CN106754632B - 一种灰楸叶片原生质的制备方法 - Google Patents

一种灰楸叶片原生质的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106754632B
CN106754632B CN201611255964.6A CN201611255964A CN106754632B CN 106754632 B CN106754632 B CN 106754632B CN 201611255964 A CN201611255964 A CN 201611255964A CN 106754632 B CN106754632 B CN 106754632B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protoplast
protoplasts
enzymolysis
kalopanax
leaves
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611255964.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106754632A (zh
Inventor
麻文俊
王军辉
易飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Original Assignee
Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry filed Critical Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority to CN201611255964.6A priority Critical patent/CN106754632B/zh
Publication of CN106754632A publication Critical patent/CN106754632A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106754632B publication Critical patent/CN106754632B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种灰楸叶片原生质体的制备方法，其以灰楸组培苗幼嫩叶片为材料，通过控制纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R‑10的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解温度、酶解时间等因素，获得了灰楸叶片原生质体。本发明所述方法获得的游离原生质体数量多，活力高，可为灰楸原生质体培养及植株再生、遗传转化、体细胞杂交、原生质体融合育种等研究奠定基础。

Description

一种灰楸叶片原生质的制备方法
技术领域
本发明涉及一种灰楸叶片原生质体的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
灰楸(Catalpa fargesii)为紫葳科(Bignoniaceae)梓树属(Catalpa)高大落叶乔木，是我国传统栽培的优质珍贵用材及园林观赏树种。灰楸根系发达，生长速度快，抗风、固土能力强，耐寒耐旱，材质纹理通直、坚韧致密，是优质速生用材树种。
原生质体是植物细胞去除细胞壁后的产物，可应用于远源亲本间的融合，易于导入外源基因，同时也是研究细胞膜上蛋白质(如离子通道、水孔蛋白、信号受体等)功能的良好材料，并可为细胞间的物质运输，信息交换等的研究提供技术支撑。
目前关于灰楸的研究多集中于遗传多样性评价、优良新品种培育与高效繁育技术研究等方面，有关灰楸原生质体分离和制备方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灰楸叶片原生质体的制备方法，该制备方法简单高效，所得原生质体数量多，活性高。
本发明的技术方案为：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体存活率的测定。
本发明提供的制备原生质体的方法，具体包括以下步骤：
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成宽度不超过0.15mm的长条形，置于含1％-3％纤维素酶Onozuka RS和0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10的酶解液中，在摇床上黑暗条件下进行酶解；优选幼嫩叶片用刀片切成1.0mm×0.1mm的长条形；
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液500～700转/min离心3～7min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。
进一步，本发明方法还包括步骤：(4)原生质体的产量用血球计数板测定，重复3次，原生质体产量(个/g)＝酶液中原生质体的数量(个)/酶解所用叶条的质量(g)。
进一步，本发明方法还包括步骤：(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，原生质体存活率＝有活力的原生质体/原生质体总数×100％。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(1)所述的灰楸组培苗高度为6-8cm，选取从上往下第3-6片叶。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液组成：0.01MCaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶Onozuka RS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液配制方法为：纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10、甘露醇在溶液A中充分溶解，50℃加热10min，0.45nm滤膜过滤，静置至室温使用。溶液A的构成为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解温度为25-30℃，酶解时间为6-14h，床转速为50rpm。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的用于降解细胞壁的酶优选组合为纤维素酶Onozuka RS+离析酶Macerozyme R-10，采用国产纤维素酶+离析酶Macerozyme R-10未能获得原生质体。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，所述步骤(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，优选所述的缓冲液的配置为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，0.3-0.7M甘露醇。即酶解液中不含纤维素酶Onozuka RS+离析酶Macerozyme R-10的溶液配置。
所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其中步骤(5)所述的0.01％酚藏花红溶液用0.6M甘露醇配制而成。
本发明进一步提供一种用于灰楸叶片原生质体制备的酶解液，所述酶解液组成为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶Onozuka RS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇，余量为水。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明首次对灰楸进行原生质体的分离与纯化，将为灰楸的种质资源拓展、遗传育种、基因工程等后续研究奠定良好的物质基础。
(2)本发明通过控制纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解温度、酶解时间等因素，筛选出分离灰楸叶片原生质体最适合的条件，建立了一种简单高效的灰楸叶片原生质体制备方法。
附图说明
图1为根据实施例1得到的灰楸叶片原生质体示意图，标尺为100μm。
图2为根据实施例1得到的灰楸叶片原生质体存活率结果示意图，标尺为50μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围；在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所涉及的纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10的配比及浓度组合如下：
Figure BDA0001198911010000041
Figure BDA0001198911010000051
本发明所涉及的酶解液中甘露醇浓度如下：
0.3M，04M，0.5M，0.6M，0.7M
本发明所涉及的酶解温度如下：
25℃，28℃，30℃
本发明所涉及的酶解时间如下：
6h，8h，10h，12h，14h
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解10h。酶解液成分为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，0.5％离析酶Macerozyme R-10，0.4M甘露醇。
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。
(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为1.29×106个/g。
(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为90.65％。
实施例2
一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度25℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解12h。酶解液成分为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，2％离析酶Macerozyme R-10，0.3M甘露醇。
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。
(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为2.16×106个/g。
(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为77.45％。
实施例3
一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第5-6片的幼嫩叶片。
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度30℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解8h。酶解液成分为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，3％纤维素酶Onozuka RS，1％离析酶Macerozyme R-10，0.6M甘露醇。
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。
(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为1.18×106个/g。
(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为88.81％。
实施例4
一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第5-6片的幼嫩叶片。
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解12h。酶解液成分为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％纤维素酶Onozuka RS，2％离析酶Macerozyme R-10，0.4M甘露醇。
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。
(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为0.81×106个/g。
(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为66.64％。
实施例5
一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解6h。酶解液成分为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，1％离析酶Macerozyme R-10，0.7M甘露醇。
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。
(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为0.55×106个/g。
(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为48.32％。
实施例6
一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解14h。酶解液成分为：0.01M CaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，3％离析酶Macerozyme R-10，0.4M甘露醇。
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。
(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为1.78×106个/g。
(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为74.59％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出部分改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)样品筛选：取灰楸组培幼苗的幼嫩叶片,其中,所述的灰楸组培苗高度为6-8cm，选取从上往下第3-6片叶;
(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成宽度不超过0.15mm的长条形，置于酶解液中，在摇床上黑暗条件下进行酶解，酶解温度25-30℃；其中, 所述的酶解液组成：0.01M CaCl2，0.02MKCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶OnozukaRS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇;
(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液500～700转/min离心3～7min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：(4)原生质体的产量用血球计数板测定，重复3次，原生质体产量＝酶液中原生质体的数量/酶解所用叶条的质量；其中，原生质体产量的单位为个/克，原生质体的数量的单位为个，酶解所用叶条的质量的单位为克。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤：(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，原生质体存活率＝有活力的原生质体/原生质体总数×100％。
4.根据权利要求1所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的酶解时间为6-14h。
5.根据权利要求1所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)幼嫩叶片用刀片切成1.0mm×0.1mm的长条形，所述的摇床转速为50rpm。
6.根据权利要求1所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬。
7.根据权利要求6所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液的配制为：0.01MCaCl2，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，0.3-0.7M甘露醇。
8.根据权利要求3所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的0.01％酚藏花红溶液用0.6M甘露醇配制而成。
CN201611255964.6A 2016-12-30 2016-12-30 一种灰楸叶片原生质的制备方法 Active CN106754632B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611255964.6A CN106754632B (zh) 2016-12-30 2016-12-30 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611255964.6A CN106754632B (zh) 2016-12-30 2016-12-30 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106754632A CN106754632A (zh) 2017-05-31
CN106754632B true CN106754632B (zh) 2020-05-12

Family

ID=58953501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611255964.6A Active CN106754632B (zh) 2016-12-30 2016-12-30 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106754632B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267549B (zh) * 2017-07-06 2021-01-05 江苏省中国科学院植物研究所 一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法
CN108130323A (zh) * 2017-12-20 2018-06-08 奥明（杭州）基因科技有限公司 一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法
CN110041418A (zh) * 2019-05-23 2019-07-23 中国林业科学研究院林业研究所 灰楸CfPIP1-1水通道蛋白
CN113897328A (zh) * 2020-07-06 2022-01-07 北京市农林科学院 一种制备苋菜原生质体的方法及其应用
CN112048464B (zh) * 2020-09-21 2022-07-01 北京林业大学 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法
CN112111443A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 中国林业科学研究院林业研究所 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法
CN112251395A (zh) * 2020-10-29 2021-01-22 西南大学 一种枇杷原生质体的分离方法
CN114214305B (zh) * 2022-01-18 2023-05-09 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201508302D0 (en) * 2015-05-14 2015-06-24 Synpromics Ltd Method of screening synthetic promotors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究;赵苏州等;《安徽农业科学》;20141231;第42卷(第12期);第3479-3480页第1节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106754632A (zh) 2017-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106754632B (zh) 一种灰楸叶片原生质的制备方法
CN101617631B (zh) 花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN105145355B (zh) 毛竹原生质体培养的方法
AU2020101602A4 (en) A Method for Rapidly Preparing Stevia Leaf Protoplasts
CN103583369A (zh) 一种用于大麦小孢子培养愈伤组织诱导的培养基
CN103352023B (zh) 大麦原生质体制备及peg介导转化方法
Pati et al. Micropropagation, protoplast culture and its implications in the improvement of scented rose
CN110089426A (zh) 一种培育不结球白菜小孢子植株的方法
CN103299910B (zh) 一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法
CN105385649A (zh) 一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法
CN105219693B (zh) 一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法
CN1947496A (zh) 一种牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法
CN101401550B (zh) 诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基
CN109777764A (zh) 一种香橼叶肉原生质体的分离方法
CN110982775B (zh) 一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法
JPH0434395B2 (zh)
CN103329854A (zh) 一种大豆蚜虫均一化人工养殖方法
CN101946713B (zh) 甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法
CN104498427A (zh) 一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法
CN105018412B (zh) 一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法
JP4271598B2 (ja) トマトセルラインおよびその生産方法、並びに、トマトセルライン培養用培地
CN107216201B (zh) 一种培育香菇的印度梨形孢秸秆培养基制备方法
CN102349444B (zh) 一种辽东楤木原生质体培养方法
CN113667690B (zh) 一种快速高效的花椒转基因方法
CN114214305B (zh) 一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant