KR20170101011A

KR20170101011A - Usp35 단백질 또는 usp35 단백질 발현 벡터를 포함하는 염색체 이상을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 및 usp35 단백질을 이용하는 방법

Info

Publication number: KR20170101011A
Application number: KR1020160023649A
Authority: KR
Inventors: 송은주; 박진영; 김은경
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-09-05

Abstract

USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 유효 성분으로 포함하는 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, 염색체 이상을 진단하는 방법 및, 및 염색체 이상을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 의하면 개체 또는 세포의 염색체 이상을 효율적으로 예방 또는 치료하고, 염색체 이상을 효율적으로 진단하고, 염색체 이상을 치료할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 포함하는 염색체 이상을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 및 USP35 단백질을 이용하는 방법{Pharmaceutical composition comprising USP35 protein or USP35 protein expression vector for preventing or treating chromosome aberration and method using USP35 protein}

USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 유효 성분으로 포함하는 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, 염색체 이상을 진단하는 방법 및, 및 염색체 이상을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzymes)는 유비퀴틴 연결 효소인 E3 효소에 의해 특정 단백질에 붙은 하나의 유비퀴틴 단백질, 또는 다중 유비퀴틴 단백질 사슬을 제거해주는 효소이다. 탈유비퀴틴화 효소는 세포 주기나 유전자 손상 및 복구, 또는 세포 신호 전달 등과 같은 전반적인 세포 생리를 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 인간 게놈 분석 결과, 약 100여개의 탈유비퀴틴화 효소가 발견되었으나 안타깝게도 그 중요성에 비해 아직까지 많은 탈유비퀴틴화 효소들의 기능이 알려지지 않았다. USP35 단백질 역시 세포 내에서 어떠한 역할을 하는지 정확하게 알려지지 않은 탈유비퀴틴화 효소이다. 이러한 USP35의 정확한 기능 및 분자적 기전을 알아낸다면, 세포 주기 변화에 의해 발병되는 다양한 질환을 치료하는데 도움이 될 수 있다.

일 양상은 USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 유효 성분으로 포함하는 개체 또는 세포의 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA를 이용하는 개체 또는 세포의 염색체 이상을 진단하는 방법 및 키트를 제공한다.

다른 양상은 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA를 이용하는 개체 또는 세포의 염색체 이상을 치료할 수 있는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 양상은 USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 유효 성분으로 포함하는 개체의 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

유비퀴틴 특이적 펩티다제 35(ubiquitin specific peptidase 35: USP35) 단백질은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 USP35 코딩 서열로부터 발현된 것일 수 있다. USP35 단백질은 NCBI Accession No: NM_020798.2, GI number: 291219935의 서열을 포함하는 mRNA로부터 번역된 것일 수 있다. 또한 USP35 단백질은 NCBI Accession No: AAI31490.1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어 USP35 단백질은 천연적으로 존재하는 USP35 및 그의 탈유비퀴틴화 활성이 존재하는 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.

상기 개체는 포유동물일 수 있다. 또한 상기 개체는 그로부터 분리된 조직 또는 세포를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 포유동물은 인간, 영장류, 마우스, 랫, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이 또는 그 조합일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서, 숙주 세포 내에 도입되면 독립적으로 복제되어 벡터 및 내부에 삽입된 외래 DNA 등의 카피를 생산한다. 용어 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)" 또는 "발현 벡터"는 특정 단백질의 증폭을 목적으로 내부에 외래 DNA 단편을 삽입시킨 벡터로서, 상기 외래 DNA 단편은 특정 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 발현 또는 클로닝을 목적으로 한 벡터 시스템의 구축은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행 가능하다.

상기 벡터는 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 코딩 서열의 발현을 수행하는데 필요한 핵산 서열을 지칭하며, 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다.

상기 발현 벡터는 조절 서열 외에, 제한 효소 절단 부위, 약물 저항성 유전자와 같은 마커 유전자, 분비 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 제한효소 절단 부위는 제한효소에 의해 특이적으로 인식되어 절단되는 특정한 염기 서열을 지칭한다. 상기 절단 부위는 예를 들면, EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, SalI, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, 및 Xho I과 같은 제한효소에 의해 특이적으로 인식되는 서열일 수 있다. 상기 마커 유전자는 선택 표지로서 기능하며, 암피실린, 게나마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 및 테트라사이클린과 같은 약물의 내성 유전자일 수 있다. 상기 분비 신호 서열 또는 리더 서열은, 합성된 단백질을 세포 구획 (예를 들면, 주변 세포질 공간(periplasmic space))으로 향하게 하거나 세포외 배지로 분비하도록 유도하는 서열로, 전술된 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 이와 같은 서열들은 도입되는 DNA, 숙주 세포의 종류, 배양 배지의 조건 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 USP35 단백질 발현 벡터는 예를 들면 도 1에 도시된 벡터 구조를 갖는 것일 수 있다.

상기 숙주 세포는 상기 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시켜 생성될 수 있다. 상기 숙주 세포는 상기 발현 벡터를 안정화하고 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 원핵 생물 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 원핵 생물은 단백질의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환될 수 있는 박테리아를 지칭한다. 재조합 발현 벡터의 숙주 세포로의 형질전환은 예를 들면, DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 스크래프 로딩(scrape loading) 및 감염(infection) 등에 의해 수행될 수 있다.

