CN101225114A - 一种培育抗虫植物的方法及其专用蛋白和基因 - Google Patents

一种培育抗虫植物的方法及其专用蛋白和基因 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培育抗虫植物的方法及其专用蛋白和基因。本发明所提供的培育抗虫植物的方法及其专用蛋白和基因，能提高植物中Vip3A杀虫蛋白的表达量，并使Vip3A杀虫蛋白转运到叶绿体中并在那里积累，进而提高这种蛋白在植物体内的含量，显著提高植物的抗虫性，同时减轻Vip3A杀虫蛋白对植物细胞正常功能的干扰作用，利于筛选到相对于受体植物农艺性状无明显变化或变化较小的抗虫转基因植物，在植物虫害的治理中将会有广阔的应用前景。

Description

一种培育抗虫植物的方法及其专用蛋白和基因
技术领域
本发明涉及一种培育抗虫植物的方法及其专用蛋白和基因。
背景技术
植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。广谱化学杀虫剂已被广泛用于控制具有重要农业意义的害虫，但带来的环境问题又阻碍了杀虫剂的进一步应用。使用生物控制各种害虫在一定情况下是可行的，最好的例子是来自革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(BacillusThruingiensis，Bt)的δ-内毒素。这种杀虫蛋白被用作生物杀虫制剂可有效地对抗许多鳞翅目害虫。但使用Bt杀虫制剂的重要限制是这种杀虫蛋白在环境中容易被降解，在生产上要重复施用，大大增加了成本从而为农业生产的实际应用带来困难，造成这些生物制剂的应用有限。
为了解决Bt杀虫蛋白生物制剂应用的局限，许多科学家经过一系列的研究，将表达Bt杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，获得一些抗虫转基因植物。然而这些杀虫蛋白虽然杀虫性高，但单个蛋白的应用只是对少数的昆虫敏感，也就是这些蛋白杀虫具有一定的限制性和特异性。Btδ-内毒素应用的限制性和特异性取决于昆虫肠内毒素的活化和其与呈现在昆虫肠上皮细胞上的特异受体结合能力。因此目前使用Btδ-内毒素等抗虫蛋白控制特定害虫的能力依赖于找到具有所需活性范围的适当δ-内毒素。
因此对自然界的各种害虫，应寻找新的抗虫蛋白基因，尤其是杀虫机制与Btδ-内毒素不同的抗虫蛋白基因。
Vip3A类杀虫蛋白是在苏云金芽孢杆菌营养生长期所产生的蛋白，它不同于Bt芽孢形成期产生的晶体毒蛋白δ-内毒素。Vip3A通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。Vip3A在昆虫肠道内被水解为四种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物(33KD)为Vip3A蛋白的毒性核心结构。Vip3A结合敏感昆虫的中肠上皮细胞，启动细胞程序性死亡，造成中肠上皮细胞的溶解导致昆虫死亡。对非敏感昆虫不产生任何病症，不会导致中肠上皮细胞的凋亡和溶解。虽然Vip3A对小地老虎(Agrotis ipsilon)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)这些敏感害虫的毒杀效果较好，需要较低的毒蛋白水平就可以达到很好的杀虫性能，但是Vip3A对一些其他主要害虫，如美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、菜蛾(Plutellaxylostella)和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)等的杀虫能力不高，需要较高的浓度才能有效地杀死害虫，对于转基因植物也要求该蛋白在植物体内的表达和积累的水平较高才能有效的进行生产应用(Liu J，Song F，Zhang J，Liu R，He K，Tan J andHuang D.Identification of Vip3A-type genes from Bacillus thuringiensis strains andcharacterization of anovel Vip3A-typegene，Letters in App lied Microbiology，2007，1-7)，否则这些低水平表达毒蛋白的转基因植物大面积种植反而加速害虫产生抗性。为了解决转Vip3A基因植物抗虫应用的难题，应从多方面着手研究，其中，如何提高该基因在植物体内表达量和高水平积累是直接决定转基因植物能否进行生产应用的关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗虫相关蛋白。
本发明所提供的抗虫相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗虫性相关的由(a)衍生的蛋白质。
序列表中序列2是一种由硫氨素合成酶1(THI1)N-端转运信号肽(TS)(82个氨基酸)和具有苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A氨基酸特征的活性杀虫蛋白(758个氨基酸)组成的融合蛋白，共由840个氨基酸组成。其中，转运信号肽(TS)的作用是使Vip3A杀虫蛋白转运到叶绿体和线粒体中并在那里积累。
为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
          表1标签的序列
  标签   残基   序列
  Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR
  Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH
  FLAG   8   DYKDDDDK
  Strep-tag II   8   WSHPQFEK
  c-myc   10   EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述抗虫相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述抗虫相关蛋白的编码基因为如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
如下1)或2)或3)所述的基因也属于本发明的保护范围：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5’末端第247-2523位；
2)其核苷酸序列如序列表中的序列3所示；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白的DNA分子。
其中，1)所述序列为不带原信号肽编码序列的优化Vip3A基因的序列；2)为带原信号肽编码序列的优化Vip3A基因的序列。
将编码杀虫蛋白Vip3A的野生型Vip3A基因进行改造后得到优化Vip3A基因，改造的方法具体可为：采用植物偏好密码子，并去除会使mRNA不稳定序列、PolyA加尾信号、和内含子剪切类似位点，同时使GC含量提高等。
含有上述任一所述基因的重组载体(克隆载体或表达载体)也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在pBin438的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分子或序列表中序列1的自5’末端第247-2523位脱氧核苷酸所示的DNA分子或序列表中序列3所示的DNA分子得到的重组表达载体。
含有上述任一所述基因的转基因细胞系或重组菌也均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗虫植物的方法。
本发明所提供的培育抗虫植物的方法，是将上述任一所述的基因导入植物细胞中，得到抗虫植物。
所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入植物细胞中，得到抗虫植物。
上述任一所述中的植物具体可为双子叶植物，优选为烟草或棉花。
本发明采用植物偏好密码子，并去除会使mRNA不稳定序列、PolyA加尾信号、和内含子剪切类似位点，同时使GC含量提高，构建了Vip3A的优化基因，还在该优化基因的5′末端融合了信号肽编码基因进而构建了融合基因TVip3A，将这两种基因分别导入植物，并进行性能检测，检测结果表明，两种基因均能提高植物中Vip3A杀虫蛋白的表达量，TVip3A基因还能使Vip3A杀虫蛋白转运到叶绿体中并在那里积累，进而提高Vip3A蛋白在植物体内的含量，显著提高植物的抗虫性，同时减轻Vip3A杀虫蛋白对植物细胞正常功能的干扰作用。进一步抗虫检测结果表明，导入融合基因TVip3A的植株的抗虫性比导入Vip3A的优化基因高，前者的试虫率在95％以上，且大部分株系的试虫死亡率为100％，后者试虫死亡率一般在85％以下，但也都在70％以上。因此利用本发明的抗虫蛋白及基因来构建抗虫植物的方法，利于筛选到相对于受体植物农艺性状无明显变化或变化较小的抗虫转基因植物，在植物虫害的治理中将会有广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组克隆载体pVip3A的构建过程。
图2为重组克隆载体pTS的构建过程。
图3为重组克隆载体pTVip3A的构建过程。
图4为植物重组表达载体pBVip的构建过程。
图5为植物重组表达载体pBTVip的构建过程。
图6为转基因烟草植株的PCR检测结果。
图7为转基因烟草植株Southern杂交检测结果
图8为转基因烟草植株的Western blot分析结果。
图9为大肠杆菌中表达的Vip3A蛋白的标准曲线。
图10为转基因烟草植株叶绿体里抗虫蛋白(Vip3A蛋白)的水平。
图11为转基因棉花植株的PCR检测结果。
图12为转基因棉花植株中叶绿体中抗虫蛋白含量的ELISA测定。
具体实施方式
实施例1、转入融合基因TVip3A的烟草植株的获得及验证基因是否整合到染色体
下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(Sambrook J等人，1989)所述进行；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自NEB公司。
一、转入融合基因TVip3A的烟草植株的获得
(一)融合基因TVip3A的获得
1、对野生型苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白编码基因(Vip3A基因)的序列进行密码子优化改造
(1)选择用于密码子优化改造的野生型Vip3A基因序列：
比较GenBank中公布的Vip3A类基因编码的氨基酸序列，主要包括AAC37036、AAW65132、AAU89707、AAL69542、AAW62286、AY074707、AY074708、AY295778、AY489126、AF500478、AY074706等，同时参考文献(SelvapandiyanA，Arora N，Rajagopal R，Jalali S K，Venkatesan T，Singh S P and Bhatnagar R K.Toxicityanalysis of N-and C-terminus-deleted vegetative insecticidal protein from Bacillusthuringiensis.Applied and Environmental Microbiology，2001，67：5855～5858；Lee MK，Walters F S，Hart H，Palekar N and Chen J S.The mode of action of the Bacillusthuringiensis vegetative insec ticidal protein Vip3A differs from that of CrylAbδ-endo-toxin(J).Applied and Environmental Microbiology，2003，69：4648～4657)中报道的序列，对以上序列进行氨基酸比对，比对结果表明Vip3A杀虫蛋白多肽主要在284位、291位、406位、742位和770位的氨基酸有所不同(分别为：Q284-K284，T291-P291，E406-G406，K742-G742，P770-S770)，对这些不同位点的比对分析后，确定了一个保守性最高的序列---Chen J等人2002年登记的序列AY074707为本发明化学合成Vip3A基因的野生型序列依据。此野生型序列的N端32个氨基酸为信号肽氨基酸序列。
(2)野生型Vip3A基因序列的密码子优化改造
对野生型Vip3A基因序列的密码子优化策略主要包括：植物喜好密码子的应用；不稳定序列的改造；GC含量的提高等。野生vip3A基因的G+C含量非常低，A+T的含量很高，一方面，如果把这些序列导入植物基因组中可能会被误认为是植物基因控制序列(已知序列的A+T含量非常高)，同时在这些天然基因中会出现A+T富含区域，类似于基因启动子中的TATA盒，会导致基因的异常转录；另一方面，在转录的mRNA中聚腺苷酸化信号序列(AAUAAA)、mRNA的剪接相关的小RNA互补序列会导致RNA不稳定。因此在设计Vip3A基因人工改造序列时的一个主要目标是提高G+C的含量。另一个目标是对整个序列进行修饰，改变DNA和转录成mRNA中出现的不稳定结构，从而保证蛋白的翻译。具体优化细则见表2、表3和表4。另外，本发明改造基因的另一个重要内容是双子叶喜欢密码子的应用，除了排除酶切位点和一些序列的修饰外，尽量应用双子叶的优选第一选择密码子。基于以上原则，对野生型vip3A基因进行改造，改造的具体方法如表2、表3、表4所示，得到vip3A优化基因。vip3A优化基因共含有2373个核苷酸，编码790个氨基酸，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中，自序列3的5′末端第1-96位核苷酸为信号肽的编码序列。
            表2双子叶和单子叶的密码子使用偏好性
氨基酸 密码子   双子叶密码子使用频率(％)   单子叶密码子使用频率(％)   野生型Vip3A基因   优化Vip3A基因
氨基酸数   密码子使用频率(％) 氨基酸数   密码子使用频率(％)
  Gly   GGG   12   21   8   16   5   10
  Gly   GGA   38   17   23   47   23   47
  Gly   GGT   34   18   12   24   10   20
  Gly   GGC   16   44   6   12   11   22
  Glu   GAG   51   75   15   27   51   93
  Glu   GAA   49   25   40   73   4   7
  Asp   GAT   58   27   45   88   16   31
  Asp   GAC   42   73   6   12   35   69
  Val   GTG   29   36   11   24   30   67
  Val   GTA   12   8   21   47   0   0
