JP2003135063A

JP2003135063A - 新規な遺伝子ｎｅｄｌ−１

Info

Publication number: JP2003135063A
Application number: JP2002116753A
Authority: JP
Inventors: Akira Nakagawara; 章中川原; Ko Miyazaki; 耕宮崎
Original assignee: Chiba Prefectural Government; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Current assignee: Chiba Prefectural Government; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Priority date: 2001-08-24
Filing date: 2002-04-18
Publication date: 2003-05-13
Also published as: EP1428891A4; WO2003018842A1; EP1428891A1; US20050064411A1

Abstract

(57)【要約】【課題】神経芽細胞腫の予後良不良に関係する遺伝子
配列を明らかにし、その遺伝子情報に基づき、予後良不
良の診断を可能にすること、並びに前記遺伝子の転写産
物であるタンパク質の機能に関する情報を提供する。【解決手段】ＮＥＤＬ−１遺伝子に由来する核酸、ま
たはＮＥＤＬ−１タンパク質を利用した核酸プローブ或
いはプライマー等からなる神経芽細胞腫の予後の診断剤
および診断用キット、並びにそれらを用いる神経芽細胞
腫の予後の診断方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、神経芽細胞腫にお
いて発現する遺伝子に由来する核酸類およびそれらがコ
ードする遺伝子発現産物に関する。さらに詳しくは、本
発明は、予後良好な神経芽細胞腫と、予後不良な神経芽
細胞腫との比較において、予後良好な神経芽細胞腫で発
現が増強されているマーカー遺伝子に由来する核酸およ
びその断片、並びにそれらの神経芽細胞腫の予後の診断
への用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】個々の腫瘍にはそれぞれの個性があり、
発癌の基本的な原理は同じであっても、その生物学的特
性は必ずしも同じではない。近年、癌の分子生物学や分
子遺伝学が急速に進歩し、発癌やいわゆる腫瘍細胞のバ
イオロジーが遺伝子レベルで説明できるようになってき
た。

【０００３】（神経芽細胞腫）神経芽細胞腫は、末梢交
感神経系細胞に由来する交感神経節細胞と副腎髄質細胞
に発生する小児癌である。この交感神経系細胞は、発生
初期の神経堤細胞が腹側へ遊走し、いわゆる交感神経節
が形成される場所で分化成熟したものである。その一部
の細胞は、さらに副腎部へ遊走し、先に形成されつつあ
る副腎皮質を貫通して髄質部に達し、そこで髄質を形成
する。神経堤細胞は、ほかの末梢神経細胞の起源ともな
っており、後根神経節（知覚神経）、皮膚の色素細胞、
甲状腺Ｃ細胞、肺細胞の一部、腸管神経節細胞などへ分
化する。

【０００４】（神経芽細胞腫の予後）神経芽細胞腫は多
彩な臨床像を示すことが特徴である（中川原：神経芽腫
の発生とその分子機構小児内科３０，１４３，１
９９８）。例えば、１歳未満で発症する神経芽細胞腫
は、非常に予後が良く、大部分が分化や細胞死を起こし
て自然退縮する。現在、広く実施されている生後６か月
時の尿のマススクリーニングで陽性となる神経芽細胞腫
の多くは、この自然退縮を起こしやすいものに属する。
一方、１歳以上で発症する神経芽細胞腫は、悪性度が高
く、多くの場合、治療に抵抗して患児を死に至らしめ
る。１歳以上の悪性度の高い神経芽細胞腫は、体細胞突
然変異（Ｓｏｍａｔｉｃｍｕｔａｔｉｏｎ）が起こ
り、モノクローナルであるのに対し、自然退縮する神経
芽細胞腫では、生殖細胞突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎ）のみの遺伝子変異でとどまっている
との仮説もある。ＫｎｕｄｓｏｎＡＧ等：Ｒｅｇｒｅ
ｓｓｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａＩＶ
-Ｓ：Ａｇｅｎｅｔｉｃｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．
ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３０２，１２５４（１９
８０）を参照。

【０００５】（神経芽細胞腫の予後を推定する遺伝子）
最近の分子生物学的研究の進展により、神経成長因子
（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）
の高親和性レセプターであるＴｒｋＡの発現が分化と細
胞死の制御に深くかかわっていることが明らかとなって
きた。ＮａｋａｇａｗａｒａＡ．，ＴｈｅＮＧＦ
ｓｔｏｒｙａｎｄｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，
ＭｅｄＰｅｄｉａｔｒＯｎｃｏｌ，３１，１
１３（１９９８）を参照。Ｔｒｋは膜貫通型レセプタ
ーでもあり、Ｔｒｋ−Ａ、Ｂ、Ｃの３つが主なものであ
る。これらＴｒｋファミリー・レセプターは、中枢神経
および末梢神経系において、特異的な神経細胞の分化と
生存維持に重要な役割を果たしている。中川原等：神経
芽細胞腫におけるニューロトロフィン受容体の発現と予
後小児外科２９：４２５−４３２，１９９７を参
照。腫瘍細胞の生存や分化は、Ｔｒｋチロシンキナーゼ
やＲｅｔチロシンキナーゼからのシグナルで制御されて
いる。なかでも、ＴｒｋＡレセプターの役割は最も重要
で、予後良好な神経芽細胞腫ではＴｒｋＡの発現が著し
く高く、これからのシグナルが腫瘍細胞の生存・分化、
または細胞死（アポトーシス）を強く制御している。一
方、予後不良な神経芽細胞腫では、ＴｒｋＡの発現が著
しく抑えられており、これに代わってＴｒｋＢ或いはＲ
ｅｔからのシグナルが生存の促進という形で腫瘍の進展
を助長している。

【０００６】また、神経の癌遺伝子であるＮ-ｍｙｃの
増幅が神経芽細胞腫の予後に関連していることも明らか
になってきた。中川原：脳・神経腫瘍の多段階発癌，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，３６４，３６６
（１９９９）を参照。この遺伝子は神経芽細胞腫で初
めてクローニングされたが、正常細胞や予後良好な神経
芽細胞腫では通常１倍体当たり１つしか存在しないのに
対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅
されているのが見つかった。

【０００７】しかしながら、現在までに、神経芽細胞腫
に発現されている癌遺伝子は、Ｎ−ｍｙｃ以外知られて
おらず、その予後の良不良に関する遺伝子情報に関して
も、Ｎ−ｍｙｃとＴｒＫＡ以外はほとんど知られていな
かった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる事情
に鑑みてなされたものであり、神経芽細胞腫の予後の良
不良に関係する遺伝子の塩基配列を明らかにし、その遺
伝子情報に基づいて、神経芽細胞腫の予後の良不良に関
する診断を可能とすることを目的とする。さらに、前記
遺伝子の転写産物であるタンパク質の機能に関する情報
を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成すべく鋭意研究を重ねた結果、神経芽細胞腫の予後を
検定し、予後良好および予後不良の臨床組織サンプルの
各々からｃＤＮＡライブラリーを作成することに成功し
た。これら２種類のｃＤＮＡライブラリーから各々約２
４００クローンをクローニングし、神経芽細胞腫の予後
の良悪によって分類し、それぞれのサブセットでプロフ
ァイリングを行った。

【００１０】そこで、本発明者は、前記サブセット間で
示差的に発現し、かつ予後の良好な臨床組織サンプルで
のみ高発現を示す遺伝子群を見出し、その一つをＮＥＤ
Ｌ−１（ｎｂｌａ００７８）と名付けた。さらに、本発
明者はＮＥＤＬ−１遺伝子の全長をシークエンスし、そ
れがコードするＮＥＤＬ−１タンパク質の機能解析を行
ったところ、ＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼであること
が判明した。

【００１１】かかる知見に基づき、本発明者は、神経芽
細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強している
遺伝子を検出およびクローニングするための遺伝子情報
（塩基配列情報等）を提供することを可能とした。さら
に、前記塩基配列情報に基づき、予後の診断方法および
そのために使用可能な診断剤等を提供することを可能と
し、本発明を完成した。

【００１２】すなわち、本発明によれば以下の(a)また
は(b)の核酸を含む核酸プローブが提供される： (a)配列表の配列番号２に示す塩基配列の一部、または
それと相補的な塩基配列を有する核酸； (b)配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる核酸と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸。

【００１３】好ましくは、前記核酸プローブにおいて、
核酸がＤＮＡである。

【００１４】また好ましくは、上記核酸プローブにおい
て、核酸が少なくとも２０個の塩基長である。

【００１５】さらに好ましくは、上記核酸プローブにお
いて、核酸が配列表の配列番号２に示す塩基配列の全長
である。

【００１６】また、本発明によれば上記の核酸プローブ
を有効成分とする神経芽細胞腫の予後診断剤が提供され
る。

【００１７】また、本発明によれば以下の(a)または(b)
のＤＮＡを含むプライマーが提供される： (a)配列表の配列番号２に示す塩基配列の一部、または
それと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ； (b)配列表の配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａ、またはそれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。

【００１８】また、本発明によれば上記のプライマーを
有効成分とする神経芽細胞腫の予後キットが提供され
る。

【００１９】さらに、本発明によれば神経芽細胞腫の臨
床組織サンプルから配列表の配列番号２に示す塩基配列
からなる核酸の有無を検出することを特徴とする、神経
芽細胞腫の予後の診断方法が提供される。

【００２０】また、本発明によれば神経芽細胞腫の臨床
組織サンプルから配列表の配列番号１に示すアミノ酸配
列からなるタンパク質の有無を神経芽細胞腫の臨床組織
サンプルから検出することを特徴とする、神経芽細胞腫
の予後の診断方法が提供される。

【００２１】加えて、本発明によれば(a)配列表の配列
番号２に示す塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩
基配列を有する核酸、または(b)配列表の配列番号２に
示す塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする核酸、またはそれと相補的な塩基
配列を有する核酸を神経芽細胞腫の臨床組織サンプルと
接触させて、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列か
らなるタンパク質の発現およびその量を分析することを
特徴とする神経芽細胞腫の予後の診断方法が提供され
る。

【００２２】従って、上記の核酸およびタンパク質は、
予後良好な神経芽細胞腫と、予後不良な神経芽細胞腫と
の比較において、予後良好な神経芽細胞腫でのみ発現が
増強されているマーカー遺伝子に由来するものであり、
該核酸およびタンパク質の配列に関する情報は神経芽細
胞腫の予後の診断を可能にすることを特徴とする。

【００２３】さらに、本発明によれば配列表の配列番号
１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分と
して含むポリユビキチン化剤が提供される。

【００２４】前記ポリユビキチン化剤において、好まし
くはユビキチン化される基質がアミロイドβ前駆蛋白
（βＡＰＰ）、アミロイドβ前駆蛋白細胞内領域（ＡＩ
ＣＤ）またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ
１）変異体である。

【００２５】また、本発明によればアミロイドβ前駆蛋
白（βＡＰＰ）の調節用組成物であって、配列表の配列
番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をアミロ
イドβ前駆蛋白の細胞内での発現、産生、または形成を
調節するのに有効な量、含むことを特徴とする調節用組
成物が提供される。

【００２６】また、本発明によればアミロイドβ前駆蛋
白（βＡＰＰ）の調節用組成物であって、配列表の配列
番号２に示す塩基配列を有する核酸をアミロイドβ前駆
蛋白の細胞内での発現、産生、または形成を調節するの
に有効な量含むことを特徴とする調節用組成物が提供さ
れる。

【００２７】さらに、本発明によれば細胞に配列表の配
列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をアミ
ロイドβ前駆蛋白（βＡＰＰ）の細胞内発現、産生、ま
たは形成を調節するのに有効な量、投与することからな
る細胞内でのアミロイドβ前駆蛋白の発現、産生、また
は形成を調節する方法が提供される。

【００２８】また、本発明によれば細胞に配列表の配列
番号２に示す塩基配列を有する核酸をアミロイドβ前駆
蛋白（βＡＰＰ）の細胞内発現、産生、または形成を調
節するのに有効な量、投与することからなる細胞内での
アミロイドβ前駆蛋白（βＡＰＰ）の発現、産生、また
は形成を調節する方法が提供される。

【００２９】また、本発明によればスーパーオキシドジ
ムスターゼ（ＳＯＤ１）活性の調節用組成物であって、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパ
ク質をスーパーオキシドジムスターゼ活性を細胞内で調
節するのに有効な量、含むことを特徴とする調節用組成
物が提供される。

【００３０】また、本発明によればスーパーオキシドジ
ムスターゼ（ＳＯＤ１）活性の調節用組成物であって、
配列表の配列番号２に示す塩基配列を有する核酸をスー
パーオキシドジムスターゼ活性を細胞内で調節するのに
有効な量、含むことを特徴とする調節用組成物が提供さ
れる。

【００３１】さらに、細胞に配列表の配列番号１に示す
アミノ酸配列からなるタンパク質をスーパーオキシドジ
ムスターゼ（ＳＯＤ１）活性を調節するのに有効な量、
投与することからなる細胞内におけるスーパーオキシド
ジムスターゼ活性を調節する方法が提供される。

【００３２】また、本発明によれば細胞に配列表の配列
番号２に示す塩基配列を有する核酸をスーパーオキシド
ジムスターゼ（ＳＯＤ１）活性を調節するのに有効な
量、投与することからなる細胞内におけるスーパーオキ
シドジムスターゼ活性を調節する方法が提供される。

【００３３】上記スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯ
Ｄ１）活性の調節用組成物および細胞内におけるスーパ
ーオキシドジムスターゼ活性を調節する方法において、
好ましくはＳＯＤ１がその変異型である。

【００３４】

【発明の実施の形態】以下、本発明に係る予後良好な神
経芽細胞腫に高発現する遺伝子（以下、「本発明のＮＥ
ＤＬ−１遺伝子」或いは単に「ＮＥＤＬ−１遺伝子」と
いう）に由来する核酸（以下、「本発明に係る核酸」と
いう）、および該遺伝子がコードするタンパク質（以
下、ＮＥＤＬ−１タンパク質という）について本発明の
好適な実施の形態を参照して、詳細に説明する。

【００３５】本発明に係る核酸は、上述のごとく本発明
のＮＥＤＬ−１遺伝子に由来するものであり、該遺伝子
を構成するか或いは該遺伝子からインビボまたはインビ
トロの過程によって得られる。該核酸の塩基長に特に制
限はなく、ここでは前記遺伝子の一部に対応する核酸断
片も含めて本発明に係る核酸という。塩基長が短い場
合、その核酸は化学的手法で合成することができる。本
明細書で使用する「核酸」という用語は、例えばＤＮＡ
またはＲＮＡ、或いはそれから誘導された活性なＤＮＡ
またはＲＮＡであるポリヌクレオチドを指し、好ましく
は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。特に好ましい核酸
は、本明細書中に開示されるヒトｃＤＮＡ配列と同一
か、または相補的な配列を有する。

【００３６】また、本明細書で使用する「ストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、２
つの核酸（または断片）が、サムブルックら（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の
発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅ
ｎｅｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２および１１．４５
−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件
下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。

【００３７】より具体的には、前記「ストリンジェント
な条件」とは、約４５℃において６．０ｘＳＳＣでハイ
ブリダイゼーションを行った後に、５０℃において２．
０ｘＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシー
の選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ス
トリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃か
ら、高ストリンジェンシーとしての約０．２ｘＳＳＣ、
５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程
の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃か
ら、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで高くする
こともできる。

【００３８】また、本明細書で使用する「核酸」という
用語は、単離された核酸を指し、これは組換えＤＮＡ技
術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的
に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質ま
たはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸または
ポリヌクレオチドを指す。

【００３９】また、本明細書で使用する「予後良好」と
は、神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、
または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指
し、これはＮ−ｍｙｃその他の腫瘍マーカー（Ｔｒｋ
Ａ、染色体異常等）から判断して、悪性度が低いと医師
によって判断される。本発明の好適な実施の形態では、
病期１または２、発症年齢が１歳未満、手術後５年以上
再発なく生存し、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認め
られない症例を予後良好としたが、このような特定の例
には限定されない。また、本明細書で使用する「予後不
良」とは、神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められ
る状態を指し、これはＮ−ｍｙｃその他の公知の腫瘍マ
ーカーから判断して、悪性度が高いと医師によって判断
される。本発明の好適な実施の形態では、病期４、発症
年齢が１歳以上、手術後３年以内に死亡、臨床組織サン
プル中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められた症例を予後不良
としたが、このような特定の例には限定されない。

【００４０】神経芽細胞腫は、ヒトでは２種類しか知ら
れていない神経細胞そのものの腫瘍の１つであり、そこ
で発現している遺伝子を解析することは、神経細胞のバ
イオロジーを理解する上で非常に有用な知見をもたらす
ものと考えられる。すなわち、脳や末梢神経から、部位
特異的な均質な組織を得ることは極めて困難で、事実上
不可能である。一方、神経芽細胞腫は、末梢交感神経細
胞に由来するほぼ均一な神経細胞集団（腫瘍化してはい
るが）から成り、均質に発現している神経関連遺伝子が
得られる可能性が高い。また、神経芽細胞腫は癌である
ため、神経発生の未熟な段階で発現している重要な遺伝
子が多いことも特徴として挙げられる。

【００４１】さらに、神経芽細胞腫は、予後の良好なも
のと予後の不良なものとが臨床的、生物学的にはっきり
区別される。予後良好な神経芽細胞腫の癌細胞は、増殖
速度が極めて遅く、ある時点から自然退縮を始めること
が特徴である。これまでの知見から、この自然退縮で
は、神経細胞の分化およびアポトーシス（神経細胞死）
が起こっており、正常神経細胞の成熟段階で起こる分化
とプログラム細胞死と非常によく似た現象であることが
分かってきた。従って、この腫瘍で発現している遺伝子
を解析することによって、神経の分化やアポトーシスに
関連した重要な遺伝子情報を入手できる可能性が極めて
高い。

【００４２】上記の有用な遺伝子情報を入手できる遺伝
子であるＮＥＤＬ−１遺伝子およびそれがコードするＮ
ＥＤＬ−１タンパク質は、予後良好な神経芽細胞腫の臨
床組織に見出されたものであり、かかる遺伝子およびタ
ンパク質は以下のような特徴を有する。

【００４３】本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子は全長６２０
０塩基（コード領域４７５５塩基）を有する遺伝子であ
り、その塩基配列を配列表の配列番号２に示す。該遺伝
子がコードするＮＥＤＬ−１タンパク質は、１５８５個
のアミノ酸からなり、その全長を配列表の配列番号１に
示す。なお、前記塩基配列およびアミノ酸配列は、Ｇｅ
ｎｅＢａｎｋ( HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.go
v.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)に受理番号ＡＢ０
４８３６５として登録されている。

【００４４】本発明者は、ＮＥＤＬ−１遺伝子およびＮ
ＥＤＬ−１タンパク質の構造・機能解析の結果から、Ｎ
ＥＤＬ−１がＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼであること
も見出した。ＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼ・ファミリ
ーの一員であることが知られているＫＩＡＡ０３２２タ
ンパク質（ＮＥＤＬ２）とＮＥＤＬ−１タンパク質との
ホモロジー解析の結果を図１に示す。ＮＥＤＬ−１タン
パク質は、ＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼの特徴である
以下のドメインを有する。すなわち、(1)Ｃ末端領域に
ＨＥＣＴドメイン(約３００アミノ酸)、ＮＥＤＬ−１で
１２８０〜１５８５位；(2)中央部に複数個のＷＷドメ
イン(約３５〜４０アミノ酸)、ＮＥＤＬ−１で８０７〜
８４１位と９９８〜１０３０位、ＮＥＤＬ２で８０６〜
８４０位；(3)Ｎ末端領域にカルシウム依存的に膜脂質
に結合するＣ２ドメイン、ＮＥＤＬ−１で１８５〜２９
５位、ＮＥＤＬ２で１８６〜２９５位である。さらに、
ＮＥＤＬ−１タンパク質は、ＨＥＣＴ型ユビキチンリガ
ーゼであるＮｅｄｄ４と同程度のユビキチンリガーゼ活
性を示すことが分かった。

【００４５】タンパク質は、ユビキチン−プロテアゾー
ム系で分解されているので、このシステムは適正な細胞
プロセスに必須のものである。簡単には、該システムは
分解すべき標的タンパク質にユビキチン分子（Ｕｂ）を
多数結合させ（ポリユビキチン化またはユビキチン化と
いう）、ユビキチン化されたタンパク質は２６Ｓプロテ
アゾームによって分解される。タンパク質のユビキチン
化は、一連の酵素群、すなわちユビキチン活性化酵素
（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチ
ン連結酵素（ユビキチンリガーゼ）（Ｅ３）の触媒作用
によって進行することが明らかにされている（例えば総
説として、実験医学、田中啓二「ユビキチンとプロテア
ソーム」１８巻、１１号、１４５２〜１４５６頁、２０
００年（羊土社）を参照）。このうち、ユビキチンリガ
ーゼ（Ｅ３）がＥ２−ＵｂからＵｂを受け取り、このＵ
ｂを標的タンパク質（基質）に連結させる。したがっ
て、ユビキチンリガーゼが特定のタンパク質をユビキチ
ン化する特異性に最も関与すると考えられている。

【００４６】ユビキチン−プロテアゾーム系の異常（ユ
ビキチン代謝異常）は、多くの疾患と関連していること
が指摘されてきた（Ｒ.Ｊ.Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ.Ｂｉｏｐｈｓ. Ａｃｔａ１０８９: １４１-１５７
（１９９１））。最近、神経変性疾患とユビキチン代謝
異常の関係が注目されてきており、ユビキチンリガーゼ
として知られているＥ６−ＡＰがアンジェルマン症候群
の責任遺伝子の１つであることが報告されている（実験
医学、本多慶臣ら「ＨＥＣＴ型ユビキチン連結酵素：生
理機能と病態」１８巻、１１号、１４８３〜１４９０
頁、２０００年（羊土社））。したがって、ＨＥＣＴ型
ユビキチンリガーゼの一種である本発明のＮＥＤＬ−１
タンパク質も神経組織に高発現されることから、神経変
性疾患の原因遺伝子産物を基質とすることが充分予想さ
れる。それらの原因遺伝子産物は、アルツハイマー病に
おけるアミロイドβ前駆蛋白（βＡＰＰ）およびプレセ
リニンタンパク質（ＰＳ）等が考えられる。

【００４７】実際、後述の実施例に記載されているよう
に、ＮＥＤＬ−１がアミロイド前駆蛋白のコード領域で
あるアミロイドβ前駆蛋白細胞内領域（ＡＩＣＤ−amyl
oidbeta precursor intraceller domain）と相互作用す
ることが見出された。この相互作用は、さらにＮＥＤＬ
−１がΒＡＰＰおよびＡＩＣＤをユビキチン化すること
によるものであることが確かめられた。

【００４８】アミロイドは、アルツハイマー病患者の脳
血管や老人斑に異常なレベルで沈着する蛋白であるが、
これは主に分子量４kDaのβ蛋白から構成されており、
アミロイド前駆蛋白がセクレターゼで切り出されること
で産生される。ＮＥＤＬ−１とＡＩＣＤが直接相互作用
するという事実は、ＮＥＤＬ−１がβＡＰＰ（さらにβ
-アミロイド）の産生を直接或いは間接的に制御してい
る可能性があり、β-アミロイドの産生低下を分子標的
としたアルツハイマー病治療戦略を考慮する上で極めて
重要な知見となる。

【００４９】また、後述の実施例に記載されているよう
に、ＮＥＤＬ−１はスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ
ＯＤ１）変異体と相互作用することが見出された。これ
は、さらにＮＥＤＬ−１がＳＯＤ１変異体をユビキチン
化することによるものであることが確かめられた。

【００５０】筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は，運動ニ
ューロンの変性・脱落により筋萎縮を生じる、予後不良
の神経変性疾患である。現在、家族性のＡＬＳは、ＡＬ
Ｓ全体の５〜１０％の頻度で認められるが、その一部の
家系でその原因遺伝子が、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシド
ジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子であることが判明して
いる。ＳＯＤ１は、好気性代謝の過程で細胞内に生じる
活性酵素の一種であるスーパーオキサイドを不活化する
酵素であり、この低下により、神経細胞が変性する可能
性はあるものの、その機序の詳細は不明である。その他
の一般的な筋萎縮性側索硬化症についても、原因は不明
である。

【００５１】現在、ウイルス説、中毒説、神経栄養因子
の欠乏説、自己免疫性説、グルタミン酸過剰説、フリー
ラジカル説などが考えられているがＡＬＳで、運動神経
のみが変性する病理機序については、まだ決定的なもの
は判明していない。近年，変異ＳＯＤ１が細胞内で凝集
体を形成し，細胞毒性を発揮するという凝集体仮説が最
も有力なものとされつつある。

【００５２】現在ＳＯＤ１の変異体は約８０個報告され
ているが、これら変異体のいずれも細胞内の情報伝達経
路は不明なままである。変異ＳＯＤ１２種（Ｇ８５Ｒ/
Ｇ９３Ａ）については相互作用分子の報告があり、これ
らの変異体とのみ結合し，正常ＳＯＤ１とは結合しない
蛋白因子としては，lysyl-tRNA synthetaseとtransloco
n-associated protein deltaの２種類のみが判明してい
るだけであり(Kunst CB, Mezey E, Brownstein MJ, Pat
terson D. Mutations in SOD1 associated with amyotr
ophic lateral sclerosis cause novel protein intera
ctions.Nat Genet. 1997 Jan;15(1):91-4.)、その詳細
は未だ解明されていない。このようにＡＬＳが初めて報
告されてから約１３０年経過する現在でも変異ＳＯＤ１
が新たに獲得するとされる細胞毒性の細胞内情報伝達経
路の解明は行き詰まりともいえる状況である。以上の現
況を考慮すると本発明で得られた結果は、未だ解明され
ていないＡＬＳの発症メカニズムの解明に極めて重要な
知見を提供しているといえる。

【００５３】ＮＥＤＬ−１タンパク質は、配列表の配列
番号１に示すアミノ酸配列を有するが、本発明は、配列
表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは
複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された
アミノ酸配列を有するタンパク質をも包含する。

【００５４】また、本発明にはＮＥＤＬ−１タンパク質
等の塩も包含される。このような塩としては特に制限は
ないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシ
ウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩が好ましい。

【００５５】また、多くのタンパク質には糖鎖が付加さ
れ、アミノ酸を１若しくは複数変換することにより糖鎖
の付加を調節することができる。従って、配列表の配列
番号１に示すアミノ酸配列において、前記糖鎖の付加を
調節されたタンパク質も本発明に包含される。

【００５６】また、ＮＥＤＬ−１タンパク質をコードす
る塩基配列を有する核酸も本発明に含まれる。ここで、
「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖であ
る場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質を
コードする塩基配列を有することを意味するため、本発
明に係る核酸には配列表の配列番号１に示すアミノ酸配
列を直接コードする塩基配列からなる核酸、若しくはそ
の相補的な塩基配列からなる核酸をも包含される。

