成熟或成熟)、
抗原呈現細胞、巨噬細胞、肥胖細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、腫瘤駐留T細胞、CD122+ T細胞或自然殺手細胞(NK細胞)的數量增加大約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍或更多倍。
在具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物使葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化的全血上的IL-2表現增加。例如,與單獨使用SEB時IL-2的表現相比,IL-15/IL-15Rα複合物使IL-2的表現增加至少約2倍、3倍、4倍或5倍。
生產IL-15/IL-15Rα複合物
可以將編碼IL-15和/或IL-15Rα的核酸插入核酸構建體中,用於在哺乳動物細胞、細菌、酵母和病毒中表現。IL-15和IL-15Rα可以從相同的核酸構建體(例如,使用雙順反子核酸構建體)或從不同的核酸構建體(例如,使用單順反子核酸構建體)重組表現。在一個實施方式中,IL-15和IL-15Rα可以從包含IL-15和IL-15Rα的單個開讀框(ORF)的單個核酸構建體重組表現。
核酸構建體可以包含可操作地連接至IL-15和/或IL-15Rα的編碼序列的一個或多個轉錄調控元件。轉錄調控元件通常係編碼序列的5’,並且指導編碼IL-15和/或IL-15Rα的核酸的轉錄。在一些實施方式中,天然存在的調節天然IL-15和/或天然IL-15Rα基因的轉錄的轉錄調控元件中的一個或多個被用於控制轉錄。在其他實施方式中,與天然IL-15和/或天然IL-15Rα基因異源的一個或多個轉錄調控元件被用於控制轉錄。可以使用熟悉該項技術者已知的任何一個或多個轉錄調控元件。一個或多個轉錄調控元件的類型之非限制性實例包括組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。在具體實施方式中,轉錄至少部分地由一個或多個哺乳動物(在一些實施方式中,人)轉錄調控元件控制。在具體實施方式中,轉錄至少部分地由強啟動子(例如,CMV)控制。在其他方面,可以使用誘導型啟動子。
核酸構建體還可以包含可操作地連接至IL-15和/或IL-15Rα的編碼序列的一個或多個轉錄後調控元件。轉錄後調控元件可為編碼序列的5'和/或3',並且指導編碼IL-15和/或IL-15Rα的RNA轉錄物的翻譯的轉錄後調節。
在另一個方面,核酸構建體可為基因靶向載體,該基因靶向載體將基因現有的調控區替換為從不同基因分離的調節序列或新調節序列,如例如國際公開號WO 1994/12650和WO 2001/68882中所述。在某些實施方式中,可以將宿主細胞工程化為藉由例如改變內源性IL-15和/或IL-15Rα基因的調控區來增加內源性IL-15和/或IL-15Rα的產生。
所選的核酸構建體將取決於多種因素,包括但不限於轉錄調控元件的強度和用於表現IL-15和/或IL-15Rα的宿主細胞。核酸構建體可為質體、噬菌粒、黏接質體、病毒載體、噬菌體、人工染色體等等。在一個方面,載體可為附加型或非同源整合載體,它們可以藉由任何合適的方式(轉化、轉染、軛合、原生質體融合、電穿孔、磷酸鈣沈澱、直接顯微注射等)引入適當的宿主細胞中,從而改變它們。
核酸構建體可為用於在宿主細胞中暫態或穩定表現IL-15和/或IL-15Rα的質體或穩定整合載體。對於穩定表現,載體可以介導靶位點或隨機染色體位點處的染色體整合。可用於表現IL-15和/或IL-15Rα的宿主細胞-載體系統之非限制性實例包括病毒(例如,牛痘病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒等)感染的哺乳動物細胞系統;病毒(例如,桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統;微生物,諸如含有酵母載體的酵母,或噬菌體、DNA、質體DNA或黏接質體DNA轉化的細菌;以及藉由使用選擇標記物轉化來產生的穩定細胞系。在一些實施方式中,核酸構建體包含選擇標記基因,包括但不限於新黴素(neo)、二氫葉酸還原酶(dhfr)和潮黴素(hyg)。
核酸構建體可為單順反子或多順反子。多順反子核酸構建體可以編碼2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個,或在2個至5個、5個至10個或10個至20個範圍內的基因/核苷酸序列。例如,雙順反子核酸構建體可以按以下順序包含啟動子、第一基因(例如,IL-15)和第二基因(例如,IL-15Rα)。在這種核酸構建體中,兩個基因的轉錄由啟動子驅動,而來自第一基因的mRNA的翻譯藉由帽依賴性掃描機制來進行,並且來自第二基因的mRNA的翻譯藉由非帽依賴性機制(例如,藉由IRES)來進行。
除非另外指明,用於實施該等方面的技術將採用分子生物學、微生物學和重組DNA操作和產生的常規技術,該等技術係熟悉該項技術者常規實施的。參見例如Sambrook,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition[分子選殖:實驗室手冊(第二版)];DNA Cloning,Volumes Iand II[DNA選殖(第I卷和第II卷)](Glover編,1985);Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](Gait編,1984);Nucleic Acid Hybridization[核酸雜交](Hames和Higgins編,1984);Transcription and Translation[轉錄和翻譯](Hames和Higgins編,1984);Animal Cell Culture[動物細胞培養](Freshney編,1986);Immobilized Cells and Enzymes[固定化細胞和酶](IRL出版社(IRL Press),1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning[分子選殖實用指南](1984);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳動物細胞的基因轉移載體](Miller和Calos編,1987,Cold Spring Harbor Laboratoryp[冷泉港實驗室出版社]);Methods in Enzymology[酶學方法],第154卷和第155卷(分別由Wu和Grossman以及Wu編),(Mayer和Walker編,1987);Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology[細胞和分子生物學中的免疫化學方法](Academic Press,London[倫敦的學術出版社],Scopes,1987),Expression of Proteins in Mammalian Cells Using Vaccinia Viral Vectors[使
用牛痘病毒載體在哺乳動物細胞中表現蛋白質],載於Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學實驗室指南],第2卷(Ausubel等人編,1991)。
在具體實施方式中,編碼IL-15或IL-15Rα的核酸構建體可以共轉染至或轉染至相同的宿主細胞或不同的宿主細胞中。視需要,還可以將包含編碼選擇標記基因的核酸的核酸構建體轉染至相同的細胞中,以選擇經轉染的細胞。如果將包含編碼IL-15和IL-15Rα的核酸的核酸構建體轉染至不同的細胞中,則可以分離由不同的細胞表現的IL-15和IL-15Rα,並且在適於形成上文所述之IL-15/IL-15Rα複合物的條件下使它們彼此接觸。可以使用熟悉該項技術者已知的任何技術用核酸來轉染或轉導宿主細胞,包括例如轉化、轉染、軛合、原生質體融合、電穿孔、磷酸鈣沈澱、直接顯微注射和病毒(包括但不限於腺病毒、慢病毒和反轉錄病毒)感染。
對於重組IL-15和IL-15Rα多肽的長期、高產量產生,可以產生穩定細胞系。例如,可以使用本文所述之核酸構建體來轉化細胞系,該核酸構建體可以在相同的核酸構建體或不同的核酸構建體上含有選擇標記基因。可以藉由共轉染將選擇標記基因引入相同的細胞中。在引入載體之後,允許細胞在富集培養基中生長1-2天,然後將它們更換至選擇性培養基,以允許生長和回收成功表現所引入的核酸的細胞。可以使用本領域熟知的適合細胞類型的組織培養技術來增殖穩定轉化細胞的抗性選殖。在特別的實施方式中,細胞系已適應在無血清培養基中生長。在一個實施方式中,細胞系已適應在搖瓶中的無血清培養基中生長。在一個實施方式中,細胞系已適應在攪拌瓶或旋轉瓶中生長。在某些實施方式中,細胞系在懸浮液中培養。在特別的實施方式中,細胞系係非貼壁的或已適應作為非貼壁細胞生長。在某些實施方式中,細胞系已適應在低鈣條件下生長。在一些實施方式中,細胞系係培養的或適應在低血清培養基中生長。
在具體實施方式中,藉由在DHFR缺陷型CHO細胞中使用二氫葉酸還原酶(DHFR)擴增,使用連續增加水平的胺甲蝶呤來進行本發明之重組多肽的高收率產生的特別較佳的方法,如美國專利案號4,889,803中所述。從該等細胞獲得的多肽可為糖基化形式。
在一個實施方式中,將細胞系工程化以表現天然人IL-15和天然可溶性人IL-15Rα的穩定異二聚體,然後可以純化穩定異二聚體,並投與於人。在一個實施方式中,當從重組表現IL-15和IL-15Rα二者的細胞系產生IL-15和IL-15Rα時,IL-15/IL-15Rα異二聚體的穩定性增加。
在具體實施方式中,宿主細胞重組表現IL-15和全長IL-15Rα。在另一個具體實施方式中,宿主細胞重組表現IL-15和IL-15Rα的可溶性形式。在另一個具體實施方式中,宿主細胞重組表現IL-15和IL-15Rα的膜結合形式,該IL-15Rα不從細胞表面切割並且保持與細胞結合。在一些實施方式中,重組表現IL-15和/或IL-15Rα(全長或可溶性形式)的宿主細胞也重組表現另一種多肽(例如,細胞介素或其片段)。
在某些實施方式中,除IL-15Rα多肽之外,這種宿主細胞還重組表現IL-15多肽。編碼IL-15和/或IL-15Rα的核酸可以用於產生大量重組表現IL-15和IL-15Rα以便分離和純化IL-15和IL-15Rα的哺乳動物細胞,較佳的是IL-15和IL-15Rα締合成複合物。在一個實施方式中,大量IL-15/IL-15Rα複合物係指由細胞表現的IL-15/IL-15Rα複合物的量,該量係對照細胞(例如,未經基因工程化為重組表現IL-15、IL-15Rα、或IL-15和IL-15Rα二者的細胞,或包含空載體的細胞)內源性表現的IL-15/IL-15Rα複合物的量的至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍或超過20倍。在一些實施方式中,本文所述之宿主細胞表現大約0.1pg至25pg、0.1pg至20pg、0.1pg至15pg、0.1pg至10pg、0.1pg至5pg、0.1pg至2pg、2pg至10pg或5pg至20pg的IL-15,如藉由熟悉該項
技術者已知的技術(例如,ELISA)所測量。在某些實施方式中,本文所述之宿主細胞表現大約0.1pg/天至0.25pg/天、0.25pg/天至0.5pg/天、0.5pg/天至1pg/天、1pg/天至2pg/天、2pg/天至5pg/天或5pg/天至10pg/天的IL-15,如藉由熟悉該項技術者已知的技術(例如,ELISA)所測量。在具體實施方式中,IL-15Rα係IL-15Rα的可溶性形式。在具體實施方式中,IL-15Rα係在穩定異二聚體中與IL-15結合的IL-15Rα的可溶性形式,該穩定異二聚體增加了生物活性異二聚體IL-15/可溶性IL-15Rα細胞介素的收率並簡化了其產生和純化。
