CN105368848A - 一种人工合成的抗虫基因及其应用 - Google Patents
一种人工合成的抗虫基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105368848A CN105368848A CN201510845445.4A CN201510845445A CN105368848A CN 105368848 A CN105368848 A CN 105368848A CN 201510845445 A CN201510845445 A CN 201510845445A CN 105368848 A CN105368848 A CN 105368848A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- cry1ah
- corn
- dna molecular
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 12
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 79
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 72
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 72
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 claims 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 abstract description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 14
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 abstract 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 27
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 9
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 8
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 7
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 7
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 7
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 3
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001582888 Lobus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001609695 Anoplophora glabripennis Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- CJOBVZJTOIVNNF-UHFFFAOYSA-N cadmium sulfide Chemical compound [Cd]=S CJOBVZJTOIVNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000028624 response to insect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种人工合成的抗虫基因及其应用。本发明所提供的抗虫基因为根据玉米密码子偏好性对Cry1Ah基因进行优化后的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。与转入优化前Cry1Ah基因的转基因玉米相比，本发明所提供的人工合成的抗虫基因的转基因玉米，其Cry1Ah蛋白的表达量明显提高；同时抗虫性也明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工合成的抗虫基因及其应用，特别涉及一种根据玉米偏好密码子设计并合成的抗虫基因及其应用。
背景技术
目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如1)AT含量较高，超过60％，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’-UTR序列和3’末端的polyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001％或者几乎检测不到。
玉米螟是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米螟危害造成玉米产量损失在5％左右。我国是玉米螟的多发和重发区，20世纪70年代以来，几乎每两年就大发生一次，年损失玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。
由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且心叶期靶标害虫和穗期靶标害虫基因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗螟杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世代玉米螟的亲本。同时，玉米抗螟基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗螟育种均未取得明显进展。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子，该DNA分子是抗虫基因。
本发明所提供的DNA分子，名称为mcry1Ah，其核苷酸序列为序列表中序列3或序列3的第1-2007位。
所述DNA分子的核苷酸序列还可为与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质(命名为Cry1Ah蛋白)。
其中，序列3由2010个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子，编码序列9所示的Cry1Ah蛋白。序列9由668个氨基酸组成。
