WO2005056822A1 - Falsの臨床悪性度の判定方法 - Google Patents

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Akira Nakagawara
Kou Miyazaki
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining FALS or a therapeutic agent (method) based on the interaction of NEDL1 and its related factors with a SOD1 mutant.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • ALS familial lateral sclerosis: hereinafter referred to as FALS
  • FALS is a force found at a frequency of 5 to 10% of the entire ALS.
  • the causative gene in some families is the CU / Zn superoxide dismutase (SOD1) gene. Approximately 20% of all FALS are caused by SOD1 mutations.
  • SOD1 is a type of active enzyme produced in cells during aerobic metabolism and inactivates superoxide.
  • SOD1 mutant and V ⁇ ⁇ forms aggregates in cells and exerts cytotoxicity! (4)
  • the aggregate hypothesis is becoming the most probable cause of FALS (Non-Patent Document 1).
  • the present inventors previously compared a neuroblastoma with a good prognosis with a neuroblastoma with a poor prognosis, and found that a novel HECT type named NEDL1 whose expression was enhanced in a neuroblastoma with a good prognosis. Ubiquitin ligase was found (Patent Document 1). Furthermore, they found that NEDL1 ubiquitinated the SOD1 mutant.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 3
  • Patent document 1 International publication WO 03/018842 pamphlet
  • Non-patent document 1 Ryoichi Nakano, Cell Engineering, Vol. 20, No. 11, 1508-1512, 2001
  • Non-patent document 2 Ryen D. Fons, et al, The Journak of Cell Biology, Vol. 160, No. 4 ,
  • Non-Patent Document 3 Kunststoff C.B., et al, Nat.Genet. 15, 91-94 (1997)
  • One object of the present invention is to elucidate, at the gene or protein level, the binding and interaction (with or without NEDL1) between a SOD1 mutant and its related molecule. Furthermore, another object of the present invention is to apply the knowledge obtained therefor to clinical practice, that is, to provide new therapeutic agents (methods) and diagnostic agents (methods) for FALS.
  • NEDL1 binds to TRAP ⁇ , which forms a complex with a SOD1 mutant, and that the binding strength in the complex is approximately proportional to the clinical grade of FALS. I found it. Furthermore, similarly, NEDL1 binds to Dishevelll (hereinafter referred to as Dvll) and forms a complex with SOD1 mutant, and the binding strength in this complex is almost proportional to the clinical grade of FALS. I found it. We also found that the interaction between NEDL1 and the SOD1 mutant was almost proportional to the clinical grade of FALS.
  • a method for determining the clinical grade of FALS comprising isolating a SOD1 mutant from a subject derived from a FALS patient and evaluating the binding ability of the SOD1 mutant to TRAPS.
  • the present invention provides the use of NEDL1 or its substrate in the determination of the clinical grade of FALS. Specifically, in the determination, an isolated SOD1 mutant is used.
  • the substrate is TRAP ⁇ or Dvll.
  • the substrate is TRAP ⁇ or Dvll.
  • the method further comprises determining whether the candidate drug is an inhibitor of the interaction between the SOD mutant and NEDL1 and Z or its substrate in the neuron! Also provided are methods of screening for agents useful in treating FALS.
  • the SOD1 mutant that is a causative gene of FALS and its related molecule (TRAP
  • FIG. 1 is a diagram showing an alignment of conservative amino acid sequences between human NEDLl (hNEDLl) and mouse NEDLl (mNEDLl).
  • the numbers in the right column indicate the number of bases from methionine, which is the initiator.
  • the C2 domain, WW domain and HECT domain are shown, respectively.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram (immunoblot diagram) obtained by immunoplotting showing the binding between NEDL1 and TRAP- ⁇ .
  • FIG. 3 is an electrophoretogram obtained by immunoplotting showing the binding between NEDL1 and endogenous TRAP- ⁇ .
  • FIG. 4 is an immunoplot showing the binding between NEDL1 and a SOD1 mutant.
  • FIG. 5 is an immunoblot diagram showing ubiquitination of NEDL1 against wild-type SOD1 and SOD1 mutant.
  • FIG. 6 is an immunoblot diagram showing the time course of degradation of SOD1 mutant and wild-type SOD1 in the presence of NEDL1.
  • FIG. 7 is an immunoplot diagram showing the binding between the S0D1 mutant and exogenous TRAP ⁇ .
  • FIG. 8 is an immunoplot showing the binding between NEDL1 and Dvll.
  • FIG. 9 is an immunoplot diagram showing ubiquitination of NEDL1 to Dvll.
  • FIG. 10 is an immunoplot showing the time-dependent changes in the degradation of Dvll in the presence of NEDL1.
  • FIG. 11 is an immunoplot showing the binding between a SOD1 mutant and Dvll in the presence of NEDL1.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram of the interaction between SOD1 mutant and its related molecules in FALS pathogenesis.
  • the NEDL1 gene according to the present invention is a gene having a total length of 6200 nucleotides (coding region 4755 nucleotides), and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the NEDL1 protein encoded by this gene is composed of 1585 amino acids, and its full length is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence and the amino acid sequence are as described in GeneBank (
  • FIG. 1 shows an alignment (homology analysis) of human NEDLl (hNEDLl) and mouse NEDLl (mNEDLl). It can be seen that the NEDL-1 protein has the following domains characteristic of HECT-type ubiquitin ligase. That is, (1) C2 domain at the N-terminus (which binds to membrane lipids in a calcium-dependent manner), (2) WW domain at the center (involved in binding to proline-rich regions), and (3) HECT domain at the C-terminal region (Binding site of ubiquitin conjugating enzyme E2).
  • TRAPS was found as one of the substrates.
  • TRAP ⁇ is one of the subunits of the translocon-associated protein complex protein, which is a factor associated with protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane. It has been previously reported that TRAPS does not bind to wild-type SOD, but does bind to SOD1 mutants (Kunst CB et al., Supra). Therefore, the present inventors examined the interaction between NEDL1, TRAPS, and SODl. Specifically, COS7 cells were co-transfected with these expression constructs and deciphered by immunoplot and immunoprecipitation techniques.
  • NEDL1 binds to endogenous and exogenous TRAP ⁇ . This binding is also confirmed to be via the WW domain in yeast two-hybrid screening. However, TRAPS is not ubiquitinated by NEDL1.
