JP3769465B2 - 新規時計遺伝子Ｂｍａｌ２ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サーカディアンリズムに関与する新規タンパク質ＢＭＡＬ（Brain-Muscle-Arnt-Like protein）２及びそれらの遺伝子、並びにそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命活動には、個体レベルの行動から細胞レベルの生化学的現象まで、さまざまの周期的変化が生まれつき備わっている。これらの一定の周期で起こる生命の示すリズム活動は生体リズムといわれ、これらの周期的に繰り返される現象の周期の長さは、一年、一月又は一日という環境の周期的変動に類似したものが多い。一日単位の約２４時間周期で繰り返すサーカディアンリズム（概日リズム）の代表的なものには、睡眠覚醒リズム、メラトニンや副腎皮膚ホルモンのようなホルモン分泌リズムなどがある。上記サーカディアンリズムは、ほとんど全ての生物種及び生物組織で認められており、生物時計によって調節されている（Annu. Rev. Physiol. 55, 16-54, 1993）。サーカディアンリズムを形成する組織としては、脊椎動物の中枢神経系の視交叉上核（suprachiasmatic nucleus：ＳＣＮ）、松果体、及び網膜等の特異的ニューロン組織が知られている（Science 203, 1245-1247, 1979、Science 203, 656-658, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 999-1003, 1979、Brain Res. 245, 198-200, 1982、Neuron 10, 573-577,1993、Science 272, 419-421, 1996）。
【０００３】
哺乳動物の視交叉上核（ＳＣＮ）と同様に、非哺乳脊椎動物の松果体は、サーカディアンリズム及び光刺激によりメラトニンを産生し、サーカディアンの生理的な調節において中枢的な役割を果たしている（Science 203, 1245-1247, 1979、Science 203, 656-658, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 999-1003, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2319-2322, 1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6119-6121, 1983、J. Neurosci. 9, 1943-1950, 1989）。上記サーカディアンリズムの発振機構の特質は、遺伝子レベルで発振され、その発振が細胞レベルで増幅し、ついには個体レベルに至るシステムにあるとされている（Cell 96, 271-290, 1999）。かかる遺伝子レベルでの発振は、時計遺伝子と呼ばれる一群の遺伝子により行われている。近年、齧歯動物の時計遺伝子に関する研究から、哺乳動物におけるサーカディアン振動体遺伝子は、転写／翻訳をベースとするネガティブフィードバックループを形成するポジティブ因子やネガティブ因子であることが明らかとなっている（Cell 96, 271-290, 1999、Annu. Rev. Neurosci. 23, 713-742, 2000）。マウスの場合、ネガティブ因子には、Ｐｅｒ１（Cell 90, 1003-1011, 1997、Nature 389, 512-516, 1997）、Ｐｅｒ２（Cell 91, 1055-1064, 1997、Neuron 19, 1261-1269, 1997、Genes Cells 3, 167-176, 1998）、Ｐｅｒ３（EMBO J. 17, 4753-4759, 1998、Neuron, 20, 1103-1110, 1998）の３つのｐｅｒｉｏｄ遺伝子ホモログや、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２（Cell 98, 193-205, 1999、Nature 398, 627-630, 1999）の２つのクリプトクロムホモログが知られている。
【０００４】
ポジティブ因子としてはＢＭＡＬ１やＣＬＯＣＫなどが知られており、かかるＢＭＡＬ１やＣＬＯＣＫはベーシックヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）−ＰＡＳ（Per-Arnt-Sim）型転写因子であり、ＣＬＯＣＫ−ＢＭＡＬ１複合体は、ネガティブ因子であるＰｅｒ１（Science 280, 1564-1569, 1998）ばかりでなく、バソプレッシン等の時計制御遺伝子（Cell 96, 57-68, 1999）やアルブミンＤサイト結合タンパク質遺伝子（Genes Dev. 14, 679-689, 2000）において見い出されているＥボックス配列（Ｅ−ｂｏｘ：ＣＡＣＧＴＧ）を介して転写を活性化することが知られている。また、上記ネガティブ因子のタンパク質レベルが上昇すると、それ自身のプロモーターに対するポジティブ因子誘導転写活性が抑制され、ネガティブ因子のｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルがダウンレギュレートされ、ネガティブ因子遺伝子の転写活性化とともに分子サイクルが再び開始される。従って、ネガティブ因子のタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルは、強いサーカディアン振動を示す。これらの時計遺伝子の変動に加えて、Ｐｅｒ１及びＰｅｒ２発現は光によって誘導され（Cell 91, 1055-1064, 1997、Neuron 19, 1261-1269, 1997、Cell 91, 1043-1053, 1997）、Ｐｅｒ１の誘導により少なくとも振動体の光同調が誘発される（J. Neurosci. 19, 1115-1121, 1999）。また、ポジティブ因子であるＢｍａｌ１のｍＲＮＡレベルも、ネガティブ因子とは逆位相のサーカディアン振動を示すことが明らかとなっている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 83-87, 1998、Biochem. Biophys. Res. Commun. 253, 199-203, 1998）。Ｂｍａｌ１の転写リズムは、キイロショウジョウバエのｄＣｌｏｃｋのものと類似していることから（Science 286, 766-768, 1999）、ネガティブ因子のフィードバックループに関与しているのではないかと考えられている（Science 286, 2460-2461, 1999、Science 288, 1013-1019, 2000）。
【０００５】
他方、ニワトリ（ヒヨコ）松果体では、サーカディアン振動体、松果体細胞内の光入力経路及びメラトニン出力経路が保持されており、また、これらの特徴を細胞培養で容易に保持させることができることが知られている（Science 203, 1245-1247, 1979、Science 203, 656-658, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2319-2322, 1980、Brain Res. 438, 199-215, 1988、Recent Prog. Horm. Res. 45, 279-352, 1989、Nature 372, 94-97, 1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 304-309, 1997、Brain Res. 774, 242-245, 1997）。これらのことから、ヒヨコ松果体細胞は細胞レベルでの脊椎動物サーカディアン時計システム研究用モデルとして特に有用であるとされている（Recent Prog. Horm. Res. 45, 279-352, 1989）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
生物時計は、外界の刺激がなくても自律的に発振する自己発振系であり、同時に外界の光刺激によってリセットされるという性質をもち、約１日周期で自己発振する脊椎動物の生物時計（概日時計）は、ネガティブ因子とポジティブ因子からなるオートフィードバックループによって駆動されることが知られている。しかし、光入力経路及び出力経路を含む分子時計システム等については未だ不明な点が多い。本発明の課題は、光入力経路及び出力経路を含む時計発振機構において重要である新規タンパク質ＢＭＡＬ２（Brain-Muscle-Arnt-Like protein 2）、それらをコードする遺伝子、及びそれらを利用したプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究し、サーカディアン時計研究に適した材料であるニワトリ松果体を用いて、ｃＣＬＯＣＫ、ｃＰＥＲ２、ｃＢＭＡＬ１の遺伝子を単離し、さらに、ｃＢＭＡＬ１と相同性を示す新規の時計タンパク質ｃＢＭＡＬ２をコードするｃＤＮＡを単離し、配列を決定した。また、ヒト、マウス、ラットにおけるＢＭＡＬ２のｃＤＮＡについても、ヒト胚腎臓細胞株、マウス中脳、ラット初期繊維芽細胞からそれぞれ単離し、配列を決定した。かかる新規時計蛋白質ＢＭＡＬ２は、プルダウン解析により、ＣＬＯＣＫやＢＭＡＬ１等とヘテロ２量体を形成することや、それ自身（ＢＭＡＬ２）同士によりホモ２量体を形成することを見い出した。また、ルシフェラーゼアッセイにより、ＢＭＡＬ２は、ＣＬＯＣＫとのヘテロ２量体によりＥ−ｂｏｘを介して転写を活性化するだけではなく、ホモ２量体を形成してＥ−ｂｏｘに結合し転写を競合的に抑制することなどを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１、３、５若しくは７に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項２）や、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項４）や、配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項５）や、配列番号１１若しくは１３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項６）や、配列番号１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項７）や、配列番号１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項８）に関する。
【０００９】
また本発明は、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項９）や、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１０）や、配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１１）や、配列番号１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１２）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項１３）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１４）や、さらに、ＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１を発現することができることを特徴とする請求項１４記載の宿主細胞（請求項１５）や、発現系が、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１４又は１５記載の宿主細胞（請求項１６）や、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターが、Ｐｅｒ遺伝子、Ｔｉｍ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子、バソプレッシン遺伝子又はアルブミンＤサイト結合蛋白質遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１６記載の宿主細胞（請求項１７）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物（請求項１８）に関する。
【００１１】
また本発明は、非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１８記載の非ヒト動物（請求項１９）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２０）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞が、請求項１４〜１７のいずれか記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２０記載の該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２１）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項１８又は１９記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２２）、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２３）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞が、請求項１６又は１７記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２３記載のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２４）や、請求項１８又は１９記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする該非ヒト動物におけるＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターの転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２５）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質としては、配列番号２、４、６又は８で示されるヒトＢＭＡＬ２や、配列番号１０で示されるニワトリＢＭＡＬ２や、配列番号１２又は１４で示されるマウスＢＭＡＬ２や、配列番号１６、１８又は２０で示されるラットＢＭＡＬ２や、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質等の新規ＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質を挙げることができ、ここでＢＭＡＬ２活性とは、転写促進因子とヘテロ２量体を形成して時計発振遺伝子プロモーターのＥ−ｂｏｘを介して転写を促進させ、かつホモ２量体を形成してＥ−ｂｏｘに結合し転写を競合的に抑制する活性をいう。また、本発明の対象となるペプチドとしては、上記タンパク質の一部からなり、かつＢＭＡＬ２活性を有するペプチドであれば特に制限されるものではないが、ベーシックヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）構造や、ＰＡＳ（Per-Arnt-Sim）ドメインを有するものが好ましい。そして、上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチド、並びにこれらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドはそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
【００１４】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記本件タンパク質・ペプチドをコードするものであればどのようなものでもよく、例えば、配列番号２、４、６又は８に示されるヒトＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号１０に示されるニワトリＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号１２又は１４に示されるマウスＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号１６、１８又は２０に示されるラットＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡを具体的に挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト、ニワトリ、マウス、ラット等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。
【００１５】
また、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ヒトＢＭＡＬ２、ニワトリＢＭＡＬ２、マウスＢＭＡＬ２、ラットＢＭＡＬ２等と同効な目的とするＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１６】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した各種ＢＭＡＬ２等の精製や、各種ＢＭＡＬ２と相互作用するタンパク質の検出や、各種ＢＭＡＬ２等に対する抗体の定量などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１７】
本発明の前記タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記各種ＢＭＡＬ２等のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、サーカディアン発振系の分子メカニズムを明らかにする上で有用である。
【００１８】
また、本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパク質・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質・ペプチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１９】
本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件タンパク質・ペプチドやその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の診断や治療に使用できる可能性があり、サーカディアン発振系の分子メカニズムを明らかにする上で有用である。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。
【００２０】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をはじめとするＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２１】
本発明の宿主細胞としては、本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞であれば特に制限されるものではないが、かかる宿主細胞においてＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１が同時に発現できるように、これらの遺伝子が組み込まれているものが好ましく、さらに該宿主細胞において、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーター、例えばＰｅｒ遺伝子、Ｔｉｍ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子、バソプレッシン遺伝子、アルブミンＤサイト結合タンパク質遺伝子等のプロモーターや、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を導入したプロモーター等を少なくとも含んでいるＤＮＡ断片が組み込まれているものがより好ましい。上記ＤＮＡ断片としては、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含むものであれば特に制限されるものではないが、かかるプロモーターの下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子や、短寿命型グリーン蛍光タンパク質（ｄ１ＥＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質をコードする遺伝子や、ＧＦＰ遺伝子と時計振動体遺伝子との融合物などを連結させたＤＮＡ断片が、かかるプロモーター活性を容易に検出・測定できることから好ましい。また、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を導入したプロモーターとしては、本件タンパク質・ペプチド、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１等の促進因子や、ＰＥＲ、ＴＩＭ、ＣＲＹ等の抑制因子により、プロモーター活性を調節できるものであればどのようなものでもよく、かかるプロモーターとしては、ＲＳＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等を具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
かかる本件タンパク質・ペプチド、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１等の遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２３】
また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２４】
上記発現系を含んでなる宿主細胞や、かかる細胞を培養して得られる本件タンパク質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。本件タンパク質・ペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペプチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００２５】
本発明において、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件タンパク質・ペプチドを発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件タンパク質・ペプチドを大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物やゼブラフィッシュ、メダカ等の硬骨魚類、あるいはキイロショウジョウバエ、カイコ等の節足動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件タンパク質・ペプチド欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば以下に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、ＢＭＡＬ２ノックアウトマウスやＢＭＡＬ２トランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２７】
例えば、ＢＭＡＬ２タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＢＭＡＬ２ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＢＭＡＬ２をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＢＭＡＬ２をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのＢＭＡＬ２をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、５′又は３′末端あるいはその両方にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００２８】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＢＭＡＬ２ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＢＭＡＬ２ノックアウトマウスにＢＭＡＬ２発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＢＭＡＬ２の発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
【００２９】
ＢＭＡＬ２のトランスジェニックマウスは、ニワトリ、マウス、ヒト、ラット等に由来するＢＭＡＬ２をコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＢＭＡＬ２をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３０】
また、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子若しくはＤＮＡや、本件タンパク質・ペプチドや、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体や、本件タンパク質・ペプチド、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１等を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物等を用いると、サーカディアン発振系の分子メカニズムの解明ができるばかりではなく、本件タンパク質・ペプチドの発現促進又は抑制物質や、Ｂｍａｌ２活性促進又は抑制物質や、時計発振遺伝子等のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質などをスクリーニングすることもでき、これらスクリーニング方法により得られた物質の中には、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害などの治療に使用できる可能性がある。
【００３１】
本発明の本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と被検物質とを用いた方法を挙げることができる。上記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、例えば、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞、例えば、野生型非ヒト動物から得られた細胞、本発明の宿主細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト動物から得られた細胞等の細胞に、被検物質を接触又は導入せしめ、Ｂｍａｌ２活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法を具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
また、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物に被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞におけるＢｍａｌ２活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物に被検物質を投与した後、該非ヒト動物におけるＢｍａｌ２活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００３３】
本発明のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチド、又は、本件タンパク質・ペプチドとＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１とを発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞と被検物質を用いる方法、より具体的には、上記細胞に被検物質を接触又は導入せしめ、Ｅ−ｂｏｘを介するプロモーター活性を測定・評価する方法を挙げることができる。その他、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物に被検物質を用いることによりＥ−ｂｏｘを介するプロモーター活性の変化を測定・評価する方法も挙げることができる。また、かかるプロモーター活性を容易に調べるために、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターの下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子などを連結させておくことが好ましい。
【００３４】
本発明はまた、検体中のＢＭＡＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明のＢＭＡＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較することからなる、ＢＭＡＬ２タンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断方法に関する。ＢＭＡＬ２タンパク質をコードするＤＮＡの変異型の検出は、遺伝子に変異がある個体をＤＮＡレベルで見い出すことにより行うことができ、ＢＭＡＬ２タンパク質の過少発現、過剰発現又は変異発現により生ずる疾病の診断に有効である。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。そして、塩基配列の欠失や挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出でき、また点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ＢＭＡＬ２タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズさせることで同定することができる。このように、ＢＭＡＬ２タンパク質をコードする遺伝子の変異を検出することで、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の診断又は判定をすることができる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（クローニング及びシークエンシング）
１−１（ｃＣｌｏｃｋｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたｃＣｌｏｃｋ遺伝子の配列（GenBank accession no. AF132531及びAF144425）に基づき、設計したプライマー［センスプライマー１：5'-ACTAGTCGACTTATGTTTTTTACCATAAGCACC-3'（配列番号２１）、アンチセンスプライマー１：5'-GTCGACCTGCGCTACTGTGGCTGAGCTTTG-3'（配列番号２２）；各プライマーの５′末端にはＳａｌＩ部位が存在する］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（Takara製）とを用いてＰＣＲを行い、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰII、５×１０5ｐｆｕ）を鋳型としてｃＣｌｏｃｋｃＤＮＡを増幅した。上記ＰＣＲ法を個別に４回行い、得られた５つのクローンの配列を決定し、ＰＣＲエラーのない１つのクローンを選択した（GenBank accession no. AF246959）。なお、サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で１分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で３．５分間伸張するというサイクルを５回繰り返し、さらに９４℃で３０秒間熱変性させ、６５℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で３．５分間伸長するというサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃で６．５分間伸張を行った。
【００３６】
１−２（ｃＰｅｒ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
ｄＰｅｒ遺伝子及び哺乳動物Ｐｅｒ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計した縮重プライマー［ｐｅｒ−Ｆ；5'-CAGCAGAT(C/G)A(A/G)CTG(C/T)IT(C/G)I
GACAG(C/T)(A/G)TC(A/C)TCAG-3'（配列番号２３）、ｐｅｒ−Ｒ；5'-GCT(A/G)CACTG(A/G)CTG(A/G)TG(A/C)(C/G)IGAC(A/G)CCAC(A/G)CTC-3'（配列番号２４）］と、Ｔａｑ−Ｇｏｌｄポリメラーゼ（PE applied biosystems製）とを用いたＰＣＲ法により、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリーからｃＰｅｒ２ｃＤＮＡの２７３ｂｐ断片を得た。この得られた断片の塩基配列を基に合成したｃＰｅｒ２−Ｒ１プライマー［5'-TTGCTGTACCAGGCACATTACAAC-3'（配列番号２５）］と、縮重プライマー［ＹＫ−Ｆ１；5'-(A/G)TICA(C/T)TCIGGITA(C/T)CA(A/G)GCICCI(A/C)GIATICC-3'（配列番号２６）］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いて、さらにＰＣＲを行いニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリーからさらに長いｃＤＮＡ断片（Ｐ２−５；８８６ｂｐ）を増幅した。この断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰII、５×１０5ｐｆｕ）をスクリーニングし、ｃＰＥＲ２（Ｍｅｔ1−Ａｒｇ1014）の大部分をコードするクローンＰａ（３５８４ｂｐ）を単離した。このクローンと３′−ＲＡＣＥ法により得られたｃＤＮＡクローンにより、ｃＰＥＲ２（Ｍｅｔ1−Ｔｈｒ1344、GenBank accession no. AF246956）の完全長クローンを得た。この結果を図１に示し、ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２７と２８に示す。なお、図１中の配列上の線はＰＡＳドメイン（ＰＡＳ−Ａ及びＰＡＳ−Ｂ）及び細胞質局在領域（ＣＬＤ）を示す。また、図２に上記得られたｃＰＥＲ２と３つのマウスＰＥＲタンパク質（ｍＰＥＲ１〜３）間の各ドメインにおけるアミノ酸同一性を示す。上記サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で１分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５２℃で６０秒間アニーリングさせ、７２℃で１分間伸張するというサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で９分間伸張を行った。
【００３７】
１−３（ｃＢｍａｌｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
マウス、ラット及びヒトのＢｍａｌ１、並びにキイロショウジョウバエのｄＣｙｃｌｅのヌクレオチド配列を基に設計した縮重プライマー［ＢＭＡＬ−Ｆ；5'-GTGCT(A/C)(A/C)GGATGGC(A/T)GT(G/T)CAGC-3'（配列番号２９）、ＢＭＡＬ−Ｒ；5'-GCG(C/T)CC(A/G)ATTGC(A/C/G)AC(A/G)AGGCAG-3'（配列番号３０）］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いてＰＣＲを行い、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の一部コードするｃＤＮＡクローンをニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリーからそれぞれ得た。各増幅断片、及び５′−ＲＡＣＥ法により得られた各増幅断片のｃＤＮＡクローンをプローブとして用い、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰII、３．５×１０5ｐｆｕ）をスクリーニングし、ｃＢＭＡＬ１ｂ′（GenBank accession no. AF246957）やｃＢＭＡＬ２（GenBank accession no. AF246958）をコードする領域を含むｃＤＮＡクローンをそれぞれ単離し、配列を決定した（図３）。なお、図３中の配列上の線はベーシックヘリックス・ループ・ヘリックス領域（ｂＨＬＨ）及びＰＡＳドメイン（ＰＡＳ−Ａ及びＰＡＳ−Ｂ）を示す。なお、上記ＰＣＲはサーマルサイクラー（Perkin-Elmer）を用いて、最初のみ９４℃で１分間熱変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５０℃で１分間アニーリングした後に７２℃で１分間伸張反応させるというサイクルで、３５サイクル繰り返し行い、最後に７２℃で９分間伸長を行った。
【００３８】
上記ｃＢＭＡＬ１ｂ′配列を他の動物種のＢＭＡＬ１配列と比較することにより、ｃＢＭＡＬ１ｂ′の開始メチオニンを予測した。また、上記ｃＢＭＡＬ２の開始メチオニンは、以下の３つのことから予測された。（ｉ）配列番号９に示されるｃＢｍａｌ２の９７番目から１０５番目のノナヌクレオチド配列（ＣＣＧＣＣＡＴＧＧ）は、Kozakの翻訳開始コンセンサス配列（Nucleic Acids Res. 12. 857-872,1984）と完全に一致していた。（ii）上記Ｂｍａｌ２ｃＤＮＡクローン（３．４ｋｂ）とｍＲＮＡ（３．０、３．８ｋｂ）が、互いに類似した大きさであった。（iii）ゲノム分析から予測されたプロモーター領域には、アップストリーム・インフレームストップコドンが含まれていた。
【００３９】
次に、ｍＢＭＡＬ１ｂ′及び３つの新規ＢＭＡＬタンパク質（ｃＢＭＡＬ１ｂ′、ｃＢＭＡＬ２及びｈＢＭＡＬ２ａ）の各ドメインにおけるアミノ酸の同一性を調べ、さらに、文献（Felsenstein, J., PHYLIP, Version 3.572, University of Washington, Seattle, 1996）記載のPHYLIP, v.3.572を用いたNeighbor-joining法により、ＡＲＮＴ及びＢＭＡＬタンパク質の系統樹を作成した。これらの結果を図４及び図５にそれぞれ示す。なお、図５においては、ｃＢＭＡＬ２におけるアミノ−末端領域（Ｍｅｔ1−Ａｒｇ104）及びカルボキシル−末端領域（Ｇｌｙ459−Ｌｅｕ622）のアミノ酸数が動物種により異なることから、これらの領域に相当する部分を各タンパク質から省略し、各タンパク質間のアミノ酸同一性を計算し、また樹状図を作成した。これらの結果、ｃＢＭＡＬ１ｂ′がｍＢＭＡＬ１ｂ′と９３％の同一性を示し類似しているのに対して（図３及び４）、ｃＢＭＡＬ２（ＡＲＮＴ４）が、ＢＭＡＬ１（７０％；図５）、ＡＲＮＴ１（４１％；図５）又はＡＲＮＴ２（４０％；図５）とそれほど類似していないことから、ｃＢＭＡＬ２が新規のｂＨＬＨ−ＰＡＳを有するタンパク質であることがわかった（図４）。
【００４０】
１−４（ｈＢｍａｌ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
ｃＢｍａｌ２をプローブとして用いたインシリコスクリーニング（１９９９年１０月時点のデーター）により、ｈＢｍａｌ２の一部の配列情報を２種類のヒトＥＳＴクローン（GenBank accession nos. AA577389及びAI218390）から得た。また５′−ＲＡＣＥ法により、ｈＢｍａｌ２遺伝子の５′−非翻訳領域を含むいくつかのｃＤＮＡクローンを、２９３ＥＢＮＡ細胞（ヒト胚腎臓細胞株）のｃＤＮＡから単離し、ｈＢ２Ｆ１及びｈＢ２Ｒ１プライマー［ｈＢ２Ｆ１；5'-GACCAAGTGGCTCCTGCGAT-3'（配列番号３１）、ｈＢ２Ｒ１；5'-GCTAGAGGGTCCACTGGATG-3'（配列番号３２）］を用いたＰＣＲ法により完全長クローンを増幅した。ＰＣＲエラーを除去するために、得られた１７の完全長ｃＤＮＡクローンの配列を決定し、ヒトゲノム配列（GenBank accession no. AC021737及びAC016008）と一致するｈＢＭＡＬ２ａ〜ｄ（GenBank accession no. AF246960〜AF246963）をコードするＤＮＡ配列を全て決定した。なお、上記ＰＣＲのサーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で１分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、６０℃で６０秒間アニーリングさせ、７２℃で２分間伸張するというサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で８分間伸張を行った。これらの結果を図３、４及び５に示す。なお、図３中の配列の下の矢頭はｈＢｍａｌ２遺伝子におけるイントロンの挿入部位を示す。
【００４１】
上記のようにして、２９３ＥＢＮＡ細胞から得られた４種のｈＢＭＡＬ２（ｈＢＭＡＬ２ａ〜ｄ）をコードするｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているゲノム配列（accession nos. AC021737 and AC016008）と比較し、ｍＢｍａｌ１（Biochem. Biophys. Res. Commun. 260, 760-767, 1999）と同様に１７のエクソンに分割し、ｈＢｍａｌ２のゲノム構造を調べてみた。結果を図６に示す。なお、図６中のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の付いた線はゲノム及びｃＤＮＡクローン領域を示し、網掛け部分は単離した変異体においてスプライシングされた領域を示す。この結果、ｈＢＭＡＬ２ｂのｃＤＮＡクローンはエクソン４（ｈＢＭＡＬ２ａにおけるＶａｌ96〜Ａｒｇ109に相当）を欠損しており、ｈＢＭＡＬ２ｃのｃＤＮＡクローンはエクソン３及び４の両方（ｈＢＭＡＬ２ａにおけるＧｌｎ75〜Ａｒｇ109に相当）を欠損し、ｈＢＭＡＬ２ａにおけるＧｌｙ10とＧｌｙ11との間に付加された１１個のアミノ酸配列（ＧＥＶＡＧＧＥＡＴＡＰ）をコードするＤＮＡを伸長したエクソン１を有していた。ｈＢＭＡＬ２ｄはｃＤＮＡにおいてエクソン１（ｈＢＭＡＬ２ａ／ｂの場合と同様に）及びエクソン３／４（ｈＢＭＡＬ２ｃの場合と同様に）の両方が欠損している最も短い変異体であることがわかった。
【００４２】
１−５（ｍＢｍａｌ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
視交叉上核（ＳＣＮ）に発現するマウスＢｍａｌ２のオルソログ（ｍＢｍａｌ２）を同定するために、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（Takara製）と、ｈＢｍａｌ２配列に基づいて合成した２つのプライマー［ｈＢＭＡＬ２−Ｆ４：5'-GTGCTGGTAGTATTGGAACAGATATTG-3'（配列番号３３）、ｈＢＭＡＬ２−Ｒ１：5'-GCTAGAGGGTCCACTGGATG-3'（配列番号３４）］とを用いて、マウス中脳から抽出した全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、６２９ｂｐ断片のｃＤＮＡを得た。その後、５′−と３′−rapid amplification of cDNA ends法により、ｍＢｍａｌ２ｃＤＮＡの５′−又は３′−非翻訳領域を含むいくつかのｃＤＮＡクローンを単離した。これらの配列情報に基づき、ｍＢＭＡＬ２ａ又はｍＢＭＡＬ２ｂ（図７； GenBank accession nos. AY005163及びAY014836）の全コード配列を包含する全長クローンを増幅することができる２つのプライマー［ｍＢＭＡＬ２−Ｆ１：5'-GGTCGACCACCATGGAGTTTTCCAAGGAAACG-3'（配列番号３５）、ｍＢＭＡＬ２−Ｒ１：5'-GCTAGAGTGCCCACTGGATGTCAC-3'（配列番号３６）］を設計した。これらのプライマーと、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いてさらにＲＴ−ＰＣＲを行い、５７９アミノ酸残基からなるｍＢＭＡＬ２ａを得た。かかるアミノ酸配列は、ｂＨＬＨ、ＰＡＳ−Ａ及びＰＡＳ−Ｂドメインを有し、ｈＢＭＡＬ２と７４％、ｃＢＭＡＬ２と６３％、ｚＢＭＡＬ２と４８％の同一性を有していた。これに対して、ｍＢＭＡＬ２ｂはｍＢＭＡＬ２ａの約３分の１（１９９アミノ酸残基）のアミノ酸残基からなり、ＰＡＳ−Ｂドメインが欠損していることがわかった（図７）。この変異は、以前に報告されたｈＢＭＡＬ１ｃ（長鎖からなるＢＭＡＬ１においてＣ末端側半分が欠損したＢＭＡＬ１変異体；Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 258-264, 1997）と類似しているが、生理的な意味は未だわかっていない。
【００４３】
１−６（ｒＢｍａｌ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
次に、ほぼ全体のコード領域を包含するラットＢｍａｌ２（ｒＢｍａｌ２）のｃＤＮＡクローンを、２つのプライマー［ｍＢＭＡＬ２−Ｆ１及びｍＢＭＡＬ２−Ｒ１］を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により、ラットの初期繊維芽細胞ラット−１細胞から単離した。単離した３種類のクローン、ｒＢＭＡＬ２ａ〜ｃのアミノ酸配列を同定した（図７；それぞれGenBank accession nos. AF327071、AY014837、AY014838として登録している）。なお、ｒＢｍａｌ２におけるアミノ末端のアミノ酸配列（ｍＢＭＡＬ２−Ｆ１プライマーの位置に相当）はインシリコスクリーニングにより得た（Gen Bank accession no. AA944306）。これらの結果、得られたクローンの中で最も長い配列からなるｒＢＭＡＬ２ａは、ｍＢＭＡＬ２ａと構造上最も近いことがわかった。なお、図７中のｒＢＭＡＬ２配列の最後の点はＰＣＲプライマーであるｍＢＭＡＬ２−Ｒ１に相当する位置を、星印はｍＢＭＡＬ２ｂのインフレーム終止コドンの位置を、各行末の数字（右肩に「＋」付き）はｒＢＭＡＬ２ａに対するアミノ酸数を示す。
【００４４】
次に、各種タンパク質間のアミノ酸同一性を基にＢＭＡＬ−ＡＲＮＴファミリーの系統樹を作成した（図８）。この系統樹を作成するに当たって、Gen Bankから得られたいくつかのＢＭＡＬ−ＡＲＮＴタンパク質のアミノ酸配列を、Gene Works（Ver.2.55, clustal V）により整列させ、いくつかのギャップを含む場所を削除した。アミノ−及びカルボキシル−末端領域（ｍＢＭＡＬ２ａの１〜５９のアミノ酸配列、及び４１３〜５７９のアミノ酸配列に相当する）におけるアミノ酸の長さも、変異体の間で異なることからこれらの領域も削除した。それから、ＰＨＹＬＩＰ３．５７２ソフトウェアパッケージ（Felsenstein, J., PHYLIP, Version 3.572, University of Washington, Seattle, 1996）を使用して近隣結合系統樹（Neighbor-joining tree）を構築し（図８）、さらにmaximum likelihood分析のlocal rearrangement法と、アミノ酸置換のJTT-F modelとを用いたＰＲＯＴＭＬ２．３プログラム（Adachi, J. and Hasegawa, M., MOLPHY: Programs for molecular phylogenetic based on maximum likelihood, Version 2.3, Institute of Statistical Mathematics, Tokyo, 1996）により、上記で得られた系統樹のトポロジーを解析した。また、その系統樹の信頼性を評価するためブートストラップ検定を実施し、７０％を超えるブートストラップ確率を図８中の分岐点の近くにそれぞれ示した。なお、図８中の●及び○で示す分岐点は、種の分岐及び遺伝子重複をそれぞれ意味する。
【００４５】
上記の結果と、キイロショウジョウバエのゲノムにおいてＢｍａｌ１／２様遺伝子であるｄＣｙｃ遺伝子がシングルコピーしか存在しないことを考え併せると、Ｂｍａｌ１及びＢｍａｌ２遺伝子は、先祖の脊椎動物で起こった遺伝子重複により作られた可能性が高い（図８中の分岐点ｂ）。それから、ＢＭＡＬ２クラスターにおけるメンバー内での分岐の枝はＢＭＡＬ１のものよりはるかに長い。さらに、これはＢＭＡＬ２クラスターにおける系統樹のトポロジーが脊椎動物の系統発生を反映するものであることから、これらＢｍａｌ２遺伝子は直系（orthologous）の位置関係にあり、高頻度のアミノ酸置換から発展したものであると結論づけることができる。この結論は、ヒト遺伝子データベース（２０００年１２月９日にｈｔｇｓデータベースを検索）においてｈＢｍａｌ２以外のｍ／ｒ／ｃ／ｚＢｍａｌ２のオルソログを発見できないということからも裏付けることができる。図８中における分岐点ａはおそらく脊椎動物と節足動物の先祖間の分岐を示すもので、分岐点ｃ〜ｆは脊椎動物種の分岐を示すものである。また、上記系統樹は、節約法（Parsimony）及び近隣結合（Neighbor-joining）法により得られた系統樹のトポロジーと同様であった。
【００４６】
ＢＭＡＬ１／２クラスターのメンバー内におけるアミノ酸置換率を比較すると、ＢＭＡＬ２のアミノ酸置換率がＢＭＡＬ１のものより約２０倍高く、遺伝子重複後のＢＭＡＬ１における選択圧力（selective pressure）よりＢＭＡＬ２における選択圧力の方がより低いことがわかった。重要なのは、ＢＭＡＬ２タンパク質間における総合的なアミノ酸の同一性を減少させる特定の領域がないということである。選択圧力がより高いＢＭＡＬ１タンパク質における高保存構造は、ＢＭＡＬ２では失われた未確認の機能を有しているのではないかと考えられる。このことについて、両ＢＭＡＬタンパク質は、これらのタンパク質の機能的な二量体パートナーであるＣＬＯＣＫ（Science 280, 1564-1569, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4339-4344, 2000、J. Neurosci. 20, RC83, 2000、J. Biol. Chem. 275, 36847-36851, 2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5474-5479, 1998、Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 789-794, 1998）、ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２又はＭＯＰ４）（J. Neurosci. 20, RC83, 2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5474-5479, 1998）、低酸素症誘導因子１α（ＨＩＦ１α）（J. Neurosci. 20, RC83, 2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5474-5479, 1998、Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 789-794, 1998）、又はＨＩＦ２α（ＨＬＦ又はＥＰＡＳ１）等と相互作用することから、ＢＭＡＬ１は、キャラクタライズされていない、いくつかの重要な調節因子と相互作用するのではないかと考えられる。ＢＭＡＬ１とＢＭＡＬ２との違いを機能的に分析することは、それらのユニークな進化過程を解明するのに役立つと考えられる。
【００４７】
実施例２（ノーザンブロット分析）
文献（J. Neurochem. 70, 908-913, 1998）記載の方法と同様に、生後１週齢のヒヨコから得られた各組織（松果体、網膜、大脳、心臓、腎臓、骨格筋）の全ＲＮＡ（７．５μｇ）をノーザンブロット法により分析した。上記組織はツァイトゲーバータイム（ＺＴ：zeitgeber time）が０、６、１２、及び１８時間のときに採取して液体窒素で凍結し、ＲＮＡを抽出する前に混合した。各全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動法により分離させ、ニトロセルロース膜にブロッティングした。このブロッティング膜をｃＢｍａｌ１プローブ又はｃＢｍａｌ２プローブとハイブリダイズさせた後、５０℃の０．１×ＳＳＣ中で洗浄し（１０分間×３回）、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）で分析した後、次に、ニワトリヒストンＨ４ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ分析した。かかるニワトリヒストンＨ４ｃＤＮＡプローブは、ニワトリ松果体のｃＤＮＡから、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている配列（accession no. M74533）を基に設計したプライマー［センスプライマー２；5'-CATGTCTGGCAGAGGCAAG-3'（配列番号３７）、アンチセンスプライマー２；5'-TTAGCCGCCGAAGCCGTAG-3'（配列番号３８）］を用いてＰＣＲ法により増幅し、さらにクローニングしたものを使用した。結果を図９に示す。これらの結果、２種類のｃＢｍａｌ２遺伝子（３．８Ｋｂ及び３．０Ｋｂ、矢印で示す）やｃＢｍａｌ１遺伝子（３．３Ｋｂ）は、調査した全ての組織において様々な強度で発現することがわかった。また、ヒストンＨ４による標準化により、心臓及び腎臓においてはｃＢｍａｌ１の転写レベルが低いことや、ｃＢｍａｌ２の転写レベルが調査した組織の間で明らかな違いがないことが確認できた。
【００４８】
実施例３（松果体におけるニワトリ時計遺伝子の発現）
生後１日のヒヨコを３週間ＬＤ（１２時間明期／１２時間暗期）サイクル下において同調させた後、２日間ＤＤ（恒常暗期）条件下におき、最後の３日間については４時間毎に松果体を採取し、各松果体から得られた全ＲＮＡをノーザンブロット法により分析し、松果体におけるニワトリ時計遺伝子（ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＰｅｒ２、及びｃＣｌｏｃｋ）の発現を調べてみた。上記の各松果体から得られた全ＲＮＡ（６μｇ）をアガロースゲル電気泳動法により分離させ、ニトロセルロース膜にブロッティングし、かかるブロッティング膜を２枚作製した。ハイブリダイゼーションは、まずｃＢｍａｌ２又はｃＰｅｒ２プローブと行い、その後５０℃の０．１×ＳＳＣ中でブロッティング膜を洗浄し（１０分間×３回）、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）で分析し、次にヒストンＨ４ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ同様に分析した。かかるｃＰｅｒ２プローブは前記ｃＤＮＡ断片Ｐ２−５を用いた。他方のブロッティング膜では、上記と同様にまずｃＢｍａｌ１プローブと、その後ヒストンＨ４ｃＤＮＡと、最後にｃＣｌｏｃｋプローブとハイブリダイゼーションを行い、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザーで分析した。これらの結果を図１０（下段）に示す。また、ＭａｃＢＡＳソフトウェア（富士フイルム製）を用いてｃＢｍａｌ１（○）及びｃＢｍａｌ２（●）のシグナルを測定し、各シグナルをヒストンＨ４ｃＤＮＡのシグナルで標準化した後、それらの平均値をそれぞれの場合において１と設定し、ニワトリ時計遺伝子の転写量の経時変化を調べてみた。この結果を図１０（上段）に示す。なお、図１０中におけるノーザンブロット結果の上の横棒は明暗サイクルを示し、白い領域は明期を、黒い領域は（主観的）暗期を、灰色の領域は主観的明期をそれぞれ意味する。この結果から、３つのｃＰｅｒ２の転写（９．７Ｋｂ、７．５Ｋｂ、及び４．１Ｋｂ）やｃＣｌｏｃｋの転写（８．５Ｋｂ）が確認できた。
【００４９】
実施例４（松果体細胞培養におけるニワトリ時計遺伝子の発現）
また、松果体細胞培養におけるニワトリ時計遺伝子［ｃＢｍａｌ１（○）、ｃＢｍａｌ２（●）、ｃＰｅｒ２（△）及びｃＣｌｏｃｋ（□）］の転写量の経時的変化を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により分析し、上記実施例３の結果と比較してみた（図１１）。生後１日のヒヨコから得られた松果体細胞を３５ｍｍ皿にのせ（１皿につき８つの松果体から得た細胞）、１０％のウシ胎児血清を添加したMedium 199（Life Technologies製）中でＬＤサイクルにて５日間培養した。第６日目に培養細胞の一部分を恒常暗期（ＤＤ、図１１の右図）条件下で培養し、残りの培養細胞においては引き続きＬＤ条件下で培養した後、第７日目に恒常暗期条件下で培養して（ＬＤ、図１１の左図）、４時間毎に各松果体細胞を採取した。採取した松果体細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies製）に懸濁し、全ＲＮＡを単離するまで−８０℃で保存した。各全ＲＮＡ１μｇを、SuperScript II（Life Technologies製）逆転写酵素により逆転写させ、反応物の一部をＰＣＲ分析に使用した。まず、鋳型ｃＤＮＡ量と増幅産物量が比例関係（linear relationship）となるように、各プライマーに最適なＰＣＲサイクル数を決定し、かかる条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を７．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＳＹＢＲグリーンＩ（Molecular Probes製）で染色した後、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）で各ニワトリ時計遺伝子の転写量を測定した。また、ＧＡＰＤＨの転写量の変化をコントロールとして、上記と同様の方法により測定した。各シグナル強度をＧＡＰＤＨのシグナルで標準化した後、第６日目における各遺伝子の平均値を１と設定し、それから、全ての値（ｍＲＮＡレベル）を３つの個別の培養試料から求め、その値を平均値±ＳＥＭとして表した。
【００５０】
上記プライマー及びＰＣＲサイクル数は、次のように設定した。ｃＢｍａｌ１には、ｃＢ１Ｆ１６００−プライマー；5'-TCCAGACATTTCTTCAGCTGG-3'（配列番号３９）及びｃＢ１ＲＥＮＤ−プライマー；5'-GGATGTTGAAGCAAGGTGC-3'（配列番号４０）を用い、２３サイクル行った。ｃＢｍａｌ２には、ｃＢ２Ｆ１２７０−プライマー；5'-ACGAGTACTGCCATCAAGATG-3'（配列番号４１）及びｃＢ２ＲＥＮＤ−プライマー；5'-GAGAGCCCATTGGATGTCAC-3'（配列番号４２）を用い、２３サイクル行った。ｃＣｌｏｃｋには、ｃｑＣＦ８６２−プライマー；5'-TTCTTGGATCACAGGGCAC-3'（配列番号４３）及びｃｑＣＲ１３６４−プライマー；5'-GGAGTGCTAGTGTCCACTGTCA-3'（配列番号４４）を用い、２５サイクル行った。ｃＰｅｒ２には、ｃＰ２ＲＴＦ−プライマー；5'-GGAAGTCCTTGCAGTGCATAC-3'（配列番号４５）及びｃＰ２ＲＴＲ−プライマー；5'-ACAGGAAGCGGATATGCAG-3'（配列番号４６）を用い、２４サイクル行った。ＧＡＰＤＨ（GenBank accession no. K01458）には、ｃＧＡＦ−プライマー；5'-ACCACTGTCCATGCCATCAC-3'（配列番号４７）及びｃＧＡＲ−プライマー；5'-TCCACAACACGGTTGCTGTA-3'（配列番号４８）を用い、１５サイクル行った。なお、ポリメラーゼはＴａｑ−Ｇｏｌｄを用い、各時計遺伝子のＰＣＲのサーマルサイクラーのプログラムは、最初のみ９５℃で９分間変性させ、その後９４℃で１５秒間熱変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で３０秒間伸張するというサイクルを繰り返し行い、最後に７２℃で７分間伸張反応を行った。
【００５１】
上記の結果を図１１に示す。このことから、ＬＤサイクル及びＤＤ条件下において、ヒヨコ松果体細胞において発現した４種類全ての転写産物が、異なった位相及び振幅で日周変動を強く示すことが確認できた。実施例３におけるインビボでの変動グラフ（図１０）は、実施例４におけるインビトロでの変動グラフ（図１１）と非常に類似しており、ｃＰｅｒ２のｍＲＮＡレベルは、早朝に最高、夜の前期に最低となっていた。この結果は、マウスＳＣＮにおけるｍＰｅｒ１の変動グラフと類似していた（Cell 90, 1003-1011, 1997、Nature 389, 512-516, 1997）。ＤＤ条件下でのサーカディアンタイム（ＣＴ）２〜６時間におけるｃＰｅｒ２発現の急激な減少に対して、ＬＤ条件下では早明期（ツァイトゲーバータイム（ＺＴ）２〜６時間）にｃＰｅｒ２が高レベルで発現することから、松果体光受容が朝のｃＰｅｒ２の高レベル発現維持に役立っていることがわかる。ｃＢｍａｌ１及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルも明確な振動を示し、その位相はｃＰｅｒ２と反対であった（図１１）。ｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルのピーク時間は、インビトロでのｃＢｍａｌ１のｍＲＮＡレベルのピーク時間と比べると約４時間遅れていたが、この傾向は、インビボでの変動グラフにおいてもみられた。これに対して、ｃＣｌｏｃｋのｍＲＮＡレベルの変動巾は、比較的低く、ＺＴ１０〜１８あるいはＣＴ１０〜１８とピークの幅が広く、このピークは、２種類のＢｍａｌ遺伝子の発現レベルのピークを包括していると考えられる。同様なｃＣｌｏｃｋのｍＲＮＡの振動は、ニワトリ網膜においても観察されている（Mol. Brain Res. 70, 253-263, 1999）。
【００５２】
実施例５（視交叉上核におけるマウス時計遺伝子の発現）
また、ＬＤサイクル下にあるマウスＳＣＮにおけるｍＢｍａｌ２及び既知の時計遺伝子（ｍＰｅｒ２、ｍＣｌｏｃｋ及びｍＢｍａｌ１）のｍＲＮＡレベルを以下のように調べてみた。生後５週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスを２３℃±１℃でＬＤサイクル下におき（明期は蛍光灯で約２００ルクス）、餌と水を自由に与え飼育した。３週間後に上記マウスを断頭して素早く脳を単離し、冷凍した後厚み７００μｍの薄切片になるように切り分けた。２０ゲージ針を用いてかかる切片から両側のＳＣＮを含む小組織片を打ち出し、組織片におけるｍＢｍａｌ２、ｍＰｅｒ２、ｍＣｌｏｃｋ、ｍＢｍａｌ１等のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。なお、６頭から調製した３つの独立したＲＮＡサンプル（ｎ＝３）をそれぞれ測定し、得られた各シグナル強度をｍＧＡＰＤＨのシグナルで標準化し、その３つの値の平均値（平均値±ＳＥＭ）を求めた。なお、図１２中のｐ値はStudent's t testを用いて決定した。
【００５３】
上記プライマー及びＰＣＲサイクル数は、鋳型ｃＤＮＡ量と増幅産物量とが比例関係になるように設定した。ｍＢｍａｌ２においては、ｍＢＭＡＬ２−Ｆ２プライマー；5'-TGGTTGGATGCGAAAGAGG-3'（配列番号４９）及びｍＢＭＡＬ２−Ｒ４プライマー；5'-AGGTTTCTCTCTTGGTGAACC-3'（配列番号５０）を用い、２８サイクル行った。ｍＢｍａｌ１（Gen Bank accession no. AB012600）では、ｒｍＢｍａｌ１−Ｆ１プライマー；5'-TGGTACCAACATGCAATGC-3'（配列番号５１）及びｒｍＢｍａｌ１−Ｒ１プライマー；5'-AGTGTCCGAGGAAGATAGCTG-3'（配列番号５２）を用い、２８サイクル行った。ｍＰｅｒ２（Gen Bank accession no. AB016532）では、ｒｍＰｅｒ２−Ｆ１プライマー；5'-GCTCACTGCCAGAACTATCTCC-3'（配列番号５３）及びｒｍＰｅｒ２−Ｒ１プライマー；5'-CCTCTAGCTGAAGCAGGTTAAG-3'（配列番号５４）を用い、３０サイクル行った。ｍＣｌｏｃｋ（Gen Bank accession no. AB019258）では、ｒｍＣｌｏｃｋ−Ｆ１プライマー；5'-CAAGGTCAGCAACTTGTGACC-3'（配列番号５５）及びｒｍＣｌｏｃｋ−Ｒ１プライマー；5'-AGGATGAGCTGTGTCGAAGG-3'（配列番号５６）を用い、２８サイクル行った。ｍＧＡＰＤＨ（Gen Bank accession no. X02231）では、ｒｍＧＡＰＤＨ−Ｆ１プライマー；5'-CATCACCATCTTCCAGGAGC-3'（配列番号５７）及びｒｍＧＡＰＤＨ−Ｒ１プライマー；5'-ATTGAGAGCAATGCCAGCC-3'（配列番号５８）を用い、２１サイクル行った。なお、各時計遺伝子のＰＣＲのサーマルサイクラーのプログラムは、実施例４に記載の条件下で行った。
【００５４】
上記の結果を図１２に示す。この結果は文献（Genes Cell 3, 167-176, 1998、Science 288, 1013-1019, 2000）記載のように、ｍＰｅｒ２のｍＲＮＡレベルは、ＳＣＮ領域で強い日周変動を示し（図１２Ａ）、またｍＢｍａｌ１のｍＲＮＡレベルはＬＤサイクル下のｍＰｅｒ２とほぼ逆位相で弱く振動することがわかった（図１２Ｃ）。これに対して、ｍＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルはｍＣｌｏｃｋと同様に一日中ほぼ一定（図１２Ｂ、Ｄ）で、ｍＢｍａｌ１遺伝子とｍＢｍａｌ２遺伝子との間で転写調節に違いがあることがわかった。
【００５５】
実施例６（ヒヨコの松果体におけるｃＰｅｒ２、ｃＢｍａｌ１及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルの光依存変化）
早朝においてｃＢｍａｌ１／２が低レベルに発現していたことから（図１２）、ｃＢｍａｌ１／２転写の光によるダウンレギュレーションの可能性について調べてみた。実施例４の結果より、暗期においてｃＢｍａｌ１／２の発現レベルが両方とも高かった時間（ＣＴ１４〜ＣＴ１５）の間ヒヨコに光を当て、ＣＴ１５．５及びＣＴ１７におけるｍＲＮＡレベルの変化を調べてみた。生後１日のヒヨコを一週間ＬＤサイクル下におき、続いてＤＤ条件下においた。ＤＤ条件下の第１日目に光パルス（３５０ルクス）を１時間（ＣＴ１４〜ＣＴ１５）照射したヒヨコの松果体（図１３Ａの下図）、及び光パルスを照射していないヒヨコの松果体（図１３Ａの上図）を、ＣＴ１５．５又はＣＴ１７の時にそれぞれ単離し、各松果体から得られた全ＲＮＡ（８μｇ）をそれぞれ、アガロースゲル電気泳動法により分離し、ニトロセルロース膜にブロッティングした。
【００５６】
上記ブロットした膜をそれぞれ２分割し、一方（２．４Ｋｂより長いＲＮＡを有するもの）は、ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、又はｃＰｅｒ２プローブとハイブリダイズさせ、他方は、ヒストンＨ４プローブとハイブリダイズさせた。その後、ＭａｃＢＡＳソフトウェア（富士フイルム製）により、ｃＢｍａｌ１（図１３Ｂ）、ｃＢｍａｌ２（図１３Ｃ）、ｃＰｅｒ２（図１３Ｄ）、及びヒストンＨ４のシグナルを測定し、全シグナル強度をヒストンＨ４のシグナルで標準化し、ＣＴ１４における各遺伝子の平均値を１として、ｍＲＮＡレベルを求めた。各値は、上記と同様に行った３回の実験から求め、平均値±ＳＥＭとして表した。結果を図１３に示す。なお、図１３中の「＊」はｐ＜０．０５を、「＊＊」はｐ＜０．０２をそれぞれ意味し、ｐ値はStudent's t testを用いて決定した。これらの結果から、ＣＴ１５．５において、光照射したヒヨコの松果体で観察されたｃＢｍａｌ１及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルは、光照射していないコントロール動物の値に比べ、実質的に低下していた。これに対して、光照射後２時間のＣＴ１７では、光照射したマウスのＳＣＮにおけるｍＰｅｒ１及びｍＰｅｒ２において観察されたもの（Cell 91, 1055-1064, 1997、Neuron 19, 1261-1269, 1997、Genes Cells 3, 167-176, 1998）と同様に、光によるｃＰｅｒ２の発現誘導が確認できた。
【００５７】
実施例７（ｃＢＭＡＬ２の機能的特性；プルダウンアッセイ）
ＡＲＮＴ（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）関連タンパク質の中で、ＢＭＡＬ１とＢＭＡＬ２は近い関係にあることから（図５）、機能的にも類似しているのではないかと考え、細菌により発現させた３種類のＧＳＴ融合タンパク質［ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔ（ＧＳＴとＣ末端領域が切断されたＭｅｔ1〜Ｓｅｒ466のｃＣＬＯＣＫとの融合物）、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ１、及びＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ２］と、インビトロで転写・翻訳させた［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ１Δ（Ｍｅｔ1−Ｓｅｒ449）又は［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ２Δ（Ｍｅｔ1−Ｌｅｕ458）とを用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイを行い、ｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２、及びｃＣＬＯＣＫの関連性を調べてみた。なお、上記ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔは、ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫ（ＧＳＴと完全長のｃＣＬＯＣＫとの融合タンパク質）が２％のトリトンＸ−１００で可溶化されなかったことから、代わりに用いた。
【００５８】
上記ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔ、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ２、又はＧＳＴをコードするＤＮＡ断片を、ｐＧＥＸ５Ｘ−１発現ベクターに導入し、ＢＬ２１大腸菌（E.coli）株を用いて発現させた。各大腸菌を緩衝液Ａ［１０ｍＭのNa-phosphate（ｐＨ７．９）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＬにつきComplete EDTA-free protease inhibitor（Roche Diagnostics社製）１錠］中で溶菌し、可溶化した各融合タンパク質又はＧＳＴをグルタチオン−セファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製した。また、上記の［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ１Δ（Ｍｅｔ1−Ｓｅｒ449）及び［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ２Δ（Ｍｅｔ1−Ｌｅｕ458）は、ｃＢＭＡＬ１Δ（Ｍｅｔ1−Ｓｅｒ449）又はｃＢＭＡＬ２Δ（Ｍｅｔ1−Ｌｅｕ458）のｃＤＮＡ断片を含む発現プラスミドを、［35Ｓ］メチオニン存在下でTNT-T7 Quick Coupled Transcription/Translation System（Promega製）により、インビトロで転写・翻訳させ調製した。なお、同様にコントロールとしての［35Ｓ］標識ルシフェラーゼをインビトロで転写・翻訳させた。
【００５９】
上記の［35Ｓ］標識タンパク質（ｃＢＭＡＬ１Δ、ｃＢＭＡＬ２Δ、又はルシフェラーゼタンパク質）溶液各８μＬを、ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔ（０．１μｇ）、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ１（１．１μｇ）、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ２（３．３μｇ）、又はＧＳＴ（５．６μｇ）が結合したグルタチオン−セファロースビーズ４０μＬと混合した。この混合物を氷上の緩衝液Ｂ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、２０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１５ｍＭのＫＣｌ、０．２％のトリトンＸ−１００、２．５％のスキムミルク、５０ｍＬにつきComplete EDTA-free protease inhibitor１錠］１４０μＬ中で１時間緩やかに回転させながらインキュベートした。インキュベーション後、緩衝液Ｃ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２％のトリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、Complete EDTA-free protease inhibitor１錠］で上記混合物を４回洗浄し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動により分離した後、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）を用いてゲルのオートラジオグラフを解析した。
【００６０】
上記の結果を図１４に示す。なお、レーン１６〜１８は、[35Ｓ]標識したｃＢＭＡＬ１△、ｃＢＭＡＬ２△、又はルシフェラーゼ（それぞれ投入量の２．５％）を電気泳動した結果を示す。なお、レーン１７において観察されるわずかなシグナル（上段のバンド）は、レーン１８のルシフェラーゼが混入したことによるものである。この結果から、ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔが、ｃＢＭＡＬ１ΔだけでなくｃＢＭＡＬ２Δにもインビトロで特異的に結合することが明らかとなった（図１４、レーン１、２）。また、興味深いことに、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ２は、ｃＢＭＡＬタンパク質の両方に結合し（図１４、レーン４、５）、また、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ１においても同様な結合プロフィールを示していた（図１４、レーン７、８）。以上のことから、ｃＢＭＡＬタンパク質が、ホモ二量体及びｃＢＭＡＬ１−ｃＢＭＡＬ２ヘテロ二量体を形成する潜在的な活性を示すことがわかった。さらに、Ｃ末端が欠損したｃＢＭＡＬタンパク質では、完全長ｃＢＭＡＬタンパク質よりもＧＳＴ融合タンパク質に効率よく結合することがわかった。
