DE69223810T2

DE69223810T2 - Neues lepidopterenaktives isolat von bacillus thuringiensis, genannt b.t. ps 158c2, und gene die für lepidopterenaktive toxine kodieren

Info

Publication number: DE69223810T2
Application number: DE69223810T
Authority: DE
Inventors: Raymond Cannon; David Cummings; Jewel Payne
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 1998-05-20
Anticipated expiration: 2012-09-12
Also published as: GR3026361T3; ATE161391T1; AU2672792A; AU662563B2; ZA926944B; DE69223810D1; NZ244285A; EP0642305B1; EP0642305A1; US5268172A; WO1993005657A1; ES2112331T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die am häufigsten verwendeten mikrobiellen Pestizide sind von dem Bakterium Bacillus thuringiensis abgeleitet. Dieses bakterielle Agens wird eingesetzt, um ein breites Spektrum von blattfressenden Raupen und Moskitos zu kontrollieren. Bacillus thuringiensis erzeugt eine proteinhaltige Paraspore oder einen Kristall, die bzw. der nach Aufnähme durch einen empfänglichen Insektenwirt toxisch ist. Beispielsweise erzeugt B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 einen Kristall mit der Bezeichnung Delta-Toxin, der für die Larven einer Anzahl von Lepidoptera-Insekten toxisch ist. Die Klonierung und Expression eines Kristallprotein-Gens aus diesem B.t.-Stamm in Escherichia coli ist in der publizierten Literatur (Schnepf, H.E. und Whitely, H.R. [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897) beschrieben worden. Das US-Patent 4,448,885 und das US-Patent 4,467,036 offenbaren beide die Expression eines B.t.-Kristallproteins in E. coli.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfmdung betrifft ein neues Bacillus thuringiensis-Isolat mit der Bezeichnung B.t. PS158C2 und Mutanten davon, welche Aktivität gegen Lepidoptera- Schädlinge aufweisen.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind die aus dem Isolat erhältlichen Delta-Endotoxin-Gene, wobei die Gene für Proteine kodieren, welche Aktivität gegen Lepidoptera-Schädlinge aufweisen. Diese Toxingene können mit Hilfe eines Plasmidvektors in geeignete Wirte überführt werden.
Speziell umfaßt die Erfindung ein neues B.t.-Isolat mit der Bezeichnung B.t. PS158C2, Mutanten davon und neue Delta-Endotoxin-Gene, welche für Proteine von 47, 37, 34 und 32 kDa mit Aktivität gegen Lepidoptera-Schädlinge kodieren.

Kurzbeschreibung der Zeichnung

Figur 1 ist eine Photographie eines 9%-igen SDS-Polyacrylamidgels, welches Alkali-lösliche Proteine von Bacillus thuringiensis PS158C2 im Vergleich zu zwei typischen Lepidoptera-aktiven Stämmen zeigt.

Detaillierte Offenbarung der Erfindung

Alle bisher beschriebenen B.t.-Delta-Endotoxine mit Lepidoptera-Aktivität sind vom Typ cryl (130-140 kDa) oder cryII (etwa 70 kDa). B.t.-PS158C2 hat eine vollkommen unterschiedliche Gruppe kleinerer Proteine, von denen die größten 47 kDa bei SDS-PAGE aufweisen.

Merkmale von B.t. PS158C2

Kolonien-Morphologie -- große Kolonie, matte Oberfläche, typisch für B.t.
Vegetative Zellmorphologie -- typisch für B.t.
Einschlußtyp -- Amorph
Aktivität -- B.t. PS158C2 tötet alle getesteten Lepidoptera.
Ungefähres Molekulargewicht der Proteine (kDa) --47, 37, 34, 32
Bioassay-Verfahren und Ergebnisse:
Spodoptera littoralis-Bioassay -- Dieser Assay wurde mit sprühgetrocknetem Pulver von B.t.-Stämmen durchgeführt. Es wurden Larven in der ersten Erscheinungsform eingesetzt mit einer 1 %-Agar-Nahrung, die 0,5 % sprühgetrocknetes Pulver enthielt. Die Sterblichkeitsziffer wurde nach 7 Tagen aufgezeichnet. B.t. PS158C2 ergab eine Sterblichkeitsziffer von größer als 80%.
Plutella xylostella-Bioassay -- Verdünnungen eines sprühgetrockneten Pulvers von B.t. PS158C2 wurden in die Nahrung inkorporiert und Larven in der dritten Erscheinungsform eingesetzt. Die Sterblichkeitsziffer wurde nach 6 Tagen aufgezeichhet. Raten von mehr als 300 µg Pulver pro Gramm Nahrung ergaben uber 90% Sterblichkeit. TABELLE 1: Vergleich von B.t. PS158C2 mit anderen Lepidoptera-aktiven Stämmen
B. thuringiensis PS158C2, NRRL B-18872, und Mutanten davon können unter Verwendung bekannter Standardmedien und Fermentationstechniken kultiviert werden. Nach der Vollendung des Fermentationszyklus können die Bakterien geerntet werden, indem man zuerst die B.t.-Sporen und -Kristalle von der Fermentationsbrühe durch auf diesem Gebiet wohlbekannte Mittel abtrennt. Die gewonnenen B.t.-Sporen und -Kristalle können als benetzbares Pulver, flüssiges Konzentrat, Granulat oder andere Formulierungen durch die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln, Dispergiermitteln, inerten Trägersubstanzen und anderen Komponenten formuliert werden, um die Handhabung und die Anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern. Die Formulierungs und Anwendungsverfahren sind auf diesem Gebiet alle wohlbekannt und werden bei im Handel erhältlichen Stäminen von B.thuringiensis (HD-1) mit Aktivität gegen Lepidoptera, z.B. Raupen, eingesetzt. B.t. PS158C2 und Mutanten davon können zur Kontrolle von Lepidoptera-Schädlingen eingesetzt werden.
Eine Subkultur von B.t. PS158C2 wurde bei der permanenten Sammlung des Northern Researeh Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA am 27. August 1991 hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist wie folgt:
B.t. PS158C2 NRRL B-18872
Die vorliegende Kultur wurde unter Bedingungen hinterlegt, welche sicherstellen, daß ein Zugang zu der Kultur während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung für jemanden möglich ist, der dazu durch den Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 ermächtigt wurde. Die Hinterlegung ist gemäß den Erfordernissen ausländischer Patentgesetze in Ländern zugänglich, wo Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung oder deren Stammanmeldung(en) eingereicht sind. Es versteht sich jedoch, daß die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz bedeutet zur Ausführung der vorliegenden Erfindung unter Beeinträchtigung von staatlich erteilten Patentrechten.
Ferner wird die vorliegende Kulturhinterlegung gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden, d.h. sie wird mit aller nötigen Sorgfalt gelagert werden, um sie für einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren nach der letzten Anforderung zur Herausgabe einer Probe der Hinterlegung lebensfähig und unkontaminiert zu halten, und in jedem Fall für einen Zeitraum von mindestens 30 (dreißig) Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder für die durchsetzbare Lebensdauer eines jeden Patents, welches unter Offenbarung der Kultur erteilt werden mag. Der Hinterleger erkennt die Pflicht an, die Hinterlegung zu ersetzen, sollte die Hinterlegungsstelle aufgrund des Zustands des hinterlegten Guts nicht in der Lage sein, auf Anforderung eine Probe zu liefern. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Zugänglichkeit der vorliegenden Kulturhinterlegung für die Öffentlichkeit werden nach Erteilung eines Patents, welches diese offenbart, unwiderruflich aufgehoben werden.