含有所述DNA分子(mcry1Ah)的重组载体、重组宿主菌、重组细胞系或转基因植物也属于本发明的保护范围。
根据需要，所述重组载体既可为克隆载体，也可为表达载体；在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为pS3300-UMG2-UC2A。在本发明的一个实施例中，所述重组宿主菌为携带有所述DNA分子的农杆菌，如LBA4404。所述重组细胞系可以为真核细胞，也可以为原核细胞，如植物细胞系。所述转基因植物(如玉米)包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
由所述DNA分子(mcry1Ah)转录所得的RNA也属于本发明的保护范围。
所述DNA分子(mcry1Ah)在培育抗虫转基因玉米中的应用也属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
所述DNA分子(mcry1Ah)在提高玉米Cry1Ah蛋白表达量中的应用也属于本发明的保护范围。所述Cry1Ah蛋白为序列表中序列9所示的蛋白质。
在本发明的一个实施例中，所述玉米具体为玉米HiII。
在本发明中，所述抗虫具体为抗玉米螟。
本发明针对原核生物抗虫基因Cry1Ah(序列1)在植物中表达较低的问题，在保持原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性的结构(如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNA二级结构、核糖体结合位点等)，增加GC含量等，使其在玉米中高效稳定表达。
实验证实，本发明所提供的人工合成的抗虫基因(序列3)的转基因玉米，其Cry1Ah蛋白蛋白的表达量明显提高，每克(鲜重)叶片中Cry1Ah蛋白的表达量可达3.18μg，而原始基因表达量仅为1.01μg。同时，本发明所提供的人工合成的抗虫基因(序列3)的转基因玉米对靶标害虫的抗性也明显提高，转入mcry1Ah基因的T6代植株，在玉米5-6叶期接虫后，无明显的虫害，表现正常；而转cry1Ah基因(优化前，序列2)及非转基因植株，在接虫后，虫害非常严重。
附图说明
图1为载体pS3300-UMCT-UMG2、pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的质粒图谱。其中，A为pS3300-UMCT-UMG2的质粒图谱；B为pS3300-UMG2-UCA的质粒图谱；C为pS3300-UMG2-UC2A的质粒图谱。
图2为转基因玉米Cry1Ah基因、mCry1Ah基因和mG2-aroA基因的PCR检测图谱。其中，A为转基因玉米Cry1Ah基因的PCR检测图谱；1：CK+(质粒阳性对照)；2：Marker；3：CK-(未加DNA)；4：CK-(非转基因玉米)；5-24：转Cry1Ah基因玉米事件。B为转基因玉米mCry1Ah基因的PCR检测图谱；1：CK+(质粒阳性对照)；2：Marker；3：CK-(未加DNA)；4：CK-(非转基因玉米)；5-24：转mCry1Ah基因玉米事件。C为转基因玉米mG2-aroA基因的PCR检测图谱；1：CK+(质粒阳性对照)；2：Marker；3：CK-(未加DNA)；4：CK-(非转基因玉米)；5-14：转Cry1Ah基因玉米事件；15-24：转mCry1Ah基因玉米事件。
图3为转基因玉米苗期草甘膦的耐受性检测结果。
图4为转基因玉米田间抗虫性检测结果。其中，A为海南抗虫的转mCry1Ah基因玉米株系；B为海南不抗虫的非转基因对照株系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、密码子优化型抗虫基因的获得
本实施例根据Cry1Ah全长基因(核苷酸序列如序列表中序列1所示，参见中国专利申请：200410009918.9)编码蛋白的前667个氨基酸序列(前667个氨基酸序列如序列表中序列8所示，对应的核苷酸序列如序列表中序列2所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用玉米偏好密码子对Cry1Ah基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为序列表中序列3。序列3与Cry1Ah基因(序列1)的1-2001bp(即序列2)的同源性只有70％，而G+C含量由原来的37.4％增加到56.3％。同时为了便于克隆，在起始密码子后添加GGC三个核苷酸。序列3所示基因即为密码子优化型抗虫基因，将其命名为mcry1Ah。密码子在Cry1Ah基因和mcry1Ah基因中的使用频率见表1。为方便克隆，发明人在序列3的5’端引入SpeI酶切位点，在3’端引入AatII酶切位点，最终序列如序列表中序列4所示。序列4的第7-2016位即为序列3。序列1的第1-2001位(即序列2)编码序列表中序列8所示蛋白，序列3以及序列4的第7-2016位均编码序列9所示蛋白(与序列8所示蛋白相比多出序列9自N端起的第2个氨基酸残基)，将该蛋白命名为Cry1Ah蛋白。
表1玉米优选密码子标准
实施例2、mcry1Ah转基因玉米的获得
一、重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的构建
为了提高mcry1Ah基因(序列3)在受体生物中的表达水平，发明人在构建mcry1Ah基因的重组表达载体时，在mcry1Ah基因的5’端添加了Ω序列和Kozak序列，Ω/Kozak序列(简称OMK)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，5’端有一个UAUUUUUACAACAA序列以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白的序列。启动子选用组成性启动子Ubi启动子，其序列如序列表中序列6所示。再则，在编码序列3’端设计了2个连续的终止密码子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS稳定终止序列。PolyA+T-NOS序列如序列表中序列7所示。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-NOS终止序列确保了翻译的准确终止。
携带有cry1Ah和mcry1Ah基因的重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的构建具体程序如下：
a.SpeI和AatII酶切pS3300-UMCT-UMG2质粒(质粒图谱如图1中A所示)，回收大片段。
其中，PS3300-UMCT-UMG2质粒的载体全序列如序列表中序列11所示。该质粒中含有耐草甘膦基因mG2-aroA(序列10，参见中国专利申请：201210107071.2)。
