CN103299910B

CN103299910B - 一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法

Info

Publication number: CN103299910B
Application number: CN201310291166.9A
Authority: CN
Inventors: 戴雪梅; 周权男; 黄华孙; 华玉伟; 李哲; 黄天带; 孙爱花
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN103299910A

Abstract

本发明公开了一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法，包括胚性细胞悬浮系的建立、原生质体的分离和纯化、原生质体的看护培养、原生质体再生细胞克隆的继代增殖、体细胞胚的诱导及植株再生。本发明提供的橡胶树原生质体分离纯化的方法简单易行，原生质体看护培养所用的看护培养基成分大为简化，并采用橡胶树自身品种的悬浮细胞系作为看护细胞，极大降低了生产成本，而且有效提高了橡胶树原生质体分裂形成细胞克隆的频率及其后体细胞胚发生的频率。为利用原生质体融合（即体细胞杂交）和遗传转化等这些具有重大应用前景的生物技术育种方式进行橡胶树品种改良和种质创新提供良好的受体系统。

Description

一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法

技术领域

本发明属于植物组织和细胞工程领域，具体地说，涉及一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法。

背景技术

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Müll.Arg.，以下简称橡胶树）是重要的热带经济作物，所产的天然橡胶是一种不可替代的工业原料和国防战略物资。随着国民经济的发展，我国已成为世界上最大的天然橡胶消费国，年需求量达380万吨以上，而我国目前年产量不超过80万吨，自给率仅20%左右，远未达到国际安全警戒线，如不尽快采取切实有效的措施提高天然橡胶的产量，将直接威胁到国家的经济发展和国防安全。由于受气候和地理条件的局限，在我国适合橡胶树栽培的面积十分有限，无法靠扩大栽培面积来增产，只能通过改良现有品种，提高其单位面积产量来达到增产目的。现阶段我国的橡胶产业主要还是通过传统的有性杂交方式来改良品种，并以种子实生苗作为砧木，以具有优良特征的多龄树芽条作为接穗，采用芽接方式进行种植。然而有性杂交仅能转移部分核基因组，对于控制许多重要农艺性状的胞质基因组的转移无能为力，使得可利用的基因资源十分有限。此外，作为砧木来源的橡胶树种子产量低、不耐储藏且良莠不齐，使得优质砧木的筛选和利用受到很大限制。而通过建立高效的橡胶树原生质体植株再生体系，在此基础上开展橡胶树体细胞杂交育种可克服上述问题。体细胞杂交不仅可以转移核质基因组，还可以转移胞质基因组，并在一定程度上克服远缘杂交的不亲和性，而且经原生质体融合获得的体细胞杂种往往具有一定的杂种优势，其抗逆性和花粉育性介于双亲之间甚至是高于亲本，配合使用常规育种技术，有望选育出优良材料，在橡胶树接穗和砧木的改良上均具有一定的潜力。

建立高效的原生质体植株再生体系是进行体细胞杂交育种的前提和基础。国外学者于上世纪八十年代率先开展橡胶树原生质体的分离和培养研究，然而由于橡胶树原生质体的再生相当困难，而且不同品种对相同培养条件的反应存在很大差异，致使很多学者在这一研究领域上均未能成功。直至2000年Sushamakumari等首次报道了橡胶树品种PRII105的原生质体培养成功获得完整的再生植株，然而此后一直未再有其它品种的成功报道。究其原因，可能是该培养体系不太适用于橡胶树其它品种，尤其是国内橡胶树品种的原生质体再生培养，而且该培养体系存在以下不足：（1）原生质体培养采用的KPR培养基（Abdullah等，1986）成分复杂，含有多种稀有昂贵的维生素，实验成本高且配制程序繁杂；（2）采用禾本科黑麦草悬浮细胞作为看护细胞，不易获得，而且经看护培养后的橡胶树原生质体分裂形成细胞克隆的频率较低。鉴于橡胶树原生质体培养再生植株存在的上述技术瓶颈，目前我国在这一领域尚未有任何相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单易行且普遍适用于国内橡胶树品种原生质体培养植株再生的方法。

为了实现本发明的目的，本发明一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法，包括胚性细胞悬浮系的建立、原生质体的分离和纯化、原生质体的看护培养、原生质体再生细胞克隆的继代增殖、体细胞胚的诱导及植株再生。具体步骤如下：

（1）胚性细胞悬浮系的建立：挑取2～4g常规方法诱导的橡胶树未成熟花药或内珠被胚性愈伤组织，转入含20～40ml液体培养基的100ml三角瓶中，置于100rpm摇床上，28±1℃、黑暗条件下进行悬浮培养，每周继代一次，持续继代60～90天得到稳定均质的胚性悬浮细胞系。

所述的液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；液体培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

MS培养基的改良成分为：MgSO₄·7H₂O500mg·Ｌ^-1、KH₂PO₄400mg·L^-1、CaCl₂250mg·L^-1、MnSO₄·H₂O35mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O0.2mg·L^-1。

（2）原生质体的分离和纯化：取稳定均质后继代培养第3～7天的胚性悬浮细胞1～3g转至100ml三角瓶中，加入10～30ml溶解于原生质体洗涤液的酶混合物中，置于50rpm摇床上，28±1℃、黑暗条件下处理8～20h，进行原生质体的酶解分离。酶解后的混合物采用过滤离心法进行纯化，用30μm的金属网筛过滤除去未消化的大细胞团和细胞碎片，滤液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，所得的原生质体沉淀用适量原生质体洗涤液漂洗2次，离心弃上清后再用原生质体液体培养基漂洗1次，最后以适当密度悬浮于原生质体液体培养基中。

所述的原生质体洗涤液的组成为：12～18g·L^-1KCl、5～10g·L^-1CaCl₂、0.5～1g·L^-1MES和8%～12%甘露醇；原生质体洗涤液的pH5.7，过滤灭菌。

所述的酶混合物的组成为：1%～3%纤维素酶（R-10）、0.05%～0.5%果胶酶（Y-23）和0.1%～1%离析酶（R-10）。

所述的原生质体液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、1～4mg·L^-12,4-D、60～80g·L^-1葡萄糖、0.05～0.2g·L^-1MES、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；原生质体液体培养基的pH5.7，过滤灭菌。

（3）原生质体的看护培养：以继代保存于液体培养基中的橡胶树杂交品种H.brasiliensis×H.nitida的悬浮细胞系作为看护细胞，采用看护培养的方法进行橡胶树原生质体的培养。用于看护培养的含看护细胞的培养基（以下简称看护培养基）的制备方法如下：收集继代培养第3～6天的悬浮细胞，以最终浓度为3%～10%（V/V）的比例添加至经高温高压灭菌后温度降至40℃左右的看护培养基其余成分中，快速混匀分装至直径为9.5cm的培养皿，20～30ml/皿，待看护培养基凝固后在其表面覆盖一层消毒好的混合纤维素酯膜。吸取悬浮于原生质体液体培养基中、密度调整为0.1×10⁶～5×10⁶个/mL的原生质体悬液0.5～1.0ml接种至上述制备好的看护培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行看护培养45～60天，期间每两周更新一次看护培养基，直至原生质体发育成肉眼可见的细胞克隆。

所述的用于继代保存H.brasiliensis×H.nitida悬浮细胞系的液体培养基组成为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^-16-BA、0.5～1.5mg·L^-1KT、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；液体培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

所述的看护培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^-16-BA、0.5～1.5mg·L^-1KT、0.5～2mg·L^-1NAA、1～4mg·L^-12,4-D、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖、2～3g·L^-1植物凝胶和3%～10%看护细胞；看护培养基的pH5.8。

（4）原生质体再生细胞克隆的继代增殖：原生质体经看护培养45～60天后，挑取直径为2mm以上的细胞克隆转至继代培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行增殖培养，每20天继代一次。

所述的继代培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖和2～3g·L^-1植物凝胶；继代培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

（5）体细胞胚的诱导及植株再生：将继代增殖的原生质体再生细胞克隆转至体细胞胚诱导培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行体细胞胚的诱导，25～40天后开始出现白色球形胚，继续在体细胞胚诱导培养基中培养至体细胞胚发育成熟，随后将成熟的子叶形胚转至体细胞胚萌发培养基上黑暗培养，15～30天后开始抽芽长根，随后将其转至28±1℃、光照条件下继续培养，获得完整的原生质体再生植株。

所述的体细胞胚诱导培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.01～0.5mg·L^-16-BA、0.01～0.2mg·L^-1NAA、0.1～2mg·L^-1ABA、0.1～2mg·L^-1GA3、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖、2～3g·L^-1植物凝胶和1～2g·L^-1活性炭；体细胞胚诱导培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

所述的体细胞胚萌发培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^-1KT、0.1～1mg·L^-1IAA、0.1～2mg·L^-1GA3、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖、2～3g·L^-1植物凝胶和1～2g·L^-1活性炭；体细胞胚萌发培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

本发明一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法首次成功建立国内橡胶树品种的原生质体培养再生技术体系并提供一种有效提高橡胶树原生质体培养形成细胞克隆的频率及其经体细胞胚发生植株再生的方法，为利用原生质体培养和融合这一具有重大应用前景的生物技术育种方式进行橡胶树品种改良和种质创新奠定坚实的基础，填补了我国在橡胶树原生质体培养再生这一研究领域的空白。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明提供的橡胶树原生质体培养技术体系简单易行，实验成本低，且普遍适用于国内大多数栽培品种。

（2）本发明中所用的原生质体液体培养基源于分离原生质体的悬浮细胞继代培养基，原生质体看护培养基源于看护细胞的继代培养基，比起文献报道所用的KPR培养基，成分和配制过程均大为简化，生产成本大为降低。

（3）本发明采用橡胶树自身品种的悬浮细胞系作为看护细胞，其优点是容易获得，且能为橡胶树原生质体的再生培养提供相似的母体环境和必需的营养成分，更有利于橡胶树原生质体的持续分裂和进一步生长发育。

（4）本发明可为橡胶树体细胞杂交和遗传转化等生物技术育种提供良好的受体系统。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法实施时，步骤如下：

（1）胚性细胞悬浮系的建立：挑取3g橡胶树未成熟花药诱导的胚性愈伤组织，转入含30ml液体培养基的100ml三角瓶中，置于100rpm摇床上，28℃、黑暗条件下进行悬浮培养，每周继代一次，持续继代80天，得到稳定均质的悬浮细胞系。

所述的液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、1mg·L^-16-BA、1mg·L^-1NAA、1.5mg·L^-12,4-D、0.2g·L^-1天冬酰胺、0.4g·L^-1酸性水解酪蛋白、75ml·L^-1椰子水和50g·L^-1蔗糖；液体培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

MS培养基的改良成分为：MgSO₄·7H₂O500mg·L^-1、KH₂PO₄400mg·L^-1、CaCl₂250mg·L^-1、MnSO₄·H₂O35mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O0.2mg·L^-1（以下同）。

（2）原生质体的分离和纯化：以稳定均质的胚性悬浮细胞系为材料，于继代培养的第5天吸取2g悬浮细胞转至100ml三角瓶中，加入20ml溶解于原生质体洗涤液的酶混合物中，置于50rpm摇床上，28℃、黑暗条件下酶解12h。酶解后的混合物用30μm的金属网筛过滤除去未消化的大细胞团和细胞碎片，滤液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，所得原生质体沉淀用适量原生质体洗涤液漂洗2次，离心弃上清后再用原生质体液体培养基漂洗1次，最后以适当密度悬浮于原生质体液体培养基中。

所述的原生质体洗涤液的组成为：15g.L^-1KCl、7.5g·L^-1CaCl₂、1g·L^-1MES和10%甘露醇；原生质体洗涤液的pH5.7，过滤灭菌。

所述的酶混合物的组成为：1.5%纤维素酶（R-10）、0.15%果胶酶（Y-23）和0.5%离析酶（R-10）。

所述的原生质体液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、1mg·L^-16-BA、1mg·L^-1NAA、3mg·L^-12,4-D、70g·L^-1葡萄糖、0.1g·L^-1MES、75ml·L^-1椰子水和50g·L^-1蔗糖；原生质体液体培养基的pH5.7，过滤灭菌。

（3）原生质体的看护培养：以继代保存于液体培养基中的橡胶树杂交品种H.brasiliensis×H.nitida的悬浮细胞系作为看护细胞，采用看护培养的方法进行橡胶树原生质体的培养。用于看护培养的含看护细胞的培养基（以下简称看护培养基）的制备方法如下：收集继代培养第4天的H.brasiliensis×H.nitida悬浮细胞，以最终浓度为5%（V/V）的比例添加至经高温高压灭菌后温度降至40℃左右的看护培养基其余成分中，快速混匀分装至直径为9.5cm的培养皿，25ml/皿，待看护培养基凝固后在其表面覆盖一层消毒好的混合纤维素酯膜。吸取悬浮于原生质体液体培养基中、密度调整为0.5×10⁶个/ml的原生质体悬液0.8ml接种至上述制备好的看护培养基中，置于28℃、黑暗条件下进行培养，期间每两周更新一次看护培养基，直至原生质体发育成肉眼可见的再生细胞克隆。

所述的用于继代保存H.brasiliensis×H.nitida悬浮细胞系的液体培养基组成为：改良的MS基本培养基、0.5mg·L^-16-BA、1mg·L^-1KT、1mg·L^-1NAA、1mg·L^-12,4-D、0.2g·L^-1天冬酰胺、0.4g·L^-1酸性水解酪蛋白、75ml·L^-1椰子水和50g·L^-1蔗糖；液体培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

所述的看护培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5mg·L^-16-BA、1mg·L^-1KT、1mg·L^-1NAA、2mg·L^-12,4-D、50ml·L^-1椰子水、70g·L^-1蔗糖、2.5g·L^-1植物凝胶和5%看护细胞；看护培养基的pH5.8。

（4）原生质体再生细胞克隆的继代增殖：原生质体经看护培养50天后，挑取直径为2mm以上的细胞克隆转至继代培养基中，置于28℃、黑暗条件下进行增殖培养，每20天继代一次。

所述的继代培养基的组成为：改良的MS基本培养基、1mg·L^-16-BA、1mg·L^-1NAA、1.5mg·L^-12,4-D、50ml·L^-1椰子水、70g·L^-1蔗糖和2.5g·L^-1植物凝胶；继代培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

（5）体细胞胚的诱导及植株再生：将继代增殖的原生质体再生细胞克隆转至体细胞胚诱导培养基中，于28℃、黑暗条件下进行体细胞胚的诱导，30天后开始出现白色球形胚，继续在体细胞胚诱导培养基中培养至体细胞胚发育成熟，随后将成熟的子叶形胚转至体细胞胚萌发培养基上黑暗培养，20天后开始抽芽长根，随后将其转至28℃、光照条件下继续培养至其发育成完整的小植株。

所述的体细胞胚诱导培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.05mg·L^-16-BA、0.04mg·L^-1NAA、1mg·L^-1ABA、1mg·L^-1GA3、50ml·L^-1椰子水、70g·L^-1蔗糖、2.5g·L^-1植物凝胶和1.5g·L^-1活性炭；体细胞胚诱导培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

所述的体细胞胚萌发培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5mg·L^-1KT、0.5mg·L^-1IAA、1mg·L^-1GA3、50ml·L^-1椰子水、70g·L^-1蔗糖、2.5g·L^-1植物凝胶和1.5g·L^-1活性炭；体细胞胚萌发培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法，其特征在于包括胚性细胞悬浮系的建立、原生质体的分离和纯化、原生质体的看护培养、原生质体再生细胞克隆的继代增殖、体细胞胚的诱导及植株再生，步骤如下：

(1)胚性细胞悬浮系的建立：将常规方法诱导的橡胶树未成熟花药或内珠被胚性愈伤组织转入液体培养基中，置于摇床上进行悬浮培养，每周继代一次，得到稳定均质的悬浮细胞系；所述的液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；

(2)原生质体的分离和纯化：取稳定均质后继代培养第3～7天的胚性悬浮细胞1～3g转至100ml三角瓶中，加入10～30ml溶解于原生质体洗涤液的酶混合物中进行原生质体的酶解分离，酶解后采用过滤离心法进行纯化，所得的原生质体沉淀用适量原生质体洗涤液和原生质体液体培养基漂洗，最后以适当密度悬浮于原生质体液体培养基中；所述的原生质体洗涤液的组成为：12～18g·L^-1KCl、5～10g·L^-1CaCl₂、0.5～1g·L^-1MES和8％～12％甘露醇；所述的酶混合物的组成为：1％～3％纤维素酶、0.05％～0.5％果胶酶和0.1％～1％离析酶；所述的原生质体液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、1～4mg·L^-12,4-D、60～80g·L^-1葡萄糖、0.05～0.2g·L^-1MES、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；

(3)原生质体的看护培养：以继代保存于液体培养基中的橡胶树杂交品种H.brasiliensis×H.nitida的悬浮细胞系作为看护细胞，采用看护培养的方法进行橡胶树原生质体的培养，吸取悬浮于原生质体液体培养基中、密度调整为0.1×10⁶～5×10⁶个/ml的橡胶树原生质体悬液0.5～1.0ml接种至含3％～10％看护细胞的看护培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行看护培养45～60天，期间每两周更新一次看护培养基，得到肉眼可见的原生质体再生细胞克隆；所述的用于继代保存H.brasiliensis×H.nitida悬浮细胞系的液体培养基组成为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^-16-BA、0.5～1.5mg·L^-1KT、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；所述的看护培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^-16-BA、0.5～1.5mg·L^-1KT、0.5～2mg·L^-1NAA、1～4mg·L^-12,4-D、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖、2～3g·L^-1植物凝胶和3％～10％看护细胞；

(4)原生质体再生细胞克隆的继代增殖：挑取直径为2mm以上的原生质体再生细胞克隆转至继代培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行增殖培养，每20天继代一次；所述的继代培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖和2～3g·L^-1植物凝胶；

(5)体细胞胚的诱导及植株再生：将继代增殖的原生质体再生细胞克隆转至体细胞胚诱导培养基中，于28±1℃、黑暗条件下进行体细胞胚的诱导，25～40天后开始出现白色球形胚，继续在体细胞胚诱导培养基中培养至体细胞胚发育成熟，随后将成熟的子叶形胚转至体细胞胚萌发培养基上黑暗培养，15～30天后开始抽芽长根，随后将其转至28±1℃、光照条件下继续培养，获得完整的原生质体再生植株；所述的体细胞胚诱导培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.01～0.5mg·L^-16-BA、0.01～0.2mg·L^-1NAA、0.1～2mg·L^-1ABA、0.1～2mg·L^-1GA₃、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖、2～3g·L^-1植物凝胶和1～2g·L^-1活性炭；所述的体细胞胚萌发培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^-1KT、0.1～1mg·L^-1IAA、0.1～2mg·L^-1GA₃、40～60ml·L^-1椰子水、60～80g·L^-1蔗糖、2～3g·L^-1植物凝胶和1～2g·L^-1活性炭；

所述改良的MS基本培养基中的改良成分为：MgSO₄·7H₂O 500mg·L^-1、KH₂PO₄400mg·L^-1、CaCl₂250mg·L^-1、MnSO₄·H₂O 35mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.2mg·L^-1。