Die Toxingene, welche von den neuen Isolaten der Erfindung beherbergt werden, können nach Standardverfahren gewonnen und in eine große Vielfalt von mikrobiellen Wirten eingeführt werden. Die Expression des Toxingens resultiert direkt oder indirekt in der intrazellulären Produktion und Aufrechterhaltung des Pestizids. Bei geeigneten Wirten, z.B. Pseudomonas, können die Mikroorganismen auf dem Aufenthaltsort von Lepidoptera-Insekten aufgebracht werden, wo sie sich vermehren und von den Insekten aufgenommen werden. Das Ergebnis ist eine Kontrolle der unerwtinschten Insekten. Als Alternative kann der Mikroorganismus, der das Toxingen beherbergt, unter Bedingungen behandelt werden, welche die Aktivität des in der Zelle erzeugten Proteins verlängern. Die behandelte Zelle kann dann in der Umwelt von Zielschädlingen ausgebracht werden. Das resultierende Produkt behält die Toxizität des B.t.-Toxins.
Wenn das B. t.-Toxingen mittels eines geeigneten Vektors in einen mikrobiellen Wirt eingeführt wird und der Wirt in der Umwelt in lebendem Zustand ausgebracht wird, ist es essentiell, daß bestimmte Wirtsmikroorganismen verwendet werden. Es werden Mikroorganismen-Wirte ausgewählt, von denen bekannt ist, daß sie die "Phytosphäre" (Phyllooberfläche, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizooberfläche) einer oder mehrerer interessierenden Erntepflanze(n) bewohnen. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, daß sie imstande sind, in der besonderen Umwelt (Erntepflanze und anderen Insekten-Habitaten) erfolgreich mit den Wildtyp-Mikroorganismen im Wettbewerb zu stehen, für stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens sorgen, welches das Polypeptid-Pestizid exprimiert, und wunschenswerterweise für verbesserten Schutz des Pestizids vor umweltbedingtem Abbau und Inaktivierung sorgen.
Von einer großen Anzahl von Mikroorganismen ist bekannt, daß sie die Phyllooberfläche (die Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder die Rhizosphäre (den Boden in der Umgebung von Pflanzenwurzeln) einer großen Vielfalt von wichtigen Erntepflanzen bewohnen. Diese Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Pilze ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z.B. der Gattungen Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Phodopseudomonas, Methylophihus, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefe, z.B. der Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche Bakterienspezies der Phytosphäre wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus und Azotobacter vinlandii; und Hefespezies der Phytosphäre wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantia ca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
Eine große Vielfalt von Wegen sind zur Einführung des B.t.-Gens, welches das Toxin exprimiert, in den Mikroorganismus-Wirt unter Bedingungen verfügbar, die die stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens erlauben. Es ist möglich, DNA-Konstrukte bereitzustellen, welche einschließen die transkriptionalen und translationalen Regulationssignale zur Expression des Toxingens, das Toxingen unter deren regulatonscher Kontrolle und eine DNA-Sequenz, die zu einer Sequenz im Wirtsorganismus homolog ist, wodurch Integration eintreten wird, und/oder ein Replikationssystem, das in dem Wirt fünktionell ist, wodurch Integration oder stabile Aufrechterhaltung eintreten wird.
Die transkriptionalen Initiationssignale werden einen Promotor und eine transkriptionale Initiationsstartstelle einschließen. In einigen Fällen mag es wünschenswert sein, für eine regulative Expression des Toxins zu sorgen, wodurch die Expression des Toxins nur nach der Freisetzung in die Umwelt eintreten wird. Dies kann mit Operatoren erreicht werden oder einem Bereich, der an einen Aktivator oder an "Enhancer" bindet, die nach einer Änderung in der physikalischen oder chemischen Umwelt der Mikroorganismen zur Induktion imstande sind. Beispielsweise kann ein temperaturempfindlicher regulatorischer Bereich eingesetzt werden, wobei die Organismen im Labor ohne Expression eines Toxins gezüchtet werden können, aber die Expression nach Freisetzung in die Umwelt beginnen würde. Andere Techniken können ein spezielles Nährmedium im Labor verwenden, welches die Expression des Toxins verhindert, während das Nährmedium in der Umwelt die Expression des Toxins erlauben würde. Zur translationalen Initiation wird eine ribosomale Bindungsstelle und ein Initiationscodon vorhanden sein.