b.人工合成cry1Ah基因(序列2)和mcry1Ah基因(序列3)，并在两端添加SpeI和AatII酶切位点，得到“ACTAGT+序列2+TGA+GACGTC”所示DNA片段以及序列4所示DNA片段；将这两个DNA片段用SpeI和AatII双酶切后与步骤1回收的大片段进行连接反应，获得重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A(两质粒的质粒图谱分别如图1中B和C所示)。
重组表达载体pS3300-UMG2-UCA的结构描述为：将pS3300-UMCT-UMG2质粒的酶切位点SpeI和AatII之间的小片段替换为“序列表中序列2+TGA”所示DNA片段后的重组质粒。
重组表达载体pS3300-UMG2-UC2A的结构描述为：将pS3300-UMCT-UMG2质粒的酶切位点SpeI和AatII之间的小片段替换为序列表中序列3所示DNA片段后的重组质粒。
二、重组表达载体转化玉米获得转基因玉米
1、玉米转化起始材料的获得
取玉米HiII授粉后9～13天的幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。从消毒后的幼穗中剥取幼胚，将其放入感染培养液(配方参考：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1))中清洗一到两次，备用。
2、重组表达载体转化农杆菌
将步骤一制备的重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A分别转化农杆菌LBA4404(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)。
将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2-UCA的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2-UCA。将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2-UC2A的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2-UC2A。
3、农杆菌转化玉米幼胚
将上述步骤1经感染培养液清洗过的幼胚放入OD600为0.3-0.5左右的上述步骤2制备的农杆菌的菌液中，放置5分钟，然后将幼胚置于共培养培养基(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)上，在20℃左右黑暗条件下共培养3天，以未进行农杆菌转化的幼胚作对照。
实验同时设置了向受体玉米幼胚中转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的对照。
4、转基因玉米再生苗的获得
将上述步骤3共培养后的幼胚转入选择培养基(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)，在选择培养基中加入终浓度为1mM的草甘膦作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次，直至生长出松脆，颜色鲜黄且生长旺盛的草甘膦抗性愈伤组织。
将所得草甘膦抗性愈伤组织转入诱导培养基(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)进行诱导分化，一个月后即可获得成熟的胚状体。再将胚状体放到MS培养基上生根，即得到T0代转基因玉米的再生苗。T0代转基因玉米成熟后获得T1代转基因玉米的种子，T1代转基因玉米的种子继续自交繁殖得到T2代转基因玉米的种子。依此类推，获得T6代转基因玉米的种子。将T6代转基因玉米的种子播种后获得T6代转基因玉米植株。
5、T6代转基因玉米植株的鉴定
对T6代转基因玉米植株进行PCR鉴定，具体如下：
首先，分别提取T6代转基因玉米植株的基因组DNA，具体操作如下：
1)选取转基因玉米再生植株幼嫩叶片0.1-0.2g，在液氮研磨，转移至1.5ml的Eppendorf管中；
2)加入0.7ml的CTAB溶液(配方：Tris终浓度100mM，NaCl终浓度1.4M，EDTA终浓度20mM，CTAB终浓度2％(w/v)，巯基乙醇终浓度0.1％(v/v))，60℃，45分钟，每隔10分钟，颠倒混匀一次。
3)加入0.7ml的酚∶氯仿(体积比为1:1)，颠倒几次，1000rpm离心5分钟，转移上清至新离心管。加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比为24:1)，混匀，1000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。
4)在离心管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的无菌水中，用于PCR检测。
其次，以上述提取的T6代转基因玉米植株的基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。具体操作如下：
1)对转入Cry1Ah基因(序列2)玉米植株进行目的基因(Cry1Ah)的检测，以非转基因玉米作阴性对照，以未加入模板的反应体系为空白对照，以pS3300-UMG2-UCA质粒作为阳性对照，以转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的玉米作为空载对照。PCR扩增引物如下：
1Ah_F：5’-TTAATTGATTTAATATGGGGATTTG-3’(序列2的第241-265位)；
1Ah_R：5’-ACACGCCCTGACCTAGTTGAG-3’(序列2的第1118-1138位的反向互补序列)。
扩增产物长度为898bp。
反应体系(20μL)：DNA1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。扩增反应条件为：94℃，5min预变性；35个cycles(94℃，1min；57℃，1min；72℃，1min)；72℃延伸10min。
检测结果如图2中A所示，泳道5-24所示的20株转入Cry1Ah基因的T6代转基因玉米植株均扩增得到大小为898bp的目的条带；而阴性对照组(非转基因玉米)、空白对照组和空载对照组均没有扩增出目的条带。这一结果说明Cry1Ah基因已经整合进T6代转Cry1Ah基因玉米的基因组中。
2)对转入mCry1Ah基因(序列3)玉米植株进行目的基因(mCry1Ah)的检测，以非转基因玉米作阴性对照，以未加入模板的反应体系为空白对照，以pS3300-UMG2-UC2A质粒作为阳性对照，以转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的玉米作为空载对照。PCR扩增引物如下：
1mAh_F：5’-CTCAGTCCTCAAGATTCAGACCTTCG-3’(序列3的第501-526位)；
1mAh_R：5’-AAAGTTCTCAAGCACTGGGTTGGTGT-3’(序列3的第869-894位的反向互补序列)。
扩增产物长度为394bp。
反应体系同上。扩增反应条件为：94℃，5min预变性；35个cycles(94℃，1min；57℃，1min；72℃，1min)；72℃延伸10min。
检测结果如图2中B所示，泳道5-24所示的20株转入mCry1Ah基因的T6代转基因玉米植株均扩增得到大小为394bp的目的条带；而阴性对照组(非转基因玉米)、空白对照组和空载对照组均没有扩增出目的条带。这一结果说明mCry1Ah基因已经整合进T6代转mCry1Ah基因玉米的基因组中。
3)分别对转入Cry1Ah基因(序列2)和mCry1Ah基因(序列3)的玉米植株进行抗性基因mG2-aroA(序列10)的检测，以非转基因玉米作阴性对照，以未加入模板的反应体系为空白对照，以pS3300-UMG2-UC2A质粒作为阳性对照，以转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的玉米作为空载对照。PCR扩增引物如下：
mG2_F：5’-CCACCTGGCTCCAAGTCTATCA-3’(序列10的第142-163位)；
mG2_R：5’-GCGTCAACCTGTGCTCCAAA-3’(序列10的第715-734位的反向互补序列)。
扩增产物长度为593bp。
反应体系同上。扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40min，35个循环，最后72℃延伸10min。
检测结果如图2中C所示，泳道5-14所示的10株转入Cry1Ah基因的T6代转基因玉米植株以及泳道15-24所示的10株转入mCry1Ah基因的T6代转基因玉米植株均扩增得到大小为593bp的目的条带；而阴性对照组(非转基因玉米)和空白对照组均没有扩增出目的条带(空载对照组由于携带mG2-aroA基因因而扩增出了目的条带)。这一结果说明mG2-aroA基因已经整合进T6代转Cry1Ah或mCry1Ah基因玉米的基因组中。
实施例3、转基因玉米植株Cry1Ah蛋白表达的ELISA检测
实验材料：选取12个转基因事件相同生长阶段(五叶期)的T6代转基因玉米(转Cry1Ah基因、转mCry1Ah基因，以及转pS3300-UMCT-UMG2空载体)各10株。同时以未转基因的玉米作为阴性对照。
样品处理：各取功能叶(上三叶)叶片1g(鲜重)左右混合，液氮磨碎后，转入10ml离心管中加入3ml样品提取液，剧烈震动，4℃离心1h，取上清为待测样品，备用。
上述鲜重为将叶片用液氮研磨成粉末样品后加入装有提取液的离心管所称重量减去装有提取液的离心管加入粉末样品前的重量。
样品测定方法具体如下：
1、加样：加入50μL酶标二抗到ELISA板(EnviroLogix公司产品，货号：AP003CRBS)每一孔，然后快速加入标样：将Cry1Ah蛋白标样用样品液稀释到3μg/ml，然后2倍稀释11个梯度(包括0孔)每孔加50μL，重复3次。待测样品提取液50μL，重复3次。
其中，Cry1Ah蛋白标样的制备方法如下：将序列1所示的DNA片段连接到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，得到表达Cry1Ah蛋白的原核表达载体pET-28a-Cry1Ah。将pET-28a-Cry1Ah转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导其表达Cry1Ah蛋白，收集菌体后，将菌体通过超声波破碎，将所表达蛋白释放到提取液中，后用His标签蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司产品，目录号CW0009A)纯化，Cry1Ah蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测。SDS-PAGE电泳鉴定显示纯度能够达到约95％，经eppendorf蛋白核酸测定仪biophotometerplus测定Cry1Ah蛋白的浓度达到3.0mg/ml。
2、轻微震动混匀每孔样品，要避免样品溅出。
3、室温孵育1-2小时，同时在摇床上以200rpm的速度轻摇。
4、洗板：将样品甩掉，在报纸上摔两下，然后放到洗板机洗板5遍。
5、每孔加入100μl底物缓冲液。
6、避光，孵育15到30分钟。
7、加入100μl终止液。
8、比色：在酶标板上读数，用450nm波长。
9、以不同浓度的Cry1Ah蛋白标准品溶液浓度(ng/mL)作为X轴，以步骤8测量所得的Cry1Ah蛋白标准品的OD值的作为Y轴，用EXCEL绘制标准曲线。
10、将步骤8测量所得的待测样品的OD值代入上述步骤9绘制的标准曲线方程，计算待测样品中Cry1Ah蛋白含量。
11、Cry1Ah蛋白占鲜重的含量＝待测样品中Cry1Ah蛋白含量×待测样品的体积/样品鲜重，单位：μg/g
12、实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线，其标准曲线方程为y＝9035.2x+198.75(R2＝0.9997)。
13、待测样品的检测结果如表2所示，可见，T6代转基因玉米中Cry1Ah蛋白的表达量均明显高于非转基因玉米(P<0.01)，且转mCry1Ah基因玉米中Cry1Ah蛋白的表达量显著高于转Cry1Ah基因玉米(P<0.05)。转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的T6代玉米植株中Cry1Ah蛋白的表达量和未转基因的玉米植株基本一致，无显著差异。这一结果表明，经过密码子优化后，Cry1Ah蛋白在转基因玉米中的表达量得到了明显的提高。
表2转基因植株Cry1Ah蛋白表达的ELISA检测结果
注：Cry1Ah蛋白浓度单位μg/g，表示每克叶片(鲜重)所测Ccry1Ah蛋白的微克数。
实施例4、转基因玉米植株田间除草剂耐性及抗虫性检测
一、转基因玉米植株田间除草剂耐性检测
1、试验材料：T6代转Cry1Ah和mCry1Ah基因玉米植株，以及转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的T6代玉米植株，同时设置非转基因玉米植株对照。
2、试验设计：5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm
3、试验处理：按照800ml/亩的用量喷施农达(Roundup，含41％的草甘膦，田间推荐使用剂量为150-250ml/亩)。
4、试验处理时期：5-6叶期。7天后开始观察实验结果。
5、试验结果
如图3(喷施农达15天后)所示：(1)转mcry1Ah基因植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常。(2)转cry1Ah基因植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常。(3)转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常。(4)非转基因植株均已全部死亡。
二、转基因玉米植株田间抗虫性检测
1、试验材料：T6代转Cry1Ah和mCry1Ah基因玉米植株，以及转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的T6代玉米植株，同时设置非转基因玉米植株对照。
2、试验设计：5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm
3、试验处理：将经步骤一喷施草甘膦存活后的转基因植株接虫(非转基因玉米植株未喷施草甘膦)，每株接人工饲养的初孵幼虫(玉米螟)30～40头，用毛笔接种到玉米心叶中，接虫3天后，第2次接虫，接虫数量同第1次。14天后调查玉米叶片受玉米螟的危害程度和幼虫存活数，调查按玉米抗虫性鉴定技术规范NY/T1248.5执行。
4、试验处理时期：在玉米植株发育至8-10叶期(小喇叭口期)时进行人工接虫，接虫时间选择在清晨或傍晚。
5、试验结果
如图4及表3所示：(1)转mCry1Ah基因植株，表现正常，后期的生长期内均无虫害反应；(2)转Cry1Ah基因植株、转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的植株和非转基因植株均虫害严重。这一结果表明，转入密码子优化后的mCry1Ah基因的玉米，其抗虫性得到了明显的提高。
表3转基因植株抗虫性鉴定结果
Claims (11)
1.DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列3所示的DNA分子；
2.DNA分子，为核苷酸序列如序列表中序列3的第1-2007位所示的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质。
4.根据权利要求2所述的成套DNA分子，其特征在于：所述DNA分子甲的核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质；所述DNA分子乙的核苷酸序列与序列表中序列10或序列10的第1-1335位至少具有98％的同一性，且编码序列11所示蛋白质。
5.含有权利要求1或2或3所述DNA分子的重组载体。
6.含有权利要求1或2或3所述DNA分子的重组宿主菌。
7.含有权利要求1或2或3所述DNA分子的重组细胞系。
8.含有权利要求1或2或3所述DNA分子的转基因植物。
9.由权利要求1或2或3所述DNA分子转录所得的RNA。
10.权利要求1或2或3所述的DNA分子在培育抗虫转基因玉米中的应用。
11.权利要求1或2或3所述DNA分子在提高玉米Cry1Ah蛋白表达量中的应用；所述Cry1Ah蛋白为序列表中序列9所示蛋白质。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510845445.4A CN105368848B (zh) | 2015-11-26 | 2015-11-26 | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 |
| PCT/CN2016/088525 WO2017088480A1 (zh) | 2015-11-26 | 2016-07-05 | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510845445.4A CN105368848B (zh) | 2015-11-26 | 2015-11-26 | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105368848A true CN105368848A (zh) | 2016-03-02 |
| CN105368848B CN105368848B (zh) | 2019-01-22 |
Family
ID=55371477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510845445.4A Active CN105368848B (zh) | 2015-11-26 | 2015-11-26 | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105368848B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017088480A1 (zh) * | 2015-11-26 | 2017-06-01 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1614022A (zh) * | 2004-12-01 | 2005-05-11 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鳞翅目昆虫高毒力的Bt cry1Ah基因及其表达产物 |
| CN101358190A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-02-04 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其应用 |
| CN102643848A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-08-22 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用 |
| CN102643840A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-08-22 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种含有耐草甘膦基因的重组dna片段及其应用 |