숙주 세포의 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지 및 배양조건을 사용하여 수행될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들면 LB 배지, Ham's F10 (Sigma), MEM (Minimal Essential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma)등이 이용될 수 있다. 필요한 경우, 호르몬 또는 기타 성장 인자, 염, 완충제, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코오스 등이 공지된 적합한 농도로 보충될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 선택된 숙주 세포에 따라 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

숙주 세포에 의해 발현된 폴리펩티드는 분비 신호 펩티드에 의해 세포 외로 분비될 수 있으며, 이 경우 배양액 또는 배지로부터 이를 회수함으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 배양 상청액을 시판되는 단백질 필터를 사용하여 농축시켜 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 그러나, 분비 신호 서열이 없이 발현된 경우, 상기 폴리펩티드는 세포 내 페리플라즘 공간에 존재하므로 세포 용해물(cell lysate)로부터 직접 수득될 수 있다. 페리플라즘 공간으로 분비되는 폴리펩티드를 단리시키는 공정은 공지되어 있으며, 일반적으로 미립자 파편(숙주 세포 또는 분해된 단편)을 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다.

선택적으로, 이러한 배양물로부터 수득된 폴리펩티드를 당업계에 공지된 방법에 의해 추가적으로 정제할 수 있다. 예를 들면, 회수되는 폴리펩티드에 따라, 상기 폴리펩티드는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 분별 용해(예를 들면, 암모늄 술페이트 침전)와 같은, 통상의 단백질 정제 기술을 사용할 수 있다.

용어 "염색체 이상"은 염색체의 수나 구조에 이상이 있는 염색체 돌연변이를 의미한다. 상기 염색체 이상은 유사 분열 또는 감수 분열 도중 염색체 불분리 현상에 의해 발생할 수 있다. 상기 염색체 이상은 정상적인 염색체 수보다 많거나 적은 수의 염색체 수를 갖는 염색체 이수성(aneuploidy)을 포함한다. 염색체 이수성은 암, 종양, 다운증후군, 클라인펠터 증후군, 묘성 증후군, 또는 야콥 증후군 등의 질병의 원인이 될 수 있다.

한편, Aurora B(또는 Aurora 키나제 B) 단백질은 염색체 승객 단백질(Chromosomal passenger protein)로서 방추체 형성 확인지점 경로(Spindle assembly checkpoint pathway)의 최상위 조절자이며 그의 발현과 활성이 세포 주기에 따라 다르게 조절되는 단백질이다. 세포분열 초기 단계에서는 Aurora B가 동원체(centromere)에 위치하여 방추체와 동원체 간의 연결이 제대로 이루어질 수 있도록 도움을 주고, 이후 세포분열 과정 후기가 시작되면 방추체의 중앙으로 이동하여 세포질분열이 온전히 이루어질 수 있도록 도와준다. Aurora B 단백질은 NCBI Accession No: NC_000017.11의 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 코딩서열로부터 발현된 것일 수 있다. 또한 Aurora B 단백질은 그의 모든 이소폼을 포함하는 것으로 해석되며, NCBI Accession No: NP_001300884.1, NP_001300883.1, NP_001300882.1, NP_001300881.1, NP_001300880.1, 또는 NP_001300879.1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어 Aurora B 단백질은 천연적으로 존재하는 Aurora B 및 그의 키나제 활성이 존재하는 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.

본 발명자들은 USP35 단백질이 Aurora B 단백질의 안정성을 유지시키고, 기능을 조절하여 정상적인 세포 분열 과정이 진행될 수 있도록 하는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서 본 발명의 USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터는 개체의 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위한 물질로서 이용될 수 있다.

다른 양상은 개체의 염색체 이상의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 분리된 시료와 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA와 상기 물질의 복합체를 형성시키는 단계; 상기 복합체로부터 상기 시료 중의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 수준을 대조군에서의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준과 비교하는 단계; 및 상기 분리된 시료에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 대조군의 수준과 비교하여 변화한 경우 개체가 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 개체의 염색체 이상을 진단하는 방법을 제공한다.

상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 개체의 염색체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질은 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제(agonist) 또는 길항체(antagonist), 폴리뉴클레오티드 또는 그 조합일 수 있다. 상기 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질은 고속 대량 스크리닝(high throughput screening: HTS) 등 당업계에 알려진 방법에 따라 선별할 수 있고, 또는 상업적으로 구매 가능한 것일 수 있다.

상기 방법은 또한 상기 복합체의 수준을 측정하여 시료 중의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 복합체를 다시 분리하여 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 것, 또는 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 그 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩(protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 대조군에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 염색체 이상에 걸리지 않은 개체일 수 있다.

상기 방법은 또한 상기 개체의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우 개체를 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수준의 변화는 개체의 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법은 또한 상기 결정하는 단계는 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 양성 대조군 또는 정상 대조군에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준보다 낮은 경우, 상기 개체는 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 결정하는 단계는 상기 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 양성 대조군 또는 정상 대조군에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준과 동등하거나 높은 경우, 상기 개체는 염색체 이상이 없는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은 Aurora B 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 Aurora B 단백질의 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우 개체를 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 Aurora B 단백질의 수준이 양성 대조군 또는 정상 대조군에서 측정된 Aurora B 수준보다 낮은 경우, 상기 개체는 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 같은 것은 이미 언급된 바와 같다.