可以使用本領域熟知的重組蛋白質產生和純化的方法來純化重組IL-15和IL-15Rα,例如參見國際公開號WO 2007/070488。簡而言之,多肽可以在細胞內、在周質空間中產生,或直接分泌至培養基中。可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化包含多肽的細胞溶解物或上清液。用於蛋白質純化的其他技術(例如在離子交換柱上的分餾、乙醇沈澱、逆相HPLC、在二氧化矽上的層析、在肝素SEPHAROSETM(凝膠過濾物質;法瑪西亞公司(Pharmacia Inc.),皮斯卡特維,新澤西州)上的層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬胺酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沈澱)也是可用的。
在一些實施方式中,IL-15和IL-15Rα由不同的細胞合成或重組表現,隨後分離並且體外組合以形成IL-15/IL-15Rα複合物,然後投與於受試者。在其他實施方式中,IL-15和IL-15Rα由不同的細胞合成或重組表現,隨後分離並且將IL-15/IL-15Rα複合物原位或體內同時投與於受試者。在另外其他實施方式中,IL-15和IL-15Rα由相同的細胞合成或一起表現,並分離所形成的IL-15/IL-15Rα複合物。
用於核酸表現的所選的宿主細胞將取決於細胞的預期用途。在選擇宿主細胞時,可以考慮諸如細胞係否類似於內源性表現例如IL-15和/或IL-15Rα的細胞那樣糖基化的因素。
可用於表現由本文的核酸構建體編碼的一種或多種蛋白質的宿主細胞之非限制性實例包括哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、原代細胞、永生化細胞、植物細胞和昆蟲細胞。在具體實施方式中,宿主細胞係哺乳動物細胞系。哺乳動物細胞系之實例包括但不限於COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HepG2、MCF7、HEK 293、HEK 293T、RD、PC12、融合瘤、前B細胞、293、293H、K562、SkBr3、BT474、A204、M07Sb、TFβ1、Raji、Jurkat、MOLT-4、CTLL-2、MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y、C127、N0和BE(2)-C細胞。作為用於表現的宿主的其他哺乳動物細胞系係本領域已知的,並且包括許多得自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的永生化細胞系。
CHO細胞
中國倉鼠卵巢(CHO)細胞最常用於產生用於治療用途的糖基化多肽。該等細胞產生確定的糖基化譜,並允許創建遺傳穩定的高生產率細胞系。此外,可以在無血清培養基中以高細胞密度培養CHO細胞,以開發安全且可重複的生物學方法。當使用CHO細胞作為宿主細胞進行重組表現時遇到的一個主要問題是在細胞培養基中表現和分泌的目的多肽的蛋白水解降解,也稱為「剪切」。
在一些實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物由CHO細胞系產生,該CHO細胞系已被改變以損害蛋白裂解酶之功能,例如藉由減少或消除蛋白裂解酶基因的功能表現,顯著降低目的重組多肽(由所述細胞表現和分泌到細胞培養基中)的蛋白水解降解(「剪切」)。因此,與相應的脊椎動物細胞相比(其
中蛋白裂解酶的作用未損害),損害該細胞中蛋白裂解酶的作用減少分泌的重組IL-15/IL-15Rα複合物的剪切。用蛋白裂解酶,鑒定了負責剪切重組表現的和分泌的多肽的關鍵蛋白酶。改變脊椎動物細胞以損害蛋白裂解酶的作用允許藉由減少或消除細胞培養基中重組表現的和分泌的目的多肽的剪切來顯著改善目的多肽的重組產生。由此,IL-15/IL-15Rα複合物的產量增加。
在CHO細胞中,已報導負責產生核心聚糖結構(β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶1)的α(2-6)連接的NANA延伸的酶係無活性的或未在CHO細胞中表現的(參見例如Chung等人2017)-儘管該酶本身的基因存在於灰倉鼠中。又出乎意料地發現,與人類細胞系產生的IL-15/IL-15Rα複合物相比,CHO細胞產生的本揭露內容之IL-15/IL-15Rα複合物具有不同的糖基化模式。此外,在CHO細胞產生的IL-15/IL-15Rα複合物中觀察到α(2-6)鍵型聚糖。這種糖基化模式係獨特的。與預期的CHO模式相比,它更接近人類糖基化形式,潛在地提供了直接的好處。CHO細胞系的細節可以在WO 2015/166427中找到,其通過引用併入本文。
藥物組成物
本文提供了包含IL-15/IL-15Rα複合物之組成物。該組成物包括可用於製造藥物組成物的原料藥組成物(例如,不純的或非無菌的組成物)和藥物組成物(即,適用於投與於受試者或患者的組成物),它們可以用於製備單位劑型。該組成物(例如,藥物組成物)包含有效量的IL-15/IL-15Rα複合物,或IL-15/IL-15Rα複合物和藥學上可接受的載劑的組合。在具體實施方式中,該組成物(例如,藥物組成物)包含有效量的一種或多種IL-15/IL-15Rα複合物和藥學上可接受的載劑。在一些實施方式中,該組成物還包含另外的治療劑,例如抗癌劑、抗病毒劑、抗炎劑、佐劑。下文提供了此類治療劑之非限制性實例。
在具體實施方式中,術語「藥學上可接受的」意指由聯邦政府或州政府的監管機構批准或在美國藥典或其他公認的藥典中列出用於動物,更具體而言用於人類。術語「載劑」係指與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑(例如,弗氏(Freund)佐劑(完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)或更較佳的是MF59C.1佐劑)、賦形劑或媒介物。此類藥物載劑可為無菌液體,諸如水和油(包括石油、動物、植物或合成來源的那些油,諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等)。在一個實施方式中,當靜脈內投與藥物組成物時,水係載劑。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載劑,特別是注射用溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要,組成物還可以含有少量潤濕劑或乳化劑,或者pH緩衝劑。該等組成物可以採用溶液劑、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋製劑等等的形式。
可以使用一種或多種藥學上可接受的載劑或賦形劑以任何常規方式配製藥物組成物。在具體實施方式中,根據本文所述方法投與於受試者的IL-15/IL-15Rα複合物以藥物組成物投與。
一般而言,包含IL-15/IL-15Rα複合物的藥物組成物的組分以單位劑型提供,例如在指示活性劑的量的氣密密封容器(諸如安瓿或小藥囊)中作為乾燥凍乾粉末或無水濃縮物。在藉由輸注投與IL-15/IL-15Rα複合物的情況下,可以用含有無菌藥用級水或鹽水(例如,PBS)的輸注瓶進行配藥。如果藉由注射投與IL-15/IL-15Rα複合物,可以提供一安瓿瓶無菌注射用水或鹽水,以便在投與之前將各成分混合。
在一些實施方式中,可以配製IL-15/IL-15Rα複合物,以用於藉由熟悉該項技術者已知的任何方法投與,包括但不限於腸胃外投與(例如,皮下
投與、靜脈內投與、腫瘤內投與或肌肉內投與)。在一個實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物被配製用於局部或全身腸胃外投與(例如腫瘤內投與)。在具體實施方式中,分別配製IL-15/IL-15Rα複合物,以用於皮下投與或靜脈內投與。在一個實施方式中,在藥學上相容的溶液中配製IL-15/IL-15Rα複合物。
可以配製IL-15/IL-15Rα複合物,以用於藉由注射(例如,藉由推注或連續輸注)腸胃外投與。注射用製劑可以以單位劑型提供,例如,在添加有防腐劑的安瓿或多劑量容器。該組成物可以採取例如溶於油性媒介物或水性媒介物的懸浮液、溶液或乳劑的形式,並且可以含有配製劑(例如助懸劑、穩定劑和/或分散劑)。替代性地,活性成分可為粉末形式,以便在使用前用合適的媒介物(例如,無菌無熱原水)復原。
治療和劑量方案
在一個方面,本文提供了用於增強IL-15介導的免疫功能之方法,該方法包括將IL-15/IL-15Rα複合物以特定劑量方案投與於受試者。由於增強IL-15介導的免疫功能有益於預防、治療和/或控制某些障礙,因此本文提供了用於預防、治療和/或控制此類障礙之方法,該方法包括將IL-15/IL-15Rα複合物投與於有需要的受試者。增強IL-15介導的免疫功能將帶來有益效果的障礙之非限制性實例包括癌症、淋巴細胞減少、免疫不全、感染性疾病和傷口。
在一個實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者中的障礙之方法,其中IL-15介導的免疫功能的增強有益於預防、治療和/或控制此類障礙,該方法包括在治療週期的持續時間內將相同劑量的IL-15/IL-15Rα複合物投與於受試者。在一個實施方式中,劑量在0.1μg/kg和0.5μg/kg的範圍內。在一個實施方式中,劑量在0.25μg/kg和1μg/kg的範圍內。在一個具體實施方式中,劑量在0.5μg/kg和2μg/kg的範圍內。在另一個實施方式中,劑量在1μg/kg和4μg/kg之間。在另一個實施方式中,劑量在2μg/kg和8μg/kg之間。在另一個
實施方式中,劑量為0.1μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、8μg/kg。在一個具體實施方式中,劑量為1μg/kg。在某些實施方式中,將該劑量投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、2次至4次、2次至5次、2次至6次、3次至6次、4次至6次、6次至8次、5次至8次、或5次至10次。在一些實施方式中,經5天至7天、5天至10天、7天至12天、7天至14天、7天至21天、或14天至21天的時間段,將該劑量投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、2次至4次、2次至5次、1次至5次、2次至6次、3次至6次、4次至6次、或6次至8次。在具體實施方式中,經5天至7天、5天至10天、7天至12天、7天至14天、7天至21天、或14天至21天的時間段,將每個劑量投與至少1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。在另一個具體實施方式中,將每個劑量投與至少一次,並且對受試者每週投與劑量一次並持續三週。
在另一個實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者中的障礙之方法,其中IL-15介導的免疫功能的增強有益於預防、治療和/或控制此類障礙,該方法包括在給藥週期中,將IL-15/IL-15Rα複合物以給藥方案投與於受試者至少一次、兩次、四次或六次,然後是非投與時間段。在具體實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物每週投與一次並持續三週,第四週不投與。然後重複給藥週期。
在一個替代性實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者中的障礙之方法,其中IL-15介導的免疫功能的增強有益於預防、治療和/或控制此類障礙,該方法包括(a)將至少一個初始低劑量的IL-15/IL-15Rα複合物投與於受試者;以及(b)在治療週期期間,將更高劑量的IL-15/IL-15Rα複合物連續投與於受試者。在具體實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者的癌症之方法,該方法包括(a)在治療週期期間,將初始劑量的
IL-15/IL-15Rα複合物投與於受試者;以及(b)在治療週期期間,將更高劑量的IL-15/IL-15Rα複合物連續投與於受試者。在一個具體實施方式中,初始劑量在0.1μg/kg和0.5μg/kg的範圍內。在一個具體實施方式中,初始劑量在0.25μg/kg和1μg/kg的範圍內。在另一個實施方式中,初始劑量在0.5μg/kg和2μg/kg的範圍內。在一個具體實施方式中,初始劑量在1μg/kg和4μg/kg之間。在另一個實施方式中,初始劑量在2μg/kg和8μg/kg之間。在另一個實施方式中,初始劑量為約0.25μg/kg。在另一個實施方式中,初始劑量為約0.5μg/kg。在另一個實施方式中,初始劑量為約1μg/kg。在另一個實施方式中,初始劑量為0.1μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、8μg/kg。在某些實施方式中,初始劑量投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、2次至4次、2次至5次、2次至6次、3次至6次、4次至6次、6次至8次、5次至8次、或5次至10次。在一些實施方式中,經5天至7天、5天至10天、7天至12天、7天至14天、7天至21天、或14天至21天的時間段,將初始劑量投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、2次至4次、2次至5次、1次至5次、2次至6次、3次至6次、4次至6次、或6次至8次。在某些實施方式中,每個連續更高的劑量係前一劑量1.2倍、1.25倍、1.3倍、1.35倍、1.4倍、1.45倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍,或是前一劑量高1.2倍至2倍、2倍至3倍、2倍至4倍、1倍至5倍、2倍至6倍、3倍至4倍、3倍至6倍或4倍至6倍,或是前一劑量高2倍。在一些實施方式中,每個連續更高的劑量比前一劑量高25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%或200%。在具體實施方式中,經5天至7天、5天至10天、7天至12天、7天
至14天、7天至21天、或14天至21天的時間段,將每個劑量投與至少1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。在另一個具體實施方式中,將每個劑量投與至少一次,並且受試者每週7天投與劑量三次(例如,週一、週三和週五)持續兩週。
在某些實施方式中,監測受試者的以下不良事件:諸如3級或4級血小板減少、3級或4級粒細胞減少、3級或4級白血球增多(白血球(WBC)>100,000mm3)、3級或4級WBC減少、絕對淋巴細胞計數(ALC)和/或絕對嗜中性球計數(ANC)、淋巴細胞增多和器官功能障礙(例如,肝功能障礙或腎功能障礙)。在某些實施方式中,如果受試者經歷不良事件,諸如3級或4級血小板減少、3級或4級粒細胞減少、3級或白血球增多(白血球>100,000mm3)、3級或4級WBC減少、絕對淋巴細胞計數(ALC)和/或絕對嗜中性球計數(ANC)、淋巴細胞增多和器官功能障礙(例如,肝功能障礙或腎功能障礙),則劑量不增加,並且劑量可以保持不變、停止或減少。根據該等實施方式,投與於受試者的IL-15/IL-15Rα複合物的劑量可以減少或保持不變,直到不良事件減少或消失。
在另一個實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者中的障礙之方法,其中IL-15介導的免疫功能的增強有益於預防、治療和/或控制此類障礙,該方法包括:將IL-15/IL-15Rα複合物以劑量方案投與於人受試者,該劑量方案包括開始的第一週期以及依次週期,第一週期包括在0.25μg/kg和4μg/kg之間的初始劑量,在依次週期中劑量與前一劑量相比增加兩倍至三倍。每個劑量投與至少一次、兩次、四次或六次,然後將劑量升高至下一水平,並且監測在投與一定劑量的IL-15/IL-15Rα複合物之後的一定時間段(例如,在投與一定劑量的IL-15/IL-15Rα複合物之後大約24小時至大約48小時、大約24小時至大約36小時、大約24小時至大約72小時、大約48小時至大約72小時、大約
36小時至大約48小時、或大約48小時至60小時,以及投與另一個劑量的IL-15/IL-15Rα複合物之前)從受試者獲得的樣本(例如,血漿樣本)中的游離的IL-15的濃度,然後將劑量升高至下一水平。
在另一個實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者中的障礙之方法,其中IL-15介導的免疫功能的增強有益於預防、治療和/或控制此類障礙,該方法包括將IL-15/IL-15Rα複合物以如下依次劑量的劑量方案投與於受試者:(i)0.25μg/kg;(ii)0.5μg/kg;(iii)1μg/kg;(iv)2μg/kg;(v)4μg/kg;和(vi)8μg/kg。在某個實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物以如下依次劑量的劑量方案投與於受試者:(i)1μg/kg;(ii)2μg/kg;(iii)4μg/kg;和(iv)8μg/kg。在給藥週期中,將每個劑量投與至少一次、兩次、四次或六次,然後將劑量升高至下一水平,並且其中監測在投與一定劑量的IL-15/IL-15Rα複合物之後的一定時間段內(例如,在投與一個劑量的IL-15/IL-15Rα複合物之後大約24小時至大約48小時、大約24小時至大約36小時、大約24小時至大約72小時、大約48小時至大約72小時、大約36小時至大約48小時、或大約48小時至60小時,和投與另一個劑量的IL-15/IL-15Rα複合物之前)從受試者獲得的樣本(例如,血漿樣本)中的游離的IL-15的濃度,然後將劑量升高至下一水平。
在另一個實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者的癌症之方法,該方法包括將IL-15/IL-15Rα複合物以如下依次劑量的劑量方案投與於受試者:(i)1μg/kg;(ii)2μg/kg;(iii)4μg/kg;和(iv)8μg/kg,其中每個劑量在給藥週期中投與至少一次、兩次、四次或六次,然後將劑量升高至下一水平。在具體實施方式中,該方法包括使用週期性投與方案向受試者投與IL-15/IL-15Rα複合物,其中該週期性投與方案包括:(a)在1週至3週的第一時間段內每1、2或3天將0.1至10μg/kg劑量的IL-15/IL-15Rα複合物皮下投與於受試者;以及(b)在1週至2個月的第二時間段(其中未將IL-15/IL-15Rα複合物投與於
受試者)之後,在1週至3週的第三時間段內每1、2或3天將0.1至10μg/kg劑量的IL-15/IL-15Rα複合物皮下投與於受試者。
在一個特定實施方式中,受試者係人受試者。在某些實施方式中,將治療週期中的劑量投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、1次至5次、2次至4次、2次至5次、1次至6次、2次至6次、1次至6次、3次至6次、4次至6次、6次至8次、5次至8次、或5次至10次。在一些實施方式中,經5天至7天、5天至10天、7天至12天、7天至14天、7天至21天、或14天至21天的時間段,將劑量投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、1次至5次、2次至4次、2次至5次、2次至6次、1次至6次、3次至6次、4次至6次、或6次至8次。在某些實施方式中,將每個劑量每給藥週期投與1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次,或1次至3次、1次至4次、1次至5次、2次至4次、2次至5次、1次至6次、2次至6次、1次至6次、3次至6次、4次至6次、6次至8次、5次至8次、或5次至10次。在具體實施方式中,經5天至7天、5天至10天、7天至12天、7天至14天、7天至21天、或14天至21天的時間段,將每個劑量投與至少1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次,或1次至3次、1次至4次、1次至5次、2次至4次、2次至5次、1次至6次、2次至6次、1次至6次、3次至6次、4次至6次、6次至8次、5次至8次、或5次至10次。
在另一個具體實施方式中,受試者每週7天投與劑量三次(例如,週一、週三和週五)。在某些實施方式中,監測受試者的以下不良事件:諸如3級或4級血小板減少、3級或4級粒細胞減少、3級或4級白血球增多(白血球(WBC)>100,000mm3)、3級或4級WBC減少、絕對淋巴細胞計數(ALC)和/或絕對嗜中性球計數(ANC)、淋巴細胞增多和器官功能障礙(例如,肝功能障礙或腎功能障礙)。在某些實施方式中,如果受試者經歷不良事件,諸如3級或4級
血小板減少、3級或4級粒細胞減少、3級或白血球增多(白血球>100,000mm3)、3級或4級WBC減少、絕對淋巴細胞計數(ALC)和/或絕對嗜中性球計數(ANC)、淋巴細胞增多和器官功能障礙(例如,肝功能障礙或腎功能障礙),則劑量不增加,並且劑量可以保持不變、停止或減少。根據該等實施方式,投與於受試者的IL-15/IL-15Rα複合物的劑量可以減少或保持不變,直到不良事件減少或消失。
在具體實施方式中,根據本文所述之方法,將每個劑量每週投與一次並持續三週。在具體實施方式中,根據本文所述之方法,將每個劑量每週投與一次、三次並持續兩週。在具體實施方式中,根據本文所述之方法,將每個劑量每週投與一次、三次並持續兩週、三週或四週。在具體實施方式中,根據本文所述之方法,將每個劑量每週投與一次、六次並持續兩週、三週或四週。在具體實施方式中,根據本文所述之方法,將每個劑量每隔一天投與一次並持續兩週、三週或四週。在具體實施方式中,根據本文所述之方法,將每個劑量每天投與一次並持續兩週、三週或四週。
在某些實施方式中,根據本文所述之方法,將IL-15/IL-15Rα複合物皮下投與於受試者。在一些實施方式中,根據本文所述之方法,將IL-15/IL-15Rα複合物靜脈內或肌內投與於受試者。在某些實施方式中,根據本文所述之方法,將IL-15/IL-15Rα複合物腫瘤內投與於受試者。在一些實施方式中,根據本文所述之方法,將IL-15/IL-15Rα複合物局部投與於受試者中的部位(例如,感染部位)。
在某些實施方式中,根據本文描述的方法從受試者獲得的樣本係血液樣本。在一個具體實施方式中,樣本係血漿樣本。IL-15的基礎血漿水平在人體中為大約1pg/ml,在猴子(諸如獼猴)中為大約8-10pg/ml,在齧齒動物(諸
如小鼠)中為大約12pg/ml。可以使用熟悉該項技術者已知的技術從受試者獲得樣本。
在具體實施方式中,藉由本文所述之方法增強的免疫功能之實例包括淋巴細胞的增殖/擴增(例如,淋巴細胞數量的增加)、淋巴細胞凋亡的抑制、樹突狀細胞(或抗原呈現細胞)的活化和抗原呈遞。在特定實施方式中,藉由本文所述之方法增強的免疫功能係CD4+ T細胞(例如,Th1和Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如,細胞毒性T淋巴細胞、α/β T細胞和γ/δ T細胞)、B細胞(例如,漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、樹突狀細胞(未成熟或成熟)、抗原呈現細胞、巨噬細胞、肥胖細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、腫瘤駐留T細胞、CD122+ T細胞或自然殺手細胞(NK細胞)的數量的增殖/擴增或活化。在一個實施方式中,本文所述之方法增加淋巴細胞先驅細胞的增殖/擴增或數量。在一些實施方式中,相對於陰性對照,本文所述之方法使CD4+ T細胞(例如,Th1和Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如,細胞毒性T淋巴細胞、α/β T細胞和γ/δ T細胞)、B細胞(例如,漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、樹突狀細胞(未成熟或成熟)、抗原呈現細胞、巨噬細胞、肥胖細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、腫瘤駐留T細胞、CD122+ T細胞或自然殺手細胞(NK細胞)的數量增加大約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍或更多倍。
在具體實施方式中,相對於未投與IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合的受試者中的免疫功能,本文所述之方法將受試者中的免疫功能增強或誘導至少0.2倍、0.5倍、0.75倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍,如使用本領域熟知的測定法(例如,ELISPOT、ELISA和細胞增殖測定法)所測定。在具體實施方式中,相對於未投與IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合的受試者中的免疫功能,本文
所述之方法將受試者中的免疫功能增強或誘導至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%,如使用本領域熟知的測定法(例如ELISPOT、ELISA和細胞增殖測定法)所測定。在具體實施方式中,免疫功能係細胞介素釋放(例如,干擾素-γ、IL-2、IL-5、IL-10、IL-12或轉化生長因子(TGF)-β)。在一個實施方式中,IL-15介導的免疫功能係NK細胞增殖,它可以例如藉由流動式細胞分析術(檢測表現NK細胞的標記物(例如,CD56)的細胞數)來測定。在一個實施方式中,IL-15介導的免疫功能係CD8+ T細胞增殖,它可以例如藉由流式來測定。在另一個實施方式中,IL-15介導的免疫功能係抗體產生,它可以例如藉由ELISA來測定。在一些實施方式中,IL-15介導的免疫功能係效應子功能,它可以例如藉由細胞毒性測定法或本領域熟知的其他測定法來測定。可以使用熟悉該項技術者已知的標準技術來監測/評估一個或多個劑量的IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合對周邊血淋巴細胞計數的作用。哺乳動物中的周邊血淋巴細胞計數可以藉由例如以下步驟來確定:從所述哺乳動物獲得周邊血樣本,使用例如聚蔗糖-泛影葡胺(法瑪西亞公司)(FicollHypaque(Pharmacia))梯度離心將淋巴細胞與周邊血的其他組分(諸如血漿)分離,以及使用台盼藍對淋巴細胞進行計數。哺乳動物中的周邊血T細胞計數可以藉由例如以下步驟來確定:使用例如使用聚蔗糖-泛影葡胺(法瑪西亞公司)(Ficoll-Hypaque(Pharmacia))梯度離心將淋巴細胞與周邊血的其他組分(諸如血漿)分離,用針對軛合至FITC或藻紅蛋白的T細胞抗原(諸如CD3、CD4和CD8)的抗體來標記T細胞,以及藉由FACS來測量T細胞的數量。此外,可以使用熟悉該項技術者已知的標準技術(諸如FACS)來確定對特定T細胞(例如,CD2+、CD4+、CD8+、CD4+RO+、CD8+RO+、CD4+RA+或CD8+RA+)或NK細胞亞群的作用。
可以使用熟悉該項技術者已知的標準技術來評估IL-15和/或PD-1的血漿水平。例如,血漿可以從獲自受試者的血液樣本獲得,並且可以藉由ELISA來測量血漿中的IL-15和/或PD-1水平。
組合療法
本揭露內容還提供了可以與IL-15/IL-15Rα組合使用的其他療法。在一個方面,本文提供了用於預防、治療和/或控制癌症之方法,該方法包括將有效量的IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子或包含IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組成物投與於有需要的受試者。如本文使用的術語「癌症」意欲包括所有類型的癌性生長或致癌性過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官,而不考慮組織病理學類型或侵襲的階段。在具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物以相同的重複劑量或者替代以劑量遞增方案皮下投與。在具體實施方式中,抗PD-1抗體分子以平穩給藥方案作為靜脈內輸注劑投與。
在具體實施方式中,根據本文所述之方法將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於受試者實現了以下一種、兩種或三種或更多種結果:(1)減少腫瘤或贅生物的生長;(2)減少腫瘤的形成;(3)根除、除去或控制原發性、區域性和/或轉移性癌症;(4)減少轉移性擴散;(5)降低死亡率;(6)提高生存率;(7)延長生存期;(8)增加緩解期的患者人數;(9)降低住院率;(10)縮短住院時間;以及(11)維持腫瘤的大小,使其增加不超過10%、或不超過8%、或不超過6%、或不超過4%;較佳的是,腫瘤的大小增加不超過2%。
在具體實施方式中,相對於投與陰性對照的患有癌症的受試者中(在一些實施方式中,在相同的癌症動物模型中)的腫瘤的生長,根據本文所述方法將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於患有癌症的受試者(在一些實施方式中,癌症的動物模型)使腫瘤的生長抑制或減少至少2倍、較佳的是至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、或至少10倍,如
使用本領域熟知的測定法所測量。在另一個實施方式中,相對於投與陰性對照、或作為單一藥劑的IL-15/IL-15Rα複合物或抗PD-1抗體分子的患有癌症的受試者中(在一些實施方式中,在相同的癌症動物模型中)的腫瘤的生長,根據本文所述方法將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於患有癌症的受試者(在一些實施方式中,癌症的動物模型)使腫瘤的生長抑制或減少至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%,如使用本領域熟知的測定法所測量。
癌性疾病之實例包括但不限於實性瘤、血液癌症、軟組織腫瘤和轉移性病灶。實性瘤之實例包括各種器官系統(諸如影響肝、肺、乳腺、淋巴、胃腸(例如,結腸)、泌尿生殖道(例如,腎細胞、尿路上皮細胞)、前列腺和咽的那些器官系統)的惡性腫瘤,例如肉瘤和癌(包括腺癌和鱗狀細胞癌)。腺癌包括諸如大多數大腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌和食管癌的惡性腫瘤。鱗狀細胞癌包括惡性腫瘤,例如在肺、食管、皮膚、頭頸部區域、口腔、肛門和子宮頸中。在一個實施方式中,癌症係黑色素瘤,例如晚期黑色素瘤。還可以使用本發明之方法和組成物治療或預防前述癌症的轉移性病灶。
使用本文揭露的IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合可以抑制癌症生長的示例性癌症包括通常對免疫療法有反應的癌症。用於治療的較佳的癌症之非限制性實例包括黑色素瘤(例如,轉移性惡性黑色素瘤)、腎癌(例如,透明細胞癌)、前列腺癌(例如,激素難治性前列腺腺癌)、乳癌、大腸癌和肺癌(例如,非小細胞肺癌)。另外,可以使用本文所述之組合療法來治療難治性或復發性惡性腫瘤。
可以治療的其他癌症之實例包括骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃食道癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、默克(Merkel)細胞癌、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、兒童實性瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導的癌症(包括石棉誘導的癌症(例如,間皮瘤))以及所述癌症的組合。
在具體實施方式中,癌症係黑色素瘤、腎癌、大腸癌或前列腺癌。在另一個實施方式中,癌症係轉移性的。在另一個實施方式中,受試者先前已經用免疫檢查點抑制劑(CPI),例如抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4進行了治療,並且已經反應並進展。
IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合可以與一種或多種其他療法(例如,抗癌劑、細胞介素或抗激素劑)一起投與,以治療和/或控制癌症。下文描述了抗癌劑之非限制性實例。
在一個實施方式中,本文提供了用於預防、治療和/或控制受試者中的障礙(例如,受試者中的過度增殖性病症或障礙(例如,癌症))之方法,包括將抗PD-1抗體分子投與於受試者。在一些實施方式中,藉由注射(例如,皮下注射或靜脈內注射)以約200mg至500mg,例如約250mg至450mg、約300mg至400mg、約250mg至350mg、約350mg至450mg、或約300mg、或
約400mg的劑量(例如,平穩劑量)投與抗PD-1抗體分子。給藥日程表(例如,平穩給藥日程表)可以從例如每週一次至每2週、3週、4週、5週或6週一次變化。在一個實施方式中,將抗PD-1抗體分子以從約300mg至400mg的劑量投與,每三週一次或每四週一次。在一個實施方式中,將抗PD-1抗體分子以從約300mg的劑量投與,每三週一次。在一個實施方式中,將抗PD-1抗體分子以從約400mg的劑量投與,每四週一次。在一個實施方式中,將抗PD-1抗體分子以從約300mg的劑量投與,每四週一次。在一個實施方式中,將抗PD-1抗體分子以從約400mg的劑量投與,每三週一次。
根據本文所述之方法,IL-15/IL-15Rα複合物可以以藥物組成物的形式投與於受試者。在具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物與一種或多種其他療法(例如,抗PD-1抗體分子)組合投與。組合療法包括同時和連續投與IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子。如本文所用,如果IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子在同一天(例如,同時或相隔1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時或8小時)投與於患者,則將其稱為同時投與。相比之下,如果IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子在不同的日期投與於患者(例如IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子可以以1天、2天或3天的間隔投與),則將其稱為連續投與。在本文所述之方法中,IL-15/IL-15Rα複合物的投與可以在投與抗PD-1抗體分子之前或之後進行。當同時投與時,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子可以在相同的藥物組成物中或在不同的藥物組成物中。
IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合也可以與放射療法(包括例如使用X射線、γ射線和其他輻射源)一起投與,以破壞癌細胞。在具體實施方式中,放射治療作為外部束輻射或遠距離療法投與,其中輻射來自遠端源。在其他實施方式中,放射治療作為內部療法或近距離療法投與,其中放射源放置於靠近癌細胞或腫瘤塊的體內。IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體
分子也可以與化學療法組合地投與。在一個實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子可以在放射療法或化學療法之前、期間或之後根據本文所述之方法投與。在一個實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合可以在手術之前、期間或之後投與。
在一些實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於患有或診斷為癌症的受試者。在其他實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於傾向於產生癌症或易受癌症產生影響的受試者。
在某些實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於0個月至6個月大、6個月至12個月大、1歲至5歲、5歲至10歲、10歲至15歲、15歲至20歲、20歲至25歲、25歲至30歲、30歲至35歲、35歲至40歲、40歲至45歲、45歲至50歲、50歲至55歲、55歲至60歲、60歲至65歲、65歲至70歲、70歲至75歲、75歲至80歲、80歲至85歲、85歲至90歲、90歲至95歲、或95歲至100歲的受試者。在其他實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於成人。在某些實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於將要經歷或已經經歷手術、化學療法和/或放射療法的受試者。在一些實施方式中,將IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合投與於難治性患者。在某個實施方式中,難治性患者係標準抗癌療法難以治癒的患者。在某些實施方式中,當癌症未被顯著根除和/或症狀未顯著緩解時,患有癌症的患者係療法難以治癒的。在這種情況下,使用本領域公認的「難治性」含義,可以藉由本領域已知的任何方法體內或體外確定患者否為難治性的,從而測定治療的有效性。在各種實施方式中,當癌性腫瘤未減少或已增加時,患有癌症的患者係難治性的。
本發明之其他方法用於治療已經暴露於特定毒素或病原體的患者。因此,本發明之另一個方面提供了治療受試者中的感染性疾病之方法,該方法包括將本文揭露的組合(例如,包含IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合)投與於受試者,以治療受試者的感染性疾病。
除了刺激宿主對感染的天然免疫防禦之外或代替刺激宿主對感染的天然免疫防禦,在感染(例如,急性感染和/或慢性感染)的治療中,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合的投與可以與常規治療組合。宿主對感染的天然免疫防禦包括但不限於炎症、發熱、抗體介導的宿主防禦、T淋巴細胞介導的宿主防禦(包括淋巴因子分泌和細胞毒性T細胞(特別是在病毒感染期間))、補體介導的裂解和調理作用(促進吞噬作用)和吞噬作用。抗PD-1抗體分子使功能異常的T細胞重新活化的能力可用於治療慢性感染,特別是細胞介導的免疫對於完全恢復很重要的那些慢性感染。
抗體介導的PD-1阻斷可以作為IL-15/IL-15Rα複合物投與的輔助或與Il-15/IL-15Rα複合物和/或疫苗組合,以刺激對病原體、毒素和自體抗原的免疫反應。該治療方法可為特別有用的病原體之實例包括目前不存在有效疫苗的病原體,或常規疫苗不完全有效的病原體。該等病原體包括但不限於HIV、肝炎(A型肝炎、B型肝炎和C型肝炎)、流感、皰疹、梨形鞭毛蟲(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)。IL-15/IL-15Rα複合物和PD-1阻斷產生的免疫系統刺激對於介質(諸如在感染的過程中提供改變的抗原的HIV)產生的已確立的感染特別有用。例如,該等新型表位在治療時被識別為外來的,因此引起強烈的T細胞反應,並且藉由PD-1的負訊息不會抑制該T細胞反應。
可以與IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子組合使用以預防、治療和/或控制疾病(例如,癌症、感染性疾病、淋巴細胞減少、免疫不全
和傷口)的其他療法包括但不限於小分子、合成藥物、肽(包括環狀肽)、多肽、蛋白質、核酸(例如,DNA和RNA核苷酸,包括但不限於反義核苷酸序列、三螺旋、RNAi和編碼生物活性蛋白、多肽或肽的核苷酸序列)、抗體、合成或天然無機分子、模擬劑以及合成或天然有機分子。此類療法的具體實例包括但不限於免疫調節劑(例如,干擾素)、抗炎劑(例如,腎上腺皮質激素、皮質類固醇(例如,倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德(budesonide)、氟尼縮松(flunisolide)、氟替卡松(fluticasone)、曲安奈德(triamcinolone)、甲基強體松龍(methylprednisolone)、強體松龍(prednisolone)、強體松(prednisone)、氫化皮質酮(hydrocortisone))、糖皮質素、類固醇和非甾體類抗炎藥(例如,阿司匹靈、伊布洛芬、雙氯芬酸和COX-2抑制劑))、止痛藥、白三烯拮抗劑(例如,孟魯司特(montelukast)、甲基黃嘌呤、紮魯司特(zafirlukast)和齊留通(zileuton))、β2-促效劑(例如,阿布特羅(albuterol)、比特羅(biterol)、非諾特羅(fenoterol)、異他林(isoetharie)、奧西普那林(metaproterenol)、吡布特羅(pirbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林福莫特羅(terbutalin formoterol)、沙美特羅(salmeterol)和沙丁胺醇特布他林(salbutamol terbutaline))、抗膽鹼藥(例如,異丙托溴銨(ipratropium bromide)和氧托溴銨(oxitropium bromide))、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine)、青黴胺、胺苯碸(dapsone)、抗組織胺藥、抗瘧疾藥(例如,羥氯喹)、抗病毒藥(例如,核苷類似物(例如,齊多夫定(zidovudine)、阿昔洛韋(acyclovir)、更昔洛韋(ganciclovir)、維達拉濱(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、三氟胸苷(trifluridine)和利巴韋林(ribavirin))、膦甲酸(foscarnet)、金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)、沙奎那韋(saquinavir)、茚地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)和AZT)和抗生素(例如,放線菌素D
(dactinomycin)(以前稱為放線菌素)、博來黴素、紅黴素、青黴素、光輝黴素(mithramycin)和安麯黴素(anthramycin,AMC))。
已知可以用於或已經用於或目前用於預防、控制和/或治療受IL-15功能/傳訊和/或免疫檢查點調節影響的疾病的任何療法均可以與IL-15/Il-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合療法組合使用。參見例如Gilman等人,Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Basis of Therapeutics[古德曼和吉爾曼治療學的藥理學基礎],第10版,McGraw-Hill,New York[紐約麥格勞.希爾公司],2001;The Merck Manual of Diagnosis and Therapy[默克診療手冊],Berkow,M.D.等人(編),第17版,Merck Sharp & Dohme Research Laboratories,Rahway,NJ[新澤西州拉威的默沙東研究實驗室],1999;Cecil Textbook of Medicine[希氏內科學教科書],第20版,Bennett和Plum(編),W.B.Saunders,Philadelphia[費城的桑德斯出版公司],1996和Physicians’ Desk Reference[醫師案頭參考](第66版,2012)的關於療法(例如,預防劑或治療劑)的資訊,該等療法已經用於或目前用於預防、治療和/或控制疾病或障礙(例如,癌症、感染性疾病、淋巴細胞減少、免疫不全和傷口)。
除了IL-15/Il-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合療法之外可以使用的一種或多種其他療法之非限制性實例包括免疫調節劑,諸如但不限於化療劑和非化療免疫調節劑。化療劑之非限制性實例包括胺甲蝶呤、環孢菌素A、來氟米特(leflunomide)、順鉑、異環磷醯胺(異環磷醯胺)、紫杉烷類(諸如汰癌勝(taxol)和紫杉醇(paclitaxol))、拓撲異構酶I抑制劑(例如,CPT-11、托泊替康(topotecan)、9-AC和GG-211)、吉西他濱(gemcitabine)、長春瑞濱(vinorelbine)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、長春瑞濱、替莫唑胺(temodal)、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、
長春新鹼、長春花鹼、秋水仙素、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基蒽二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素、放線菌素D、l-脫氫睪固酮、糖皮質素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤黴素同系物和環磷醯胺。
