JP2022553598A

JP2022553598A - 生物内に新規遺伝子を作出するための方法およびその使用

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Publication number: JP2022553598A
Application number: JP2022506562A
Authority: JP
Inventors: チアン、リンチエン; ワン、チヤオ; モー、ストン; チェン、ボー; リー、ホアロン
Original assignee: Qingdao Kingagroot Chemical Compound Co Ltd
Current assignee: Qingdao Kingagroot Chemical Compound Co Ltd
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2022-12-26
Also published as: PE20221178A1; IL292654A; EP4074832A1; US20220348950A1; ZA202206200B; CO2022007902A2; KR20220066979A; EP4074832A4; BR112022001455A2; WO2021088923A1; AU2020378500A1; MX2022005431A; CA3159360A1; CN112779266A; CL2022001192A1; AR120421A1

Abstract

本発明は、遺伝子工学および生物情報科学の技術分野、特に、人工ＤＮＡ鋳型の不在下で生物内に新規遺伝子を作出するための方法、およびその使用に関する。この方法は、生物のゲノム中の２つ以上の異なる特定部位に同時にＤＮＡ切断を作出することを含んでなり、これらの特定の部位は異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離し得るゲノム部位であり、ＤＮＡ切断は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復によって互いに連結されて元のゲノム配列とは異なる種々の遺伝子要素または種々のタンパク質ドメインの新規組合せを作出し、それにより新規遺伝子を作出する。本発明の新規遺伝子は、その生物の成長、発達、抵抗性、収量およびその他の形質を変化させることができ、適用に大きな価値を有する。

Description

技術分野
本発明は、遺伝子工学および生物情報科学の技術分野、特に、人工ＤＮＡ鋳型の不在下で生物内に新規遺伝子を作出するための方法、およびその使用に関する。

背景技術
概して、生物の完全な遺伝子発現カセットは、プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、コード領域（ＣＤＳ）または非コードＲＮＡ領域（非コードＲＮＡ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ターミネーターおよび他の多くの要素を含んでなる。非コードＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含むＲＮＡレベルでその生物学的機能を遂行することができる。ＣＤＳ領域はエキソンとイントロンを含む。転写されたＲＮＡがタンパク質に翻訳された後、異なるセグメントのアミノ酸は通常異なるドメインを形成する。特定のドメインはそのタンパク質の細胞内局在および機能を決定する（例えば、核局在シグナル、葉緑体リーディングペプチド、ミトコンドリアリーディングペプチド、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、酵素触媒中心など）。非コードＲＮＡについても、異なるセグメントは異なる機能を有する。遺伝子の１または複数の要素が変化すると新規機能を有し得る新規遺伝子が形成される。例えば、蟠桃のＰｐＯＦＰ１遺伝子の上流に生じる１．７Ｍｂ染色体フラグメントの逆位事象は新規プロモーターを生じることがあり、このプロモーターは、丸形の桃果実に比べて果実発達のＳ２期において扁平型の桃果実でのＰｐＯＦＰ１の発現を著しく増強し、それにより、桃果実の垂直方向の発達を阻害し、蟠桃に扁平型の表現型を生じる(Zhou et al. 2018. A 1.7-Mb chromosomal inversion downstream of a PpOFP1 gene is responsible for flat fruit shape in peach. Plant Biotechnol. J. DOI: 10.1111/pbi.13455)。

生物学的ゲノムにおける新規遺伝子の自然の生成は、長い進化プロセスを必要とする。研究によれば、新規遺伝子の生成のための分子機構は、エキソン再配列、遺伝子重複、レトロ転位、および可動要素（トランスポゾン、レトロトランスポゾン）の組込み、水平遺伝子導入、遺伝子融合分裂、ｄｅｎｏｖｏ発生、および他の多くの機構を含み、新規遺伝子は派生および機能的進化によって自然選抜の作用下で種に保有されることがある。ミバエ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、および霊長類で同定されている比較的若い新規遺伝子は、計算によれば数十万年～数百万年の歴史を有する(Long et al. 2012. The origin and evolution of new genes. Methods Mol Biol. DOI: 10.1007/978-1-61779-585-5_7)。従って、遺伝子工学および生物育種の分野では、植物を例に取れば、新規遺伝子を植物に導入することが望まれる場合（新規遺伝子の総ての遺伝要素がそれらの種自体の異なる遺伝子に由来している場合であっても）、トランスジェニック技術によって初めて達成することができる。すなわち、新規遺伝子を形成するために、異なる遺伝子に由来する要素がｉｎｖｉｔｒｏでともに構築され、これがトランスジェニック技術によって植物に移入される。これは新規遺伝子の構築をｉｎｖｉｔｒｏで行う必要があるという点で特徴的であり、結果としてトランスジェニック作物が生じる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などに代表される遺伝子編集ツールは、効率的かつ正確に生物のゲノムの特定の部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じ、その後、これらの二本鎖切断（ＤＳＢ）は細胞固有の非相同末端修復または相同組換え機構を介して修復され、それにより、部位特異的突然変異を生じる。遺伝子編集技術の現行の適用は、主として、単一遺伝子の内部要素の編集、大抵の場合には、ＣＤＳエキソン領域の編集を狙いとしている。エキソンの編集は通常、その遺伝子にフレームシフト突然変異をもたらし、遺伝子の機能消失に至る。このため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの遺伝子編集ツールは、遺伝子ノックアウト（すなわち、遺伝子破壊）ツールとしても知られる。遺伝子の発現レベルに影響を与えるために、ＣＤＳ領域の他、プロモーター、５’ＵＴＲおよびその他の領域のノックアウトも可能である。これらの方法は総て、新規遺伝子を生じることなく既存の遺伝子を変異させるので、生産において何らかの必要を満たすことは困難である。例えば、ほとんどの遺伝子では、既存の遺伝子編集技術は遺伝子発現のアップレギュレーションを達成することは難しく、タンパク質の細胞内局在を変化させること、またはタンパク質の機能的ドメインを変化させることも難しい。新規形質を形成するように遺伝子の発現パターンを変化させるために既存の遺伝子の上流にプロモーターまたはエンハンサー配列を挿入すること文献で報告されているが(Lu et al. 2020. Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice. Nat Biotechnol. DOI: 10.1038/s41587-020-0581-5)、この方法は外来ＤＮＡ鋳型の提供を必要とするので、遺伝子改変作物と同様の厳密な規制が適用となり、適用が限られる。

発明の概要
従来技術における上記の問題を解決するために、本発明は、生物のゲノム中の特定の部位の組合せにおいて２つ以上のＤＮＡ二本鎖切断を同時に作出することによって、人工ＤＮＡ鋳型の不在下で、生物内に新規遺伝子を作出するための方法およびその使用を提供する。

１つの側面において、本発明は、生物内に新規遺伝子を作出するための方法であって、以下の工程：前記生物のゲノム中の２つ以上の異なる特定の部位に同時にＤＮＡ切断を作出し、前記特定の部位は、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離し得るゲノム部位である工程、前記ＤＮＡ切断を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復によって互いに連結する工程、元のゲノム配列とは異なる種々の遺伝要素または種々のタンパク質ドメインの新規組合せを作出し、それにより、新規遺伝子を作出する工程を含んでなる方法を提供する。

１つの特定の実施形態において、「２つ以上の異なる特定の部位」は、同じ染色体または異なる染色体に位置し得る。同じ染色体に位置する場合には、２つの特定の部位に同時に生じているＤＮＡ切断から生じる染色体フラグメントは修復後に欠失、逆位または反復倍加する場合があり、異なる染色体に位置する場合には、２つの特定の部位に生じたＤＮＡ切断は、修復後に互いに連結されて染色体腕の乗換え事象を生じ得る。これらの事象は、特異的に設計されたプライマーを用いるＰＣＲシーケンシングによって同定およびスクリーニングすることができる。

特定の実施形態において、「２つ以上の異なる特定の部位」は、少なくとも２つの異なる遺伝子上の特定の部位であり得るか、または同じ遺伝子上の少なくとも２つの異なる特定の部位であり得る。

特定の実施形態において、「少なくとも２つの異なる遺伝子」の転写方向は、同じであっても異なってもよい（互いに離れるまたは近づく）。

特定の実施形態において、「ＤＮＡ切断」は、標的特性を有するヌクレアーゼを生物の細胞に、ゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させるために送達することによって起こる。このタイプのＤＮＡ切断と従来技術（例えば、放射線または化学的突然変異誘発）によって生じるＤＮＡ切断の間には本質的な違いはない。

特定の実施形態において、「標的特性を有するヌクレアーゼ」は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから選択される。

それらの中で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、異なる配列を標的とする２つ以上のリーディングＲＮＡを介してゲノム中の異なる部位に２つ以上のＤＮＡ二本鎖切断を作出することができ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮシステムは、２つ以上の特定の部位の配列にＺＦＮタンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質を別個に設計することによって、２つ以上の部位に同時にＤＮＡ二本鎖切断を作出することができる。２つの切断が同じ染色体に位置する場合には、欠失、逆位および倍加などの修復結果が生じることがあり、２つの切断が２つの異なる染色体に位置する場合には、染色体腕の乗換えを生じ得る。２つのＤＮＡ切断における欠失、逆位、倍加および染色体セグメントの交換は、異なる遺伝子要素またはタンパク質ドメインを組換え、それにより、新規機能的遺伝子を作出し得る。

特定の実施形態において、「標的特性を有するヌクレアーゼ」は、ＤＮＡの形態で存在する。

別の特定の実施形態において、「標的特性を有するヌクレアーゼ」は、ＤＮＡの形態ではなくｍＲＮＡまたはタンパク質の形態で存在する。

特定の実施形態において、標的特性を有するヌクレアーゼを細胞に送達するための方法は、１）ＰＥＧを介した細胞トランスフェクション；２）リポソームを介した細胞トランスフェクション；３）電気ショック形質転換；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子ガン衝撃；または６）アグロバクテリウムを介した形質転換からなる群から選択される。

「遺伝子要素」は、遺伝子のプロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、コード領域（ＣＤＳ）または非コードＲＮＡ領域（非コードＲＮＡ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）およびターミネーターを含んでなる。

特定の実施形態において、異なる遺伝子要素の組合せは、異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターと他方の遺伝子のＣＤＳまたは非コードＲＮＡ領域の組合せを指す。

特定の実施形態において、異なる遺伝子要素の組合せの一方はその生物の強力な内因性プロモーターを指し、他方はＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯまたはＧＨ１遺伝子のコード領域である。

別の特定の実施形態において、異なる遺伝子要素の組合せは、異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域と他方の遺伝子のＣＤＳまたは非コードＲＮＡ領域の組合せを指す。

特定の実施形態において、「異なる発現パターン」は、遺伝子発現の異なるレベルを指す。

別の特定の実施形態において、「異なる発現パターン」は、遺伝子発現の異なる組織特異性を指す。

別の特定の実施形態において、「異なる発現パターン」は、遺伝子発現の異なる発達段階特異性を指す。

別の特定の実施形態において、異なる遺伝子要素の組合せは、同じ遺伝子内の隣接する遺伝子要素の組合せである。

「タンパク質ドメイン」は、タンパク質の特定の機能的ドメインに相当するＤＮＡフラグメントを指し、限定されるものではないが、核局在シグナル、葉緑体リーディングペプチド、ミトコンドリアリーディングペプチド、リン酸化部位、メチル化部位、膜貫通ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、受容体活性化ドメイン、酵素触媒中心などが挙げられる。

特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組合せは、異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質コード遺伝子の一方の局在シグナル領域と他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域の組合せを指す。

特定の実施形態において、「異なる細胞内部位」としては、限定されるものではないが、核部位、細胞質部位、細胞膜部位、葉緑体部位、ミトコンドリア部位、または小胞体膜部位が挙げられる。

別の特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組合せは、異なる生物学的機能を有する２つのタンパク質ドメインの組合せを指す。

特定の実施形態において、「異なる生物学的機能」としては、限定されるものではないが、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドとの結合、小分子シグナルとの結合、イオン結合、または特定の酵素反応が挙げられる。

別の特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組合せは、同じ遺伝子内の隣接するタンパク質ドメインの組合せを指す。

別の特定の実施形態において、遺伝子要素とタンパク質ドメインの組合せは、同じ遺伝子内のタンパク質ドメインと隣接するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはターミネーターの組合せを指す。

特に、異なる遺伝子のプロモーターの交換は染色体フラグメントの逆位によって達成でき、同じ染色体に位置する２つの遺伝子が異なる配向を有する場合には、それら２つの遺伝子のそれぞれのプロモーターとＣＤＳの特定の部位でＤＮＡ切断が起こり得、その切断間の領域が逆位となり、それにより、これらの２つの遺伝子のプロモーターが交換され、逆位した染色体セグメントの両末端に２つの新規遺伝子が生じ得る。これら２つの遺伝子の異なる配向は、それらの５’末端が内部にある、すなわち、両遺伝子が離れる配向にあるか、またはそれらの５’末端が外部にある、すなわち、両遺伝子が互いに近づくものであり得る。遺伝子が離れる配向にあれば、それらの遺伝子のプロモーターは、図２のスキーム１に示されるように逆位となり、遺伝子が互いに近づく配向にあれば、それらの遺伝子のＣＤＳ領域は、図４のスキーム１に示されるように逆位となる。逆位領域は、間に他の遺伝子がない１０ｋｂ未満の短いものであってもよいし、または逆位領域は、３００ｋｂ～３Ｍｂに達して数百の遺伝子を含む、極めて長いものであってもよい。

染色体フラグメントを倍加することによって新規遺伝子を作出することも可能であり、同じ染色体に位置する２つの遺伝子が同じ配向にある場合には、２つの遺伝子のそれぞれのプロモーターとＣＤＳの間の特定の部位でＤＮＡ切断が作出でき、この切断間の領域は倍加によって二価となり得、新規遺伝子は、図１スキーム１および図３に示されるように、下流遺伝子のプロモーターを上流遺伝子のＣＤＳ領域に融合することによって倍加セグメントの接合部に作出される。倍加領域の長さは５００ｂｐ～５Ｍｂの範囲であり得、間に他の遺伝子を含まない極めて短いものでも、または数百の遺伝子を含むように極めて長いものでもよい。この方法は元の２つの遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の領域に点突然変異を誘発するが、このような小規模の点突然変異は一般に、遺伝子発現の特性にほとんど効果がないが、プロモーター置換によって作出された新規遺伝子は新規な発現特性を有する。あるいはまた、ＤＮＡ切断は同じ遺伝子のあるタンパク質ドメインの両側の特定の位置に作出することもでき、この切断間の領域は倍加により二価となり、それにより、特定の機能的ドメインが倍加した新規遺伝子を作出することができる。

別の側面において、本発明は、生物内に新規遺伝子を作出するための方法であって、以下の工程：生物のゲノムまたは染色体のレベルで少なくとも２つの異なる遺伝子上の特定の部位にＤＮＡ切断を作出する工程、一方の内因性遺伝子の特定の遺伝子要素と別の内因性遺伝子の遺伝子要素が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復を介してともに連結され、それにより、新規遺伝子を作出するように、ＤＮＡの移入、倍加、逆位または欠失を誘導する工程を含んでなる方法を提供する。

本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子も提供する。

元の遺伝子に比べて、新規遺伝子は異なるプロモーターを有し、従って、組織もしくは強度もしくは発達段階に関する発現特徴を有し、または新規アミノ酸配列を有し得る。

「新規アミノ酸配列」は、２つ以上の遺伝子の全部のもしく部分的なコード領域の融合、または同じ遺伝子の部分的タンパク質コード領域の倍加のいずれかであり得る。

特定の実施形態において、新規遺伝子は、生物の高発現内因性ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯまたはＧＨ１遺伝子である。

本発明はまた、前記遺伝子を含むＤＮＡも提供する。

本発明はまた、前記遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその生物学的に有効なフラグメントも提供する。

本発明はまた、前記遺伝子およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる組換え発現ベクターも提供する。

本発明はまた、前記遺伝子を含む発現カセットも提供する。

本発明はまた、前記発現カセットを含んでなる宿主細胞も提供する。好ましくは、宿主細胞は、植物細胞、動物細胞または真菌細胞である。

本発明はらに、前記宿主細胞から再生した生物も提供する。

本発明はさらに、生物における抵抗性／耐性形質または成長有利形質の付与または改善における前記遺伝子の使用も提供する。

本発明はさらに、
（ａ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターおよび他方の遺伝子のコード領域もしくは非コードＲＮＡ領域；
（ｂ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターと５’非翻訳領域の間の領域と他方の遺伝子のコード領域もしくは非コードＲＮＡ領域；
（ｃ）同じ遺伝子内の隣接する遺伝子要素；
（ｄ）異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質コード遺伝子の一方の局在シグナル領域および他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域；
（ｅ）異なる生物学的機能を有する２つのタンパク質ドメイン；
（ｆ）同じ遺伝子内の隣接するタンパク質ドメイン；または
（ｇ）タンパク質ドメインおよび同じ遺伝子内の隣接するプロモーター、５’非翻訳領域、３’非コード領域またはターミネーター
を含んでなる組成物も提供する。

特定の実施形態において、「異なる細胞内部位」としては、限定されるものではないが、核部位、細胞質部位、細胞膜部位、葉緑体部位、ミトコンドリア部位，または小胞体膜部位を指す。

特定の実施形態において、「異なる生物学的機能」は、限定されるものではないが、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドとの結合、低分子シグナルとの結合、イオン結合、または特定の酵素反応を指す。

特定の実施形態において、組成物はｉｎｖｉｖｏで融合される。

特に、本発明はまた、外因性ＤＮＡドナーフラグメントに依存せずに生物内で標的内因性遺伝子の発現レベルを増強する編集方法であって、以下の工程：標的内因性遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子のそれぞれのプロモーターとＣＤＳの間の特定の部位に同時にＤＮＡ切断を作出する工程；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結して標的内因性遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターのｉｎｖｉｖｏ融合を形成し、それにより、新規高発現内因性遺伝子を作出する工程を含んでなる方法も提供する。この方法を、内因性遺伝子をノックアップするための編集方法と呼称する。

特定の実施形態において、標的内因性遺伝子および任意選択の高発現内因性遺伝子は、同じ染色体に位置する。

別の特定の実施形態において、標的内因性遺伝子および任意選択の高発現内因性遺伝子は、異なる染色体に位置する。

別の側面において、本発明は、植物において内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、ＨＰＰＤ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターをｉｎｖｉｖｏにおいて融合させて新規高発現植物内因性ＨＰＰＤ遺伝子を形成することを含んでなる方法を提供する。すなわち、ＨＰＰＤ遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子のそれぞれのプロモーターとＣＤＳの間の特定の部位に同時にＤＮＡ切断を作出すること、細胞内修復経路を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結してＨＰＰＤ遺伝子のコード領域と任意選択の内因性の強力なプロモーターのｉｎｖｉｖｏ融合を形成し、それにより、新規高発現ＨＰＰＤ遺伝子を作出することである。イネでは、この強力なプロモーターは、好ましくはユビキチン２遺伝子のプロモーターである。

本発明はまた、上記の編集方法によって得ることができる高発現植物内因性ＨＰＰＤ遺伝子も提供する。

本発明はまた、
（１）配列番号９、配列番号１０、配列番号１８もしくは配列番号１９に示されるような核酸配列またはその部分的配列もしくはその相補配列；
（２）（１）に定義される配列のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列；あるいは
（３）ストリンジェント条件下で（１）または（２）に示されるような配列とハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子も提供する。

別の側面において、本発明は、植物において内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、ＥＰＳＰＳ遺伝子のコード領域を強力な植物内因性プロモーターとｉｎｖｉｖｏにおいて融合させて新規高発現植物内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を形成することを含んでなる方法を提供する。すなわち、ＥＰＳＰＳ遺伝子および任意選択の高発現内因性遺伝子のそれぞれのプロモーターとＣＤＳの間の特定の部位に同時にＤＮＡ切断を作出すること、細胞内修復経路を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結してＥＰＳＰＳ遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターのｉｎｖｉｖｏ融合を形成し、それにより、新規高発現ＥＰＳＰＳ遺伝子を作出することである。イネでは、この強力なプロモーターは、好ましくはＴＫＴ遺伝子のプロモーターである。

本発明はまた、上記の編集方法によって得ることができる高発現植物内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子も提供する。

本発明はまた、
（１）配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４に示されるような核酸配列またはその部分的配列もしくはその相補配列；
（２）（１）に定義される配列のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列；あるいは
（３）ストリンジェント条件下で（１）または（２）に示されるような配列とハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子も提供する。

別の側面において、本発明は、植物において内因性ＰＰＯ（ＰＰＯＸ）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、ＰＰＯ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターをｉｎｖｉｖｏにおいて融合させて新規高発現植物内因性ＰＰＯ遺伝子を形成することを含んでなる方法を提供する。すなわち、ＰＰＯ遺伝子および任意選択の高発現内因性遺伝子のそれぞれのプロモーターとＣＤＳの間の特定の部位に同時にＤＮＡ切断を作出すること、細胞内修復経路を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結してＰＰＯ遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターのｉｎｖｉｖｏ融合を形成し、それにより、新規高発現ＰＰＯ遺伝子を作出することである。イネでは、この強力なプロモーターは、好ましくはＣＰ１２遺伝子のプロモーターである。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)では、強力なプロモーターは、好ましくはユビキチン１０遺伝子のプロモーターである。

本発明はまた、上記編集方法によって得ることができる高発現植物内因性ＰＰＯ遺伝子も提供する。

本発明はまた、
（１）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、もしくは配列番号２６に示されるような核酸配列またはその部分的配列、もしくはその相補配列；
（２）（１）に定義される配列のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列；あるいは
（３）ストリンジェント条件下で（１）または（２）に示されるような配列とハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する高発現イネ内因性ＰＰＯ遺伝子も提供する。

本発明はまた、ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳまたはＰＰＯ遺伝子を含むＤＮＡも提供する。

本発明はまた、ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳもしくはＰＰＯ遺伝子によりコードされるタンパク質またはその生物学的に有効なフラグメントも提供する。

本発明はまた、ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳまたはＰＰＯ遺伝子、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる組換え発現ベクターも提供する。

本発明はさらに、ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳまたはＰＰＯ遺伝子を含んでなる発現カセットも提供する。

本発明はさらに、発現カセットを含んでなる植物宿主細胞も提供する。

本発明はさらに、植物宿主細胞から再生した植物も提供する。

本発明はまた、除草剤に対する抵抗性または耐性が増強された植物を生産するための方法であって、植物宿主細胞を植物および／またはその後代へと再生することを含んでなる方法も提供する。

特定の実施形態において、除草剤抵抗性または耐性が増強された植物は、遺伝的分離によって外因性トランスジェニック成分を除去するために、本発明の植物宿主細胞から再生された植物を野生型植物と交雑させることによって得ることができる非トランスジェニック系統である。

本発明はまた、上記の高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子、高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子、高発現イネ内因性ＰＰＯ遺伝子またはそれらの任意の組合せのいずれかを含んでなる除草剤耐性イネも提供する。

特定の実施形態において、除草剤抵抗性イネは非トランスジェニックである。

本発明はさらに、植物細胞、植物組織、植物部分または植物において阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性の向上における高発現植物内因性ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳまたはＰＰＯ遺伝子の使用も提供する。

別の側面において、本発明は、植物栽培地において雑草を防除するための方法であって、前記植物は上記の植物または上記の方法によって作出された植物を含んでなり、栽培地に１以上のＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳまたはＰＰＯ阻害性除草剤を、雑草を有効に防除するための量で施与することを含んでなる方法を提供する。

本発明者らの研究において、同時に二重標的または多重標的遺伝子編集を受けている細胞において、異なる標的のＤＮＡ二本鎖切断の末端が一定の割合で互いに自発的に連結され、同じ染色体の標的間ではフラグメントの欠失、逆位または倍加、および／または異なる染色体の標的間では染色体フラグメントの交換の事象が生じることが判明した。この現象は植物および動物で共通に存在することが文献で報告されている(Puchta et al. 2020. Changing local recombination patterns in Arabidopsis by CRISPR/Cas mediated chromosome engineering. Nat Commun. DOI: 10.1038/s41467-020- 18277-z; Li et al. 2015. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. J Mol Cell Biol. DOI: 10.1093/jmcb/mjv016)。

本発明者らは意外にも、対象とする遺伝子の特定の要素に近接する遺伝子編集標的の組合せにＤＮＡ二本鎖切断を誘導して自発的修復連結を生じさせることによって、指示された異なる遺伝子要素の組合せが、外来のＤＮＡ鋳型を提供する必要なく、ゲノムレベルで達成することができ、それから新規機能的遺伝子を作出することが可能であることを見出した。この戦略は、新規遺伝子の作出を大幅に加速化し、動物および植物育種ならびに遺伝子機能研究に大きな可能性を有する。

発明の詳細な説明
本発明において、特に断りのない限り、本明細書に使用される科学用語および技術用語は、当業者に共通に理解されている意味を有する。さらに、タンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学、免疫学関連用語および本明細書に使用される研究手順は総て、対応する分野で広く使用されている用語および常法である。例えば、本発明で使用される標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業者に周知であり、以下の文献に詳細に記載されている：Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989。本発明のより良い理解のために、関連用語の定義および説明を以下に示す。

用語「ゲノム」は、本明細書において使用する場合、生物の各細胞もしくはウイルスもしくはオルガネラに存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）の総ての相補物、ならびに／または一単位（ハプロイド）として親から受け継いだ完全なゲノムを指す。

用語「遺伝子編集」は、生きている生物の遺伝情報またはゲノムの標的化された特定の改変を行うための戦略および技術を指す。従って、遺伝子コード領域の編集を含むだけでなく、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も含む。この用語はまた、核（存在する場合）および細胞のその他の遺伝情報の編集または改変も含む。

用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」は、限定されるものではないが、１）ＳｐＣａｓ９、ＳｃＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ｘＣａｓ９、ＶＲＥＲ－Ｃａｓ９、ＥＱＲ－Ｃａｓ９、ＳｐＧ－Ｃａｓ９、ＳｐＲＹ－Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＮＧ－Ｃａｓ９、ＮＧＡ－Ｃａｓ９（ＶＱＲ）などを含むＣａｓ９；２）ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、ＭＡＤ７などを含むＣａｓ１２、または上記ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼの任意の変異体もしくは誘導体を含むＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列であり得、好ましくは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼは、対応する野生型配列に比べて、得られたＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼが異なるＰＡＭ配列を認識するような突然変異を含んでなる。本明細書において使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼ」は、天然のＣＲＩＳＰＲシステムで確認され、その後、その天然バックグラウンドから単離され、好ましくは改変または組み合わせて、標的ゲノム工学のツールとして好適な、対象とする組換え構築物とされた任意のヌクレアーゼである。元の野生型ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼがＤＮＡ認識、すなわち、結合特性を提供する限り、いずれのＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼも使用可能であり、場合により、本発明の種々の実施形態に好適となるようにリプログラムまたはそうでなければ突然変異されていてもよい。

用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、遺伝子発現を転写レベルで調節するＲＮＡ干渉とは異なる、クラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)に頼る配列特異的遺伝子操作技術を指す。

「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」および「Ｃａｓ９」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓ９タンパク質またはそのフラグメント（例えば、活性なＣａｓ９のＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含んでなるＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復および関連システム）ゲノム編集システムの一成分である。ガイドＲＮＡの誘導下でＤＮＡ標的配列を標的として切断してＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することができる。

「Ｃａｓタンパク質」または「Ｃａｓポリペプチド」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によりコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。Ｃａｓタンパク質は、細菌または古細菌タンパク質であり得る。例えば、本明細書のＩ～ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓタンパク質は、一般に原核生物に起源し、Ｉ型およびＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌または古細菌種に由来し、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓ９）は細菌種に由来し得る。「Ｃａｓタンパク質」には、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはそれらの組合せもしくは複合体が含まれる。

「Ｃａｓ９変異体」または「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体」は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの変異体を指し、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃＲＮＡに、またはｓｇＲＮＡに会合した場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、ＤＮＡ標的配列の全部または一部を認識してそれに結合し、場合により、ＤＮＡ標的配列の全部または一部を解き、ＤＮＡ標的配列の全部もしくは一部にニックを入れるか、またはＤＮＡ標的配列の全部もしくは一部を切断する能力を保持する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体には、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体が含まれ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、以下のように親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとは異なる：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（標的部位を改変し得るポリヌクレオチド特異的エンドヌクレアーゼ複合体を形成するためのｇＲＮＡとの複合体とした場合）は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（同じ標的部位を改変し得るポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成するために同じｇＲＮＡとの複合体とした場合）に比べて、限定されるものではないが、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、標的外切断の低減、またはそれらの任意の組合せなどの少なくとも１つの改良された特性を有する。

本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体には、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡに、またはｓｇＲＮＡに会合した場合の二本鎖ＤＮＡ標的部位に結合してニックを入れることができる変異体が含まれるが、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡに、またはｓｇＲＮＡに会合した場合に標的部位に結合して二本鎖破断（切断）を生じ得る。

「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書においては互換的に使用され、通常、複合体を形成するように部分的に相補的なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子からなり、ｃｒＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）に標的配列と特異的に結合するよう指示するために標的配列と十分な相補性を有する配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いた補正のために特定の遺伝子を標的とするために使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。しかしながら、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の特性を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計し得ることも当技術分野で公知である。

用語「シングルガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書においては互換的に使用され、可変の標的化ドメイン（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたトレーサー対合配列に連結）のｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）の融合を含んでなる、２つのＲＮＡ分子の合成融合を指す。ｓｇＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡフラグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡフラグメントを含んでなってよく、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合によりＤＮＡ標的部位に結合し、または場合によりＤＮＡ標的部位にニック入れるかもしくはＤＮＡ標的部位を切断する（一本鎖または二本鎖破断を導入する）ことができるように、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができる。

特定の実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体として細胞に送達することができる。ＲＮＰは、ｇＲＮＡとの複合体とされた精製Ｃａｓ９タンパク質から構成され、ＲＮＰが、限定されるものではないが、幹細胞および免疫細胞を含む多くのタイプの細胞に効率的に送達可能であることは当技術分野で周知である(Addgene, Cambridge, MA, Mirus Bio LLC, Madison, WI)。

本明細書において、プロトスペーサー隣接モチーフ(protospacer adjacent motif)（ＰＡＭ）は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって認識される（標的とされた）標的配列（プレスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。この標的ＤＮＡ配列が適当なＰＡＭ配列に隣接しなければ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは標的ＤＮＡ配列を上手く認識することはできない可能性がある。本明細書におけるＰＡＭの配列および長さは、使用するＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体によって異なり得る。ＰＡＭ配列はいずれの長さであってもよいが、一般には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。

本明細書において使用する場合、用語「生物」は、動物、植物、真菌、細菌などを含む。

本明細書において使用する場合、用語「宿主細胞」は、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞などを含む。

本発明において、「植物」は、光合成を行うことができるいずれの分化した多細胞生物も意味すると理解されるべきであり、特に、単子葉植物または双子葉植物、例えば、以下のものである：（１）食用作物：イネ属種(Oryza spp.)、例えば、イネ(Oryza sativa）、野生イネ(Oryza latifolia)、イネ(Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima)；コムギ属種(Triticum spp.)、例えば、コムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(T. Turgidumssp. Durum)；オオムギ属種(Hordeum spp.)、例えば、オオムギ(Hordeum vulgare)、ホルデウム・アリゾニカム(Hordeum arizonicum)；ライムギ (Secale cereale)；カラスムギ属種(Avena spp.)、例えば、エンバク(Avena sativa)、カラスムギ(Avena fatua)、アベナ・ビザンチン(Avena byzantine)、アベナ・ファツアｖａｒ．サティバ(Avena fatua var.sativa)、アベナ・ハイブリダ(Avena hybrida)；ヒエ属種(Echinochloa spp.)、例えば、トウジンビエ(Pennisetum glaucum)、ソルガム、ソルガム(Sorghum bicolor)、ソルガム・バルガレ(Sorghum vulgare)、ライコムギ、ゼア・メイ (Zea mays)またはトウモロコシ、キビ、イネ、アワ(Foxtail millet)、キビ、ソルガム(Sorghum bicolor)、キビ属(Panicum)、ソバ属種(Fagopyrum spp.)、キビ(Panicum miliaceum)、アワ(Setaria italica)、ワイルドライス(Zizania palustris)、テフ(Eragrostis tef)、キビ(Panicum miliaceum)、シコクビエ(Eleusine coracana); （２）マメ科作目：ダイズ属種(Glycine spp.)、例えば、ダイズ(Glycine max)、ソーヤ・ヒスピダ(Soja hispida)、ソーヤ・マックス(Soja max)、ソラマメ属種(Vicia spp.)、ササゲ属種(Vigna spp.)、エンドウ属種(Pisum spp.)、ソラマメ、ルピナス属種(Lupinus spp.)、ソラマメ属、タマリンド(Tamarindus indica)、レンズマメ(Lens culinaris)、レンリソウ属種(Lathyrus spp.)、フジマメ、ソラマメ、リョクトウ、アズキ、ヒヨコマメ；（３）油料作物：ラッカセイ(Arachis hypogaea)、ラッカセイ属種(Arachis spp)、偽ゴマ属種(Sesamum spp.)、ヒマワリ属種(Helianthus spp.)、例えば、ヒマワリ(Helianthus annuus)、アブラヤシ属(Elaeis)、例えば、アブラヤシ(Eiaeis guineensis)、アメリカアブラヤシ(Elaeis oleifera)、ダイズ、セイヨウアブラナ(Brassicanapus)、ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)、ゴマ(Sesamum orientale)、カラシナ(Brassica juncea)、ナタネ、アブラツバキ(Camellia oleifera)、アブラヤシ、オリーブ、ひまし油植物、セイヨウアブラナ(Brassica napus L.)、カノーラ；（４）繊維作物：サイザルアサ(Agave sisalana)、ワタ属種(Gossypium spp.)、例えば、ワタ属(Gossypium)、ゴシピウム・バルバデンセ(Gossypium barbadense)、ゴシピウム・ヒルスツムGossypium hirsutum）、ケナフ(Hibiscus cannabinus)、サイザルアサ(Agave sisalana)、マニラアサ(Musa textilis Nee)、アマ(Linum usitatissimum)、コウマ(Corchorus capsularis L)、カラムシ(Boehmeria nivea) (L.)、アサ(Cannabis sativa)、アサ(Cannabis sativa)；（５）果実作物：ナツメ属種(Ziziphus spp.)、キュウリ属種(Cucumis spp.)、パッションフルーツ(Passiflora edulis)、ブドウ属種(Vitis spp.)、スノキ属種(Vaccinium spp.)、セイヨウナシ(Pyrus communis)、サクラ属種(Prunus spp.)、バンジロウ属種(Psidium spp.)、ザクロ(Punica granatum)、リンゴ属種(Malus spp.)、スイカ(Citrullus lanatus)、ミカン属種(Citrus spp.)、イチジク(Ficus carica)、キンカン属種(Fortunella spp.)、オランダイチゴ属種(Fragaria spp.)、サンザシ属種(Crataegus spp.)、カキノキ属種(Diospyros spp.)、ピタンガ(Eugenia unifora)、ビワ(Eriobotrya japonica)、リュウガン(Dimocarpus longan)、パパイヤ(Carica papaya)、ヤシ属種(Cocos spp.)、スターフルーツ(Averrhoa carambola)、マタタビ属種(Actinidia spp.)、アーモンド(Prunus amygdalus)、バショウ属種(Musa spp.) （マレーヤマバショウ(musa acuminate)）、ワニナシ属種(Persea spp.)（アボカド(Persea Americana)）、グァバ(Psidium guajava)、マメーリンゴ(Mammea Americana)、マンゴー(Mangifera indica)、カンラン(Canarium album)（オリーブ(Oleaeuropaea)）、パパイヤ)(Caricapapaya)、ココヤシ(Cocos nucifera)、アセロラ(Malpighia emarginata)、サポジラ(Manilkara zapota)、パイナップル(Ananas comosus)、アナナス属種(Annona spp.)、ポンカン(Citrus reticulate)（ミカン属種）、パンノキ属種(Artocarpus spp.)、レイシ(Litchi chinensis)、スグリ属種(Ribes spp.)、キイチゴ属種(Rubus spp.)、セイヨウナシ、モモ、アンズ、ウメ、ヤマモモ、レモン、キンカン、ドリアン、オレンジ、イチゴ、ブルーベリー、ハミウリ、マスクメロン、ナツメヤシ、クルミ、サクラ；（６）根茎作物：キャッサバ属種(Manihot spp.)、サツマイモ(Ipomoea batatas)、サトイモ(Colocasia esculenta)、塊茎カラシ、アリウム・セパ(Allium cepa) （タマネギ）、エレオカリス・ツベロサ(eleocharis tuberose)(シログワイ)、ハマスゲ(Cyperus rotundus)、サンヤク(Rhizoma dioscoreae)；（７）野菜作物：ホウレンソウ属種(Spinacia spp.)、インゲンマメ属(Phaseolus spp.)、レタス(Lactuca sativa)、ツルレイシ属種(Momordica spp)、パセリ(Petroselinum crispum)、トウガラシ属種(Capsicum spp.)、ナス属種(Solanum spp.)（例えば、バレイショ(Solanum tuberosum)、ヒラナス(Solanum integrifolium)、トマト(Solanum lycopersicum)）、トマト属種(Lycopersicon spp.)（例えば、トマト(Lycopersicon esculentum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、リコペルシコン・ピリフォルム(Lycopersicon pyriforme)）、マクロチロマ属種(Macrotyloma spp.)、ケール、トカドヘチマ(Luffa acutangular)、レンティル、オクラ、タマネギ、バレイショ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ(Brussels sprouts)、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、カラードグリーン、カボチャ、トウガン(Benincasa hispida)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、セロリ(Apium graveolens)、ヒユ属種(Amaranthus spp.)、ネギ属種(Allium spp.)、トロロアオイ属種(Abelmoschus spp.)、エンダイブ(Cichorium endivia)、カボチャ属種(Cucurbita spp.)、コリアンダー(Coriandrum sativum)、アピシニアガラシ(B.carinata)、ダイコン(Rapbanus sativus)、アブラナ属種(Brassica spp.)（例えば、ナタネ(Brassica napus)、カブ種(Brassica rapa ssp.)、キャノーラ、ナタネ、アブラナ、アブラナ、カラシナ、キャベツ、クロガラシ、キャノーラ（ナタネ）、メキャベツ、ナス科(Solanaceae)(ナス)、アマトウガラシ(Capsicum annuum)(ピーマン)、キュウリ、ヘチマ、ハクサイ、アブラナ、キャベツ、ヒョウタン、ニラ、ハス、レンコン、レタス；（８）花卉作物：ノウゼンハレン(Tropaeolum minus)、キンレンカ(Tropaeolum majus)、ダンドク(Canna indica)、ウチワサボテン属種(Opuntia spp.)、マンジュギク属種(Tagetes spp.)、シンビジウム属(Cymbidium)（ラン）、ハマユウ(Crinum asiaticum L.)、クンシラン、アマリリス(Hippeastrum rutilum)、ハマナス(Rosa rugosa)、コウシンバラ(Rosa Chinensis)、マツリカ(Jasminum sambac)、チューリップ(Tulipa gesneriana L.)、サクラ属種(Cerasus sp.)、ファルビチス・ニル(Pharbitis nil)(L.)アサガオ、キンセンカ(Calendula officinalis L.)、ハス属種(Nelumbo sp.)、ヒナギク(Bellis perennis L.)、カーネーション(Dianthus caryophyllus)、ペチュニア(Petunia hybrida)、チューリップ(Tulipa gesneriana L.)、リリウム・ブラウニー(Lilium brownie)、ウメ(Prunus mume)、スイセン(Narcissus tazetta L.)、オウバイ(Jasminum nudiflorum Lindl.)、オトメザクラア(Primula malacoides)、ジンチョウゲ(Daphne odora)、ツバキ(Camellia japonica)、ギンコウボク(Michelia alba)、モクレン(Magnolia liliiflora)、ムーシュウチュウ(Viburnum macrocephalum)、クンシラン(Clivia miniate)、ホンカイドウ(Malus spectabilis)、ボタン(Paeonia suffruticosa)、シャクヤク(Paeonia lactiflora)、チョウジ(Syzygium aromaticum)、アザレア(Rhododendron simsii)、シャクナゲ(Rhododendron hybridum)、カラタネオガタマ(Michelia figo (Lour.) Spreng.)、ハナズオウ(Cercis chinensis)、ヤマブキ(Kerria japonica)、タニウツギ(Weigela florida)、レンギョウ(Fructus forsythyae)、オウバイモドキ(Jasminum mesnyi)、ブルークローバー(Parochetus communis)、シクラメン(Cyclamen persicum Mill.)、コチョウラン交配種(Phalaenophsis hybrid)、デンドロビウム・ノビル(Dendrobium nobile)、ヒヤシンス(Hyacinthus orientalis)、イチハツ(Iris tectorum Maxim)、オランダカイウ(Zantedeschia aethiopica)、キンセンカ(Calendula officinalis)、ヒイロサンジコ(Hippeastrum rutilum)、ベゴニア・センパフローレンス(Begonia semperflorenshybr)、フクシア(Fuchsia hybrida)、シラホシベゴニア(Begonia maculataRaddi)、（ゼラニウム）、ポトス(Epipremnum aureum)；（９）薬用作物：ベニバナ(Carthamus tinctorius)、ハッカ属種(Mentha spp.)、ルバーブ(Rheum rhabarbarum)、サフラン(Crocus sativus)、クコ(Lycium chinense)、ポリゴナツム・オドラツム(Polygonatum odoratum)、ポリゴナツム・キンギアヌム(Polygonatum Kingianum)、ハナスゲ(Anemarrhena asphodeloides Bunge)、バクモンドウ(Radix ophiopogonis)、バイオ(Fritillaria cirrhosa)、キョウオウ(Curcuma aromatica)、ヨウシュンシャ(Amomum villosum Lour.)、ツルドクダミ(Polygonum multiflorum)、シンシュウダイオウ(Rheum officinale)、カンゾウ(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、キバナオウギ(Astragalus membranaceus)、チョウセンニンジン(Panax ginseng)、サンシチニンジン(Panax notoginseng)、ゴカヒ(Acanthopanax gracilistylus)、トウキ(Angelica sinensis)、センキュウ(Ligusticum wallichii)、ミシマサイコ(Bupleurum sinenses DC.)、シロバナチョウセンアサガオ(Datura stramonium Linn.)、チョウセンアサガオ(Datura metel L.)、タイワンハッカ(Mentha haplocalyx)、メハジキ(Leonurus sibiricus L.)、カワミドリ(Agastache rugosus)、コガネバナ(Scutellaria baicalensis)、ウツボグサ(Prunella vulgaris L.)、ピレトルム・カルネウム(Pyrethrum carneum)、イチョウ(Ginkgo biloba L.)、ボリビアキナノキ(Cinchona ledgeriana)、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)（野生種）、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa Linn)、コショウ(Piper Nigrum L.)、バンランコン(Radix Isatidis)、オオバナオケラ(Atractylodes macrocephala Koidz)；（１０）原料作物：パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)、トウゴマ(Ricinus communis)、オオアブラギリ(Vernicia fordii)、クワ(Morus alba L.)、ホップ(Humulus lupulus)、カバノキ属(Betula)、アルヌス・クレマストギン・ブルク(Alnus cremastogyne Burk.)、ウルシ(Rhus verniciflua stokes)；（１１）牧草作物：カモジグサ属種(Agropyron spp.)、シャジクソウ属種(Trifolium spp.)、ススキ(Miscanthus sinensis)、チカラシバ属種(Pennisetum sp.)、クサヨシ(Phalaris arundinacea)、パニクム・ウィルガツム(Panicum virgatum)、プレーリーグラス、インディアングラス、ビッグブルーステムグラス、オオアワガエリ(Phleum pratense)、シバ、カヤツリグサ科(cyperaceae)(コブレシア・ピグマエア(Kobresia pygmaea)、タカヒカゲスゲ(Carex pediformis)、ホソバヒカゲスゲ(Carex humilis))、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa Linn)、オオアワガエリ(Phleum pratense L.)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、シナガワハギ(Melilotus suavcolen)、ゲンゲ(Astragalus sinicus)、サンヘンプ(Crotalaria juncea)、ツノクサネム(Sesbania cannabina)、アカウキクサ(Azolla imbircata)、ホテイアオイ(Eichhornia crassipes)、クロバナエンジュ(Amorpha fruticose)、ルピナス(Lupinus micranthus)、シャジクソウ属(Trifolium)、ムラサキモメンヅル(Astragalus adsugens pall)、ボタンウキクサ(Pistia stratiotes linn)、
ナガエツルノゲイトウ(Alternanthera philoxeroides)、ドクムギ属(Lolium)；（１２) 糖料作物：サトウキビ属種(Saccharum spp.)、テンサイ(Beta vulgaris)；（１３）飲料作物：チャノキ(Camellia sinensis)、チャノキ(Camellia Sinensis)、チャ、コーヒー（コーヒーノキ属種(coffea spp.))、カカオ(Theobroma cacao)、ホップ(Humulus lupulus Linn.)；（１４）芝生植物：ビーチグラス(Ammophila arenaria)、イチゴツナギ属種(Poa spp.)(ナガハグサ(Poa pratensis)(ブルーグラス))、ヌカボ属種(Agrostis spp.)(ヌカボ(Agrostis matsumurae)、コヌカグサ(Agrostis palustris))、ドクムギ属種(Lolium spp.) (ネズミムギ)、ウシノケグサ属種(Festuca spp.) （ウシノケグサ(Festuca ovina L.)）、シバ属種(Zoysia spp.)（ノシバ(Zoysiajaponica)）、ギョウギシバ属種(Cynodon spp.) (ギョウギシバ(Cynodon dactylon)／バミューダグラス)、セントオーガスチングラス (Stenotaphrum secundatum)、スズメノヒエ属(Paspalum spp.)、ムカデシバ(Eremochloa ophiuroides) (センチピードグラス)、アキソノプス属種(Axonopus spp.)（カーペットグラス）、ボウテロウア・ダクチロイデス(Bouteloua dactyloides) （バッファローグラス）、ボウテロウア属品種(Bouteloua var. spp.)（ブルーグラマ(Bouteloua gracilis)）、メヒシバ(Digitaria sanguinalis)、ハマスゲ(Cyperus rotundus)、ヒメクグ(Kyllingabrevifolia)、チャガヤツリ(Cyperusamuricus)、ヒメムカシヨモギ(Erigeron canadensis)、チドメグサ(Hydrocotylesibthorpioides)、ヤハズソウ(Kummerowiastriata)、ニシキソウ(Euphorbia humifusa)、ビオラ・アルベンシス(Viola arvensis)、ノヤマスゲ(Carex rigescens)、カレックス・ヘテロスタキヤ(Carex hetelostachya)、シバ；（１５）樹木作物：マツ属種(Pinus spp.)、ヤナギ属種(Salix spp.)、カエデ属種(Acer spp.)、フヨウ属種(Hibiscus spp.)、ユーカリ属種(Eucalyptus spp.)、イチョウ(Ginkgo biloba)、ホウライチク属種(Bambusa sp.)、ハコヤナギ属種(Populus spp.)、プロソピス属種(Prosopis spp.)、コナラ属種(Quercus spp.)、ナツメヤシ属種(Phoenix spp.)、ブナ種(Fagus spp.)、パンヤノキ(Ceiba pentandra)、ニッケイ属種(Cinnamomum spp.)、シナソ属種(Corchorus spp.)、ヨシ(Phragmites australis)、ホオズキ属種(Physalis spp.)、ヌスビトハギ属種(Desmodium spp.)、ハコヤナギ、セイヨウキヅタ(Hedera helix)、モウハクヨウ(Populus tomentosa Carr)、サンゴジュ(Viburnum odoratissinum)、イチョウ(Ginkgo biloba L.)、コナラ属(Quercus)、ニワウルシ(Ailanthus altissima)、ツバキ(Schima superba)、ナナメノキ(Ilex purpurea)、モミジバスズカケノキ(Platanus acerifolia)、トウネズミモチ(ligustrum lucidum)、ブクスス・メジストフィラ・レブル(Buxus megistophylla Levl.)、ダフリアカラマツ(Dahurian larch)、ブラックワトル(Acacia mearnsii)、バビショウ(Pinus massoniana)、カシアマツ(Pinus khasys)、ショウコウ(Pinus yunnanensis)、ウンナンマツ(Pinus finlaysoniana)、アブラマツ(Pinus tabuliformis)、チョウセンゴョウマツ(Pinus koraiensis)、クロクルミ(Juglans nigra)、レモン(Citrus limon)、モミジバスズカケノキ(Platanus acerifolia)、フトモモ(Syzygium jambos)、ハンカチノキ(Davidia involucrate)、キワタ(Bombax malabarica L.)、パンヤノキ(Ceiba pentandra (L.))、バウヒニア・ブラケアナ(Bauhinia blakeana)、アメリカネムノキ(Albizia saman)、ネムノキ(Albizzia julibrissin)、サンゴシトウ(Erythrina corallodendron)、デイコ(Erythrina indica)、タイサンボク(Magnolia grandiflora)、ソテツ(Cycas revolute)、サルスベリ(Lagerstroemia indica)、針葉樹、高木、低木；（１６）堅果作物：ブラジルナッツノキ(Bertholletia excelsea)、クリ属種(Castanea spp.)、ハシバミ属種(Corylus spp.)、ペカン属種(Carya spp.)、クルミ属種(Juglans spp.)、ピスタチオ(Pistacia vera)、カシュー(Anacardium occidentale)、マカダミア(Macadamia integrifolia)、ペカン(Carya illinoensis Koch)、マカダミア、ピスタチオ、アーモンド、堅果を産生するその他の植物；（１７）その他：シロイヌナズナ(arabidopsis thaliana)、ヒメスズメノヒエ(Brachiaria eruciformis)、シンクリノイガ(Cenchrus echinatus)、エノコログサ(Setaria faberi)、オヒシバ(eleusine indica)、カダバ・ファリノーサ(Cadaba farinose)、藻類、カレックス・エラータ(Carex elata)、観賞植物、オオバナカリッサ(Carissa macrocarpa)、チョウセンアザミ属種(Cynara spp.)、ニンジン(Daucus carota)、ヤマノイモ属種(Dioscorea spp.)、エリアンサス属種(Erianthus sp.)、オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)、ワスレグサ(Hemerocallis fulva)、ミヤコグサ属種(Lotus spp.)、オオスズメノヤリ(Luzula sylvatica)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、シナガワハギ属種(Melilotus spp.)、クロミグワ(Morus nigra)、タバコ属種(Nicotiana spp.)、オリーブ属種(Olea spp.)、オルニソプス属種(Ornithopus spp.)、アメリカボウフウ(Pastinaca sativa)、ニワトコ属種(Sambucus spp.)、シロガラシ属種(Sinapis sp.)、シジギウム属種(Syzygium spp.)、ガマグラス(Tripsacum dactyloides)、リンパウイ(Triticosecale rimpaui)、ニオイスミレ(Viola odorata)など。

特定の実施形態において、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、ナタネ、ムラサキウマゴヤシ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、バレイショ、サツマイモ、ハクサイ、キャベツ、キュウリ、ブッソウゲ、ポトス(Scindapsus aureus)、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、ミカン、モモ、セイヨウナシ、バナナなどから選択される。

本明細書において使用する場合、用語「植物」は、植物全体および植物のいずれの後代、細胞、組織または部分も含む。用語「植物部分」は、例えば、限定するものではないが、種子（成熟種子、種皮を含まない未熟胚、および未熟種子を含む）；挿し穂；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、蕾、葉、根、茎、および関連の外植体）を含む植物のいずれの部分も含む。植物組織または植物器官は、種子、カルス組織、または構造もしくは機能的単位に組織化された他のいずれかの植物細胞集団であり得る。植物細胞または組織培養物によっては、その細胞または組織が由来する植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、その植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができる。これに対して、植物を再生できない植物細胞もある。植物細胞または組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、絹糸、花、仁、穂、穂軸、鞘、または茎であり得る。

植物部分は、収穫可能な部分および後代植物を繁殖させるために使用できる部分を含んでなる。繁殖に使用可能な植物部分としては、例えば、限定するものではないが、種子；果実；接ぎ穂；実生；塊茎；および根茎が挙げられる。収穫可能な植物部分は、例えば、限定するものではないが：花；花粉；実生；塊茎；葉；茎；果実；種子；および根を含む有用な植物部分のいずれであってもよい。

植物細胞は、植物の構造的および生理学的単位である。本明細書において使用する場合、植物細胞にはプロトプラストおよび部分的に細胞壁を有するプロトプラストが含まれる。植物細胞は、単離された単細胞または細胞凝集塊（例えば、ルーズカルスおよび培養細胞）の形態であってもよく、より高次の組織単位（例えば、植物組織、植物器官、および完全植物）の一部であってもよい。従って、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子生産細胞、または完全な植物を再生することができる細胞もしくは細胞集合物であり得る。従って、本明細書における実施形態において、複数の植物細胞を含有し、完全な植物に再生可能な種子は「植物部分」と見なされる。

本明細書において使用する場合、用語「プロトプラスト」は、細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、脂質二重膜が露出している植物細胞を指す。一般に、プロトプラストは、細胞培養物または完全な植物を再生する能力を有する、細胞壁のない単離された植物細胞である。

植物「後代」には、植物のいずれの後続世代も含む。

用語「阻害性除草剤耐性」および「阻害性除草剤抵抗性」は、互換的に使用可能であり、両方とも阻害性除草剤に対する耐性および抵抗性を指す。「阻害性除草剤に対する耐性の改善」および「阻害性除草剤に対する抵抗性の改善」は、阻害性除草剤に対する耐性または抵抗性が、野生型遺伝子を含む植物に比べて改善されていることを意味する。

用語「野生型」は、自然界で見出すことができる核酸分子またはタンパク質を指す。

本発明において、用語「栽培地」は、本発明の植物が栽培される土壌などの場所を含んでなり、また、例えば、植物種子、植物実生および生育植物も含んでなる。用語「雑草を防除する有効量」は、標的雑草の生長または発達に影響を及ぼすため、例えば、標的雑草の生長もしくは発達を妨げるもしくは阻害するため、または雑草を枯死させるために十分な除草剤の量を指す。有利には、雑草を防除する有効量は、本発明の植物種子、植物実生または植物の生長および／または発達に有意な影響を及ぼさない。当業者は、慣例の実験からこのような雑草を防除する有効量を決定することができる。

用語「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む機能的分子（例えば、限定するものではないが、特定のタンパク質）を発現する核酸フラグメントを含んでなる。

特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列とは、ＲＮＡへ転写され得るＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質へ翻訳され得るＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードすることができ、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質へ翻訳できないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、もしくはＤＮＡ標的化ＲＮＡ；これらは「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」としても知られる）をコードすることもできる。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本発明においては互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応するおよび天然のアミノ酸の人為的化学類似体である、アミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」はまた、限定するものではないが、グリコシル化、脂質連結、硫酸化、グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰ－リボシル化を含む、それらの修飾形態も含み得る。

用語「生物学的に有効なフラグメント」は、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から１以上のアミノ酸残基が欠損しているがその機能活性を保持しているフラグメントを指す。

用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッドを含んでなり、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。

用語「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」は両方とも、ＤＮＡまたはＲＮＡにおける塩基の配列を指す。

当業者ならば本発明の配列番号９～配列番号１７に示されるようなＤＮＡフラグメントを変異させるために、指向性進化法および点突然変異法などの既知の方法を容易に使用することができる。本発明の前記配列のいずれか１つと少なくとも７５％の同一性を有し、かつ、同じ機能を示す人為的に修飾されたヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列の誘導体で、本発明の配列の等価物と見なされる。

用語「同一性」は、天然核酸配列との配列類似性を指す。配列同一性は、視認またはコンピューターソフトウエアによって評価することができる。コンピューター配列アラインメントソフトウエアを用いると、２つ以上の配列間の同一性をパーセンテージ（％）として表すことができ、これを関連配列間の同一性を評価するために使用することができる。「部分的配列」は、所与の配列の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を意味する。

ストリンジェント条件は次の通りであり得る：７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、および１ｍＭＥＤＴＡの混合溶液中、５０℃でのハイブリダイズ、ならびに２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄；あるいはまた、７％ＳＤＳ、０．５ＭＮａＰＯ_４および１ｍＭＥＤＴＡの混合溶液中、５０℃でのハイブリダイズ、ならびに１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄；あるいはまた、７％ＳＤＳ、０．５ＭＮａＰＯ_４および１ｍＭＥＤＴＡの混合溶液中、５０℃でのハイブリダイズ、ならびに０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄；あるいはまた、７％ＳＤＳ、０．５ＭＮａＰＯ_４および１ｍＭＥＤＴＡの混合溶液中、５０℃でのハイブリダイズ、ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄；あるいはまた、７％ＳＤＳ、０．５ＭＮａＰＯ_４および１ｍＭＥＤＴＡの混合溶液中、５０℃でのハイブリダイズ、ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄；あるいはまた、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中、６５℃でのハイブリダイズ、次いで、各１回の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの膜洗浄；あるいはまた、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの溶液中、６８℃での各５分のハイブリダイズおよび２回の膜洗浄、次いで、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの溶液中、６８℃でのハイブリダイズおよび各１５分２回の膜洗浄；あるいはまた、０．１×ＳＳＰＥ（もしくは０．１×ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳの溶液中、６５℃でのハイブリダイズおよび膜洗浄。