【００５７】さらに、本発明に係る核酸は、配列番号２
に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする核酸であってもよく、この条件
を満たす限りにおいてはその塩基配列は特に制限されな
い。さらに、本発明の核酸には前記ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする核酸に相補的な塩基配列を
有する核酸も包含され、具体的には、例えば、配列番号
２に示す塩基配列を有する核酸または前記核酸に相補的
な塩基配列を有する核酸の塩基のいくつかに欠失、置
換、挿入、付加がある核酸が挙げられる。ここで、欠
失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、
置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い
欠失、置換、挿入、付加も含む。

【００５８】神経芽細胞腫の予後良好なものと、不良な
ものとの臨床組織サンプルにおける本発明のＮＥＤＬ−
１遺伝子の発現量を比較した結果、顕著な差が認められ
た。すなわち、この遺伝子は、予後良好な神経芽細胞腫
で発現が増強されていた。したがって、配列番号２に示
す塩基配列は、上記の様々に有用な遺伝子情報以外に、
その配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出す
ることによって神経芽細胞腫の良不良を診断する腫瘍マ
ーカーの情報として利用可能である。また、配列番号１
に示すアミノ酸配列も、その配列情報に基づいて本発明
のＮＥＤＬ−１タンパク質を検出することによって神経
芽細胞腫の良不良を診断する腫瘍マーカーの情報として
利用可能である。

【００５９】すなわち、本発明は、本発明のＮＥＤＬ−
１遺伝子およびＮＥＤＬ−１タンパク質を用いて、神経
芽細胞腫およびそれに関連する様々な遺伝子情報を以下
の手段により得ることを可能とする。

【００６０】（１）ハイブリダイゼーションに用いる
プローブ本発明の１つの実施の形態に従えば、本発明に係る核酸
をハイブリダイゼーションのプローブ（すなわち、本発
明の核酸プローブ）として使用することによって、神経
芽細胞腫で発現している本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子を
検出することが可能である。さらに、本発明に係る核酸
をハイブリダイゼーションのプローブとして使用し、様
々な腫瘍、正常組織における遺伝子発現を調べることに
よって、該遺伝子発現の分布を同定することも可能であ
る。

【００６１】本発明に係る核酸をハイブリダイゼーショ
ンのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーシ
ョン法自身については、特に限定はない。好適な方法と
して、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、サザン
ハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレ
イ法等が挙げられる。

【００６２】前記ハイブリダイゼーションの１つの応用
例として、本発明に係る核酸をノザンハイブリダイゼー
ションのプローブとして用い、検定したい臨床組織サン
プル中においてｍＲＮＡの長さを測定することや、本発
明のＮＥＤＬ−１遺伝子発現を定量的に検出することが
可能である。

【００６３】また別の応用例として、本発明に係る核酸
をサザンハイブリダイゼーションのプローブとして用
い、検定したい臨床組織サンプルのゲノムＤＮＡ中、該
ＤＮＡ配列の有無を検出することが可能である。

【００６４】さらに別の応用例として、本発明に係る核
酸をＦＩＳＨ法のプローブとして用い、本発明のＮＥＤ
Ｌ−１遺伝子の染色体上の位置を同定することも可能で
ある。

【００６５】さらに別の応用例として、本発明に係る核
酸をＩＳＨ法のプローブとして用い、本発明のＮＥＤＬ
−１遺伝子の発現の組織分布を同定することも可能であ
る。

【００６６】本発明に係る核酸をハイブリダイゼーショ
ン用プローブとして使用する場合、少なくとも２０個の
塩基長が必要であり、本発明に係る核酸のうち、２０個
以上の連続した塩基からなる核酸が好ましく用いられ
る。より好ましくは、４０個以上の連続した塩基からな
る核酸が用いられる。特に好ましくは、６０個以上の連
続した塩基からなる核酸が用いられる。さらに、配列番
号２に示す塩基配列の全長からなる核酸を用いてもよ
い。

【００６７】当業者にとって、上記各種のハイブリダイ
ゼーションにおける核酸プローブ技法は周知であり、例
えば、個々の長さの本発明の核酸プローブと、目的とす
るポリヌクレオチドとの適当なハイブリダイズ条件は容
易に決定することができる。種々の長さを含むプローブ
に対し至適なハイブリダイズ条件を得るためのかかる操
作は、当業者では周知であり、例えばサンブルックら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（前掲）を参照して、行えばよ
い。

【００６８】好ましくは、本発明の核酸プローブは、容
易に検出されるように標識される。検出可能な標識は、
目視によって、または機器を用いるかのいずれかによっ
て検出され得るいかなる種類、元素または化合物であっ
てもよい。通常使用される検出可能な標識としては、放
射性同位元素、アビジンまたはビオチン、蛍光物質（Ｆ
ＩＴＣまたはローダミン等）が挙げられる。前記放射性
同位元素は、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、³Ｈ、³⁵Ｓ等である。
また、ビオチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレ
ーション、化学的または酵素的手段によって、核酸に組
み込むことができる。ビオチン標識されたプローブは、
アビジン／ストレプトアビジン、蛍光標識、酵素、金コ
ロイド複合体等などの標識手段を使用したハイブリダイ
ゼーションの後検出される。また、本発明の核酸プロー
ブは、タンパク質と結合させることによって標識されて
もよい。その目的で、例えば放射性または蛍光ヒストン
一本鎖結合タンパク質が使用される。このようにして、
適当に標識されたプローブは、本発明の予後診断剤を構
成する。

【００６９】（２）ＰＣＲに用いるプライマー本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子を検出するには上記のハイ
ブリダイゼーション法の他に、本発明に係る核酸に含ま
れる任意の核酸（ＤＮＡ）配列からプライマーを設計し
て、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉ
ｏｎ（ＰＣＲ）法を用いることにより可能である。例え
ば、検定したい臨床組織サンプルからｍＲＮＡを抽出
し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定
することが可能である。このような方法は、当業者にと
って周知の方法に従って行われるが、例えば、サンブル
ックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（前掲）、および遺
伝子病入門（高久史麿著：南江堂）が参照される。

【００７０】本発明に係る核酸（ＤＮＡ）をＰＣＲ用プ
ライマー（すなわち、本発明のプライマー）として使用
する場合、１０ないし６０個の塩基長が必要であり、本
発明に係る塩基配列の一部であって、１０ないし６０個
の連続した塩基を有する核酸が好ましく用いられる。よ
り好ましくは、１５ないし３０個の塩基を有するものが
用いられる。また一般的には、プライマー配列中のＧＣ
含量が４０ないし６０％のものが好ましい。さらに、増
幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差がないこと
が望まれる。また、プライマーの３'末端でアニールせ
ず、プライマー内で２次構造をとらないことも望まし
い。

【００７１】（３）遺伝子のスクリーニング本発明に係る核酸を使用することによって、様々な組織
や細胞で発現している本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子の発
現分布を検出することが可能である。これは例えば、本
発明に係る核酸を上記のようにハイブリダイゼーション
のプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用する
ことによって、可能となる。

【００７２】また、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を
用いても遺伝子の発現分布を検出することが可能であ
る。すなわち、本発明に係る核酸を直接、前記チップ、
アレイ上に張り付けことが出来る。そこに臨床組織サン
プルから抽出したｍＲＮＡを蛍光物質などで標識し、ハ
イブリダイズさせ、その遺伝子がどの様な組織の細胞で
高発現しているかを解析することが可能である。またチ
ップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは、本発明に係る核
酸をプローブとして用いたＰＣＲの反応産物であっても
よい。

【００７３】（４）腫瘍の予後診断の方法およびそのた
めに使用可能な腫瘍マーカー上述のように本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子は、予後良好
な神経芽細胞腫で発現が増強されていた。そこで、本発
明に係る核酸をハイブリダイゼーションのプローブ或い
はＰＣＲのプライマーとして使用し、被験者から採取し
た、臨床組織を含むサンプル中で、前記遺伝子の発現の
増強の有無を調べることにより予後診断が行える。遺伝
子の検出方法としては、前述のノーザンブロットハイブ
リダイゼーション法、インサイチュハイブリダイゼーシ
ョン法、およびＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。

【００７４】ハイブリダイゼーション法を用いるとき、
サンプル中で前記核酸プローブとハイブリダイズする核
酸の量が増強する場合、予後が良好であると診断でき
る。また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いるとき、サンプルから
ｍＲＮＡを抽出し、これをＤＮＡに逆転写して、前記プ
ライマーにより増幅するＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、遺伝
子発現を半定量的に測定する。このようにして遺伝子発
現の増強が認められる場合、予後が良好であると診断で
きる。この特定の診断目的のためには、該プライマーを
必須成分として一組含有する診断用キットを用いること
が好ましい。該診断用キットは、プライマー成分以外
に、ＰＣＲ用の緩衝液、洗浄液、および酵素等の公知の
成分を含む。

【００７５】（６）アンチセンスオリゴヌクレオチド本発明の別の実施の形態に従えば、本発明に係る核酸に
対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明に係る
核酸にハイブリダイズすることが可能であり、アンチセ
ンスＤＮＡとアンチセンスＲＮＡとを含む。アンチセン
スＤＮＡは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を阻害し、ア
ンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。この
ようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、自動合成機
を使用して、または本発明に係る核酸を鋳型とするＰＣ
Ｒ法により合成できる。さらに、該アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、ＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選
択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性が
高められたアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体をも
包含する。このような誘導体は、公知のアンチセンス技
術を用いて、合成することができる。

【００７６】ｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソー
ム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列
に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、該ＲＮＡの合成を阻止することができ、特に遺伝
子の発現抑制効果が高い。従って、本発明は、かかるア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを好適に包含する。

【００７７】（６）遺伝子治療本発明の別の実施の形態に従えば、遺伝子治療に用いら
れる治療用遺伝子をコードする核酸配列が提供される。
そこで、本発明に係る核酸を遺伝子運搬に使用されるベ
クターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入
遺伝子（本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子）を発現させ、例
えば神経変性疾患の遺伝子治療に用いることができる。

【００７８】１．ベクター導入されうるウイルスベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ
ウイルスをもとに作製できる。このようなベクターは、
ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクタ
ー、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のい
かなるウイルスベクターであってもよい。また、ウイル
スベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種
ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝
子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウイルスの
核酸配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベク
ターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タン
パク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイ
ルス（ＶｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉ
ｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタ
ンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが
挙げられる［ＮａｌｄｉｎｉＬ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７２２６３−（１９９６）］。さらに、治療効果を
持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイル
スもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス
以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合
体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイル
スリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリ
アー等が使用可能である。さらに遺伝子導入系としては
エレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能であ
る。

【００７９】２．発現プロモーターさらに、治療用遺伝子に用いられる発現カセットは、標
的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれ
ば、特に制限されることなくいかなるものでも用いるこ
とができる。当業者はそのような発現カセットを容易に
選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内
で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好まし
くは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カ
セットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺
伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに
用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイル
ス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シ
ミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペ
スウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイル
ス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウ
イルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイル
ス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣ
ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等の
ウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱
ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来の
プロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモ
ーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現
が誘導されるプロモーターを含む。

【００８０】（７）医薬品本発明の別の実施の形態として、医薬品に用いられる治
療用タンパク質及びペプチドが提供される。本発明を実
施する際に考慮されるように、本発明のＮＥＤＬ−１タ
ンパク質およびその一部であるペプチドを任意の調製法
にて調製し、任意の投与法、投与量にて用いることで、
例えば各種悪性腫瘍、或いは神経変性疾患（例えば、ア
ルツハイマー病）の治療に用いることができる。

【００８１】１．調製法医薬品は、例えば上記に示すような治療用にデザインさ
れた薬物遺伝子を含む組換えウイルスベクターとして調
製される。より具体的に言えば、ＮＥＤＬ−１遺伝子を
含む組換えウイルスベクターを、水、生理食塩水、等張
化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで調製でき
る。また任意に製造されたＮＥＤＬ−１タンパク質を同
様に水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒
に溶解することで調製することも可能である。その際、
ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、
コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加しても調
製可能である。

【００８２】２．投与法、投与量上記医薬品の生体への投与の方法については特に制限は
ない。例えば非経口的投与、例えば注射投与することに
より好ましく実施できる。その医薬品の使用量は、その
使用方法、使用目的等により異なり、当業者は容易に適
宜選択最適化することが可能である。例えば、注射投与
して用いる場合には、１日量約０．１μｇ／ｋｇ〜１０
００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましく
は、１日量約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。

【００８３】（８）抗体、アンチセンス、リボザイム、
ＴＦＯ本発明のさらに別の実施の形態として、本発明のＮＥＤ
Ｌ−１タンパク質のユビキチンリガーゼ活性を抑制する
抗体、及び本発明のＮＥＤＬ−１遺伝子の発現を抑制す
るアンチセンス、リボザイム、ＴＦＯ等の塩基配列が提
供される。本発明を実施する際に考慮されるように、こ
れらのアンチセンス、リボザイム、ＴＦＯをコードする
核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任
意の発現プロモーターにより導入遺伝子を発現させ、例
えば初代培養細胞の株化や癌のモデル動物作製に用いる
ことができる。

【００８４】（９）遺伝子改変動物本発明のさらに別の実施の形態として、本発明のＮＥＤ
Ｌ−１遺伝子の発現をノックアウトする核酸配列、及び
ノックアウト動物（ノックアウトマウス等）が提供され
る。また、前記遺伝子を強制発現したトランスジェニッ
ク動物（トランスジェニックマウス等）、遺伝子に点変
異や欠失等の任意の変異を導入した変異遺伝子が導入さ
れた遺伝子改変動物等が提供される。このような遺伝子
改変動物は、例えば神経変性疾患のモデル動物作製に用
いることができる。

【００８５】以上説明したように、本発明のＮＥＤＬ−
１遺伝子またはタンパク質若しくはこれらから得られる
情報を利用することにより、臨床組織サンプルから該Ｎ
ＥＤＬ−１遺伝子を検出することが可能となり、神経芽
細胞腫の予後の良悪の診断が可能となる。また、前記遺
伝子若しくはタンパク質、まはこれらから得られる情報
を利用することにより、予後の診断方法および前記方法
に使用可能な腫瘍マーカーを設計することが可能とな
る。

【００８６】以下、実施例に即してさらに詳しく説明す
るが、本発明の技術的範囲はこれらの例に限定されるも
のではない。

【００８７】

【実施例】（製造例１）神経芽細胞腫からのｃＤＮＡラ
イブラリーの構築１．試料入手神経芽細胞腫の臨床組織サンプルを手術摘出直後に準無
菌的に凍結し、その後−８０℃に保存した。

【００８８】２．予後良好な試料の選別１で得られた試料について予後の検定を以下の指標をも
とに行った。

【００８９】予後良好：予後不良：・病期１または２・病期４・発症年齢が１歳未満・発症年齢が１歳以上・手術後５年以上再発なく生存・手術後３年以内に死亡・Ｎ-ｍｙｃの増幅なし・Ｎ-ｍｙｃ増幅あり上記２つの試料において、Ｎ-ｍｙｃ増幅は下記のよう
にして確認した。

【００９０】上記１で得られたサンプルを剃刀で細かく
切断し、５ｍｌのＴＥＮバッファー（５０ｍＭＴｒｉ
ｓ―ＨＣＬ（ｐＨ＝８．０）／１ｍＭＥＤＴＡ／１０
０ｍＭＮａＣｌ）を加えよくホモジナイズした。この
混合液に７５０μｌのＳＤＳ（１０％）、１２５μｌの
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、
軽く混和し、５０℃で８時間放置した。その後、フェノ
ール・クロロホルム処理を行い、最後にエタノール沈殿
により、ゲノムＤＮＡを精製した。５μｇの得られたゲ
ノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社製）で完全
に消化し、Ｎ-ｍｙｃのプローブを用いてサザンハイブ
リダイゼーションによりＮ-ｍｙｃ増幅を調べた。

【００９１】３．予後良好な神経芽細胞腫の臨床組織か
らｍＲＮＡの調製上記２において予後良好であると判定された神経芽細胞
腫の臨床組織サンプル２〜３ｇをＴｏｔａｌＲＮＡ
ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＧＥＮ社製）用い
て処理し、トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータ
ルＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースカラム（Ｃｏｌｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ社製）を用いて、ｐｏｌｙＡ構造を有
するｍＲＮＡのプールを精製した。

【００９２】４．ｍＲＮＡの脱リン酸化上記３において調製した１００〜２００μｇのｍＲＮＡ
のプールを６７．３μｌの０．１％ジエチルピロカーボ
ネート（ＤＥＰＣ）を含む蒸留滅菌水に溶解させ、２０
μｌの５ｘＢＡＰバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０
０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）／メルカプトエタノール（５０
ｍＭ）］、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／
μｌ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、１０μｌのＢＡＰ（０．
２５ｕｎｉｔ／μｌ、バクテリア由来アルカリフォスフ
ァターゼ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を３７℃
で１時間反応させ、ｍＲＮＡの５'末端の脱リン酸化処
理を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理を
２回行い、最後にエタノール沈殿により、脱リン酸化ｍ
ＲＮＡのプールを精製した。

【００９３】５．脱リン酸化ｍＲＮＡの脱キャップ処理上記４において調製した脱リン酸化ｍＲＮＡのプールの
全量を７５．３μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌
水に溶解させ、２０μｌの５ｘＴＡＰバッファー［酢酸
ナトリウム（２５０ｍＭ、ｐＨ＝５．５）／メルカプト
エタノール（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ、ｐＨ＝
８．０）］、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ
／μｌ）、２μｌのＴＡＰ（ＴｏｂａｃｃｏＡＩＣＤ
ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：２０ｕｎｉｔ／μ
ｌ）］を加えた。この混合液を３７℃で１時間反応さ
せ、脱リン酸化ｍＲＮＡの５'末端の脱キャップ処理を
行った。この際、キャップ構造を持たない不完全長の脱
リン酸化ｍＲＮＡは脱キャップ処理されず５'末端は脱
リン酸化された状態に留まる。その後、フェノール・ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿により、脱キャップｍ
ＲＮＡのプールを精製した。

【００９４】６．オリゴキャップｍＲＮＡの調製上記５において調製した脱キャップｍＲＮＡのプールの
全量を１１μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に
溶解させ、４μｌの５'−オリゴＲＮＡ（５'−ＡＧＣＡ
ＵＣＧＡＧＵＣＧＧＣＣＵＵＧＧＣＣＵＡＣＵＧＧ−
３'：１００ｎｇ／μｌ）、１０μｌの１０ｘｌｉｇａ
ｔｉｏｎバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５００ｍＭ、
ｐＨ＝７．０）／メルカプトエタノール（１００ｍ
Ｍ）］、１０μｌの塩化マグネシウム（５０ｍＭ）、
２．５μｌのＡＴＰ（２４ｍＭ）、２．５μｌのＲＮａ
ｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、１０μｌのＴ４ＲＮ
Ａｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔ／μｌ：宝酒造社
製）、５０μｌのポリエチレングリコール（５０％ｗ／
ｖ、ＰＥＧ８０００：シグマ社製）を加えた。この混合
液を２０℃で３時間反応させ、脱キャップｍＲＮＡの
５'末端に５'−オリゴＲＮＡを連結した。この際、キャ
ップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化ｍＲＮＡは、
５'−オリゴＲＮＡが連結されない。その後、フェノー
ル・クロロホルム処理、エタノール沈殿により、オリゴ
キャップｍＲＮＡのプールを精製した。

【００９５】７．オリゴキャップｍＲＮＡからのＤＮＡ
除去上記６において調製したオリゴキャップｍＲＮＡのプー
ルを７０．３μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水
に溶解させ、４μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ＝
７．０）、５．０μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１６μｌ
の塩化マグネシウム（５０ｍＭ）、２．７μｌのＲＮａ
ｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＤＮａｓｅＩ
（５ｕｎｉｔ／μｌ：宝酒造社製）を加えた。この混合
液を３７℃で１０分間反応させ、余分なＤＮＡを分解し
た。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿、カラム精製（Ｓ−４００ＨＲ：ファルマシアバ
イオテック社製）により、ＤＮＡ（−）オリゴキャップ
ｍＲＮＡのプールを精製した。

【００９６】８．１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの調
製上記７において調製したＤＮＡ（−）オリゴキャップｍ
ＲＮＡのプールをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ラ
イフテックオリエンタル社製キット）を用いて逆転写
し、１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのプールを得た。
ＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールを２１μ
ｌの滅菌蒸留水に溶解させ、１０μｌの１０ｘＦｉｒｓ
ｔＳｔｒａｎｄバッファー（キット付属品）、８μｌ
のｄＮＴＰｍｉｘ（５ｍＭ、キット付属品）、６μｌの
ＤＴＴ（０．１Ｍ、キット付属品）、２．５μｌのオリ
ゴーｄＴアダプタープライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ、
５'−ＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＧＴＧ
ＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３'）、
２．０μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２
μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴａｓｅ
（キット付属品）を加えた。この混合液を４２℃で３時
間反応させ、逆転写反応を行った。その後、フェノール
・クロロホルム処理、アルカリ処理、中和処理にて全て
のＲＮＡを分解し、エタノール沈殿で精製した。

【００９７】９．２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの調
製上記８において調製した１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮ
ＡのプールをＧｅｎｅＡｍｐ（パーキンエルマー社製キ
ット）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。１ｓｔｓｔｒ
ａｎｄｃＤＮＡのプールを５２．４μｌの滅菌蒸留水
に溶解させ、３０μｌの３．３ｘＲｅａｃｔｉｏｎバッ
ファー（キット付属品）、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ
（２．５ｍＭ、キット付属品）、４．４μｌの酢酸マグ
ネシウム（２５ｍＭ、キット付属品）、１．６μｌのプ
ライマーＦ（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５'−ＡＧＣＡＴＣ
ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧ−３'）、１．６μｌ
のプライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５'−ＧＣＧＣ
ＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＧＴ−３'）、２μｌの
ｒＴｔｈ（キット付属品）を加えた。この混合液に、１
００μｌのミネラルオイルを静かに加え重層した。この
反応液を９４℃ で５分間変性させた後、９４℃、１分
間、５２℃、１分間、７２℃、１０分間を１サイクルと
して１２サイクル繰り返し、さらに７２℃で１０分間放
置しＰＣＲ反応を行った。その後、フェノール・クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿で精製し、２ｎｄｓｔｒ
ａｎｄｃＤＮＡのプールを得た。

【００９８】１０．２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの
ＳｆｉＩ処理上記９において調製した２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮ
Ａのプールを８７μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、１０ｘ
ＮＥＢバッファー（ＮＥＢ社製）、１００ｘＢＳＡ（ウ
シ血清アルブミン、ＮＥＢ社製）、２μｌのＳｆｉＩ
（制限酵素、２０ｕｎｉｔ／μｌ、ＮＥＢ社製）を加え
た。この混合液を５０℃で一晩反応させ、ＳｆｉＩによ
る制限酵素処理を行った。その後、フェノール・クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿で精製し、両末端がＳｆｉ
Ｉ処理されたｃＤＮＡのプールを得た。

【００９９】１１．ＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのサイ
ズ分画上記１０において調製したＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡ
のプールを１％のアガロースゲルで電気泳動し、２ｋｂ
以上の分画をＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ１
０１社製）を用いて精製した。精製したｃＤＮＡのプー
ルは１００μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、３７℃で６時
間放置した。その後、フェノール・クロロホルム処理、
エタノール沈殿で精製し、長鎖ｃＤＮＡのプールを得
た。

【０１００】１２．ｃＤＮＡライブラリー上記１１において調製した長鎖ｃＤＮＡのプールをＤＮ
ＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．１（宝酒造社製
キット）を用いてクローニングベクターであるｐＭＥ１
８Ｓ―ＦＬ３（東京大学医科学研究所菅野純夫教授よ
り供与）にライゲーションを行った。長鎖ｃＤＮＡのプ
ールを８μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、あらかじめ制限
酵素ＤｒａＩＩＩで処理された１μｌのｐＭＥ１８Ｓ−
ＦＬ３、８０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＡ（キット付属
品）、１０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（キット付属
品）を加え、１６℃で３時間反応させた。その後、フェ
ノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製しｃ
ＤＮＡライブラリーを得た。

【０１０１】（実施例１）大腸菌へのトランスフォーメ
ーション１．クローニング実施例１の１２で調製したｃＤＮＡライブラリーを大腸
菌（ＴＯＰ−１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトラ
ンスフォーメーションした。ｃＤＮＡライブラリーを１
０μｌの滅菌蒸留水に溶解し、ＴＯＰ−１０に混合し
た。その後、氷上にて３０分間、４０℃で１分間、氷上
で５分間インキュベートした。５００μｌのＳＯＢ培地
を加え、３７℃で６０分間振盪培養した。アンピシリン
を含む寒天培地上に適量づつ播種し、３７℃で一昼夜培
養して、大腸菌クローンを得た。

【０１０２】２．大腸菌クローンの保存（グリセロール
ストックの調製）上記１において得られた寒天培地上の大腸菌クローン
を、爪楊枝にて拾い上げ、９６穴プレートに準備した１
２０μｌのＬＢ培地中に懸濁させた。この９６穴プレー
トを３７℃で一晩静置し、大腸菌の培養を行った。その
後６０％グリセロール溶液を７２μｌ加え、−２０℃で
保存した（グリセロールストック）。

【０１０３】（実施例２）塩基配列決定１．プラスミドの調製実施例１の２で調製した１０μｌのグリセロールストッ
クを１５ｍｌの遠心チューブに移し、３ｍｌのＬＢ培
地、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加え、３７℃で一
晩振盪し、大腸菌の培養を行った。その後、ＱＩＡｐｒ
ｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ社製）を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出、
精製した。

【０１０４】２．両末端シークエンスの解析上記１において調製したプラスミドＤＮＡをＤＮＡＳ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡＢＩ社製キット）を用い
て両末端のシークエンスを決定した。６００ｎｇのプラ
スミドＤＮＡ、８μｌのプレミックス（キット付属
品）、３．２ｐｍｏｌのプライマーを混合し、滅菌蒸留
水で合計２０μｌになるように調製した。この混合液を
９６℃２分間変性させた後、９６℃、１０秒間、５０
℃、５秒間、６０℃、４分間を１サイクルとして２５サ
イクル繰り返し反応を行った。その後エタノール沈殿で
精製した。変性条件下でポリアクリルアミドゲルにて電
気泳動を行い、ＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用いて配
列決定を行った。

【０１０５】（実施例３）データベースを用いたホモロ
ジー検索実施例２において両末端シークエンスを解析して得られ
たサンプルの塩基配列情報についてインターネットを介
したＤＮＡ配列のホモロジー検索を行った。検索にはＮ
ＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＵ
ＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）のＢＬＡＳＴを用いた。ホモ
ロジー検索の結果、ｃＤＮＡサンプルの一つであるｎｂ
ｌａ００７８はヒト９番染色体上のゲノムシークエンス
（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＬ１６１６２５）と高い
相同性を示した。

【０１０６】（実施例４）ｎｂｌａ００７８の全長クロ
ーニング実施例３で得られたゲノム配列について、遺伝子転写配
列をＧＥＮＥＳＣＡＮ（ＢｕｒｇｅＣ等：１９９７、
１９９８）およびＦＧＥＮＥＳＨ（ＳａｌａｍｏｖＡ
Ａ等：１９９９）を用いて予測した。予測された配列を
もとにｎｂｌａ００７８の全長を以下の方法でクローニ
ングした。

【０１０７】すなわち、予後良好な神経芽細胞腫臨床組
織サンプルから抽出した１５μｇのトータルＲＮＡをＳ
ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤ
ＮＡに逆転写した。逆転写した２μｌのｃＤＮＡに５μ
ｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０ｘｒＴａｑバッファー
（宝酒造社製）、１μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、各々
０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴ
ａｑ（宝酒造社製）を混合した。この混合液を９５℃で
２分間変性させた後、９５℃、１５秒間、５８℃、１５
秒間、７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイク
ル繰り返し、さらに７２℃で２０分間放置しＰＣＲ反応
を行った。ＰＣＲで増幅したバンドをｐＧＥＭ-Ｔｅ
ａｓｙｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブク
ローニングし、一般的手法（ＳａｎｇｅｒＦ．等：Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：
５４６３-５４６７．（１９７７））を用いて塩基配列
を決定した。解析にはＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用
いた。塩基配列は全て両鎖とも解析した。

【０１０８】得られたＮＥＤＬ−１遺伝子配列をＤＤＢ
Ｊ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬに登録した。受理番号は
ＡＢ０４８３６５である。

【０１０９】（実施例５）半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる
予後良好・不良神経芽細胞腫でのＮＥＤＬ−１遺伝子発
現の比較全ての半定量的ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法により実施し
た。

【０１１０】１．逆転写（ＲＴ）反応抽出した５μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉ
ｐｔＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａ
ｓｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写し
た。

【０１１１】２．ＰＣＲ反応ＰＣＲ反応はｒＴａｑ（宝酒造社製）を用いて行った。
逆転写した２μｌのｃＤＮＡ、５μｌの滅菌蒸留水、１
μｌの１０ｘｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭｄ
ＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、
０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃
で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間、５８℃、１
５秒間、７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイ
クル繰り返し、さらに７２℃で２０分間放置しＰＣＲ反
応を行った。

【０１１２】また陽性対照としてＧＡＰＤＨを用いた。
プライマーを以下に示すＦＷ：５'ＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＣ３'
（配列番号３）ＲＶ：５'ＧＴＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＣ３'
（配列番号４）３．ＮＥＤＬ−１遺伝子発現の比較実施例３で得られた予後良好・不良神経芽細胞腫のトー
タルＲＮＡについて、上記の条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を
行った。この反応液を２．５％のアガロースゲルで電気
泳動した。この結果、ＮＥＤＬ−１遺伝子の発現が予後
良好な神経芽細胞腫臨床組織に特異的であることが確認
された。結果を図２に示す。なお、図２中、各レーンの
サンプルは以下のとおりである。

【０１１３】レーンＦ１〜１６（左側）：予後良好な神
経芽細胞腫臨床組織サンプルレーンＵＦ１〜１６（右側）：予後不良な神経芽細胞腫
臨床組織サンプル対照：ＧＡＰＤＨ陽性対照（予後良好）：ＴｒｋＡ陰性対照（予後不良）：ＮＭＹＣ（実施例６）半定量的ＰＣＲによる組織依存的ＮＥＤ
Ｌ−１遺伝子発現ヒト正常組織のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用
いて実施例５に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行っ
た。この反応液を２．５％のアガロースゲルで電気泳動
した。この結果、ＮＥＤＬ−１遺伝子発現の分布はヒト
正常組織において組織特異性があることが確認された。
結果を図３(a)に示す。対照としてＧＡＰＤＨを使用し
た。ＮＥＤＬ−１の発現は、脳、胎児脳、小脳、および
腎臓に限局されていた。

【０１１４】（実施例７）半定量的ＰＣＲによる神経芽
腫細胞株依存的ＮＥＤＬ−１遺伝子発現種々の神経芽腫細胞株からのトータルＲＮＡについて、
実施例５に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。こ
の反応液を２．５％のアガロースゲルで電気泳動した。
この結果、ＮＥＤＬ−１遺伝子発現の分布は細胞特異性
があることが確認された。結果を図３(b)に示す。ＮＥ
ＤＬ−１の発現が見られたのは、ＳＫＮ−ＤＺ、ＴＧ
Ｗ、ＫＡＮ、ＫＣＮ＋８、およびＬＡＮ−５であった。

【０１１５】（実施例８）ノザンハイブリダイゼーショ
ンヒト各組織のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをブロットしたmultipl
e tissue Northern blotを用いて、ＮＥＤＬ−１ｃＤＮ
Ａ（³²Ｐで標識）をプローブとしてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。対照としてβアクチンｃＤＮＡプローブ
を用いた。結果を図４に示す。脳、腎臓、および胎児脳
に約１０．０および７．０ｋｂの２つの転写産物が観察
された。

【０１１６】（実施例９）ユビキチンリガーゼ活性Ｅ２（ＵｂｃＨ５ｃまたはＵｂｃＨ７）を発現するバク
テリア細胞溶解物の等量をユビキチン、酵母Ｅ１、さら
にＥ３（Ｎｅｄｄ４、ＮＥＤＬ−１、またはＮＥＤＬ
２）と３７℃で２時間、インキュベートした。続いて、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元化条件下、分離して、抗ユビキ
チン抗体でブロットした。Ｅ３（ユビキチンリガーゼ）
として、精製組換えＧＳＴ−Ｎｅｄｄ１、ＧＳＴ−ＮＥ
ＤＬ−１／ＨＥＣＴ、およびＧＳＴ−ＮＥＤＬ２／ＨＥ
ＣＴをそれぞれ使用した。結果を図５に示す。ユビキチ
ン化は、Ｅ３の量に依存して増加した（図中、点線で囲
まれた部分）。ＮＥＤＬ−１は、陽性対照であるＮｅｄ
ｄ４と同程度のユビキチンリガーゼ活性を示した。

【０１１７】（実施例１１）ＮＥＤＬ−１の細胞内局
在ＮＥＤＬ−１遺伝子の全長をＣｏｓ７細胞に一過的にト
ランスフェクトした。４８時間後、その細胞を溶解させ
て、６％ポリアクリルアミド上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、ＮＥＤＬ−１抗体を用いて分析した。各遺伝子産物
が約２２０ｋＤの位置に検出された。結果を図６(a)に
示す。また、内因性発現（ＣＨＰ１３４細胞）でも外因
性発現（Ｃｏｓ７細胞）でもＮＥＤＬ−１は、細胞質お
よび細胞膜に主に局在しており、この結果はＮｅｄｄ４
ファミリーの他のものともよく一致する（図６(b)）。

【０１１８】（実施例１２）ＮＥＤＬ−１とＡＩＣＤ
との相互作用ＮＥＤＬ−１ＷＷドメイン領域をＤＮＡ結合ドメイン融
合タンパク質として、MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid SYS
TEM2（Ｋ１６０４−１: クロンテックカンパニー）を用
いて、定型的なyeast two-hybrid screenを実施した。
具体的には、ＤＮＡ結合ドメインCloning vectorである
ｐＡＳ２−１(GenBank ACCESSION:U30497)にインフレー
ムでＰＣＲクローニングし、ＤＮＡシークエンサ−ABI
PRISM 377（Perkin Elmer/ΒＡＰＰlied Biosystems）
で配列確認を行った。支持酵母細胞株としてＣＧ−１９
４５株を用い、ライブラリ−はHuman Fetal Brain MATC
HMAKER cDNA Library ( Priming Method:Xho I-(dT)15/
Vector:pACT2/Cat.#HL4028AH)を使用した。ＳＤ(-His,-
Trp)ＴＰＤプレートで増殖能の検定を行い、ＨＩＳ３の
阻害剤である３−アミノ−１，２，４−トリアゾール２
０ｍＭを添加したＹＰＤ培地でライブラリースクリーニ
ングを行った。ＨＩＳ+のコロニーをピックアップし、
更にβ−ガラクトシダーゼ活性を定法により検定し、陽
性クローンを選択した。これらの陽性クローンから定法
によりプラスミドＤＮＡを回収した。上述の手順に従
い、yeast two-hybrid screenを実行することで複数個
見いだされた陽性クローン中にＡＩＣＤ領域を有するク
ローンが見いだされ、まず当該クローンに注目してさら
に検討を進めた。

【０１１９】当該クローンのＡＩＣＤ領域にＥＰＩＴＯ
ＰＥとしてＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加
し、ＣＭＶプロモーターで発現する哺乳類細胞発現ベク
ターを構築し、上述のシークエンサーで配列確認後、Ｃ
ＭＶ−ＮＥＤＬ−１発現プラスミドと共に細胞内に一過
性に共発現させることで、細胞内での物理的な相互作用
が再現できるかどうかの検討を行った。

【０１２０】Ｃｏｓ７細胞を８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ
になるよう１０％ＦＢＳを含むDulbecco's modified Ea
gle's mediumに維持し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法を用
いて一過性に各６μgのＤＮＡを用いて遺伝子導入を行
った。リポソーム試薬としてはLipofectAMINE plus (Li
fe Technologies,Inc.)を使用した。４８時間後、細胞
を氷上にてＰＢＳで２回洗浄し１ｍｌＴＮＥＢｕｆｆｅ
ｒ (１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８／１％ＮＰ
４０／０．１５ＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ／１０μ
ｌａｐｒｏｔｉｎｉｎ) を加え、１０分間氷上でイン
キュベートした。その後Eppendorf tubeに移しProtein
B-Sepharose（５０％ｓｌｕｒｒｙ）を２０μｌ添加
し、３０分４℃で回転し、非特異的結合を排除した。そ
の後１５０００ｒｐｍ／３０分、４℃で遠心し上清をデ
カンテーションで新しいEppendorftubeに移し、Protein
B-Sepharose３５μｌと抗ＮＥＤ１抗体を１０μｌ添加
し４℃で回転を３時間行った。その後、軽くｓｐｉｎ
ｄｏｗｎし、ＴＮＥＢｕｆｆｅｒで4回洗浄した後、Ｔ
ＮＥｂｕｆｆｅｒ２５μｌおよびｘ２ｓａｍｐｌｅ
ｂｕｆｆｅｒ２５μｌ加え、５分間ボイルし、泳動サ
ンプルとした。同一蛋白量を１５％アクリルアミドゲ
ル、Tricine SDS-PAGEで展開し、ＰＶＤＦ膜に転写後、
３％ＢＳＡでブロッキングし、1次抗体を抗ＦＬＡＧ−
Ｍ２抗体(Ｓｉｇｍａ)、２次抗体をＨＲＰで標識したAn
ti-Mouse IgG抗体で抗体反応後、ECL Western Blotting
Detection Reagent（コード番号RPN2106）で検出し
た。

【０１２１】図７は、抗ＮＥＤＬ−１抗体で免疫沈降
し、抗ＦＬＡＧ抗体で検出したものである。レーン２、
３と６、７はセット、レーン４、５と８、９はセットで
あり、それぞれ異なる独立した２個のクローンでの結果
である。ＦＬＡＧ−ＡＩＣＤがＮＥＤＬ−１と共沈して
いる（レーン２、３）。単純ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴ
ＴＩＮＧでＦＬＡＧ−ＡＩＣＤの蛋白発現バンドは弱
く、蛋白の不安定性に起因する（レーン４、５）。レー
ン４、５/８、９はネガティブコントロールであり、単
純ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＴＩＮＧでは強い発現がみ
られるにもかかわらず（レーン８、９）、ＮＥＤＬ−１
とは共沈していない（レーン４、５）。図８は、抗ＦＬ
ＡＧ抗体で免疫沈降し、ＮＥＤＬ−１抗体で検出したも
のである。ＮＥＤＬ−１とＦＬＡＧ−ＡＩＣＤが共存し
た場合のみ、強い共沈バンドが得られ（レーン４、５）
両者の直接的相互作用がわかる。

【０１２２】（実施例１３）ＮＥＤＬ−１によるΒＡ
ＰＰおよびＡＩＣＤのユビキチン化実施例１２に記載した、yeast two-hybrid screenを実
施したが、ハーベスト前にプロテアソームインヒビター
ＭＧ１３２、２０μＭで２時間処理を行った。その他の
実験方法はほぼ実施例１２に準じた。免疫沈降の結果を
図９に示す。

【０１２３】図9(a)は、抗ＨＡ抗体で免疫沈降させ、抗
ユビキチン抗体でブロットしたものである。ＮＥＤＬ−
１の存在下、ユビキチン化された細胞内分子の絶対量が
増加していることが分かる。図9(b)は、抗ＦＬＡＧ抗体
で免疫沈降させ、抗ユビキチン抗体でブロットしたもの
である。図9(c)および(d)は、抗ＨＡ抗体で免疫沈降さ
せ、ＡＩＣＤを認識する抗体でブロットしたものであ
る。βＡＰＰを起点として、上方に高分子のスメアバン
ドが見られ、βＡＰＰのユビキチン化が示唆される。図
9(a)と図9(c)からＮＥＤＬ−１の存在下、βＡＰＰはユ
ビキチン化を受けることは明らかであるが、その程度は
βＡＰＰの変異（ＷＴとＭＴ）とは無関係である（図9
(a)と図9(c)のレーン１および２さらにレーン３および
４を参照）。ＡＩＣＤのユビキチン化が図9(a)のレーン
５、６と図9(b)のレーン７、８に示されている。ＦＬＡ
Ｇ−ＡＩＣＤは、約７ＫＤの分子量である（図9(d)）。
図9(a)と図9(b)においては、検出に抗ユビキチン抗体を
使用しているので、ユビキチン化されていないＦＬＡＧ
−ＡＩＣＤは、現れないが（最下段）、ＦＬＡＧ−ＡＩ
ＣＤに約９ＫＤのユビキチン分子が付加するに従い、約
９ＫＤづつ増加したバンドが抗ユビキチン抗体で検出さ
れ（図中の星印）、ＡＩＣＤのみでも、ＮＥＤＬ−１に
よってユビキチン化を受けることが分かる。図中、２本
線様に見えるバンドは外来性のＨＡタグが付加されたユ
ビキチンと内在性のタグ無しのユビキチンの分子量差を
表している。

【０１２４】（実施例１４）ＮＥＤＬ−１とＳＯＤ１
変異体との相互作用実施例１２に記載した、yeast two-hybrid screenをＳ
ＯＤ１遺伝子で実施した。実験方法はほぼ実施例１２に
準じた。すなわち、ＳＯＤ１遺伝子（野生型、変異型）
をＣＭＶ−ＮＥＤＬ−１と細胞内で一過性に共発現させ
た。抗ＮＥＤＬ−１抗体で免疫沈降後、洗浄し、泳動サ
ンプル化した。同一蛋白量を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
展開し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＦＬＡＧ抗体で抗体反
応後、ＥＣＬを用いて検出した。その結果を図１０(a)
に示す。同様に、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降後、洗浄
し、泳動サンプル化した。同一蛋白量を6%SDS-PAGEで展
開し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＮＥＤＬ−１抗体で抗体
反応後、ＥＣＬを用いて検出した。その結果を図１０
(b)に示す。レーン３において、ＮＥＤＬ−１とＳＯＤ
１（ＷＴ）とは互いに共沈していない。レーン４、５に
おいて、発症後急速な臨床経過を辿り、１年以内に死亡
する変異であるＳＯＤ１（Ａ４Ｖ）、ＳＯＤ１（Ｃ６
Ｆ）はＮＥＤＬ−１と強く相互作用して、共沈してい
る。レーン６において、発症後緩徐な臨床経過を示し、
約４０年近く生存可能なＳＯＤ１（Ｈ４６Ｒ）はＮＥＤ
Ｌ−１とごく微弱な相互作用しか示さない。レーン７に
おいて、発症後特異な神経症状を示す変異であるＳＯＤ
１（Ｇ９３Ａ）は、ＮＥＤＬ−１と中等度の相互作用を
示す。

【０１２５】図１０に示した試験結果から、ＮＥＤＬ−
１は、野生型のＳＯＤ１とは相互作用しないが、家族性
ＡＬＳの原因となるＳＯＤ１変異体とは相互作用するこ
とが明らかとなった。さらに、その相互作用の程度と臨
床上の悪性度の程度はほぼ相関することも分かった。

【０１２６】（実施例１４）ＮＥＤＬ−１によるＳＯ
Ｄ１変異体のユビキチン化実施例１２に記載した、yeast two-hybrid screenを実
施したが、ハーベスト前にプロテアソームインヒビター
ＭＧ１３２、２０μＭで２時間処理を行った。その他の
実験方法はほぼ実施例１２に準じた。免疫沈降の結果を
図１１に示す。ここで、産物をＦＬＡＧで免疫沈降さ
せ、抗ユビキチン抗体でブロットしたものである。ＮＥ
ＤＬ−１の非存在下でもＳＯＤ１変異体は、ユビキチン
化されている。図１１のレーン１、３、５、および７を
参照。ユビキチン化の程度は３＞５＞７＞１であり、変
異体の臨床上の重症度（上記で説明）と相関関係があ
る。これは細胞内に存在する品質管理を司るユビキチン
リガーゼ、例えばＤｏｒｆｉｎ等で処理されている可能
性がある（Niwa J., Ishigaki S., Doyu M., Suzuki
T., Tanaka K., Sobue G. A., Novel centrosomal ring
-finger protein, dorfin,mediates ubiquitin ligase
activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001Mar
2; 281 (3): 706-13）。

【０１２７】一方、ＮＥＤ−１の存在下、ユビキチン化
の程度が劇的に増強することが分かる。図１１のレーン
２、４、６、および８を参照。ユビキチン化の程度は、
ここでも４＞６＞８＞２であり、変異体の臨床上の重症
度と相関関係がある。ＮＥＤＬ−１は、ＳＯＤ１変異体
に対して、変異型ΒＡＰＰとは異なり強くユビキチン化
能を発揮する品質管理ユビキチンリガーゼとしての機能
を有することが分かる。

【０１２８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の核酸プロ
ーブ或いは本発明のプライマーは、各種ハイブリダイゼ
ーションまたはＰＣＲ法に使用でき、ＮＥＤＬ−１遺伝
子の神経芽細胞腫のみならず他ヒト組織、細胞での発現
の検出や、その構造および機能の解析を可能とする。ま
た、本発明は該遺伝子がコードするＮＥＤＬ−１タンパ
ク質の遺伝子工学的製造も可能とする。該タンパク質
は、ユビキチンリガーゼ活性が確認され、その構造から
もＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼであることが明らかと
なった。したがって、ユビキチン−プロテアゾーム系に
おけるＮＥＤＬ−１タンパク質の基質の同定が可能にな
り、それが関与する神経変性疾患の治療の可能性を開
く。実際、ＮＥＤＬ−１がβＡＰＰ、ＡＩＣＤやＳＯＤ
１（変異型）と相互作用することが確かめられた。さら
に、これらの相互作用がユビキチン化を介していること
も確かめられた。

【０１２９】また、本発明に係る核酸は、予後良好な神
経芽細胞腫で発現が増強されているＮＥＤＬ−１遺伝子
に由来する核酸であり、従って、これらの核酸に基づく
遺伝子情報により神経芽細胞腫の予後の診断が可能とな
る。該遺伝子は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子が予後不良因子であ
るのに対して、ＴｒｋＡ遺伝子と同様に予後良好因子と
見なされるので、神経芽細胞腫の悪性度および抗癌剤に
対しての感受性の指標（腫瘍マーカー）となり得る。具
体的には、本発明の核酸プローブ或いは本発明のプライ
マーを用いて、神経芽細胞腫の予後診断剤または診断用
キットを構成し、臨床組織サンプルからＮＥＤＬ−１遺
伝子若しくはＮＥＤＬ−１タンパク質を検定し、予後の
診断を行いうる。

【０１３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. <120> Novel gene NEDL-1 <130> HMS952 <140> JP 2001-254974 <141> 2001-8-24 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic polynucleotide <400> 1 Met Ala Ser Pro Ser Arg Asn Ser Gln Ser Arg Arg Arg Cys Lys Glu 1 5 10 15 Pro Leu Arg Tyr Ser Tyr Asn Pro Asp Gln Phe His Asn Met Asp Leu 20 25 30 Arg Gly Gly Pro His Asp Gly Val Thr Ile Pro Arg Ser Thr Ser Asp 35 40 45 Thr Asp Leu Val Thr Ser Asp Ser Arg Ser Thr Leu Met Val Ser Ser 50 55 60 Ser Tyr Tyr Ser Ile Gly His Ser Gln Asp Leu Val Ile His Trp Asp 65 70 75 80 Ile Lys Glu Glu Val Asp Ala Gly Asp Trp Ile Gly Met Tyr Leu Ile 85 90 95 Asp Glu Val Leu Ser Glu Asn Phe Leu Asp Tyr Lys Asn Arg Gly Val 100 105 110 Asn Gly Ser His Arg Gly Gln Ile Ile Trp Lys Ile Asp Ala Ser Ser 115 120 125 Tyr Phe Val Glu Pro Glu Thr Lys Ile Cys Phe Lys Tyr Tyr His Gly 130 135 140 Val Ser Gly Ala Leu Arg Ala Thr Thr Pro Ser Val Thr Val Lys Asn 145 150 155 160 Ser Ala Ala Pro Ile Phe Lys Ser Ile Gly Ala Asp Glu Thr Val Gln 165 170 175 Gly Gln Gly Ser Arg Arg Leu Ile Ser Phe Ser Leu Ser Asp Phe Gln 180 185 190 Ala Met Gly Leu Lys Lys Gly Met Phe Phe Asn Pro Asp Pro Tyr Leu 195 200 205 Lys Ile Ser Ile Gln Pro Gly Lys His Ser Ile Phe Pro Ala Leu Pro 210 215 220 His His Gly Gln Glu Arg Arg Ser Lys Ile Ile Gly Asn Thr Val Asn 225 230 235 240 Pro Ile Trp Gln Ala Glu Gln Phe Ser Phe Val Ser Leu Pro Thr Asp 245 250 255 Val Leu Glu Ile Glu Val Lys Asp Lys Phe Ala Lys Ser Arg Pro Ile 260 265 270 Ile Lys Arg Phe Leu Gly Lys Leu Ser Met Pro Val Gln Arg Leu Leu 275 280 285 Glu Arg His Ala Ile Gly Asp Arg Val Val Ser Tyr Thr Leu Gly Arg 290 295 300 Arg Leu Pro Thr Asp His Val Ser Gly Gln Leu Gln Phe Arg Phe Glu 305 310 315 320 Ile Thr Ser Ser Ile His Pro Asp Asp Glu Glu Ile Ser Leu Ser Thr 325 330 335 Glu Pro Glu Ser Ala Gln Ile Gln Asp Ser Pro Met Asn Asn Leu Met 340 345 350 Glu Ser Gly Ser Gly Glu Pro Arg Ser Glu Ala Pro Glu Ser Ser Glu 355 360 365 Ser Trp Lys Pro Glu Gln Leu Gly Glu Gly Ser Val Pro Asp Arg Pro 370 375 380 Gly Asn Gln Ser Ile Glu Leu Ser Arg Pro Ala Glu Glu Ala Ala Val 385 390 395 400 Ile Thr Glu Ala Gly Asp Gln Gly Met Val Ser Val Gly Pro Glu Gly 405 410 415 Ala Gly Glu Leu Leu Ala Gln Val Gln Lys Asp Ile Gln Pro Ala Pro 420 425 430 Ser Ala Glu Glu Leu Ala Glu Gln Leu Asp Leu Gly Glu Glu Ala Ser 435 440 445 Ala Leu Leu Leu Glu Asp Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Glu Glu 450 455 460 Pro Leu Glu Glu Glu Ala Thr Thr Gln Ser Arg Ala Gly Arg Glu Glu 465 470 475 480 Glu Glu Lys Glu Gln Glu Glu Glu Gly Asp Val Ser Thr Leu Glu Gln 485 490 495 Gly Glu Gly Arg Leu Gln Leu Arg Ala Ser Val Lys Arg Lys Ser Arg 500 505 510 Pro Cys Ser Leu Pro Val Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Ala Ser Ala 515 520 525 Cys Gly Asp Pro Glu Thr Pro Arg Thr His Tyr Ile Arg Ile His Thr 530 535 540 Leu Leu His Ser Met Pro Ser Ala Gln Gly Gly Ser Ala Ala Glu Glu 545 550 555 560 Glu Asp Gly Ala Glu Glu Glu Ser Thr Leu Lys Asp Ser Ser Glu Lys 565 570 575 Asp Gly Leu Ser Glu Val Asp Thr Val Ala Ala Asp Pro Ser Ala Leu 580 585 590 Glu Glu Asp Arg Glu Glu Pro Glu Gly Ala Thr Pro Gly Thr Ala His 595 600 605 Pro Gly His Ser Gly Gly His Phe Pro Ser Leu Ala Asn Gly Ala Ala 610 615 620 Gln Asp Gly Asp Thr His Pro Ser Thr Gly Ser Glu Ser Asp Ser Ser 625 630 635 640 Pro Arg Gln Gly Gly Asp His Ser Cys Glu Gly Cys Asp Ala Ser Cys 645 650 655 Cys Ser Pro Ser Cys Tyr Ser Ser Ser Cys Tyr Ser Thr Ser Cys Tyr 660 665 670 Ser Ser Ser Cys Tyr Ser Ala Ser Cys Tyr Ser Pro Ser Cys Tyr Asn 675 680 685 Gly Asn Arg Phe Ala Ser His Thr Arg Phe Ser Ser Val Asp Ser Ala 690 695 700 Lys Ile Ser Glu Ser Thr Val Phe Ser Ser Gln Asp Asp Glu Glu Glu 705 710 715 720 Glu Asn Ser Ala Phe Glu Ser Val Pro Asp Ser Met Gln Ser Pro Glu 725 730 735 Leu Asp Pro Glu Ser Thr Asn Gly Ala Gly Pro Trp Gln Asp Glu Leu 740 745 750 Ala Ala Pro Ser Gly His Val Glu Arg Ser Pro Glu Gly Leu Glu Ser 755 760 765 Pro Val Ala Gly Pro Ser Asn Arg Arg Glu Gly Glu Cys Pro Ile Leu 770 775 780 His Asn Ser Gln Pro Val Ser Gln Leu Pro Ser Leu Arg Pro Glu His 785 790 795 800 His His Tyr Pro Thr Ile Asp Glu Pro Leu Pro Pro Asn Trp Glu Ala 805 810 815 Arg Ile Asp Ser His Gly Arg Val Phe Tyr Val Asp His Val Asn Arg 820 825 830 Thr Thr Thr Trp Gln Arg Pro Thr Ala Ala Ala Thr Pro Asp Gly Met 835 840 845 Arg Arg Ser Gly Ser Ile Gln Gln Met Glu Gln Leu Asn Arg Arg Tyr 850 855 860 Gln Asn Ile Gln Arg Thr Ile Ala Thr Glu Arg Ser Glu Glu Asp Ser 865 870 875 880 Gly Ser Gln Ser Cys Glu Gln Ala Pro Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly 885 890 895 Gly Ser Asp Ser Glu Ala Glu Ser Ser Gln Ser Ser Leu Asp Leu Arg 900 905 910 Arg Glu Gly Ser Leu Ser Pro Val Asn Ser Gln Lys Ile Thr Leu Leu 915 920 925 Leu Gln Ser Pro Ala Val Lys Phe Ile Thr Asn Pro Glu Phe Phe Thr 930 935 940 Val Leu His Ala Asn Tyr Ser Ala Tyr Arg Val Phe Thr Ser Ser Thr 945 950 955 960 Cys Leu Lys His Met Ile Leu Lys Val Arg Arg Asp Ala Arg Asn Phe 965 970 975 Glu Arg Tyr Gln His Asn Arg Asp Leu Val Asn Phe Ile Asn Met Phe 980 985 990 Ala Asp Thr Arg Leu Glu Leu Pro Arg Gly Trp Glu Ile Lys Thr Asp 995 1000 1005 Gln Gln Gly Lys Ser Phe Phe Val Asp His Asn Ser Arg Ala Thr Thr 1010 1015 1020 Phe Ile Asp Pro Arg Ile Pro Leu Gln Asn Gly Arg Leu Pro Asn His 1025 1030 1035 1040 Leu Thr His Arg Gln His Leu Gln Arg Leu Arg Ser Tyr Ser Ala Gly 1045 1050 1055 Glu Ala Ser Glu Val Ser Arg Asn Arg Gly Ala Ser Leu Leu Ala Arg 1060 1065 1070 Pro Gly His Ser Leu Val Ala Ala Ile Arg Ser Gln His Gln His Glu 1075 1080 1085 Ser Leu Pro Leu Ala Tyr Asn Asp Lys Ile Val Ala Phe Leu Arg Gln 1090 1095 1100 Pro Asn Ile Phe Glu Met Leu Gln Glu Arg Gln Pro Ser Leu Ala Arg 1105 1110 1115 1120 Asn His Thr Leu Arg Glu Lys Ile His Tyr Ile Arg Thr Glu Gly Asn 1125 1130 1135 His Gly Leu Glu Lys Leu Ser Cys Asp Ala Asp Leu Val Ile Leu Leu 1140 1145 1150 Ser Leu Phe Glu Glu Glu Ile Met Ser Tyr Val Pro Leu Gln Ala Ala 1155 1160 1165 Phe His Pro Gly Tyr Ser Phe Ser Pro Arg Cys Ser Pro Cys Ser Ser 1170 1175 1180 Pro Gln Asn Ser Pro Gly Leu Gln Arg Ala Ser Ala Arg Ala Pro Ser 1185 1190 1195 1200 Pro Tyr Arg Arg Asp Phe Glu Ala Lys Leu Arg Asn Phe Tyr Arg Lys 1205 1210 1215 Leu Glu Ala Lys Gly Phe Gly Gln Gly Pro Gly Lys Ile Lys Leu Ile 1220 1225 1230 Ile Arg Arg Asp His Leu Leu Glu Gly Thr Phe Asn Gln Val Met Ala 1235 1240 1245 Tyr Ser Arg Lys Glu Leu Gln Arg Asn Lys Leu Tyr Val Thr Phe Val 1250 1255 1260 Gly Glu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Gly Pro Ser Arg Glu Phe Phe Phe 1265 1270 1275 1280 Leu Leu Ser Gln Glu Leu Phe Asn Pro Tyr Tyr Gly Leu Phe Glu Tyr 1285 1290 1295 Ser Ala Asn Asp Thr Tyr Thr Val Gln Ile Ser Pro Met Ser Ala Phe 1300 1305 1310 Val Glu Asn His Leu Glu Trp Phe Arg Phe Ser Gly Arg Ile Leu Gly 1315 1320 1325 Leu Ala Leu Ile His Gln Tyr Leu Leu Asp Ala Phe Phe Thr Arg Pro 1330 1335 1340 Phe Tyr Lys Ala Leu Leu Arg Leu Pro Cys Asp Leu Ser Asp Leu Glu 1345 1350 1355 1360 Tyr Leu Asp Glu Glu Phe His Gln Ser Leu Gln Trp Met Lys Asp Asn 1365 1370 1375 Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp Leu Thr Phe Thr Val Asn Glu Glu Val 1380 1385 1390 Phe Gly Gln Val Thr Glu Arg Glu Leu Lys Ser Gly Gly Ala Asn Thr 1395 1400 1405 Gln Val Thr Glu Lys Asn Lys Lys Glu Tyr Ile Glu Arg Met Val Lys 1410 1415 1420 Trp Arg Val Glu Arg Gly Val Val Gln Gln Thr Glu Ala Leu Val Arg 1425 1430 1435 1440 Gly Phe Tyr Glu Val Val Asp Ser Arg Leu Val Ser Val Phe Asp Ala 1445 1450 1455 Arg Glu Leu Glu Leu Val Ile Ala Gly Thr Ala Glu Ile Asp Leu Asn 1460 1465 1470 Asp Trp Arg Asn Asn Thr Glu Tyr Arg Gly Gly Tyr His Asp Gly His 1475 1480 1485 Leu Val Ile Arg Trp Phe Trp Ala Ala Val Glu Arg Phe Asn Asn Glu 1490 1495 1500 Gln Arg Leu Arg Leu Leu Gln Phe Val Thr Gly Thr Ser Ser Val Pro 1505 1510 1515 1520 Tyr Glu Gly Phe Ala Ala Leu Arg Gly Ser Asn Gly Leu Arg Arg Phe 1525 1530 1535 Cys Ile Glu Lys Trp Gly Lys Ile Thr Ser Leu Pro Arg Ala His Thr 1540 1545 1550 Cys Phe Asn Arg Leu Asp Leu Pro Pro Tyr Pro Ser Tyr Ser Met Leu 1555 1560 1565 Tyr Glu Lys Leu Leu Thr Ala Val Glu Glu Thr Ser Thr Phe Gly Leu 1570 1575 1580 Glu 1585 <210> 2 <211> 6200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic polynucleotide <400> 2 ggtttttagg cctggccgcc atggcgtctc cttctagaaa ctcccagagc cgacgccggt 60 gcaaggagcc gctccgatac agctacaacc ccgaccagtt ccacaacatg gacctcaggg 120 gcggccccca cgatggcgtc accattcccc gctccaccag cgacactgac ctggtcacct 180 cggacagccg ctccacgctc atggtcagca gctcctacta ttccatcggg cactctcagg 240 acctggtcat ccactgggac ataaaggagg aagtggacgc tggggactgg attggcatgt 300 acctcattga tgaggtcttg tccgaaaact ttctggacta taaaaaccgt ggagtcaatg 360 gttctcatcg gggccagatc atctggaaga tcgatgccag ctcgtacttt gtggaacctg 420 aaactaagat ctgcttcaaa tactaccatg gagtgagtgg ggccctgcga gcaaccaccc 480 ccagtgtcac ggtcaaaaac tcggcagctc ctatttttaa aagcattggt gctgatgaga 540 ccgtccaagg acaaggaagt cggaggctga tcagcttctc tctctcagat ttccaagcca 600 tggggttgaa gaaagggatg tttttcaacc cagaccctta tctgaagatt tccattcagc 660 ctgggaaaca cagcatcttc cccgccctcc ctcaccatgg acaggagagg agatccaaga 720 tcataggcaa caccgtgaac cccatctggc aggccgagca attcagtttt gtgtccttgc 780 ccactgacgt gctggaaatt gaggtgaagg acaagtttgc caagagccgc cccatcatca 840 agcgcttctt gggaaagctg tcgatgcccg ttcaaagact cctggagaga cacgccatag 900 gggatagggt ggtcagctac acacttggcc gcaggcttcc aacagatcat gtgagtggac 960 agctgcaatt ccgatttgag atcacttcct ccatccaccc agatgatgag gagatttccc 1020 tgagtaccga gcctgagtca gcccaaattc aggacagccc catgaacaac ctgatggaaa 1080 gcggcagtgg ggaacctcgg tctgaggcac cagagtcctc tgagagctgg aagccagagc 1140 agctgggtga gggcagtgtc cccgatcgtc cagggaacca aagcatagag ctttccagac 1200 cagctgagga agcagcagtc atcacggagg caggagacca gggcatggtc tctgtgggac 1260 ctgaaggggc tggggagctc ctggcccagg tgcaaaagga catccagcct gcccccagtg 1320 cagaagagct ggccgagcag ctggacctgg gtgaggaggc atcagcactg ctgctggaag 1380 acggtgaagc cccagccagc accaaggagg agcccttgga ggaggaagca acgacccaga 1440 gccgggctgg aagggaagaa gaggagaagg agcaggagga ggagggagat gtgtccaccc 1500 tggagcaggg agagggcagg ctgcagctgc gggcctcggt gaagagaaaa agcaggccct 1560 gctccttgcc tgtgtccgag ctggagacgg tgatcgcgtc agcctgcggg gaccccgaga 1620 ccccgcggac acactacatc cgcatccaca ccctgctgca cagcatgccc tccgcccagg 1680 gcggcagcgc ggcagaggag gaggacggcg cggaggagga gtccaccctc aaggactcct 1740 cggagaagga tgggctcagc gaggtggaca cggtggccgc tgacccgtct gccctggaag 1800 aggacagaga agagcccgag ggggctactc caggcacggc gcaccctggc cactccgggg 1860 gccacttccc cagcctggcc aatggcgcgg cccaggatgg cgacacgcac cccagcaccg 1920 ggagcgagag cgactccagc cccaggcaag gcggggacca cagttgcgag ggctgtgacg 1980 cgtcctgctg cagcccctcg tgctacagct cctcgtgcta cagcacgtcc tgctacagca 2040 gctcgtgcta cagcgcctcg tgctacagcc cctcctgcta caacggcaac aggttcgcca 2100 gccacacgcg cttctcctcc gtggacagcg ccaagatctc cgagagcacg gtcttctcct 2160 cgcaagacga cgaggaggag gagaacagcg cgttcgagtc ggtacccgac tccatgcaga 2220 gccctgagct ggacccggag tccacgaacg gcgctgggcc gtggcaagac gagctggccg 2280 cccctagcgg gcacgtggaa agaagcccgg aaggtctgga atcccccgtg gcaggtccaa 2340 gcaatcggag agaaggtgaa tgtcctatac tccataattc ccagccagta agccagcttc 2400 cttccctgag gcctgaacat catcactacc caacaatcga tgagcctctt ccaccaaact 2460 gggaagctcg aattgacagc cacgggcggg tcttttatgt ggaccacgtg aaccgcacaa 2520 ccacctggca gcgtccgacg gcagcagcca ccccggatgg catgcggaga tcggggtcca 2580 tccagcagat ggagcaactc aacaggcggt atcaaaacat tcagcgaacc attgcaacag 2640 agaggtccga agaagattct ggcagccaaa gctgcgagca agccccagca ggaggaggcg 2700 gaggtggagg gagtgactca gaagccgaat cttcccagtc cagcttagat ctaaggagag 2760 aggggtcact ttctccagtg aactcacaaa aaatcacctt gctgctgcag tccccagcgg 2820 tcaagttcat caccaacccc gagttcttca ctgtgctaca tgccaattat agtgcctacc 2880 gagtcttcac cagtagcacc tgcttaaagc acatgattct gaaagtccga cgggatgctc 2940 gcaattttga acgctaccag cacaaccggg acttggtgaa tttcatcaac atgttcgcag 3000 acactcggct ggaactgccc cggggctggg agatcaaaac ggaccagcag ggaaagtctt 3060 ttttcgtgga ccacaacagt cgagctacca ctttcattga cccccgaatc cctcttcaga 3120 acggtcgtct tcccaatcat ctaactcacc gacagcacct ccagaggctc cgaagttaca 3180 gcgctggaga ggcctcagaa gtttctagaa acagaggagc ctctttactg gccaggccag 3240 gacacagctt agtagctgct attcgaagcc aacatcaaca tgagtcattg ccactggcat 3300 ataatgacaa gattgtggca tttcttcgcc agccaaacat ttttgaaatg ctgcaagagc 3360 gtcagccaag cttagcaaga aaccacacac tcagggagaa aatccattac attcggactg 3420 agggtaatca cgggcttgag aagttgtcct gtgatgcgga tctggtcatt ttgctgagtc 3480 tctttgaaga agagattatg tcctacgtcc ccctgcaggc tgccttccac cctgggtata 3540 gcttctctcc ccgctgttca ccctgttctt cacctcagaa ctccccaggt ttacagagag 3600 ccagtgcaag agccccttcc ccctaccgaa gagactttga ggccaagctc cgcaatttct 3660 acagaaaact ggaagccaaa ggatttggtc agggtccggg gaaaattaag ctcattattc 3720 gccgggatca tttgttggag ggaaccttca atcaggtgat ggcctattcg cggaaagagc 3780 tccagcgaaa caagctctac gtcacctttg ttggagagga gggcctggac tacagtggcc 3840 cctcgcggga gttcttcttc cttctgtctc aggagctctt caacccttac tatggactct 3900 ttgagtactc ggcaaatgat acttacacgg tgcagatcag ccccatgtcc gcatttgtag 3960 aaaaccatct tgagtggttc aggtttagcg gtcgcatcct gggtctggct ctgatccatc 4020 agtaccttct tgacgctttc ttcacgaggc ccttctacaa ggcactcctg agactgccct 4080 gtgatttgag tgacctggaa tatttggatg aggaattcca ccagagtttg cagtggatga 4140 aggacaacaa catcacagac atcttagacc tcactttcac tgttaatgaa gaggtttttg 4200 gacaggtcac ggaaagggag ttgaagtctg gaggagccaa cacacaggtg acggagaaaa 4260 acaagaagga gtacatcgag cgcatggtga agtggcgggt ggagcgcggc gtggtacagc 4320 agaccgaggc gctggtgcgc ggcttctacg aggttgtaga ctcgaggctg gtgtccgtgt 4380 ttgatgccag ggagctggag ctggtgatag ctggcaccgc ggaaatcgac ctaaatgact 4440 ggcggaataa cactgagtac cggggaggtt accacgatgg gcatcttgtg atccgctggt 4500 tctgggctgc ggtggagcgc ttcaataatg agcagaggct gagattactg cagtttgtca 4560 cgggaacatc cagcgtgccc tacgaaggct tcgcagccct ccgtgggagc aatgggcttc 4620 ggcgcttctg catagagaaa tgggggaaaa ttacttctct ccccagggca cacacatgct 4680 tcaaccgact ggatcttcca ccgtatccct cgtactccat gttgtatgaa aagctgttaa 4740 cagcagtaga ggaaaccagc acctttggac ttgagtgagg acatggaacc tcgcctgaca 4800 ttttcctggc cagtgacatc acccttcctg ggatgatccc cttttccctt tcccttaatc 4860 aactctcctt tgattttggt attccatgat ttttattttc aaaccaaatc aggattgaca 4920 aaagctgtgc atgaagaact gccttcttct aagatctaac cttcaggctt ctctcctctg 4980 ttttcaatga actgctagcc tgtatgcaat attaaaaaac agctgtctca aggtctgtgt 5040 atatctccac atacctccat tactaacaat gaaatatgaa tgcaagttaa gctacacttg 5100 accaaatggt aataaatgtt tacttccatt tctatcattg aagggaaaat gtgagcatta 5160 agcactccag gctttcatat gcccatgtct tctgagcaga gccaccattt tttataattt 5220 ctaataacca actccagaac taggagctga tcaactcttt gttttcctct ccatctactt 5280 ttccctgtgc ataatatcca tccaaaggac aacagtggca aagctgaaat ttttatacat 5340 tcaactcatg attcacatgt ggcatcagtc ccatcagccg gaactagcct agacatacgg 5400 tgcaaatatg acacttctaa cgattaacaa cagcaagaaa acacctgctg ctgatgcaat 5460 gcaatgcatc ccaatggttg tggggattgt gggctcaact caagagaagt ttaggagggg 5520 gagcatccct agtgaatact cacaccacaa gaaggacaaa cttgtgcaca tgtccaagaa 5580 agaaagcttc ttgattgagg tagcatgaag gatgaggctt cagcccccat tgtcttatgt 5640 agaatgtggc aatgccaact ggagaaaggg aagaaggaca tattaccttg gtttgaatcc 5700 ctgagttctg tactgttctg ttttgtttag tctagccaca gttcttcaca aaggaaaaaa 5760 aaatgtgtag atgataccat gacttttgtt aaagccatga cttttgtttg cttggcagac 5820 aaaccctttt tttaaaactt tgatattttt ttttcacatt ttttttcctt ttcctttctt 5880 aatcatggag ttcaagttcc tttgcattcg attgtccatc gggaccacac taggaagctg 5940 cagagagtga tggtgcttgt tagggatcaa gggcaacata gtacttctcc ttcacccata 6000 gtaatcctcc tggggcagaa acataacacc ccaaaggcac gttgatttgt atcaaaataa 6060 atatccagtt tcttttagca ttcagtgaaa acatatctca gaaaacttca tgttgtcaga 6120 aaaacagctg caggctccaa agacagccta acctctcaac tacatttgaa ataaacccaa 6180 ccataatggt aaaaaaaaaa 6200 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic polynucleotide <400> 3 ctgcaccaac aatatccc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic polynucleotide <400> 4 gtagagacag ggtttcac 7