生物學活性
在一個方面,IL-15/IL-15Rα複合物和/或抗PD-1抗體分子增加了免疫反應,該免疫反應可為例如抗體反應(體液反應)或細胞免疫反應(例如,細胞介素分泌(例如,干擾素-γ)、輔助活性或細胞毒性)。在一個實施方式中,增加的免疫反應係增加的細胞介素分泌、抗體產生、效應子功能、T細胞增殖和/或NK細胞增殖。測量此類活性的各種測定法係本領域熟知的,並且包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA;參見例如Current Protocols in Immunology[免疫學實驗室指南]的第2.1節,Coligan等人(編),John Wiley and Sons,Inc.[約翰‧威立父子出版公司]1997)、鑒定抗原特異性T細胞的「四聚體染色」測定法(參見Altman等人,(1996),Science[科學]274:94-96)、混合淋巴細胞靶標培養測定法(參見例如Palladino等人,(1987),Cancer Res.[癌症研究]47:5074-5079)以及可用於測量體外細胞介素釋放的ELISPOT測定法(參見例如Scheibenbogen等人,(1997),Int.J.Cancer[國際癌症雜誌]71:932-936)。
在一些方面,相對於陰性對照或作為單一藥劑投與的IL-15/IL-15Rα複合物或抗PD-1抗體分子引起的免疫反應,藉由IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合誘導或增強的免疫反應被增強或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、或12倍,如藉由本領域的任何已知方法所測定。在某些實施方式中,相對於陰性對照誘導的免疫反應,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合誘導的免疫反應增強至少0.5倍至2倍、至少2倍至5倍、至少5倍至10倍、至少10倍至50倍、至少50倍至100倍、至
少100倍至200倍、至少200倍至300倍、至少300倍至400倍、或至少400倍至500倍,如藉由本領域的任何已知方法所測定。在具體實施方式中,用於評估免疫反應的測定法測量抗體產生、細胞介素產生或細胞毒性的水平,並且此類測定法係本領域熟知的。在一些實施方式中,用於測量免疫反應的測定法係確定抗體或細胞介素水平的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、確定細胞介素釋放的ELISPOT測定法、或確定細胞毒性的[51Cr]釋放測定法。
在具體實施方式中,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合增加了葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化的全血上的IL-2表現。例如,與IL-15/IL-15Rα複合物、抗PD-1抗體分子或同種型對照(例如,IgG4)單獨使用時IL-2的表現相比,IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子使IL-2的表現增加至少約2倍、3倍、4倍或5倍。當IL-15/IL-15Rα複合物與抗PD-1抗體在同一天投與而並非IL-15/IL-15Rα複合物在抗PD-1抗體分子投與之後72小時投與時,累加效應或協同效更加顯著。
在一個實施方式中,相對於與陰性對照或作為單一藥劑的IL-15/IL-15Rα複合物或抗PD-1抗體分子接觸時癌細胞的增殖,與IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合接觸的癌細胞的增殖或活力被抑制或減少至少2倍、較佳的是至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、或至少10倍,如使用本領域熟知的測定法(例如,使用CSFE、BrdU和放射性胸苷摻入的細胞增殖測定法)所測量。替代性地,可以藉由測量乳酸脫氫酶(LDH)(乳酸脫氫酶係細胞溶解時釋放的穩定的胞質酶)的測定法,或藉由細胞溶解時[51Cr]的釋放來測量細胞活力。在另一個實施方式中,相對於與陰性對照或作為單一試劑的IL-15/IL-15Rα複合物或抗PD-1抗體分子接觸的癌細胞,與IL-15/IL-15Rα複合物和抗PD-1抗體分子的組合接觸的癌細胞的增殖被抑制或減少至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至
少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%,如使用本領域熟知的測定法(例如,使用CSFE、BrdU和放射性胸苷摻入的細胞增殖測定法)所測量。
可以進行該等測定的癌細胞系係熟悉該項技術者熟知的。還可以對原代細胞(例如,組織外植體)進行壞死、凋亡和增殖測定。
在一個實施方式中,藉由細胞係否能夠攝取染料(諸如中性紅,台盼藍或ALAMARTM藍)來測量壞死細胞(Page等人,(1993),Intl.J.of Oncology[國際腫瘤學雜誌]3:473-476)。在這種測定法中,在含有染料的培養基中培養細胞,洗滌細胞,並藉由分光光度法測量剩餘染料(這反映了染料的細胞攝取)。在另一個實施方式中,染料係磺醯羅丹明B(SRB),它與蛋白質的結合可以用作細胞毒性的量度(Skehan等人,(1990),J.Natl Cancer Inst.[國立癌症研究所雜誌]82:1107-12)。在又一個實施方式中,在定量比色測定法中,四唑鹽(諸如MTT)被用於藉由檢測活細胞(非死細胞)來測定哺乳動物細胞的存活和增殖(參見例如Mosmann,(1983),J.Immunol.Methods[免疫學方法雜誌]65:55-63)。
在其他實施方式中,在培養物的貼壁和「漂浮」隔室中測量凋亡的細胞。藉由除去上清液,用胰蛋白酶消化貼壁細胞來收集兩個隔室,並組合兩種製備物,接下來進行離心洗滌步驟(10分鐘,2000rpm)。用舒林酸(sulindac)和相關化合物處理腫瘤細胞培養物以獲得大量的細胞凋亡的方案在文獻中已有所描述(參見例如Piazza等人,(1995)Cancer Research[癌症研究]55:3110-16)。該方法的特徵包括收集漂浮細胞和貼壁細胞,鑒定觀察細胞凋亡的最佳處理時間和劑量範圍,以及鑒定最佳細胞培養條件。在另一個實施方式中,藉由測量DNA片段化來定量凋亡。用於DNA片段化的體外定量測定的商業化光度測定法係可用的。此類測定法之實例(包括TUNEL(它檢測摻入片段化DNA中的標記核苷酸)和基於ELISA的測定法)在Biochemica[生物化學],(1999),第2期,第34-37
頁(羅氏分子生物化學(Roche Molecular Biochemicals))中有所描述。在又一個實施方式中,可以在形態學上觀察細胞凋亡。
本揭露之一個或多個實施方式的細節陳述於上文所附的說明書中。現在描述較佳的方法和材料,但類似或等效於本文所述之任何方法和材料也可以用於本揭露的實踐或測試。根據說明書並且根據申請專利範圍,本揭露之其他特徵、目標和優點將是清楚的。在本說明書和隨附申請專利範圍中,除非上下文另外明確說明,否則單數形式包括複數指代物。除非另外定義,否則本文所用的全部技術和科學術語具有與本揭露所屬領域的普通技術者通常所理解的相同的意義。除非另外說明,否則適當時本說明書中引用的所有專利和出版物均藉由引用併入。提供以下實例以便更充分地說明本揭露之較佳的實施方式。該等實例決不應被解釋為限制由所附申請專利範圍限定的揭露的主題的範圍。
具體實施方式、引用和參考文獻
本發明在範圍上不受本文所述之具體實施方式的限制。實際上,根據上述說明和附圖,除了本文所述之那些修改之外,本發明之各種修改對於熟悉該項技術者來說將是顯而易見的。該等修改旨在落入所附請求項的範圍內。
本文引用了各種參考文獻,包括專利申請、專利和科學出版物;每個這樣的參考文獻的揭露內容藉由引用以其全文特此併入本文。
實例
實例1:CHO細胞系中hetIL-15的產生
使用中國倉鼠卵巢(CHO)親本細胞系CHO-MaKo來產生IL-15/IL-15Rα異二聚體(也稱為「hetIL-15」)。CHO-MaKo細胞系係使用鋅指核酸酶(ZFN)技術藉由靶向缺失CHO-C8TD中的蛋白裂解酶基因而衍生的。發現該蛋白酶蛋白裂解酶參與CHO細胞中多種重組治療性蛋白質的降解。CHO-C8TD衍生自單個小瓶的來自WCB070625的親本細胞系CHO-K1PD。CHO-K1PD衍生自最初從ATCC(目錄號CCL-61.3)獲得的CHO-K1細胞系。CHO-MaKo細胞系的細節可以在WO 2015/166427中找到,其藉由引用併入本文。
藉由用線性化的載體pBW1697(編碼IL-15(介白素15)和IL015Rα(介白素15受體α))和編碼IL-15Rα的pBW1703電穿孔共同轉染CHO-MaKo細胞。在兩天的恢復期後,將轉染的細胞池在補充甲胺蝶呤(MTX)的低葉酸培養基中培養數週,以選擇重組細胞。為了增加IL-15表現,藉由電穿孔用編碼IL-15的線性化載體pBW1916轉染回收的細胞池。在兩天的恢復期後,將轉染的細胞池在補充甲胺蝶呤(MTX)和嘌呤黴素的低葉酸培養基中培養數週,以選擇重組細胞,從該重組細胞藉由FACS分選的單個細胞。關於生物反應器性能,mRNA大小和完整性(藉由北方印漬)、轉基因拷貝數(藉由qPCR)、表現盒的大小和完整性(藉由南方印漬)和序列驗證(藉由NGS)進一步表徵選擇的選殖。
pBW1697、pBW1703和pBW1916的載體圖如圖1所示。表3提供了最終表現構建體和表現盒的概述。
如表1所示,使用了兩種不同的IL-15表現盒:在pBW1697中,開讀框(ORF)中包括29個胺基酸的天然訊息肽(自身SP)和114個胺基酸的IL-15鏈之前的19個胺基酸的天然原肽序列。在pBW1916中,IL-15鏈與所謂的UTR12訊息肽(UTR12SP)組合在一起。
IL-15Rα也從兩種不同的ORF中表現。在pBW1697中,使用了帶有其天然訊息肽(自身SP)的全長受體(IL-15Rα FL)。在pBW1703中,表現了IL-15Rα的可溶性形式,其具有UTR12 SP。
ORF:開讀框,SP:訊息肽,FL:全長,n.a:不適用,sol:可溶性
實例2. IL-15/IL-15Rα異二聚體的產生
藉由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系產生IL-15/IL-15Rα。使用生物反應器中的標準分批補料生產方法進行生產。
將來自原始細胞庫的一個冷凍小瓶解凍並懸浮在擴增培養基中。進行一系列搖瓶傳代以擴大接種物的體積。當接種物的體積和活細胞密度足夠高時(活細胞密度大約為4.8 x 106個細胞/mL;活率>90%),將接種物轉移到第一種子反應器中。
將來自前一步驟的接種物轉移至含擴增培養基的第一種子生物反應器,並以分批模式進一步培養。當活細胞密度足夠時(活細胞密度約為5.4 x 106個細胞/mL),將培養物用於接種第二種子生物反應器。
將來自第一種子生物反應器的培養物轉移至含擴增培養基的第二種子生物反應器,並以分批模式進一步培養。當活細胞密度足夠時(活細胞密度約為5.6 x 106個細胞/mL),將培養物用於接種生產生物反應器。
生產生物反應器以分批補料模式運行。將來自步驟3的培養物轉移到含有生產培養基的生產生物反應器。在整個生物反應器運行過程中,用兩種進料溶液進料。兩種進料的添加都以約2 x 106細胞/mL的活細胞密度開始。在約12.5 x 106個細胞/mL的活細胞密度下,培養溫度從36.5℃轉變為33.0℃。當細胞活率降至75%或開始生產後的約14天,開始收穫。監測每批收穫物的生物負載和外源因子(adventitous agent)進行監控。