本発明において使用される場合、「発現カセット」、「発現ベクター」および「発現構築物」は、植物において対象とするヌクレオチド配列の発現に好適な、組換えベクターなどのベクターを指す。用語「発現」は、機能的生成物の産生を指す。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（例えば、ｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡを生成するための転写）および／またはＲＮＡの、前駆体または成熟タンパク質への翻訳を指し得る。

本発明の「発現構築物」は、線状核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクターであり得、またはいくつかの実施形態では、翻訳され得るＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。

本発明の「発現構築物」は、異なる供給源からの対象とする調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ供給源からの対象とする調節配列およびヌクレオチド配列を含んでなり得るが、通常天然に存在するものとは異なる様式で配置されている。

本発明において「高発現遺伝子」は、発現レベルが特定の組織における一般的な遺伝子の発現レベルよりも高い遺伝子を指す。

用語「組換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築物」は、本明細書においては互換的に使用され、ベクターおよび少なくとも１つの挿入配列を含んでなるＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは、通常、挿入配列の発現および／または増幅の目的で、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために作出される。この挿入配列はプロモーター配列に、作動可能に連結してもよいし、または作動不能に連結してもよく、またはＤＮＡ調節配列に、作動可能に連結してもよいし、または作動不能に連結してもよい。

用語「調節配列」および「調節要素」は、互換的に使用され、コード配列の上流（５’非コード配列）、中流または下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。植物発現調節要素は、植物における対象とするヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳を制御し得るヌクレオチド配列を指す。

調節配列としては、限定するものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリＡ認識配列が挙げられる。

用語「プロモーター」は、別の核酸フラグメントの転写を制御し得る核酸フラグメントを指す。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターは、それが植物細胞に由来するかどうかにかかわらず、植物細胞において遺伝子の転写を制御し得るプロモーターである。このプロモーターは、構成プロモーターまたは組織特異的プロモーターまたは発達段階により調節されるプロモーターまたは誘導プロモーターであり得る。

用語「強力なプロモーター」は、当技術分野において周知で、広く使用されている用語である。多くの強力なプロモーターが当技術分野で公知であるか、または慣例の実験によって特定することができる。強力なプロモーターの活性は、野生型生物において過剰発現させるために核酸分子に作動可能に連結されたプロモーター、例えば、内因性遺伝子のプロモーターより高い活性を有するプロモーターの活性よりも高い。好ましくは、強力なプロモーターの活性は、野生型生物において過剰発現させるために核酸分子に作動可能なように連結されたプロモーターの活性よりも約２％、５％、８％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％または１０００％を超えて高い。当業者はどのようにしてプロモーターの活性を測定し、異なるプロモーターの活性を比較するかを知っている。

用語「構成プロモーター」は、一般に、ほとんどの場合、ほとんどの細胞腫で遺伝子発現を生じるプロモーターを指す。「組織特異的プロモーター」および「組織好適プロモーター」は、互換的に使用され、必ず例外なくというわけではないが主としてある組織または器官で発現され、また、特定の細胞または細胞種でも発現されるプロモーターを指す。「発達段階により調節されるプロモーター」とは、活性が発達事象によって決定されるプロモーターを指す。「誘導プロモーター」は、内因性または外因性刺激（環境、ホルモン、化学シグナルなど）に応答して作動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。

本明細書において使用する場合、用語「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の転写が転写調節要素によって制御および調節されるような、調節要素（例えば、限定するものではないが、プロモーター配列、転写終結配列など）と核酸配列（例えば、コード配列またはオープンリーディングフレーム）の連結を指す。調節要素領域と核酸分子を作動可能に連結するための技術は当技術分野で公知である。

核酸分子（例えば、プラスミド、線状核酸フラグメント、ＲＮＡなど）またはタンパク質を植物に「導入すること」とは、核酸またはタンパク質が植物細胞内で機能し得るように植物細胞をその核酸またはタンパク質で形質転換することを指す。本発明において使用される用語「形質転換」は、安定形質転換および一過性形質転換を含んでなる。

用語「安定形質転換」は、外因性ヌクレオチド配列の植物ゲノムへの導入がその外因性遺伝子の安定な遺伝をもたらすことを指す。ひと度、安定に形質転換されると、外因性核酸配列は植物ゲノムおよびそのいずれの後代にも安定に組み込まれる。

用語「一過性形質転換」は、機能を遂行するための核酸分子またはタンパク質の植物細胞への導入が外来遺伝子の安定な遺伝をもたらさないことを指す。一過性形質転換において、外因性核酸配列は、植物ゲノムに組み込まれない。

生物における内因性遺伝子の発現の変化には、強度と時空間特徴という２つの側面が含まれる。強度の変化には、遺伝子発現の増強（ノックアップ）、低下（ノックダウン）および／または遮断（ノックアウト）が含まれ、時空間特異性には、時間的（生長および発達段階）特異性および空間的（組織）特異性、ならびに誘導可能性が含まれる。さらに、これにはタンパク質の標的化の変化、例えば、タンパク質細胞質局在の特徴の、葉緑体局在または核局在の特徴への変化が含まれる。

特に定義のない限り、本明細書において使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価ないずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用可能であるが、以下、好ましい方法および材料を説明する。

本明細書に引用されている総ての刊行物および特許は、各個の刊行物および特許が正確かつ個々に引用することにより本明細書の一部とされ、および引用されている刊行物に関連する方法および／または材料を開示および記載するために引用することにより本明細書の一部とされるかのように、引用することにより本明細書の一部とされる。出願日までに刊行されたいずれの刊行物の引例も、本発明が既存の発明の公開に先行するに適格でないことを承認するものと解釈されるべきでない。さらに、示されている公開日は実際の公開日とは異なることがあり、実際の公開日は独立検証を要する場合がある。

特に記載や暗示のない限り、本明細書において使用する場合、「１つの(a)」、「１つの(a/an)」および「その(the)は、「少なくとも１つの」を意味する。本明細書に記載または引用される総ての特許、特許出願、および刊行物は、それらが個々に引用されている場合と同じ引例の程度で、それらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。

本発明は、以下の有利な技術的効果を有する：
本発明は、生物内で新規遺伝子を直接作出し、元の遺伝子編集ツール（すなわち、遺伝子ノックアウト）の従来の使用を完全に変え、新規遺伝子を作出するためにその新規使用を実現し、特に、標的遺伝子の発現を増強するために遺伝子編集技術を使用することにより内因性遺伝子をノックアップするための編集方法を実現するための方法を開発するために以下の２つの異なる専門分野の情報を包括的に使用する。１つ目は、遺伝子編集分野の情報であり、すなわち、２つ以上の異なる標的部位およびＣａｓ９が同時にゲノムまたは生物を標的とする場合に、欠失、逆位、倍加または逆位－倍加などの種々の状況が起こり得る。２つ目はゲノミクス分野の情報、すなわち、ゲノム中の種々の遺伝子の部位および距離、ならびに遺伝子中の種々の要素（プロモーター、５’ＵＴＲ、コード領域（ＣＤＳ）、種々のドメイン領域、ターミネーターなど）の特定の部位、方向および機能、ならびに種々の遺伝子の発現特異性などについての情報である。これらの２つの異なる分野における情報を組み合わせることにより、ＤＮＡ切断は２つ以上の異なる遺伝子の特定の部位に、または単一の遺伝子内の２つ以上の特定の部位（これらの特定の部位はゲノミクスの分野で決定することができる）に引き起こされ、異なる遺伝子要素または機能的ドメインの新規組合せは、欠失、逆位、倍加、および逆位－倍加または染色体腕の交換などを介して形成し（これらの特定の部位は遺伝子編集分野で示される）、それにより、生物において新規遺伝子を特異的に作出することができる。

本発明によって作出される新規遺伝子は、外因性の導入遺伝子または合成遺伝子要素を用いずに、元の遺伝子の発現強度、時空間特異性、特別な機能的ドメインなどを変化させるために、生物の自然のＤＮＡ修復機構の作用下での２つ以上の遺伝子の異なる要素の融合または組換えによって形成される。新規遺伝子は２つ以上の異なる遺伝子要素の融合を有するので、これは遺伝子突然変異の範囲を大幅に拡大し、より豊富かつ多様な機能を作り出し、従って、広範囲の応用可能性を有する。同時に、これらの新規遺伝子は遺伝子編集ベクターに連結されないことから、これらのベクター要素は遺伝的分離によって除去し、それにより、動物および植物育種のために新規遺伝子を含む非トランスジェニック生物素材を得ることができる。あるいは、非組込み型一過性編集は、新規遺伝子を含む非遺伝子改変生物素材を作出するために、ｍＲＮＡまたはリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）の送達によって行うことができる。このプロセスは非トランスジェニックであり、結果として編集された材料も同様に導入遺伝子を含まない。理論上および事実上、これらの新規遺伝子は、従来の育種技術（例えば、放射線または化学突然変異誘発）によって得ることもできる。違いは、従来技術を用いたスクリーニングは膨大なランダムな突然変異体を含むライブラリーの作出を必要とし、従って、新規機能的遺伝子をスクリーニングするために時間とコストがかかる。本発明において、新規機能的遺伝子は遺伝子編集技術と組み合わせた生物情報科学分析によって作出することができるとともに、育種期間を大幅に短縮することができる。本発明の方法は、多くの国の遺伝子編集生物に対する現行の規制に義務を負うものではない。

さらに、本発明の新規遺伝子作出技術は、成長、発達、抵抗性、収量などを含む生物の多くの形質を変化させるために使用することができ、大きな応用価値を有する。作出された新規遺伝子は、新規調節要素（例えば、プロモーター）を有してもよく、これは元の遺伝子の発現強度および／もしくは時空間特徴を変化させるか、新規アミノ酸配列を有し、従って、新規機能を有する。作物を例にとると、特定の遺伝子の発現の変化は、害虫および雑草などの有害生物ならびに干魃、浸水、および塩分などの非生物学的ストレスに対する抵抗性を増大させることができ、また、収量を増大させ、品質を高めることもできる。魚類を例にとると、魚類における成長ホルモンの発現特徴の変化は、その成長および発達速度を著しく変化させることができる。

図１は、イネにおける新規ＨＰＰＤ遺伝子の作出の概略図を示す。図２は、イネにおける新規ＥＰＳＰＳ遺伝子の作出の概略図を示す。図３は、シロイヌナズナにおける新規ＰＰＯＸ遺伝子の作出の概略図を示す。図４は、イネにおける新規ＰＰＯＸ遺伝子の作出の概略図を示す。図５は、イネプロトプラストで試験したＨＰＰＤ倍加スキームの配列決定結果を示す。図６は、イネのためのアグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２０９１のマップを示す。図７は、ｐＱＹ２０９１形質転換ハイグロマイシン抵抗性イネカルスにおける新規遺伝子フラグメントの検出のためのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域の融合によって作出された新規遺伝子のＰＣＲバンドを示す。数字は、異なるカルスサンプルの番号である。ＭはＤＮＡマーカーを表し、バンドサイズは順に１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、５０００ｂｐ、７５００ｂｐである。図８は、ｐＱＹ２０９１形質転換イネＴ０実生における新規遺伝子フラグメントの検出のためのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域の融合により作出された新規遺伝子のＰＣＲバンドを示す。数字は、異なるＴ０実生の通し番号である。ＭはＤＮＡマーカーを表し、バンドサイズは順に１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、５０００ｂｐ、７５００ｂｐである。図９は、ＨＰＰＤ遺伝子倍加系統のＱＹ２０９１Ｔ０世代のＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇ抵抗性に関する試験結果を示す。同じ植木鉢で、野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８は左、ＨＰＰＤ倍加系統は右である。図１０は、ＨＰＰＤ遺伝子倍加系統のＱＹ２０９１Ｔ０世代におけるＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子の相対的発現レベルを示す。８１８ＣＫ１および８１８ＣＫ３は、除草剤抵抗性試験に使用した、野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８の２つの対照植物を表し；１３Ｍおよび２０Ｍは、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表し；１３Ｌおよび２０Ｌは、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の二次分げつ葉サンプルを表す。図１１は、ＱＹ２０９１Ｔ１世代の潜在的遺伝子型および分子検出プライマーの結合部位の概略図を示す。図１２は、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０のＨＰＰＤ倍加および推定倍加配列を検出する配列決定結果の比較を示す。図１３は、実生段階におけるＱＹ２０９１ＨＰＰＤ倍加系統のＴ１世代に関する除草剤抵抗性試験の結果を示す。図１４は、イネＰＰＯ１遺伝子染色体フラグメント逆位の潜在的編集事象のタイプおよび分子検出プライマーの結合部位の概略図を示す。図１５は、ＥＰＳＰＳ逆位検出の配列決定結果を示す。図１６は、イネアグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２２３４のマップを示す。図１７は、ｐＱＹ２２３４で形質転換されたハイグロマイシン抵抗性イネカルスの新規遺伝子フラグメントの検出のためのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、ＣＰ１２遺伝子のプロモーターとＰＰＯ１のコード領域の融合によって作出された新規遺伝子のＰＣＲバンドを示す。数字は異なるカルスサンプルの通し番号である。ＭはＤＮＡマーカーを表し、バンドサイズは順に１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、５０００ｂｐ、７５００ｂｐである。図１８は、ＱＹ２２３４Ｔ０世代のＰＰＯ１遺伝子逆位系統２０８１の抵抗性試験結果を示す。同じ処理用量下、左の植木鉢は野生型ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５対照であり、右はＰＰＯ１逆位系統である。図１９は、ＱＹ２２３４Ｔ０世代ＰＰＯ１逆位系統におけるＰＰＯ１およびＣＰ１２遺伝子の相対的発現レベルを示す。Ｈ５ＣＫ１およびＨ５ＣＫ２は、２つの野生型ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５対照植物を示し；２５２Ｍ、３０４Ｍおよび３２９は、ＱＹ２２３４－２５２、ＱＹ２２３４－３０４およびＱＹ２２３４－３２９Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表し；２５２Ｌ、３０４Ｌおよび３２９Ｌは、二次分げつ葉サンプルを表す。図２０は、Ｈｕａｉｄａｏ５バックグラウンドに推定逆位配列を有するＰＰＯ１逆位の配列決定結果の比較を示す。図２１は、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンドに推定逆位配列を有するＰＰＯ１逆位の配列決定結果の比較を示す。図２２は、実生段階におけるＱＹ２２３４ＰＰＯ１逆位系統のＴ１世代に関する除草剤抵抗性試験結果を示す。

本発明を実施するための特定のモデル
以下、さらに本発明を実施例と併せて説明する。以下の記載は単に例示であって、本発明の保護範囲はこれに限定されるものではない。

実施例１：植物において染色体フラグメントの倍加を誘導することによる内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法－イネプロトプラスト試験
ＨＰＰＤは植物におけるクロロフィル合成経路の重要な酵素であり、ＨＰＰＤ活性の阻害は最終的に植物の白化および枯死をもたらす。メソトリオンおよびトプラメゾンなどの多くの除草剤は、ＨＰＰＤを標的タンパク質とする阻害剤であり、従って、植物において内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現レベルを高めると、これらの除草剤に対する植物の耐性を向上させることができる。イネＨＰＰＤ遺伝子（配列番号６に示される通り、１－１０６７ｂｐはプロモーターであり、残りは発現領域である）は、イネ第２染色体に位置する。生物情報科学的分析によれば、イネユビキチン２（以下、ＵＢＩ２と呼称）遺伝子（配列番号５に示される通り、１－２１０７ｂｐはプロモーターであり、残りは発現領域であった）はＨＰＰＤ遺伝子の約３３８ｋｂ下流に位置し、ＵＢＩ２遺伝子およびＨＰＰＤ遺伝子は染色体上に同じ配向にあることが判明した。国際イネゲノム全塩基配列解読プロジェクト(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)によって提供されているイネ遺伝子発現プロファイルデータによれば、イネの葉におけるＵＢＩ２遺伝子の発現強度はＨＰＰＤ遺伝子の３～１０倍であり、ＵＢＩ２遺伝子プロモーターは強力な構成的発現プロモーターであった。

図１に示されるように、スキーム１は、ＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子それぞれのプロモーターとＣＤＳ領域の間の部位に同時に二本鎖切断が作出され、スクリーニングおよび同定の後にこれら２つの切断間の領域を倍加する事象が見られ、ＵＢＩ２のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域がともに融合することによって新規遺伝子が形成できることを示す。さらに、図１に示されるようなスキーム２に従って、ＵＢＩ２のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域が融合した新規遺伝子は、２つの連続的逆位によって形成することもできる。まず、図１に示されるようなスキームを次のようにイネプロトプラスト系で試験した。

１．まず、イネＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)に入力して利用可能な編集標的部位を検索した。オンラインでスコアを得た後、ＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の以下の標的部位を試験のために選択した。

ガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ２は、ＨＰＰＤ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の、ＨＰＰＤタンパク質の開始コドンに近接した位置にあり、ガイドＲＮＡ３およびガイドＲＮＡ４は、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の、ＵＢＩ２タンパク質開始コドンに近接した位置にあった。

ｐＨＵＥ４１１ベクター(https://www.addgene.org/62203/)を骨格として用い、“Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. A CRISPR/Cas9 Toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29; 14(1): 327"に記載されるように、ベクター構築を行うために上記の標的部位に関して以下のプライマーを設計した。

以下の二重標的組合せのための遺伝子編集ベクターを、上記文献に示されている方法に従って構築した。具体的には、ｓｇＲＮＡ発現カセットを構築するために、ｐＣＢＣ－ＭＴ１Ｔ２プラスミド(https://www.addgene.org/50593/)を鋳型とし、ｓｇＲＮＡ１＋３、ｓｇＲＮＡ１＋４、ｓｇＲＮＡ２＋３およびｓｇＲＮＡ２＋４二重標的フラグメントをそれぞれ増幅した。ｐＨＵＥ４１１のベクター骨格をＢｓａＩで消化し、ゲルから回収し、標的フラグメントを消化し、そのままライゲーション反応に使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてベクター骨格と標的フラグメントを連結し、連結産物をＴｒａｎｓ５αコンピテント細胞に形質転換した。異なるモノクローンを採取し、配列決定した。ＳｐａｒｋｊａｄｅＨｉｇｈＰｕｒｉｔｙプラスミドミニ抽出キットを用いて、適正な配列を有するクローンからプラスミドを抽出し、それにより、次のように、それぞれｐＱＹ００２０６５、ｐＱＹ００２０６６、ｐＱＹ００２０６７、およびｐＱＹ００２０６８と呼称する組換えプラスミドを得た：
ｐＱＹ００２０６５ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ１＋３（ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ３の組合せ）
ｐＱＹ００２０６６ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ１＋４（ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ４の組合せ）
ｐＱＹ００２０６７ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ２＋３（ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ３の組合せ）
ｐＱＹ００２０６８ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ２＋４（ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ４の組合せ）