다른 양상은 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 개체의 염색체 이상을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

상기 수준은 USP35 유전자의 mRNA 또는 단백질 단계에서의 발현 수준인 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 USP35 유전자의 mRNA의 양, 단백질의 양, 또는 그 조합을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제제는 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질인 것일 수 있다.

상기 키트는 예를 들면 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정할 수 있는, 염색체 이상 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 염색체 이상 진단용 마이크로어레이는 상기 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 USP35 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다.

상기 키트가 USP35 유전자의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 물질, 상기 물질의 면역학적 검출을 위한 기질, 적합한 버퍼, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 또는 유리 슬라이드글라스가 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, 또는 RITC가 사용될 수 있다. 발색 기질은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), 또는 TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

상기 조성물 및 키트는 Aurora B 단백질의 수준을 측정하기 위한 제제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 같은 것은 이미 언급된 바와 같다.

다른 양상은 후보물질이 투여된 개체로부터 분리된 시료와 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA와 상기 물질의 복합체를 형성시키는 단계; 상기 복합체로부터 상기 시료 중의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 수준을 대조군에서의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준과 비교하는 단계; 및 상기 분리된 시료에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 대조군의 수준과 비교하여 변화한 경우 상기 후보 물질을 염색체 이상의 예방 또는 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 염색체 이상 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 후보 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 후보 물질은 염색체 이상의 예방 또는 치료에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 물질일 수 있다. 후보 물질을 투여하는 경로는 선택되는 물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여 경로는 예를 들면, 정맥 내, 근육 내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관 내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의한 경로일 수 있다. 상기 물질은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 또는 이미 개체로부터 분리된 시료에 후보 물질을 투여할 수 있다.

상기 방법은 상기 개체의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우, 상기 후보 물질을 염색체 이상의 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수준의 변화는 개체의 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법은 또한 상기 결정하는 단계는 분리된 시료에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 후보 물질을 투여하지 않은 대조군에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준보다 높아지는 경우, 그 후보 물질은 염색체 이상을 예방 또는 치료하는데 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 결정하는 단계는 상기 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 후보 물질을 투여하지 않은 대조군에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준보다 같거나 낮은 경우, 그 후보 물질은 염색체 이상을 예방 또는 치료하는데 효과적이지 않은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은 Aurora B 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 Aurora B 단백질의 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우, 그 후보 물질은 염색체 이상을 예방 또는 치료하는데 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 측정된 Aurora B 단백질의 수준이 후보 물질을 투여하지 않은 대조군에서 측정된 Aurora B 수준보다 높은 경우, 상기 후보 물질은 염색체 이상을 예방 또는 치료하는데 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA를 이용하는 방법 및 키트는 개체 또는 세포의 염색체 이상을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA를 이용하는 스크리닝하는 방법은 개체 또는 세포의 염색체 이상을 치료할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

도 1은 USP35 발현 벡터 p3XFLAG-CMV7.1의 벡터 구조를 나타낸다.
도 2는 Aurora B 발현 벡터 pCMV-Myc-N의 벡터 구조를 나타낸다.
도 3a는 HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 형질주입하고, 이후 대조군 발현 벡터, 야생형 USP35 단백질 발현 벡터, 또는 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 형질주입한 세포를 각 세포 분열 단계에서 TPX2 항체로 면역 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 도 3b는 각 세포 분열 단계별로 TPX2 항체로 염색한 세포들의 수를 세고 그 중 비정상적인 분열을 일으키는 세포의 수를 계산한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SD이고 *, p<0.05이다.
도 4a는 HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 형질주입한 후 세포 주기와 관련된 여러 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 비교한 것이다. 도 4b는 HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 형질주입하고 세포주기 G2/M기에서 모든 세포의 성장을 멈추게 한 후, 다시 성장이 진행될 수 있게 하고 일정한 시간 간격으로 세포를 수득하여, 각 수득 시간별 여러 단백질들의 수준을 웨스턴 블롯으로 비교한 것이다. 도 4c는 HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 형질주입하고, 각 세포를 Aurora B 항체와 β-투불린(tubulin) 항체로 염색하여 염색된 세포들을 세포분열과정의 단계별로 나누어 형광현미경을 이용하여 관찰한 것을 나타낸다. 도 4d는 각 세포 분열 단계별로 Aurora B 단백질의 염색 정도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD이고 **, p<0.005이다.
도 5a는 HEK293T 세포에 flag-USP35 단백질 발현 벡터와 HA-Aurora B 단백질 발현 벡터를 함께 형질주입 하고 flag로 면역 침전을 실행한 후, 웨스턴 블롯으로 두 단백질의 결합을 확인한 것을 나타낸다. 도 5b 및 3c는 HEK293T 세포에 USP35 단백질 발현 벡터 또는 Aurora B 단백질 발현 벡터를 형질주입한 후, MG132를 세포에 처리하고, 니켈-풀다운 방법을 통해 USP35 단백질에 의한 Aurora B 단백질의 탈유비퀴틴화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 것을 나타낸다. 도 5b는 USP35 변이체, 도 5c는 USP15에 의해서는 Aurora B의 탈유비퀴틴화가 일어나지 않는 것을 나타낸다. 도 5d는 HEK293T 세포에 USP35 단백질 발현 벡터 또는 Aurora B 단백질 발현 벡터에, CHD1 발현 벡터를 더 형질주입한 후, MG132를 세포에 처리하고 니켈-풀다운 방법으로 USP35 단백질에 의한 Aurora B 단백질의 탈유비퀴틴화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 것을 나타낸다.
도 6a는 USP35의 탈유비퀴틴화 위치를 확인하기 위한 USP35의 탈유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸다. 도 6b는 USP35 녹-다운 세포에 MG132를 처리한 후 Aurora B의 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 것을 나타낸다. 도 6c는 HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 형질주입하고 세포주기 G2/M기에서 모든 세포의 성장을 멈추게 한 후, 시클로헥사미드(cyclohexamide)를 처리하고 일정한 시간 간격으로 세포를 수득하여, 각 수득 시간별 여러 단백질들의 수준을 웨스턴 블롯으로 비교한 것이다. 도 6d는 HeLa 세포에 대조군 발현 벡터, 야생형 USP35 단백질 발현 벡터 또는 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 형질주입하고 시클로헥사미드를 처리한 후, 일정한 시간 간격으로 세포를 수득하여, 각 수득 시간별 Aurora B 단백질의 안정성을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7a는 HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 형질주입하고, 이후 대조군 발현 벡터, 야생형 USP35 단백질 발현 벡터, 또는 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 다시 형질주입한 경우, Aurora B와 그와 관련된 단백질 양의 변화를 웨스턴 블롯을 통해 관찰한 결과를 나타낸다. 도 7b는 USP35 녹다운 세포들의 히스톤 3 인산화 단백질을 면역 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 도 7c는 히스톤 3 인산화 단백질의 항체로 면역 염색된 세포의 수를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD이고 *, p<0.05, **, p<0.005이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. USP35의 Aurora B 안정성 유지 및 이에 의한 Aurora B 기능 조절 확인

1. 실험재료 및 실험방법

(1) 세포 배양

HEK293T와 HeLa 세포를 10% FBS(Hyclone, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone, USA)에서 배양하였다.

(2) siRNA 및 발현 벡터 형질주입

대조군 siRNA 음성 대조군과 USP35에 대한 siRNA(5'-CCAAGAGGAAGGATGGTAC-3')는 Bioneer(Korea)에서 합성하였다. siRNA는 리포펙타민(Lipofectamine)(Invitrogen, USA)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 형질주입 하였다. 야생형 USP35 단백질 발현 벡터(p3XFLAG-CMV7.1)는 Genescript(USA)에서 구매하였고 도 1에 도시된 벡터 구조를 가졌다. Aurora B 단백질 발현 벡터(pCMV-Myc-N)는 성균관대학교 의과대학 이창우 교수로부터 제공 받았으며 도 2에 도시된 벡터 구조를 가졌다. 발현 벡터는 2 M CaCl₂ 와 2X HBS(50 mM HEPES, 10 mM KCl, 12 mM 글루코스, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HPO₄, pH 7.05) 완충용액을 이용하여 세포에 형질주입 하였다.

(3) 웨스턴 블롯

각 세포를 수득하여 단백질 용해 버퍼(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl. 0.5 % NP40, 1 mM EDTA, pH 7.5)를 이용하여 단백질을 준비하였다. 20-50 μg의 단백질을 5X SDS 샘플 버퍼와 함께 100℃에서 5분간 끓여준 후 6-15 % 겔에 걸어 SDS-PAGE로 분리하였다. 겔에 있는 단백질을 니트로셀룰로오즈 막(Pall Corporation, USA)으로 옮긴 후 5% 무지방 우유를 이용하여 블록하고 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후 상기 막을 이차 항체와 함께 상온에서 1시간 인큐베이션하고 ECL 용액(Santa Cruz Biotechnology, USA)으로 반응시켜 ChemiDoc(ATTO Technology, USA)을 사용하여 시각화하였다. 일차 항체로서 Flag(Sigma-Aldrich, USA); HA, Myc, HSP90, Cyclin A, Cyclin B1, p27, INCENP, 및 서비빈(Survivin)(Santa Cruz Biotechnology, USA); Aurora B 와 USP35(Bethyl laboratories, USA); 인산화된 히스톤 3(Merk Millipore, USA); β-액틴(Ab Frontier, Korea)이 이용되었고, 이차 항체는 염소(Goat) 항-래빗 항체와 염소 항-마우스 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)가 이용되었다.

(4) 면역 침전(Immunoprecipitation)

HEK293T 세포에 대조군 벡터 또는 Flag가 달려 있는 USP35 단백질 발현벡터 또는 HA가 달려 있는 Aurora B 단백질 발현벡터를 24시간 동안 형질주입한 후, 세포를 수득하여 단백질 용해 버퍼를 이용하여 단백질을 준비하였다. 3-5 mg의 단백질에 20-30 μl Flag 비드(Sigma-Aldrich, USA)를 넣고 4℃에서 4-6시간 인큐베이션하였다. 단백질 용해 버퍼로 3번 세척한 후 3X Flag 펩티드를 넣고 4℃에서 30분 인큐베이션 하였다. 세척 후 비드를 제외한 나머지 용액만 얻어 5X SDS 샘플 버퍼와 함께 100℃에서 10분간 끓여주었다. 각 샘플은 웨스턴 블롯을 통해 시각화하였다.

(5) 니켈-풀다운 분석(Ni-pulldown assay)

HEK293T 세포에 여러 발현 벡터를 24시간 동안 형질주입한 후, 10 μM MG132를 4시간 동안 처리하였다. 세포를 수득하여 요소(urea) 단백질 용해 버퍼(8 M Urea, 0.3 M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄, 50 mM Tris-HCl, 1 mM PMSF, 10 mM Imidazole, pH 8)를 넣고 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 깬 후 단백질을 얻었다. 3-5 mg 단백질에 100 μL의 Ni-NTA 아가로스(QIAGEN, USA)를 넣고 4℃에서 4-6시간 인큐베이션 하였다. 세척 후 남은 아가로스에 5X 샘플 버퍼를 넣고 100℃에서 10분간 끓여주었다. 각 샘플은 웨스턴 블롯을 통해 시각화하였다.

(6) 면역 염색(Immunostaining)

커버 글라스 위에 키운 HeLa 세포에 10 pmol의 대조군 siRNA와 USP35 siRNA를 48시간 동안 형질주입한 후, 대조군 발현 벡터 또는 야생형 USP35 단백질 발현 벡터, 또는 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 24시간 동안 형질주입 하였다. 각 세포를 얼음 위에서 100% 메탄올에 15분 동안 고정한 후 0.25% Triton X-100을 1X PBS에 녹인 용액에 10분 동안 인큐베이션하여 투과성을 만들어 주었다. 세포를 1X PBS로 세 번 세척하고 1% BSA 용액으로 30분간 블로킹한 후 동일한 용액에 1차 항체(TPX2 또는 인산화된 히스톤 3)를 희석시켜 세포에 2시간 동안 처리해주었다. 이후, 세포를 1X PBS로 세 번 세척하고 1% BSA 용액에 FITC가 결합된 2차 항체(Alexa Fluor 488, Life technology)를 희석시켜 1시간 동안 처리해주었다. 다시 1X PBS로 세 번 세척하고 5분간 DAPI로 핵을 염색하였다. 마운틴 용액을 이용하여 커버 글라스를 슬라이드 글라스 위에 옮겨 부착한 후 형광현미경을 통해 관찰하였다.

(7) 동기화(Synchronization)

HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA를 48시간 동안 형질주입한 후 100 ng/ml의 노코다졸(Nocodazole)을 18시간 처리하여, 모든 세포가 세포주기 G2/M기에서 성장을 멈추게 하였다. 세포를 1X PBS로 3번 세척한 후 10% FBS(Hyclone, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone, USA)에서 배양하였다. 각 세포를 2시간 간격으로 총 10시간 동안 수득하였다.

(8) 탈유비퀴틴화 분석(Deubiquitination assay)

HEK293T 세포에 대조군 벡터 또는 Flag가 달려 있는 USP35 단백질 발현벡터를 24시간 동안 형질주입한 후, 세포를 수득하여 단백질 용해 버퍼를 이용하여 단백질을 준비하였다. 3-5 mg의 단백질에 20-30 μL Flag 비드(Sigma-Aldrich, USA)를 넣고 4℃에서 4-6시간 인큐베이션하였다. 단백질 용해 버퍼로 3번 세척하고 버퍼를 완전히 제거한 후 DUB 버퍼(20 mM HEPES(pH 7.4), 100 mM NaCl)와 3X Flag 펩티드를 넣고 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. 세척 후 비드를 제외한 나머지 용액만 얻어 500 ng/μL의 K48-연결(linked) 폴리 Ub 체인 또는 K63-연결 폴리 Ub 체인과 100 mM DTT를 넣은 후 30℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 5X SDS 샘플 버퍼와 함께 100℃에서 10분간 끓여주었다. 각 샘플은 웨스턴 블롯을 통해 시각화하였다.

2. USP45 녹-다운(knock-down)에 의한 세포 분열 중 염색체 분리 오류의 증가 확인

USP35의 녹-다운에 의해 세포분열 과정에 문제가 생길 수 있는지 확인해보았다. HeLa 세포에 대조군 siRNA 또는 USP35 siRNA 10 pmol을 48시간 동안 형질주입하고, 이후 대조군 발현 벡터, 야생형 USP35 과발현 백터 또는 활성이 없는 USP35 변이체(C450A) 과발현 벡터를 24시간 동안 추가로 형질주입한 세포의 세포분열 중기(metaphase), 후기(anaphase) 및 말기(telophase)의 세포를 관찰하였다.

도 3a는 상기와 같이 형질주입한 세포를 각 세포분열 단계에서 TPX2 항체로 면역 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 도 3a와 같이 USP35 siRNA가 형질 주입된 세포들은 세포분열 과정에서 오류가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, USP35 siRNA가 형질 주입된 세포들에 야생형 USP35 단백질 발현 벡터를 추가적으로 형질주입하면 세포 분열 과정에서의 오류가 다시 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 형질주입 했을 때는 나타나지 않았다.

도 3b는 형광 현미경으로 관찰한 결과를 토대로 세포분열 과정 단계의 세포 중 오류가 발생한 세포 수를 세어 백분율로 계산해 본 결과이다. USP35 녹-다운에 의해 오류 발생률이 약 10% 정도 증가하고, 이때 야생형 USP35 단백질 발현 벡터를 형질주입하면 오류 발생률이 대조군과 유사한 정도로 감소하는 것을 확인하였다. 하지만 USP35 변이체 단백질의 경우, USP35 녹-다운에 의한 오류의 증가에 아무런 영향을 주지 못하였다.

3. USP35 녹-다운에 의한 세포분열 과정 중 Aurora B 단백질 양의 감소 확인

(1) USP35 녹-다운에 의한 Aurora B 단백질 감소 확인

USP35 녹-다운으로 인해 영향을 받는 세포 주기에 관여하는 다양한 단백질들을 조사하기 위해, HeLa 세포에 USP35 siRNA를 형질주입한 후 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과 도 4a와 같이 USP35 녹-다운에 의해 여러 단백질들 중 Aurora B 단백질 수준이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

(2) USP35 녹-다운에 의한 세포주기 중 Aurora B 단백질의 양 감소 확인

대조군 세포와 USP35가 녹-다운된 세포를 G2/M기로 동기화한 후 다시 성장이 진행될 수 있게 하고, 일정한 시간 간격으로 세포를 수득하여 세포분열 과정에 참여하는 다양한 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 측정 및 비교하였다. 그 결과, 도 4b와 같이 USP35의 녹-다운에 의해 Aurora B 단백질의 양이 대조군에 비해 모든 단계에서 감소되어 있는 것을 확인하였다. 반면, 또 다른 세포주기 관련 단백질들인 시클린(Cyclin) A, B1, 및 p27 단백질 양은 USP35 녹-다운 샘플에서 전체적으로 증가되어 있었다.

(3) USP35 녹-다운에 의한 세포분열 단계별 Aurora B 단백질의 양 및 위치 확인

USP35 녹-다운에 의한 세포분열 과정의 단계별로 Aurora B 단백질의 양 및 위치를 확인해보기 위해 면역 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 4c에서 볼 수 있듯이, 세포분열 전중기 단계(prometaphase)에서는 Aurora B의 양 및 위치가 대조군 및 USP35 녹-다운 실험군에서 유사하게 나타났지만, 이후 중기 단계로 넘어가면서 USP35 녹-다운에 의해 Aurora B의 발현양이 현저히 떨어지고 그 위치 또한 염색체 부분이 아닌 주변으로 흩어져 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 동시에 USP35 녹-다운 세포는 세포분열 중 Aurora B 단백질의 양 및 위치가 변화하여, 염색체가 여러 개의 염색 분체로 나뉘는 오류가 발생하게 된다.

도 4d는 각 세포분열 단계별로 Aurora B 단백질의 양을 측정하여 그래프로 나타낸 것으로, USP35 녹-다운 세포의 중기 단계에서 Aurora B 단백질의 양이 상당히 감소한 것을 알 수 있다.

4. USP35의 Aurora B 탈유비퀴틴화 활성 확인

(1) USP35와 Aurora B의 결합 여부 확인

USP35와 Aurora B가 서로 직접적으로 결합하는지 여부를 확인해보았다. HEK293T 세포에 flag-USP35 단백질 발현 벡터와 HA-Aurora B 단백질 발현 벡터를 함께 24시간 형질주입 하고 flag로 면역 침전을 실행한 후, 웨스턴 블롯으로 두 단백질의 결합을 확인하였다. 그 결과 도 5a와 같이 USP35는 Aurora B와 결합함을 확인하였다.

(2) 유비퀴틴 과발현에 의해 유비퀴틴화된 Aurora B에 대한 USP35의 탈유비퀴틴화 활성 확인

USP35가 Aurora B를 탈유비퀴틴화할 수 있는지 확인하였다. HA-Aurora B, His-유비퀴틴, flag-USP35, 및 flag-USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 HEK293T 세포에 24시간 동안 형질주입한 후, 프로테오솜 억제제인 MG132를 세포에 4시간 동안 처리한 후 니켈-풀다운 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 5b와 같이 유비퀴틴 단백질의 과발현에 의해 유비퀴틴화된 Aurora B 단백질이 야생형 USP35에 의해 탈유비퀴틴화되는 것이 확인되었다. 반면, USP35 변이체에 의해서는 아무런 변화가 없었다.

도 5c는 또 다른 탈유비퀴틴화 효소인 USP15를 이용하여 동일한 실험을 수행한 결과를 나타낸다. 이때 USP15는 Aurora B의 탈유비퀴틴화에 영향을 주지 못하였으며, 따라서 Aurora B는 특이적으로 USP35에 의해서 탈유비퀴틴화 되는 것임을 확인하였다.

(3) CDH1 의해 유비퀴틴화된 Aurora B에 대한 USP35의 탈유비퀴틴화 활성 확인

Aurora B는 세포 내에서 CDH1에 의해 활성화된 APC/C 유비퀴틴화 효소에 의해 유비퀴틴화되고 이를 인식하는 프로테오좀에 의해 분해된다. 따라서, CDH1에 의해 유비퀴틴화 된 Aurora B가 USP35에 의해 다시 탈유비퀴틴화 되는지 확인하기 위해 상기 실시예 4.(2)와 같은 조건에 CDH1을 추가적으로 형질주입하여 니켈-풀다운을 진행하였다.

그 결과는 도 5d와 같다. 유비퀴틴 단백질의 과발현으로 인해 유비퀴틴화 된 Aurora B는 야생형 USP35 단백질에 의해 탈유비퀴틴화 되었으며, 이때 CDH1이 과발현되면 Aurora B의 유비퀴틴화가 더 증가하였다. 그러나 유비퀴틴화된 Aurora B는 USP35 단백질에 의해 다시 탈유비퀴틴화되었다. 이상의 실험 결과는 Aurora B가 USP35의 기질임을 의미하며, USP35가 Aurora B의 탈유비퀴틴화 효소로서 역할을 할 수 있음을 나타낸다.

5. USP35의 Aurora B의 안정성 유지 역할을 확인

(1) USP35의 탈유비퀴틴화 위치 확인 및 이로 인한 Aurora B 분해 억제 효과 확인

유비퀴틴 단백질은 유비퀴틴화 효소에 의해 기질에 결합한 후 자신의 리신 48번 잔기(Lysine 48)에 또 다른 유비퀴틴 단백질이 결합하면서 유비퀴틴 체인을 형성할 수 있고, 이렇게 만들어진 유비퀴틴 체인은 프로테오솜이 인식하여 기질을 분해시킬 수 있다. 반면 유비퀴틴 단백질의 리신 63번 잔기(Lysine 63)에 유비퀴틴 체인이 형성되면 프로테오좀에 의해 분해되는 대신 그 기저 물질이 참여하는 신호 전달에 변화를 주게 된다. 이처럼 유비퀴틴 단백질의 리신 잔기 중 어느 리신 잔기에 유비퀴틴 체인이 형성되는지 여부는 기질의 역할 수행에 매우 중요한 부분이다. 반대로 탈유비퀴틴화 효소에 의해 어떤 리신 잔기에 형성된 유비퀴틴 체인이 제거되느냐 역시 기질의 기능에 있어 중요하다.

따라서, USP35의 탈유비퀴틴화 위치를 확인하기 위해 탈유비퀴틴화 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 6a와 같이 USP35가 유비퀴틴 단백질의 리신 48번 잔기에 형성된 유비퀴틴 체인을 제거하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, USP35는 기질이 유비퀴틴화 되어 프로테오좀에 의해 분해되는 것을 막아줌으로써 기질의 안정성을 유지시켜주는 역할을 하는 것을 확인하였다. 추가적으로, USP35의 녹-다운 세포에 프로테오솜 억제제인 MG132를 처리하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 6b와 같이 Aurora B의 단백질 수준이 감소하지 않음을 확인하였다.

(2) USP35에 의한 Aurora B의 안정성 유지 확인

USP35가 Aurora B의 안정성을 유지시켜줄 수 있는지 확인해보기 위해 세포에 시클로헥사미드(cyclohexamide: CHX)를 처리하여 더이상 새로운 단백질이 합성될 수 없게 한 후 Aurora B의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

Aurora B 단백질은 세포분열 과정 동안 가장 많이 생성된다. 따라서, 먼저 USP35 녹-다운에 의해 Aurora B가 감소되는 현상을 관찰하기 위해서 세포를 G2/M기로 동기화시킨 후 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 6c에서 볼 수 있듯이 대조군에 비해 USP35 녹-다운 세포에서 CHX 처리 후 Aurora B 단백질 수준이 빠르게 감소하였다.

반대로 USP35에 의해 Aurora B의 안정성이 계속 유지되는 것을 확인하기 위해서 일반 세포에 야생형 USP35 또는 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 형질주입한 결과, 도 6d와 같이 야생형 USP35에 의해 Aurora B 단백질 수준이 CHX 처리에도 불구하고 지속적으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. USP35 변이체의 경우는 음성 대조군과 유사하게 Aurora B 단백질 수준이 감소되었다.

결론적으로, USP35가 Aurora B에 붙어있는 유비퀴틴 단백질의 리신 48번 잔기에 형성된 유비퀴틴 체인을 제거하여 Aurora B가 프로테오좀에 의해 분해되는 것을 막고 그 안정성을 유지시켜 줄 수 있다는 것을 확인하였다.

6. USP35의 변화에 의한 Aurora B 단백질의 기능 조절 확인

(1) USP35와 Aurora B의 특이적 결합 확인

먼저 Aurora B와 함께 염색체 승객 복합체(Chromosomal passenger complex: CPC)를 형성하는 INCENP와 서비빈(survivin) 단백질 수준에 USP35가 영향을 주는지 확인하였다. HeLa 세포에 10 pmol의 USP35 siRNA를 48시간 동안 형질주입한 후, 다시 야생형 USP35 또는 USP35 변이체 단백질 발현 벡터를 24시간 동안 형질주입 하였다.

그 결과, 도 7a에서 볼 수 있듯이 Aurora B의 단백질 수준이 USP35에 따라 변하는 것과는 달리, INCENP와 서비빈의 경우는 USP35의 녹-다운이나 과발현에 의해 그 단백질 수준이 변하지 않았다. 즉, USP35는 CPC를 형성하는 여러 단백질 중 Aurora B를 특이적으로 조절한다는 것을 보여준다.

(2) Aurora B의 기질인 히스톤 3의 인산화 수준 변화 확인

1) 히스톤 3의 웨스턴 블롯 측정

USP35가 Aurora B의 수준뿐만 아니라 실제 기능에 영향을 미칠 수 있는지 확인하였다. Aurora B는 키나제의 일종으로 기질을 인산화시켜 세포분열 과정을 조절하며, 대표적인 기질로는 히스톤 3이 있다. 따라서 USP35의 녹-다운 이후 인산화 히스톤 3의 수준을 측정하였다.

그 결과, 도 7a와 같이 USP35 녹-다운에 의해 Aurora B의 단백질 수준이 감소하며, 이때 그 기질인 히스톤 3의 인산화 역시 감소하는 것을 확인하였다. 또한 이러한 감소는 야생형 USP35의 과발현에 의해 다시 회복되었고 USP35 변이체에 의해서는 아무런 변화가 없었다.

2) 히스톤 3의 면역 염색 측정

USP35 녹-다운 세포들의 히스톤 3의 인산화 단백질을 면역 염색한 결과, 도 7b 및 도 7c와 같이 염색된 세포 수가 감소하였고 이때 야생형 USP35를 과발현 시켜주면 염색된 세포 수가 대조군과 유사하게 증가하였다. 하지만 USP35의 변이체는 아무런 영향을 주지 못했다. 이상의 결과들은 USP35가 Aurora B의 안정성을 유지시킬 뿐만 아니라 Aurora B의 기능에도 영향을 줄 수 있음을 의미한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Pharmaceutical composition comprising USP35 protein or USP35 protein expression vector for preventing or treating chromosome aberration and method using USP35 protein <130> pn112754 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3057 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggacaaga tcttggaggc ggtggtgacg tcgtcatacc cggtcagcgt gaagcagggg 60 ctggttcggc gcgtgctgga ggcggcgcgg cagccgctgg agcgtgagca gtgcctggcg 120 ctgctggcgc tgggcgcgcg cctctacgtg ggcggcgcgg aggagctgcc gcgccgcgtg 180 ggctgccagc tgctgcacgt ggccggccgc caccaccccg acgtcttcgc cgagttcttc 240 agcgcgcgtc gcgtgctgcg cctgctgcag ggtggcgccg gccccccggg cccccgcgcg 300 ctcgcctgcg tgcagctggg tctgcagctg ctgcccgagg ggcctgcggc cgacgaggtg 360 ttcgcgctgc tgcggcgcga ggtgctgcgc accgtgtgcg agcgcccggg ccccgcggcc 420 tgcgcgcagg tggcacggct gctggctcgc cacccgcgct gtgtgcccga cggaccccac 480 cgcctgctct tctgccagca gctggtgcgt tgcctcggcc gcttccgctg cccagccgaa 540 ggcgaggagg gcgccgtgga gttcctagag caggcccagc 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ggtggaccta aagttccccg cttccgtgcc catgggagcc 900 caggacctca tctccaaact gctcaggcat aacccctcgg aacggctgcc cctggcccag 960 gtctcagccc acccttgggt ccgggccaac tctcggaggg tgctgcctcc ctctgccctt 1020 caatctgtcg cctga 1035

Claims

USP35 단백질 또는 USP35 단백질 발현 벡터를 유효 성분으로 포함하는 개체의 염색체 이상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 염색체 이상은 염색체 이수성(aneuploidy)인 것인 약학적 조성물.
개체의 염색체 이상의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
분리된 시료와 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA와 상기 물질의 복합체를 형성시키는 단계;
상기 복합체로부터 상기 시료 중의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계;
상기 측정된 수준을 대조군에서의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준과 비교하는 단계; 및
상기 분리된 시료에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 대조군의 수준과 비교하여 변화한 경우 개체가 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 개체의 염색체 이상을 진단하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 물질은 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제(agonist) 또는 길항체(antagonist), 단백질 또는 그 조합인 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 결정하는 단계는 상기 개체의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 정상 대조군의 수준에 비교하여 낮은 경우, 상기 개체는 염색체 이상이 있는 것으로 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 방법은 Aurora B 단백질의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 개체의 염색체 이상을 진단하기 위한 조성물.
후보물질이 투여된 개체로부터 분리된 시료와 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA와 상기 물질의 복합체를 형성시키는 단계;
상기 복합체로부터 상기 시료 중의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계;
상기 측정된 수준을 대조군에서의 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준과 비교하는 단계; 및
상기 분리된 시료에서 측정된 USP35 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준이 대조군의 수준과 비교하여 변화한 경우 상기 후보 물질을 염색체 이상의 예방 또는 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 염색체 이상 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 방법은 Aurora B 단백질의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.