純化過程包括兩個專門用於病毒滅活/去除的步驟,即低pH孵育和納濾。最後,將產物濃縮並滲濾至最終緩衝液中。
實例3. O-聚糖組成的確定
藉由基質輔助雷射解吸電離質譜(MALDI-MS)分析O-聚糖。為此目的,藉由還原性β-消除方法將O連接的聚糖從蛋白質上化學切割,並在
MS檢測之前藉由全甲基化進行衍生化。根據MS數據,生成鑒定結果和半定量結果。表4匯總了所有五批次中主要聚糖種類的身份和相對豐度。
圖6以橫條圖視覺化了各種種類之分佈。
在衍生自不同細胞系的hetIL-15批次之間觀察到O-聚糖變體和分佈的相關差異。HEK293批次包含約50%的核心2類型變體(C2G、C2S1、C2GS1、C2GS2)。僅在CHO衍生批次中以痕量水平檢測到該等。與HEK293批次相比,在CHO批次中檢測到了更高水平的核心1單唾液酸化變體(C1S1)(分別為約50%相對於約15%)。所有批次的唾液酸化總體水平非常高(>97%)。由於觀察到的差異,認為從HEK293和CHO細胞衍生的批次相對於它們的一般O-聚糖組成不同。
圖7顯示了核心1型O-聚糖形式(「C1」)的基本結構。用其他聚糖殘基(例如唾液酸)的延伸導致更複雜的結構,如表4所示(例如C1S1、C1S2)。所有分析的批次中均存在核心1結構模體。下圖8顯示了核心2型O-聚糖形式(「C2」)的基本結構。用其他聚糖殘基的延伸導致更複雜的結構,如表4所示(例如C2S1、C2GS1)。僅在HEK293批次中以相關水平檢測到此結構。
「-「:未檢測到或低於0.5%的報告限值
「H」:己糖
「F」:岩藻糖
「C」:核心
「Lac」:N-乙醯基-乳糖胺
「G」:半乳糖(伸長的核心2)
「S」:唾液酸
「N」:N-乙醯基己糖胺
關於唾液酸的鍵類型,進一步表徵了O-聚糖。藉由β-消除法從蛋白質上化學切割後,藉由乙基酯化進行衍生化。乙基酯化後對O連接的聚糖的MS分析提供了唾液酸鍵資訊(α2,3或α2,6),並且僅在定性基礎上進行。
HEK293和CHO批次均顯示兩種類型的唾液酸鍵(α2,3和α2,6)。對於在人類細胞中(HEK293)表現的蛋白質而言,這是預期的,但是在CHO細胞中表現的蛋白質中卻很少見。下圖9顯示了CHO臨床批次BC0001之質譜圖。與更主要的α2,3連接的唾液酸變體相比,α2,6連接的唾液酸的相對強度相當低。
藉由逆相層析法評估唾液酸譜和含量。化學切割和螢光標記後,藉由梯度洗脫在柱上分離唾液酸,並藉由螢光檢測進行定量。
N-乙醯神經胺酸係人糖蛋白中主要的唾液酸。在非人糖蛋白中發現了N-羥乙醯神經胺酸,這是不希望的。因此,較佳的是N-乙醯神經胺酸與N-羥乙醯神經胺酸的高比率。
HEK293批次顯示出很高的比率。該等批次中的N-羥乙醯神經胺酸的量可以認為是微不足道的。
CHO批次顯示出超過200的高且可比較的比率。這表明在該等樣本中存在少於0.5%的不希望的N-羥乙酸神經胺酸。
實例4. N-聚糖組成的確定
從hetIL-15異二聚體上酶促切割N-聚糖,並使用RapiFluorTM技術用螢光標記和三級胺衍生化。純化後,藉由HILIC(親水相互作用液相層析)與螢光檢測偶合MS(質譜)對標記的N-聚糖進行分析。
圖10中的層析圖顯示了一個HEK293衍生批次和一個CHO衍生批次的疊加。在衍生自兩種不同細胞系的CHO批次之間觀察到N-聚糖群體和分佈的顯著差異。主要的N-聚糖種類不同,HEK293批次的譜顯示出異質分佈,而CHO批次的譜更均一。
表5匯總了所有五批次中主要N-聚糖種類的身份和相對峰面積。
圖11的層析圖顯示了三個HEK293批次的疊加。三個批次的總體碳水化合物模式以及主要形式的等級順序相似,並且觀察到的差異在預期的批次間差異內。主要種類與半乳糖基化(FA2B/FA2/FA3/FA4)有關,但觀察到高水平的唾液酸化。在低水平下檢測到大量不同的唾液酸化聚糖。未檢測到對藥物動力學或免疫性有潛在影響的種類,例如岩藻糖基化聚糖和高甘露糖聚糖。
圖12的層析圖顯示了兩個CHO批次的疊加。這兩個批次的碳水化合物模式非常相似。兩個主要的唾液酸化種類(FA2G2S2和FA2G2S1)貢獻了大約60%的N-聚糖群體。未檢測到對藥物動力學或免疫性有潛在影響的種類,例如岩藻糖基化聚糖和高甘露糖聚糖。
實例5. 在患有轉移性癌症的成人中對單獨的或與抗PD-1抗體分子組合的IL-15/IL-15Rα複合物的I/Ib期研究
該實例描述了確定單獨地或與抗PD-1抗體分子組合地投與於患有實性瘤或淋巴瘤的人類患者的皮下(SC)重組異二聚體IL-15/可溶性IL-15Rα複合物(hetIL-15)(由CHO細胞系產生)的安全性、耐受性、劑量限制性毒性(DLT)和最大耐受劑量(MTD)的研究。
目標
該I/Ib期研究的目的係確定由CHO細胞系產生的異二聚體IL-15/可溶性IL-15Rα複合物(hetIL-15)(稱為「CHO hetIL-15」)的安全性,以及它是否可以與抗PD-1抗體安全地組合使用,並確定適當的劑量和日程表以進行進一步研究。此外,該研究將表徵CHO hetIL-15作為單一藥劑以及與抗PD-1抗體組合的藥物動力學譜,並鑒定初步的抗腫瘤活性。
主要目標係表徵CHO hetIL-15作為單一藥劑以及與抗PD-1抗體組合在患有先前對免疫檢查點抑制劑(CPI)有反應並進展(繼發耐藥患者)的實性瘤和淋巴瘤的患者中的安全性、耐受性。
次要目標係:1)評估CHO hetIL-15和抗PD-1抗體的初步抗腫瘤活性;和2)表徵CHO hetIL-15作為單一藥劑以及與抗PD-1抗體組合的藥物動力學(PK)和抗PD-1抗體的PK。
研究設計
這是一項在患有先前獲得對抗PD-1/CPI療法的反應後進展的晚期實性瘤和淋巴瘤的受試者中皮下投與單獨CHO hetIL-15及與抗PD-1抗體組合的I/Ib期、開放標籤、全球、多中心的研究。先前的反應被定義為放射照相完全反應(CR)或部分反應(PR)。如果最近的治療方案包括CPI,則穩定疾病(SD)持續6個月的受試者也將包括在內。研究由兩個部分組成,即劑量遞增和劑量擴展。在遞增部分過程中將檢查兩個單獨的組:1) CHO hetIL-15作為單一藥劑的評估。可以在第一次疾病重新評估的抗PD-1抗體時添加抗PD-1抗體和2)CHO hetIL-15和抗PD-1抗體以組合形式從C1D1開始投與。
患者群體
該研究將在18歲的男性和女性患者中進行,該等患者先前用CPI(抗PD-1/PD-L1和/或抗CTLA4)治療,並且先前已經反應並進展。如果最近的方案包括CPI,則先前的反應係初始放射照相CR/PR(無需進行確認性掃描)或SD持續6個月。在劑量遞增期間,將在患有晚期實性瘤和淋巴瘤的患者中進行研究。在擴展過程中,將在黑色素瘤患者中進行研究。
關鍵入選標準
2.經組織學確認並記錄的晚期實性瘤和淋巴瘤(包括不能藉由手術或放療治癒的局部晚期實性瘤和淋巴瘤,和患有轉移性疾病的那些),具有標準療法後的進展記錄或者研究者認為尚無針對其的合適的標準療法存在。
遞增:患者先前用CPI(抗PD-1/PD-L1和/或抗CTLA-4)治療,並且先前已經反應並進展。如果最近的方案包括CPI,則先前的反應係初始放射照相CR/PR(無需進行確認性掃描)或SD持續6個月。
擴展黑色素瘤患者先前用CPI(抗PD-1/PD-L1和/或抗CTLA-4)治療,並且先前已經反應並進展。如果最近的方案包括CPI,則先前的反應係放射照相CR/PR(無需進行確認性掃描)或SD持續6個月。
關鍵排除標準
1.已接受任何先前IL-15治療的患者。
2.對一種或多種研究藥物的任何成分和其他mAb和/或其賦形劑發生嚴重超敏反應的病史。
3.患有原發性CNS腫瘤的患者被排除在外。存在有症狀的CNS轉移或需要局部CNS定向療法(例如放療或手術)或需要在研究進入前2週增加皮質類固醇劑量的CNS轉移。經治療的有症狀的腦轉移患者應保持神經學穩定(在治療後4週內且在進入研究前),並在投與任何研究治療前,每天接受劑量10mg的強體松或等效物至少2週。
4.在研究治療的第一劑量的7天內,在腎上腺功能不全的情況下進行全身性慢性類固醇療法(>10mg/天強體松或等效物)或任何免疫抑制療法,但替代劑量類固醇除外。允許局部、吸入、鼻和眼用類固醇。
5.具有除了在本研究中接受治療的之外的惡性疾病。例外情況包括已經進行了潛在治療療法的皮膚基底細胞癌或皮膚鱗狀細胞癌,或原位子宮頸癌或其他不會影響預期壽命的腫瘤。
功效評估
根據RECIST1.1,iRECIST對實性瘤(如Seymour等人(2017)Lancet Oncol[柳葉刀腫瘤學];18:e143-e152所述)和淋巴瘤(Cheson等人(2014)
J.Clin.Oncol.[臨床腫瘤學雜誌]32(27):3059-67)進行的腫瘤評估。在篩選時,將在治療開始的28天內(第1週期第1天前的-28天至-1天)進行影像評估。所有受試者均將接受胸部、腹部和骨盆的電腦斷層掃描(CT)掃描及IV造影。如果頸部有疾病的臨床證據,還將進行頸部的CT及IV造影。具有已知CNS疾病的受試者需要在基線時對腦進行成像。應使用磁共振成像(MRI)以評估CT未充分成像的疾病部位。如果受試者不能耐受造影劑,可以在沒有造影劑的情況下進行CT。MRI可用於評估其中不具有IV造影的CT係不充分的疾病部位。可以藉由使用尺子或卡尺的體檢來測量可見的皮膚病變和易於觸及的腫瘤,並將拍攝彩色照片。超音波不應該用於測量疾病部位的反應。
結果測量
藉由基線和治療時CHO hetIL-15和抗PD-1抗體的血清濃度評估藥物動力學。
CHO hetIL-15作為單一藥劑及與抗PD-1抗體組合的第1週期(28天)的劑量限制毒性(DLT)發生率。
不良事件(AE)和嚴重不良事件(SAE)的發生率和嚴重程度,包括實驗室參數、生命徵象和心電圖(ECG)的變化。
其他評估包括:
1.評估腫瘤浸潤性CD8+ T細胞和NK細胞的數量和細胞毒性活性的變化以及T細胞選殖的豐度變化。
2.對基線和治療中的腫瘤活檢進行定序。藉由IHC評估腫瘤活檢上的PD-L1表現和CD8+ T細胞。
3.基線和治療中腫瘤樣本的基因表現譜
4.來自基線和治療中血漿樣本中循環游離腫瘤DNA的DNA定序
5.評估激活/增殖標記物、血液中T細胞和NK細胞亞群上檢查點抑制劑和血漿中可溶性免疫因子的水平和/或表現的自基線的變化
研究治療
劑量遞增和劑量擴展
患者將用CHO hetIL-15作為單一藥劑及與抗PD-1抗體組合治療,直到達到MTD或為該組合確定較低的RD。劑量遞增將根據EWOC原則藉由適應性BHLRM來指導,以在未來研究的受試者中控制劑量-限制毒性(DLT)的風險。在劑量遞增部分將評估兩個獨立的劑量組:
第1)組:CHO hetIL-15單一藥劑(在首次疾病重新評估後,允許受試者可以開始使用抗PD-1抗體)
第2)組:從C1D1開始CHO hetIL-15與抗PD-1抗體組合。
圖14提供了將要評價的臨時劑量水平。在研究過程中可以添加另外的和/或中等劑量水平。此外,可以評價hetIL-15的替代給藥日程表,例如在週期的前兩週期間每週一次或每週兩次投與hetIL-15。可以在小於MTD的任何劑量水平添加佇列,以便更好地理解安全性、PK和/或PD。
治療期將在第1週期的第1天(C1D1)開始。每個治療週期由28天組成。每週一次皮下投與CHO hetIL-15,3週投與/1週停用。在給予抗PD-1抗體時,將在每個週期的第1天以400mg的固定劑量靜脈內投與一次。
對於該試驗入選的受試者,CHO hetIL-15單獨或與抗PD-1抗體組合的起始劑量係每週一次皮下(SC)2μg/kg,3週投與/1週停用日程表。PD-1抗體的起始劑量為400mg Q4W i.v.。可以探索替代性的給藥日程表,該方案將被修改以反映任何新的一個或多個日程表。
在臨床前模型中,單獨的IL-15治療可誘導IFN-γ並具有抗腫瘤作用,但由於CD8+ T細胞上PD-1上調,這種抗腫瘤活性可能受到限制。添加
檢查點抑制物(例如PD-1和CTLA-4抑制劑)可進一步增加IFN-γ表現並降低CD8+ T細胞上PD-1的表現,從而提高生存率(Yu等人(2010)Clin Cancer Res[臨床癌症研究];16(24):6019-28,Yu等人(2012)Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊];109(16):6187-92)。此外,初步臨床數據顯示,對CPI反應的受試者的IL-15基線水平較高。黑色素瘤、NSCLC和乳癌中的CD8+ T細胞腫瘤浸潤還與更高水平的IL-15和NK基因特徵相關。因此,CHO hetIL-15、IL-15促效劑與抗PD-1抗體、PD-1抑制劑的組合可能具有協同作用,並且可以進一步增強抗腫瘤反應,特別是在先前已對檢查點抑制劑反應並隨後復發的受試者群體中。
可以將另外的藥劑與CHO hetIL-15±抗PD-1抗體組合,並可以在研究的擴展部分考慮其他適應症。該等另外的組合方案和/或適應症只有在具有將來的方案修訂的情況下加入本試驗時才進行探討。
一旦宣佈CHO hetIL-15與抗PD-1抗體組合的MTD和/或RD,則開始研究的劑量擴展部分。擴展組的主要目標係進一步評估CHO hetIL-15與抗PD-1抗體組合的安全性和耐受性。擴展組的次要目標係評估CHO hetIL-15與抗PD-1抗體組合在CPI復發性黑色素瘤受試者中的抗腫瘤活性。
暫定劑量水平
表6和表7描述了可在該試驗期間評估的CHO hetIL-15的起始劑量和臨時劑量水平。抗PD-1抗體的劑量固定為400mg Q4W。除了起始劑量水平1,實際的劑量水平將根據可用的毒性、藥物動力學和藥效學數據確定。
劑量限制性毒性的定義
劑量限制性毒性(DLT)定義為在DLT期間(28天)內發生的不良事件或實驗室異常值,其中與作為單一藥劑的CHO hetIL-15或CHO hetIL-15/anti-PD-1組合的關係不能排除,並且主要與疾病、疾病進展、併發疾病或伴隨用藥無關。表8列出了DLT的標準。將使用美國國家癌症研究所不良事件通用術語標準(NCI CTCAE)5.0版用於所有評級。出於劑量遞增決策的目的,將考慮DLT並納入BHLRM中。
生物標記物
生物標記物分析將用於研究CHO hetIL-15作為單一藥劑或與抗PD-1抗體組合在分子和細胞水平上的作用,以及確定標記物的變化如何與暴露和臨床相關結果。此外,還將探索功效的潛在預測標記物以及對hetIL-15的耐藥機制。
預計CHO hetIL-15將促進NK和CD8+ T細胞並增強抗腫瘤免疫力,並且CHO hetIL-15和抗PD-1抗體組合療法將抑制腫瘤生長。
與HEK293產生的hetIL-15相比,實例6由CHO產生的hetIL-15不具有IL-15Rα鏈C末端剪接變體。
藉由肽作圖、SDS-PAGE(天然和還原條件)、SEC、RP-HPLC和質譜比較了HEK293和CHO hetIL-15的大小異質性。
如圖15所示,HEK293批次和CHO批次的層析圖譜有顯著差異。由於存在剪接變體(CHO批次中不存在),HEK293批次顯示出雙IL-15Rα峰。剪接變體的位置在IL-15受體峰的C-末端區域。關於四個IL-15峰的分佈以及IL-15Rα和IL-15的峰面積比,HEK293和CHO批次非常相似。峰面積比監控IL-15Rα和IL-15的化學計量:2.0的比率對應於兩條鏈的1:1莫耳比。
僅在HEK293批次中檢測到IL-15Rα鏈的剪接變體,該變體由159個殘基(I1-G159)(如下所示)組成,其藉由肽作圖確定:
應理解,本文描述之實例和方面僅出於說明的目的,並且根據其進行的各種修改或改變對於熟悉該項技術者將是明瞭的,並包括在本申請的精神和範圍以及所附申請專利範圍的範圍內。
另外,在根據馬庫什組描述本發明之特徵或方面的情況下,熟悉該項技術者將認識到,本發明也因此以馬庫什組的任何單個成員或成員子組進行描述。
本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都藉由引用以其整體(或根據上下文指示)明確地併入,其引用程度與每個文獻均單獨藉由引用併入的程度相同。在衝突存在的情況下,則以包括定義在內的本說明書為準。
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<223> /注=“人工序列之描述:合成
多肽”
<400> 28
<210> 29
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注=“人工序列之描述:合成
多肽”
<400> 29
Claims (34)
- 一種多肽複合物,該多肽複合物包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽,其中該多肽複合物包含N連接的聚糖,該N連接的聚糖包含FA2G2、FA2G2S1、FA2G2S2、FA3G3S1、FA2F1G2S2、FA3G2S2、和FA3G3S3。
- 如請求項1所述之多肽複合物,其中IL-15多肽具有SEQ ID NO:1或5的序列,並且IL-15Rα具有SEQ ID NO:6、7、10、12、14或21的序列。
- 如請求項1所述之多肽複合物,其中該N連接的聚糖包含至少10%、12.5%、15%、17.5%、20%或22.5%的FA2G2S1。
- 如請求項1所述之多肽複合物,其中該N連接的聚糖包含至少10%、20%、30%、或40%的FA2G2S2。
- 一種多肽複合物,該多肽複合物包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽,其中該多肽複合物包含O連接的聚糖,並且其中至少80%、85%、90%或95%的該聚糖係核心-1 O連接的聚糖。
- 如請求項5所述之多肽複合物,其中IL-15多肽具有SEQ ID NO:1或5的序列,並且IL-15Rα具有SEQ ID NO:6、7、10、12、14或21的序列。
- 如請求項5所述之多肽複合物,其中該核心-1 O連接的聚糖係單唾液酸化的和/或二唾液酸化的。
- 一種多肽複合物,該多肽複合物包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽,其中該多肽複合物包含O連接的聚糖,並且其中至少80%、85%、90%或95%的該聚糖具有核心-1 O連接的聚糖結構;並且其中該多肽複合物包含N連接的聚糖,該N連接的聚糖包含FA2G2、FA2G2S1、FA2G2S2、FA3G3S1、FA2F1G2S2、FA3G2S2、和FA3G3S3。
- 如請求項8所述之多肽複合物,其中IL-15多肽具有SEQ ID NO:1或5的序列,並且IL-15Rα具有SEQ ID NO:6、7、10、12、14或21的序列。
- 如請求項8所述之多肽複合物,其中該N連接的聚糖包含至少10%、12.5%、15%、17.5%、20%或22.5%的FA2G2S1。
- 如請求項8所述之多肽複合物,其中該N連接的聚糖包含至少10%、20%、30%、或40%的FA2G2S2。
- 如請求項8所述之多肽複合物,其中該核心-1 O連接的聚糖主要是單唾液酸化的和/或二唾液酸化的。
- 一種在非人類細胞中產生的分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體,其中該IL-15/IL-15Rα異二聚體包含α(2,6)O連接的唾液酸化。
- 如請求項13所述之分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體,其中該非人類細胞係重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
- 如請求項14所述之分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體,其中改變該CHO細胞以損害蛋白裂解酶之功能。
- 如請求項13所述之分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體,其中該分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體包含O連接的聚糖,並且其中至少80%、85%、90%或95%的該聚糖係核心-1 O連接的聚糖。
- 如請求項16所述之分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體,其中約15%的該O-聚糖具有α(2,6)連接的唾液酸化。
- 一種藥物組成物,該藥物組成物包含如請求項1-12中任一項所述之多肽複合物或如請求項13-17中任一項所述之分離的IL-15/IL-15Rα異二聚體。
- 如請求項18所述之藥物組成物,該藥物組成物進一步包含藥學上可接受的載劑。
- 一種非人細胞,該非人類細胞包含編碼人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽的核酸,其中由該細胞表現的IL-15和IL-15Rα形成異二聚體,並且其中該異二聚體包含α(2,6)連接的唾液酸化。
- 如請求項20所述之非人類細胞,其中該非人類細胞係重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
- 如請求項20所述之非人類細胞,其中改變該CHO細胞以損害蛋白裂解酶之功能。
- 如請求項18或19所述之藥物組成物,其用於在治療有需要的受試者之癌症中使用。
- 一種產生表現IL-15/IL-15α異二聚體的細胞之方法,該方法包括:(a)提供非人類細胞;(b)同時用兩種載體轉染該非人類細胞,其中該兩種載體包含編碼IL-15Rα和IL-15的第一載體,和編碼IL-15Rα的一部分的第二載體,並培養轉染的細胞;(c)用編碼IL-15的第三載體轉染來自步驟b)的細胞,並培養轉染的細胞;並且(d)分離表現IL-15/IL-15α異二聚體的單個選殖。
- 如請求項24所述之方法,其中該非人類細胞係重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
- 如請求項25所述之方法,其中修飾該CHO細胞以損害蛋白裂解酶基因之功能。
- 如請求項24所述之方法,其中該IL-15Rα具有SEQ ID NO:6、12或14的序列。
- 如請求項24所述之方法,其中該IL-15具有SEQ ID NO:1或5的序列。
- 如請求項24所述之方法,其中IL-15Rα的該部分係IL-15Rα的可溶性部分。
- 如請求項29所述之方法,其中IL-15Rα的該可溶性部分具有SEQ ID NO:7、10或21的序列。
- 一種產生IL-15/IL-15Rα異二聚體之方法,該方法包括:(a)在允許IL-15/IL-15Rα異二聚體表現和該IL-15/IL-15Rα異二聚體分泌的條件下培養由請求項24-30中任一項所述產生的細胞,並且(b)從該細胞培養物中分離該IL-15/IL-15α異二聚體。
- 一種多肽複合物,該多肽複合物包含人介白素15(IL-15)多肽和人介白素15受體α(IL-15Rα)多肽,其中該多肽複合物由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生,並且其中該多肽複合物不具有IL-15Rα鏈剪接變體。
- 如請求項32所述之多肽複合物,其中改變該CHO細胞以損害蛋白裂解酶之功能。
- 如請求項32所述之多肽複合物,其中該IL-15Rα鏈剪接變體包含從I1到G159的跨度的159個殘基。
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