【図面の簡単な説明】

【図１】(a)は、ＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼ類のタ
ンパク質構造を模式的に示す図であり、いずれもＣ末端
側にＨＥＣＴドメイン、中央部に複数のＷＷドメイン、
Ｎ末端側にＣ２ドメインを有することを示している。
(b)は、ＮＥＤＬ−１タンパク質のアミノ酸配列とＮＥ
ＤＬ２タンパク質のアミノ酸配列とのホモロジー解析を
表すアラインメント図である。前記各ドメインは、下線
を施すか、箱で囲まれて表示されている。また、保存ア
ミノ酸は、星印で表示されている。

【図２】半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、予後良好・不
良神経芽細胞腫の臨床組織サンプルにおけるＮＥＤＬ−
１遺伝子の発現を測定した結果を示す電気泳動図であ
る。

【図３】(a)は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、正常
ヒト組織におけるＮＥＤＬ−１遺伝子の発現を測定した
結果を示す電気泳動写真に対応する図である。(b)は、
半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、各種の神経芽細胞腫株
におけるＮＥＤＬ−１遺伝子の発現を測定した結果を示
す電気泳動写真に対応する図である。

【図４】正常ヒト組織におけるＮＥＤＬ−１遺伝子の組
織別発現をノーザンブロットによって分析したオートラ
ジオグラフィーを表す図である。

【図５】ＮＥＤＬ−１タンパク質のユビキチンリガーゼ
活性を示すイムノブロットした電気泳動図である。

【図６】ＮＥＤＬ−１遺伝子の細胞内局在化を表すウェ
スタンブロット図である。(a)は、Ｃｏｓ７細胞、(b)は
ＣＨＰ１３４細胞での結果を表わす。

【図７】ＮＥＤＬ−１タンパク質のＡＩＣＤとの相互作
用を示すイムノブロットした電気泳動図であり、抗ＮＥ
ＤＬ−１抗体で免疫沈降させ、抗ＦＬＡＧ抗体で検出し
たものである。

【図８】ＮＥＤＬ−１タンパク質のＡＩＣＤとの相互作
用を示すイムノブロットした電気泳動図であり、抗ＦＬ
ＡＧ抗体で免疫沈降させ、抗ＮＥＤＬ−１抗体で検出し
たものである。

【図９】(a)は、ＮＥＤＬ−１タンパク質のβＡＰＰお
よびＡＩＣＤに対するユビキチン化を示すイムノブロッ
トした電気泳動図であり、抗ＨＡ抗体で免疫沈降させ、
抗ユビキチン抗体で検出したものである。(b)は、ＮＥ
ＤＬ−１タンパク質のＦＬＡＧ−ＡＩＣＤに対するユビ
キチン化を示すイムノブロットした電気泳動図であり、
抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させ、抗ユビキチン抗体で検
出したものである。(c)は、ＮＥＤＬ−１タンパク質の
βＡＰＰおよびＡＩＣＤに対するユビキチン化を示すイ
ムノブロットした電気泳動図であり、抗ＨＡ抗体で免疫
沈降させ、ＡＩＣＤを認識する抗体で検出したものであ
る。

【図１０】(ａ)は、ＮＥＤＬ−１タンパク質のＳＯＤ１
変異体との相互作用を示すイムノブロットした電気泳動
図であり、抗ＮＥＤＬ−１抗体で免疫沈降させ、抗ＦＬ
ＡＧ抗体で検出したものである。(ｂ)は、ＮＥＤＬ−１
タンパク質のＳＯＤ１変異体との相互作用を示すイムノ
ブロットした電気泳動図であり、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫
沈降させ、抗ＮＥＤＬ−１抗体で検出したものである。

【図１１】ＮＥＤＬ−１タンパク質のＳＯＤ１およびＳ
ＯＤ１変異体に対するユビキチン化を示すイムノブロッ
トした電気泳動図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者宮崎耕千葉県千葉市緑区おゆみ野948−28 プロムナード201 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA07 CA04 CA09 DA02 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ40 QQ42 QR31 QR38 QR55 QR72 QR82 QS12 QS16 QS24 QS25 QS34 QS39 QX02 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)または(b)の核酸を含む核酸プ
ローブ： (a)配列表の配列番号２に示す塩基配列の一部、または
それと相補的な塩基配列を有する核酸； (b)配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる核酸と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸。
【請求項２】前記核酸がＤＮＡであることを特徴とす
る請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項３】核酸が少なくとも２０個の塩基長である
請求項１または２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】前記核酸が配列表の配列番号２に示す塩
基配列の全長である請求項３に記載の核酸プローブ。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載の核
酸プローブを有効成分とする神経芽細胞腫の予後診断
剤。
【請求項６】以下の(a)または(b)のＤＮＡを含むプラ
イマー： (a)配列表の配列番号２に示す塩基配列の一部、または
それと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ； (b)配列表の配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａ、またはそれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項７】請求項６に記載のプライマーを有効成分
とする神経芽細胞腫の予後診断用キット。
【請求項８】神経芽細胞腫の臨床組織サンプルから配
列表の配列番号２に示す塩基配列からなる核酸の有無を
検出することを特徴とする、神経芽細胞腫の予後の診断
方法。
【請求項９】神経芽細胞腫の臨床組織サンプルから配
列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク
質の有無を検出することを特徴とする、神経芽細胞腫の
予後の診断方法。
【請求項１０】 (a)配列表の配列番号２に示す塩基配
列の一部、またはそれと相補的な塩基配列を有する核
酸、または(b)配列表の配列番号２に示す塩基配列から
なる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する核酸、またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸
を神経芽細胞腫の臨床組織サンプルと接触させて、配列
表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
の発現およびその量を分析することを特徴とする、神経
芽細胞腫の予後の診断方法。
【請求項１１】配列表の配列番号１に示すアミノ酸配
列からなるタンパク質を有効成分として含むポリユビキ
チン化剤。
【請求項１２】ユビキチン化される基質がアミロイド
β前駆蛋白（βＡＰＰ）であることを特徴とする請求項
１１に記載のポリユビキチン化剤。
【請求項１３】ユビキチン化される基質がアミロイド
β前駆蛋白細胞内領域（ＡＩＣＤ）であることを特徴と
する請求項１１に記載のポリユビキチン化剤。
【請求項１４】ユビキチン化される基質がスーパーオ
キシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）変異体であることを特
徴とする請求項１１に記載のポリユビキチン化剤。
【請求項１５】アミロイドβ前駆蛋白（βＡＰＰ）の
調節用組成物であって、配列表の配列番号１に示すアミ
ノ酸配列からなるタンパク質をアミロイドβ前駆蛋白の
細胞内での発現、産生、または形成を調節するのに有効
な量、含むことを特徴とする調節用組成物。
【請求項１６】アミロイドβ前駆蛋白（βＡＰＰ）の
調節用組成物であって、配列表の配列番号２に示す塩基
配列を有する核酸をアミロイドβ前駆蛋白の細胞内での
発現、産生、または形成を調節するのに有効な量含むこ
とを特徴とする調節用組成物。
【請求項１７】細胞に配列表の配列番号１に示すアミ
ノ酸配列からなるタンパク質をアミロイドβ前駆蛋白
（βＡＰＰ）の細胞内発現、産生、または形成を調節す
るのに有効な量、投与することからなる細胞内でのアミ
ロイドβ前駆蛋白の発現、産生、または形成を調節する
方法。
【請求項１８】細胞に配列表の配列番号２に示す塩基
配列を有する核酸をアミロイドβ前駆蛋白の細胞内発
現、産生、または形成を調節するのに有効な量、投与す
ることからなる細胞内でのアミロイドβ前駆蛋白（βＡ
ＰＰ）の発現、産生、または形成を調節する方法。
【請求項１９】スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯ
Ｄ１）活性の調節用組成物であって、配列表の配列番号
１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をスーパーオ
キシドジムスターゼ活性を細胞内で調節するのに有効な
量、含むことを特徴とする調節用組成物。
【請求項２０】スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯ
Ｄ１）活性の調節用組成物であって、配列表の配列番号
２に示す塩基配列を有する核酸をスーパーオキシドジム
スターゼ活性を細胞内で調節するのに有効な量、含むこ
とを特徴とする調節用組成物。
【請求項２１】スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯ
Ｄ１）が変異型であることを特徴とする、請求項１９ま
たは２０に記載の調節用組成物。
【請求項２２】細胞に配列表の配列番号１に示すアミ
ノ酸配列からなるタンパク質をスーパーオキシドジムス
ターゼ（ＳＯＤ１）活性を調節するのに有効な量、投与
することからなる細胞内におけるスーパーオキシドジム
スターゼ活性を調節する方法。
【請求項２３】細胞に配列表の配列番号２に示す塩基
配列を有する核酸をスーパーオキシドジムスターゼ活性
（ＳＯＤ１）を調節するのに有効な量、投与することか
らなる細胞内におけるスーパーオキシドジムスターゼ活
性を調節する方法。
【請求項２４】スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯ
Ｄ１）が変異型であることを特徴とする、請求項２２ま
たは２３に記載の方法。