【００６１】
実施例８（ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを含むプローブを用いた電気泳動易動度シフト分析）
Ｅ−ｂｏｘ配列に対する、ｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫ又はｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫの結合性を、ｃＰｅｒ２遺伝子のプロモーター領域に存在するＥ−ｂｏｘ（ＣＡＣＧＴＧ）を含む配列をプローブとして用いて電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）により測定した。上記プローブとしては、ｃＰｅｒ２遺伝子の推定プロモーター／エンハンサー領域内におけるＥ−ｂｏｘ配列及びそのフランキング配列に相当するオリゴヌクレオチド［ｃＰ２Ｅ１−Ｓ：5'-GTGTCACACGTGAGGCTTA-3'（配列番号５９）、及びｃＰ２Ｅ１−ＡＳ：5'-TAAGCCTCACGTGTGACAC-3'（配列番号６０）］を合成し、これら合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングした後、TOPO-TA cloning kit（Invitrogen, CA）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにサブクローンし、その後、制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した３９ｂｐの断片を用いた。上記ｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫは、ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２又はｃＣｌｏｃｋのｃＤＮＡを含む発現プラスミドから、TNT-T7 Quick Coupled Transcription/Translation System（Promega）を用いてインビトロで転写・翻訳させることによって調製し、また、発現ベクターpcDNA3.1/V5/His empty vectorのみを上記と同様に転写・翻訳させたものをコントロールとして用いた。
【００６２】
上記得られた各タンパク質混合物（ＢＭＡＬ１＋ＢＭＡＬ２、ＢＭＡＬ１＋ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ２＋ＣＬＯＣＫ）５μＬに、32Ｐ標識化プローブ（３３ｆｍｏｌｅｓ、１．３×１０5ｃｐｍ）を含む緩衝液［２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、及び１μｇの変性鮭精子ＤＮＡ］３２μＬを加え、２３℃で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、各混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、実施例７と同様にＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）を用いて分析した。その結果を図１５に示す。また、図１５中のレーン１は標識プローブのみを、レーン２〜５は各翻訳産物（コントロール、ＢＭＡＬ１、ＢＭＡＬ２、又はＣＬＯＣＫ）と標識プローブとを反応させた結果を示している。なお、図中の星印はフリープローブの位置を、黒矢じりはｂＨＬＨ−ＰＡＳ型タンパク質の特異的な複合体を、白矢じりはバックグラウンドを示す。この結果から、ｃＣＬＯＣＫ存在下でｃＢＭＡＬ２やｃＢＭＡＬ１は、それぞれ２又は３つの複合体を形成しているのが確認できた（図１５におけるレーン７及び８の黒矢じり）。また、ｃＣＬＯＣＫ、ｃＢＭＡＬ１、又はｃＢＭＡＬ２だけをプローブと反応させた場合（図１５におけるレーン３〜６）、特異的なバンドがみられなかったことから、上記複合体は調べたＰＡＳ型タンパク質（ｃＣＬＯＣＫ、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２）のいずれかのホモ二量体を表すものではないと推測できる。これらの結果から、ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘが、インビボにおけるｃＣＬＯＣＫ−ｃＢＭＡＬ１／２ヘテロマーの標的の一つであると考えられる。
【００６３】
実施例９（２９３ＥＢＮＡ細胞でのｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫによる転写調節）
フィードバックループにおける役割モデルとしてｍＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘやｍＰｅｒ１プロモーターを、出力経路における役割モデルとしてバソプレッシン遺伝子のＥ−ｂｏｘを、それぞれ用いてｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫによる転写活性化能や転写抑制能を調べてみた。ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen製）を、１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies製）中で培養し、この培養した細胞を１ウエルあたり３×１０5細胞となるように６ウエルプレートにのせて、総量１μｇの種々の発現プラスミド［発現ベクター、リポーター遺伝子を含むプラスミド、０．２５ｎｇのウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼリポーター（ｐＲＬ−ＣＭＶ；Promega製）、及び、図１６に示す量の各種時計遺伝子（ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＣｌｏｃｋ）のｃＤＮＡを含むプラスミド］と、リポフェクタミンプラス（Lipofectamine plus；Life Technologies製）とを用いてトランスフェクトした。
【００６４】
なお、上記発現ベクターはpcDNA3.1/V5/His empty vector（Invitrogen製）を用い、また、上記リポーター遺伝子は、２５ｎｇのｍＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを含むホタルルシフェラーゼリポーター（cPer2 E-box-luc；pGL3-Promoter骨格を持つ；Promega製）、２５ｎｇのcPer2 mut. E-box-luc、５０ｎｇのｍＰｅｒ１プロモーターを含むホタルルシフェラーゼリポーター（ｍＰｅｒ１−ｌｕｃ；pGL3-Basic骨格を持つ；Promega製）、２５ｎｇのマウスバソプレッシンＥ−ｂｏｘを含むホタルルシフェラーゼリポーター（AVP E-box-luc；pGL3-Promoter骨格を持つ；Promega製）、２５ｎｇのAVP mut. E-box-luc、又は２５ｎｇのＴＲＥ−ｌｕｃを用いて行った。上記トランスフェクションから２日後、細胞抽出物を製造者のプロトコールに基づき、ルミノメトリー（luminometry；Progema製）によるデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。なお、各抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性により標準化し、３つの個別に得られた培養抽出物の値から平均値（平均値±ＳＥＭ）を求めた。
【００６５】
上記リポーター遺伝子を含むプラスミドは、以下のように作製した。cPer2 E-box-lucは、ｃＰｅｒ２遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内におけるＥ−ｂｏｘ配列（ＣＡＣＧＴＧ）と、そのフランキング配列とをタンデムに結合させたもの（５'−ＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡ−３′）を、ＳＶ４０プロモーターを有するルシフェラーゼリポーター（pGL3-Promoter、Promega製）に挿入して作製した。また、対照実験としてのリポータープラスミドとしてのcPer2 mut.E-boxは、文献（Cell 96, 57-68, 1999）記載の方法と同様にＥ−ｂｏｘ配列をＧＧＡＣＣＴに変異させ作製した。ｍＰｅｒ１−ｌｕｃは、２．２ＫｂのｍＰｅｒ１のアップストリームフラグメントを、マウスゲノムＤＮＡの鋳型［センスプライマー３；5'-TCGAGCTCTTTGGTACCTGGCCAGCAACC-3'（配列番号６１）及びアンチセンスプライマー３；5'-TCACGACACCTGGCCGTTCGAGG-3'（配列番号６２）］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いたＰＣＲ法により増幅した後、個別のＰＣＲ法により得られた６クローンの塩基配列を決定し、そのうちＰＣＲエラーがない１つのクローンをルシフェラーゼリポーター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、Promega製）につないで作製した。AVP E-box-lucは、マウスバソプレッシン遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内におけるＥ−ｂｏｘ配列（ＣＡＣＧＴＧ）と、そのフランキング配列とを連結させたもの（５′−ＴＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡ−３′）を、ＳＶ４０プロモーターを有するルシフェラーゼリポーター（pGL3-Promoter、Promega製）に挿入して作製した。また、対照実験としてのリポータープラスミドであるAVP mut. E-box-luc（Ｅ−ｂｏｘを変異させたリポーター）は、文献（Cell 96, 57-68, 1999）記載の方法で作製し、ＴＲＥ−ｌｕｃにおいては、ヒトコラゲナーゼ遺伝子内におけるホルボールエステル応答配列（ＴＲＥ）と、そのフランキング配列とをタンデム［5'-CGGCTGACTCATCAAGCTGACTCATCAAGCTGACTCATCAA-3'（配列番号６３）］に連結させ、それを、pGL-Basic vecter中にｐＲＬ−ＴＫベクター（Promega製）のＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIフラグメントをつなぎ合わせたルシフェラーゼリポーター（pGL3-TK-promoter vector）のＢｇｌII部位に挿入して作製した。
【００６６】
以上の結果を図１６に示す。これらのことから、ｃＣＬＯＣＫがｃＢＭＡＬ１だけでなくｃＢＭＡＬ２とも結合し、ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介しての転写活性を促進することがわかった（図１６Ａ）。また、３個のＥ−ｂｏｘ配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有する２．２ｋｂのｍＰｅｒ１プロモーターを用いても同様の結果が得られた（図１６Ｂ）。興味深いことに、図１６Ｂ（図の左部分参照）及び図１６Ｃ（図の左から１０〜１６番目の棒グラフを参照）において、ｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化は、比較的低用量のｃＢｍａｌ２発現プラスミド（２０ｎｇ）と、ｃＣｌｏｃｋプラスミド（２５０ｎｇ）とを共発現した場合で明らかなピークを示し、上記の量より多いｃＢｍａｌ２プラスミドでは転写活性が抑制されていた。しかし、ｃＢｍａｌ１にはそのような抑制効果はみられなかった。また、ｃＢｍａｌ２を多量（１６０ｎｇ）に使用しても、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ、図１６Ｂ）及びＳＶ４０プロモーターからの内因性の転写活性が抑制されることがないことから、かかる抑制はＥ−ｂｏｘ又はＥ−ｂｏｘ結合成分への特異的な効果によるものであることがわかった。
【００６７】
さらに、図１０及び図１１の結果、ｃＢｍａｌ１とｃＢｍａｌ２とが僅かにずれて発現することから、転写調節におけるｃＢＭＡＬ１及びｃＢＭＡＬ２の協同効果も調べてみた。バソプレッシン遺伝子のＥ−ｂｏｘをレポーターとした場合（図１６Ｃ）、ｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化がｃＢｍａｌ２を少量（１０ｎｇ）発現させることにより著しく高くなった（図１６Ｃの左から１７〜２３番目の棒グラフを参照）。また、ｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫの転写活性化において少量（１０ｎｇ）のｃＢｍａｌ１プラスミドを使用することにより、同程度又はより優れた協同効果が確認できた（図１６Ｃの左から２４〜３０番目の棒グラフを参照）。さらに、より多量のｃＢｍａｌ２（８０〜１６０ｎｇ）又はｃＢｍａｌ１（４０〜１６０ｎｇ）を使用することにより協同活性化が著しく抑制された。これはｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘやｍＰｅｒ１プロモーター（図１６Ｂ）を用いた場合においても規模は小さいとはいえ、同様の結果がみられた。
【００６８】
実施例１０（Ｅ−ｂｏｘ配列を介した転写活性化に対するｃＰＥＲ２の効果）
次に、ｃＰＥＲ２が、転写活性化因子ｃＢＭＡＬ−ｃＣＬＯＣＫの転写活性化に対して抑制的に働くかどうかを調べてみた。なお、本実施例においては、ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトする発現プラスミドに、図１７Ａ及びＢに示す量のｃＰｅｒ２のｃＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトする以外は、実施例９記載の方法と同様に行った。その結果を図１７Ａ及びＢに示す。その結果、ｃＰｅｒ２プラスミド（２５０ｎｇ）を２９３ＥＢＮＡ細胞に共発現させると、ｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫによるｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介した転写活性化を抑制し、かかる抑制効果の程度は、同条件下におけるｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化の抑制効果の程度より強力なものであった（図１７Ａ）。また、バソプレッシンＥ−ｂｏｘを介したｃＢＭＡＬ−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化の場合においても同様な傾向がみられ（図１７Ｂ）、ｃＰＥＲ２の量を多くするにつれて、さらなる抑制効果が確認できた。
【００６９】
ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介した転写活性化について本来備わっている性質を、培養したニワトリ松果体細胞を用いて調べてみた。生後一日のヒヨコから調製した松果体細胞を４×１０5細胞／ウエルになるように２４ウエルプレートにのせ、ＬＤサイクル下で培養した。培養３日目のＺＴ９における松果体細胞に、５００ｎｇの上記ｃＰｅｒ２発現プラスミド又はpcDNA3.1/V5/His（コントロール）と、２５０ｎｇのcPer2 E-box-luc又はcPer2 mut.E-box-lucと、５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ（Promega）とを、リポフェクタミンプラスを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした翌日、ＺＴ６における細胞抽出物を用いてデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。この結果を図１７Ｃに示す。この結果から、ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介する内在性の転写活性は、Ｅ−ｂｏｘ配列に変異を生じさせることにより著しく減少し、さらにｃＰＥＲ２を強制発現させることによる転写活性の抑制効果もＥ−ｂｏｘ依存的であった。以上のことはニワトリ松果体細胞がｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘ上で作用するポジティブ因子を発現し、この因子がｃＰＥＲ２による負の調節に対して影響していることを示唆している。
【００７０】
実施例１１（ｃＢＭＡＬ１及びｃＢＭＡｌ２の過剰発現によるメラトニンリズムの消散）
周期性の維持における２つのＰＡＳタンパク質の役割を評価するために、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２を培養したヒヨコ松果体細胞内で過剰発現させ、メラトニンリズムに対する影響を調べてみた。ヒヨコ松果体細胞を、２４ウエルクローニングプレート（Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Germany）で２日間培養し、リポフェクタミンプラス（Life Technologies）とGenefector（VennNova LLc, FL）とを用いて、５００ｎｇの上記ｃＢＭＡＬ１若しくはｃＢＭＡＬ２発現プラスミド、又はpcDNA3.1/V5/His（コントロール）をトランスフェクトした。トランスフェクト後２日目に、上記細胞を２００ｍｇ／ＬのＧ４１８（Life Technologies）を含む培地で４日間培養してトランスフェクトされた細胞を選択し、その選択した細胞を５０ｍｇ／ＬのＧ４１８を含む培地で更に培養した。かかる培養培地を４時間毎に回収し、文献（Neurosci 20, 986-991, 2000）記載の方法により放出したメラトニン量を測定した。その結果を図１８に示す。なお、各パネルにおける４つのデーターは、個別の培養物から得た結果をそれぞれ示し、ＬＤサイクル間のメラトニン産生レベルを平均１と設定してそれぞれの値を求めた。また、図１８の下におけるバーは光による状態を示す。
【００７１】
各細胞における松果体のメラトニンリズムを調べた結果、わずかな位相の遅延が確認できた。この変化はトランスフェクトされていない松果体細胞においてもみられたが、この時計発振は、コントロール細胞（図９Ａ）や、ｍ１又はｍ２アセチルコリンレセプターのような時計タンパク質と関連のないタンパク質が過剰発現した細胞を、数日間ＤＤ条件下で培養することによってもみられた。これらのコントロール細胞に対して、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の過剰発現細胞では、ＤＤ条件下でメラトニン産生における振動は１回しかみられず、その振動はその後一定に保たれることがわかった（図１８Ｂ及びＣ）。ＬＤサイクル下では、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の過剰発現細胞における日ごとのメラトニンの変動は、コントロール細胞におけるものとほとんど類似していることから、光によるメラトニン産生の細胞機構は、過剰発現したｃＢＭＡＬタンパク質によって安定に維持されていると考えられる。にもかかわらず、ＤＤ条件下でリズムが消失するということは、とりも直さずｃＢＭＡＬ１およびｃＢＭＡＬ２がいずれもリズム発振に必須の因子であることを強く示唆している。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によると、光入力経路及び出力経路を含む時計発振機構において重要である新規ＢＭＡＬ２活性を有する新規時計タンパク質、それらをコードする遺伝子ＤＮＡを提供することができる。また、それらタンパク質や遺伝子ＤＮＡを用いることにより、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の予防や治療に有用な物質をスクリーニングするだけではなく、サーカディアン発振系の分子メカニズムを明らかにすることができる。また、本発明のＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質は、転写促進と抑制の両方の機能を併せ持ち、また、ＣＬＯＣＫ以外のパートナーとも結合して様々な生体機能に関与していると考えられることから、かかるＢＭＡＬ２やＢＭＡＬ２のドミナントネガティブ変異体を過剰に外部から遺伝子導入することにより、ｐｅｒｉｏｄ遺伝子をはじめとする一群の転写調節領域の機能を、特異的に阻害することへの応用が期待できる。
【００７３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｃＰＥＲ２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ｃＰＥＲ２及び３つのマウスＰＥＲ蛋白質（ｍＰＥＲ１−３）間におけるドメインにおけるアミノ酸同一性の結果を示す図である。
【図３】各種ＢＭＡＬのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図４】各種ＢＭＡＬタンパク質におけるドメインのアミノ酸同一性の結果を示す図である。
【図５】ＡＲＮＴ−ＢＭＡＬタンパク質の系統樹、及びｃＢＭＡＬ２又はｈＢＭＡＬ２とのアミノ酸同一性を示す図である。
【図６】本発明のｈＢｍａｌ２遺伝子のゲノム構造を示す図である。
【図７】本発明のマウスＢＭＡＬ２及びラットＢＭＡＬ２の基本構造を示す図である。
【図８】ＢＭＡＬ−ＡＲＮＴファミリータンパク質の系統樹を示す図である。
【図９】本発明のｃＢｍａｌ２及びｃＢｍａｌ１遺伝子発現のノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【図１０】ニワトリ松果体のｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＰｅｒ２及びｃＣｌｏｃｋの個体におけるｍＲＮＡレベルの経時変化の結果を示す図である。
【図１１】ＬＤ条件下又はＤＤ条件下におけるｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＰｅｒ２及びｃＣＬＯＣＫのｍＲＮＡレベルの培養ニワトリ松果体細胞での経時変化を示す図である。
【図１２】マウス視交叉上核におけるｍＰｅｒ２、ｍＣｌｏｃｋ、ｍＢｍａｌ１及びｍＢｍａｌ２のｍＲＮＡ発現のＬＤ条件下での日周変動の結果を示す図である。
【図１３】ニワトリ松果体におけるｃＰｅｒ２、ｃＢｍａｌ１、及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡ発現の光依存変化の結果を示す図である。
【図１４】本発明のｃＢＭＡＬ２、ｃＢＭＡＬ１及びｃＣＬＯＣＫタンパク質の間におけるインビトロでの物理的相互作用の結果を示す図である。
【図１５】Ｅ−ｂｏｘ配列と、ｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫ又はｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫとの結合性を電気泳動易動度シフト分析（ＥＭＳＡ）により測定した結果を示す図である。
【図１６】２９３ＥＢＮＡ細胞でのｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫによる転写調節の結果を示す図である。
【図１７】Ｅ−ｂｏｘ配列を介した転写活性化に対するｃＰＥＲ２の効果を示す図である。
【図１８】ヒヨコ松果体細胞のメラトニンリズムにおけるｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の過剰発現による効果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、サーカディアンリズムに関与する新規タンパク質ＢＭＡＬ（Brain-Muscle-Arnt-Like protein）２及びそれらの遺伝子、並びにそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命活動には、個体レベルの行動から細胞レベルの生化学的現象まで、さまざまの周期的変化が生まれつき備わっている。これらの一定の周期で起こる生命の示すリズム活動は生体リズムといわれ、これらの周期的に繰り返される現象の周期の長さは、一年、一月又は一日という環境の周期的変動に類似したものが多い。一日単位の約２４時間周期で繰り返すサーカディアンリズム（概日リズム）の代表的なものには、睡眠覚醒リズム、メラトニンや副腎皮膚ホルモンのようなホルモン分泌リズムなどがある。上記サーカディアンリズムは、ほとんど全ての生物種及び生物組織で認められており、生物時計によって調節されている（Annu. Rev. Physiol. 55, 16-54, 1993）。サーカディアンリズムを形成する組織としては、脊椎動物の中枢神経系の視交叉上核（suprachiasmatic nucleus：ＳＣＮ）、松果体、及び網膜等の特異的ニューロン組織が知られている（Science 203, 1245-1247, 1979、Science 203, 656-658, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 999-1003, 1979、Brain Res. 245, 198-200, 1982、Neuron 10, 573-577,1993、Science 272, 419-421, 1996）。
