CN103805594B - 一种细胞杂交生产青蒿素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于它包括黄花蒿腺毛细胞的分离收集、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备、原生质体的融合、融合杂交细胞的培养、建立杂交细胞系五个步骤。本发明采用酶法分离收集黄花蒿叶片的腺毛细胞，与植物中的模式细胞株BY2细胞开展原生质体融合后进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，构建黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞的杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。本发明在实施过程中选择性高，显著提高青蒿素产率的同时大大提高了生产效率；生产条件温和易控制，具有良好的工业生产应用前景。

Description

一种细胞杂交生产青蒿素的方法

技术领域

本发明涉及植物细胞工程技术领域，特别涉及一种细胞杂交生产青蒿素的方法。

背景技术

青蒿素是从植物黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯药物，是当今疟疾治疗的最理想药物，能有效治疗对奎宁产生抗药性的疟原虫感染。青蒿素主要从黄花蒿中直接提取得到，或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黄花蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。因此黄花蒿仍是青蒿素药物生产的惟一药源。

虽然黄花蒿是世界广布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。研究证实黄花蒿中合成青蒿素的主要部位是其叶片表面的腺毛细胞。由于其合成部位的特异性，黄花蒿中青蒿素的含量仅占叶片干重的0.8％～1.4％，因此单纯从自然资源中提取时存在分离成本高、废弃物多、耗费时间、操作不可控等诸多问题。虽然已存在化学合成青蒿素的成功案例，但是由于其过程极其复杂、副产物多且产率低等原因没有得到广泛推广与应用。如果能分离出黄花蒿中青蒿素合成的特异细胞，通过细胞工程法进行发酵法生产制备青蒿素必将显著提高青蒿素的生产效率，产率也会大大提高，生产条件操作可控，同时具有生产条件温和环境友好等优势，具有广泛的应用前景。

根据本发明要解决的技术问题和本发明采用的技术方案进行专利检索，其检索结果如下。

专利1：

专利权人为大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司，申请号为2012105953048。本发明公开一种黄花蒿中富集纯化青蒿素的生产工艺，该方法为：将原料经粗粉碎后从投料斗投入，提取罐组主机旋转，将物料从机组前端向后缓慢推进，同时提取溶剂从机组末端的进液管进入提取罐内，由罐后端穿过移动的物料向前端流动，固液两相物质在这种逆向运动中充分接触，从而将药材中有效成分提取出来。药渣经出料传送器强制推动至出渣口而排出，专门的挤汁机对药渣进行挤压，将药渣申残留药液挤出药材组织，减少药渣申残留药液含量。提取效率更高、提取更完全。本发明同时选用连续萃取罐组萃取并结合硅胶柱层析法纯化，分离效果更佳。可得最高收率为0.4％，含量为95％以的青蒿素成品。

专利2：

专利权人为广州牌牌生物科技有限公司，申请号为2012100594763。本发明涉及一种从中草药黄花蒿中生产青蒿素的方法，包括粉碎、高压渗漉、连续上样、薄层硅胶吸附分离、95％乙醇结晶纯化，工艺流程简单，成本低，效益高，环保，适合工业化生产青蒿素产品。高压渗漉能提高提取率，连续上样节省步骤同时也节约了石油醚的用量，运用薄层硅胶最大上样法提高了青蒿素的吸附量和生产能力。

专利3：

专利权人为上海交通大学，申请号为2013101006814。本发明公开一种药用青蒿素的制备方法，包括如下步骤：将二氢青蒿酸通过对羧基的保护得到二氢青蒿酸衍生物，其在催化剂存在下被过氧化物氧化成相应的过氧化二氢青蒿酸衍生物，然后在酸的催化下与氧气作用下可高收率地得到目标产物青蒿素。与现有技术相比，本发明具有如下优点：所用试剂便宜易得，合成路线短，反应选择性高，制备过程对环境友好，操作及后处理简单，总收率高，适合工业化生产。

专利4：

专利权人为于荣敏，申请号为2009100380438。本发明公开了一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其步骤包括将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到植物细胞中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基；培养物用有机溶剂超声提取，提取物蒸干，得浸膏I；培养基用有机溶剂萃取，萃取液蒸干，得浸膏II；合并两浸膏，分离出青蒿素类成分。利用本法生产青蒿素具有快速、高效的特点，具有很大的工业应用前景。

通过专利文件的检索，没有发现能够破坏本发明专利新颖性的现有技术，也不存在相互结合能破坏本发明创造性的文件。

发明内容

为了解决现有技术中生产青蒿素的方法所存在的问题与缺陷，本发明提供一种细胞杂交生产青蒿素的方法。其采用酶法分离收集黄花蒿叶片的腺毛细胞，与植物中的模式细胞株BY2细胞开展原生质体融合后进行细胞培养，构建黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞的杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案为：一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1-1.5g、半纤维素酶0.5-1g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理25～40分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞。

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1-1.5g、半纤维素酶0.5-1g、蔗糖3-7g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃条件下酶解0.5-1小时；通过离心得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体。

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果。

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养。

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

所述的步骤四中筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。

综上所述，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明采用酶法分离收集黄花蒿叶片的腺毛细胞，与植物中的模式细胞株BY2细胞开展原生质体融合后进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，构建黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞的杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。本发明在实施过程中选择性高，显著提高青蒿素产率的同时大大提高了生产效率；生产条件温和易控制，具有良好的工业生产应用前景。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

实施例1：

一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1g、半纤维素酶1g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理25分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞。

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1g、半纤维素酶1g、蔗糖3g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃恒温条件下酶解0.5小时；通过离心分别得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体。

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果。

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养。筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

实施例2：

一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1.5g、半纤维素酶0.5溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理40分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞。

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1.5g、半纤维素酶0.5g、蔗糖7g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃恒温条件下酶解1小时；通过离心分别得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体。

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果。

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养。筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

实施例3：

一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1.3g、半纤维素酶0.7g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理30分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞。

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1.3g、半纤维素酶0.7g、蔗糖5g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃恒温条件下酶解0.75小时；通过离心分别得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体。

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果。

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养。筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

实施例4：

一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1.2g、半纤维素酶0.8g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理28分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞。

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1.2g、半纤维素酶0.8g、蔗糖4g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃恒温条件下酶解0.5小时；通过离心分别得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体。

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果。

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养。筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

实施例5：

一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1.4g、半纤维素酶0.6g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理35分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞。

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1.4g、半纤维素酶0.6g、蔗糖6g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃恒温条件下酶解1小时；通过离心分别得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体。

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果。

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养。筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1-1.5g、半纤维素酶0.5-1g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理25～40分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞；

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1-1.5g、半纤维素酶0.5-1g、蔗糖3-7g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃条件下酶解0.5-1小时；通过离心得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体；

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果；

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养；

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

2.根据权利要求1所述的一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于所述的步骤四中筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。