CN110257317A - 一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，包括如下步骤：S1：用标准的漂白剂在微离心管中对种子进行表面消毒；S2：将S1中的培养基转移到植物生长室内进行存放；S3：准备1.5毫升的离心管，其中离心管内放置有1毫升的酶溶液，分离叶肉原生质；S4：将预先制备的冷冻酶液加热至22℃‑25℃，并在接下来的步骤中，让它保持在室温条件下。本发明提供了一种分离技术的方案，通过实践，能够在30分钟内分离出所有三个主要的叶组织(叶肉、维管束和表皮)，并且纯度很高。
Description
技术领域
本发明涉及植物分离技术领域，尤其涉及一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法。
背景技术
在植物研究领域中，越来越多的实验表明不同组织对于同样的环境改变，会产生不同的应答。因此，有效的分离不同的植物组织，从而检验组织专一性的应答反应已是植物学研究的发展方向。目前，已经有数种分离特定细胞类型的方法，包括激光捕获微分离，使用具有组织特异性绿色荧光蛋白表达的植物来产生原生质体和活性荧光细胞分选等方法。然而激光捕获显微解剖的方法是非常复杂的，并且在处理大量的样品时存在一定困难。另一种方法是使用荧光素酶(LUC)测定启动子活性。是可以检测到叶片中单个细胞或少量细胞的生物发光，并可以在体内跟踪基因表达的动态行为。在该方法中，报道基因在轰击后瞬时表达，或在转化后稳定整合。但对于瞬时表达，主要应用于浅层组织，而深层组织比如维管束细胞就比较困难。而对于稳定转化，则很难避免不同组织的污染。过去十年出现的研究表明，对环境条件的变化有组织特异性的反应，这反映了光感受器和生物钟功能的组织特异性方面。因此人们对基因的组织特异性非常感兴趣，从叶片中获得高效的纯组织群体是非常必要的。为此，我们提出了一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法。
发明内容
本发明提出了一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，包括如下步骤：
S1：选取植物种子，用标准的漂白剂在微离心管中对种子进行表面消毒，并在0.5MS培养基上用0.5％(质量体积比)蔗糖播种种子，种子间距约0.7毫米至1厘米，将种子在4℃保存1天，并让种子在正常生长条件下等待发芽；
S2：将S1中的培养基转移到植物生长室内进行存放，且对环境进行控制，放置时间为10天，直至得到植物叶片；
S3：准备1.5毫升的离心管，其中离心管内放置有1毫升的酶溶液，分离叶肉原生质；
S4：将预先制备的冷冻酶液加热至22℃-25℃，并在接下来的步骤中，让它保持在室温条件下；
S5：用微型剪刀剪下S1中植物叶片的子叶或真叶，将上表皮贴在三叶草标签胶带上，每个样本将20-25片子叶紧密放置在一起，为了有效地剥离表皮，需保证将剥离的子叶或真叶立即将其放在胶带上，以保持子叶干燥，子叶之间必须紧密对齐在一起，然后将透明胶带贴在下表皮上，小心地将胶带拉开，剥去表皮表层细胞层；
S6：修剪去皮的植物叶片，仍然粘在标签胶带上，以去除任何多余的，使用镊子将标签胶带放入步骤S3中准备好的离心管底部，需确保附着的表面与管内的酶溶液接触，在室温下，缓慢倒置旋转离心管15-20分钟，延长这一过程将增加非叶肉细胞的污染比例，轻轻旋转离心管，是为了增加完整的叶肉原生质体的数量；
S7：使用30微米尼龙过滤器，将叶肉原生质过滤到一个新的1.5毫升离心管，并在4℃下取细胞颗粒，然后将细胞颗粒冷冻在液氮中；
S8：维管束和表皮的分离，具体步骤如下：
A、使用前，设置非接触式全自动超声破碎仪，准备1.5毫升的离心管3-4支，其中含有1毫升的酶溶液；
B、剪下60-80片新鲜的植物叶片，将植物叶片放入离心管中，且每个离心管内放置一定量的植物叶片；
C、用非接触式全自动超声破碎仪轻轻地将样品进行超声波处理，直到叶子变得透明并溶解，且溶解时间为30-60s，需定期检查非接触式全自动超声破碎仪内部的管道，并在每个循环中通过轻轻的倒置将其彻底混合；
S9：超声处理后，将离心管置于冰上，并从离心管中取出内容物，用滴管将其分散到培养皿的倒置盖上，为了便于分离组织的处理，需使用宽而浅的培养皿，在立体显微镜下，确保叶肉细胞破坏良好，维管束和表皮完整，较长时间的处理会导致组织过度破碎，而较短的处理又会使维管束和表皮粘连；
S10：在许多情况下，维管束和表皮并没有分开，该情况下，需要通过使用立体显微镜，用两支带针注射器将维管束和表皮分开，在之前的缓冲池边缘通过针尖来收集维管束或表皮组织：用一根针固定表皮，用另一根针取下维管束，将组织冷冻在针尖上的液氮中，用微型镊子将针上的组织拿下来，并把它们放进干净的试管内，重复以上步骤以获得足够的组织，即可进行荧光定量PCR分析；
S11：从分离的组织中提取核糖核酸，添加450微升的缓冲RL,到组织上，然后涡旋混匀10-20秒，涡旋混匀后，即完成对维管束、表皮和叶肉细胞的分离。
优选的，在S7中，还需将叶肉原生质使用90-110克离心5分钟，然后用1毫升微量吸液管取出上层清液，上层清液不需要完全去除，只要上层清液的重量低于100微升即可。
优选的，在S8中，离心管内的植物叶片的数量不得超过30片，否则会损害了酶溶液的缓冲能力。
优选的，在S10中，分离的组织能够在-80℃下保存数周，当分离的脉管系统和表皮在-80℃下保存时，将离心管盖在-80℃下打开30分钟，使液氮蒸发，在-80℃干燥后，关闭管道并将其保存在-80℃。
本发明提出的一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，有益效果在于：为了加快组织特异性分析，从而快速高效的叶片中分离出维管束、表皮和叶肉细胞组织。叶片组织具有不同的力学特性和细胞间的连通性；例如血管系统和表皮细胞是紧密相连的。在这些差异的基础上，通过原生质体分离叶肉，通过叶片的超声和酶消化分离维管束和表皮组织。本发明提供了一种分离技术的方案，通过实践，能够在30分钟内分离出所有三个主要的叶组织(叶肉、维管束和表皮)，并且纯度很高。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
本发明提出了一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，包括如下步骤：
S1：选取植物种子，用标准的漂白剂在微离心管中对种子进行表面消毒，并在0.5MS培养基上用0.5％(质量体积比)蔗糖播种种子，种子间距约0.7毫米至1厘米，将种子在4℃保存1天，并让种子在正常生长条件下等待发芽，MS培养基的制备方法，具体如下：
选取16克琼脂粉和10克蔗糖到1,900毫升蒸馏水中，装在2升的瓶子里，用1摩尔每升的氢氧化钾调整pH值到5.7-5.8，加入水直到2升的体积，得到培养基，将培养基在121℃高压20分钟，然后冷却至50-70℃，将培养液倒入干净的工作台上的培养皿中，该培养基可在4℃下保存至少3个月；
S2：将S1中的培养基转移到植物生长室内进行存放，且对环境进行控制，放置时间为10天，直至得到植物叶片；
S3：准备1.5毫升的离心管，其中离心管内放置有1毫升的酶溶液，分离叶肉原生质；
S4：将预先制备的冷冻酶液加热至22℃-25℃，并在接下来的步骤中，让它保持在室温条件下，冷冻酶液具体为0.75％(质量/体积比)纤维素酶'onozuka'R-10,0.25％(质量/体积比)macerozyme R-10,0.4摩尔每升的甘露醇，8毫摩尔每升的氯化钙和5毫摩尔每升的MES-氢氧化钾。使用前准备好酶液，并将其冷冻在冰上。溶液可以在4℃下储存2天；
S5：用微型剪刀剪下S1中植物叶片的子叶或真叶，将上表皮贴在三叶草标签胶带上，每个样本将20-25片子叶紧密放置在一起，为了有效地剥离表皮，需保证将剥离的子叶或真叶立即将其放在胶带上，以保持子叶干燥，子叶之间必须紧密对齐在一起，然后将透明胶带贴在下表皮上，小心地将胶带拉开，剥去表皮表层细胞层；
S6：修剪去皮的植物叶片，仍然粘在标签胶带上，以去除任何多余的，使用镊子将标签胶带放入步骤S3中准备好的离心管底部，需确保附着的表面与管内的酶溶液接触，在室温下，缓慢倒置旋转离心管15-20分钟，延长这一过程将增加非叶肉细胞的污染比例，轻轻旋转离心管，是为了增加完整的叶肉原生质体的数量；
S7：使用30微米尼龙过滤器，将叶肉原生质过滤到一个新的1.5毫升离心管，并在4℃下取细胞颗粒，然后将细胞颗粒冷冻在液氮中，还需将叶肉原生质使用90-110克离心5分钟，然后用1毫升微量吸液管取出上层清液，上层清液不需要完全去除，只要上层清液的重量低于100微升即可；
S8：维管束和表皮的分离，具体步骤如下：
A、使用前，设置非接触式全自动超声破碎仪，准备1.5毫升的离心管3-4支，其中含有1毫升的酶溶液；
B、剪下60-80片新鲜的植物叶片，将植物叶片放入离心管中，且每个离心管内放置一定量的植物叶片，且离心管内的植物叶片的数量不得超过30片，否则会损害了酶溶液的缓冲能力；
C、用非接触式全自动超声破碎仪轻轻地将样品进行超声波处理，直到叶子变得透明并溶解，且溶解时间为30-60s，需定期检查非接触式全自动超声破碎仪内部的管道，并在每个循环中通过轻轻的倒置将其彻底混合；
S9：超声处理后，将离心管置于冰上，并从离心管中取出内容物，用滴管将其分散到培养皿的倒置盖上，为了便于分离组织的处理，需使用宽而浅的培养皿，如培养皿的倒置盖。在立体显微镜下，确保叶肉细胞破坏良好，维管束和表皮完整，较长时间的处理会导致组织过度破碎，而较短的处理又会使维管束和表皮粘连；
S10：在许多情况下，维管束和表皮并没有分开，该情况下，需要通过使用立体显微镜，用两支带针注射器将维管束和表皮分开，在之前的缓冲池边缘通过针尖来收集维管束或表皮组织：用一根针固定表皮，用另一根针取下维管束，将组织冷冻在针尖上的液氮中，用微型镊子将针上的组织拿下来，并把它们放进干净的试管内，重复以上步骤以获得足够的组织，即可进行荧光定量PCR分析，分离的组织能够在-80℃下保存数周，当分离的脉管系统和表皮在-80℃下保存时，将离心管盖在-80℃下打开30分钟，使液氮蒸发，在-80℃干燥后，关闭管道并将其保存在-80℃；
S11：从分离的组织中提取核糖核酸，添加450微升的缓冲RL,到组织上，然后涡旋混匀10-20秒，涡旋混匀后，即完成对维管束、表皮和叶肉细胞的分离。
植物生长的条件:为了获得健康的植株，必须适当控制培养基条件、光质量、光量和湿度，这对成功分析基因表达至关重要。如果植物是健康的，光的质量、温度、湿度和介质组成不是主要的考虑因素。这些条件可以通过适当的控制进行实验改变，尽管我们还没有测试过可能会影响产量的极端条件。
约100粒种子可在直径为9厘米、大小为0.7毫米的培养皿上播种。如果萌发率>90％，一个培养皿可分离出叶肉、维管束、表皮和整个子叶。为了保持良好的发芽率，种子应妥善储存，并定期更新。在比较不同遗传背景下的基因表达时，应监测发芽率和生长率，以确定相同年龄和发育状况的植物。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：选取植物种子，用标准的漂白剂在微离心管中对种子进行表面消毒，并在0.5MS培养基上用0.5％(质量体积比)蔗糖播种种子，种子间距约0.7毫米至1厘米，将种子在4℃保存1天，并让种子在正常生长条件下等待发芽；
S2：将S1中的培养基转移到植物生长室内进行存放，且对环境进行控制，放置时间为10天，直至得到植物叶片；
S3：准备1.5毫升的离心管，其中离心管内放置有1毫升的酶溶液，分离叶肉原生质；
S4：将预先制备的冷冻酶液加热至22℃-25℃，并在接下来的步骤中，让它保持在室温条件下；
S5：用微型剪刀剪下S1中植物叶片的子叶或真叶，将上表皮贴在三叶草标签胶带上，每个样本将20-25片子叶紧密放置在一起，为了有效地剥离表皮，需保证将剥离的子叶或真叶立即将其放在胶带上，以保持子叶干燥，子叶之间必须紧密对齐在一起，然后将透明胶带贴在下表皮上，小心地将胶带拉开，剥去表皮表层细胞层；
S6：修剪去皮的植物叶片，仍然粘在标签胶带上，以去除任何多余的，使用镊子将标签胶带放入步骤S3中准备好的离心管底部，需确保附着的表面与管内的酶溶液接触，在室温下，缓慢倒置旋转离心管15-20分钟，延长这一过程将增加非叶肉细胞的污染比例，轻轻旋转离心管，是为了增加完整的叶肉原生质体的数量；
S7：使用30微米尼龙过滤器，将叶肉原生质过滤到一个新的1.5毫升离心管，并在4℃下取细胞颗粒，然后将细胞颗粒冷冻在液氮中；
S8：维管束和表皮的分离，具体步骤如下：
A、使用前，设置非接触式全自动超声破碎仪，准备1.5毫升的离心管3-4支，其中含有1毫升的酶溶液；
B、剪下60-80片新鲜的植物叶片，将植物叶片放入离心管中，且每个离心管内放置一定量的植物叶片；
C、用非接触式全自动超声破碎仪轻轻地将样品进行超声波处理，直到叶子变得透明并溶解，且溶解时间为30-60s，需定期检查非接触式全自动超声破碎仪内部的管道，并在每个循环中通过轻轻的倒置将其彻底混合；
S9：超声处理后，将离心管置于冰上，并从离心管中取出内容物，用滴管将其分散到培养皿的倒置盖上，为了便于分离组织的处理，需使用宽而浅的培养皿，在立体显微镜下，确保叶肉细胞破坏良好，维管束和表皮完整，较长时间的处理会导致组织过度破碎，而较短的处理又会使维管束和表皮粘连；
S10：在许多情况下，维管束和表皮并没有分开，该情况下，需要通过使用立体显微镜，用两支带针注射器将维管束和表皮分开，在之前的缓冲池边缘通过针尖来收集维管束或表皮组织：用一根针固定表皮，用另一根针取下维管束，将组织冷冻在针尖上的液氮中，用微型镊子将针上的组织拿下来，并把它们放进干净的试管内，重复以上步骤以获得足够的组织，即可进行荧光定量PCR分析；
S11：从分离的组织中提取核糖核酸，添加450微升的缓冲RL,到组织上，然后涡旋混匀10-20秒，涡旋混匀后，即完成对维管束、表皮和叶肉细胞的分离。
2.根据权利要求1所述的一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，其特征在于：在S7中，还需将叶肉原生质使用90-110克离心5分钟，然后用1毫升微量吸液管取出上层清液，上层清液不需要完全去除，只要上层清液的重量低于100微升即可。
3.根据权利要求1所述的一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，其特征在于：在S8中，离心管内的植物叶片的数量不得超过30片，否则会损害了酶溶液的缓冲能力。
4.根据权利要求1所述的一种快速从植物叶片中分离维管束、表皮和叶肉细胞的方法，其特征在于：在S10中，分离的组织能够在-80℃下保存数周，当分离的脉管系统和表皮在-80℃下保存时，将离心管盖在-80℃下打开30分钟，使液氮蒸发，在-80℃干燥后，关闭管道并将其保存在-80℃。
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|---|---|---|---|---|
| CN112900126A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-06-04 | 长江大学 | 一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法 |
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2019
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Cited By (2)
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| CN112900126A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-06-04 | 长江大学 | 一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法 |
| CN112900126B (zh) * | 2021-01-15 | 2022-06-24 | 长江大学 | 一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法 |
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