【０００３】
哺乳動物の視交叉上核（ＳＣＮ）と同様に、非哺乳脊椎動物の松果体は、サーカディアンリズム及び光刺激によりメラトニンを産生し、サーカディアンの生理的な調節において中枢的な役割を果たしている（Science 203, 1245-1247, 1979、Science 203, 656-658, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 999-1003, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2319-2322, 1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6119-6121, 1983、J. Neurosci. 9, 1943-1950, 1989）。上記サーカディアンリズムの発振機構の特質は、遺伝子レベルで発振され、その発振が細胞レベルで増幅し、ついには個体レベルに至るシステムにあるとされている（Cell 96, 271-290, 1999）。かかる遺伝子レベルでの発振は、時計遺伝子と呼ばれる一群の遺伝子により行われている。近年、齧歯動物の時計遺伝子に関する研究から、哺乳動物におけるサーカディアン振動体遺伝子は、転写／翻訳をベースとするネガティブフィードバックループを形成するポジティブ因子やネガティブ因子であることが明らかとなっている（Cell 96, 271-290, 1999、Annu. Rev. Neurosci. 23, 713-742, 2000）。マウスの場合、ネガティブ因子には、Ｐｅｒ１（Cell 90, 1003-1011, 1997、Nature 389, 512-516, 1997）、Ｐｅｒ２（Cell 91, 1055-1064, 1997、Neuron 19, 1261-1269, 1997、Genes Cells 3, 167-176, 1998）、Ｐｅｒ３（EMBO J. 17, 4753-4759, 1998、Neuron, 20, 1103-1110, 1998）の３つのｐｅｒｉｏｄ遺伝子ホモログや、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２（Cell 98, 193-205, 1999、Nature 398, 627-630, 1999）の２つのクリプトクロムホモログが知られている。
【０００４】
ポジティブ因子としてはＢＭＡＬ１やＣＬＯＣＫなどが知られており、かかるＢＭＡＬ１やＣＬＯＣＫはベーシックヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）−ＰＡＳ（Per-Arnt-Sim）型転写因子であり、ＣＬＯＣＫ−ＢＭＡＬ１複合体は、ネガティブ因子であるＰｅｒ１（Science 280, 1564-1569, 1998）ばかりでなく、バソプレッシン等の時計制御遺伝子（Cell 96, 57-68, 1999）やアルブミンＤサイト結合タンパク質遺伝子（Genes Dev. 14, 679-689, 2000）において見い出されているＥボックス配列（Ｅ−ｂｏｘ：ＣＡＣＧＴＧ）を介して転写を活性化することが知られている。また、上記ネガティブ因子のタンパク質レベルが上昇すると、それ自身のプロモーターに対するポジティブ因子誘導転写活性が抑制され、ネガティブ因子のｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルがダウンレギュレートされ、ネガティブ因子遺伝子の転写活性化とともに分子サイクルが再び開始される。従って、ネガティブ因子のタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルは、強いサーカディアン振動を示す。これらの時計遺伝子の変動に加えて、Ｐｅｒ１及びＰｅｒ２発現は光によって誘導され（Cell 91, 1055-1064, 1997、Neuron 19, 1261-1269, 1997、Cell 91, 1043-1053, 1997）、Ｐｅｒ１の誘導により少なくとも振動体の光同調が誘発される（J. Neurosci. 19, 1115-1121, 1999）。また、ポジティブ因子であるＢｍａｌ１のｍＲＮＡレベルも、ネガティブ因子とは逆位相のサーカディアン振動を示すことが明らかとなっている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 83-87, 1998、Biochem. Biophys. Res. Commun. 253, 199-203, 1998）。Ｂｍａｌ１の転写リズムは、キイロショウジョウバエのｄＣｌｏｃｋのものと類似していることから（Science 286, 766-768, 1999）、ネガティブ因子のフィードバックループに関与しているのではないかと考えられている（Science 286, 2460-2461, 1999、Science 288, 1013-1019, 2000）。
【０００５】
他方、ニワトリ（ヒヨコ）松果体では、サーカディアン振動体、松果体細胞内の光入力経路及びメラトニン出力経路が保持されており、また、これらの特徴を細胞培養で容易に保持させることができることが知られている（Science 203, 1245-1247, 1979、Science 203, 656-658, 1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2319-2322, 1980、Brain Res. 438, 199-215, 1988、Recent Prog. Horm. Res. 45, 279-352, 1989、Nature 372, 94-97, 1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 304-309, 1997、Brain Res. 774, 242-245, 1997）。これらのことから、ヒヨコ松果体細胞は細胞レベルでの脊椎動物サーカディアン時計システム研究用モデルとして特に有用であるとされている（Recent Prog. Horm. Res. 45, 279-352, 1989）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
生物時計は、外界の刺激がなくても自律的に発振する自己発振系であり、同時に外界の光刺激によってリセットされるという性質をもち、約１日周期で自己発振する脊椎動物の生物時計（概日時計）は、ネガティブ因子とポジティブ因子からなるオートフィードバックループによって駆動されることが知られている。しかし、光入力経路及び出力経路を含む分子時計システム等については未だ不明な点が多い。本発明の課題は、光入力経路及び出力経路を含む時計発振機構において重要である新規タンパク質ＢＭＡＬ２（Brain-Muscle-Arnt-Like protein 2）、それらをコードする遺伝子、及びそれらを利用したプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究し、サーカディアン時計研究に適した材料であるニワトリ松果体を用いて、ｃＣＬＯＣＫ、ｃＰＥＲ２、ｃＢＭＡＬ１の遺伝子を単離し、さらに、ｃＢＭＡＬ１と相同性を示す新規の時計タンパク質ｃＢＭＡＬ２をコードするｃＤＮＡを単離し、配列を決定した。また、ヒト、マウス、ラットにおけるＢＭＡＬ２のｃＤＮＡについても、ヒト胚腎臓細胞株、マウス中脳、ラット初期繊維芽細胞からそれぞれ単離し、配列を決定した。かかる新規時計蛋白質ＢＭＡＬ２は、プルダウン解析により、ＣＬＯＣＫやＢＭＡＬ１等とヘテロ２量体を形成することや、それ自身（ＢＭＡＬ２）同士によりホモ２量体を形成することを見い出した。また、ルシフェラーゼアッセイにより、ＢＭＡＬ２は、ＣＬＯＣＫとのヘテロ２量体によりＥ−ｂｏｘを介して転写を活性化するだけではなく、ホモ２量体を形成してＥ−ｂｏｘに結合し転写を競合的に抑制することなどを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１、３、５若しくは７に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項２）や、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項４）や、配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項５）や、配列番号１１若しくは１３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項６）や、配列番号１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項７）や、配列番号１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項８）に関する。
【０００９】
また本発明は、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項９）や、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１０）や、配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１１）や、配列番号１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１２）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項１３）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１４）や、さらに、ＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１を発現することができることを特徴とする請求項１４記載の宿主細胞（請求項１５）や、発現系が、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１４又は１５記載の宿主細胞（請求項１６）や、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターが、Ｐｅｒ遺伝子、Ｔｉｍ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子、バソプレッシン遺伝子又はアルブミンＤサイト結合蛋白質遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１６記載の宿主細胞（請求項１７）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物（請求項１８）に関する。
【００１１】
また本発明は、非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１８記載の非ヒト動物（請求項１９）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２０）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞が、請求項１４〜１７のいずれか記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２０記載の該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２１）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項１８又は１９記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２２）、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２３）や、請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞が、請求項１６又は１７記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２３記載のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２４）や、請求項１８又は１９記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする該非ヒト動物におけるＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターの転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２５）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質としては、配列番号２、４、６又は８で示されるヒトＢＭＡＬ２や、配列番号１０で示されるニワトリＢＭＡＬ２や、配列番号１２又は１４で示されるマウスＢＭＡＬ２や、配列番号１６、１８又は２０で示されるラットＢＭＡＬ２や、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質等の新規ＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質を挙げることができ、ここでＢＭＡＬ２活性とは、転写促進因子とヘテロ２量体を形成して時計発振遺伝子プロモーターのＥ−ｂｏｘを介して転写を促進させ、かつホモ２量体を形成してＥ−ｂｏｘに結合し転写を競合的に抑制する活性をいう。また、本発明の対象となるペプチドとしては、上記タンパク質の一部からなり、かつＢＭＡＬ２活性を有するペプチドであれば特に制限されるものではないが、ベーシックヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）構造や、ＰＡＳ（Per-Arnt-Sim）ドメインを有するものが好ましい。そして、上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチド、並びにこれらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドはそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
【００１４】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記本件タンパク質・ペプチドをコードするものであればどのようなものでもよく、例えば、配列番号２、４、６又は８に示されるヒトＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号１０に示されるニワトリＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号１２又は１４に示されるマウスＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号１６、１８又は２０に示されるラットＢＭＡＬ２をコードするＤＮＡや、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡを具体的に挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト、ニワトリ、マウス、ラット等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。
【００１５】
また、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ヒトＢＭＡＬ２、ニワトリＢＭＡＬ２、マウスＢＭＡＬ２、ラットＢＭＡＬ２等と同効な目的とするＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１６】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した各種ＢＭＡＬ２等の精製や、各種ＢＭＡＬ２と相互作用するタンパク質の検出や、各種ＢＭＡＬ２等に対する抗体の定量などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１７】
本発明の前記タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記各種ＢＭＡＬ２等のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、サーカディアン発振系の分子メカニズムを明らかにする上で有用である。
【００１８】
また、本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパク質・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質・ペプチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１９】
本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件タンパク質・ペプチドやその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の診断や治療に使用できる可能性があり、サーカディアン発振系の分子メカニズムを明らかにする上で有用である。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。
【００２０】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をはじめとするＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２１】
本発明の宿主細胞としては、本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞であれば特に制限されるものではないが、かかる宿主細胞においてＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１が同時に発現できるように、これらの遺伝子が組み込まれているものが好ましく、さらに該宿主細胞において、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーター、例えばＰｅｒ遺伝子、Ｔｉｍ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子、バソプレッシン遺伝子、アルブミンＤサイト結合タンパク質遺伝子等のプロモーターや、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を導入したプロモーター等を少なくとも含んでいるＤＮＡ断片が組み込まれているものがより好ましい。上記ＤＮＡ断片としては、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含むものであれば特に制限されるものではないが、かかるプロモーターの下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子や、短寿命型グリーン蛍光タンパク質（ｄ１ＥＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質をコードする遺伝子や、ＧＦＰ遺伝子と時計振動体遺伝子との融合物などを連結させたＤＮＡ断片が、かかるプロモーター活性を容易に検出・測定できることから好ましい。また、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を導入したプロモーターとしては、本件タンパク質・ペプチド、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１等の促進因子や、ＰＥＲ、ＴＩＭ、ＣＲＹ等の抑制因子により、プロモーター活性を調節できるものであればどのようなものでもよく、かかるプロモーターとしては、ＲＳＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等を具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
かかる本件タンパク質・ペプチド、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１等の遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２３】
また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２４】
上記発現系を含んでなる宿主細胞や、かかる細胞を培養して得られる本件タンパク質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。本件タンパク質・ペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペプチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００２５】
本発明において、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件タンパク質・ペプチドを発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件タンパク質・ペプチドを大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物やゼブラフィッシュ、メダカ等の硬骨魚類、あるいはキイロショウジョウバエ、カイコ等の節足動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件タンパク質・ペプチド欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば以下に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、ＢＭＡＬ２ノックアウトマウスやＢＭＡＬ２トランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２７】
例えば、ＢＭＡＬ２タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＢＭＡＬ２ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＢＭＡＬ２をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＢＭＡＬ２をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのＢＭＡＬ２をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、５′又は３′末端あるいはその両方にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００２８】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＢＭＡＬ２ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＢＭＡＬ２ノックアウトマウスにＢＭＡＬ２発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＢＭＡＬ２の発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
【００２９】
ＢＭＡＬ２のトランスジェニックマウスは、ニワトリ、マウス、ヒト、ラット等に由来するＢＭＡＬ２をコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＢＭＡＬ２をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３０】
また、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子若しくはＤＮＡや、本件タンパク質・ペプチドや、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体や、本件タンパク質・ペプチド、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１等を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物等を用いると、サーカディアン発振系の分子メカニズムの解明ができるばかりではなく、本件タンパク質・ペプチドの発現促進又は抑制物質や、Ｂｍａｌ２活性促進又は抑制物質や、時計発振遺伝子等のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質などをスクリーニングすることもでき、これらスクリーニング方法により得られた物質の中には、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害などの治療に使用できる可能性がある。
【００３１】
本発明の本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と被検物質とを用いた方法を挙げることができる。上記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、例えば、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞、例えば、野生型非ヒト動物から得られた細胞、本発明の宿主細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト動物から得られた細胞等の細胞に、被検物質を接触又は導入せしめ、Ｂｍａｌ２活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法を具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
また、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物に被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞におけるＢｍａｌ２活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物に被検物質を投与した後、該非ヒト動物におけるＢｍａｌ２活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００３３】
本発明のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチド、又は、本件タンパク質・ペプチドとＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１とを発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞と被検物質を用いる方法、より具体的には、上記細胞に被検物質を接触又は導入せしめ、Ｅ−ｂｏｘを介するプロモーター活性を測定・評価する方法を挙げることができる。その他、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物に被検物質を用いることによりＥ−ｂｏｘを介するプロモーター活性の変化を測定・評価する方法も挙げることができる。また、かかるプロモーター活性を容易に調べるために、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターの下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子などを連結させておくことが好ましい。
【００３４】
本発明はまた、検体中のＢＭＡＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明のＢＭＡＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較することからなる、ＢＭＡＬ２タンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断方法に関する。ＢＭＡＬ２タンパク質をコードするＤＮＡの変異型の検出は、遺伝子に変異がある個体をＤＮＡレベルで見い出すことにより行うことができ、ＢＭＡＬ２タンパク質の過少発現、過剰発現又は変異発現により生ずる疾病の診断に有効である。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。そして、塩基配列の欠失や挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出でき、また点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ＢＭＡＬ２タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズさせることで同定することができる。このように、ＢＭＡＬ２タンパク質をコードする遺伝子の変異を検出することで、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の診断又は判定をすることができる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（クローニング及びシークエンシング）
１−１（ｃＣｌｏｃｋｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたｃＣｌｏｃｋ遺伝子の配列（GenBank accession no. AF132531及びAF144425）に基づき、設計したプライマー［センスプライマー１：5'-ACTAGTCGACTTATGTTTTTTACCATAAGCACC-3'（配列番号２１）、アンチセンスプライマー１：5'-GTCGACCTGCGCTACTGTGGCTGAGCTTTG-3'（配列番号２２）；各プライマーの５′末端にはＳａｌＩ部位が存在する］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（Takara製）とを用いてＰＣＲを行い、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰII、５×１０5ｐｆｕ）を鋳型としてｃＣｌｏｃｋｃＤＮＡを増幅した。上記ＰＣＲ法を個別に４回行い、得られた５つのクローンの配列を決定し、ＰＣＲエラーのない１つのクローンを選択した（GenBank accession no. AF246959）。なお、サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で１分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で３．５分間伸張するというサイクルを５回繰り返し、さらに９４℃で３０秒間熱変性させ、６５℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で３．５分間伸長するというサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃で６．５分間伸張を行った。
【００３６】
１−２（ｃＰｅｒ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
ｄＰｅｒ遺伝子及び哺乳動物Ｐｅｒ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計した縮重プライマー［ｐｅｒ−Ｆ；5'-CAGCAGAT(C/G)A(A/G)CTG(C/T)IT(C/G)I
GACAG(C/T)(A/G)TC(A/C)TCAG-3'（配列番号２３）、ｐｅｒ−Ｒ；5'-GCT(A/G)CACTG(A/G)CTG(A/G)TG(A/C)(C/G)IGAC(A/G)CCAC(A/G)CTC-3'（配列番号２４）］と、Ｔａｑ−Ｇｏｌｄポリメラーゼ（PE applied biosystems製）とを用いたＰＣＲ法により、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリーからｃＰｅｒ２ｃＤＮＡの２７３ｂｐ断片を得た。この得られた断片の塩基配列を基に合成したｃＰｅｒ２−Ｒ１プライマー［5'-TTGCTGTACCAGGCACATTACAAC-3'（配列番号２５）］と、縮重プライマー［ＹＫ−Ｆ１；5'-(A/G)TICA(C/T)TCIGGITA(C/T)CA(A/G)GCICCI(A/C)GIATICC-3'（配列番号２６）］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いて、さらにＰＣＲを行いニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリーからさらに長いｃＤＮＡ断片（Ｐ２−５；８８６ｂｐ）を増幅した。この断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰII、５×１０5ｐｆｕ）をスクリーニングし、ｃＰＥＲ２（Ｍｅｔ1−Ａｒｇ1014）の大部分をコードするクローンＰａ（３５８４ｂｐ）を単離した。このクローンと３′−ＲＡＣＥ法により得られたｃＤＮＡクローンにより、ｃＰＥＲ２（Ｍｅｔ1−Ｔｈｒ1344、GenBank accession no. AF246956）の完全長クローンを得た。この結果を図１に示し、ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２７と２８に示す。なお、図１中の配列上の線はＰＡＳドメイン（ＰＡＳ−Ａ及びＰＡＳ−Ｂ）及び細胞質局在領域（ＣＬＤ）を示す。また、図２に上記得られたｃＰＥＲ２と３つのマウスＰＥＲタンパク質（ｍＰＥＲ１〜３）間の各ドメインにおけるアミノ酸同一性を示す。上記サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で１分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５２℃で６０秒間アニーリングさせ、７２℃で１分間伸張するというサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で９分間伸張を行った。
【００３７】
１−３（ｃＢｍａｌｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
マウス、ラット及びヒトのＢｍａｌ１、並びにキイロショウジョウバエのｄＣｙｃｌｅのヌクレオチド配列を基に設計した縮重プライマー［ＢＭＡＬ−Ｆ；5'-GTGCT(A/C)(A/C)GGATGGC(A/T)GT(G/T)CAGC-3'（配列番号２９）、ＢＭＡＬ−Ｒ；5'-GCG(C/T)CC(A/G)ATTGC(A/C/G)AC(A/G)AGGCAG-3'（配列番号３０）］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いてＰＣＲを行い、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の一部コードするｃＤＮＡクローンをニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリーからそれぞれ得た。各増幅断片、及び５′−ＲＡＣＥ法により得られた各増幅断片のｃＤＮＡクローンをプローブとして用い、ニワトリ松果体ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰII、３．５×１０5ｐｆｕ）をスクリーニングし、ｃＢＭＡＬ１ｂ′（GenBank accession no. AF246957）やｃＢＭＡＬ２（GenBank accession no. AF246958）をコードする領域を含むｃＤＮＡクローンをそれぞれ単離し、配列を決定した（図３）。なお、図３中の配列上の線はベーシックヘリックス・ループ・ヘリックス領域（ｂＨＬＨ）及びＰＡＳドメイン（ＰＡＳ−Ａ及びＰＡＳ−Ｂ）を示す。なお、上記ＰＣＲはサーマルサイクラー（Perkin-Elmer）を用いて、最初のみ９４℃で１分間熱変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５０℃で１分間アニーリングした後に７２℃で１分間伸張反応させるというサイクルで、３５サイクル繰り返し行い、最後に７２℃で９分間伸長を行った。
【００３８】
上記ｃＢＭＡＬ１ｂ′配列を他の動物種のＢＭＡＬ１配列と比較することにより、ｃＢＭＡＬ１ｂ′の開始メチオニンを予測した。また、上記ｃＢＭＡＬ２の開始メチオニンは、以下の３つのことから予測された。（ｉ）配列番号９に示されるｃＢｍａｌ２の９７番目から１０５番目のノナヌクレオチド配列（ＣＣＧＣＣＡＴＧＧ）は、Kozakの翻訳開始コンセンサス配列（Nucleic Acids Res. 12. 857-872,1984）と完全に一致していた。（ii）上記Ｂｍａｌ２ｃＤＮＡクローン（３．４ｋｂ）とｍＲＮＡ（３．０、３．８ｋｂ）が、互いに類似した大きさであった。（iii）ゲノム分析から予測されたプロモーター領域には、アップストリーム・インフレームストップコドンが含まれていた。
【００３９】
次に、ｍＢＭＡＬ１ｂ′及び３つの新規ＢＭＡＬタンパク質（ｃＢＭＡＬ１ｂ′、ｃＢＭＡＬ２及びｈＢＭＡＬ２ａ）の各ドメインにおけるアミノ酸の同一性を調べ、さらに、文献（Felsenstein, J., PHYLIP, Version 3.572, University of Washington, Seattle, 1996）記載のPHYLIP, v.3.572を用いたNeighbor-joining法により、ＡＲＮＴ及びＢＭＡＬタンパク質の系統樹を作成した。これらの結果を図４及び図５にそれぞれ示す。なお、図５においては、ｃＢＭＡＬ２におけるアミノ−末端領域（Ｍｅｔ1−Ａｒｇ104）及びカルボキシル−末端領域（Ｇｌｙ459−Ｌｅｕ622）のアミノ酸数が動物種により異なることから、これらの領域に相当する部分を各タンパク質から省略し、各タンパク質間のアミノ酸同一性を計算し、また樹状図を作成した。これらの結果、ｃＢＭＡＬ１ｂ′がｍＢＭＡＬ１ｂ′と９３％の同一性を示し類似しているのに対して（図３及び４）、ｃＢＭＡＬ２（ＡＲＮＴ４）が、ＢＭＡＬ１（７０％；図５）、ＡＲＮＴ１（４１％；図５）又はＡＲＮＴ２（４０％；図５）とそれほど類似していないことから、ｃＢＭＡＬ２が新規のｂＨＬＨ−ＰＡＳを有するタンパク質であることがわかった（図４）。
【００４０】
１−４（ｈＢｍａｌ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
ｃＢｍａｌ２をプローブとして用いたインシリコスクリーニング（１９９９年１０月時点のデーター）により、ｈＢｍａｌ２の一部の配列情報を２種類のヒトＥＳＴクローン（GenBank accession nos. AA577389及びAI218390）から得た。また５′−ＲＡＣＥ法により、ｈＢｍａｌ２遺伝子の５′−非翻訳領域を含むいくつかのｃＤＮＡクローンを、２９３ＥＢＮＡ細胞（ヒト胚腎臓細胞株）のｃＤＮＡから単離し、ｈＢ２Ｆ１及びｈＢ２Ｒ１プライマー［ｈＢ２Ｆ１；5'-GACCAAGTGGCTCCTGCGAT-3'（配列番号３１）、ｈＢ２Ｒ１；5'-GCTAGAGGGTCCACTGGATG-3'（配列番号３２）］を用いたＰＣＲ法により完全長クローンを増幅した。ＰＣＲエラーを除去するために、得られた１７の完全長ｃＤＮＡクローンの配列を決定し、ヒトゲノム配列（GenBank accession no. AC021737及びAC016008）と一致するｈＢＭＡＬ２ａ〜ｄ（GenBank accession no. AF246960〜AF246963）をコードするＤＮＡ配列を全て決定した。なお、上記ＰＣＲのサーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で１分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、６０℃で６０秒間アニーリングさせ、７２℃で２分間伸張するというサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で８分間伸張を行った。これらの結果を図３、４及び５に示す。なお、図３中の配列の下の矢頭はｈＢｍａｌ２遺伝子におけるイントロンの挿入部位を示す。
【００４１】
上記のようにして、２９３ＥＢＮＡ細胞から得られた４種のｈＢＭＡＬ２（ｈＢＭＡＬ２ａ〜ｄ）をコードするｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているゲノム配列（accession nos. AC021737 and AC016008）と比較し、ｍＢｍａｌ１（Biochem. Biophys. Res. Commun. 260, 760-767, 1999）と同様に１７のエクソンに分割し、ｈＢｍａｌ２のゲノム構造を調べてみた。結果を図６に示す。なお、図６中のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の付いた線はゲノム及びｃＤＮＡクローン領域を示し、網掛け部分は単離した変異体においてスプライシングされた領域を示す。この結果、ｈＢＭＡＬ２ｂのｃＤＮＡクローンはエクソン４（ｈＢＭＡＬ２ａにおけるＶａｌ96〜Ａｒｇ109に相当）を欠損しており、ｈＢＭＡＬ２ｃのｃＤＮＡクローンはエクソン３及び４の両方（ｈＢＭＡＬ２ａにおけるＧｌｎ75〜Ａｒｇ109に相当）を欠損し、ｈＢＭＡＬ２ａにおけるＧｌｙ10とＧｌｙ11との間に付加された１１個のアミノ酸配列（ＧＥＶＡＧＧＥＡＴＡＰ）をコードするＤＮＡを伸長したエクソン１を有していた。ｈＢＭＡＬ２ｄはｃＤＮＡにおいてエクソン１（ｈＢＭＡＬ２ａ／ｂの場合と同様に）及びエクソン３／４（ｈＢＭＡＬ２ｃの場合と同様に）の両方が欠損している最も短い変異体であることがわかった。
【００４２】
１−５（ｍＢｍａｌ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
視交叉上核（ＳＣＮ）に発現するマウスＢｍａｌ２のオルソログ（ｍＢｍａｌ２）を同定するために、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（Takara製）と、ｈＢｍａｌ２配列に基づいて合成した２つのプライマー［ｈＢＭＡＬ２−Ｆ４：5'-GTGCTGGTAGTATTGGAACAGATATTG-3'（配列番号３３）、ｈＢＭＡＬ２−Ｒ１：5'-GCTAGAGGGTCCACTGGATG-3'（配列番号３４）］とを用いて、マウス中脳から抽出した全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、６２９ｂｐ断片のｃＤＮＡを得た。その後、５′−と３′−rapid amplification of cDNA ends法により、ｍＢｍａｌ２ｃＤＮＡの５′−又は３′−非翻訳領域を含むいくつかのｃＤＮＡクローンを単離した。これらの配列情報に基づき、ｍＢＭＡＬ２ａ又はｍＢＭＡＬ２ｂ（図７； GenBank accession nos. AY005163及びAY014836）の全コード配列を包含する全長クローンを増幅することができる２つのプライマー［ｍＢＭＡＬ２−Ｆ１：5'-GGTCGACCACCATGGAGTTTTCCAAGGAAACG-3'（配列番号３５）、ｍＢＭＡＬ２−Ｒ１：5'-GCTAGAGTGCCCACTGGATGTCAC-3'（配列番号３６）］を設計した。これらのプライマーと、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いてさらにＲＴ−ＰＣＲを行い、５７９アミノ酸残基からなるｍＢＭＡＬ２ａを得た。かかるアミノ酸配列は、ｂＨＬＨ、ＰＡＳ−Ａ及びＰＡＳ−Ｂドメインを有し、ｈＢＭＡＬ２と７４％、ｃＢＭＡＬ２と６３％、ｚＢＭＡＬ２と４８％の同一性を有していた。これに対して、ｍＢＭＡＬ２ｂはｍＢＭＡＬ２ａの約３分の１（１９９アミノ酸残基）のアミノ酸残基からなり、ＰＡＳ−Ｂドメインが欠損していることがわかった（図７）。この変異は、以前に報告されたｈＢＭＡＬ１ｃ（長鎖からなるＢＭＡＬ１においてＣ末端側半分が欠損したＢＭＡＬ１変異体；Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 258-264, 1997）と類似しているが、生理的な意味は未だわかっていない。
【００４３】
１−６（ｒＢｍａｌ２ｃＤＮＡのクローニング及びシークエンシング）
次に、ほぼ全体のコード領域を包含するラットＢｍａｌ２（ｒＢｍａｌ２）のｃＤＮＡクローンを、２つのプライマー［ｍＢＭＡＬ２−Ｆ１及びｍＢＭＡＬ２−Ｒ１］を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により、ラットの初期繊維芽細胞ラット−１細胞から単離した。単離した３種類のクローン、ｒＢＭＡＬ２ａ〜ｃのアミノ酸配列を同定した（図７；それぞれGenBank accession nos. AF327071、AY014837、AY014838として登録している）。なお、ｒＢｍａｌ２におけるアミノ末端のアミノ酸配列（ｍＢＭＡＬ２−Ｆ１プライマーの位置に相当）はインシリコスクリーニングにより得た（Gen Bank accession no. AA944306）。これらの結果、得られたクローンの中で最も長い配列からなるｒＢＭＡＬ２ａは、ｍＢＭＡＬ２ａと構造上最も近いことがわかった。なお、図７中のｒＢＭＡＬ２配列の最後の点はＰＣＲプライマーであるｍＢＭＡＬ２−Ｒ１に相当する位置を、星印はｍＢＭＡＬ２ｂのインフレーム終止コドンの位置を、各行末の数字（右肩に「＋」付き）はｒＢＭＡＬ２ａに対するアミノ酸数を示す。
【００４４】
次に、各種タンパク質間のアミノ酸同一性を基にＢＭＡＬ−ＡＲＮＴファミリーの系統樹を作成した（図８）。この系統樹を作成するに当たって、Gen Bankから得られたいくつかのＢＭＡＬ−ＡＲＮＴタンパク質のアミノ酸配列を、Gene Works（Ver.2.55, clustal V）により整列させ、いくつかのギャップを含む場所を削除した。アミノ−及びカルボキシル−末端領域（ｍＢＭＡＬ２ａの１〜５９のアミノ酸配列、及び４１３〜５７９のアミノ酸配列に相当する）におけるアミノ酸の長さも、変異体の間で異なることからこれらの領域も削除した。それから、ＰＨＹＬＩＰ３．５７２ソフトウェアパッケージ（Felsenstein, J., PHYLIP, Version 3.572, University of Washington, Seattle, 1996）を使用して近隣結合系統樹（Neighbor-joining tree）を構築し（図８）、さらにmaximum likelihood分析のlocal rearrangement法と、アミノ酸置換のJTT-F modelとを用いたＰＲＯＴＭＬ２．３プログラム（Adachi, J. and Hasegawa, M., MOLPHY: Programs for molecular phylogenetic based on maximum likelihood, Version 2.3, Institute of Statistical Mathematics, Tokyo, 1996）により、上記で得られた系統樹のトポロジーを解析した。また、その系統樹の信頼性を評価するためブートストラップ検定を実施し、７０％を超えるブートストラップ確率を図８中の分岐点の近くにそれぞれ示した。なお、図８中の●及び○で示す分岐点は、種の分岐及び遺伝子重複をそれぞれ意味する。
【００４５】
上記の結果と、キイロショウジョウバエのゲノムにおいてＢｍａｌ１／２様遺伝子であるｄＣｙｃ遺伝子がシングルコピーしか存在しないことを考え併せると、Ｂｍａｌ１及びＢｍａｌ２遺伝子は、先祖の脊椎動物で起こった遺伝子重複により作られた可能性が高い（図８中の分岐点ｂ）。それから、ＢＭＡＬ２クラスターにおけるメンバー内での分岐の枝はＢＭＡＬ１のものよりはるかに長い。さらに、これはＢＭＡＬ２クラスターにおける系統樹のトポロジーが脊椎動物の系統発生を反映するものであることから、これらＢｍａｌ２遺伝子は直系（orthologous）の位置関係にあり、高頻度のアミノ酸置換から発展したものであると結論づけることができる。この結論は、ヒト遺伝子データベース（２０００年１２月９日にｈｔｇｓデータベースを検索）においてｈＢｍａｌ２以外のｍ／ｒ／ｃ／ｚＢｍａｌ２のオルソログを発見できないということからも裏付けることができる。図８中における分岐点ａはおそらく脊椎動物と節足動物の先祖間の分岐を示すもので、分岐点ｃ〜ｆは脊椎動物種の分岐を示すものである。また、上記系統樹は、節約法（Parsimony）及び近隣結合（Neighbor-joining）法により得られた系統樹のトポロジーと同様であった。
【００４６】
ＢＭＡＬ１／２クラスターのメンバー内におけるアミノ酸置換率を比較すると、ＢＭＡＬ２のアミノ酸置換率がＢＭＡＬ１のものより約２０倍高く、遺伝子重複後のＢＭＡＬ１における選択圧力（selective pressure）よりＢＭＡＬ２における選択圧力の方がより低いことがわかった。重要なのは、ＢＭＡＬ２タンパク質間における総合的なアミノ酸の同一性を減少させる特定の領域がないということである。選択圧力がより高いＢＭＡＬ１タンパク質における高保存構造は、ＢＭＡＬ２では失われた未確認の機能を有しているのではないかと考えられる。このことについて、両ＢＭＡＬタンパク質は、これらのタンパク質の機能的な二量体パートナーであるＣＬＯＣＫ（Science 280, 1564-1569, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4339-4344, 2000、J. Neurosci. 20, RC83, 2000、J. Biol. Chem. 275, 36847-36851, 2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5474-5479, 1998、Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 789-794, 1998）、ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２又はＭＯＰ４）（J. Neurosci. 20, RC83, 2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5474-5479, 1998）、低酸素症誘導因子１α（ＨＩＦ１α）（J. Neurosci. 20, RC83, 2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5474-5479, 1998、Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 789-794, 1998）、又はＨＩＦ２α（ＨＬＦ又はＥＰＡＳ１）等と相互作用することから、ＢＭＡＬ１は、キャラクタライズされていない、いくつかの重要な調節因子と相互作用するのではないかと考えられる。ＢＭＡＬ１とＢＭＡＬ２との違いを機能的に分析することは、それらのユニークな進化過程を解明するのに役立つと考えられる。
【００４７】
実施例２（ノーザンブロット分析）
文献（J. Neurochem. 70, 908-913, 1998）記載の方法と同様に、生後１週齢のヒヨコから得られた各組織（松果体、網膜、大脳、心臓、腎臓、骨格筋）の全ＲＮＡ（７．５μｇ）をノーザンブロット法により分析した。上記組織はツァイトゲーバータイム（ＺＴ：zeitgeber time）が０、６、１２、及び１８時間のときに採取して液体窒素で凍結し、ＲＮＡを抽出する前に混合した。各全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動法により分離させ、ニトロセルロース膜にブロッティングした。このブロッティング膜をｃＢｍａｌ１プローブ又はｃＢｍａｌ２プローブとハイブリダイズさせた後、５０℃の０．１×ＳＳＣ中で洗浄し（１０分間×３回）、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）で分析した後、次に、ニワトリヒストンＨ４ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ分析した。かかるニワトリヒストンＨ４ｃＤＮＡプローブは、ニワトリ松果体のｃＤＮＡから、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている配列（accession no. M74533）を基に設計したプライマー［センスプライマー２；5'-CATGTCTGGCAGAGGCAAG-3'（配列番号３７）、アンチセンスプライマー２；5'-TTAGCCGCCGAAGCCGTAG-3'（配列番号３８）］を用いてＰＣＲ法により増幅し、さらにクローニングしたものを使用した。結果を図９に示す。これらの結果、２種類のｃＢｍａｌ２遺伝子（３．８Ｋｂ及び３．０Ｋｂ、矢印で示す）やｃＢｍａｌ１遺伝子（３．３Ｋｂ）は、調査した全ての組織において様々な強度で発現することがわかった。また、ヒストンＨ４による標準化により、心臓及び腎臓においてはｃＢｍａｌ１の転写レベルが低いことや、ｃＢｍａｌ２の転写レベルが調査した組織の間で明らかな違いがないことが確認できた。
【００４８】
実施例３（松果体におけるニワトリ時計遺伝子の発現）
生後１日のヒヨコを３週間ＬＤ（１２時間明期／１２時間暗期）サイクル下において同調させた後、２日間ＤＤ（恒常暗期）条件下におき、最後の３日間については４時間毎に松果体を採取し、各松果体から得られた全ＲＮＡをノーザンブロット法により分析し、松果体におけるニワトリ時計遺伝子（ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＰｅｒ２、及びｃＣｌｏｃｋ）の発現を調べてみた。上記の各松果体から得られた全ＲＮＡ（６μｇ）をアガロースゲル電気泳動法により分離させ、ニトロセルロース膜にブロッティングし、かかるブロッティング膜を２枚作製した。ハイブリダイゼーションは、まずｃＢｍａｌ２又はｃＰｅｒ２プローブと行い、その後５０℃の０．１×ＳＳＣ中でブロッティング膜を洗浄し（１０分間×３回）、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）で分析し、次にヒストンＨ４ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ同様に分析した。かかるｃＰｅｒ２プローブは前記ｃＤＮＡ断片Ｐ２−５を用いた。他方のブロッティング膜では、上記と同様にまずｃＢｍａｌ１プローブと、その後ヒストンＨ４ｃＤＮＡと、最後にｃＣｌｏｃｋプローブとハイブリダイゼーションを行い、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザーで分析した。これらの結果を図１０（下段）に示す。また、ＭａｃＢＡＳソフトウェア（富士フイルム製）を用いてｃＢｍａｌ１（○）及びｃＢｍａｌ２（●）のシグナルを測定し、各シグナルをヒストンＨ４ｃＤＮＡのシグナルで標準化した後、それらの平均値をそれぞれの場合において１と設定し、ニワトリ時計遺伝子の転写量の経時変化を調べてみた。この結果を図１０（上段）に示す。なお、図１０中におけるノーザンブロット結果の上の横棒は明暗サイクルを示し、白い領域は明期を、黒い領域は（主観的）暗期を、灰色の領域は主観的明期をそれぞれ意味する。この結果から、３つのｃＰｅｒ２の転写（９．７Ｋｂ、７．５Ｋｂ、及び４．１Ｋｂ）やｃＣｌｏｃｋの転写（８．５Ｋｂ）が確認できた。
【００４９】
実施例４（松果体細胞培養におけるニワトリ時計遺伝子の発現）
また、松果体細胞培養におけるニワトリ時計遺伝子［ｃＢｍａｌ１（○）、ｃＢｍａｌ２（●）、ｃＰｅｒ２（△）及びｃＣｌｏｃｋ（□）］の転写量の経時的変化を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により分析し、上記実施例３の結果と比較してみた（図１１）。生後１日のヒヨコから得られた松果体細胞を３５ｍｍ皿にのせ（１皿につき８つの松果体から得た細胞）、１０％のウシ胎児血清を添加したMedium 199（Life Technologies製）中でＬＤサイクルにて５日間培養した。第６日目に培養細胞の一部分を恒常暗期（ＤＤ、図１１の右図）条件下で培養し、残りの培養細胞においては引き続きＬＤ条件下で培養した後、第７日目に恒常暗期条件下で培養して（ＬＤ、図１１の左図）、４時間毎に各松果体細胞を採取した。採取した松果体細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies製）に懸濁し、全ＲＮＡを単離するまで−８０℃で保存した。各全ＲＮＡ１μｇを、SuperScript II（Life Technologies製）逆転写酵素により逆転写させ、反応物の一部をＰＣＲ分析に使用した。まず、鋳型ｃＤＮＡ量と増幅産物量が比例関係（linear relationship）となるように、各プライマーに最適なＰＣＲサイクル数を決定し、かかる条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を７．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＳＹＢＲグリーンＩ（Molecular Probes製）で染色した後、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）で各ニワトリ時計遺伝子の転写量を測定した。また、ＧＡＰＤＨの転写量の変化をコントロールとして、上記と同様の方法により測定した。各シグナル強度をＧＡＰＤＨのシグナルで標準化した後、第６日目における各遺伝子の平均値を１と設定し、それから、全ての値（ｍＲＮＡレベル）を３つの個別の培養試料から求め、その値を平均値±ＳＥＭとして表した。
【００５０】
上記プライマー及びＰＣＲサイクル数は、次のように設定した。ｃＢｍａｌ１には、ｃＢ１Ｆ１６００−プライマー；5'-TCCAGACATTTCTTCAGCTGG-3'（配列番号３９）及びｃＢ１ＲＥＮＤ−プライマー；5'-GGATGTTGAAGCAAGGTGC-3'（配列番号４０）を用い、２３サイクル行った。ｃＢｍａｌ２には、ｃＢ２Ｆ１２７０−プライマー；5'-ACGAGTACTGCCATCAAGATG-3'（配列番号４１）及びｃＢ２ＲＥＮＤ−プライマー；5'-GAGAGCCCATTGGATGTCAC-3'（配列番号４２）を用い、２３サイクル行った。ｃＣｌｏｃｋには、ｃｑＣＦ８６２−プライマー；5'-TTCTTGGATCACAGGGCAC-3'（配列番号４３）及びｃｑＣＲ１３６４−プライマー；5'-GGAGTGCTAGTGTCCACTGTCA-3'（配列番号４４）を用い、２５サイクル行った。ｃＰｅｒ２には、ｃＰ２ＲＴＦ−プライマー；5'-GGAAGTCCTTGCAGTGCATAC-3'（配列番号４５）及びｃＰ２ＲＴＲ−プライマー；5'-ACAGGAAGCGGATATGCAG-3'（配列番号４６）を用い、２４サイクル行った。ＧＡＰＤＨ（GenBank accession no. K01458）には、ｃＧＡＦ−プライマー；5'-ACCACTGTCCATGCCATCAC-3'（配列番号４７）及びｃＧＡＲ−プライマー；5'-TCCACAACACGGTTGCTGTA-3'（配列番号４８）を用い、１５サイクル行った。なお、ポリメラーゼはＴａｑ−Ｇｏｌｄを用い、各時計遺伝子のＰＣＲのサーマルサイクラーのプログラムは、最初のみ９５℃で９分間変性させ、その後９４℃で１５秒間熱変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で３０秒間伸張するというサイクルを繰り返し行い、最後に７２℃で７分間伸張反応を行った。
【００５１】
上記の結果を図１１に示す。このことから、ＬＤサイクル及びＤＤ条件下において、ヒヨコ松果体細胞において発現した４種類全ての転写産物が、異なった位相及び振幅で日周変動を強く示すことが確認できた。実施例３におけるインビボでの変動グラフ（図１０）は、実施例４におけるインビトロでの変動グラフ（図１１）と非常に類似しており、ｃＰｅｒ２のｍＲＮＡレベルは、早朝に最高、夜の前期に最低となっていた。この結果は、マウスＳＣＮにおけるｍＰｅｒ１の変動グラフと類似していた（Cell 90, 1003-1011, 1997、Nature 389, 512-516, 1997）。ＤＤ条件下でのサーカディアンタイム（ＣＴ）２〜６時間におけるｃＰｅｒ２発現の急激な減少に対して、ＬＤ条件下では早明期（ツァイトゲーバータイム（ＺＴ）２〜６時間）にｃＰｅｒ２が高レベルで発現することから、松果体光受容が朝のｃＰｅｒ２の高レベル発現維持に役立っていることがわかる。ｃＢｍａｌ１及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルも明確な振動を示し、その位相はｃＰｅｒ２と反対であった（図１１）。ｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルのピーク時間は、インビトロでのｃＢｍａｌ１のｍＲＮＡレベルのピーク時間と比べると約４時間遅れていたが、この傾向は、インビボでの変動グラフにおいてもみられた。これに対して、ｃＣｌｏｃｋのｍＲＮＡレベルの変動巾は、比較的低く、ＺＴ１０〜１８あるいはＣＴ１０〜１８とピークの幅が広く、このピークは、２種類のＢｍａｌ遺伝子の発現レベルのピークを包括していると考えられる。同様なｃＣｌｏｃｋのｍＲＮＡの振動は、ニワトリ網膜においても観察されている（Mol. Brain Res. 70, 253-263, 1999）。
【００５２】
実施例５（視交叉上核におけるマウス時計遺伝子の発現）
また、ＬＤサイクル下にあるマウスＳＣＮにおけるｍＢｍａｌ２及び既知の時計遺伝子（ｍＰｅｒ２、ｍＣｌｏｃｋ及びｍＢｍａｌ１）のｍＲＮＡレベルを以下のように調べてみた。生後５週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスを２３℃±１℃でＬＤサイクル下におき（明期は蛍光灯で約２００ルクス）、餌と水を自由に与え飼育した。３週間後に上記マウスを断頭して素早く脳を単離し、冷凍した後厚み７００μｍの薄切片になるように切り分けた。２０ゲージ針を用いてかかる切片から両側のＳＣＮを含む小組織片を打ち出し、組織片におけるｍＢｍａｌ２、ｍＰｅｒ２、ｍＣｌｏｃｋ、ｍＢｍａｌ１等のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。なお、６頭から調製した３つの独立したＲＮＡサンプル（ｎ＝３）をそれぞれ測定し、得られた各シグナル強度をｍＧＡＰＤＨのシグナルで標準化し、その３つの値の平均値（平均値±ＳＥＭ）を求めた。なお、図１２中のｐ値はStudent's t testを用いて決定した。
【００５３】
上記プライマー及びＰＣＲサイクル数は、鋳型ｃＤＮＡ量と増幅産物量とが比例関係になるように設定した。ｍＢｍａｌ２においては、ｍＢＭＡＬ２−Ｆ２プライマー；5'-TGGTTGGATGCGAAAGAGG-3'（配列番号４９）及びｍＢＭＡＬ２−Ｒ４プライマー；5'-AGGTTTCTCTCTTGGTGAACC-3'（配列番号５０）を用い、２８サイクル行った。ｍＢｍａｌ１（Gen Bank accession no. AB012600）では、ｒｍＢｍａｌ１−Ｆ１プライマー；5'-TGGTACCAACATGCAATGC-3'（配列番号５１）及びｒｍＢｍａｌ１−Ｒ１プライマー；5'-AGTGTCCGAGGAAGATAGCTG-3'（配列番号５２）を用い、２８サイクル行った。ｍＰｅｒ２（Gen Bank accession no. AB016532）では、ｒｍＰｅｒ２−Ｆ１プライマー；5'-GCTCACTGCCAGAACTATCTCC-3'（配列番号５３）及びｒｍＰｅｒ２−Ｒ１プライマー；5'-CCTCTAGCTGAAGCAGGTTAAG-3'（配列番号５４）を用い、３０サイクル行った。ｍＣｌｏｃｋ（Gen Bank accession no. AB019258）では、ｒｍＣｌｏｃｋ−Ｆ１プライマー；5'-CAAGGTCAGCAACTTGTGACC-3'（配列番号５５）及びｒｍＣｌｏｃｋ−Ｒ１プライマー；5'-AGGATGAGCTGTGTCGAAGG-3'（配列番号５６）を用い、２８サイクル行った。ｍＧＡＰＤＨ（Gen Bank accession no. X02231）では、ｒｍＧＡＰＤＨ−Ｆ１プライマー；5'-CATCACCATCTTCCAGGAGC-3'（配列番号５７）及びｒｍＧＡＰＤＨ−Ｒ１プライマー；5'-ATTGAGAGCAATGCCAGCC-3'（配列番号５８）を用い、２１サイクル行った。なお、各時計遺伝子のＰＣＲのサーマルサイクラーのプログラムは、実施例４に記載の条件下で行った。
【００５４】
上記の結果を図１２に示す。この結果は文献（Genes Cell 3, 167-176, 1998、Science 288, 1013-1019, 2000）記載のように、ｍＰｅｒ２のｍＲＮＡレベルは、ＳＣＮ領域で強い日周変動を示し（図１２Ａ）、またｍＢｍａｌ１のｍＲＮＡレベルはＬＤサイクル下のｍＰｅｒ２とほぼ逆位相で弱く振動することがわかった（図１２Ｃ）。これに対して、ｍＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルはｍＣｌｏｃｋと同様に一日中ほぼ一定（図１２Ｂ、Ｄ）で、ｍＢｍａｌ１遺伝子とｍＢｍａｌ２遺伝子との間で転写調節に違いがあることがわかった。
【００５５】
実施例６（ヒヨコの松果体におけるｃＰｅｒ２、ｃＢｍａｌ１及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルの光依存変化）
早朝においてｃＢｍａｌ１／２が低レベルに発現していたことから（図１２）、ｃＢｍａｌ１／２転写の光によるダウンレギュレーションの可能性について調べてみた。実施例４の結果より、暗期においてｃＢｍａｌ１／２の発現レベルが両方とも高かった時間（ＣＴ１４〜ＣＴ１５）の間ヒヨコに光を当て、ＣＴ１５．５及びＣＴ１７におけるｍＲＮＡレベルの変化を調べてみた。生後１日のヒヨコを一週間ＬＤサイクル下におき、続いてＤＤ条件下においた。ＤＤ条件下の第１日目に光パルス（３５０ルクス）を１時間（ＣＴ１４〜ＣＴ１５）照射したヒヨコの松果体（図１３Ａの下図）、及び光パルスを照射していないヒヨコの松果体（図１３Ａの上図）を、ＣＴ１５．５又はＣＴ１７の時にそれぞれ単離し、各松果体から得られた全ＲＮＡ（８μｇ）をそれぞれ、アガロースゲル電気泳動法により分離し、ニトロセルロース膜にブロッティングした。
【００５６】
上記ブロットした膜をそれぞれ２分割し、一方（２．４Ｋｂより長いＲＮＡを有するもの）は、ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、又はｃＰｅｒ２プローブとハイブリダイズさせ、他方は、ヒストンＨ４プローブとハイブリダイズさせた。その後、ＭａｃＢＡＳソフトウェア（富士フイルム製）により、ｃＢｍａｌ１（図１３Ｂ）、ｃＢｍａｌ２（図１３Ｃ）、ｃＰｅｒ２（図１３Ｄ）、及びヒストンＨ４のシグナルを測定し、全シグナル強度をヒストンＨ４のシグナルで標準化し、ＣＴ１４における各遺伝子の平均値を１として、ｍＲＮＡレベルを求めた。各値は、上記と同様に行った３回の実験から求め、平均値±ＳＥＭとして表した。結果を図１３に示す。なお、図１３中の「＊」はｐ＜０．０５を、「＊＊」はｐ＜０．０２をそれぞれ意味し、ｐ値はStudent's t testを用いて決定した。これらの結果から、ＣＴ１５．５において、光照射したヒヨコの松果体で観察されたｃＢｍａｌ１及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡレベルは、光照射していないコントロール動物の値に比べ、実質的に低下していた。これに対して、光照射後２時間のＣＴ１７では、光照射したマウスのＳＣＮにおけるｍＰｅｒ１及びｍＰｅｒ２において観察されたもの（Cell 91, 1055-1064, 1997、Neuron 19, 1261-1269, 1997、Genes Cells 3, 167-176, 1998）と同様に、光によるｃＰｅｒ２の発現誘導が確認できた。
【００５７】
実施例７（ｃＢＭＡＬ２の機能的特性；プルダウンアッセイ）
ＡＲＮＴ（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）関連タンパク質の中で、ＢＭＡＬ１とＢＭＡＬ２は近い関係にあることから（図５）、機能的にも類似しているのではないかと考え、細菌により発現させた３種類のＧＳＴ融合タンパク質［ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔ（ＧＳＴとＣ末端領域が切断されたＭｅｔ1〜Ｓｅｒ466のｃＣＬＯＣＫとの融合物）、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ１、及びＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ２］と、インビトロで転写・翻訳させた［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ１Δ（Ｍｅｔ1−Ｓｅｒ449）又は［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ２Δ（Ｍｅｔ1−Ｌｅｕ458）とを用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイを行い、ｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２、及びｃＣＬＯＣＫの関連性を調べてみた。なお、上記ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔは、ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫ（ＧＳＴと完全長のｃＣＬＯＣＫとの融合タンパク質）が２％のトリトンＸ−１００で可溶化されなかったことから、代わりに用いた。
【００５８】
上記ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔ、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ２、又はＧＳＴをコードするＤＮＡ断片を、ｐＧＥＸ５Ｘ−１発現ベクターに導入し、ＢＬ２１大腸菌（E.coli）株を用いて発現させた。各大腸菌を緩衝液Ａ［１０ｍＭのNa-phosphate（ｐＨ７．９）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＬにつきComplete EDTA-free protease inhibitor（Roche Diagnostics社製）１錠］中で溶菌し、可溶化した各融合タンパク質又はＧＳＴをグルタチオン−セファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製した。また、上記の［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ１Δ（Ｍｅｔ1−Ｓｅｒ449）及び［35Ｓ］標識ｃＢＭＡＬ２Δ（Ｍｅｔ1−Ｌｅｕ458）は、ｃＢＭＡＬ１Δ（Ｍｅｔ1−Ｓｅｒ449）又はｃＢＭＡＬ２Δ（Ｍｅｔ1−Ｌｅｕ458）のｃＤＮＡ断片を含む発現プラスミドを、［35Ｓ］メチオニン存在下でTNT-T7 Quick Coupled Transcription/Translation System（Promega製）により、インビトロで転写・翻訳させ調製した。なお、同様にコントロールとしての［35Ｓ］標識ルシフェラーゼをインビトロで転写・翻訳させた。
【００５９】
上記の［35Ｓ］標識タンパク質（ｃＢＭＡＬ１Δ、ｃＢＭＡＬ２Δ、又はルシフェラーゼタンパク質）溶液各８μＬを、ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔ（０．１μｇ）、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ１（１．１μｇ）、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ２（３．３μｇ）、又はＧＳＴ（５．６μｇ）が結合したグルタチオン−セファロースビーズ４０μＬと混合した。この混合物を氷上の緩衝液Ｂ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、２０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１５ｍＭのＫＣｌ、０．２％のトリトンＸ−１００、２．５％のスキムミルク、５０ｍＬにつきComplete EDTA-free protease inhibitor１錠］１４０μＬ中で１時間緩やかに回転させながらインキュベートした。インキュベーション後、緩衝液Ｃ［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２％のトリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、Complete EDTA-free protease inhibitor１錠］で上記混合物を４回洗浄し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動により分離した後、ＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）を用いてゲルのオートラジオグラフを解析した。
【００６０】
上記の結果を図１４に示す。なお、レーン１６〜１８は、[35Ｓ]標識したｃＢＭＡＬ１△、ｃＢＭＡＬ２△、又はルシフェラーゼ（それぞれ投入量の２．５％）を電気泳動した結果を示す。なお、レーン１７において観察されるわずかなシグナル（上段のバンド）は、レーン１８のルシフェラーゼが混入したことによるものである。この結果から、ＧＳＴ−ｃＣＬＯＣＫΔが、ｃＢＭＡＬ１ΔだけでなくｃＢＭＡＬ２Δにもインビトロで特異的に結合することが明らかとなった（図１４、レーン１、２）。また、興味深いことに、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ２は、ｃＢＭＡＬタンパク質の両方に結合し（図１４、レーン４、５）、また、ＧＳＴ−ｃＢＭＡＬ１においても同様な結合プロフィールを示していた（図１４、レーン７、８）。以上のことから、ｃＢＭＡＬタンパク質が、ホモ二量体及びｃＢＭＡＬ１−ｃＢＭＡＬ２ヘテロ二量体を形成する潜在的な活性を示すことがわかった。さらに、Ｃ末端が欠損したｃＢＭＡＬタンパク質では、完全長ｃＢＭＡＬタンパク質よりもＧＳＴ融合タンパク質に効率よく結合することがわかった。
【００６１】
実施例８（ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを含むプローブを用いた電気泳動易動度シフト分析）