Zur Erhöhung der Expression der "Messenger"-RNA können verschiedene Manipulationen durchgeführt werden, insbesondere die Verwendung eines aktiven Promotors ebenso wie der Einsatz von Sequenzen, welche die Stabilität der "Messenger"-RNA erhöhen. Der Initiations- und translationale Terminationsbereich wird ein Stopcodon oder Stopcodons einschließen, einen Terminationsbereich und gegebenenfalls ein Polyadenylierungssignal.
In Transkriptionsrichtung, nämlich in 5'- zu 3'-Richtung der kodierenden oder "Sense"-Sequenz, wird das Konstrukt den transkriptionalen regulatorischen Bereich, falls vorhanden, und den Promotor, wobei der regulatorische Bereich entweder 5' oder 3' vom Promotor gelegen sein kann, die ribosomale Bindungsstelle, das Initiationseodon, das Strukturgen mit einem offenen Leserahlnen in Phase mit dem Initiationscodon, das oder die Stopcodons, die Polyadenylierungs-Signalsequenz, falls vorhanden, und den Terminationsbereich einschließen. Diese Sequenz kann als Doppeistrang für sich allein zur Transformation eines Mikroorganismen-Wirts verwendet werden, wird aber üblicherweise mit einer DNA-Sequenz, die einen Marker beinhaltet, eingeschlossen sein, wobei während der Einführung der DNA in den Wirt die zweite DNA-Sequenz mit dem Toxin-Expressionskonstrukt verknüpft sein kann.
Durch einen Marker ist ein Strukturgen beabsichtigt, das die Selektion derjenigen Wirte, die modifiziert oder transformiert worden sind, ermöglicht. Der Marker wird normalerweise einen Selektionsvorteil bieten, beispielsweise Resistenz gegen ein Biozid, z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika oder Schwermetallen; Komplementierung, z.B. um einem auxotrophen Wirt Prototrophie zu verleihen, oder dgl. Vorzugsweise wird Komplementierung eingesetzt, so daß der modifizierte Wirt nicht nur selektioniert werden kann, sondern auch im Freiland wettbewerbsfähig ist. Es können einer oder mehrere Marker bei der Entwicklung der Konstrukte ebenso wie zur Modifizierung des Wirts eingesetzt werden. Die Organismen können weiter modifiziert sein, indem für einen Wettbewerbsvorteil gegenüber anderen Wildtyp-Mikroorganismen im Freiland gesorgt wird. Beispielsweise können Gene, die Metall-chelierende Agentien, z.B. Siderophore, exprimieren, zusammen mit dem Strukturgen, welches das Toxin exprimiert, in den Wirt eingeführt werden. Auf diese Weise kann die erhöhte Expression eines Siderophors dem Toxin-erzeugenden Wirt einen Wettbewerbsvorteil bieten, so daß er effektiv mit den Wildtyp-Mikroorganismen in Wettbewerb stehen und stabil eine Nische in der Umwelt besetzen kann.
Wenn kein fünktionales Replikationssystem vorhanden ist, wird das Konstrukt auch eine Sequenz von mindestens 50 Basenpaaren (bp), vorzugsweise mindestens etwa 100 bp, und üblicherweise nicht mehr als etwa 1000 bp einer Sequenz, die zu einer Sequenz im Wirt homolog ist, einschließen. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit legitimer Rekombination erhöht, so daß das Gen in den Wirt integriert und durch den Wirt stabil aufrechterhalten werden wird. Wünschenswerterweise wird sich das Toxingen in enger Nachbarschaft zu dem Gen befinden, das für die Komplementierung sorgt, ebenso wie das Gen, das den Wettbewerbsvorteil bietet. Deshalb wird, falls das Toxingen verlorengeht, der resultierende Organismus wahrscheinlich auch das komplementierende Gen und/oder das Gen, das den Wettbewerbsvorteil bietet, verlieren, so daß er nicht mehr in der Lage sein wird, in der Umwelt mit dem Gen, welches das intakte Kontrukt behält, in Wettbewerb zu stehen.
Eine große Anzahl von transkriptionalen regulatorischen Bereichen sind aus einer großen Vielfalt von Mikroorganismen-Wirten wie Bakterien, Bakteriophagen, Cyanobakterien, Algen, Pilzen und dgl. verfügbar. Verschiedene transkriptionale regulatorische Bereiche schließen die Bereiche ein, die mit dem trp-Gen, lac-Gen, gal-Gen, den linken und rechten Lambda-Promotoren, dem Tac-Promotor, den in der Natur mit dem Toxingen assoziierten Promotoren, wenn diese im Wirt funktionell sind, assoziiert sind. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr.4,332,898, 4,342,832 und 4,356,270. Der Terminationsbereich kann derjenige Terminationsbereich sein, der normalerweise mit dem transkriptionalen Initiationsbereich assoziiert ist, oder ein anderer transkriptionaler Initiationsbereich, solange die beiden Bereiche kompatibel und im Wirt fünktionell sind.
Wenn eine stabile episomale Aufrechterhaltung oder Integration gewünscht ist, wird ein Plasmid eingesetzt werden, welches ein im Wirt funktionelles Replikationssystem aufweist. Das Replikationssystem kann von dem Chromosom, einem episomalen Element, das normalerweise in diesem Wirt oder einem anderen Wirt vorhanden ist, oder einem Replikationssystem eines Virus, das im Wirt stabil ist, abgeleitet sein. Es sind eine große Anzahl von Plasmiden verfügbar, z.B. pBR322, pACYCIB4, RSF1010, pRO1614 und dgl. Siehe beispielsweise Olson et al. (1982) J. Bacteriol. 150:6069, und Bagdasarian et al. (1981) Gene 16:237, und die US-Patente Nr.4,356,270, 4,362,817 und 4,371,625.
Das B.t.-Gen kann zwischen dem transkriptionalen und translationalen Initiationsbereich und dem transkriptionalen und translationalen Terminationsbereich eingeführt werden, um so unter der regulatorischen Kontrolle des Initiationsbereichs zu stehen. Dieses Konstrukt wird in einem Plasmid enthalten sein, das mindestens ein Replikationssystem beinhalten wird, aber mehr als eines beinhalten kann, wenn ein Replikations system zur Klonierung während der Entwicklung des Plasmids eingesetzt wird und das zweite Replikationssystem zur Funktion im endgültigen Wirt nötig ist. Zusätzlich können em oder mehrere Marker vorhanden sein, die oben beschrieben worden sind. Wenn Integration gewünscht ist, wird das Plasmid wünschenswerterweise eine Sequenz einschließen, die zu dem Wirts-Genom homolog ist.
Die Transformanten können nach bekannten Verfahren isoliert werden, üblicherweise unter Verwendung einer Selektionstechnik, welche die Selektion des gewünschten Organismus gegenüber unmodifizierten Organismen oder übertragenden Organismen, falls diese anwesend sind, ermöglicht. Die Transformanten können dann auf Pestizid-Aktivität getestet werden.
Geeignete Wirtszellen, wobei die Pestizid-enthaltenden Zellen behandelt werden, um die Aktivität des Toxins in der Zelle zu verlängern, wenn die dann behandelte Zelle in der Umwelt von Zielschädlingen ausgebracht wird, können Prokaryoten oder Eukaryoten einschließen und sind normalerweise auf solche Zellen beschränkt, die keine Substanzen erzeugen, die für höhere Organismen wie Säuger toxisch sind. Es könnten jedoch Organismen, die Substanzen erzeugen, welche für höhere Organismen toxisch sind, eingesetzt werden, wenn das Toxin instabil ist oder das Niveau der Anwendung ausreichend niedrig, um jede Möglichkeit der Toxizität für einen Säugerwirt zu vermeiden. Als Wirte werden von besonderem Interesse die Prokaryoten und die niederen Eukaryoten, z.B. Pilze, sein. Beispielhafte Prokaryoten, sowohl Gram-negative als auch -positive, schließen Enterobacteriaceae wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae wie Rhizobium; Spirillaceae wie Photobakterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae wie Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae ein. Unter den Eukaryoten sind Pilze wie Phycomycetes und Ascomycetes, die Hefe, z.B. Saccharomyces und Schizosaccharomyces, einschließen; und Basidiomycetes-Hefe wie Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dgl.
Eigenschaften, die für die Auswahl einer Wirtszelle für Produktionszwecke von besonderern Interesse sind, schließen die Leichtigkeit, mit der das B.t.-Gen in den Wirt eingeführt werden kann, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Effizienz der Expression, die Stabilität des Pestizids im Wirt und das Vorhandensein unterstützender genetischer Fähigkeiten ein. Eigenschaften, die für die Verwendung als Pestizid-Mikrokapsel von Interesse sind, schließen Schutzeigenschaften für das Pestizid wie dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Packung oder Bildung von Einschlußkörpern; Blattaffinität; mangelnde Toxizität gegenüber Säugern, Attraktivität für die Schädlinge zur Aufnahme; Leichtigkeit des Abtötens und Fixierens ohne Beschädigung des Toxins und dgl. ein. Andere Gesichtspunkte beinhalten die Leichtigkeit der Formulierung und der Handhabung, wirtschaftliche Gesichtspunkte, Lagerungsbeständigkeit und dgl.
Wirtsorganismen von besonderem Interesse schließen Hefe, z.B. Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. und Sporobolomyces sp.; phylloplane Organismen wie Pseudomonas sp., Erwinia sp. und Flavobacterium sp.; oder andere Organismen wie Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp. und dgl. ein. Spezielle Organismen schließen Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis und dgl. ein.