２．上記ｐＱＹ００２０６５－００２０６８ベクターに関して高純度および高濃度のプラスミドを次のように作製した：
ＰｒｏｍｅｇａＭｅｄｉｕｍプラスミド抽出キット（ＭｉｄｉｐｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ７６４０）を用い、説明書に従ってプラスミドを抽出した。具体的な工程は以下の通りであった：
（１）カナマイシンを含有する３００ｍｌの液体ＬＢ培地に５ｍｌの大腸菌(Escherichia coli)を加え、２００ｒｐｍ、３７℃で１２～１６時間振盪する；
（２）上記の細菌溶液を５００ｍｌの遠沈管に入れ、５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄する；
（３）３ｍｌの細胞再懸濁溶液（Cell Resuspension Solution）（ＣＲＳ）を加えて細胞ペレットを再懸濁させ、ボルテックスにかけて十分に混合する；
（４）３ｍｌの細胞溶解溶液(Cell Lysis Solution)（ＣＬＳ）を加え、５分以内でゆっくり上下混合する；
（５）３ｍｌの栄養溶液を加え、無色透明になるまで転倒させることでよく混合する；
（６）１４，０００ｇで１５分間遠心分離し、沈澱が稠密に形成されなければさらに１５分間遠心分離する；
（７）遠沈管に白い沈澱を吸い込まないように、上清を新しい５０ｍｌ遠沈管に移す；
（８）１０ｍｌのＤＮＡ精製樹脂（ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅｓｉｎ、使用前に激しく撹拌する）を加え、よく混合する；
（９）樹脂／ＤＮＡ混合物をフィルターカラムに注ぎ、真空ポンプ陰圧法（０．０５ＭＰａ）によって処理する；
（１０）１５ｍｌのカラム洗浄溶液(Column Wash Solution)（ＣＷＳ）をフィルターカラムに加え、真空化する。
（１１）１５ｍｌのＣＷＳを加え、もう一度真空化を繰り返し、全溶液がフィルターカラムを通過した後３０秒間真空化を延長する；
（１２）フィルターカラムを切り取り、１．５ｍｌの遠沈管に移し、１２，０００ｇで２分管遠心分離して残留する液体を除去し、このフィルターカラムを新しい１．５ｍｌ遠沈管に移す；
（１３）７０℃に予熱した２００μＬの無菌水を加え、２分間静置する；
（１４）１２，０００ｇで２分間遠心分離してプラスミドＤＮＡを溶出させ、濃度は一般に約１μｇ／μＬであった。

３．イネプロトプラストの調製およびＰＥＧを介した形質転換の実施：
まず、プロトプラスト用のイネ実生を準備し、これは日本晴品種である。種子は、中国農業大学植物防疫学科雑草科から提供され、所内で殖やした。イネ種子は、まず、脱穀し、脱穀種子を７５％エタノールで１分間すすぎ、５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで２０分間処理し、次いで、無菌水で５回以上洗浄した。ウルトラクリーンテーブル内で風乾した後、種子を１／２ＭＳ培地を含む組織培養瓶に、各瓶２０個として置いた。プロトプラストは、２６℃、１２時間光で約１０日間インキュベートすることによって調製した。

イネプロトプラストの調製およびＰＥＧを介した形質転換の方法は、"Lin et al., 2018 Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: from single-cell mutation detection to mutant plant regeneration. Plant Biotechnology Journal https://doi.org /10.1111/pbi.12870"に従って行った。工程は次の通りであった。

（１）実生の葉鞘を選別し、鋭利なＧｅｅｌｙかみそり刃で、約１ｍｍ片に切断し、後に使用するために０．６ＭマンニトールおよびＭＥＳ培養培地（配合：０．６Ｍマンニトール、０．４ＭＭＥＳ、ｐＨ５．７）に置いた。総ての材料を切断し、２０ｍｌの酵素加水分解溶液（配合：１．５％セルラーゼＲ１０／ＲＳ（ヤクルト本社）、０．５％マセロチームＲ１０（ヤクルト本社）、０．５Ｍマンニトール、２０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．７、１０ｍＭＣａＣｌ_２、０．１％ＢＳＡ、５ｍＭ β－メルカプトエタノール）に移し、薄いホイルで包み、２８℃の振盪機に置き、５０ｒｐｍ、暗所で約４時間、酵素加水分解を行い、速度は最後の２分に１００ｒｐｍに増した；
（２）酵素溶解の後、等容量のＷ５溶液（配合：１５４ｍＭＮａＣｌ、１２５ｍＭＣａＣｌ_２、５ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭＥＳ）を加え、１０秒間水平振盪してプロトプラストを遊離させた。酵素溶解後の細胞を３００メッシュの篩で濾過し、１５０ｇで５分間遠心分離してプロトプラストを集めた；
（３）細胞をＷ５溶液で２回すすぎ、プロトプラストを１５０ｇで５分間の遠心分離によって集めた；
（４）プロトプラストを適当量のＭＭＧ溶液（配合：３．０５ｇ／ＬＭｇＣｌ_２、１ｇ／ＬＭＥＳ、９１．２ｇ／Ｌマンニトール）に再懸濁させ、プロトプラスト濃度は約２×１０^６細胞／ｍＬであった。

プロトプラストの形質転換は次のように行った：
（１）２００μＬの上記ＭＭＧ再懸濁プロトプラストに、高品質の内毒素非含有プラスミドＤＮＡ（１０～２０μｇ）を加え、軽くたたいてよく混合した；
（２）等容量の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液（配合：４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ、０．５Ｍマンニトール、１００ｍＭＣａＣｌ_２）を加え、軽くたたいてよく混合し、２８℃、暗所で１５分間静置した；
（３）形質転換の誘導後、１．５ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加え、軽くたたいて細胞をよく混合した。細胞を１５０ｇで３分間の遠心分離によって集めた。この工程をもう一度繰り返した；
（４）１．５ｍｌのＷ５溶液を加えて細胞を再懸濁させ、２８℃のインキュベーターに入れ、暗所で１２～１６時間培養した。プロトプラストのゲノムＤＮＡを抽出するために、培養を４８～６０時間行った。

４．ゲノムの標的化および新規遺伝子の検出：
（１）まず、プロトプラストＤＮＡを、一部改変したＣＴＡＢ法により抽出した。具体的な方法は次の通りであった：プロトプラストを遠心分離した後、上清を廃棄した。５００μＬのＤＮＡ抽出溶液（配合：ＣＴＡＢ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ８１．８２ｇ／Ｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．２％β－メルカプトエタノール）を加え、振盪してよく混合し、６５℃の湯浴で１時間インキュベートし、インキュベートしたサンプルが冷めたところで５００μＬのクロロホルムを加え、転倒して混合し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、４００μＬの上清を新しい１．５ｍｌの遠沈管に移し、１ｍｌの７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加え、混合物を－２０℃に維持して２０分間沈降させ、混合物を１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してＤＮＡを沈澱させ、沈澱を風乾した後、５０μＬの超純水を加え、後に使用するために－２０℃で保存した。

（２）以下の表の検出プライマーを用いて、両端に標的部位を含むフラグメントまたはＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤコード領域の融合から生じる推定フラグメントを増幅した。これらのＰＣＲ産物の長さは３００～１０００ｂｐであり、プライマー８－Ｆ＋プライマー６－Ｒの組合せを用いて、染色体フラグメントの倍加後の中間接合の融合フラグメントを検出し、生成物の長さは６３０ｂｐと予想された。

ＰＣＲ反応系は次の通りであった。

（３）ＰＣＲ反応は以下の一般的な反応条件下で行った。

（４）ＰＣＲ反応生成物を１％アガロースゲル電気泳動によって検出した。結果は、ｐＱＹ００２０６６およびｐＱＹ００２０６８形質転換サンプルにおいて、ＵＢＩ２プロモーターおよびＨＰＰＤコード領域の推定融合フラグメントに関して６３０ｂｐの陽性バンドが検出できたことを示した。

５．確認のためにＵＢＩ２プロモーターおよびＨＰＰＤコード領域の融合フラグメント陽性サンプルの配列を決定し、ＯｓＨＰＰＤ倍加プライマー８－ＦおよびＯｓＨＰＰＤ倍加プライマー６－Ｒプライマーを両末端からの配列決定に使用した。図５に示されるように、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターおよびＨＰＰＤ遺伝子の発現領域を直接連結し、イネＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＨＰＰＤ遺伝子の発現領域の融合の編集事象をｐＱＹ００２０６６およびｐＱＹ００２０６８プラスミドで形質転換したイネのプロトプラストゲノムＤＮＡにおいて検出することができたが、このことは新規ＨＰＰＤ遺伝子を形成するために染色体フラグメントを倍加させるスキームが実現可能であり、発現が強力なプロモーターによって駆動される新規ＨＰＰＤ遺伝子を作出することができることを示し、これをＨＰＰＤ倍加事象と定義した。ＨＰＰＤ倍加事象を試験するための、ｐＱＹ００２０６６ベクターで形質転換したプロトプラストの配列決定結果を配列番号９に示し、ＨＰＰＤ倍加事象を試験するための、ｐＱＹ００２０６８ベクターで形質転換したプロトプラストの配列決定結果を配列番号１０に示す。

実施例２：アグロバクテリウムを介した形質転換による染色体フラグメント倍加による内因性ＨＰＰＤ遺伝子のノックアップ発現を用いた除草剤抵抗性イネの作出
１．ノックアップ編集ベクターの構築：実施例１におけるプロトプラスト試験の結果に基づき、高い編集効率を有する二重標的組合せＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ１：５’ＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣ３’およびＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ４：５’ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴ３’を選択した。アグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２０９１を実施例１に従って構築した。ｐＨＵＥ４１１をベクター骨格として使用し、イネコドンの最適化を行った。ベクターの地図を図６に示した。

２．イネカルスのアグロバクテリウム形質転換：
１）アグロバクテリウム形質転換：１μｇのイネノックアップ編集ベクターｐＱＹ２０９１プラスミドを１０μｌのアグロバクテリウムＥＨＡ１０５ヒートショックコンピテント細胞（ＡｎｇｙｕＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｇ６０４０）に加え、氷上に５分間置き、急速凍結のために５分間液体窒素に浸漬した後、取り出し、３７℃で５分間加熱し、最後に氷上に５分間置いた。５００μｌのＹＥＢ液体培地（配合：酵母抽出物１ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、牛肉抽出物５ｇ／Ｌ、スクロース５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ）を加えた。この混合物を振盪機内に置き、２８℃、２００ｒｐｍで２～３時間インキュベートし、細菌を３５００ｒｐｍで３０秒間の遠心分離によって集め、集めた細菌をＹＥＢ（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ＋リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）プレート上に拡げ、インキュベーターにて２８℃で２日間インキュベートし、単一のコロニーを採取し、液体培養培地に入れ、細菌を－８０℃で保存した。

２）アグロバクテリウムの培養：ＹＥＢプレート上の形質転換アグロバクテリウムの単一のコロニーを採取し、２０ｍｌのＹＥＢ液体培地（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ＋リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）に加え、２８℃で撹拌しながら、ＯＤ６００が０．５となるまで培養し、次いで、細菌細胞を５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって集め、２０～４０ｍｌのＡＡＭ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、ロット番号ＬＡ８５８０）液体培地を加えて、ＯＤ６００が０．２～０．３となるように細菌細胞を再懸濁させ、次いで、カルスに感染させるために、アセトシリンゴン（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、商品番号Ａ８１１０）を終濃度が２００μＭとなるように加えた。

３）イネカルスの誘導：形質転換レシピエントイネの品種は、江蘇省淮安市の種子市場から購入し、所内で殖やしたＨｕａｉｄａｏ５およびＪｉｎｊｉｎｇ８１８であった。８００～２０００個の清浄なイネ種を脱穀した後、洗浄後に水が澄むまで無菌水で洗浄した。次に、これらの種子を７０％アルコールで３０秒間消毒した後、３０ｍｌの５％次亜塩素酸ナトリウムを加え、混合物を水平振盪機に置き、５０ｒｐｍで２０分間振盪し、次いで、無菌水で５回洗浄した。これらの種子を無菌吸水紙に置き、風乾して種子表面の水を除去し、誘導培地に植え込み、カルスを得るために２８℃で培養した。

誘導培地の配合：４．１ｇ／ＬＮ６粉末＋０．３ｇ／Ｌ加水分解カゼイン＋２．８７８ｇ／Ｌプロリン＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋３％スクロース＋０．１ｇ／Ｌイノシトール＋０．５ｇグルタミン＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．８。

４）イネカルスのアグロバクテリウム感染：１０日間継代培養した直径３ｍｍのＨｕａｉｄａｏＮｏ．５またはＪｉｎｊｉｎｇ８１８のカルスを選抜し、５０ｍｌ遠沈管に集め、ＯＤ６００を０．２～０．３に調整したアグロバクテリウムＡＡＭの再懸濁溶液を、カルスを含む遠沈管に注ぎ、２８℃、２００ｒｐｍの速度の振盪機に置き、２０分間感染を行い、感染が完了した際に、細菌溶液を廃棄し、カルスを無菌濾紙に置き、約２０分間風乾し、次いで、共培養培地を含むプレートに置いて共培養を行い、このプレートを、１００μＭアセトシリンゴンを含有するＡＡＭ液体培地に浸した無菌濾紙で覆い、３日の共培養の後に、アグロバクテリウムを洗浄（まず、無菌水で５回洗浄し、次いで、５００ｍｇ／Ｌセファロスポリン抗生物質で２０分間洗浄する）によって除去し、５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン選抜培地で選抜培養を行った。

共培養培地の配合：４．１ｇ／ＬＮ６粉末＋０．３ｇ／Ｌ加水分解カゼイン＋０．５ｇ／Ｌプロリン＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋２００μＭＡＳ＋１０ｇ／Ｌグルコース＋３％スクロース＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．５。

３．分子同定およびハイグロマイシン抵抗性カルスの実生への分化：
融合フラグメントの特定のプライマーが染色体フラグメント倍加の後に生成される従来のイネ形質転換の選抜プロセスとは異なり、本発明においてハイグロマイシン抵抗性カルスは、カルス選抜および培養段階中に分子的に同定することができ、陽性倍加事象を決定することができ、異なる遺伝要素の融合から生じる新規遺伝子を含むカルスを分化培養のために選抜し、実生の出現を誘導した。具体的な工程は次の通りであった。

１）共培養カルスを、１回目の選抜のために選抜培地に移した（２週間）。選抜培地の配合は、４．１ｇ／ＬＮ６粉末＋０．３ｇ／Ｌ加水分解カゼイン＋２．８７８ｇ／Ｌプロリン＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋３％スクロース＋０．５ｇグルタミン＋３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン（ＨＹＧ）＋５００ｍｇ／Ｌセファロスポリン（ｃｅｆ）＋０．１ｇ／Ｌイノシトール＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．８である。

２）１回目の選抜が完了した後、新たに生長したカルスを２回目の選抜のために新たな選抜培地に移した（２週間）。この段階で、新たに生長した直径３ｍｍより大きいカルスをピンセットでつまんで少量のサンプルを取り、そのＤＮＡを１回目の分子同定に関して実施例１に記載したＣＴＡＢ法で抽出した。本実施例では、ｐＱＹ２０９１ベクターで形質転換したカルスのＰＣＲ同定を行うためにＯｓＨＰＰＤ倍加プライマー８－Ｆ（８Ｆ）およびＯｓＨＰＰＤ倍加プライマー６－Ｒ（６Ｒ）のプライマー対を選択し、反応系および反応条件は実施例１と同様とした。合計３５０個の試験カルスに、Ｈｕａｉｄａｏ５のカルスでは陽性サンプルは検出されなかったが、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８のカルスでは、２８の陽性サンプルが検出された。いくつかのカルスのＰＣＲ検出結果を図７に示した。

３）ＰＣＲにより陽性と同定されたカルスを、３回目の選抜および拡大培養のために新たな選抜培地に移し、カルスの直径が５ｍｍより大きくなった後は、拡大培養中のカルスに、８Ｆ＋６Ｒプライマー対を用いた２回目の分子同定を行い、２回目に陽性と同定された良好な生長状態の黄色～白色のカルスを、分化を行うために分化培地に移し、３～４週間後に約１ｃｍの実生を得ることができ、これらの分化した実生を発根培養のために発根培地に移し、発根培養の実生が環境馴化を受けた後に、それらを土の入った植木鉢に移し、栽培のために温室に置いた。分化培地の配合は、４．４２ｇ／ＬＭＳ粉末＋０．５ｇ／Ｌ加水分解カゼイン＋０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋３％スクロース＋３％ソルビトール＋３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．１ｇ／Ｌイノシトール＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．８である。発根培地の配合は、２．３ｇ／ＬＭＳ粉末＋３％スクロース＋０．４５％フィタゲルである。

４．ＨＰＰＤ倍加実生（Ｔ０世代）の分子検出：
２回目の分子同定の後、２９の倍加事象陽性カルスが同時分化し、４０３のＴ０世代実生が得られ、８Ｆ＋６Ｒプライマー対を４０３の実生の３回目の分子同定のために使用し、このうち５６が陽性バンドを有していた。これらの陽性実生を栽培のために温室に移した。いくつかのＴ０実生のＰＣＲ検出結果を図８に示した。

５．ＨＰＰＤ倍加実生（Ｔ０世代）のＨＰＰＤ阻害性除草剤抵抗性試験：
倍加事象陽性と同定されたＴ０世代の形質転換実生を、Ｔ１世代の種子を得るために拡大繁殖させるために温室内の大型プラスチックバケツに移した。実生が分げつを始めた後、旺盛に生育している系統から分げつを採取し、同じ生長期間の野生型対照品種の分げつと同じポットに植えた。植物の背丈が約２０ｃｍに達した後、除草剤抵抗性試験を行った。使用した除草剤は、当社により製造されたＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇ（ＣＡＳＮｏ．１６２２９０８－１８－２）であり、その圃場用量は通常、有効成分４グラム／ムー（４ｇａ．ｉ．／ムー）であった。この実験において、Ｓｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇは、歩行用噴霧塔で２ｇａ．ｉ．／ムー、４ｇａ．ｉ．／ムー、８ｇａ．ｉ．／ムーおよび３２ｇａ．ｉ．／ムーの用量勾配で施与した。

抵抗性試験結果を図９に示した。５～７日の施与の後、野生型対照イネ実生は白化を示し始めたが、ＨＰＰＤ倍加事象の系統では、総てが通常の緑のままであった。４週間の施与の後、野生型イネ実生は枯死しかけていたが、倍加事象系統は総て、緑のままで正常に生育し続けた。これらの試験結果は、ＨＰＰＤ遺伝子倍加系統がＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇに対する耐性を有意に向上していたことを示した。

６．ＨＰＰＤ倍加実生（Ｔ０世代）におけるＨＰＰＤ遺伝子の相対的発現の定量的検出：
ＨＰＰＤ遺伝子倍加系統のＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇに対する抵抗性の向上は、ＨＰＰＤの発現を増強したＵＢＩ２の強力なプロモーターとＨＰＰＤ遺伝子ＣＤＳの融合によるものであったと推測されたことから、Ｔ０世代系統ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０を用い、ＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子それぞれの発現レベルを検出するために、除草剤抵抗性試験に使用した一次分げつおよび二次分げつからのサンプルを採取し、野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８を対照とした。具体的な工程は次の通りであった。

１）全ＲＮＡの抽出（トリゾール法）：
０．１～０．３ｇの新鮮葉を採取し、液体窒素中で摩砕して粉末とした。溶解のため、組織５０～１００ｍｇ当たり１ｍｌのトリゾール試薬を加え、上記の組織のトリゾール溶解物を１．５ｍｌの遠沈管に移し、室温（１５～３０℃）で５分間静置し、クロロホルムをトリゾール１ｍｌ当たり０．２ｍｌの量で加え、この遠沈管に蓋をし、１５秒間手で激しく振盪し、室温（１５～３０℃）で２～３分間静置し、次いで、１２０００ｇ（４℃）で１５分間遠心分離し、上の水相を取り出し、新たな遠沈管に入れ、イソプロパノールをトリゾール１ｍｌ当たり０．５ｍｌの量で加え、この混合物を１０分間室温（１５～３０℃）で維持し、次いで、１２０００ｇ（２～８℃）で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、洗浄のため、このペレットに７５％エタノールをトリゾール１ｍｌ当たり１ｍｌの量で加えた。この混合物をボルテックスにかけ、７５００ｇ（２～８℃）で５分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈澱したＲＮＡを室温で３０分間自然乾燥させ、このＲＮＡ沈澱を５０μｌのＲＮアーゼ非含有水によって溶解させ、電気泳動分析および濃度決定の後に冷凍庫で－８０℃にて保存した。

２）ＲＮＡ電気泳動分析：
１％濃度のアガロースゲルを調製し、次いで、１μｌのＲＮＡを取り、１μｌの２×ローディングバッファーと混合した。この混合物をゲルに載せた。電圧は１８０Ｖに設定し、電気泳動時間は１２分であった。電気泳動が完了した後、アガロースゲルを採取し、フラグメントの部位および明度をＵＶゲルイメージングシステムで観察した。

３）ＲＮＡ純度検出：
ＲＮＡ濃度は、マイクロタンパク質核酸分析装置で測定した。良好な純度のＲＮＡは、１．８～２．１のＯＤ２６０／ＯＤ２８０値を有した。１．８より低い値は重大なタンパク質混入を示し、２．１より高い値は重大なＲＮＡ分解を示した。

４）リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ
抽出した全ＲＮＡを特定の逆転写キットで逆転写させてｃＤＮＡを得た。主要な手順は、まず、抽出した全ＲＮＡの濃度を決定することを含んでなり、１～４μｇ部のＲＮＡを逆転写酵素合成によりｃＤＮＡを合成するために使用した。得られたｃＤＮＡを－２０℃で保存した。

(1)以下の表に示すようにＲＮＡ鋳型の溶液を氷上で調製し、ＰＣＲ装置にて変性およびアニーリング反応を行った。このプロセスは、ＲＮＡ鋳型の変性およびプライマーと鋳型の特異的アニーリングを促し、それにより、逆転写効率を向上させた。

(2)ｃＤＮＡを合成するために表２に示すように逆転写反応系を調製した。

(3)イネのＵＢＱ５遺伝子を内部参照遺伝子として選択し、合成されたｃＤＮＡを鋳型として使用して蛍光定量的ＰＣＲを行った。表３に挙げたプライマーを使用して表４に従い、反応溶液を調製した。

(4)反応は、表５のリアルタイム定量的ＰＣＲ反応工程に従って行った。反応は４０サイクルで行った。

５）データ処理および実験結果
表６に示されるように、ＵＢＱ５を内部参照として用い、標的遺伝子のＣｔ値からＵＢＱ５のＣｔ値を減算することによってΔＣｔを計算し、次いで、標的遺伝子の相対的発現レベルを表す２^－ΔＣｔを計算した。８１８ＣＫ１および８１８ＣＫ３は、除草剤抵抗性試験に使用した、２つの野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８対照植物であり、１３Ｍおよび２０Ｍは、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表し、１３Ｌおよび２０Ｌは、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の二次分げつ葉サンプルを表した。

結果を図１０に示した。イネＵＢＱ５を内部参照遺伝子として用いてＯｓＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子の相対的発現レベルを計算した。結果は、ＨＰＰＤ倍加系統のＨＰＰＤ発現レベルは野生型の発現レベルよりも有意に高いことを示し、融合されたＵＢＩ２の強力なプロモーターがＨＰＰＤの発現レベルを高め、それにより、ＨＰＰＤ遺伝子のノックアップによる高発現ＨＰＰＤ遺伝子が作出されたことを示す。ＵＢＩ２の発現レベルにおける若干の低下は、プロモーター領域の編集から生じる小規模な突然変異によるものであり得、本発明者らは実際にＵＢＩ２標的部位において塩基の挿入、欠失または小フラグメントの欠失を検出した。野生型に比べて、ＵＢＩ２およびＨＰＰＤの発現レベルは、有意に一貫し、理論的予想に合っている傾向にあり、とりわけ、２０ＭサンプルのＨＰＰＤ発現レベルは、野生型ＣＫ３群の発現レベルの約６倍であった。

上記の結果は、プロトプラストで試験されたような有効な染色体フラグメント倍加プログラムに従い、倍加事象を有するカルスおよび形質転換実生は、アグロバクテリウム形質転換および組織培養中の複数回の分子同定によって選抜可能であり、形質転換実生内に作出された新規ＨＰＰＤ遺伝子融合物中のＵＢＩ２の強力なプロモーターはＨＰＰＤ遺伝子の発現レベルを高め、それらの植物に圃場用量の最大８倍のＨＰＰＤ阻害性除草剤Ｓｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇに対する抵抗性を獲得させ、従って、内因性ＨＰＰＤ遺伝子がノックアップされた除草剤抵抗性イネが作出されたことを示した。これを例に取ると、実施例１および実施例２の染色体フラグメント倍加の技術的解決を用いれば、所望のプロモーターを内因性遺伝子に導入することもでき、その遺伝子発現パターンは新規遺伝子を作出すべく変化するはずであり、所望の遺伝子発現パターンを有する植物の新品種がアグロバクテリウムを介した形質転換によって作出される可能性がある。

実施例３：染色体フラグメント倍加により引き起こされる内因性ＨＰＰＤ遺伝子のノックアップ発現を有する除草剤抵抗性イネ系統のＴ１世代の分子検出および除草剤抵抗性試験
図１のスキーム１に示されるように、野生型イネゲノムにおけるＨＰＰＤ遺伝子とＵＢＩ２遺伝子の間の物理的距離は３３８ｋｂであった。染色体の長さは、それらの間の染色体フラグメントが倍加処理により倍加された後に３３８ｋｂ伸び、ＨＰＰＤＣＤＳ領域の発現を駆動するために倍加フラグメントの接合物にＵＢＩ２プロモーターを有する高発現新規ＨＰＰＤ遺伝子が作出された。新規遺伝子が安定に受け継がれるかどうかおよび遺伝的安定性に及ぼす倍加染色体フラグメントの効果を決定するために、分子検出および除草剤抵抗性試験をＨＰＰＤ倍加系統のＴ１世代に関して行った。

まず第一に、総ての陽性Ｔ０系統が正常な種子を生産できたことから、倍加事象はＴ０世代植物の稔性に有意な効果を及ぼさなかったことが認められた。ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０系統に関して、さらにＴ１世代実生の作付け試験を行った。

１．サンプルの調製：
ＱＹ２０９１－１３については、合計３６個体のＴ１実生を植え付け、そのうち２７個体が正常に生育し、９個体がアルビノであった。３２個体をＤＮＡ抽出および検出のために選択し、Ｎｏ．１～２４が正常実生であり、Ｎｏ．２５～３２がアルビノ実生であった。

ＱＹ２０９１－２０については、合計４４個体のＴ１実生を植え付け、そのうち３３個体が正常に生育し、１１個体がアルビノであった。４０個体をＤＮＡ抽出および検出のために選択し、Ｎｏ．１～３２が正常実生であり、Ｎｏ．３３～４０がアルビノ実生であった。

アルビノ実生はＴ１世代植物で見られた。ＨＰＰＤは植物のクロロフィル合成経路の重要な酵素であることから、二重標的編集から生じるＴ０世代植物はおそらくは染色体フラグメントの倍加、欠失、逆位、または編集標的部位における小フラグメント突然変異などの、多くの遺伝子型のキメラであり得ると推測される。アルビノ表現型は、ＨＰＰＤ遺伝子が破壊された、例えば、ＨＰＰＤＣＤＳ領域が欠失した植物に生成され得る。可能性ある遺伝子型を決定するために、ＰＣＲ用の種々のプライマー対が設計された。

２．ＰＣＲ分子同定：
１）検出プライマーの配列：配列５’－３’

２）上記プライマーの結合部位を図１１に示す。とりわけ、染色体フラグメントの倍加の後のＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤＣＤＳの融合フラグメントを検出するためにプライマー８Ｆ＋プライマー６Ｒを使用し、その生成物の長さは６３０ｂｐであり、染色体フラグメント欠失事象を検出するために試験１４１－Ｆ＋プライマー４Ｒを用い、その生成物の長さは２２２ｂｐであり、また、編集ベクターのＴ－ＤＮＡフラグメントを検出するためにｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆを用い、その生成物の長さは６６０ｂｐであった。

３）ＰＣＲ反応系、反応手順およびゲル電気泳動検出は、実施例１に従って行った。

３．分子検出結果：
倍加および欠失事象の検出結果を表７に示した。染色体フラグメント倍加事象および欠失事象がＴ１世代植物で見られ、系統が異なれば比率も異なると言える。ＱＹ２０９１－１３における倍加事象（２９／３２）は、おそらくはＴ０世代植物におけるキメラ比率が異なるために、ＱＹ２０９１－２０における倍加事象（２１／４０）よりも多かった。試験結果は、倍加によって作出された融合遺伝子は受け継がれ得ることを示した。

上記のＴ１実生の編集ベクターのＴ－ＤＮＡフラグメントを検出するためにｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆプライマーを使用した。ＱＹ２０９１－２０－１７およびＱＹ２０９１－１３－７のＰＣＲ産物の電気泳動結果はＴ－ＤＮＡフラグメント陰性であったが、このことはそれが、同型接合倍加であったことを示す。倍加同型接合非トランスジェニック系統は倍加事象のＴ１世代から分離され得ることが認められた。

４．配列決定による編集事象の検出：
倍加融合フラグメントを、ＱＹ２０９１－２０では倍加同型接合陽性Ｔ１世代サンプル１、５、７、１１、１８および１９に関して、ＱＹ２０９１－１３では倍加同型接合陽性Ｔ１サンプル１、３、７、９、１０および１２に関して配列決定した。標的部位における編集事象を検出するための配列決定のために、ＨＰＰＤ遺伝子の左標的部位およびＵＢＩ２の右標的部位を同時に増幅した。それらのうち、左ＨＰＰＤ標的部位の編集事象を検出ためにはプライマー３Ｆ＋プライマー７Ｒを使用し、野生型対照生成物は４８１ｂｐの長さであり、右ＵＢＩ２標的部位の編集事象を検出するためにはプライマー８Ｆ＋プライマー４Ｒを使用し、野生型対照生成物は３２９ｂｐの長さであった。

１）倍加事象の遺伝子型：
ＱＹ２０９１－１３におけるＨＰＰＤ倍加の配列決定結果を配列番号１８に示し、ＱＹ２０９１－２０におけるＨＰＰＤ倍加の配列決定結果を配列番号１９に示す、図１２参照。倍加の推定リンカー配列と比較して、ＱＹ２０９１－１３のリンカーに１つのＴ塩基が挿入され、ＱＹ２０９１－２０のリンカーからは１９塩基が欠失され、ＵＢＩ２のプロモーター領域には挿入および欠失の両方が生じており、ＨＰＰＤタンパク質のコード領域に影響はなかった。実施例２においてＨＰＰＤ遺伝子の発現レベルに対する検出結果から、ＵＢＩ２プロモーターがＨＰＰＤＣＤＳ領域と融合されたこれらの新規ＨＰＰＤ遺伝子の発現レベルは有意に高まったことが認められ得る。

２）元のＨＰＰＤおよびＵＢＩ２標的部位の両端における編集事象：
標的部位の両端にはより多くのタイプの編集事象が存在した。２つの系統において、ＨＰＰＤプロモーター領域には３種類の編集、すなわち、単一塩基の挿入、１７塩基の欠失、および１６塩基の欠失、ＵＢＩ２プロモーター領域には２種類の編集、すなわち、７塩基の挿入および３塩基の欠失が存在した。試験およびサンプリングに使用したＴ１植物は総て緑色の実生であって正常に生長したが、このことはこれらのプロモーター領域における小規模の突然変異は遺伝子機能に有意な影響を及ぼさず、それらの後代から除草剤抵抗性イネ品種が選抜できることを示した。

５．Ｔ１世代の実生に対する除草剤抵抗性試験：
ＱＹ２０９１ＨＰＰＤ倍加系統のＴ１世代の除草剤抵抗性は実生段階で試験した。Ｔ１世代の種子に表面消毒を行った後、それらを１．２μＭＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇを含有する１／２ＭＳ培地で発芽させ、２８℃、１６時間明期／８時間暗期で栽培し、野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８を対照として使用した。

抵抗性の試験結果を図１３に示した。明所で１０日間の栽培の後、野生型対照イネ実生は白化の表現型を示し、ほとんど総てがアルビノであったが、ＨＰＰＤ倍加事象の系統ＱＹ２０９１－７、１３、２０、２２は、白化実生と緑色実生の表現型分離を示した。上記分子検出結果によれば、Ｔ１世代に遺伝子型分離が見られた。アルビノ実生は除草剤処理の不在下で現れたが、緑色実生は、１．２μＭＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇを添加した後も緑色のままであり続け、正常に生育した。これらの試験結果は、ＨＰＰＤ遺伝子倍加系統のＳｈｕａｎｇｚｕｏｃａｏｔｏｎｇに対する高い抵抗性はＴ１世代に安定に受け継がれ得ることを示した。

実施例４：染色体フラグメント逆位を誘導することにより内因性ＰＰＯ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法－イネプロトプラスト試験
イネＰＰＯ１（ＰＰＯＸ１としても知られる）遺伝子（配列番号７に示される通り、１～１０６５ｂｐがプロモーターであり、残りがコード領域であった）は染色体１に位置し、カルビンサイクルタンパク質ＣＰ１２遺伝子（配列番号８に示される通り、１～２０８８ｂｐがプロモーターであり、残りがコード領域であった）はＰＰＯ１遺伝子の９１１ｋｂ下流に反対方向で存在する。国際イネゲノム全塩基配列解読プロジェクト(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)により提供されているイネ遺伝子発現プロファイルデータによれば、イネ葉におけるＣＰ１２遺伝子の発現強度はＰＰＯ１遺伝子の５０倍であり、ＣＰ１２遺伝子プロモーターは、葉で発現の高い強力なプロモーターであった。

図４のスキーム１に示されるように、２つの遺伝子の個々のプロモーターとＣＤＳ領域の間に同時に二本鎖切断を引き起こしてスクリーニングすることにより、これらの２つの切断の間の領域は逆転し、ＰＰＯ１遺伝子のプロモーターがＣＰ１２遺伝子のプロモーターに置換し、ＰＰＯ１遺伝子の発現レベルが高まり、ＰＰＯ阻害性除草剤に対する抵抗性を獲得し、それにより、除草剤抵抗性系統が選抜できる。さらに、図４のスキーム２に示されるように、ＣＰ１２遺伝子のプロモーターによって駆動されるＰＰＯ１の新規遺伝子は、まず逆位、次いで倍加によって作出することもできる。

１．まず、イネＰＰＯ１およびＣＰ１２ゲノムＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)に入力して利用可能な編集標的部位を検索した。オンラインでスコア化した後、試験のためにＰＰＯ１およびＣＰ１２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の以下の標的部位を選択した。

ガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ２は、ＰＰＯ１遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間にＰＯ１開始コドンに近接して位置し、ガイドＲＮＡ３およびガイドＲＮＡ４は、ＣＰ１２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間にＣＰ１２開始コドンに近接して位置した。

実施例１に記載されるように、上記の標的部位に関して、ｐＨＵＥ４１１を骨格とする二重標的ベクターを構築するためにプライマーを設計した。

具体的には、ｐＣＢＣ－ＭＴ１Ｔ２プラスミド(https://www.addgene.org/50593/)を鋳型として用いてそれぞれｓｇＲＮＡ１＋３、ｓｇＲＮＡ１＋４、ｓｇＲＮＡ２＋３、ｓｇＲＮＡ２＋４二重標的フラグメントを増幅し、ｓｇＲＮＡ発現カセット構築した。ｐＨＵＥ４１１ベクター骨格をＢｓａＩで消化し、ゲルから回収し、標的フラグメントを消化後にそのままライゲーション反応に使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてベクター骨格と標的フラグメントを連結し、その連結生成物をＴｒａｎｓ５αコンピテント細胞に形質転換し、異なるモノクローンを選択し、配列決定した。ＳｐａｒｋｊａｄｅＨｉｇｈＰｕｒｉｔｙプラスミドミニ抽出キットを用いて、適正な配列決定結果を有するプラスミドを抽出し、それにより、以下に示されるようにそれぞれｐＱＹ００２０９５、ｐＱＹ００２０９６、ｐＱＹ００２０９７、ｐＱＹ００２０９８と呼称された組換えプラスミドを得た。
ＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ３の組合せを含むｐＱＹ００２０９５ｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ１＋３
ＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ３の組合せを含むｐＱＹ００２０９６ｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ２＋３
ＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ４の組合せを含むｐＱＹ００２０９７ｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ１＋４
ＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ４の組合せを含むｐＱＹ００２０９８ｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ２＋４

２．実施例１の工程２に記載されるように、上記のｐＱＹ００２０９５－００２０９８ベクターに関して高純度および高濃度のプラスミドを作製した。

３．実施例１の工程３に記載されるように、イネプロトプラストを調製し、上記のベクターでＰＥＧを介した形質転換を行った。

４．実施例１の工程４に記載されるように、ＰＣＲ検出に関して下表に示される検出プライマーを用いて新規遺伝子のゲノム標的および検出を行った。

これらのうち、ＰＰＯ－Ｒ２とＣＰ－Ｒ２の組合せを用いてＣＰ１２プロモーター駆動ＰＰＯ１ＣＤＳ新規遺伝子フラグメントを増幅し、これは染色体フラグメント逆位の後に右側に生じ、ＰＰＯ－Ｆ２とＣＰ－Ｆ２の組合せを用いてＰＰＯ１プロモーター駆動ＣＰ１２ＣＤＳ新規遺伝子フラグメントを増幅し、これは逆位の後に左側に生じた。二重標的編集から生じる可能性のある遺伝子型および分子検出プライマーの結合部位を図１４に示した。

５．ＰＣＲおよび配列決定結果は、ＣＰ１２プロモーターがＰＰＯ１の発現を駆動する、予想される新規遺伝子がイネプロトプラストの形質転換から作出されたことを示した。イネＣＰ１２遺伝子プロモーターがＰＰＯ１遺伝子発現領域に融合された編集事象が、形質転換したイネプロトプラストのゲノムＤＮＡにおいて検出できた。これは、染色体フラグメント逆位を介して新規ＰＰＯ遺伝子を形成するためのスキームが実現可能であり、強力なプロモーターによって駆動される新規ＰＰＯ遺伝子が作出できたことを示し、これをＰＰＯ１逆位事象と定義した。ｐＱＹ００２０９５ベクターで形質転換したプロトプラストにおける染色体フラグメント逆位の配列決定結果を配列番号１５に示し、ｐＱＹ００２０９５ベクターで形質転換したプロトプラストにおける染色体フラグメント欠失の配列決定結果を配列番号１６に示し、ｐＱＹ００２０９８ベクターで形質転換したプロトプラストにおける染色体フラグメント逆位の配列決定結果を配列番号１７に示した。

実施例５：アグロバクテリウムを介した形質転換による染色体フラグメント逆位によって内因性ＰＰＯ遺伝子のノックアップ発現が引き起こされた除草剤抵抗性イネの作出
１．ノックアップ編集ベクターの構築：プロトプラスト試験の結果に基づき、アグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２２３４を構築するために、高い編集効率を有するＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ１：５’ＣＣＡＴＧＴＣＣＧＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＧ３’とＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ４：５’ＣＧＧＡＴＴＴＣＴＧＣＧＴ－ＧＴＧＡＴＧＴ３’の二重標的組合せを選択した。ｐＨＵＥ４１１をベクター骨格として用い、イネコドンの最適化を行った。ベクターマップを図１６に示した。

２．アグロバクテリウム形質転換イネカルスおよび２回の分子同定：
実施例２の工程２に記載の方法に従い、ｐＱＹ２２３４プラスミドを用いてイネカルスを形質転換した。レシピエント品種はＨｕａｉｄａｏＮｏ．５およびＪｉｎｊｉｎｇ８１８であった。カルス選抜段階において、ハイグロマイシン抵抗性カルスに対して２回の分子同定を行い、逆位事象が陽性のカルスを再生させた。カルスの分子検出の際、ＰＰＯ－Ｒ２とＣＰ－Ｒ２の組合せによる染色体フラグメント逆位の後に右側に生じるＣＰ１２プロモーター駆動ＰＰＯ１ＣＤＳ新規遺伝子フラグメントの増幅は、この逆位事象の陽性標準と思われたが、カルスの分化および実生出現後には、逆位後に左側に生じるＣＰ１２新規遺伝子が陽性標準と見なされた。ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５由来の合計７３４のカルスを試験し、このうち２４カルスが逆位事象陽性であり、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８由来の２５９カルスを試験し、このうち２９カルスが逆位事象陽性であった。図１７は、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８カルスＮｏ．１９２～２５９のＰＣＲ検出結果を示した。

３．合計５３の逆位事象陽性カルスに２回の分子同定を行い、次いで、同時再生し、９つの倍加事象陽性カルスを同定し、これに２回の分子同定を行い、次いで、同時再生して１，８７５のＴ０実生を生産し、このうち７６８系統がＨｕａｉｄａｏＮｏ．５バックグラウンド由来であり、１１０７系統がＪｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンド由来であった。これら１８７５の実生に、ＰＰＯ－Ｒ２およびＣＰ－Ｒ２プライマー対を用いてさらに３回目の分子同定を行い、このうちＨｕａｉｄａｏＮｏ．５バックグラウンド由来の１８４系統は逆位陽性バンドを示し、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンド由来の３５０系統は逆位陽性バンドを示した。陽性実生を栽培のために温室に移動した。

４．ＰＰＯ１逆位実生（Ｔ０世代）のＰＰＯ阻害性除草剤抵抗性試験：
逆位事象陽性と同定されたＱＹ２２３４Ｔ０世代の形質転換実生を温室内の大型プラスチックバケツに移植してＴ１世代の種子を育成した。多数の陽性実生が存在したので、生長期間および状態が同等の一部のＴ０実生および野生型対照系統を選抜した。草丈が約２０ｃｍに達した際に、そのまま除草剤抵抗性試験を行った。使用した除草剤は、当社が製造した高効率ＰＰＯ阻害性除草剤であった。（コード２０８１、中国特許出願第２０２０１０２８１６６６．４号参照）

この試験では、除草剤を歩行用噴霧塔によって３段階の勾配、すなわち、０．１８、０．４、および０．６ｇａｉ／ｍｕで施与した。

抵抗性試験結果を図１８に示した。施与３～５日後、野生型対照イネ実生は葉の先端から白化し始め、葉に壊死斑が現れ、植物体は徐々に萎凋したが、ＰＰＯ１逆位事象系統のほとんどのものは正常な生長を維持し、葉には著明な植物毒性は無かった。さらに、一部の系統は、おそらくは編集事象の多遺伝子型モザイクおよびＴ０世代系統におけるＰＰＯ１の低発現レベルのために植物毒性を示した。施与２週間後、野生型イネ実生は枯死し、逆位事象系統のほとんどのものは緑色を維持し続け、正常に生育した。これらの試験結果は、ＰＰＯ１逆位系統が２０８１に対する植物の耐性を有意に向上させることができたことを示した。

５．ＰＰＯ１逆位実生（Ｔ０世代）におけるＰＰＯ１遺伝子の相対的発現レベル定量的検出：
これらのＰＰＯ１遺伝子逆位系統の２０８１に対する抵抗性の増強は、ＰＰＯ１の発現レベルを高める、強力なＣＰ１２プロモーターとＰＰＯ１遺伝子のＣＤＳの融合のためであると推測された。よって、ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５バックグラウンドからのＴ０世代ＱＹ２２３４－２５２、ＱＹ２２３４－３０４およびＱＹ２２３４－３２９の系統を選択し、それらの一次分げつおよび二次分げつのサンプルを採取し、ＰＰＯ１およびＣＰ１２遺伝子の発現レベルの検出を行った。野生型ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５を対照として使用した。具体的なプロトコールは実施例２の工程６に従い、イネＵＢＱ５遺伝子を内部参照遺伝子とした。蛍光定量的プライマーは以下の通りであった：５’から３’

ＵＢＱ５を内部参照として使用した。標的遺伝子のＣｔ値からＵＢＱ５のＣｔ値を減算することによってΔＣｔを計算した。次に、標的遺伝子の相対的発現レベルを表す２^－ΔＣｔを計算した。Ｈ５ＣＫ１およびＨ５ＣＫ２はＨｕａｉｄａｏＮｏ．５の２つの野生型対照植物であり、２５２Ｍ、３０４Ｍおよび３２９Ｍは、ＱＹ２２３４－２５２、ＱＹ２２３４－３０４およびＱＹ２２３４－３２９Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表し、２５２Ｌ、３０４Ｌ、および３２９Ｌは、それらの二次分げつ葉サンプルを表した。結果を下表８に示した。

種々の系統におけるＰＰＯ１およびＣＰ１２の相対的発現レベルを図１９に示した。これらの結果が示したように、実施例２の倍加事象とは異なり、これらの逆位事象系統の遺伝子発現レベルは有意に異なった。ＣＰ１２の発現レベルは２つのＨｕａｉｄａｏＮｏ．５ＣＫ群間で大きく異なり、おそらくこれは実生の生長速度の違いのためである。Ｈ５ＣＫ２対照群に比べて、試験群のＣＰ１２の発現レベルは総て低下傾向を示し、一方、２５２Ｌおよび３２９Ｍに関するＰＰＯ１の発現レベルは有意に上昇しており、３０４Ｌおよび３２９Ｌに関するＰＰＯ１の発現レベルは中等度の上昇であり、２５２Ｍおよび３０４Ｍに関するＰＰＯ１の発現レベルは低下していた。主として遺伝子発現レベルを増大させた染色体フラグメントの倍加とは異なり、染色体フラグメントの逆位は両側に新規遺伝子を作出し、従って、両側の標的おいて取種の編集事象が起こる可能性があり、転写方向の変化も同時に遺伝子発現レベルに影響を及ぼし得る。すなわち、Ｔ０世代植物は複雑なキメラであった。また、同じ植物体の一次分げつと二次分げつの間で遺伝子発現レベルの有意な違いも見られ得る。定量的ＰＣＲの結果から、ＰＰＯ１逆位事象はＰＰＯ１遺伝子発現レベルを高めるより高い可能性を示し、従って、逆位事象に関する除草剤抵抗性選抜によってＰＰＯ１の発現レベルが高い除草剤抵抗性系統が選抜できることが見て取れる。

上記の結果は、プロトプラストにおいて有効な染色体フラグメント逆位を検出するスキームに従って、アグロバクテリウム形質転換および組織培養中に複数回の分子同定によって逆位事象を有するカルスおよび形質転換実生が選抜でき、形質転換体実生に生じた新規ＰＰＯ１遺伝子に融合されたＣＰ１２の強力なプロモーターが実際にＰＰＯ１遺伝子の発現レベルを高めることができ、これが植物にＰＰＯ阻害性除草剤２０８１に対する抵抗性を付与でき、それにより、内因性ＰＰＯ遺伝子がノックアップされた除草剤抵抗性イネが作出されたことを実証した。これを例に取ると、実施例４および実施例５の染色体フラグメント逆位プロトコールはまた、遺伝子発現パターンが導入および必要なプロモーターとの融合（それにより新規遺伝子が作出できる）によって変化される必要がある他の内因性遺伝子にも当てはまり、所望の遺伝子発現パターンを有する新規品種は植物におけるアグロバクテリウムを介した形質転換によって作出することができる。

実施例６：染色体フラグメント逆位によって内因性ＰＰＯ１遺伝子の発現がノックアップされた除草剤抵抗性イネ系統のＴ１世代植物の分子検出および除草剤抵抗性試験
図１４に示されるように、野生型イネゲノムＰＰＯ１遺伝子とＣＰ１２遺伝子の間の物理的距離は９１１ｋｂであり、ＣＰ１２プロモーター駆動ＰＰＯ１ＣＤＳ領域を有する高発現ＰＰＯ１遺伝子は、２つの遺伝子の間の染色体フラグメントの逆位の日に右側に生じた。染色体フラグメントの欠失も起こる場合があった。新規遺伝子が安定に遺伝し得るかどうかおよび遺伝的安定性に対する染色体フラグメント逆位の影響を試験するために、ＰＰＯ１逆位系統のＴ１世代に対して分子検出および除草剤抵抗性試験を行った。

まず第１に、総ての陽性Ｔ０系統が正常に種子を生産することができたことから、逆位事象がＴ０世代植物の稔性に及ぼす大きな影響は無かったことが認められた。ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５バックグラウンドを有するＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１系統のＴ１世代を検出のために選択した。

１．サンプル調製：
ＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１に関して、合計４８のＴ１実生を植え付けた。総ての植物が正常に生育した。

２．ＰＣＲ分子同定：
１）検出プライマー配列：５’－３’

２）上記プライマーの結合部位を図１４に示し、染色体フラグメントの逆位後の右ＣＰ１２プロモーターとＰＰＯ１コード領域の融合フラグメントを検出するためにＰＰＯ－Ｒ２＋ＣＰ－Ｒ２を使用し、生成物の長さは５０７ｂｐであり；染色体フラグメントの逆位後の左ＰＰＯ１プロモーターとＣＰ１２コード領域の融合フラグメントを検出するためにＰＰＯ－Ｆ２＋ＣＰ－Ｆ２を使用し、生成物の長さは５６０ｂｐであり；逆位前の左ＰＰＯ標的部位を検出ためにＰＰＯ－Ｆ２＋ＰＰＯ－Ｒ２を使用し、野生型対照における生成物の長さは５８６ｂｐであり；逆位前の右ＣＰ１２標的部位を検出するためにＣＰ－Ｆ２＋ＣＰ－Ｒ２を使用し、野生型対照における生成物の長さは４８１ｂｐであった。編集ベクターのＴ－ＤＮＡフラグメントを検出するためにｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆを使用し、生成物の長さは６６０ｂｐであった。

３）ＰＣＲ反応系および反応条件：

ＰＣＲ産物に、１８０Ｖの電圧で１０分間、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。

３．分子検出結果：
検出結果を表９に示した。合計４８個体の植物を検出し、そのうち１２個体の植物（２／７／１１／１６／２６／３６／３７／４０／４１／４４／４６／４７）は逆位の同型接合であり、２１個体の植物（１／３／４／５／６／８／９／１５／１７／２０／２２／２３／２４／２７／３０／３１／３３／３４／３９／４２／４３）は逆位の異型接合であり、１５個体の植物（１０／１２／１３／１４／１８／１９／２１／２５／２８／２９／３２／３５／３８／４５／４８）は非逆位の同型接合であった。同型接合逆位：異型接合逆位：同型接合非逆位の割合は１：１．７５：１．２５、およそ１：２：１であった。従って、この検出結果はメンデルの法則に従い、逆位によって生じた新規ＰＰＯ１遺伝子が遺伝可能であったことを示す。

上記のＴ１実生に関して、編集ベクターのＴ－ＤＮＡフラグメント検出するためにＰｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆプライマーを使用した。１６および４１の電気泳動結果はＴ－ＤＮＡフラグメント陰性であり、同型接合逆位を示す。逆位事象のＴ１世代から同型接合逆位の非トランスジェニック系統が分離可能であることが認められた。

４．編集事象の配列決定検出：
逆位事象の遺伝子型検出は、右側の新規ＰＰＯ遺伝子の編集事象に着目するものであった。これらの突然変異事象はＰＰＯ１遺伝子の完全なタンパク質コードフレームとともに保持された。温室および圃場での表現型観察によって植物の正常な生長に影響を及ぼさなかった左側のＣＰ１２部位編集事象が保持された。逆位事象陽性系統で検出された編集事象の遺伝子型を以下に列挙するが、シームレスは逆位後の推定融合フラグメント配列と同一であることを示した。ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５バックグラウンドの、成功したＱＹ２２３４逆位事象の遺伝子型は次の通りであった。

シーケンシングピークマップおよび配列比較結果のいくつかを図２０に示した。

Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンドの、成功したＱＹ２２３４逆位の遺伝子型は次の通りであった。

シーケンシングピークマップおよび配列比較結果のいくつかを図２１に示した。

ＣＰ１２プロモーターがＰＰＯ１コード領域に融合された上記の異なる新規ＰＰＯ１遺伝子の配列決定結果を配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示した。

５．Ｔ１世代実生の除草剤抵抗性試験：
実生段階のＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１ＰＰＯ１逆位系統のＴ１世代に対して除草剤抵抗性試験行った。野生型ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５を対照として用い、逆位系統のＴ１世代種子と同時に植え付けた。実生が草丈１５ｃｍに達した際に、２０８１を０．３、０．６、０．９および１．２ｇａ．ｉ．／ｍｕの４種類のレベルで噴霧することによって施与した。栽培条件は２８℃、１６時間明期、８時間暗期とした。

抵抗性試験結果を図２２に示した。５日間の施与後、野生型対照イネ実生は０．３ｇａ．ｉ．／ｍｕの用量で明らかな植物毒性を示した。それらは葉の先端から萎凋し始め、葉に壊死斑が現れ、０．６ｇａ．ｉ．／ｍｕの用量では、植物はすぐに枯死した。しかしながら、ＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１Ｔ１実生は０．３ｇａ．ｉ．／ｍｕの用量で正常な生長を維持し、葉に明らかな植物毒性は見られず、０．６および０．９ｇａｉ／ｍｕの用量では、一部のＴ１実生は葉の先端に乾燥を示したが、ほとんどのＴ１実生は緑色を維持し、生長し続けることができ、一方、対照は実質的に枯死した。１．２ｇａ．ｉ．／ｍｕの用量では、対照植物は総て枯死したが、Ｔ１実生の一部は緑色を維持し、生長し続けることができた。これらの試験結果は、ＰＰＯ１遺伝子逆位系統の、２０８１に対する抵抗性はＴ１世代に安定に遺伝し得ることを示した。

実施例７：植物において内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法
ＥＰＳＰＳは、植物における芳香族アミノ酸合成経路の重要な酵素であり、殺生物除草剤グリホセート標的部位であった。ＥＰＳＰＳ遺伝子の高い発現レベルは植物にグリホセート抵抗性を付与することができる。ＥＰＳＰＳ遺伝子（配列番号４に示される通り、１～１８９７ｂｐはプロモーターであり、残りは発現領域であった）は、イネの第６染色体上にあった。上流の遺伝子は、反対の方向のトランスケトラーゼ（ＴＫＴ、配列番号３に示される通り、１～２０９１ｂｐはプロモーターであり、残りは発現領域であった）であった。葉のＴＫＴ遺伝子の発現強度は、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現強度の２０～５０倍であった。図２に示されるように、２つの遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間に同時にそれぞれ二本鎖切断を誘導すると、スクリーニングの後に、これらの２つの切断の間の領域の逆位（スキーム１）または逆位倍加（スキーム２）を見出すことができた。両場合とも、ＥＰＳＰＳ遺伝子のプロモーターはＴＫＴ遺伝子のプロモーターに置き換わり、それにより、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現レベルが高まり、グリホセートに対する抵抗性が得られる。さらに、図２に示されるようにスキーム３、４および５もまた、ＴＫＴ遺伝子プロモーターによって駆動される新規ＥＰＳＰＳ遺伝子を作出することができた。ＴＫＴに隣接し、ＴＫＴと方向が反対のＥＰＳＰＳの遺伝子構造は、単子葉植物で保存されていた（表１０）。一方、双子葉植物でも、両遺伝子は隣接しているが、同じ配向であり、従って、この方法は植物において普遍的なものであった。

この目的で、骨格としてｐＨＵＥ４１１を、標的として以下を使用した。

いくつかの異なる二重標的ベクターを構築した:

（２）以下の表に示した適切な検出プライマーを用い、両側に標的部位を含むフラグメントまたはＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤコード領域の融合によって生じた推定フラグメントを増幅した。なお、生成物の長さは３００～１０００ｂｐである。

プロトプラスト形質転換後、検出結果は、予想された逆位事象が得られたことを示した。図１５に示されるように、ｐＱＹ００２０６２ベクターで形質転換したプロトプラストの逆位検出の配列決定結果を配列番号１１に示し、ＱＹ００２０６２ベクターで形質転換したプロトプラストの欠失検出の配列決定結果を配列番号１２に示し、ｐＱＹ００２０９３ベクターで形質転換したプロトプラストの逆位検出の配列決定結果を配列番号１３に示し、ｐＱＹ００２０９３ベクターで形質転換したプロトプラストの欠失検出の配列決定結果を配列番号１４に示した。

これらのベクターを、イネのカルスを形質転換するためにアグロバクテリウムに導入した。新規ＥＰＳＰＳ遺伝子を含む植物が得られた。除草剤生物検定法の結果は、植物がグリホセート除草剤に対する明らかな抵抗性を有したことを示した。

実施例８：アラビドプシスにおいて内因性ＰＰＯ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）は、除草剤の主要な標的の１つであった。植物内因性ＰＰＯの高発現により、ＰＰＯ阻害性除草剤に対する抵抗性は有意に増強することができた。アラビドプシスＰＰＯ遺伝子（配列番号１に示される通り、１～２０５８ｂｐはプロモーターであり、残りは発現領域であった）は第４染色体に位置し、ユビキチン１０遺伝子（配列番号２に示される通り、１～２０７８ｂｐはプロモーターであり、残りは発現領域であった）は、ＰＰＯ遺伝子と同じ配向で１．９Ｍ下流に位置した。

図３に示されるようなスキームに示されるように、ＰＰＯ遺伝子およびユビキチン１０遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の部位にそれぞれ同時に二本鎖切断を作出すること。これら２つの切断間の領域の倍加事象はスクリーニングによって、すなわち、ユビキチン１０プロモーターとＰＰＯコード領域を融合することによって作出された新規遺伝子によって得ることができた。さらに、図１に示されるようなスキーム２に従い、ユビキチン１０プロモーターおよびＰＰＯコード領域が相互に融合された新規遺伝子も作出可能であった。

この目的で、ｐＨＥＥ４０１Ｅを骨格として使用し(https://www.addgene.org/71287/)、以下の部位を標的部位として使用した。

二重標的ベクターを"Wang ZP, Xing HL, Dong L, Zhang HY, Han CY, Wang XC, Chen QJ. Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a single generation. Genome Biol . 2015 Jul 21;16:144."によって記載されている方法に従って構築した。

アラビドプシスを以下のような方法に従って形質転換した。
（１）アグロバクテリウム形質転換
アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞を組換えプラスミドで形質転換して組換えアグロバクテリウムを得た。

（２）アグロバクテリウム感染溶液の調製
１）活性化させたアグロバクテリウムを３０ｍｌのＹＥＰ液体培地（２５ｍｇ／ＬＲｉｆおよび５０ｍｇ／ＬＫａｎ含有）に植え込み、２８℃、２００ｒｐｍでの振盪下で一晩、ＯＤ６００値が約１．０～１．５となるまで培養した。
２）細菌を６０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって集め、上清を廃棄した。
３）細菌を感染溶液（ｐＨを調整する必要はない）に再懸濁させて、後の使用のためＯＤ６００＝０．８とした。

（３）アラビドプシスの形質転換
１）植物形質転換の前に、植物が密な花序を持ち、ストレス応答が無く、十分に生育していなければならない。最初の形質転換は、草丈が２０ｃｍに達する限り行うことができた。土壌が乾燥した際に適宜灌水を行った。形質転換の１日間に、生育した長角果をハサミで切り取った。
２）形質転換させる植物の花序を上記の溶液中に、穏やかに撹拌しながら３０秒～１分間浸漬した。浸潤した植物はその上に液体の薄層を有していなければならない。
３）形質転換後、植物を２４時間暗所で培養した後、生育のために通常の明所環境に取り出した。
４）１週間後、２回目の形質転換を同様に行った。

（４）採種
種子が成熟した際に採種した。採種した種子は、３７℃のオーブンで約１週間乾燥させた。

（５）トランスジェニック植物の選択
種子を殺菌剤で５分間処理し、ｄｄＨ_２Ｏで５分間洗浄した後、ＭＳ選択培地（３０μｇ／ｍｌＨｙｇ、１００μｇ／ｍｌＣｅｆを含有）上に平らに拡げた。次に、培養のためにその培地を明所インキュベーター（温度２２℃、１６時間明期、８時間暗期、光度１００～１５０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ、湿度７５％）に入れた。陽性実生が選択され、１週間後に土壌に移植した。

（６）Ｔ１突然変異植物の検出
（６．１）ゲノムＤＮＡの抽出
１）約２００ｍｇのアラビドプシス葉を切り取り、２ｍｌの遠沈管に入れた。鋼球を加え、葉をハイスループット組織破壊機で摩砕した。
２）十分に摩砕した後、４００μＬのＳＤＳ抽出バッファーを加え、転倒させて混合した。混合物を６５℃の湯浴で１５分インキュベートし、期間中５分毎に転倒させて混合した。
３）混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
４）３００μＬの上清を取り出し、新しい１．５ｍｌの遠沈管に移し、－２０℃に予冷した等容量のイソプロパノールを遠沈管に加えた後、遠沈管を－２０℃で１時間または一晩維持した。
５）混合物を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６）５００μＬの７０％エタノールを遠沈管に加えて沈澱を洗浄し、洗浄溶液を遠心分離後に廃棄した（沈澱を廃棄しないように注意）。沈澱を室温で乾燥した後、３０μＬのｄｄＨ_２Ｏを加えてＤＮＡを溶解させ、その後、－２０℃で保存した。

（６．２）ＰＣＲ増幅
抽出したＴ１植物のゲノムを鋳型として用い、標的フラグメントを検出プライマーで増幅した。５μＬの増幅生成物を採取し、１％アガロースゲル電気泳動によって検出した後、ゲルイメージャーによって画像化した。残りの生成物はそのままシーケンシング会社によって配列決定された。

配列決定結果は、アラビドプシス中にＡｔＰＰＯ１遺伝子倍加が上手く形成されていたことを示し、除草剤抵抗性試験は、この倍加植物がＰＰＯ除草剤に対して抵抗性を有していたことを示した。

実施例９：ゼブラフィッシュにおける新規発現特徴を有するＧＨ１遺伝子の作出
ゼブラフィッシュの生長ホルモン（ＧＨ）遺伝子は成長および発達速度を制御していた。現在では、タイセイヨウサケにおいてトランスジェニック技術によりＧＨ遺伝子を高発現させることで、成長速度を著しく高めることができる。この技術には多大な経済的価値があったが、数十年後の市場が承認されたにすぎない。ＧＨ１遺伝子はゼブラフィッシュの生長ホルモン遺伝子であった。本発明では、成長の速い魚類品種を作出するために、ゼブラフィッシュの好適なプロモーター（継続的発現、強度、および組織特異性に関して好適）を、欠失、逆位、倍加、逆位倍加、染色体導入などによってｉｎｖｉｖｏにおいて一緒に融合した。

本明細書に記載されている総ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が個々に具体的に引用することにより本明細書の一部とされるかのように、引用することにより本明細書の一部とされる。

明瞭な理解のため、実施例および実施形態により本発明をより詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および改変が実施可能であることは明らかであり、このような変更および改変は総て本発明の範囲にある。

Claims

生物内に新規遺伝子を作出するための方法であって、以下の工程：前記生物のゲノム中の２つ以上の異なる特定の部位に同時にＤＮＡ切断を作出し、前記特定の部位は、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離し得るゲノム部位であり、前記ＤＮＡ切断は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復によって互いに連結される、元のゲノム配列とは異なる種々の遺伝要素または種々のタンパク質ドメインの新規組合せを作出し、それにより、新たな遺伝子を作出する工程を含んでなる、方法。
前記２つ以上の異なる特定の部位が同じ染色体上または異なる染色体上にある、請求項１に記載の方法。
前記２つ以上の異なる特定の部位が少なくとも２つの異なる遺伝子上の特定の部位であり得るか、または同じ遺伝子上の少なくとも２つの異なる特定の部位であり得る、請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも２つの異なる遺伝子が同じ転写方向であっても異なる転写方向であってもよい、請求項３に記載の方法。
前記ＤＮＡ切断が、標的特性を有するヌクレアーゼを前記生物の細胞に送達して前記ゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させることによって達成される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記標的特性を有するヌクレアーゼがメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
前記標的特性を有するヌクレアーゼがＤＮＡの形態である、請求項５または６に記載の方法。
前記標的特性を有するヌクレアーゼがｍＲＮＡまたはタンパク質の形態であって、ＤＮＡではない、請求項５または６に記載の方法。
前記標的特性を有するヌクレアーゼが１）ＰＥＧを介した細胞トランスフェクション法；２）リポソームを介した細胞トランスフェクション法；３）電気ショック形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子ガン衝撃；または６）アグロバクテリウムを介した形質転換法によって細胞に送達される、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
前記遺伝子要素がプロモーター、５’非翻訳領域、コード領域または非コードＲＮＡ領域、３’非翻訳領域、遺伝子のターミネーター、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記異なる遺伝子要素の組合せが、異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターと他方の遺伝子のコード領域または非コードＲＮＡ領域との組合せである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記異なる遺伝子要素の組合せにおいて、一方の要素が前記生物の強い内因性プロモーターであり、他方がＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯまたはＧＨ１遺伝子のコード領域である、請求項１１に記載の方法。
前記異なる遺伝子要素の組合せが、異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域と他方の遺伝子のＣＤＳまたは非コードＲＮＡ領域との組合せである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記異なる発現パターンが遺伝子発現の異なるレベルである、請求項１１または１３に記載の方法。
前記異なる発現パターンが遺伝子発現の異なる組織特異性である、請求項１１または１３に記載の方法。
前記異なる発現パターンが遺伝子発現の異なる発達段階特異性である、請求項１１または１３に記載の方法。
前記異なる遺伝子要素の組合せが同じ遺伝子の隣接する遺伝子要素の組合せである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質ドメインが、タンパク質の特定の機能的ドメイン；好ましくは、限定するものではないが、核局在シグナル、葉緑体リーディングペプチド、ミトコンドリアリーディングペプチド、リン酸化部位、メチル化部位、膜貫通ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、受容体活性化ドメイン，または酵素触媒中心に相当するＤＮＡフラグメントである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記異なるタンパク質ドメインの組合せが、異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質の一方の局在シグナル領域と他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域との組合せである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
異なる細胞内部位が核部位、細胞質部位、細胞膜部位、葉緑体部位、ミトコンドリア部位、および小胞体膜部位からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
前記異なるタンパク質ドメインの組合せが異なる生物学的機能を有する２つのタンパク質ドメインの組合せである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記異なる生物学的機能が特定のＤＮＡまたはＲＮＡ保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドとの結合、低分子シグナルとの結合、イオンとの結合、特定の酵素反応、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
前記異なるタンパク質ドメインの組合せが同じ遺伝子の隣接するタンパク質ドメインの組合せである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記遺伝子要素とタンパク質ドメインの組合せが、同じ遺伝子のタンパク質ドメインと隣接するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはターミネーターとの組合せである、請求項１～１０および１８のいずれか一項に記載の方法。
前記生物が動物、植物または真菌である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる新規遺伝子。
元の遺伝子に比べて、新規遺伝子は異なるプロモーターを有し、従って、異なる時空間的特徴もしくは異なる強度特徴もしくは異なる発達段階特徴で発現されるか、または新規アミノ酸配列を有し、好ましくは、「新規アミノ酸配列」は、２つ以上の遺伝子コード領域の全体的融合もしくはコード領域の部分的融合または同じ遺伝子のタンパク質コード領域の一部の倍加のいずれかであり得る、請求項２６に記載の新規遺伝子。
新規遺伝子が生物内の高発現内因性ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯまたはＧＨ１遺伝子である、請求項２６または２７に記載の新規遺伝子。
請求項２６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子を含むＤＮＡ。
請求項２６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質、またはその生物学的に有効なフラグメント。
請求項２６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる，組換え発現ベクター。
請求項２６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子を含んでなる、発現カセット。
請求項３２に記載の発現カセットを含んでなり、好ましくは、植物細胞、動物細胞または真菌細胞である、宿主細胞。
請求項３３に記載の宿主細胞から再生された生物。
生物の抵抗性／耐性形質または成長有利形質の付与または改善における請求項２６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子の使用。
（ａ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターおよび他方の遺伝子のコード領域もしくは非コードＲＮＡ領域；
（ｂ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方のプロモーターから５’非翻訳領域までおよび他方の遺伝子のコード領域もしくは非コードＲＮＡ領域；
（ｃ）同じ遺伝子内の隣接する遺伝子要素；
（ｄ）異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質コード遺伝子の一方の局在シグナル領域および他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域；
（ｅ）異なる生物学的機能を有する２つのタンパク質ドメイン；
（ｆ）同じ遺伝子内の隣接するタンパク質ドメイン；または
（ｇ）タンパク質ドメインおよび同じ遺伝子内の隣接するプロモーター、５’非翻訳領域、３’非コード領域またはターミネーター
を含んでなる、組成物。
前記異なる発現パターンが遺伝子発現の異なるレベルである、請求項３６に記載の組成物。
前記異なる発現パターンが遺伝子発現の異なる組織特異性である、請求項３６に記載の組成物。
前記異なる発現パターンが遺伝子発現の異なる発達段階特異性である、請求項３６に記載の組成物。
前記異なる細胞内部位が核部位、細胞質部位、細胞膜部位、葉緑体部位、ミトコンドリア部位、小胞体膜部位、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の組成物。
前記異なる生物学的機能が特定のＤＮＡまたはＲＮＡ保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドとの結合、低分子シグナルとの結合、イオンとの結合、特定の酵素反応、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の組成物。
ｉｎｖｉｖｏで融合される、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の組成物。
生物内の標的内因性遺伝子の遺伝子発現レベルを増強するための、外因性ＤＮＡドナーフラグメントに依存しない編集方法であって、以下の工程：標的内因性遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子のそれぞれのプロモーターとコード領域の間の選択された部位に別個にＤＮＡ切断を同時に作出する工程；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復の手段によって前記ＤＮＡ切断を互いに連結し、それにより、標的内因性遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターのｉｎｖｉｖｏ融合を作出して新規高発現内因性遺伝子を形成する工程を含んでなる、編集方法。
前記標的内因性遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子が同じ染色体に位置する、請求項４３に記載の編集方法。
前記標的内因性遺伝子および前記任意選択の内因性高発現遺伝子が異なる染色体に位置する、請求項４３に記載の編集方法。
植物において内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、ＨＰＰＤ遺伝子のコード領域を植物の強力な内因性プロモーターとｉｎｖｉｖｏで融合して新規高発現植物内因性ＨＰＰＤ遺伝子を形成することを含んでなる、編集方法。
以下の工程：ＨＰＰＤ遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子のそれぞれのプロモーターとコード領域の間の選択された特定の部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に作出する工程、細胞内修復経路を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、ｖｉｖｏにおいて、ＨＰＰＤ遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターの融合を作出して新規高発現ＨＰＰＤ遺伝子を形成する工程を含んでなる、請求項４６に記載の編集方法。
前記植物がイネであり、好ましくは、前記強力なプロモーターがユビキチン２遺伝子のプロモーターである、請求項４６または４７に記載の編集方法。
請求項４６～４８のいずれか一項に記載の編集方法によって得ることができる高発現植物内因性ＨＰＰＤ遺伝子。
（１）配列番号９、配列番号１０、配列番号１８もしくは配列番号１９に示されるような核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
（２）（１）に定義される配列のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列；あるいは
（３）（１）または（２）に示されるような配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子。
植物において内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、ＥＰＳＰＳ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターをｉｎｖｉｖｏにおいて融合して新規高発現植物内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を形成することを含んでなる、編集方法。
以下の工程：ＥＰＳＰＳ遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子のそれぞれのプロモーターとコード領域の間の選択された特定の部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に作出する工程、細胞内修復経路を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、ｉｎｖｉｖｏにおいてＥＰＳＰＳ遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターの融合を作出して新規高発現ＥＰＳＰＳ遺伝子を形成する工程を含んでなる、請求項５１に記載の編集方法。
前記植物がイネであり、好ましくは、前記強力なプロモーターがＴＫＴ遺伝子のプロモーターである、請求項５１または５２に記載の編集方法。
請求項５１～５３のいずれか一項に記載の編集方法によって得ることができる高発現植物内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
（１）配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４に示されるような核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
（２）（１）に定義される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列；あるいは
（３）ストリンジェント条件下で（１）または（２）に示されるような配列とハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
植物において内因性ＰＰＯ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、ＰＰＯ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターをｉｎｖｉｖｏにおいて融合して新規高発現植物内因性ＰＰＯ遺伝子を形成することを含んでなる、編集方法。
以下の工程：ＰＰＯ遺伝子および任意選択の内因性高発現遺伝子のそれぞれのプロモーターとコード領域の間の選択された特定の部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に作出する工程、細胞内修復経路を介して前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、ｉｎｖｉｖｏにおいてＰＰＯ遺伝子のコード領域と任意選択の強力な内因性プロモーターの融合を作出して新規高発現ＰＰＯ遺伝子を形成する工程を含んでなる、請求項５６に記載の編集方法。
前記植物がイネまたはアラビドプシス属であり、好ましくは、イネにおいて、前記強力なプロモーターはＣＰ１２遺伝子のプロモーターであり、アラビドプシス属において、強力なプロモーターはユビキチン１０遺伝子のプロモーターである、請求項５６または５７に記載の編集方法。
請求項５６～５８のいずれか一項に記載の編集方法によって得ることができる高発現植物内因性ＰＰＯ遺伝子。
（１）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５，もしくは配列番号２６に示されるような核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
（２）（１）に定義される配列のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列；あるいは
（３）ストリンジェント条件下で（１）または（２）に示されるような配列とハイブリダイズし得る核酸配列
から選択される配列を有する高発現イネ内因性ＰＰＯ遺伝子。
請求項４９、５０、５４、５５、５９および６０のいずれか一項に記載の遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
請求項４９、５０、５４、５５、５９および６０のいずれか一項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質またはその生物学的に有効なフラグメント。
請求項４９、５０、５４、５５、５９および６０のいずれか一項に記載の遺伝子とそれに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる、組換え発現ベクター。
請求項４９、５０、５４、５５、５９および６０のいずれか一項に記載の遺伝子を含んでなる発現カセット。
請求項６４に記載の発現カセットを含んでなる植物宿主細胞。
請求項６５に記載の植物宿主細胞から再生された植物。
除草剤に対する抵抗性または耐性が増強された植物を生産するための方法であって、請求項６５に記載の植物宿主細胞を植物体およびそれに由来する後代へと再生することを含んでなる、方法。
前記除草剤に対する抵抗性または耐性が増強された植物が、遺伝的分離によって外因性トランスジェニック成分を除去するために、前記植物宿主細胞から再生された植物を野生型植物と交雑させることによって得ることができる非トランスジェニック系統である、請求項６７に記載の方法。
請求項５０に記載の高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子、請求項５５に記載の高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子、請求項６０に記載の高発現イネ内因性ＰＰＯ遺伝子のうち１つまたは２つ以上の組合せを含んでなる、除草剤抵抗性のイネ。
非トランスジェニックである、請求項６９に記載のイネ。
植物細胞、植物組織、植物部分または植物において対応する阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性の向上における請求項４９、５０、５４、５５、５９および６０のいずれか一項に記載の遺伝子の使用。
植物の栽培地において雑草を防除するための方法であって、前記植物が請求項６６に記載の植物、請求項６７もしくは６８に記載の方法によって作製された植物，または請求項６９もしくは７０に記載のイネからなる群から選択され、ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳまたはＰＰＯ阻害性除草剤の１以上を、雑草を有効に防除するための量で栽培地に施与することを含んでなる、方法。