Ｅ−ｂｏｘ配列に対する、ｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫ又はｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫの結合性を、ｃＰｅｒ２遺伝子のプロモーター領域に存在するＥ−ｂｏｘ（ＣＡＣＧＴＧ）を含む配列をプローブとして用いて電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）により測定した。上記プローブとしては、ｃＰｅｒ２遺伝子の推定プロモーター／エンハンサー領域内におけるＥ−ｂｏｘ配列及びそのフランキング配列に相当するオリゴヌクレオチド［ｃＰ２Ｅ１−Ｓ：5'-GTGTCACACGTGAGGCTTA-3'（配列番号５９）、及びｃＰ２Ｅ１−ＡＳ：5'-TAAGCCTCACGTGTGACAC-3'（配列番号６０）］を合成し、これら合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングした後、TOPO-TA cloning kit（Invitrogen, CA）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにサブクローンし、その後、制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した３９ｂｐの断片を用いた。上記ｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫは、ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２又はｃＣｌｏｃｋのｃＤＮＡを含む発現プラスミドから、TNT-T7 Quick Coupled Transcription/Translation System（Promega）を用いてインビトロで転写・翻訳させることによって調製し、また、発現ベクターpcDNA3.1/V5/His empty vectorのみを上記と同様に転写・翻訳させたものをコントロールとして用いた。
【００６２】
上記得られた各タンパク質混合物（ＢＭＡＬ１＋ＢＭＡＬ２、ＢＭＡＬ１＋ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ２＋ＣＬＯＣＫ）５μＬに、32Ｐ標識化プローブ（３３ｆｍｏｌｅｓ、１．３×１０5ｃｐｍ）を含む緩衝液［２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、及び１μｇの変性鮭精子ＤＮＡ］３２μＬを加え、２３℃で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、各混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、実施例７と同様にＦＬＡ２０００バイオイメージアナライザー（富士フイルム製）を用いて分析した。その結果を図１５に示す。また、図１５中のレーン１は標識プローブのみを、レーン２〜５は各翻訳産物（コントロール、ＢＭＡＬ１、ＢＭＡＬ２、又はＣＬＯＣＫ）と標識プローブとを反応させた結果を示している。なお、図中の星印はフリープローブの位置を、黒矢じりはｂＨＬＨ−ＰＡＳ型タンパク質の特異的な複合体を、白矢じりはバックグラウンドを示す。この結果から、ｃＣＬＯＣＫ存在下でｃＢＭＡＬ２やｃＢＭＡＬ１は、それぞれ２又は３つの複合体を形成しているのが確認できた（図１５におけるレーン７及び８の黒矢じり）。また、ｃＣＬＯＣＫ、ｃＢＭＡＬ１、又はｃＢＭＡＬ２だけをプローブと反応させた場合（図１５におけるレーン３〜６）、特異的なバンドがみられなかったことから、上記複合体は調べたＰＡＳ型タンパク質（ｃＣＬＯＣＫ、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２）のいずれかのホモ二量体を表すものではないと推測できる。これらの結果から、ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘが、インビボにおけるｃＣＬＯＣＫ−ｃＢＭＡＬ１／２ヘテロマーの標的の一つであると考えられる。
【００６３】
実施例９（２９３ＥＢＮＡ細胞でのｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫによる転写調節）
フィードバックループにおける役割モデルとしてｍＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘやｍＰｅｒ１プロモーターを、出力経路における役割モデルとしてバソプレッシン遺伝子のＥ−ｂｏｘを、それぞれ用いてｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫによる転写活性化能や転写抑制能を調べてみた。ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen製）を、１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies製）中で培養し、この培養した細胞を１ウエルあたり３×１０5細胞となるように６ウエルプレートにのせて、総量１μｇの種々の発現プラスミド［発現ベクター、リポーター遺伝子を含むプラスミド、０．２５ｎｇのウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼリポーター（ｐＲＬ−ＣＭＶ；Promega製）、及び、図１６に示す量の各種時計遺伝子（ｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＣｌｏｃｋ）のｃＤＮＡを含むプラスミド］と、リポフェクタミンプラス（Lipofectamine plus；Life Technologies製）とを用いてトランスフェクトした。
【００６４】
なお、上記発現ベクターはpcDNA3.1/V5/His empty vector（Invitrogen製）を用い、また、上記リポーター遺伝子は、２５ｎｇのｍＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを含むホタルルシフェラーゼリポーター（cPer2 E-box-luc；pGL3-Promoter骨格を持つ；Promega製）、２５ｎｇのcPer2 mut. E-box-luc、５０ｎｇのｍＰｅｒ１プロモーターを含むホタルルシフェラーゼリポーター（ｍＰｅｒ１−ｌｕｃ；pGL3-Basic骨格を持つ；Promega製）、２５ｎｇのマウスバソプレッシンＥ−ｂｏｘを含むホタルルシフェラーゼリポーター（AVP E-box-luc；pGL3-Promoter骨格を持つ；Promega製）、２５ｎｇのAVP mut. E-box-luc、又は２５ｎｇのＴＲＥ−ｌｕｃを用いて行った。上記トランスフェクションから２日後、細胞抽出物を製造者のプロトコールに基づき、ルミノメトリー（luminometry；Progema製）によるデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。なお、各抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性により標準化し、３つの個別に得られた培養抽出物の値から平均値（平均値±ＳＥＭ）を求めた。
【００６５】
上記リポーター遺伝子を含むプラスミドは、以下のように作製した。cPer2 E-box-lucは、ｃＰｅｒ２遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内におけるＥ−ｂｏｘ配列（ＣＡＣＧＴＧ）と、そのフランキング配列とをタンデムに結合させたもの（５'−ＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡ−３′）を、ＳＶ４０プロモーターを有するルシフェラーゼリポーター（pGL3-Promoter、Promega製）に挿入して作製した。また、対照実験としてのリポータープラスミドとしてのcPer2 mut.E-boxは、文献（Cell 96, 57-68, 1999）記載の方法と同様にＥ−ｂｏｘ配列をＧＧＡＣＣＴに変異させ作製した。ｍＰｅｒ１−ｌｕｃは、２．２ＫｂのｍＰｅｒ１のアップストリームフラグメントを、マウスゲノムＤＮＡの鋳型［センスプライマー３；5'-TCGAGCTCTTTGGTACCTGGCCAGCAACC-3'（配列番号６１）及びアンチセンスプライマー３；5'-TCACGACACCTGGCCGTTCGAGG-3'（配列番号６２）］と、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼとを用いたＰＣＲ法により増幅した後、個別のＰＣＲ法により得られた６クローンの塩基配列を決定し、そのうちＰＣＲエラーがない１つのクローンをルシフェラーゼリポーター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、Promega製）につないで作製した。AVP E-box-lucは、マウスバソプレッシン遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内におけるＥ−ｂｏｘ配列（ＣＡＣＧＴＧ）と、そのフランキング配列とを連結させたもの（５′−ＴＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡ−３′）を、ＳＶ４０プロモーターを有するルシフェラーゼリポーター（pGL3-Promoter、Promega製）に挿入して作製した。また、対照実験としてのリポータープラスミドであるAVP mut. E-box-luc（Ｅ−ｂｏｘを変異させたリポーター）は、文献（Cell 96, 57-68, 1999）記載の方法で作製し、ＴＲＥ−ｌｕｃにおいては、ヒトコラゲナーゼ遺伝子内におけるホルボールエステル応答配列（ＴＲＥ）と、そのフランキング配列とをタンデム［5'-CGGCTGACTCATCAAGCTGACTCATCAAGCTGACTCATCAA-3'（配列番号６３）］に連結させ、それを、pGL-Basic vecter中にｐＲＬ−ＴＫベクター（Promega製）のＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIフラグメントをつなぎ合わせたルシフェラーゼリポーター（pGL3-TK-promoter vector）のＢｇｌII部位に挿入して作製した。
【００６６】
以上の結果を図１６に示す。これらのことから、ｃＣＬＯＣＫがｃＢＭＡＬ１だけでなくｃＢＭＡＬ２とも結合し、ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介しての転写活性を促進することがわかった（図１６Ａ）。また、３個のＥ−ｂｏｘ配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有する２．２ｋｂのｍＰｅｒ１プロモーターを用いても同様の結果が得られた（図１６Ｂ）。興味深いことに、図１６Ｂ（図の左部分参照）及び図１６Ｃ（図の左から１０〜１６番目の棒グラフを参照）において、ｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化は、比較的低用量のｃＢｍａｌ２発現プラスミド（２０ｎｇ）と、ｃＣｌｏｃｋプラスミド（２５０ｎｇ）とを共発現した場合で明らかなピークを示し、上記の量より多いｃＢｍａｌ２プラスミドでは転写活性が抑制されていた。しかし、ｃＢｍａｌ１にはそのような抑制効果はみられなかった。また、ｃＢｍａｌ２を多量（１６０ｎｇ）に使用しても、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ、図１６Ｂ）及びＳＶ４０プロモーターからの内因性の転写活性が抑制されることがないことから、かかる抑制はＥ−ｂｏｘ又はＥ−ｂｏｘ結合成分への特異的な効果によるものであることがわかった。
【００６７】
さらに、図１０及び図１１の結果、ｃＢｍａｌ１とｃＢｍａｌ２とが僅かにずれて発現することから、転写調節におけるｃＢＭＡＬ１及びｃＢＭＡＬ２の協同効果も調べてみた。バソプレッシン遺伝子のＥ−ｂｏｘをレポーターとした場合（図１６Ｃ）、ｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化がｃＢｍａｌ２を少量（１０ｎｇ）発現させることにより著しく高くなった（図１６Ｃの左から１７〜２３番目の棒グラフを参照）。また、ｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫの転写活性化において少量（１０ｎｇ）のｃＢｍａｌ１プラスミドを使用することにより、同程度又はより優れた協同効果が確認できた（図１６Ｃの左から２４〜３０番目の棒グラフを参照）。さらに、より多量のｃＢｍａｌ２（８０〜１６０ｎｇ）又はｃＢｍａｌ１（４０〜１６０ｎｇ）を使用することにより協同活性化が著しく抑制された。これはｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘやｍＰｅｒ１プロモーター（図１６Ｂ）を用いた場合においても規模は小さいとはいえ、同様の結果がみられた。
【００６８】
実施例１０（Ｅ−ｂｏｘ配列を介した転写活性化に対するｃＰＥＲ２の効果）
次に、ｃＰＥＲ２が、転写活性化因子ｃＢＭＡＬ−ｃＣＬＯＣＫの転写活性化に対して抑制的に働くかどうかを調べてみた。なお、本実施例においては、ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトする発現プラスミドに、図１７Ａ及びＢに示す量のｃＰｅｒ２のｃＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトする以外は、実施例９記載の方法と同様に行った。その結果を図１７Ａ及びＢに示す。その結果、ｃＰｅｒ２プラスミド（２５０ｎｇ）を２９３ＥＢＮＡ細胞に共発現させると、ｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫによるｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介した転写活性化を抑制し、かかる抑制効果の程度は、同条件下におけるｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化の抑制効果の程度より強力なものであった（図１７Ａ）。また、バソプレッシンＥ−ｂｏｘを介したｃＢＭＡＬ−ｃＣＬＯＣＫによる転写活性化の場合においても同様な傾向がみられ（図１７Ｂ）、ｃＰＥＲ２の量を多くするにつれて、さらなる抑制効果が確認できた。
【００６９】
ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介した転写活性化について本来備わっている性質を、培養したニワトリ松果体細胞を用いて調べてみた。生後一日のヒヨコから調製した松果体細胞を４×１０5細胞／ウエルになるように２４ウエルプレートにのせ、ＬＤサイクル下で培養した。培養３日目のＺＴ９における松果体細胞に、５００ｎｇの上記ｃＰｅｒ２発現プラスミド又はpcDNA3.1/V5/His（コントロール）と、２５０ｎｇのcPer2 E-box-luc又はcPer2 mut.E-box-lucと、５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ（Promega）とを、リポフェクタミンプラスを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした翌日、ＺＴ６における細胞抽出物を用いてデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。この結果を図１７Ｃに示す。この結果から、ｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘを介する内在性の転写活性は、Ｅ−ｂｏｘ配列に変異を生じさせることにより著しく減少し、さらにｃＰＥＲ２を強制発現させることによる転写活性の抑制効果もＥ−ｂｏｘ依存的であった。以上のことはニワトリ松果体細胞がｃＰｅｒ２のＥ−ｂｏｘ上で作用するポジティブ因子を発現し、この因子がｃＰＥＲ２による負の調節に対して影響していることを示唆している。
【００７０】
実施例１１（ｃＢＭＡＬ１及びｃＢＭＡｌ２の過剰発現によるメラトニンリズムの消散）
周期性の維持における２つのＰＡＳタンパク質の役割を評価するために、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２を培養したヒヨコ松果体細胞内で過剰発現させ、メラトニンリズムに対する影響を調べてみた。ヒヨコ松果体細胞を、２４ウエルクローニングプレート（Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Germany）で２日間培養し、リポフェクタミンプラス（Life Technologies）とGenefector（VennNova LLc, FL）とを用いて、５００ｎｇの上記ｃＢＭＡＬ１若しくはｃＢＭＡＬ２発現プラスミド、又はpcDNA3.1/V5/His（コントロール）をトランスフェクトした。トランスフェクト後２日目に、上記細胞を２００ｍｇ／ＬのＧ４１８（Life Technologies）を含む培地で４日間培養してトランスフェクトされた細胞を選択し、その選択した細胞を５０ｍｇ／ＬのＧ４１８を含む培地で更に培養した。かかる培養培地を４時間毎に回収し、文献（Neurosci 20, 986-991, 2000）記載の方法により放出したメラトニン量を測定した。その結果を図１８に示す。なお、各パネルにおける４つのデーターは、個別の培養物から得た結果をそれぞれ示し、ＬＤサイクル間のメラトニン産生レベルを平均１と設定してそれぞれの値を求めた。また、図１８の下におけるバーは光による状態を示す。
【００７１】
各細胞における松果体のメラトニンリズムを調べた結果、わずかな位相の遅延が確認できた。この変化はトランスフェクトされていない松果体細胞においてもみられたが、この時計発振は、コントロール細胞（図９Ａ）や、ｍ１又はｍ２アセチルコリンレセプターのような時計タンパク質と関連のないタンパク質が過剰発現した細胞を、数日間ＤＤ条件下で培養することによってもみられた。これらのコントロール細胞に対して、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の過剰発現細胞では、ＤＤ条件下でメラトニン産生における振動は１回しかみられず、その振動はその後一定に保たれることがわかった（図１８Ｂ及びＣ）。ＬＤサイクル下では、ｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の過剰発現細胞における日ごとのメラトニンの変動は、コントロール細胞におけるものとほとんど類似していることから、光によるメラトニン産生の細胞機構は、過剰発現したｃＢＭＡＬタンパク質によって安定に維持されていると考えられる。にもかかわらず、ＤＤ条件下でリズムが消失するということは、とりも直さずｃＢＭＡＬ１およびｃＢＭＡＬ２がいずれもリズム発振に必須の因子であることを強く示唆している。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によると、光入力経路及び出力経路を含む時計発振機構において重要である新規ＢＭＡＬ２活性を有する新規時計タンパク質、それらをコードする遺伝子ＤＮＡを提供することができる。また、それらタンパク質や遺伝子ＤＮＡを用いることにより、睡眠相後退症候群、非２４時間睡眠・覚醒症候群、睡眠相前進症候群、時差帯域変化症候群、交代勤務睡眠障害群等の概日リズム睡眠障害等の予防や治療に有用な物質をスクリーニングするだけではなく、サーカディアン発振系の分子メカニズムを明らかにすることができる。また、本発明のＢＭＡＬ２活性を有するタンパク質は、転写促進と抑制の両方の機能を併せ持ち、また、ＣＬＯＣＫ以外のパートナーとも結合して様々な生体機能に関与していると考えられることから、かかるＢＭＡＬ２やＢＭＡＬ２のドミナントネガティブ変異体を過剰に外部から遺伝子導入することにより、ｐｅｒｉｏｄ遺伝子をはじめとする一群の転写調節領域の機能を、特異的に阻害することへの応用が期待できる。
【００７３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｃＰＥＲ２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ｃＰＥＲ２及び３つのマウスＰＥＲ蛋白質（ｍＰＥＲ１−３）間におけるドメインにおけるアミノ酸同一性の結果を示す図である。
【図３】各種ＢＭＡＬのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図４】各種ＢＭＡＬタンパク質におけるドメインのアミノ酸同一性の結果を示す図である。
【図５】ＡＲＮＴ−ＢＭＡＬタンパク質の系統樹、及びｃＢＭＡＬ２又はｈＢＭＡＬ２とのアミノ酸同一性を示す図である。
【図６】本発明のｈＢｍａｌ２遺伝子のゲノム構造を示す図である。
【図７】本発明のマウスＢＭＡＬ２及びラットＢＭＡＬ２の基本構造を示す図である。
【図８】ＢＭＡＬ−ＡＲＮＴファミリータンパク質の系統樹を示す図である。
【図９】本発明のｃＢｍａｌ２及びｃＢｍａｌ１遺伝子発現のノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【図１０】ニワトリ松果体のｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＰｅｒ２及びｃＣｌｏｃｋの個体におけるｍＲＮＡレベルの経時変化の結果を示す図である。
【図１１】ＬＤ条件下又はＤＤ条件下におけるｃＢｍａｌ１、ｃＢｍａｌ２、ｃＰｅｒ２及びｃＣＬＯＣＫのｍＲＮＡレベルの培養ニワトリ松果体細胞での経時変化を示す図である。
【図１２】マウス視交叉上核におけるｍＰｅｒ２、ｍＣｌｏｃｋ、ｍＢｍａｌ１及びｍＢｍａｌ２のｍＲＮＡ発現のＬＤ条件下での日周変動の結果を示す図である。
【図１３】ニワトリ松果体におけるｃＰｅｒ２、ｃＢｍａｌ１、及びｃＢｍａｌ２のｍＲＮＡ発現の光依存変化の結果を示す図である。
【図１４】本発明のｃＢＭＡＬ２、ｃＢＭＡＬ１及びｃＣＬＯＣＫタンパク質の間におけるインビトロでの物理的相互作用の結果を示す図である。
【図１５】Ｅ−ｂｏｘ配列と、ｃＢＭＡＬ１−ｃＣＬＯＣＫ又はｃＢＭＡＬ２−ｃＣＬＯＣＫとの結合性を電気泳動易動度シフト分析（ＥＭＳＡ）により測定した結果を示す図である。
【図１６】２９３ＥＢＮＡ細胞でのｃＢＭＡＬ１、ｃＢＭＡＬ２及びｃＣＬＯＣＫによる転写調節の結果を示す図である。
【図１７】Ｅ−ｂｏｘ配列を介した転写活性化に対するｃＰＥＲ２の効果を示す図である。
【図１８】ヒヨコ松果体細胞のメラトニンリズムにおけるｃＢＭＡＬ１又はｃＢＭＡＬ２の過剰発現による効果を示す図である。
Claims (25)
- 配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号１、３、５若しくは７に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号１１若しくは１３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号１５、１７若しくは１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
- さらに、ＣＬＯＣＫ及び／又はＢＭＡＬ１を発現することができることを特徴とする請求項１４記載の宿主細胞。
- 発現系が、Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１４又は１５記載の宿主細胞。
- Ｅボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターが、Ｐｅｒ遺伝子、Ｔｉｍ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子、バソプレッシン遺伝子又はアルブミンＤサイト結合蛋白質遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１６記載の宿主細胞。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物。
- 非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１８記載の非ヒト動物。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞が、請求項１４〜１７のいずれか記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２０記載の該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
- 請求項１８又は１９記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質又はＢｍａｌ２活性促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
- 請求項９〜１２のいずれか記載のタンパク質を発現し、かつＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターを含有している細胞が、請求項１６又は１７記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２３記載のプロモーター転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
- 請求項１８又は１９記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする該非ヒト動物におけるＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）を有するプロモーターの転写活性の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
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