KR20200038942A - 약학적 키트 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20200038942A
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amino acid
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KR1020207004523A
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콴-화 치
유-샨 왕
이-춘 후앙
신-치엔 치앙
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존프로 바이오테크 아이엔씨
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Abstract

암을 치료하기 위한 약학적 키트가 본원에 개시된다. 본 약학적 키트는 작용제 및 조작된 자연 살해 세포를 포함한다. 작용제가 암 세포에서 종양 관련 항원 발현을 증가시킬 수 있으며, 이어 종양 관련 항원-특이적 키메라 항원 수용체를 갖는 조작된 자연 살해 세포에 의해 표적화되고 파괴될 수 있다. 본원은 또한 암 치료를 위한 본 약학적 키트의 용도를 개시한다.

Description

약학적 키트 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/541,778호의 이점에 관한 것이고 이를 청구하며; 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 치료를 위한 약학적 키트 및 암 치료용 의약의 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
암은 비정상적이고 제어되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 복잡한 질환이다. 암 세포는 (1) 세포 통신: 정상 세포와 비교하여, 암 세포는 세포의 성장 또는 사멸을 조절하는 신호에 덜 반응함; (2) 침습 능력: 세포 부착 분자는 일반적으로 암 세포에서 하향 조절되고; 따라서, 덜 제한된 세포가 혈액 또는 림프액을 통해 신체의 다른 부위로 쉽게 전이되거나 퍼질 수 있음; (3) 세포 분화: 암 세포는 분화되지 않거나 정상 세포와 비교하여 덜 분화됨; 및 (4) 면역억제: 암 세포는 다양한 면역억제 세포(예를 들어, 조절 T 세포(Treg) 또는 골수-유래 억제 세포(MDSC))를 활성화시키고/거나 면역억제 인자(예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β) 또는 인터루킨-10(IL-10)))의 발현을 자극시키는 것을 통해 면역 반응을 억제함;을 비롯해 여러 가지 면에서 정상 세포와 다르다.
암에 대한 가장 일반적인 치료법은 수술, 방사선요법 및 화학요법을 포함한다. 불행하게도, 이들 치료는 종양 성장을 억제하는 것 외에도, 정상 조직에 대한 상해 또는 세포독성의 위험과 관련된다. 따라서, 부작용을 일으키지 않고 암 세포를 사멸시키도록 설계된 대체 치료법이 연구 및 전임상 연구에서 시도되고 있다. 이들 치료 중, 면역요법이 종양-특이적 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 수지상 세포(DC), 자연 살해 세포(NK 세포) 및 자연 살해 T 세포(NKT 세포))를 활성화시키고/거나 항암 인자(예를 들어, 인터페론-γ(IFN-γ) 및 그랜자임)의 발현/방출을 자극함으로써 종양을 제거하는 가장 유망한 치료법 중 하나이다. 활성화된 면역 세포는 그의 표적화 특이성을 특징으로 한다; 즉, 이들 면역 세포는 암 세포상에서 과발현되거나 특이하게 발현된 종양 관련 항원(TAA)을 인식하고 이에 결합함으로써 암 세포를 특이적으로 표적화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 임상 실무에서 면역요법의 치료 효능은 여전히 주요 조직적합성 복합체(MHC) 및 그에 제시된 TAA 둘 다가 종종 면역 감시를 피하기 위한 메커니즘 중 하나인 암 세포에서 하향 조절되거나 상실된다는 점 때문에 여전히 실망스럽다. 또한, NK 세포의 치료 효능은 암 세포에 의해 분비된 면역억제 인자(예를 들어, TGF-β 또는 IL-10)에 의해 저하될 수 있는 것으로 보고되어 있다.
전술한 점에 비추어, 암 환자를 효과적으로 치료하고 이에 따라 암 환자의 삶의 질 및/또는 수명을 향상시키기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 관련 기술에 존재한다.
요약
다음은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 본 개시의 간략화된 요약을 제시한다. 이 요약은 본 개시의 포괄적인 개요가 아니며, 본 발명의 핵심/주요 요소를 식별하거나 본 발명의 범위를 정확하게 서술하지 않는다. 그것의 유일한 목적은 본원에 개시된 일부 개념을 이후에 제시되는 보다 상세한 설명에 대한 서두로서 간략화된 형태로 제시하기 위함이다.
본원에서 구현되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 개시의 한 측면은 암에 걸렸거나 이로 의심되는 대상을 치료하는데 유용한 약학적 키트에 관한 것이다. 본 약학적 키트는 작용제를 함유하는 제1 용기, 및 조작된 자연 살해(NK) 세포를 함유하는 제2 용기를 포함한다. 본 개시의 실시양태에 따라, 작용제는 암에서 종양 관련 항원(TAA)의 발현을 증가시킬 수 있고, 조작된 NK 세포는 TAA에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는다.
본 개시의 다른 측면은 본 약학적 키트를 사용하여 암에 걸렸거나 이로 의심되는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암에 대한 TAA의 발현을 증가시키기 위해 제1 유효량의 본 작용제를 투여하는 단계; 및 TAA에 특이적인 CAR을 갖는 본 발명의 조작된 NK 세포의 제2 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, TAA는 암태아성 항원(CEA)이다. 이들 실시양태에서, CAR의 가변 도메인, 힌지 도메인 및 이펙터 도메인은 각각 서열 번호 1, 2 및 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시예에 따르면, CAR은 서열 번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일반적으로, 작용제는 5-아자사이티딘, 5,6-디하이드로-5-아자사이티딘, 5-아자-2'-데옥시사이티딘, 아라비노푸라노실-5-아자사이토신, 트리코스타틴 A(TSA), 페닐 부티레이트(PB), 소듐 부티레이트(NaB), 발프로산(VPA) 및 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 실시예에 따르면, 작용제는 5-아자사이티딘 또는 소듐 부티레이트이다.
본 발명의 약학적 키트 및/또는 방법으로 치료 가능한 예시적인 암은 위암, 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 신장암, 결장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 뇌종양, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 식도 암종, 다발성 골수종 및 두경부 편평 세포 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 일부 실시양태에 따르면, 암은 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법에 내성이 있다.
본 개시의 많은 수반되는 특징 및 장점은 첨부 도면과 관련하여 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
본 설명은 첨부 도면의 관점에서 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 더 잘 이해될 것이며, 이들 도면에서,
도 1은 본 개시의 실시예 2에 따른 특정 암 세포에서의 CEA 발현을 도시한 히스토그램이다.
도 2는 본 개시의 실시예 2에 따른 특정 암 세포에 대한 NK92MI-CEA 세포의 세포독성 효과를 도시한 선 도표이다.