  • NEDL1 does not bind to wild-type SOD1 as shown in FIG.
  • the ability of NEDL1 to bind to various SOD1 mutants is found to be approximately proportional to the clinical grade of the FALS patient from which the SOD1 mutant was isolated.
  • Figure 6 shows the time course of degradation of the SOD1 mutant in the presence of NEDL1. Figure 6 also shows that the SOD1 mutant is degraded in proportion to the clinical malignancy.
  • NEDL1 in the pathogenesis of FALS, (l) NEDLl ubiquitinates SODl mutants alone or together with TRAP ⁇ .
  • TRAP S forms aggregates with the SOD1 mutant, which induces Golgi apparatus fragmentation and results in neuronal apoptosis.
  • Human DV11 is a protein having a power of 670 amino acids and has the following domains. That is, (1) DIX domain required for cano-cal Wnt / TCF signaling, (2) PDZ domain (target of Stbm, CKI binding), (3) DEP domain (membrane localization during PCP signaling) (DJ Sussman et al, Dev. Biol. 166, 73-86 (1994); A. Wodarz et al, Cell Dev. Biol. 14, 59-88 (1998); M. Boutros et al. Cell, 94, 109-118 (1998), suggesting that the DEP domain and the WW domain of NEDL1 bind.
  • DIX domain required for cano-cal Wnt / TCF signaling
  • PDZ domain target of Stbm, CKI binding
  • DEP domain membrane localization during PCP signaling
  • FIG. 9 shows the time-dependent change of Dvll degradation in the presence of NEDL1.
  • NEDL1 a neuronal E3 ubiquitin ligase, binds (interacts) with TRAPS, but also binds to Dvll, which degrades by ubiquitination.
  • NEDL1 thus forms a complex with the SOD1 mutant, DV11, and TRAP ⁇ , thus forming a large aggregate with the SOD1 mutant that has escaped ubiquitin-mediated degradation.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram of the interaction between the SOD1 mutant and its related molecules in FALS pathogenesis based on the findings obtained in the present invention.
  • Candidate drugs as inhibitors include nucleic acids, proteins, low molecular weight compounds (chemically or naturally derived), and high molecular weight compounds other than proteins.
  • a Two-Hybrid System for example, uyuns, J. shiell, 1993, 75, 791-803; uolemis, EA, shi urrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sions, Inc.) 1996, Ch. 20.0-20.1).
  • screening methods for inhibitors can be carried out by immunological techniques. Specifically, SOD1 mutants (especially those with high clinical malignancy) and NEDL1 and Z or their substrates are expressed in cells (neural cells), cultured for a certain period of time with candidate drugs, and then crushed. To prepare a cell lysate.
  • Immunoprecipitation with an antibody against one molecule, and the other molecule (other than that) contained in the precipitate is not detected by immunological techniques (immuno plot, etc.) and quantified.
  • the effect of the candidate drug on the interaction of each molecule can be detected.
  • screening for inhibitors can be performed by simultaneously adding an appropriate agonist and a candidate drug to the culture system, performing the above-mentioned assay, and comparing the result with immunoprecipitates from cells not containing the candidate drug. Is possible
  • the SOD1 mutant identified by the above-described screening method and a protein or the like which is an inhibitor of NEDL1 and Z or its substrate can be orally or parenterally administered to a patient suffering from or possibly having FALS. Should be administered.
  • the protein is prepared as a pharmaceutical composition. This involves mixing an effective amount of the binding inhibitor with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent into a suitable dosage form. Suitable dosage forms for administration include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, capsules, suppositories, injections and the like.
  • the full-length human NEDL1 cDNA was prepared by fusing the PCR amplified fragment (nucleotide position 1 (translation start site) -position 68) with KIAA0322 cDNA (donated by T. Nagase, Kazusa DNA Research Institute). .
  • COS7 and Neuro2a cells were prepared by adding Dulbecco's modified Eagle medium (Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM). Cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% carbon dioxide saturated with water in air. The co-transfection of each expression plasmid is specified by the manufacturer. According to the specification, the test was performed using Lipofectamine (LipofectAMINE, manufactured by Life Technologies, Inc.). In certain experiments, transfected cells were treated with MG-132 at a final concentration of 40 ⁇ for 30 minutes.
  • In vitro ubiquitinating Atsushi was carried out as follows. () .5 / ⁇ Purified 03 fusion protein, 0.25 ⁇ g yeast El (Boston Biochem), 1 ⁇ l and 10 ⁇ g Ub of crude cell lysates from E. coli expressing E2s (Sigma) in 250 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1.2 M NaCl, 50 mM ATP, 10 mM MgCl, and 30 mM dithiothreitol.
  • reaction was stopped by adding SDS sample buffer.
  • the sample was analyzed by SDS-PAGE, transferred to a membrane, and immuno-plotted with an anti-ubiquitin monoclonal antibody (Medial Biological Laboratories).
  • Mammalian expression plasmids for hemagglutinin and (His6) -tagged ubiquitin were kindly provided by D. Bohmann.
  • the full-length NEDL1 cDNA was introduced into a mammalian expression plasmid pEFl / His (Invitrogen) or pIRESpuro2 (Clontech).
  • the cDNA encoding wild-type or mutant SOD1 was ligated to the carboxy terminus of the FLAG or Myc epitope tag sequence and subcloned into pIRESpuro2.
  • a FLAG or Myc epitope tag was conjugated to the carboxy terminus of TRAP ⁇ .
  • a FLAG or Myc epitope tag was conjugated to the amino terminus of Dvll.
  • the coding sequence is automatically sequenced Confirmed by column determination.
  • Anti-NEDL1 antibody and anti-TRAP ⁇ antibody were prepared for the NEDL1 oligopeptide (positions 460-482) and the TRAP ⁇ oligopeptide (positions 93-126), respectively, in Pergum.
  • COS7 cells or Neuro2a cells were co-transformed with expression plasmids in various combinations. After 48 hours, cells were incubated in TNE buffer (10 mM Tris-HCl pH7.8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) supplemented with a protease inhibitor cocktail (Sigma). Dissolved.
  • cell lysis was performed in RIPA buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) and then Strong sonication was performed.
  • the membrane is probed with a primary antibody, and these are probed with horseradish phenol oxidase (Jackson Immuno Research
  • COS7 cells were co-transformed with the expression plasmids (NEDL1 and FLAG-TRAP ⁇ ) shown in FIG.
  • Whole cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-FLAG antibody (first panel) or anti-NEDL1 antibody (second panel). Immunoprecipitates were immunoplotted (IB) using the indicated antibodies.
  • Whole cell lysates were analyzed for each protein expression level by immunoplot analysis. (3rd panel, 4th panel). Detection was performed using a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. Similar experiments were performed by transfecting COS7 cells with the xpress-NEDLl expression plasmid (Fig. 3). From these results, it was confirmed that the binding force between NEDL1 and TRAPS was exogenous TRAP ⁇ .
  • SOD1 mutants (L126S, H46R, D90A), which show a slow clinical course after onset, show little binding to NEDL1 (Fig. 4, lanes 11-13). It can be seen that the SOD1 mutant (G93A), which is a mutation showing a specific neurological symptom after onset, has moderate binding to NEDL1. In addition, it can be seen that wild-type SOD1 and NEDL1 do not bind (co-precipitation does not occur!) (Lane 2).
  • COS7 cells were transiently co-transfected with expression plasmids encoding FLAG-tagged TRAP ⁇ and Myc-tagged SOD1 mutants or Myc-tagged wild-type SOD1.
  • Whole cell lysates were immunoprecipitated with anti-Myc antibody (first panel) or anti-FLAG antibody (second panel) and then immunoplotted with anti-FLAG or anti-Myc antibody (FIG. 7).
  • Expression of the FLAG tag TRAP ⁇ or Myc tag SOD1 mutant was analyzed using an anti-FLAG antibody (third panel) or an anti-Myc antibody (fourth panel), respectively.
  • Example 4 NEDL1-Dependent Ubiquitin-Dani NEDL1 ubiquitinated the SOD1 mutant in a manner dependent on the type of SOD1.
  • COS7 cells were transiently co-transfected with the expression plasmids shown in FIG.
  • Whole cell lysates of transfused C0S7 cells were immunoprecipitated with anti-Myc antibody and immunoplotted with anti-ubiquitin antibody (top panel). The degree of ubiquitination was almost proportional to the clinical severity of FALS (A4V>G93A> H46R).
  • Whole cell lysates were immunoplotted with an anti-NEDL1 antibody to confirm expression of transfused NEDL1 (lower panel).
  • the arrow indicates the position of SOD1 which is not ubiquitinated, and the left side indicates the position of one molecular weight marker.
  • NEDL1 did not affect the degradation of wild-type SOD1. It can be seen that the degradation of the SOD1 mutant protein is accelerated, and in the presence of NEDL1, the half-life of the SOD1 mutant protein decreases almost in proportion to the severity of FALS (A4V> G93A> H46R).
  • the Myc tag Dvll was overexpressed together with NEDL1 in COS7 cells.
  • Whole cell lysates were immunoprecipitated with anti-NEDL1 antibody, followed by immunoplot with anti-Myc antibody (FIG. 8, upper panel).
  • Expression level of Myc-tagged Dvll was analyzed by immunoblot using anti-Myc antibody (lower panel)
  • COS7 cells were transiently co-transfected with the expression plasmids shown in FIG.
  • Whole cell lysates from transfused COS7 cells were immunoprecipitated with anti-Myc antibody and immunoblotted with anti-ubiquitin antibody (top panel).
  • Whole cell lysates were immunoplotted with anti-xpress-NEDLl antibody (middle panel) or anti-Myc antibody (lower panel) and transfected NEDL1 or The expression of Myc-Dvll was confirmed.
  • Neuro2a cells were transfected with an expression plasmid for FLAG tag Dvll in the presence or absence of the NEDL1 expression plasmid. After addition of cyclohexidine (final concentration 50 ⁇ g / ml), the transpheat cells were collected at different time points as shown in FIG.
  • Neuro2a cell lysates were immunoplotted with anti-FLAG antibody to analyze Dvll protein levels. In the presence of NEDL1, the half-life of FLAG-Dvll was significantly reduced.
  • COS7 cells were transiently co-transfected with the expression plasmids shown in FIG.
  • Whole cell lysates were immunoprecipitated with anti-Myc antibody and then immunoplotted with anti-FLAG or anti-Myc antibody. It can be seen that in the presence of NEDL1, the binding between Dvll and the SOD1 mutant was enhanced (Fig. 11, lane 4). It can also be seen that the binding ability decreases almost in proportion to the severity of FALS (A4V> G93A> H46R).
  • the present invention provides a method for evaluating the binding ability between NEDL1 and a SOD1 mutant or the binding ability between a NEDL1-related factor and a SOD1 mutant in the presence or absence of NEDL1. Further, it enables the determination of the clinical grade of the FALS patient from which the SOD1 mutant has been isolated, and is useful for the diagnosis of FALS.

Abstract

FALS患者由来の被検体からSOD1変異体を単離し、該SOD1変異体とNEDL1および／またはその関連分子であるTRAPδまたはDvl1との結合能を評価して、FALSの臨床悪性度を判定する。

Description

明 細 書
FALSの臨床悪性度の判定方法
技術分野
[0001] 本発明は、 NEDL1およびその関連因子と、 SOD1変異体との相互作用に基づぐ FALSの判定方法、或いは治療薬 (方法）に関する。
背景技術
[0002] 筋萎縮性側索硬化症 (ALS)は、脊椎、運動皮質、脳幹の運動ニューロンの変性、脱 落により筋萎縮を生じる、予後不良の神経変性疾患である。現在、家族性の
ALS(familial lateral sclerosis :以下、 FALSという)は、 ALS全体の 5— 10%の頻度で認め られる力 その一部の家系で原因遺伝子が、 CU/Znスーパーォキシドジスムターゼ (SOD1)遺伝子であることが判明しており、 FALS全体の約 20%が SOD1遺伝子変異を 原因としている。 SOD1は、好気性代謝の過程で細胞内に生じる活性酵素の一種で あり、スーパーォキシドを不活性ィ匕する。近年、変異型 SOD1 (以下、 SOD1変異体と Vヽぅ)が細胞内で凝集体を形成し、細胞毒性を発揮すると！ヽぅ凝集体仮説が FALSの 病因として最も有力なものとされつつある（非特許文献 1)。
[0003] 本発明者らは、以前予後良好な神経芽腫と予後不良な神経芽腫との比較におい て、予後良好な神経芽腫で発現が増強されている NEDL1と命名した新規な HECT型 ュビキチンライゲースを見出した (特許文献 1)。さらに、 NEDL1は SOD1変異体をュビ キチンィ匕することも見出した。
[0004] SOD1変異体の細胞内情報伝達経路については、不明な部分が多いが SOD1変異 体のみと結合し、正常 SOD1 (野生型 SOD1)とは結合しない蛋白因子として、小胞体ト ランスロコン成分である TRAP δ (translocon— associated protein complex)が報告され て ヽる (非特許文献 2、非特許文献 3)。
[0005] このように FALSの原因遺伝子である SOD1変異体とその関連分子との間の相互作 用については、解明されつつあるが、 FALSの病理発生については、前記凝集体仮 説が正 、としてもそのメカニズムの全容の解明には程遠 、現状である。
特許文献 1：国際公開 WO 03/018842パンフレット 非特許文献 1 :中野亮一、細胞工学、第 20卷、第 11号、 1508-1512、 2001 非特許文献 2 : Ryen D. Fons, et al, The Journak of Cell Biology, Vol. 160, No. 4,
2003 (529-539)
非特許文献 3 : Kunst C.B., et al, Nat. Genet. 15, 91-94 (1997)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] SOD1変異体とその関連分子との間の相互作用における NEDL1の役割について明 らかにし、 FALSの発症メカニズムの凝集体仮説を検証する。その過程において、各 種分子間の結合、相互作用を評価すると、 FALSの治療'診断につながる知見が得ら れる可能性がある。
[0007] 本発明は、 SOD1変異体とその関連分子との結合、相互作用（NEDL1が介在するか 、または介在しない）を遺伝子または蛋白レベルで解明することを 1つの目的とする。 さら〖こ、本発明は、そこで得られた知見を臨床に応用すること、すなわち FALSの新た な治療剤 (方法)、診断薬 (方法)を提供することを別の目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、 NEDL1力TRAP δとが結合し、さらにこれらは SOD1変異体と複合体 を形成して、該複合体における結合強度は FALSの臨床悪性度とほぼ比例することを 見出した。さらに、同様に NEDL1が Dishevelll (以下、 Dvllという)と結合し、さらにこれ らは SOD1変異体と複合体を形成して、該複合体における結合強度は FALSの臨床 悪性度とほぼ比例することを見出した。また、 NEDL1と SOD1変異体との相互作用も FALSの臨床悪性度とほぼ比例することを見出した。
[0009] 特定的には、 FALS患者由来の被検体から SOD1変異体を単離し、該 SOD1変異体 と TRAP Sとの結合能を評価することを特徴とする、 FALSの臨床悪性度の判定方法 が提供される。
[0010] また、 FALS患者由来の被検体力も SOD1変異体を単離し、該 SOD1変異体と
NEDL1および Dvllとの結合能を評価することを特徴とする、 FALSの臨床悪性度の判 定方法も提供される。
[0011] また、 FALS患者由来の被検体力も SOD1変異体を単離し、該 SOD1変異体と NEDLlとの結合能を評価することを特徴とする、 FALSの臨床悪性度の判定方法も提 供される。
[0012] 要するに、本発明は FALSの臨床悪性度の判定における NEDL1またはその基質の 使用を提供する。具体的には、その判定において、単離 SOD1変異体を用いることを 特徴とする。ここで、好ましくは前記基質は、 TRAP δまたは Dvllである。
[0013] くわえて、 SOD変異体と NEDL1および Zまたはその基質との相互作用における阻 害剤が提供される。
[0014] 好ましくは、前記基質が TRAP δまたは Dvllである。
[0015] また、神経細胞にお!/、て、候補薬剤が SOD変異体と NEDL1および Zまたはその基 質との相互作用における阻害剤であるカゝ否かを決定することを特徴とする、 FALSの 治療において有用な薬剤をスクリーニングする方法も提供される。
発明の効果
[0016] 本発明に従えば、 FALSの原因遺伝子である SOD1変異体とその関連分子 (TRAP
δ、 Dvll等）との間に NEDLlが介在して、複合体が形成されることが明ら力となり、 FALSの発症メカニズムとしての凝集体説が確かめられた。さら〖こ、このような複合体 における SOD1変異体と前記分子との結合能 (NEDL1を介する力 介さないかして）が FALSの臨床悪性度に関連しているので、該結合能を評価することによって、 FALSの 臨床悪性度を判定することができる。
[0017] また、上記の凝集体の形成を阻止することができれば、 FALSの治療に繋がる。した がって、本発明に従えば、 FALSの治療に有用であろう、 SOD変異体と NEDL1および Zまたはその基質との相互作用における阻害剤が見出される。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]図 1は、ヒト NEDLl(hNEDLl)とマウス NEDLl(mNEDLl)との間の保存的アミノ酸 配列のァライメントを示す図である。図中、右欄番号は、イニシエータ一であるメチォ ニンからの塩基数を表す。 C2ドメイン、 WWドメインおよび HECTドメインがそれぞれ 示されている。
[図 2]NEDL1と TRAP- δとの結合を示す免疫プロットした電気泳動図（免疫ブロット図 )である。 [図 3]NEDL1と内因性 TRAP- δとの結合を示す免疫プロットした電気泳動図である。
[図 4]NEDL1と SOD1変異体との結合を示す免疫プロット図である。
[図 5]NEDL1の野生型 SOD1および SOD1変異体に対するュビキチンィ匕を示す免疫ブ ロット図である。
[図 6]NEDL1の存在下、 SOD1変異体および野生型 SOD1の分解の経時変化を示す 免疫ブロット図である。
[図 7]S0D1変異体と外因性 TRAP δとの結合を示す免疫プロット図である。
[図 8]NEDL1と Dvllとの結合を示す免疫プロット図である。
[図 9]NEDL1の Dvllに対するュビキチン化を示す免疫プロット図である。
[図 10]NEDL1の存在下、 Dvllの分解の経時変化を示す免疫プロット図である。
[図 11]NEDL1の存在下、 SOD1変異体と Dvllとの結合を示す免疫プロット図である。
[図 12]FALS病理発生における SOD1変異体とその関連分子との間の相互作用の模 式図を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明について、好適な実施の形態を参照して、詳細に説明する。
[0020] 本発明に係る NEDL1遺伝子は、全長 6200塩基 (コード領域 4755塩基）を有する遺 伝子であり、その塩基配列を配列表の配列番号 2に示す。該遺伝子がコードする NEDL1タンパク質は、 1585個のアミノ酸からなり、その全長を配列表の配列番号 1に 示す。なお、前記塩基配列およびアミノ酸配列は、 GeneBank (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)に受理番号 AB048365として登録されて!、る。
[0021] 図 1にヒト NEDLl(hNEDLl)とマウス NEDLl(mNEDLl)のァライメント（ホモロジ一解析 )を示す。 NEDL-1タンパク質は、 HECT型ュビキチンリガーゼの特徴である以下のド メインを有することが分かる。すなわち、（1)N末端に C2ドメイン (カルシウム依存的に 膜脂質に結合する）、（2)中央部に WWドメイン (プロリンリッチ領域との結合に関与)、 (3)C末端領域に HECTドメイン (ュビキチン結合酵素 E2の結合部位)である。
[0022] NEDL1の基質を同定するために、本発明者らは、前記 WWドメイン（757-1114位） を用いて、 yeast two hybridスクリーニングを行った。その結果、 1つの基質として TRAP Sが見出された。 [0023] TRAP δは、小胞体膜を横切るタンパク質のトランスロケーションに関連する因子で ある、トランスロコン（translocon- associated protein)複合体の構成タンパク質の 1つの サブユニットである。 TRAP Sが野生型 SODとは結合しないが、 SOD1変異体と結合す ることは既に報告されている（Kunst C.B.ら、前掲)。そこで、本発明者らは、 NEDL1 、 TRAP S、および SODl間の相互作用を調べた。具体的には、 COS7細胞をこれらの 発現構築物で共トランスフエタトし、免疫プロットおよび免疫沈降アツセィによって、解 祈した。
[0024] NEDL1と TRAP δとの結合
上記の解析の結果、図 2、 3に示すように、 NEDL1は、内因性および外因性の TRAP δと結合していることが確認される。この結合は、 yeast two-hybridスクリーニングでも 前記 WWドメインを介していることが確認される。し力し、 TRAP Sは、 NEDL1によって ュビキチン化されない。
[0025] NEDL1 SOD1 の結合
上記の解析の結果、図 4に示すように、 NEDL1は、 SOD1変異体と結合する力 野生 型 SOD1とは結合しないことが確認される。また、 NEDL1と様々な SOD1変異体との結 合能は、 SOD1変異体が単離された FALS患者の臨床悪性度とほぼ比例することが分 かる。
[0026] くわえて、 NEDL1が SOD1変異体をュビキチン化することが確認され（図 5)、そのュ ビキチンィ匕の程度は、 SOD1変異体が単離された FALS患者の臨床悪性度とほぼ比 例することが分かる。
[0027] NEDL1の存在下、 SOD1変異体の分解の経時変化を示したもの力 図 6であるが、 ここでも臨床悪性度に比例して、 SOD1変異体が分解していることが分かる。
[0028] これらの結果から、 SOD1変異体のュビキチンィ匕を経由する分解には、 NEDL1が介 在し、臨床悪性度に比例して、分解が進行することが示される。
[0029] TRAP Sと SOD1との結合
上記の解析の結果、図 7に示すように、外因性 TRAP Sは、 SOD1変異体と結合する 力 野生型 SOD1とは結合しないことが確認される。また、 NEDL1の場合と同様に、 TRAP Sと様々な SOD1変異体との結合能は、 SOD1変異体が単離された FALS患者 の臨床悪性度とほぼ比例することが分かる。
[0030] 以上の結果および他の研究結果を総合して、 FALSの病理発生における NEDL1の 役割として、（l)NEDLlは、単独でまたは TRAP δと共に SODl変異体をュビキチンィ匕 する (2)NEDL1と TRAP Sは、 SOD1変異体と凝集体を形成し、これがゴルジ装置の断 片化を誘起、ニューロンのアポトーシスをもたらす (3)凝集体の形成は、 NEDL1および Zまたは TRAP δの機能不全を引き起こし、それが運動-ユーロン死に結びつく疾患 となる (4)NEDL1ZTRAP- δ ZSODl変異体の凝集体は、その正常な機能が運動-ュ 一ロンの生存に重要である分子シャペロンのような因子を取り込み、不活性化する、 などであろう。
[0031] 次いで、ュビキチンィ匕依存性蛋白分解時の NEDL1の基質を同定するために、本発 明者らは、 NEDL1の WWドメインを含む別のドメイン（382-1448位）を用いて、 yeast two hybridスクリーニングを行った。その結果、 Dvllが基質として同定された。
[0032] ヒト DV11は、 670個のアミノ酸力もなるタンパク質で、以下のドメインを有する。すなわ ち、（1)カノ-カル Wnt/TCFシグナリングに必要とされる DIXドメイン、（2)PDZドメイン（ Stbm、 CKI結合の標的）、（3)DEPドメイン (PCPシグナリング中の膜局在化に関与）で ある (D.J. Sussman et al, Dev. Biol. 166, 73—86 (1994); A. Wodarz et al, Cell Dev. Biol. 14, 59-88 (1998); M. Boutros et al., Cell, 94, 109-118 (1998》であり、 DEPドメ インと NEDL1の WWドメインが結合するものと考えられる。
[0033] TRAP δの場合と同様に、 NEDL1、 DV11および SODl間の相互作用を調べた。具体 的には、 COS7細胞をこれらの発現構築物で共トランスフエタトし、免疫プロットおよび 免疫沈降アツセィによって、解析した。
[0034] NEDL1と Dyllとの結合
上記の解析の結果、図 8に示すように、 NEDL1は、 Dvllと結合していることが確認さ れる。また、 NEDL1は、 Dvllをュビキチン化することが確認され、（図 9)さらに NEDL1 の存在下、 Dvllの分解の経時変化を示したものが図 10である。
[0035] Dyllと SOD1との結合
上記の解析の結果、図 11に示すように、 Dvllは、 SOD1と NEDL1の存在下結合する ことが確認される。また、 Dvllと様々な SOD1変異体との結合能は、 SOD1変異体が単 離された FALS患者の臨床悪性度とほぼ比例することが分かる。
[0036] ALS患者の運動-ユーロンで細胞骨格異常が報告されており、 NEDL1介在 Dvll分 解に対する前記の SOD1変異体の影響が運動-ユーロン死に関与していることは可 能である（Luo, Z.G. et al.， Neuron 35, 489-505(2002))。
[0037] H
神経細胞 E3ュビキチンリガーゼである NEDL1は、 TRAP Sと結合 (相互作用）するが 、 Dvllとも結合し、これをュビキチン化して分解する。 NEDL1は、このように SOD1変異 体、 DV11、 TRAP δと複合体を形成するので、特にュビキチン介在の分解を逃れた SOD1変異体と巨大な凝集体を形成する。標的タンパク質 (基質)である DV1ほたは TRAP Sの活性に影響を与える NEDL1の機能は、 SOD1変異体によって調節される。 これら個々の相互作用がすべて、 FALSの病理発生に関係しているようである。したが つて、前記複合体もしくは巨大凝集体形成の分子メカニズムの解明は、 ALSにおける 運動-ユーロン死を説明し、ひいては ALSに対する新たな治療薬 ·治療方法の展望 を開くことになる。図 12に、本発明において得られた知見に基づぐ FALS病理発生に おける SOD1変異体とその関連分子との間の相互作用の模式図を示す。
[0038] FAし Sの'治瘠剤および'治療方法
上記のような考察に基づいて、本発明によれば、 SOD1変異体と NEDL1および Zま たはその基質との相互作用における阻害剤の開発が提供される。阻害剤としての候 補薬剤は、核酸、タンパク質、低分子化合物 (化学合成または天然由来)、タンパク 質以外の高分子化合物などである。
[0039] このような阻害剤のスクリーニング方法としては、 Two-Hybrid System (例えば、 uyuns, J. し ell, 1993, 75, 791—803; uolemis, E. A., し urrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sions, Inc.) 1996, Ch. 20.0- 20.1)が挙げられる。また、免疫学 的手法で、阻害剤のスクリーニング法を実施することもできる。具体的には、細胞 (神 経細胞）内で SOD1変異体 (特に、臨床悪性度の高いもの）と NEDL1および Zまたは その基質を発現させ、一定時間候補薬剤と共に培養した後、細胞を粉砕して細胞溶 解液を調製する。一方の分子に対する抗体で免疫沈降させ、沈殿中に含まれる他方 の分子 (それ以外)を免疫学的手法 (免疫プロット等)で検出な!ヽし、定量することで、 候補薬剤の各分子の相互作用に及ぼす影響を検出できる。ここで、上記培養系に適 当なァゴ-ストと候補薬剤とを同時に添加して、上記アツセィを行い、候補薬剤を含 まない細胞からの免疫沈降物と比較することで阻害剤のスクリーニングが可能である
[0040] 上記のスクリーニング方法で同定された SOD1変異体と NEDL1および Zまたはその 基質における阻害剤であるタンパク質等は、 FALSを患う患者またはその可能性のあ る患者に経口的に、または非経口的に投与する。この目的で、そのタンパク質を薬学 的組成物として調製する。これは、有効量の該結合阻害を薬学的に許容される担体 、もしくは希釈剤と混合して、適当な剤形とする。投与に適した剤形は、錠剤、丸剤、 散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等である。
実施例
[0041] (方法）
(ヒト NEDL1 cDNAのクロー-ング）
ヒト NEDL1 cDNAのクローユングについては、国際公開 WO 03/018842パンフレット (PCT/JP02/08524)に詳述してある力 本発明では、以下のようにして、実施した。す なわち、フォワード 'プライマー（5，- GGTTTTTAGGCCTGGCCGCC- 3，、配列番号 3 )およびリバース ·プライマー（5， - CAATGAGGTACATGCCAATCC- 3，、配列番号 4 )を使用し、ヒト胎児脳（Stratagene社製）をテンプレートとして、 NEDLlcDNA (ヒト神経 芽細胞種からの cDNAライブラリー）の 5'部分を増幅した。全長ヒト NEDL1 cDNAは、 PCR増幅断片 (ヌクレオチド 1位 (翻訳開始部位)一 68位）と KIAA0322 cDNA ( (財)か ずさ DNA研究所、 T.Nagase氏より寄贈）と融合させて、作成した。
[0042] (細胞培養およびトランスフエクシヨン）
細胞は、 10%熱不活性化ゥシ胎児血清（FBS、 Life Technologies, Inc.)、ペニシリン (100IU/ml)、ストレプトマイシン (100 μ g/ml)を添カ卩した RPMI1640培地で増殖した。 COS7および Neuro2a細胞は、 10%熱不活性化ゥシ胎児血清とペニシリン (100IU/ml) Zストレプトマイシン (100 μ g/ml)を添カ卩したダルベッコ変法イーグル培地 (Dulbecco' s modified Eagle medium: DMEM)に維持した。細胞は、空気中水飽和 5%炭酸ガス雰 囲気下、 37°Cで培養し。各発現プラスミドの共トランスンスフエクシヨンは、製造者の指 示書に従い、リポフエクトァミン (LipofectAMINE、 Life Technologies, Inc.社製)を用い て実施した。ある種の実験では、トランスフエタトした細胞を MG-132を用いて、終濃度 40 μ Μで 30分間処理した。
[0043] (Yeast Two-Hybrid screening)
スクリーニングは、ヒト胎児脳（1次スクリーニング)およびヒト成人脳（2次スクリーニン グ）から得られた cDNAライブラリーを用いる、 Gal4- based matchmaker two-hybrid system (し lonetech社製) 使用し飞実行し 7こ。 Saccharomyces cereviciaeし G丄 945糸田 胞を pAS2- 1- NEDL1- 1 (757- 1114位、 1次スクリーニング）または pAS2- 1- NEDL1- 2 ( 382-1448位、 2次スクリーニング)で形質転換した。これらの発現ベクターは共に LacZ の転写のみを活性ィ匕しな ヽ。形質転換体をさらに前記 cDNAライブラリーで形質転換 した。 LacZ陽性コロニーを選択した。これら陽性コロニーからプラスミド DNAを抽出し て、その核酸配列を決定した。
[0044] (インビトロュビキチンィ匕アツセィ）
インビトロュビキチンィ匕アツセィは、以下のように実施した。（).5 /^の精製03丁融合 蛋白、 0.25 μ g酵母 El(Boston Biochem社製)、 E2sを発現する E. coliからの粗細胞溶 解物 1 μ 1および 10 μ gゥシ Ub(Sigma社製)を 250 mM Tris— HCl(pH7.6)、 1.2 M NaCl、 50 mM ATP、 10 mM MgCl、および 30 mMジチオスレィトール中でインキュベートし
2
た。 30°Cで 2時間後、 SDSサンプルバッファを添カ卩して、反応を停止した。試料を SDS-PAGEで分析し、メンブランに移し、抗ュビキチンモノクローナル抗体 (Medial Biological Laboratories社製)で免疫プロットした。
[0045] (発現構築物）
へマグルチニンタグおよび (His6)タグされたュビキチンの哺乳動物用発現プラスミド は、 D. Bohmann氏より寄贈された。全長 NEDL1 cDNAを哺乳動物用発現プラスミド pEFl/His (Invitrogen社製)または pIRESpuro2 (Clontech社製)に導入した。野生型ま たは変異型の SOD1をコードする cDNAを FLAGもしくは Mycェピトープタグ配列の力 ルボキシ末端に接合し、 pIRESpuro2にサブクロニーングした。同様に、 FLAGもしくは Mycェピトープタグを TRAP δのカルボキシ末端に接合した。さらに、 FLAGもしくは Mycェピトープタグを Dvllのァミノ末端に接合した。コード配列は、自動 DNA塩基配 列決定によって確認した。
[0046] (免疫沈降およびウェスタンプロット分析）
ゥサギで NEDL1オリゴぺペチド (460- 482位)と TRAP δオリゴペプチド (93- 126位)に 対して、それぞれ抗 NEDL1抗体と抗 TRAP δ抗体を作成した。免疫沈降実験では、 COS7細胞または Neuro2a細胞を様々な組合わせで、発現プラスミドを用いて共トラス フエタトした。 48時間後、プロテアーゼ阻害剤カクテル (Sigma社製)を追加した TNEバ ッファ (10 mM Tris-HCl pH7.8、 150 mM NaCl、 1% NP— 40、 1 mM EDTA、 1 mM PMSF)中で細胞溶解した。全細胞溶解物を抗 NEDL1抗体、抗 FLAG抗体 (M2、 Sigma 社製)または抗 Myc抗体 (9B11、 Cell Signaling Technology社製)を用いて、免疫沈降さ せた。免疫複合体を GTP結合タンパク質セファロースビーズ上で回収し、 Laemmliサ ンプルバッファ中で沸騰させて溶出し、 SDSポリアミドゲルで電気泳動し、エレクトロブ ロットによりポリビ-リデンジフルオリドメンブラン (Immobilon、 Millipore社製)に移した 。ュビキチン化実験では、細胞溶解を RIPAバッファ (10 mM Tris-HCl pH7.4、 150 mM NaCl、 1% NP- 40、 0.1%デォキシコール酸ナトリウム、 0.1% SDS、 1 mM EDTA)中 で実施し、その後強力な超音波処理を行った。メンブレンを第 1抗体でプローブし、そ れカらホースラティシュぺノレォキシダーゼ (Jackson Immuno Research
Laboratories/ southern Biotechnology Associates, Inc.製)で標識し 7こ二次饥体とと ¾ にインキュベートした。免疫反応性のバンドを ECL増強化学発光法 (Amersham Pharmacia Biotech社)によって検出した。タンパク質分解実験では、 Neuro2細胞を所 定の発現プラスミドでトランスフエタトした。トランスフエクシヨンの 48時間後、細胞をシ クロへキシミド (Sigma社製)の 50 μ g/ml濃度で所定時間処理した。その後、全細胞溶 解物の等量 (50 μ g)をウェスタンブロットにかけ、続いて Intelligent Quantifier software(Bio Image社製)を用いて、定量した。
[0047] (実施例 1) NEDL1と TRAP Sとの結合
COS7細胞を図 2に示した発現プラスミド（NEDL1および FLAG- TRAP δ )で共トラン スフ タトした。全細胞溶解物を抗 FLAG抗体 (第 1パネル)または抗 NEDL1抗体 (第 2 パネル)で免疫沈降 (IP)させた。免疫沈降物を図に示した抗体を用いて免疫プロット (IB)した。全細胞溶解物を各タンパク質の発現レベルについて、免疫プロット解析し た (第 3パネル、第 4パネル)。検出は、ホースラデイシュペルォキシダーゼ共役された 二次抗体を用いて行った。 COS7細胞を xpress-NEDLl発現プラスミドでトランスフエク トし、同様の実験を行った（図 3)。これらの結果から、 NEDL1と TRAP Sとの結合力外 因性 TRAP δについて確認された。
[0048] (実施例 2) NEDL1と SOD1変異体との結合
NEDL1および FLAGタグ SOD1変異体または野生型 SOD1を過剰発現する COS7細 胞からの全細胞溶解物を抗 FLAG抗体 (第 1パネル)または抗 NEDL1抗体 (第 2パネ ル）を用いて、免疫沈降させ、それから抗 NEDL1抗体または抗 FLAG抗体を用いて、 免疫プロットした。 NEDL1または FLAGタグ SOD1変異体の発現を抗 NEDL1抗体（第 3 パネル)または抗 FLAG抗体 (第 4パネル)を用いて、それぞれ解析した（図 4)。発症 後、急速な臨床経過を迪り、患者が 1.5年以内に死亡する SOD1変異体 (C6F、 A4V) は、 NEDL1と強く結合していることが分かる（図 4、レーン 3、 4)。一方、発症後緩徐な 臨床経過を示す、 SOD1変異体（L126S、 H46R、 D90A)は、ほとんど NEDL1と結合を していないことが分かる（図 4、レーン 11一 13)。発症後特異な神経症状を示す変異で ある、 SOD1変異体（G93A)は、 NEDL1と中程度の結合をしていることが分かる。また 、野生型 SOD1と NEDL1は結合しな 、（共沈しな!ヽ）ことも分かる（レーン 2)。
[0049] (実施例 3) TRAP Sと SOD1変異体との結合
COS7細胞を FLAGタグ TRAP δおよび Mycタグ SOD1変異体または Mycタグ野生型 SOD1をコードする発現プラスミドで一過的に共トランスフエタトした。全細胞溶解物を 抗 Myc抗体 (第 1パネル)または抗 FLAG抗体 (第 2パネル)を用いて、免疫沈降させ、 それから抗 FLAG抗体または抗 Myc抗体を用いて、免疫プロットした（図 7)。 FLAGタ グ TRAP δまたは Mycタグ SOD1変異体の発現を抗 FLAG抗体 (第 3パネル)または抗 Myc抗体 (第 4パネル)を用いて、それぞれ解析した。発症後、急速な臨床経過を迪り 、患者力 1.5年以内に死亡する SOD1変異体 (A4V)は、 TRAP δと強く結合していること が分かる（図 7、レーン 4)。一方、発症後緩徐な臨床経過を示す、 SOD1変異体（ H46R)は、ほとんど TRAP Sと結合をしていないことが分かる（レーン 6)。また、野生型 SOD1と TRAP δは結合しな 、（共沈しな!、）ことも分かる（レーン 3)。
[0050] (実施例 4) NEDL1依存性ュビキチンィ匕 NEDL1は、 SOD1変異体を SOD1のタイプに依存する様式でュビキチン化した。 COS7細胞を図 5に示した発現プラスミドを用いて、一過的に共トランスフエタトした。ト ランスフエタトした C0S7細胞力ゝらの全細胞溶解物を抗 Myc抗体で免疫沈降させて、 抗ュビキチン抗体を用いて免疫プロットした (上部パネル)。ュビキチンィ匕の程度は、 ほぼ FALSの臨床重症度 (A4V〉G93A〉H46R)に比例した。全細胞溶解物を抗 NEDL1 抗体で免疫プロットし、トランスフエタトした NEDL1の発現を確認した（下部パネル)。 図中、矢印は、ュビキチンィ匕されていない SOD1の位置を示し、左側に分子量マーカ 一の位置を示してある。
[0051] (実施例 5) NEDL1の存在下、または不在下の野生型 SOD1および SOD1変異体の 半減期
シクロへキシジンを添加後（終濃度 50 μ g/ml)、図 6に示したような異なる時点で回 収した、空ベクターまたは NEDL1発現プラスミドでトランスフエタトした Neuro2a細胞の 溶解物を抗 FLAG抗体で免疫プロットして、 SOD1蛋白レベルを分析した。 SOD1変異 体は、野生型 SODはり迅速に分解された。 NEDL1は、野生型 SOD1の分解に影響を 及ぼさなかった。 SOD1変異体タンパク質の分解は、促進され、 NEDL1の存在下、 SOD1変異体タンパク質の半減期は、ほぼ FALSの重症度 (A4V〉G93A〉H46R)に比例 して減少してゆくことが分かる。
[0052] (実施例 6) NEDL1と Dvllとの結合
COS7細胞中、 Mycタグ Dvllを NEDL1とともに過剰発現させた。全細胞溶解物を抗 NEDL1抗体で免疫沈降させ、続いて抗 Myc抗体を用いて免疫プロットした（図 8の上 部パネル）。 Mycタグ Dvllの発現レベルを抗 Myc抗体を用いて、免疫ブロットし解析し た（下部パネル）
[0053] (実施例 7) Dvllの NEDL1依存性ュビキチン化
NEDL1は、 COS7細胞中 Dvllをュビキチン化した。 COS7細胞を図 9に示した発現プ ラスミドを用いて、一過的に共トランスフエタトした。トランスフエタトした COS7細胞から の全細胞溶解物を抗 Myc抗体で免疫沈降させて、抗ュビキチン抗体を用いて免疫 ブロットした（上部パネル)。全細胞溶解物を抗 xpress-NEDLl抗体（中段パネル)また は抗 Myc抗体（下段パネル)で免疫プロットし、トランスフエタトした NEDL1または Myc- Dvllの発現を確認した。
[0054] (実施例 8) NEDL1による Dvllの分解
Neuro2a細胞を FLAGタグ Dvll用の発現プラスミドを用いて、 NEDL1発現プラスミド の存在下、または不在のもとでトランスフエタトした。トランスフエタト細胞をシクロへキ シジン添加後（終濃度 50 μ g/ml)、図 10に示したような異なる時点で回収した。
Neuro2a細胞溶解物を抗 FLAG抗体で免疫プロットして、 Dvll蛋白レベルを分析した 。 NEDL1の存在下、 FLAG- Dvllの半減期は、顕著に減少した。
[0055] (実施例 9) Dvllと SOD1変異体との結合
COS7細胞を図 11に示した発現プラスミドで一過的に共トランスフエタトした。全細胞 溶解物を抗 Myc抗体で、免疫沈降させ、それから抗 FLAG抗体または抗 Myc抗体を 用いて、免疫プロットした。 NEDL1の存在下、 Dvllと SOD1変異体との結合が強まって いることが分かる（図 11、レーン 4)。結合能は、ほぼ FALSの重症度 (A4V〉G93A〉 H46R)に比例して減少してゆくことも分かる。
産業上の利用可能性
[0056] 以上説明したように、本発明は、 NEDL1と SOD1変異体との結合能、或いは NEDL1 存在下、または非存在下での NEDL1関連因子と SOD1変異体との結合能を評価する ことによって、前記 SOD1変異体が単離された FALS患者の臨床悪性度の判定を可能 にし、 FALSの診断に役に立つ。

Claims

請求の範囲
[1] FALS患者由来の被検体から SOD1変異体を単離し、該 SOD1変異体と TRAP δとの 結合能を評価することを特徴とする、 FALSの臨床悪性度の判定方法。
[2] FALS患者由来の被検体力 SOD1変異体を単離し、該 SOD1変異体と NEDL1および
Dvllとの結合能を評価することを特徴とする、 FALSの臨床悪性度の判定方法。
[3] FALS患者由来の被検体力 SOD1変異体を単離し、該 SOD1変異体と NEDL1との結 合能を評価することを特徴とする、 FALSの臨床悪性度の判定方法。
[4] FALSの臨床悪性度の判定における NEDL1またはその基質の使用。
[5] 単離 SOD1変異体を用いることを特徴とする請求項 4に記載の NEDL1の使用。
[6] 前記基質が TRAP δまたは Dvllであることを特徴とする請求項 5に記載の NEDLlの使 用。
[7] SOD1変異体と NEDL1および Zまたはその基質との相互作用における阻害剤。
[8] 前記基質が TRAP δまたは Dvllであることを特徴とする請求項 7に記載の阻害剤。
[9] 神経細胞において、候補薬剤が SOD変異体と NEDL1および Zまたはその基質との 相互作用における阻害剤である力否かを決定することを特徴とする、 FALSの治療に ぉ 、て有用な薬剤をスクリーニングする方法。
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