Die Zelle wird üblicherweise intakt sein und im wesentlichen in der Vermehrungsform vorliegen, wenn sie behandelt ist, eher als in einer Sporenform, obwohl in einigen Fällen Sporen eingesetzt werden können.
Die Behandlung der mikrobiellen Zelle, z.B. ein Mikroorganismus, der das B.t. Toxingen enthält, kann auf chemische oder physikalische Weise oder durch eine Kombination von chemischen und/oder physikalischen Mitteln erfolgen, solange sich die Methode nicht schädlich auf die Eigenschaften des Toxins auswirkt oder die zelluläre Fähigkeit zum Schutz des Toxins nicht verringert. Beispiele chemischer Reagenzien sind Halogenierungsmittel, insbesondere Halogene der Atomzahl Nr.17-80. Spezieller kann Iod unter milden Bedingungen und für eine ausreichende Zeit, um die gewünschten Resultate zu erreichen, eingesetzt werden. Andere geeignete Techniken beinhalten die Behandlung mit Aldehyden, z.B. Formaldehyd und Glutaraldehyd; Antiinfektionsmitteln, z.B. Zephiranchlorid und Cetylpyridiniumchlorid; Alkoholen wie Isopropanol und Ethanol; verschiedenen histologischen Fixativen, z.B. Bouins Fixativ und Hellys Fixativ (siehe: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); oder eine Kombination von physikalischen (Wärme) und chemischen Agenzien, die die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins erhalten und verlängern, wenn die Zelle dem Wirtstier verabreicht wird. Beispiele physikalischer Mittel sind Strahlung kurzer Wellenlänge, z.B. Gamma-Strahlung und Röntgenstrahlung, Einfrieren, UV-Bestrahlung, Lyophilisierung und dgl.
Die Zellen werden im allgemeinen erhöhte Strukturstabilität aufweisen, welche die Resistenz gegenüber Umweltbedingungen erhöht. Wenn das Pestizid in einer Proform vorliegt, sollte das Verfahren zur Inaktivierung so gewählt werden, daß das Processing der Proform zur reifen Form des Pestizids durch das Zielschädlingspathogen nicht behindert wird. Beispielsweise wird Formaldehyd Proteine vernetzen und könnte das Processing der Proform eines Polypeptid-Pestizids verhindern. Das Verfahren zur Inaktivierung oder Abtötung hält mindestens einen wesentlichen Teil der Bioverfügbarkeit oder Bioaktivität des Toxins aufrecht.
Der zelluläre Wirt, der das insektizide B.t.-Gen enthält, kann in jedem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, worin das DNA-Konstrukt einen Selektionsvorteil bietet, vorausgesetzt, es ist ein selektives Medium, so daß im wesentlichen alle oder alle Zellen das B.t.-Gen behalten. Diese Zellen können dann nach üblichen Verfahren geerntet werden. Alternativ können die Zellen vor der Ernte behandelt werden.
Die B.t.-Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulate oder Stäube, durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, z.B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (gepulverten Maiskolben, Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können Streu-Haft- Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder oberflächenaktive Mittel beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische Agenzien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere beinhalten.
Die Pestizid-Konzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Pestizid wird in mindestens 1 Gew.-% vorhanden sein und kann 100 Gew.- % betragen. Die trockenen Formulierungen werden etwa 1-95 Gew.-% des Pestizids enthalten, während die flüssigen Formulierungen nn allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Feststoffe in der flüssigen Phase enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis etwa 10&sup4; Zellen/mg enthalten. Diese Formulierungen werden mit etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
Die Formulierungen können in der Umwelt der Lepidoptera-Schädlinge, z.B. Pflanzen, Boden oder Wasser, durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder dgl. ausgebracht werden.
Mutanten von PS158C2 können nach auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann eine nicht-sporenbildende Mutante durch Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese von PS158C2 erhalten werden. Die Mutanten können unter Verwendung von UV-Licht und Nitrosoguanidin nach auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, soweit nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1 - Züchtung von B.t. PS158C2 NRRL B-18872

Eine Subkultur von B.t. PS158C2, NRRL B-18872, oder Mutanten davon kann dazu verwendet werden, um das folgende Medium, ein Medium mit Pepton, Glucose und Salzen anzuimpfen.
Bacto-Pepton 7,5 g/l
Glucose 1,0 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 4,35 g/l
Salzlösung 5,0 ml/l
CaCl&sub2;-Lösung 5,0 ml/l
Salzlösung (100 ml)
MgSO&sub4; . 7H&sub2;O 2,46 g
MnSO&sub4;. H&sub2;O 0,04 g
ZnSO&sub4;. 7H&sub2;O 0,28 g
FeSO&sub4;. 7H&sub2;O 0,40 g
CaCl&sub2;-Lösung (100 ml)
CaCl&sub2; . 2H&sub2;O 3,66 g
pH 7,2
Die Salzlösung und die CaCl&sub2;-Lösung werden filtersterilisiert und zur autoklavierten und gekochten Brühe zum Animpfüngszeitpunkt zugegeben. Die Kolben werden bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 Upm 64 h lang inkubiert.
Das obige Verfahren kann leicht nach auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren auf große Fermentoren maßstäblich übertragen werden.
Die B.t.-Sporen und/oder -Kristalle, die bei der obigen Fermentation erhalten werden, können nach auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Ein häufig angewandtes Verfahren besteht darin, die geemtete Fermentationsbrühe Trenntechniken, z.B. Zentrifügation, zu unterwerfen.
Die verschiedenen Methoden, die bei der Herstellung der Plasmide und der Transformation von Wirtsorganismen eingesetzt wurden, sind auf diesem Gebiet wohlbekannt. Ebenso sind Verfahren für den Einsatz des Bakteriophagen Lambda als Klonierungs- Vehikel, d.h. die Präparation von Lambda-DNA, in vitro-Verpackung und Transfektion rekombinanter DNA, auf diesem Gebiet wohlbekannt. Diese Verfahren sind alle in Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, beschrieben.

BEISPIEL 2 - Insertion von Toxingenen in Pflanzen

Die für die neuen insektiziden Toxine kodierenden neuen Gene, wie hier offenbart, können in Pflanzenzellen unter Verwendung des Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens eingeführt werden. Die Pflanzenzellen können dann dazu veranlaßt werden, zu Pflanzen zu regenerieren (Zambryski, P., Joos, H., Gentello, C., Leemans, J., Van Montague, M. und Schell, 3 [1983] Cell 32:1033-1043). Ein besonders nützlicher Vektor in dieser Beziehung ist pEND4K (Klee, 11.3., Yanofsky, M.F. und Nester, E.W. [1985] Bioltechnology 3:637-642). Dieses Plasmid kann sowohl in Pflanzenzellen als auch in Bakterien replizieren und weist mehrfache Klonierungsstellen für "Passenger"-Gene auf. Die Toxingene können beispielsweise in die BamHI-Stelle von pEND4K inseriert werden, in E. coli vermehrt und in geeignete Pflanzenzellen transformiert werden.

BEISPIEL 3 - Klonierung neuer B. thuringiensis-Gene in Baculoviren

Die neuen erfindungsgemäßen Gene können in Baculoviren wie Autographa californica Kern-Polyhedrosis-Virus (AcNPV) kloniert werden. Es können Plasmide konstruiert werden, die das AcNPV-Genom in einen im Handel erhältlichen Klonierungsvektor wie pUC8 kloniert enthalten. Das AcNPV-Genom ist so modifiziert, daß der kodierende Bereich des Polyhedrin-Gens entfernt ist und eine nur einmal vorkommende Klonierungsstelle für ein "Passenger"-Gen direkt hinter dem Polyhedrin-Promotor plaziert ist. Beispiele solcher Vektoren sind pGP-B6874, beschrieben von Pennock et al. (Pennock, G.D., Shoemaker, C. und Miller, L.K. [1984] Mol Cell. Biol. 4:399-406) und pAC380, beschrieben von Smith et al. (Smith, G.E., Summers, M.D. und Fraser, M.J. [1983] Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165). Die Gene, welche für die erfindungsgemäßen neuen Proteintoxine kodieren, können mit BamHI- "Linkem" an geeigneten Bereichen sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts des kodierenden Bereichs modifiziert werden und in die "Passenger"-Stelle eines der AcNPV-Vektoren eingebaut werden.

Claims

1. Bacillus thuringiensis PS158C2 mit den identifizierenden Lepidoptera-aktiven Merkmalen von NRRL B-18872 oder eine Mutante davon mit Aktivität gegen Insektenschädlinge der Ordnung Lepidoptera.

2. Gen, das für ein gegen Lepidoptera-Insekten aktives Toxin kodiert, erhältlich aus einem Mikroorganismus wie in Anspruch 1 definiert.

3. Toxin, das Aktivität gegen Lepidoptera-Insekten aufweist, kodiert von einem Gen wie in Anspruch 2 definiert.

4. Pflanze, Mikroorganismus oder Baculovirus, transformiert von einem Gen wie in Anspruch 2 definiert.

5. Mikroorganismus nach Anspruch 4, der eine Spezies ist von Pseudomonas, Azotobacter, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter oder Alcaligenes.

6. Mikroorganismus nach Anspruch 5, der pigmentiert ist und Phyllooberflächen-adhärent.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 4 in Form intakter Zellen, die das in Anspruch 3 definierte Toxin intrazellulär enthalten.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, der ein aus Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Rhizobiaceae, Spirillaceae, Lactobacillaceae, Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae ausgewählter Prokaryot ist, oder ein aus Phycomycetes, Ascomycetes und Basidiomycetes ausgewählter niederer Eukaryot.

9. Mikroorganismus nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, der ein pigmentiertes Bakterium, Hefe oder ein Pilz ist.

10. Mikroorganismus nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 9, der eine Spezies von Pseudomonas, z.B. Pseudomonas fluorescens, ist.

11. Zusammensetzung, umfassend einen Mikroorganismus wie in Anspruch 1 definiert, z.B. als Sporen oder Kristalle in Verbindung mit einem Insektizid-Träger, z.B. Phagostimulantien oder Lockstoffe umfassend.

12. Saatüberzugs-Zusammensetzung, umfassend einem Mikroorganismus wie in Anspruch 1 definiert.

13. Verfahren zur Kontrolle von Lepidoptera-Insekten, welches umfaßt, daß die Insekten oder deren Umwelt mit einem Mikroorganismus wie in irgendeinem der Ansprüche 1 und 4 bis 10 definiert, z.B. in Form eines Köderkörnchens, in Kontakt gebracht werden bzw. wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Köderkörnchen gleichzeitig mit dem Einpflanzen von Getreidesamen in das Erdreich ausgebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin die Insekten Spdoptera littoralis oder Plutella xylostella sind.