도 3A 및 3B는 본 발명의 실시예 3에 따른 5-아자사이티딘 처리된 암 세포(도 3A) 및 소듐 부티레이트 처리된 암 세포(도 3B)에 대한 NK92MI-CEA 세포의 세포독성 효과를 각각 도시한 선 도표이다.
도 4A 내지 4C는 본 개시의 실시예 4에 따른 특정 치료제가 투여된 마우스의 종양 용적(도 4A 및 4B) 및 CEA 혈청 수준(도 4C)을 각각 도시한 선 도표 및 히스토그램이다.
발명의 상세한 설명
첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도된 것이며 본 실시예로 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내도록 의도되지 않는다. 본 설명은 실시예의 기능과 실시예를 구성하고 동작시키기 위한 일련의 단계들을 설명한다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서는 상이한 실시예에 의해 달성될 수 있다.
1. 정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모아 놓았다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하고 사용하는 의미를 가질 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 동일한 의미의 복수 형태를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 구체적으로, 본원 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 또한, 본원 및 청구범위에 사용된 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 동일한 의미를 가지며, 1, 2, 3 또는 그 이상을 포함한다.
본 발명의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 특정 실시예에서 제시된 수치는 가능한 정확하게 보고되었다. 그러나, 임의의 수치값은 필히 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 인한 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 내를 의미한다. 작업 실시예/실시예에서를 제외하고, 또는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 개시된 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 물질의 양, 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등은 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 필요에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 각각의 수치 파라미터는 최소한 보고된 유효 자릿수의 수에 비추어, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본원에서 동정된 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율(%)의 아미노산 서열 동일성"은 서열 정렬 및 필요하다면 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭 도입 후, 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 폴리펩티드 잔기의 백분율로 정의되는데, 이때 서열 동일성 부분으로서 어떤 보존적 치환도 고려되지 않는다. 백분율 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업자가 알고 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 두 폴리펩티드 서열 사이의 서열 비교는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 의해 온라인으로 제공되는 컴퓨터 프로그램 Blastp(단백질-단백질 BLAST)에 의해 수행되었다. 주어진 폴리펩티드 서열 B에 대한 주어진 폴리펩티드 서열 A의 아미노산 서열 동일성 백분율(선택적으로, 주어진 폴리펩티드 서열 B에 대해 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩티드 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같은 공식으로 계산된다:
Figure pct00001
상기 식에서, X는 해당 프로그램의 A 및 B 정렬에서 서열 정렬 프로그램 BLAST에 의해 동일하게 매치되는 것으로 판정된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 A 또는 B에서 더 짧은 아미노산 잔기의 총 수이다.
본원에 사용된 용어 "주기", "치료의 주기" 및 "치료 주기"는 상호 교환적이며 치료가 환자에게 적용되는 기간을 지칭한다. 전형적으로, 암 요법에서 치료의 주기에는 치료가 주어지지 않는 휴식 기간이 뒤따른다. 휴식 기간 후, 하나 이상의 추가 치료 주기가 적용될 수 있으며, 각각에 추가의 휴식 기간이 뒤따른다.
용어 "치료하는"은 암과 관련된 증상, 이차 장애 또는 상태를 부분적으로 또는 완전히 예방, 개선, 완화 및/또는 관리하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료하는"은 암과 관련된 하나 이상의 증상, 이차 장애 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 발병 지연, 진행 억제, 중증도 감소 및/또는 발생률을 감소시킬 목적으로 암과 관련된 증상, 이차 장애 또는 상태를 갖는 대상에게 본 개시의 하나 이상의 화합물/세포를 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다. 암과 관련된 증상, 이차 장애 및/또는 상태에는 열, 쇠약, 피로, 체중 감소, 통증, 기침, 출혈, 피부 변화, 설사 또는 변비, 구역, 구토 및 식욕 부진이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 암과 관련된 증상, 이차 장애 및/또는 상태의 발생 위험을 감소시키기 위해 상기의 증상, 장애 및/또는 상태의 초기 징후만을 나타내는 대상에게 치료가 적용될 수 있다. 효과적이라는 용어가 본원에 정의되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소된다면, 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 대안적으로, 증상, 장애 또는 상태의 진행이 감소되거나 중단되면 치료는 "효과적"이다.
본원에서 언급된 용어 "유효량"은 원하는 반응을 이끌어 내기에 충분한 성분의 양을 나타낸다. 치료 목적상, 유효량은 또한 치료적으로 혜택을 주는 효과가 성분의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 우세한 양이다. 특정의 유효량 또는 충분한 양은 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태(예를 들어, 환자의 체질량, 연령 또는 성별), 치료되는 포유동물 또는 동물의 종류, 치료 지속 시간, 동반 요법(존재하는 경우)의 특성 및 사용된 특정 제형 및 화합물 또는 그 유도체의 구조와 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 유효량은 예를 들어 세포 수, 그램, 밀리그램 또는 마이크로그램 또는 체중 킬로그램 당 밀리그램(mg/Kg)으로 표현될 수 있다. 대안적으로, 유효량은 배지 부피당 세포 수와 같은 활성 성분(예를 들어, 본 발명의 조작된 NK 세포)의 밀도로 표현될 수 있거나; 또는 몰 농도, 질량 농도, 부피 농도, 몰랄 농도, 몰 분율, 질량 분율 및 혼합비와 같은 활성 성분의 농도(예를 들어, 본 발명의 작용제)로 표현될 수 있다. 구체적으로, 본원에 기술된 작용제 또는 조작된 NK 세포와 관련하여 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 대상에서 암과 관련된 증상을 경감 또는 개선하기에 충분한 작용제 또는 조작된 NK 세포의 양을 지칭한다. 통상의 기술을 가진자는 동물 모델로부터 결정된 용량에 기초하여 의약(본 작용제와 같은)에 대한 인간 등가 용량(HED)을 계산할 수 있다. 예를 들어, 인간 대상에 사용하기 위한 최대 안전한 복용량을 추정하는데 미국식품의약국(FDA)이 "Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers"이라는 표제로 공개한 산업적 지침을 따를 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"는 종양/암 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 이와 관련하여 사용된 "우선적으로 발현된"이라는 표현은 항원이 비-종양 세포에서의 항원의 발현 수준보다 적어도 10% 더 큰 수준(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 150%, 200%, 400%, 또는 초과)으로 종양 세포상에서 발현됨을 의미한다. 특정 실시양태에서, 항원은 위암, 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 신장암, 결장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 뇌종양, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 식도 암종, 다발성 골수종 및 두경부 편평 세포 암종으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 항원이다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 세포에 대한 항체의 특이성을 부여하기 위해 사용되는 조작된 수용체를 지칭한다. 보다 구체적으로, 조작된 수용체는 항원에 결합할 수 있는 세포 외 도메인, 세포 외 도메인이 유래되는 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인, 및 적어도 하나의 세포 내 도메인을 포함한다. "키메라 항원 수용체"는 때때로 "키메라 수용체", "T-본체" 또는 "키메라 면역 수용체(CIR)"로도 지칭된다. "항원에 결합할 수 있는 세포 외 도메인"은 특정 항원에 결합할 수 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. "세포 내 도메인"은 세포에서 생물학적 과정의 활성화 또는 억제를 유발하는 신호를 전달하는 도메인으로서 기능하는 것으로 알려진 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. "막관통 도메인"은 세포막에 걸쳐 있고 세포 외 및 신호 전달 도메인을 연결하는 기능을 할 수 있는 것으로 알려진 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 키메라 항원 수용체는 임의로 세포 외 도메인과 막관통 도메인 사이의 링커로서 작용하는 "힌지 도메인"을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조작하다", "조작하는" 또는 "조작된"은 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 생체 분자의 유전자 조작 또는 변형, 또는 생명 공학 분야에서 일반적으로 알려진 유사한 기술을 지칭한다.