| CN104711268A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-06-17 | 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 | 一种抗虫基因Zm-Cry1A(h)及其相关生物材料与应用 |
-
2015
- 2015-11-26 CN CN201510845445.4A patent/CN105368848B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1614022A (zh) * | 2004-12-01 | 2005-05-11 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鳞翅目昆虫高毒力的Bt cry1Ah基因及其表达产物 |
| CN101358190A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-02-04 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其应用 |
| CN102643848A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-08-22 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用 |
| CN102643840A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-08-22 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种含有耐草甘膦基因的重组dna片段及其应用 |
| CN104711268A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-06-17 | 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 | 一种抗虫基因Zm-Cry1A(h)及其相关生物材料与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LI XIUYING ET AL: "Acquisition of insect-resistant transgenic maize harboring a truncated cry1Ah gene via agrobacterium-mediated transformation", 《JOURNAL OF INTEGRATIVE AGRICULTURE》 * |
| 李圣彦 等: "利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米（Zea mays L.）中的表达", 《中国农业科技导报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017088480A1 (zh) * | 2015-11-26 | 2017-06-01 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105368848B (zh) | 2019-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103403170A (zh) | 植物中的蛋白质表达 | |
| CN110819607A (zh) | CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用 | |
| CN110903361B (zh) | 一种植物抗虫基因mVip3Aa及其载体和应用 | |
| CN102191254A (zh) | 调节植物胁迫抗性的cbf转录因子及其编码基因和应用 | |
| CN107267526B (zh) | 三七MYB转录因子基因PnMYB2及其应用 | |
| CN102712929B (zh) | 植物根特异表达启动子的鉴定和应用 | |
| CN106337059A (zh) | 一种改良柑桔黄龙病抗性的方法 | |
| CN110229818B (zh) | 蜡梅CpSNAC1基因启动子及其应用 | |
| CN105838726B (zh) | 一种紫花苜蓿耐盐基因MsCDPK及其编码蛋白与应用 | |
| Wang et al. | Trehalose synthase gene transfer mediated by Agrobacterium tumefaciens enhances resistance to osmotic stress in sugarcane | |
| CN113913457A (zh) | 一种抑制或杀灭桃蛀螟的方法及其应用 | |
| CN105400814A (zh) | 一种培育抗虫转基因玉米的方法 | |
| CN109354614B (zh) | OsCSLD4蛋白在提高植物盐胁迫耐性中的应用 | |
| CN101851284B (zh) | 一种植物抗逆性相关膜蛋白BjCRP1及其基因和应用 | |
| CN107663232B (zh) | 植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用 | |
| CN104140462B (zh) | 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用 | |
| CN114134171B (zh) | 一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用 | |
| CN116083445A (zh) | 一种CrBZR1基因及其应用 | |
| CN105368848A (zh) | 一种人工合成的抗虫基因及其应用 | |
| CN101883572A (zh) | 高粱铝耐受基因SbMATE | |
| CN105400797A (zh) | 一种含有抗虫基因的重组dna片段及其应用 | |
| CN105349570A (zh) | 一种人工合成的抗虫基因表达载体及其应用 | |
| CN108004257A (zh) | 水稻硫氰酸酶编码基因OsRHOD1;1及其应用 | |
| CN104861051B (zh) | 植物发育相关蛋白AtUBP15及其编码基因和应用 | |
| CN104120134B (zh) | GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性转基因植物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |