CN104542295A

CN104542295A - 一种青蒿转基因育种方法

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Publication number: CN104542295A
Application number: CN201510022107.0A
Authority: CN
Inventors: 王景雪
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: CN104542295B

Abstract

本发明提供了一种青蒿转基因育种方法，是以未成熟青蒿花序为外植体，用携带有外源基因的农杆菌菌液侵染外植体，经过2-3天的共培养，将外植体放置在加有选择压的培养基上诱导产生愈伤组织，进一步诱导成再生植株，再通过对报告基因的分子生物学检测，从再生植株中鉴定出转化植株。本发明用青蒿的未成熟花序作为外植体,与农杆菌EHA105菌株共培养具有更高的转化率，最高转化率为17.2％，比目前青蒿转基因中常用的叶片外植体转化率高8.59％。本发明不仅为青蒿遗传转化提供了一个新的转化系统，而且也为其他难以进行农杆菌转化的植物种提供了借鉴。

Description

一种青蒿转基因育种方法

技术领域

本发明涉及基因育种，具体属于一种青蒿转基因育种方法。

背景技术

疟疾是一种严重危害生命疾病，每年全世界大约有一百万人死于疟疾，并每年大约有350-500万新增病例(Graham et al.2010；Graham et al.2010；Milhous and Weina 2010)。

长期以来，青蒿就是一种用来治疗疟疾的特效药用植物。青蒿素是一种倍半萜烯内酯内过氧化物,是目前公认最有效的抗耐多药恶性疟原虫的化合物(Weina 2008；Li et al.2006)。青蒿素还具有治疗某些癌症和其他病毒性疾病和寄生虫病的能力(Efferth 2007；Efferth etal.2008；Weathers et al.2011).然而,由于青蒿植物中低青蒿素含量(占干重0.01％-0.8％)。以青蒿素为基础药物的应用受到了限制,特别是在发展中国家(Nair et al.1986；Klayman 1985)。同时，青蒿素由于结构非常复杂,一直未能实现全化学合成。虽然部分化学合成青蒿素已经实现,但是它成本较高，无法推广应用(Haynes，2006年)。目前，青蒿素的大量生产仍是基于提高栽培青蒿中青蒿素的含量。所以,利用青蒿转基因技术选育高青蒿素含量的新品系将对于青蒿素的大量生产将会起到积极作用。

青蒿转基因工作开始于1996年和1997年，所用方法是农杆菌介导法(Banerjee et al.1997；Vergauwe et al.1996年)。从那时起，研究者在青蒿的转基因方法上做了大量的工作，然而收效甚微。许多研究证明，青蒿转基因是非常困难的，因为它费力、耗时,更重要的是转化效率很低(低于10％)(Liu et al.2011年)。一些研究报道证明，青蒿的转化效率明显受到外植体类型、土壤农杆菌菌株,外植体的年龄等因素的影响(Teixeira da Silva 2003；Vergauwe et al.1998；Ghosh et al.1997)。因此，高效的青蒿转基因技术是青蒿育种迫切需要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化效率较高的青蒿转基因育种方法。

本发明提供的一种青蒿转基因育种方法，是以未成熟青蒿花序为外植体，用携带有外源基因的农杆菌菌液侵染外植体，经过2-3天的共培养，将外植体放置在加有选择压的培养基上诱导产生愈伤组织，进一步诱导成再生植株，再通过对报告基因的分子生物学检测，从再生植株中鉴定出转化植株。

具体包括如下步骤：

1)取田间生长的青蒿未成熟花序作为外植体，用50％次氯酸钠溶液消毒，用无菌蒸馏水冲洗5次，并切成1-2cm的切段，然后置于携带有质粒pCaMBIA2301的农杆菌菌液中浸泡5-30分钟,取出后用无菌滤纸去除多余的菌液，将其转移至共培养基上，培养2-3天；然后将外植体转入添加了选择压的诱导培养基中培养，直到诱导出愈伤组织和抗性芽苗，在诱导培养阶段，每隔4周继代培养一次；

2)将生长至2-3个叶片的绿色抗性芽苗转移到生根培养基中培养，诱导抗性芽苗生根，即成抗性再生植株。

所述的农杆菌为根癌农杆菌，菌株为EHA105或LBA4404，优选EHA105。

所述的农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀0.2-0.6。

所述的培养的温度维持在25±2℃，培养的光照周期为光照16h、黑暗8h。

所述的共培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.4-5.8；

所述的诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖，300mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.4-5.8；

所述的生根培养基为：以MS为基本培养基，添加0.2mg/L NAA,30g/L蔗糖,300mg/L头孢霉素,10mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.4-5.8。

本发明采用青蒿花序作为外植体进行转基因育种的方法，同样适用于其它植物花序作为外植体进行转基因育种。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1)与目前常规的农杆菌介导的青蒿转基因方法相比，本发明利用未成熟花序诱导转化细胞产生愈伤组织，并利用抗生素对转化细胞进行初步筛选，保证了转化愈伤组织的均一性。

2)本发明用青蒿的未成熟花序作为外植体,与农杆菌EHA 105菌株共培养具有更高的转化率，最高转化率为17.2％。

3)本发明不仅为青蒿遗传转化提供了一个新的转化系统，而且也为其他难以进行农杆菌转化的植物种提供了借鉴。

附图说明

图1pCaMBIA2301质粒物理图谱

图2未成熟花序外植体转化后抗性芽苗分化、生长情况，其中，A：抗性芽苗分化，B：抗性芽苗生长。

图3转基因植株和未转基因的对照植株Southern印迹杂交分析,其中，M：为分子量标记；1-7分别为不同的转基因植株AT-3、AT-10、AT-16、AT-23、AT-27、AT-32和AT-37；8为未转基因的对照植株；9为质粒pCaMBIA2301作为阳性对照。

具体实施方式

实施例1

以青蒿品种‘酉阳1号’为受体进行转基因实验。

1.试验方法：

(1)土壤农杆菌菌株培养

农杆菌菌株EHA 105，购于上海迈其生物科技有限公司。农杆菌菌株LBA4404和pCaMBIA2301(图1)质粒均购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。质粒pCaMBIA2301包含GUS基因，该基因受花叶病毒35S启动子和NOS终止子调控。pCaMBIA2301(图1)质粒用冻融法分别转入到农杆菌EHA 105菌株和LBA4404菌株中。

携带有pCaMBIA2301质粒的农杆菌EHA 105菌株和LBA4404菌株，分别接种在含有50mg/L卡那霉素,50mg/L利福平的20mL YEB培养基中。培养瓶放置在28℃恒温培养箱中过夜培养。之后取200μL培养液转接到含有50mg/L卡那霉素,50mg/L利福平的50mL YEB的无菌液体培养基中，培养温度保持在28℃，震荡培养转速为250rpm,培养到OD₆₀₀达到了0.2时，将农杆菌培养物在4000g条件下离心5分钟。去除原先的培养基，用相同体积，未加琼脂的共培养基将农杆菌沉淀物重新悬浮，制备成农杆菌菌液。

(2)植物转化和再生

在青蒿生长季取未成熟的花序作为外植体，用50％(v/v)次氯酸钠灭菌15分钟,随后用无菌蒸馏水冲洗5次。然后，将花序切成1-2cm的小段。将外植体分别浸在包含pCaMBIA 2301质粒的农杆菌EHA 105或LBA4404菌液中(OD₆₀₀＝0.4)中15分钟,然后用无菌滤纸去除多余的菌液。将侵染后的外植体放置于以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8的共培养基中共培养3天；再将外植体移入以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖，300mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.8的诱导培养基中诱导愈伤组织产生和抗性芽再生。在诱导愈伤组织和抗性芽再生阶段，每隔4周继代培养一次。待再生的抗性芽生长出第3个叶片时转移到以MS为基本培养基，添加0.2mg/L NAA,30g/L蔗糖,300mg/L头孢霉素,10mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.8的生根培养基中培养，诱导抗性芽生根，即为抗性苗再生植株。

所有的组织培养的温度维持在25±2℃，光照时间是16/8h(光/暗周期)

(3)PCR分析筛选转基因植株

用CTAB法从再生植株和未转基因植株的叶片中提取基因组DNA。使用GUS基因特异的引物：上游引物：5’GTGAATCCGCACCTCTGG-3’和

下游引物：5’-ATCGCCGCTTTGGACATA-3'，对所有样品进行PCR扩增，筛选转基因植株。

PCR扩增程序：(1)94℃预变性5分钟；(2)94℃变性30秒,53℃退火30秒,72℃延伸60秒，进行30次循环扩增。(3)72℃延伸长10分钟。引物由上海生物技术有限公司合成(上海,中国),http://www.sangon.com。

(4)Southern印迹杂交分析

对PCR扩增阳性植株，进行Southern印迹杂交分析,确认外源基因是否整合到青蒿基因组中。从转基因和未转基因的青蒿植株中提取总DNA(每个样本10μg)，使用EcoRI酶切，在0.80％琼脂糖凝胶中电泳分析。然后将DNA片段转移到HybondTM N⁺膜上(Hybond-NAmersham,www.apbiotech.com)，将质粒pCaMBIA2301的0.7kb GUS基因片段扩增,使用PCRDIG探针合成的试剂盒标记，42℃杂交过夜。用CSPD作为检测剂(www.roche.com.Germany)，膜于37℃条件下曝光。观察X光胶片的荧光信号。

GUS基因片段和探针都用PTC-200热循环仪进行PCR扩增(MJ Research,www.mjr.com)。

(5)GUS组织化学定位检测

从转基因和未转基因幼苗上取叶片，进行GUS组织化学定位检测。叶片淹没在X-gluc溶液(Merck Biosciences,Germany)中，其溶液含0.1mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值7.0),0.5mmol/L的铁氰化钾,0.5mmol/L的亚铁氰化钾,10mmol/L的EDTA,0.1％X-gluc,10％甲醇，在37℃条件下过夜染色。之后将叶片样品转移到一定梯度浓度的乙醇溶液中去除叶绿素其他色素的影响,观察叶片组织上蓝色反应。所用乙醇溶液的浓度分别为30％,50％,70％和90％。

2.实验结果：

(1)基因转化结果

本实验以生长20天的无菌苗叶片作为未成熟花序的外植体参照。分别用两个携带有相同质粒的农杆菌菌株进行共培养转化。按照上述转化方法将质粒pCaMBIA2301上的GUS基因，用农杆菌介导的方法转入到青蒿外植体中。共转化外植体1330个，得到122个抗性苗再生植株。青蒿转化后外植体的愈伤组织诱导率(出愈率)、抗性芽分化和抗性苗再生率详见表1。未成熟花序外植体转化后抗性芽苗分化、生长情况见图2。

表1.青蒿转化后出愈率、抗性芽分化和抗性苗再生率

*n表示外植体数目。

从表1可知，未成熟花序外植体与叶片外植体相比，其出愈率，抗性芽分化率和抗性苗再生率均较高。本实验中，两种外植体分别用两个菌株侵染均可诱导出愈伤组织，其愈伤组织形成的最大和最小效率分别是76.5％和65.7％。虽然在愈伤组织诱导阶段，LBA4404菌株比EHA105菌株具有更高的诱导率。但是在抗性芽分化阶段，EHA105菌株具有比LBA4404菌株更高的诱导率。最大的平均抗性芽分化率为18.07％，为以未成熟花序外植体，EHA105菌株为侵染菌株获得的。在抗性苗再生方面，EHA105菌株也优于LBA4404菌株，最大的平均抗性苗再生率为17.17％，同样也是以未成熟花序外植体，EHA105菌株为侵染菌株获得的。并且以未成熟花序为外植体比目前青蒿转基因中常用的以叶片外植体转化率高8.59％。所以选择未成熟花序为青蒿转基因的新外植体，EHA105菌株为优化的农杆菌侵染菌株。

以未成熟花序为外植体，与农杆菌EHA105和LBA4404菌株共培养，共得到的76个抗性再生植株，其中53个抗性株来源于与农杆菌EHA105菌株共培养得到。23个抗性株来源于与农杆菌LBA4404菌株共培养得到。将53个来源于未成熟花序与农杆菌EHA105菌株共培养得到的抗性株作为待测植株，进一步进行了分子检测和T₁代转基因植株分离情况调查。

(2)转基因植株分子检测结果

从53个待测植株中随机选取40个植株，提取了叶片总DNA，进行PCR扩增，其中38个植株呈阳性。在PCR阳性株中随机取7株进行Southern印迹杂交分析,7株转基因植株均呈阳性(图3)。结合抗性植株再生率，计算得到以未成熟花序为外植体与农杆菌EHA105菌株共培养转化体系的外源基因平均转化率为17.17％。

(3)转基因植株GUS组织化学定位检测结果

GUS基因在这项研究中作为报告基因，GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶的组织化学定位检测为快速检测GUS转基因提供了方便。本实验中，利用组织化学染色法对转基因植株AT-3；AT-10；AT-16；AT-27和未转基因的对照植株叶片进行了检测。结果表明：除了未转基因的对照植株叶片外,所有的转基因植株都有蓝色反应，这说明GUS基因已经整合到转基因植株基因组中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种青蒿转基因育种方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取田间生长的青蒿未成熟花序作为外植体，用50％次氯酸钠溶液消毒，用无菌蒸馏水冲洗5次，并切成1-2cm的切段，然后置于携带有质粒pCaMBIA2301的农杆菌菌液中浸泡5-30分钟,取出后用无菌滤纸去除多余的菌液，将其转移至共培养基上，培养2-3天；然后将外植体转入添加了选择压的诱导培养基中培养，直到诱导出愈伤组织和芽苗，在诱导培养阶段，每隔4周继代培养一次；

2)将生长至2-3个叶片的绿色芽苗转移到生根培养基中培养，诱导芽苗生根，即成再生植株；

所述的共培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.3mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH为5.4-5.8；

所述的生根培养基为：以MS为基本培养基，添加0.2mg/L NAA,30mg/L蔗糖,300mg/L头孢霉素,10mg/L卡那霉素和6.5g/L琼脂，pH为5.4-5.8。

2.如权利要求1所述的一种青蒿转基因育种方法，其特征在于，所述的农杆菌为根癌农杆菌。

3.如权利要求2所述的一种青蒿转基因育种方法，其特征在于，所述的根癌农杆菌的菌株为EHA105。

4.如权利要求1或2所述的一种青蒿转基因育种方法，其特征在于，所述的农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀0.2-0.6。

5.如权利要求1或2所述的一种青蒿转基因育种方法，其特征在于，所述的培养的温度维持在25±2℃，培养的光照周期为光照16h,黑暗8h。