용어 "대상"은 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 인간 종을 포함하는 포유동물을 지칭한다. "대상"이라는 용어는 하나의 성별이 구체적으로 지시되지 않는 한 남성 및 여성의 성별을 모두 지칭하는 것으로 의도된다.
2. 바람직한 실시양태의 상세한 설명
TAA의 발현/과발현은 일반적으로 종양 형성과 관련된다. 예를 들어, 일부 TAA(예를 들어, 성장 인자 또는 이의 수용체, 신호 전달 물질 및 전사 인자)는 세포 증식 또는 침입을 유도하는 것으로 알려져 있는 반면, 다른 TAA(예를 들어, 사이토카인 또는 이의 수용체 및 면역 체크포인트)는 면역 감시 탈출에서 역할을 한다. 또한, TAA는 암 세포에서 화학요법의 내성과 관련될 수 있다고 보고되었다. TAA의 종양-촉진 특성에 기초하여, 현재 치료법의 대부분은 항종양 효과를 달성하기 위해 TAA 발현을 중화시키거나 하향 조절하도록 개발되었다. 본 발명은 적어도 부분적으로 TAA 발현을 유도하는 작용제가 종양 형성을 촉진시키는 대신에 면역요법의 항종양 효과를 부가적으로 또는 상승적으로 향상시킬 수 있다는 발견에 기초한다.
따라서, 본 개시의 제1 측면은 이를 필요로 하는 대상, 예를 들어 암에 걸렸거나 이로 의심되는 대상을 치료하기 위한 약학적 키트에 관한 것이다. 본 개시의 실시양태에 따라, 본 약학적 키트는 암에 대한 TAA의 발현 수준을 향상시키는 제1 작용제를 함유하는 제1 용기; 및 TAA를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 CAR을 갖는 조작된 NK 세포를 함유하는 제2 용기를 포함한다. 본 약학적 키트가 대상에게 투여되면, TAA-특이적 CAR을 갖는 조작된 NK 세포가 TAA가 발현된 암 세포를 특이적으로 표적화하여 파괴시킬 것이다.
일반적으로, 암에서 TAA의 발현 수준을 향상시키는 작용제는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 예를 들어 트리코스타틴 A, 페닐 부티레이트, 소듐 부티레이트, 발프로산 및 수베로일아닐리드 하이드록삼산일 수 있다. 대안적으로, 작용제는 5-아자사이티딘, 5,6-디하이드로-5-아자사이티딘, 5-아자-2'-데옥시사이티딘 및 아라비노푸라노실-5-아자사이토신과 같은 DNA 탈메틸화제일 수 있다. 본 개시의 일 실시예에 따르면, 작용제는 5-아자사이티딘이다. 본 개시의 다른 실시예에 따르면, 작용제는 소듐 부티레이트이다.
임의로, 작용제는 암에 대한 TAA 발현(예를 들어, CEA 발현)을 자극 또는 향상시키는 능력을 갖는 폴리펩티드; 예를 들어, 재조합 인터페론(예컨대, 재조합 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ)일 수 있다. 폴리펩티드는 당업자에게 친숙한 방법에 의해; 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 세포(예를 들어, 293T)에 도입하여 발현시키고 그 안에서 폴리펩티드를 생성함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 알파-아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 같은 일반적으로 사용되는 방법에 의해 합성될 수 있다. 두 방법 모두 펩티드의 C 말단에서 시작하여 각 단계에서 단일 아미노산을 첨가하는 단계적 합성을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 공지된 고체상 펩티드 합성 방법에 의해 합성될 수도 있다.
TAA의 비제한적인 예로서 CEA, CD19, CD20, CD23, CD30, CD56, CD73, CD123, 알파-페토단백질(AFP), 암 항원 125(CA-125; 뮤신 16 또는 MUC 16이라고도 함), 뮤신 1(MUC-1), CO17-1A(GA733, KS1-4, KSA 또는 EpCAM이라고도 함), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 흑색종 관련 항원(MAA), 티로시나제, 엘라스타제, 카텝신 G(CatG), 윌름스 종양(WT1), 섬유 아세포 성장 인자 5(FGF-5), 인슐린 유사 성장 인자 수용체-1(IGF-1R), 루이스(y) 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이 ras, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2; Neu, ErbB-2 또는 CD340라고도 함), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR), 엽산 결합 단백질(FBP), HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, GD3, c-Met(간세포 성장 인자 수용체 또는 HGF 수용체라고도 함), 메소텔린(MSLN), 인간 내인성 레트로바이러스-K(HERV-K), IL-11R-알파, 서비빈 및 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4)가 포함된다. 본 개시의 일부 실시양태에 따르면, TAA는 CEA이다.
본 약학적 키트에 포함된 NK 세포는 바람직하게는 암 세포의 상응하는 TAA를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 키메라 수용체를 발현시키도록 조작된다. NK 세포를 조작하는 데 유용한 방법은 형질감염 방법(즉, 물리적 및/또는 화학적 처리에 의해 폴리뉴클레오티드를 NK 세포에 도입), 바이러스 형질도입 방법(즉, 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 폴리뉴클레오티드를 NK 세포에 도입) 및 뉴클레오펙션(즉, NK 세포에 폴리펩티드를 도입하기 위해 특정 전압 및 시약으로 NK 세포를 적용함)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시의 일 실시양태에 따르면, 본 조작된 NK 세포는 렌티바이러스 형질도입에 의해 생성된다.
바람직하게는, 본 발명의 각 NK 세포는 CEA에 특이적인 CAR을 발현하도록 조작되며, 여기서 CAR은 N-말단에서 C-말단으로 가변 도메인, 힌지 도메인 및 이펙터 도메인을 포함한다. 본 개시의 일부 실시양태에 따라, CEA를 인식하는데 유용한 가변 도메인은 서열 번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 즉, CEA-특이적 가변 도메인은 서열 번호 1과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 바람직하게는, CEA-특이적 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일하다. 보다 바람직하게는 CEA-특이적 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 1과 적어도 95% 동일하다. 본 개시의 일 실시예에 따르면, CEA-특이적 가변 도메인은 서열 번호 1과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
힌지 도메인은 가변 도메인과 이펙터 도메인을 연결하기 위한 링커로서 기능한다. 일반적으로, 힌지 도메인은 CAR의 안정성, 발현 및 기능에 영향을 미칠 수 있다. 본 개시의 특정 실시양태에 따라, 본 CAR의 힌지 도메인은 서열 번호 2와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 2와 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 힌지의 아미노산 서열은 서열 번호 2와 적어도 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 힌지 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 2와 적어도 95% 동일하다. 본 개시의 하나의 특정 실시예에 따르면, 힌지 도메인은 서열 번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 CAR의 이펙터 도메인은 NK 세포가 CEA 억압 암 세포를 파괴하도록 유도하는 활성화 신호를 NK 세포에 전달한다. 본 개시의 특정 실시양태에 따라, 본 CAR의 이펙터 도메인은 서열 번호 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 3과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이펙터 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 3과 적어도 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 이펙터 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일하다. 본 개시의 하나의 특정 실시예에 따르면, 이펙터 도메인은 서열 번호 3과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 특정 실시양태에 따라, 본 CAR은 서열 번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 CAR의 아미노산 서열은 서열 번호 4와 적어도 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 본 CAR의 아미노산 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일하다. 본 개시의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 CAR은 서열 번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
작용제 및/또는 조작된 NK 세포를 보유하기에 적합한 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 제1 용기는 본 작용제 또는 이의 약학적 제형을 암의 TAA 발현을 향상시키기에 효과적인 양으로 보유할 수 있다. 제2 용기는 본 조작된 NK 세포 또는 이의 약학적 제형을 암을 사멸시키기에 효과적인 양으로 보유할 수 있다. 키트는 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제1 및 제2 용기에 각각 수용된 작용제 및 조작된 NK 세포가 특정 암 치료에 사용된다는 것을 제시한다. 대안적으로 또는 추가로, 키트는 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수(PBS), 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제3 용기를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 요구되는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 작용제 및 조작된 NK 세포의 투여를 위한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 제2 측면은 본 약학적 키트를 사용하여 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 암을 앓고 있는 대상 또는 암이 의심되는 대상)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은,
(a) 제1 유효량의 본 작용제를 대상에게 투여하는 단계; 및
(b) 제2 유효량의 본 조작된 NK 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
단계 (a)에서, 본 작용제는 대상에게 투여됨으로써 암 세포에서 TAA 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에 따라, 대상은 마우스이며, 이때 작용제는 하루에 대상 체중 Kg 당 0.1 mg 내지 1 Kg(즉, 0.1 mg 내지 1 Kg/Kg/일)의 양으로 투여된다. 바람직하게는, 작용제는 1 mg 내지 100 g/Kg/일의 양으로 투여된다. 보다 바람직하게는, 작용제는 10 mg 내지 10 g/Kg/일의 양으로 투여된다. 본 개시의 일 실시예에 따르면, 100 내지 500 mg/Kg/일의 본 작용제면 암 세포에 대한 TAA 발현을 증가시켜 본 발명의 조작된 NK 세포의 항종양 효과를 향상시키기에 충분하다.
당업자는 동물 모델로부터 결정된 용량에 기초하여 작용제에 대한 인간 등가 용량(HED)을 계산할 수 있다. 따라서, 작용제는 하루에 대상 체중 Kg 당 1 ㎍ 내지 100 g(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980 또는 990 ㎍; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980 또는 990 mg; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 g)의 양으로 인간에게 투여된다. 바람직하게는, 작용제는 10 ㎍ 내지 10 g/Kg/일의 양으로 인간에게 투여된다. 보다 바람직하게는, 작용제는 100 ㎍ 내지 1000 mg/Kg/일의 양으로 인간에게 투여된다.
대안적으로, 작용제는 대상의 체표면적에 준해 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상이 마우스인 경우, 작용제는 하루에 대상의 체표면적 m2 당 0.1 mg 내지 1 Kg(0.1 mg 내지 1 Kg/m2/일)의 양으로 투여될 수 있다. 이 경우, HED는 약 1 ㎍ 내지 100 g/m2/일이다.
원하는 목적에 따라, 작용제는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 장내, 경구, 비강, 비경구(예를 들어, 종양 내, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내, 뇌 내, 뇌실 내 또는 척수 내 주사), 국소 또는 경점막 투여에 의해 투여될 수 있다.
TAA 발현을 효율적으로 증가시키기 위해, 작용제는 대상에게 1회 이상 투여될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 전 치료 과정 동안 한 번 투여될 수 있다. 대안적으로, 작용제는 적어도 7일, 예를 들어 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28일 또는 그 이상 동안 매일 대상에게 투여될 수 있다. 본 개시의 특정 실시양태에 따르면, 소듐 부티레이트는 암 세포에서 TAA 발현을 향상시키기 위해 하루에 9회 용량으로 대상에게 투여된다.
단계 (b)에서, 조작된 NK 세포는 하루에 대상의 체표면적 m2 당 1 × 104 내지 5 × 1011 세포(예를 들어, 1 × 104, 1.5 × 104, 2 × 104, 2.5 × 104, 3 × 104, 3.5 × 104, 4 × 104, 4.5 × 104, 5 × 104, 5.5 × 104, 6 × 104, 6.5 × 104, 7 × 104, 7.5 × 104, 8 × 104, 8.5 × 104, 9 × 104, 9.5 × 104, 1 × 105, 1.5 × 105, 2 × 105, 2.5 × 105, 3 × 105, 3.5 × 105, 4 × 105, 4.5 × 105, 5 × 105, 5.5 × 105, 6 × 105, 6.5 × 105, 7 × 105, 7.5 × 105, 8 × 105, 8.5 × 105, 9 × 105, 9.5 × 105, 1 × 106, 1.5 × 106, 2 × 106, 2.5 × 106, 3 × 106, 3.5 × 106, 4 × 106, 4.5 × 106, 5 × 106, 5.5 × 106, 6 × 106, 6.5 × 106, 7 × 106, 7.5 × 106, 8 × 106, 8.5 × 106, 9 × 106, 9.5 × 106, 1 × 107, 1.5 × 107, 2 × 107, 2.5 × 107, 3 × 107, 3.5 × 107, 4 × 107, 4.5 × 107, 5 × 107, 5.5 × 107, 6 × 107, 6.5 × 107, 7 × 107, 7.5 × 107, 8 × 107, 8.5 × 107, 9 × 107, 9.5 × 107, 1 × 108, 1.5 × 108, 2 × 108, 2.5 × 108, 3 × 108, 3.5 × 108, 4 × 108, 4.5 × 108, 5 × 108, 5.5 × 108, 6 × 108, 6.5 × 108, 7 × 108, 7.5 × 108, 8 × 108, 8.5 × 108, 9 × 108, 9.5 × 108, 1 × 109, 1.5 × 109, 2 × 109, 2.5 × 109, 3 × 109, 3.5 × 109, 4 × 109, 4.5 × 109, 5 × 109, 5.5 × 109, 6 × 109, 6.5 × 109, 7 × 109, 7.5 × 109, 8 × 109, 8.5 × 109, 9 × 109, 9.5 × 109, 1 × 1010, 1.5 × 1010, 2 × 1010, 2.5 × 1010, 3 × 1010, 3.5 × 1010, 4 × 1010, 4.5 × 1010, 5 × 1010, 5.5 × 1010, 6 × 1010, 6.5 × 1010, 7 × 1010, 7.5 × 1010, 8 × 1010, 8.5 × 1010, 9 × 1010, 9.5 × 1010, 1 × 1011, 1.5 × 1011, 2 × 1011, 2.5 × 1011, 3 × 1011, 3.5 × 1011, 4 × 1011, 4.5 × 1011, 또는 5 × 1011 세포)의 양으로 대상에게 투여된다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 대상은 마우스이다. 특정 실시양태에서, 조작된 NK 세포는 하루에 대상의 체표면적 m2 당 1 × 106 내지 5 × 1011 세포; 바람직하게는, 하루에 대상의 체표면적 m2 당 1 × 107 내지 5 × 1010 세포; 보다 바람직하게는, 하루에 대상의 체표면적 m2 당 1 × 108 내지 5 × 109 세포의 양으로 대상에게 투여된다. 조작된 NK 세포는 4주에 걸쳐 주당 2 내지 4회(예를 들어, 2, 3 또는 4회; 바람직하게는 2회) 대상에게 투여되거나, 또는 첫 주에 4 내지 6 회(예를 들어, 4, 5 또는 6회, 바람직하게는 5회), 둘 째 주에 1 내지 3회(예를 들어, 1, 2 또는 3회, 바람직하게는 2회), 셋 째 주에 1 내지 3회(예를 들어, 1, 2, 또는 3회, 바람직하게는 1회) 대상에게 투여된다. 대안적으로, 조작된 NK 세포는 하루에 1 × 104 내지 1 × 1011 세포, 바람직하게는, 하루에 1 × 105 내지 1 × 1010 세포; 보다 바람직하게는, 하루에 1 × 106 내지 1 × 109 세포의 양으로 대상에게 투여될 수 있으며, 이때 조작된 NK 세포는 5 내지 8 일마다 1회(예를 들어, 5, 6, 7 또는 8일 마다 1회) 적어도 1개월 간 대상에게 투여될 수 있다. 하나의 실시예에서, 조작된 NK 세포는 4일마다 한 번씩 대상에게 투여된다.
대상이 인간인 경우, 조작된 NK 세포는 하루에 대상의 체표면적 m2 당 1-5 × 109 세포의 양으로 투여된다. 일부 실시양태에 따라, 조작된 NK 세포는 연속 2일 동안 대상에게 투여된다. 특정 실시양태에 따라, 조작된 NK 세포는 치료 사이에 약 12시간 내지 수 개월의 간격을 두고 하나 이상의 치료 주기로 대상에게 투여된다. 원하는 효과에 따라, 치료 간격은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간이거나; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25일이거나; 또는 1, 2, 3, 4개월 또는 그 이상일 수 있다. 바람직하게는, 조작된 NK 세포는 각 치료 주기의 1, 3 및 5일에 대상에게 투여된다. 예를 들어, 조작된 NK 세포는 치료 1일차에 1 × 109 세포/m2 체표면적, 치료 3일차에 3 × 109 세포/m2 체표면적, 및 치료 5 일차에 5 × 109 세포/m2 체표면적의 양으로 대상에게 투여될 수 있다.
대안적으로, 본 작용제 및 조작된 NK 세포의 실제 투여량은 대상의 신체 및 생리학적 요인에 기초하여 주치의가 결정할 수 있으며, 이러한 요인으로는 연령, 성별, 체중, 체표면적, 치료할 질환, 상태의 중증도, 이전 병력, 다른 약물의 존재, 투여 경로 등이 포함되지만 이로만 제한되지 않는다
비제한적인 투여 경로는 장내, 경구, 비강, 비경구, 국소 또는 경점막 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 상기 비경구 투여는 종양 내, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내, 뇌 내, 뇌실 내 또는 척수 내 주사 중 임의의 것일 수 있다.
본 개시의 실시양태에 따라, TAA-특이적 CAR이 발현된 조작된 NK 세포는 본 작용제로 처리되거나 전처리된 암 세포에 대해 결합 친화성 및 특이성을 나타낸다. 이들 실시양태에서, 본 작용제는 본 발명의 조작된 NK 세포의 항종양 효과를 부가적으로 또는 상승적으로 향상시킬 수 있다.
이해할 수 있는 바와 같이, 본 작용제는 조작된 NK 세포의 투여 전 또는 이와 동시에 대상에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 작용제는 조작된 NK 세포의 치료 전에 대상에게 투여된다. 임의로, 본 작용제가 적어도 2회의 독립적인 투여량으로 투여된 다음에 조작된 NK 세포의 처리가 이어진다. 예를 들어, 본 작용제는 대상에게 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여될 수 있으며, 각각의 투여량은 약 1일 간격으로 투여되고; 그리고 나서 조작된 NK 세포가 1, 2, 3회 이상 투여된다.
본 약학적 키트 및/또는 방법에 의해 치료 가능한 암은 화학요법(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU)), 방사선요법(예를 들어, 자외선(UV) 방사선) 또는 면역요법(예를 들어, 입양 면역 세포 요법(AIT))에 내성일 수 있다. 따라서, 본 약학적 키트 및/또는 방법은 암 요법에 대해 내성이 발생한 암 환자를 치료할 수 있는 잠재적 수단을 제공한다.
대안적으로, 본 조작된 NK 세포는 본 작용제의 치료(예를 들어, 공동 치료 또는 전처리)없이 암 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다. 보다 구체적으로, 암 환자에서의 TAA 발현이 건강한 대상에서의 TAA 발현보다 높은 경우, 암 환자는 작용제의 투여 없이 본 조작된 NK 세포로 직접 치료될 수 있다. 예를 들어, 암 환자에서 CEA 발현 수준이 건강한 대상과 비교하여 증가한 경우, CEA-특이적 CAR(예를 들어, CAR은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다)을 포함하는 조작된 NK 세포가 CEA-발현 암 세포를 소멸시키기 위해 암 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조작된 NK 세포, 약학적 키트 및/또는 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 암은 위암, 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 신장암, 결장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 뇌종양, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 식도 암종, 다발성 골수종 및 두경부 편평 세포 암종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시의 하나의 특정 예에 따르면, 암은 결장암 또는 직장암이다.
기본적으로, 대상은 포유동물, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 개, 고양이, 소, 염소, 양, 원숭이 및 말이다. 바람직하게는, 대상은 인간이다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 측면을 설명하고 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 추가의 설명없이, 당업자는 본 명세서의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 본원에 인용된 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
재료 및 방법
NK92MI-CEA 세포의 제조
NK92MI-CEA 세포는 하기 설명에 의해 제조되었다. mAb T84.66의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역을 각각 암호화하는 서열을 중첩 PCR 반응에 의해 증폭시키고 조립하였다. 항-CEA scFv 단편 및 CD8α의 힌지 영역(아미노산 105-165)을 암호화하는 서열을 플라스미드 pcDNA3.1/V5-HISⓒTOPO®TA에 클로닝하였다. 생성된 pcDNA3.1-scFv(항-CEA)-CD8a-CD3z 작제물로부터 유래된 완전한 CAR 서열을 SfiI 및 ClaI 클로닝 부위를 통해 리더 서열 및 HA 태그를 포함하는 변형된 레트로바이러스 pLNCX 벡터로 클로닝하여 재조합 레트로바이러스 벡터 pLNCX-scFv(항-CEA 항체)-CD8α-CD3ζ를 생성하였다. 이어서, pLNCX-scFv(항-CEA 항체)-CD8α-CD3ζ를 pVSV-G 플라스미드(인벨롭 플라스미드)와 함께 패키징 세포주 GP2-293에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 배양 배지로부터 레트로바이러스 입자를 함유하는 상등액을 수거하고, 0.45 μm 저 단백질 결합 필터로 여과하였다. 다음으로, 여과된 상등액을 폴리브렌(5 ㎍/mL)의 존재하에 NK92MI 세포주에 첨가하였다. 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 형질도입된 NK92MI 세포를 네오마이신 설페이트-G418(500 mg/ml)로 스크리닝하여 종양 항원 CEA에 특이적인 CAR(서열 번호 4)을 가지는 NK92MI-CEA 세포를 생성하였다.
세포 배양
인간 결장암 세포주 LS174T(ATCC®　CL-188™) 및 WiDr 세포(ATCC®　CCL-218™)를 1.5 g/L 중탄산나트륨 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 알파 변형 이글 최소 필수 배지(α-MEM)에서 유지하였다. HCT116 세포(ATCC® CCL-247™)를 1.5 g/L 중탄산나트륨, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 1.0 mM 피루브산나트륨 및 10% FBS를 함유하는 McCoy의 5A 배지에서 배양하였다. NK92MI 및 NK92MI-CEA 세포를 1.5 g/L 중탄산나트륨, 0.2 mM 이노시톨, 0.02 mM 엽산, 0.01 mM 2-머캅토에탄올, 10% FBS 및 12.5% 말 혈청이 보충된 α-MEM에서 배양하였다. 모든 세포를 5% CO2 하의 가습 인큐베이터에서 37 ℃로 인큐베이션하였다.
CEA 발현 결정
암 세포에서의 CEA의 발현 수준을 유세포 분석법으로 결정하였다. 암 세포를 인간 CEA-특이적 항체로 염색한 후 유세포 분석을 수행하였다. 적어도 105개 세포의 형광 강도를 기록하고 소프트웨어로 분석하였다. 기하 평균을 평균 형광 강도(MFI)로 선택하였다.
세포독성 분석
이 실험에서는, 암 세포(즉, HCT116 또는 WiDr 세포) 및 NK 세포(즉, NK92MI 또는 NK92MI-CEA 세포)를 각각 표적 및 이펙터 세포로 제공하였다. 간단히 설명하면, 표적 세포를 둥근 바닥 96-웰 배양 플레이트에서 이펙터 세포와 10:1, 5:1, 1:1 및 0.5:1을 포함한 다양한 이펙터/표적 비(E/T)로 함께 인큐베이션하였다. 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 상등액 50 ㎕를 분리하고 평평한 바닥의 96-웰 효소 분석 플레이트에서 50 ㎕의 CYTOTOX 96® 시약과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후 50 ㎕의 정지 용액(H2SO4)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 이펙터:표적 세포 비에 대한 세포독성의 백분율을 다음 방정식으로 계산하였다:
(실험 - 배양 배지 백그라운드) - (이펙터 세포 자발적 방출 - 배양 배지 백그라운드) - (표적 자발적 방출 - 배양 배지 백그라운드)/(표적 최대 방출 - 부피 보정 제어 - 표적 자발적 방출 - 배양 배지 백그라운드) × 100.
동물 연구
2 × 106개의 WiDr 세포를 9주령된 SCID 마우스의 등에 피하 이식하였다. 종양 용적이 100-200 mm3에 도달하면, 마우스에 200 mg/kg 소듐 부티레이트를 연속 5일 동안 복강 내 투여하였다. 이어서, 마우스를 다음 5 그룹에 배정하였다: (1) 마우스에 PBS가 매일 경구 투여되고, 4일마다 PBS가 복강 내 투여되는 대조군; (2) 마우스에 5 g/kg 소듐 부티레이트가 매일 경구 투여되고 4일마다 PBS가 복강 내 투여되는 NaB 그룹; (3) 마우스에 PBS가 매일 경구 투여되고 4일마다 NK92MI 세포가 복강 내 투여되는 NK92MI 그룹; (4) 마우스에 PBS가 매일 경구 투여되고, 4일마다 NK92MI-CEA 세포가 복강 내 투여되는 NK92MI-CEA 그룹; 및 (5) 마우스에 5 g/kg 소듐 부티레이트가 매일 경구 투여되고, 4일마다 NK92MI-CEA가 복강 내 투여되는 NK92MI-CEA + NaB 그룹. 마우스의 종양 용적을 2-3 일마다 측정하고, 종양 용적을 다음 공식을 사용하여 계산하였다: 길이 × (폭)2 ÷ 2 (*p < 0.05).
통계분석
생체 내 실험에 대해, 다중 비교를 위한 본페로니 사후(Bonferroni post hoc) 검정과 일원 아노바(One-Way Anova) 검정을 사용하여 종양 용적을 비교하였다.
실시예 1: CEA 발현과 약물 내성의 상관관계
CEA 발현은 화학요법의 내성과 상관관계가 있는 것으로 보고되었다. 본 실시예에서는 5-플루오로우라실 내성에 대한 CEA 과발현의 효과를 조사하였다.
HCT116 및 WiDr 세포를 소듐 부티레이트(0.1 mM) 또는 5-아자사이티딘(1 μM) 및 상이한 농도의 5-플루오로우라실(1.2, 2.4, 4.8, 9.6 및 19.2 μM)로 72시간 동안 공동-처리하였다. 5-플루오로우라실 처리 단독과 비교하여, 5-FU의 IC50 값은 소듐 부티레이트 또는 5-아자사이티딘으로 공동 처리된 세포에서 더 높았다(표 1 및 2). 데이터는 5-아자사이티딘 또는 소듐 부티레이트의 처리가 암 세포에서 약물 내성을 유도함을 입증하였다.
HCT116 세포에서 소듐 부티레이트 또는 5-아자사이티딘 유도 약물 내성
처리 5-플루오로우라실의 IC50
(μM)
평균 ± SD 		P-값
5-플루오로우라실 4.39 ± 3.10
소듐 부티레이트 + 5-플루오로우라실 9.40 ± 6.03 0.036
5-아자사이티딘 + 5-플루오로우라실 11.76 ± 9.05 0.020
결과는 각각 3회 중복으로 수행된 세 독립적인 실험의 평균 ± SD로 제시되었다. P-값(5-플루오로우라실 처리 그룹과 비교).
WiDr 세포에서 소듐 부티레이트 또는 5-아자사이티딘 유도 약물 내성.
처리 5-플루오로우라실의 IC50
(μM)
평균 ± SD 		P-값
5-플루오로우라실 4.67 ± 0.55
소듐 부티레이트 + 5-플루오로우라실 9.20 ± 2.74 < 0.001
5-아자사이티딘 + 5-플루오로우라실 10.81 ± 3.34 < 0.001
결과는 각각 3회 중복으로 수행된 세 독립적인 실험의 평균 ± SD로 제시되었다. P-값(5-플루오로우라실 처리 그룹과 비교).실시예 2: CEA가 양성으로 발현된 암 세포에 대한 NK92MI-CEA 세포의 효과
CEA의 발현이 조작된 NK 세포의 세포독성 효과에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해, HCT 세포, WiDr 세포 및 LS174T 세포를 먼저 유세포 분석법에 적용하여 그에 대한 CEA 발현을 결정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, LS174T는 HCT116 및 WiDr 세포와 비교하여 가장 높은 CEA 발현을 가졌다. 3종 암 세포주에 대한 NK92MI-CEA 세포의 세포독성 효과는 도 1에서 결정된 바와 같이 각각의 CEA 발현 수준과 상관관계가 있으며, 용해된 LS174T의 백분율이 세 가지 세포형 중에서 유의하게 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 2).
결과는 NK92MI-CEA 세포가 CEA-발현 암 세포에 대한 결합 친화성 및 세포독성을 나타내었고, 여기서 세포독성 효과는 CEA 발현 수준과 양의 상관관계가 있는 것으로 입증되었다.
실시예 3: 항암제로 전처리된 암 세포에 대한 NK92MI-CEA 세포의 효과
본 실시예에서는, 암 세포를 NK92MI-CEA 세포로 처리하기 전에 다양한 종류의 항암제로 먼저 처리하였다. 데이터는 특정 항암 약물(예를 들어, 5-아자사이티딘 및 소듐 부티레이트)이 암 세포를 화학요법 및 방사선요법에 내성으로 만든다고 나타냈다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 암 치료 내성은 CEA 발현과도 관련이 있다고 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음). 결과에 따르면, 5-아자사이티딘 또는 소듐 부티레이트의 투여는 암 세포에서 CEA 발현을 유의하게 증가시켰다(데이터는 나타내지 않음).
결과에 기초하여, 5-아자사이티딘 또는 소듐 부티레이트로 처리된 HCT116 세포를 NK92MI-CEA 세포와 10:1, 5:1, 1:1또는 0.5:1의 이펙터/표적 비(E/T 비)로 공동 배양하였다. 대조군(즉, HCT116 및 조작되지 않은 NK 세포의 공동 배양) 및 비처리 그룹(즉, HCT116 및 조작된 NK 세포의 공동 배양)과 비교하여, 5-아자사이티딘(도 3A) 또는 소듐 부티레이트(도 3B)의 투여는 NK92MI-CEA 세포의 세포독성 효과를 현저하게 증가시켰다.
실시예 4: 동물 모델에서 NK92MI-CEA 세포의 효과
본 실시예에서는, NK92MI-CEA 세포의 생체 내 항종양 활성을 평가하였다. 마우스를 재료 및 방법에 따라 처리하고, 데이터를 도 4A 내지 4C에 도시하였다.
도 4A의 데이터는 대조군, NaB 그룹 및 NK92MI 그룹과 비교하여, NK92MI-CEA 세포의 처리가 종양 성장을 유의하게 억제함을 나타냈다. 또한, 소듐 부티레이트의 공동 처리는 NK92MI-CEA 세포의 항종양 효과를 명백히 향상시킨 것으로 나타났다.
도 4B에 도시된 데이터로서, 소듐 부티레이트 또는 NK-92MI 세포의 처리는 대조군과 비교하여 종양 성장을 명백히 억제하지 않았다. 그러나, NK92MI-CEA 세포로의 처리에 의해, 그보다 더 NK92MI-CEA 세포 및 소듐 부티레이트의 병용 처리에 반응하여 종양 크기가 상당히 감소되었다.
ELISA 데이터는 소듐 부티레이트 단독, 또는 소듐 부티레이트와 NK92MI-CEA 세포의 병용 중 어느 하나를 받은 마우스에서 혈청 순환 CEA(cCEA)의 발현 수준이 대조군 마우스의 것(즉, PBS, NK92MI 세포 또는 NK92MI-CEA 세포로 처리됨)보다 더 높은 것으로 입증되었다(도 4C). 마우스 혈청 중 cCEA의 농도는 각각 520 pg/ml(대조군), 990 pg/ml(NaB 그룹), 200 pg/ml(NK92MI 그룹), 540 pg/ml(NK92MI-CEA 그룹), 및 870 pg/ml(NK92MI-CEA + NaB 그룹)이었다.
결론적으로, 본 개시는 치료하고자 하는 암 세포에서 TAA(예를 들어, CEA) 발현을 증가시킬 수 있는 작용제(예를 들어, 5-아자사이티딘 또는 소듐 부티레이트)를 함유하는 제1 유닛; 및 TAA에 특이적인 수용체를 발현하도록 조작된 NK 세포(예를 들어, NK92MI-CEA 세포)를 함유하는 제2 유닛을 포함하는 약학적 키트를 제공한다. 본 약학적 키트는 암, 특히 통상적인 암 치료에 반응하지 않는 암을 치료하는 데 유용하고; 따라서, 암 환자의 삶의 질 또는 수명을 향상시키기 위한 잠재적 수단을 제공한다.
상기 실시양태들에 대한 설명은 단지 예로서 주어진 것이고 다양한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시양태의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시양태가 어느 정도 특정하게, 또는 하나 이상의 개별 실시양태를 참조하여 위에서 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시양태를 상당히 변경시킬 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Johnpro Biotech Inc. <120> PHARMACEUTICAL KIT AND USES THEREOF <130> P2999-PCT <150> PCT/US62541778 <151> 2017-08-06 <160> 4 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain of CAR sequence <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser 35 40 45 Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Ile Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 145 150 155 160 Val Glu Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe 165 170 175 Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys 195 200 205 Tyr Val Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser 210 215 220 Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala 245 250 255 Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 2 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge domain of CAR sequence <400> 2 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 20 25 30 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 35 40 45 <210> 3 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> effector domain of CAR sequence <400> 3 Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr 1 5 10 15 Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 20 25 30 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 35 40 45 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 50 55 60 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro 65 70 75 80 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 85 90 95 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 100 105 110 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 115 120 125 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 130 135 <210> 4 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR sequence <400> 4 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser 35 40 45 Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Ile Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 145 150 155 160 Val Glu Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe 165 170 175 Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys 195 200 205 Tyr Val Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser 210 215 220 Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala 245 250 255 Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Pro Leu 260 265 270 Glu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 305 310 315 320 Pro Glu Phe Arg Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile 325 330 335 Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys 340 345 350 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 355 360 365 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 370 375 380 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg 385 390 395 400 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 405 410 415 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 420 425 430 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 435 440 445 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460

Claims (21)

  1. 암에서 종양 관련 항원(tumor-associated antigen, TAA)의 발현을 증가시키는 작용제를 함유하는 제1 용기; 및
    TAA에 특이적인 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 갖는 조작된 자연 살해 세포를 함유하는 제2 용기를 포함하는,
    대상에서 암을 치료하기 위한 약학적 키트.
  2. 제1항에 있어서, TAA는 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)이고,
    CAR은 서열 번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는, 약학적 키트.
  3. 제2항에 있어서, CAR이 가변 도메인의 C-말단에 위치한 힌지 도메인 및 이펙터 도메인을 추가로 포함하고, 이때 힌지 도메인 및 이펙터 도메인은 각각 서열 번호 2 및 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 키트.
  4. 제1항에 있어서, TAA는 CEA이고, CAR은 서열 번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 키트.
  5. 제1항에 있어서, 작용제가 5-아자사이티딘, 5,6-디하이드로-5-아자사이티딘, 5-아자-2'-데옥시사이티딘, 아라비노푸라노실-5-아자사이토신, 트리코스타틴 A, 페닐 부티레이트, 소듐 부티레이트, 발프로산 및 수베로일아닐리드 하이드록삼산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학적 키트.
  6. 제1항에 있어서, 암이 위암, 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 신장암, 결장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 뇌 종양, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 식도 암종, 다발성 골수종 및 두경부 편평 세포 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학적 키트.
  7. 제6항에 있어서, 암이 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법에 내성인, 약학적 키트.
  8. 대상에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 작용제 및 조작된 자연 살해 세포의 조합물의 용도로서,
    상기 작용제는 암에서 종양 관련 항원(TAA)의 발현을 증가시키고, 조작된 자연 살해 세포는 TAA에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 것인, 용도.
  9. 제8항에 있어서, TAA는 암태아성 항원(CEA)이고,
    CAR은 서열 번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는, 용도.
  10. 제9항에 있어서, CAR이 가변 도메인의 C-말단에 위치한 힌지 도메인 및 이펙터 도메인을 추가로 포함하고, 이때 힌지 도메인 및 이펙터 도메인은 각각 서열 번호 2 및 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
  11. 제8항에 있어서, TAA는 CEA이고, CAR은 서열 번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
  12. 제8항에 있어서, 작용제가 5-아자사이티딘, 5,6-디하이드로-5-아자사이티딘, 5-아자-2'-데옥시사이티딘, 아라비노푸라노실-5-아자사이토신, 트리코스타틴 A, 페닐 부티레이트, 소듐 부티레이트, 발프로산 및 수베로일아닐리드 하이드록삼산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
  13. 제8항에 있어서, 암이 위암, 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 신장암, 결장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 뇌 종양, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 식도 암종, 다발성 골수종 및 두경부 편평 세포 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
  14. 제13항에 있어서, 암이 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법에 내성인, 용도.
  15. 암에서 종양 관련 항원(TAA)의 발현을 증가시키는 작용제의 제1 유효량 및 TAA에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 조작된 자연 살해 세포의 제2 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, TAA는 암태아성 항원(CEA)이고, CAR은 서열 번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, CAR이 가변 도메인의 C-말단에 위치한 힌지 도메인 및 이펙터 도메인을 추가로 포함하고, 이때 힌지 도메인 및 이펙터 도메인은 각각 서열 번호 2 및 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, TAA는 CEA이고, CAR은 서열 번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제15항에 있어서, 작용제가 5-아자사이티딘, 5,6-디하이드로-5-아자사이티딘, 5-아자-2'-데옥시사이티딘, 아라비노푸라노실-5-아자사이토신, 트리코스타틴 A, 페닐 부티레이트, 소듐 부티레이트, 발프로산 및 수베로일아닐리드 하이드록삼산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  20. 제15항에 있어서, 암이 위암, 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 신장암, 결장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 뇌 종양, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 식도 암종, 다발성 골수종 및 두경부 편평 세포 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 암이 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법에 내성인, 방법.
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