  Val   GTT   39   19   8   18   4   9
  Val   GTC   20   37   5   11   11   24
  Ala   GCG   6   22   7   22   0   0
  Ala   GCA   25   16   11   34   3   9
  Ala   GCT   42   24   12   38   19   59
  Ala   GCC   27   38   2   6   10   31
  Arg   AGG   25   26   3   18   8   47
  Arg   AGA   30   9   9   53   3   18
  Ser   AGT   14   8   19   33   0   0
  Ser   AGC   18   26   6   10   23   40
  Lys   AAG   61   86   16   24   65   98
  Lys   AAA   39   14   50   76   1   2
  Asn   AAT   45   25   58   82   4   6
  Asn   AAC   55   75   13   18   67   94
  Met   ATG   100   100   14   100   14   100
  Ile   ATA   18   11   6   10   0   0
  lIe   ATT   45   24   46   78   4   7
  Ile   ATC   37   65   7   12   55   93
  Thr   ACG   8   21   5   8   0   0
  Thr   ACA   27   14   26   42   1   2
  Thr   ACT   35   19   29   47   5   8
  Thr   ACC   30   46   2   3   56   90
  Trp   TGG   100   100   3   100   3   100
  End   TGA   33   34   0   0   0   0
  Cys   TGT   44   30   1   33   0   0
  Cys   TGC   56   70   2   67   3   100
  End   TAG   19   36   0   0   0   0
  End   TAA   48   30   1   100   1   100
  Tyr   TAT   43   21   34   92   1   3
  Tyr   TAC   57   79   3   8   36   97
  Leu   TTG   26   14   9   11   46   54
  Leu   TTA   10   3   47   55   0   0
  Phe   TTT   45   25   26   84   0   0
  Phe   ITC   55   75   5   16   31   100
  Ser   TCG   6   14   2   3   0   0
  Ser   TCA   19   11   9   16   0   0
  Ser   TCT   25   15   19   33   11   19
  Ser   TCC   18   26   3   5   24   41
  Arg   CGG   5   13   1   6   0   0
  Arg   CGA   8   4   2   12   0   0
  Arg   CGT   21   12   2   12   3   18
  Arg   CGC   11   36   0   0   3   18
  Gln   CAG   41   46   4   17   14   58
  Gln   CAA   59   54   20   83   10   42
  His   CAT   54   33   7   88   0   0
  His   CAC   46   67   1   13   8   100
  Leu   CTG   9   28   3   4   3   4
  Leu   CTA   8   9   11   13   0   0
  Leu   CTT   28   15   11   13   9   11
  Leu   CTC   19   31   4   5   27   32
  Pro   CCG   9   23   5   26   1   5
  Pro   CCA   42   34   6   32   13   68
  Pro   CCT   32   17   8   42   5   26
  Pro   CCC   17   26   0   0   0   0
                     表3Vip3A基因修改的位置和根据
  位置   改变*   根据   位置   改变   根据   位置   改变
  10   AAC/AAT   1，2，3   772   AAG/AAA   1，3   1540   CTG/CTA
  13   AAC/AAT   1，2，3   775   GAG/GAA   1，3   1543   CTT/CTG
  16   ACC/ACT   1，2   778   AAG/AAA   1，3   1546   CTC/CTA
  19   AAG/AAA   1，3   784   AAG/AAA   1，3   1549   GCC/GCA
  22   CTG/TTA   1，2，3   787   ACC/ACA   1   1552   ACC/ACA
  28   ACC/ACA   1   790   AGC/AGT   1，3   1558   TTG/TTA
  37   CTC/TTA   1，2，3   796   AGC/AGT   1，3   1564   AAC/AAT
  43   TCC/AGT   1，3，5   808   AAG/AAA   1，3   1567   AAG/AAA
  46   TTC/TTT   1，2，3   811   GTG/GTT   1   1570   GAG/GAA
  49   ATC/ATT   1   814   TAC/TAT   1，2，3   1573   ACC/ACT
  52   GAC/GAT   1，4   823   TTG/TTA   1，2，3   1576   AAG/AAA
  55   TAC/TAT   1，3   826   ATC/ATT   1   1588   CCA/CCG
  58   TTC/TTT   1，3   829   GTG/GTA   1，2，3   1594   AGC/AGT
  61   AAC/AAT   1，3   832   TTG/TTA   1，2，3   1600   TTC/TTT
  67   ATC/ATT   1，3，7   835   ACC/ACA   1，3   1603   ATC/ATT
  70   TAC/TAT   1，3，7   841   CTT/CTG   3   1609   AAC/AAT
  76   TTC/TTT   1，3   847   GCC/GCA   1   1612   ATC/ATT
  82   ACC/ACT   1   850   AAG/AAA   1，3，4   1615   GTG/GTA
  85   GGA/GGT   2，5   856   TTC/TTT   1，3   1630   ATC/ATA
  91   AAG/AAA   1，3   859   CTC/CTT   1，2   1642   AAC/AAT
  94   GAT/GAC   5，6   862   ACC/ACT   1   1645   TTG/TTA
  97   ATC/ATT   1，2   865   TTC/TTA   1，2，3   1657   AAG/AAA
  109   ATC/ATT   1，3   868   ACC/ACA   1，3   1660   GCC/GCA
  112   TTC/TTT   1，3   877   CGT/CGA   3   1663   AAC/AAT
  115   AAG/AAA   1，3   880   AAG/AAA   1，3   1666   AAC/AAT
  118   ACC/ACG   3   883   TTG/TTA   1，2，3   1672   AAC/AAT
  121   GAC/GAT   1，2   886   CTC/TTA   1，2   1675   GCT/GCG
  124   ACC/ACA   1，3   892   TTG/TTA   1，2，3   1678   TAC/TAT
  127   GGA/GGT   5   895   GCC/GCA   1   1681   GTC/GTA
  133   GAC/GAT   1   898   GAC/GAT   1，2   1687   CAC/CAT
  136   CTC/CTA   1，2，3   901   ATC/ATT   1   1690   ACC/ACA
  142   CTC/CTA   1，2，3   907   TAC/TAT   1，2，3   1702   AAC/AAT
  148   GAG/GAA   1，3   910   ACC/ACT   1   1708   ACC/ACT
  151   ATC/ATT   1   913   TCC/TCT   1，2   1711   AAG/AAA
  154   CTC/TTA   1，2   916   ATC/ATT   1，2   1717   TTG/TTA
  160   AAC/AAT   1，3   922   AAC/AAT   1，3   1720   TAC/TAT
  169   CTT/TTA   1，2，3   925   GAG/GAA   1，3   1723   CAC/CAT
  172   CTC/CTA   1，2，3   928   CAC/CAT   1，7   1738   GGT/GGA
  175   AAC/AAT   1，3   931   TTG/TTA   1，2，3，7   1741   ATC/ATT
  178   GAC/GAT   1，2   934   AAC/AAT   1，2，3   1744   TCC/TCA
  181   ATC/ATT   1   940   GAG/GAA   1，3   1747   CAG/CAA
  184   TCC/TCT   1   943   AAG/AAA   1，3   1750   TTC/TTT
  187   GGC/GGT   1，2，8   949   GAG/GAA   1，3，7   1753   ATC/ATT
  190   AAG/AAA   1，3   952   TTC/TTT   1，2，3，7   1765   TTG/TTA
  196   GAC/GAT   1   955   AGG/AGA   1   1768   AAG/AAA
  199   GGA/GGG   3，5   958   GTG/GTA   1，2，3   1771   CCA/CCG
  205   AAC/AAT   1，3   973   ACC/ACA   1，3   1774   AAG/AAA
  214   CTC/TTA   1，2，4   979   TCC/TCT   1，2   1783   TAC/TAT
  217   AAC/AAT   1，3   982   AAC/AAT   1，2，3   1786   GTG/GTA
  220   GAC/GAT   1   985   ACC/ACT   1   1795   TAC/TAT
  223   CTC/CTT   1，2   988   TTC/TTT   1，3   1798   ACC/ACT
  229   GCC/GCA   1   991   TCC/TCT   1，2   1801   GTG/GTT
  241   TTG/TTA   1，2，3   994   AAC/AAT   1，3   1804   AAG/AAA
  244   AAC/AAT   1，2，3   1000   AAC/AAT   1，3   1810   AAG/AAA
  247   ACC/ACA   1   1003   TAC/TAT   1，3   1813   CCA/CCT
  250   GAG/GAA   1，3   1006   GCT/GCA   3   1816   TCC/TCT
  253   CTT/TTA   1，2，3   1009   AAG/AAA   1，3   1819   ATC/ATT
  256   TCC/TCT   1，2   1015   AAG/AAA   1，3   1822   CAC/CAT
  262   GAG/GAA   1，3   1021   AGC/AGT   1，3   1825   TTG/TTA
  265   ATC/ATA   1，2   1024   GAC/GAT   1   1828   AAG/AAA
  268   TTG/TTA   1，2，3   1033   GCC/GCA   1   1831   GAC/GAT
  271   AAG/AAA   1，3   1042   ATC/ATT   1   1834   GAG/GAA
  274   ATC/ATT   1   1048   GAG/GAA   1，3   1837   AAC/AAT
  280   AAC/AAT   1，3   1054   AAG/AAA   1，3   1840   ACC/ACT
  286   CAG/CAA   1   1063   CAC/CAT   1   1846   TAC/TAT
  289   AAC/AAT   1，3   1066   GCT/GCA   3   1849   ATC/ATT
  295   GTG/GTT   1   1072   ATC/ATT   1   1852   CAC/CAT
  298   TTG/TTA   1，2，3   1078   TTC/TTT   1，3   1858   GAG/GAA
  307   GTG/GTT   1，2   1081   GAG/GAA   1，3   1861   GAC/GAT
  310   AAC/AAT   1，2，3   1084   ATC/ATT   1，2   1864   ACC/ACA
  316   AAC/AAA   1   1087   AGC/AGT   1，2，3   1867   AAC/AAT
  322   GAC/GAT   1   1090   AAC/AAT   1，3   1873   AAC/AAT
  325   GCC/GCG   7   1096   TCC/TCA   1   1876   TTG/CTA
  328   ATC/ATA   1，2   1099   ATC/ATT   1，2   1879   GAG/GAA
  331   AAC/AAT   1，2，3   1102   ACC/ACA   1，3   1882   GAC/GAT
  334   ACC/ACG   3   1105   GTG/GTA   1，2，3   1885   TAC/TAT
  343   CGC/CGG   3   1108   TTG/TTA   1，2，3   1891   ACC/ACT
  346   GTG/GTA   1，2，3   1111   AAG/AAA   1，3   1894   ATC/ATT
  349   TAC/TAT   1，3   1114   GTG/GTA   1，2，3   1897   AAC/AAT
  352   CTC/CTA   1，2，3   1117   TAC/TAT   1，3   1900   AAG/AAA
  358   AAG/AAA   1，3   1129   CTC/CTA   1，2，3   1906   TTC/TTT
  361   ATC/ATT   1，2   1132   AAG/AAA   1，3   1912   ACC/ACA
  376   AGC/AGT   1，3   1138   AAC/AAT   1，3   1915   GGT/GGA
  379   GAC/GAT   1   1141   TAC/TAT   1，3   1918   ACC/ACT
  382   GTG/GTA   1，2，3   1156   GAC/GAT   1   1924   TTG/TTA
  388   AAG/AAA   1，3   1162   TTG/TTA   1，2，3   1936   TAC/TAT
  391   CAG/CAA   1   1165   TCC/TCG   1   1939   TTG/TTA
  394   AAC/AAT   1，3   1168   GAG/GAA   1，3   1942   ATC/ATT
  397   TAC/TAT   1，2，3   1171   GTG/GTT   1   1945   CTC/TTA
  400   GCT/GCG   3   1174   ATC/ATT   1，7   1948   AAG/AAA
  403   CTC/CTA   1，2，3   1177   TAC/TAT   1，3   1951   TCC/AGT
  406   TCC/AGT   1，3   1180   GGC/GGT   1   1954   CAG/CAA
  412   CAG/CAA   1   1183   GAC/GAT   1，2   1957   AAC/AAT
  415   ATC/ATA   1，2   1189   GAC/GAT   1，2   1960   GGC/GGA
  418   GAG/GAA   1，3   1192   AAG/AAA   1，3   1963   GAC/GAT
  424   TTG/TTA   1，2，3   1195   TTG/TTA   1，2，3   1966   GAG/GAA
  427   AGC/AGT   1，2，3   1207   GAC/GAT   1   1978   GAC/GAT
  430   AAG/AAA   1，3   1213   TCC/TCT   1   1984   TTC/TTT
  439   CAG/CAA   1   1216   GAG/GAA   1，3   1990   ATC/ATT
  445   ATC/ATT   1   1219   CAG/CAA   1   1996   GAG/GAA
  448   TCC/TCT   1   1225   TAC/TAT   1，3   1999   ATC/ATT
  460   GAC/GAT   1，2   1228   TAC/TAT   1，2，3   2002   AGC/AGT
  466   ATC/ATT   1，2   1231   ACC/ACA   1，3   2005   CCA/CCT
  469   AAC/AAT   1，3   1234   AAC/AAT   1，2，3   2008   TCC/TCT
  472   GTC/GTA   1，2，3   1240   ATC/ATA   1   2011   GAG/GAA
  478   GTC/GTA   1，2，3   1243   GTG/GTA   1，2，3   2017   TTG/TTA
  481   CTC/CTA   1，2，3   1246   TTC/TTT   1，3   2020   CTT/TTA
  484   ATC/ATT   1   1252   AAC/AAT   1，3   2023   AGC/AGT
  493   ACC/ACA   1，3   1255   GAG/GAA   1，3   2029   GAG/GAA
  496   CTC/CTT   1，2   1258   TAC/TAT   1，3   2032   TTG/TTA
  499   ACC/ACT   1   1261   GTT/GTA   3   2035   ATC/ATT
  502   GAG/GAA   1，3   1264   ATC/ATT   1，2   2038   AAC/AAT
  505   ATC/ATT   1，2   1267   ACC/ACT   1，2   2041   ACC/ACA
  508   ACC/ACA   1，3   1270   AAG/AAA   1，3   2044   AAC/AAT
  514   GCA/GCG   3   1273   ATC/ATT   1   2047   AAC/AAT
  517   TAC/TAT   1，3   1276   GAC/GAT   1   2053   ACC/ACG
  520   CAG/CAA   1   1285   AAG/AAA   1，3   2056   AGC/AGT
  526   ATC/ATT   1，2   1288   AAG/AAA   1，3   2059   ACC/ACG
  529   AAG/AAA   1，3   1294   AAG/AAA   1，3   2065   TCT/TCA
  532   TAC/TAT   1，3   1297   ACC/ACT   1   2071   AAC/AAT
  541   GAG/GAA   1，3   1300   TTG/TTA   1，2，3   2074   ATC/ATT
  544   AAG/AAA   1，3   1303   AGG/AGA   1   2083   AAC/AAT
  547   TTC/TTT   1，3   1306   TAC/TAT   13   2086   ACC/ACA
  553   GAG/GAA   1，3   1312   GTC/GTA   1，2，3，9   2092   ACC/ACT
  556   TTG/TTA   1，2，3   1315   ACCACA   1   2095   CTC/CTT
  559   ACC/ACT   1   1318   GCT/GCG   3   2098   TAC/TAT
  562   TTC/TTT   1，3   1321   AAC/AAT   1，3   2107   GGT/GGA
  568   ACC/ACA   1，3   1324   TTC/TTT   1，3   2110   CGT/CGA
  571   GAG/GAA   1，3   1327   TAC/TAT   1，3   2119   CTC/CTA
  574   ACC/ACT   1，2   1336   TCC/TCT   1，2   2122   AAG/AAA
  577   AGC/AGT   1，3   1339   ACC/ACA   1，3   2125   CAG/CAA
  580   TCT/TCA   3   1345   GAG/GAA   1，2，3   2131   CTC/CTT
  583   AAG/AAA   1，3   1348   ATC/ATT   1   2134   CAG/CAA
  586   GTC/GTA   1，2，3   1354   TTG/TTA   1，2，3   2137   TTG/TTA
  589   AAG/AAA   1，3   1357   AAC/AAT   1，3   2140   GAC/GAT
  604   CCA/CCT   3   1363   AAG/AAA   1，3   2143   AGC/AGT
  607   GCC/GCA   1   1369   GTG/GTA   1，2，3   2146   TTC/TTT
  610   GAC/GAT   1，2   1372   GAG/GAA   1，3   2149   TCC/TCA
  613   ATC/ATT   1   1375   TCC/TCA   1   2152   ACC/ACT
  619   GAC/GAT   1   1378   AGC/AGT   1，3   2155   TAC/TAT
  625   CTT/TTA   1，2，3   1384   GCT/GCG   3   2158   CGC/AGA
  628   ACC/ACT   1   1390   TAC/TAT   1，2，3   2164   TAC/TAT
  634   TTG/TTA   1，2，3   1393   AGG/AGA   1   2167   TTC/TTT
  637   ACC/ACT   1   1396   ACC/ACG   3   2182   GAC/GAT
  640   GAG/GAA   1，3   1399   CTC/TTA   1，2   2188   AAC/AAT
  643   TTG/TTA   1，2，3   1402   AGC/AGT   1，3   2191   GTG/GTA
  646   GCA/GCG   3   1405   AAC/AAT   1，3   2203   AAC/AAT
  649   AAG/AAA   1，3   1408   GAC/GAT   1   2212   GAG/GAA
  652   AGC/AGT   1，3   1414   GGC/GGG   3   2218   TTG/TTA
  655   GTG/GTA   1，2，3   1420   TAC/TAT   1，2，3   2221   TTC/TTT
  658   ACC/ACA   1，3   1426   CCA/CCG   3   2224   GAG/GAA
  661   AAG/AAA   1，3   1429   TTG/TTA   1，2，3   2227   AAG/AAA
  664   AAC/AAT   1，3   1444   AGC/AGT   1，3   2230   AGG/AGA
  673   GAC/GAT   1   1447   GAG/GAA   1，3   2233   TAC/TAT
  679   TTC/TTT   1，3   1450   ACC/ACA   1，3   2248   AAG/AAA
  682   GAG/GAA   1，3   1453   TTC/TTT   1，3   2260   GAG/GAA
  685   TTC/TTT   1，3   1462   CCA/CCG   3   2269   ACC/ACT
  691   CTC/CTT   1，2   1465   ATC/ATT   1   2272   ACC/ACA
  694   AAC/AAT   1，2，3   1468   AAC/AAT   1，3   2275   AAG/AAA
  697   ACC/ACA   1，3   1471   GGA/GGG   3   2278   TTC/TTT
  706   GAC/GAT   1   1474   TTC/TTT   1，3   2284   AAG/AAA
  709   GTG/GTA   1，2，3   1489   GAC/GAT   1   2287   GAC/GAT
  715   GTC/GTA   1，2，3   1492   GAG/GAA   1，3   2293   TTC/TTT
  718   GGC/GGA   1   1495   AAC/AAT   1，3   2296   TAC/TAT
  724   AAC/AAT   1，3，7   1498   AGC/TCA   1，3   2299   ATC/ATA
  727   TTC/TTA   1，2，3，7   1501   AGG/AGA   1   2305   CTC/CTT
  736   CGC/CGT   1   1504   TTG/TTA   1，2，3   2317   1，2，3
  739   TCC/TCA   1   1507   ATC/ATT   1，2   2320   AAC/AAT
  745   CTC/TTA   1，2   1510   ACC/ACT   1   2323   TTG/TTA
  748   AAG/AAA   1，3   1513   TTG/TTA   1，2，3   2326   TAC/TAT
  751   ACC/ACT   1   1516   ACC/ACA   1，3   2332   GGA/GGT
  754   GCT/GCA   3   1519   TGC/TGT   1，3   2338   ATC/ATT
  757   TCC/TCG   3   1522   AAG/AAA   1，3   2341   GTG/GTA
  760   GAG/GAA   1，3   1525   TCT/TCA   3   2344   CAC/CAT
  763   TTG/TTA   1，2，3   1528   TAC/TAT   1，3，7   2347   TTC/TTT
  766   ATC/ATT   1，2   1531   TTG/TTA   1，2，3，7   2359   TCC/TCT
  769   ACC/ACT   1，2   1537   GAG/GAA   1，3   2362   ATC/ATT
注：(1)“改变*”表示密码子改变后/密码子改变前。
(2)优化的根据如下：1、增加GC；2、消除TA；3、密码子优先；4、消除Hind III位点；5、多样性；6、增加EcoR V位点；7、去除mRNA不稳定结构；8、去除poly A加尾信号；9、去除内含子剪切类似位点。
             表4Vip3A基因优化时改造的一些结构
改造结构   类似核苷酸序列 位置 改造后序列情况
mRNA不稳定结构 attta   67，725，929，951，1173，1528，1643，1749，1823，1922，1937，2321 全部去除，见序列表中序列3
  poly A加尾信号 aataaa 1564，1897，   全部去除，见序列表中序列3
  内含子剪切类似位点 aggtaa 187，1309   全部去除，见序列表中序列3
(3)Vip3A优化基因序列的合成：
Vip3A优化基因(其核苷酸序列如序列表中序列3所示)由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
(4)Vip3A优化基因序列的验证
将合成的Vip3A优化基因序列连入克隆载体pGEM-T easy(Promega，Madison，USA，CAT：A1360)上，得到重组克隆载体pVip3A，其构建过程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6 RNA聚合酶启动子；T7为T7 RNA聚合酶启动子；MCS为多克隆位点)。
对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体中插入的Vip3A优化基因序列为序列表中序列3所示的核苷酸序列，其中，自序列3的5′末端第1-96位核苷酸为信号肽的编码序列。
2、叶绿体和线粒体中编码硫氨素合成酶1(THI1)N-端转运信号肽(TS)的DNA序列的合成
TS编码序列(其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端第1-246位核苷酸所示)是参照文献(Chabregas，S.M.Luche，D.D.Van Sluys，M.A.Menck，C.F.andSilva-Filho，M.C.Differential usage of two in-frame translational start codons regulatessubcellular localization of Arabidopsis thaliana THI1.J.Cell Sci.2003，116，285-291)报道的序列进行合成的。由申能博彩生物技术有限公司合成。
将合成的TS编码序列(序列表中序列1自5′末端第1-246位核苷酸)连入克隆载体pGEM-T easy(Promega，Madison，USA，CAT：A1360)，得到重组克隆载体pTS，其构建过程如图2所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；MCS为多克隆位点)。
对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体中插入的TS编码序列是序列表中序列1自5′末端第1-246位核苷酸。
3、融合基因TVip3A的获得
用限制性内切酶BamH I和EcoRV酶切重组克隆载体pTS和pVip3A，将得到的一个246bp大小的TS片段与酶切后的pVip3A相连接，即把TS信号肽编码序列插在5’缺少96个核苷酸的杀虫基因Vip3A优化基因的前端，构建成含有融合基因TVip3A的重组克隆载体pTVip，其构建过程如图4所示。融合基因TVip3A由2523个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示，编码氨基酸序列如序列表中序列2所示的融合蛋白，共编码840个氨基酸。
BamH I和Sal I酶切以及测序鉴定结果均表明pTVip在BamH I和Sal I位点间的核苷酸序列是序列表中的序列1，即融合基因TVip3A正确插入。
二、含有融合基因TVip3A的重组表达载体pBTVip的构建
(1)二元表达载体pBin438的构建：
二元表达载体pBin438，由带双增强子的CaMV35S启动子(DE35S)、TMV-RNAcDNA的Ω片段(来自pBR322的BamH I-Sal I片段)及Nos转录终止序列组成外源基因表达框架(李太元，田颖川，秦晓峰，莽克强，李文谷，何永刚，沈蕾.高效抗虫转基因烟草的研究.中国科学，B辑，1994，24(3)：276-282)。
(2)含有融合基因TVip3A的重组表达载体pBTVip的构建
用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切重组克隆载体pTVip和二元表达载体pBin438，将切下的融合基因TVip3A插到pBin438的BamH I和Sal I位点之间构建成重组植物表达载体pBTVip，其构建过程如图5所示(RB：右边界；NPT II：硫酸新霉素基因；DE-35SP：双增强子的CaMV35S启动子；Nos：终止子；LB：左边界)。
将重组表达载体pBTVip转化大肠杆菌DH5α(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：11319-019)后，挑选抗卡那霉素Kanamycin的阳性克隆，进行BamH I和Sal I酶切以及测序鉴定，结果表明pBTVip中在BamH I和Sal I位点间的核苷酸序列是序列表中的序列1，即融合基因TVip3A。
(3)含有Vip3A优化基因的重组表达载体pBVip的构建(正对照)
用限制性内切酶BamH I和Sal I分别酶切重组克隆载体pVip3A和pBin438，将切下的Vip3A优化基因片段插到pBin438的BamH I和Sal I位点之间，构建成植物重组表达载体pBVip，其构建过程如图3所示(RB：右边界；NPT II：硫酸新霉素基因；DE-35SP：双增强子的CaMV35S启动子；Nos：终止子；LB：左边界)。
将重组表达载体pBVip转化大肠杆菌DH5α(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：11319-019)后，挑选抗卡那霉素Kanamycin的阳性克隆，进行BamH I和Sal I酶切以及测序鉴定，结果表明pBVip在BamH I和Sal I位点间的核苷酸序列为序列表中序列3所示核苷酸序列，即Vip3A优化基因。
三、重组表达载体转化根癌土壤杆菌
对已经构建正确的重组植物表达载体pBVip和pBTVip分别用电击法(DowerWJ，Miller JF，Ragsdale CW.High efficiency transformation of E.coli by high voltageelectroporation.Nucleic Acids Res，1988，16(13)：6127-6145)转化到根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，经卡那霉素筛选，挑选阳性克隆，进行酶切验证，结果表明重组植物表达载体pBVip和pBTVip结构完全正确。
四、转入融合基因TVip3A的烟草植株的获得及验证
(一)转入融合基因TVip3A的烟草植株的获得
按照文献(Horch RB.A simple and general method for transferring genes intoplants.Science，1985，227：1229～1231)所述的叶盘法，将无菌培养的烟草SR1(Nicotiana tabacum cv.SR1)叶片与步骤三获得的根癌土壤杆菌共培养，以将步骤二构建的重组植物表达载体pBTVip中的T-DNA(包括nptII基因和抗虫融合基因Tvip3A)转入到烟草染色体组中，获得了转入融合基因TVip3A的烟草植株即抗虫烟草植株。
同时用同样的方法将pBVip中的抗虫基因Vip3A优化基因转入烟草植株，获得转入优化vip3A基因的抗虫烟草植株，作为正对照。
同时用同样的方法将空载体pBin438转入烟草植株，获得转入空载体pBin438的烟草植株，作为负对照。
转基因当代植株用T0代表示，T0代自交产生的种子及由它所长成的植株用T1代表示。
(二)转入融合基因TVip3A的烟草植株的验证
1、PCR扩增检测
以转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株为材料，按(Paterson AH，Curt LB，Wendel JF.A rapid method for extrac-tion of cotton(Gossypium spp.)genomic DNAsuitable for RFLP and PCR analysis.Plant Mol Bil Rep，1993，11：112-117)所述方法提取其DNA。设计扩增Vip3A优化基因部分片段的PCR特异引物，其序列为：P1：5′-AAC GGA AGC CTC AAC GAC C-3′和P2：5′-TCG TCA AGG ATG TCG GCTG-3′，由北京三博远志生物有限责任公司合成，这一对引物的扩增产物应为418bp左右的片段。
PCR扩增条件是：95℃预变性3min；94℃变性50sec，58℃退火50sec，72℃延伸50sec，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。同时以转入Vip3A优化基因的T0代烟草植株、转入空载体pBin438的T0代烟草植株和克隆载体pVip3A作为对照。
用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图6所示(泳道M为1kb DNA Marker；1为扩增克隆载体pVip3A的结果；2为转入空载体pBin438的T0代烟草植株SR1的结果；3-4为转入Vip3A优化基因的T0代烟草的结果；5-8为转入融合基因TVip3A基因的T0代烟草的结果)。这些PCR结果表明Vip3A优化基因或融合基因TVip3A可能已整合到所检测的烟草植株的染色体组中。
2、Southern杂交分析检测
(1)植物DNA的提取
取2克幼嫩的转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株的叶片在液氮中研磨成粉后，按(Paterson AH，Curt LB，Wendel JF.A rapid method for extrac-tion of cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP and PCR analysis.Plant Mol Bil Rep，1993，11：112-117)报导的方法提取细胞核DNA。DNA的定量用紫外测定法，即1OD260＝50ug/ml或在Agarose电泳后用EB染色比较确定。
(2)植物DNA的酶解和电泳
取20ugDNA加入60单位的HindIII和5ul 10×限制性内切酶缓冲液，加无菌重蒸水至总体积为50ul，37℃保温过夜。取出5ul酶切液点样，观察是否酶切完整，结果表明酶切完全，在剩余的酶切液中加入5ul上样缓冲液进行点样，在0.8％Agarose胶上以2V/cm的电压进行电泳分离DNA。
(3)DNA的转膜、探针标记和杂交反应
电泳完成后，进行变性、转膜等过程均参照分子克隆一书(Sambrook et al，1989)所述进行，所用探针为用α-32P-dCTP和Ready To Go DNA标记试剂盒标记的步骤1中的Vip3A扩增产物片段(418bp)。
以转入Vip3A优化基因的T0代烟草植株、转入空载体pBin438的T0代烟草植株和克隆载体pVip3A作为对照。
Southern杂交结果如图7所示(1为pVip3A质粒(5.4kb)；2为转入空载体pBin438的烟草植株；3-4为转入优化Vip3A基因的烟草；5-8为转入融合基因TVip3A的烟草)，证明Vip3A优化基因和TVip3A基因已经整合到所检测的烟草染色体中，而且所检测的植株中单拷贝插入占大多数。
实施例2、Vip3A优化基因的原核诱导表达和抗体制备。
用BamH I和Sal I酶切实施例1中获得的重组克隆载体pVip3A，切下人工合成的Vip3A优化基因，然后将其插入原核表达载体pET-23b(Novagen，DarmstadtGermany，Cat.No.69746-3)的BamH I和Sal I位点之间，构建成含有Vip3A优化基因的原核重组表达载体pET-Vip。将该原核重组表达载体转化至受体细胞E.coliBl21(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No.C600003)中，然后将转化子接种于含100g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，用0.4mM IPTG进行诱导表达。诱导3小时后，将培养物5000r/min离心5min收集沉淀，重悬浮2ml含20mM咪唑的1×磷酸缓冲液，pH7.0，超声破菌20w，1min×5次，15000r/min离心30min，收集上清。先用等电点方法提纯Vip3A的粗蛋白，然后在非变性胶上进行电泳，回收较为纯净的蛋白质。以纯化的蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，收集抗血清。
实施例3、抗虫转基因烟草植株的性能检测
一、抗虫转基因烟草植株中抗虫蛋白(Vip3A蛋白)的含量检测
本实验中用到的溶液如下：
提取缓冲液：50mM Na2CO3，pH9.5，1uM Leupeptin，1mM PMSF，0.05％(v/v)巯基乙醇。
上样缓冲液：125mM Tris-HCl pH6.8，20％(v/v)甘油，4％SDS，0.2％(v/v)溴酚蓝，2％(v/v)巯基乙醇。
半干转移缓冲液：48mM Tris，39mM甘氨酸，0.0375％(v/v)SDS，20％(v/v)甲醇。
溶液I：20mM Tris-HCl PH7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA，0.1％Tween-20。
溶液II：20mM Tris-HCl PH7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA。
溶液III：含5％(质量百分含量)脱脂牛奶粉的溶液I。
1、抗虫转基因烟草植株的叶片中抗虫蛋白(Vip3A蛋白)量占叶片中总蛋白量的比例
用Western blot方法进行检测分析。
取100mg转入融合基因TVip3A的T0代抗虫烟草植株新鲜叶片，液氮研磨后加入200ul提取缓冲液(50mM Na2CO3，pH9.5，1uM Leupeptin，1mM PMSF，0.05％(v/v)巯基乙醇)，12000rpm离心10min，取上清液180ul加入一新管，并加入20ul 10×上样缓冲液，100℃煮沸5min，在冰上冷却10分钟，12000rpm离心5min后，所得上清即为蛋白提取液，用于电泳分析。
取上述蛋白提取液20ul，在10％SDS-PAGE胶上，用Tris-甘氨酸缓冲体系(PH8.3)，电压60V，电泳4-6小时。
电泳结束后，用Bio-Rad电泳转移仪在恒流160A、2小时的条件下将蛋白转移至用甲醇预处理的PVDF膜上。然后将膜置于溶液III中封闭未结合蛋白的位置，室温下摇1小时或4℃过夜；将膜转入一抗反应液(溶液I+1％BSA，兔抗Vip3A抗血清，1∶5000倍稀释)中，室温摇1小时；用溶液I洗3次，每次5min；然后将膜置于羊抗兔的二抗(Anti-Rabbit IgG(H+L)，HRP Conjugate；Catalog# W4011，Promega Co.Madison，USA)反应液(溶液I+1％BSA，二抗，1∶5000倍稀释)中，室温摇1小时，用溶液I洗3次，每次5分钟，再用溶液II洗两次。最后在暗室里将膜置于Western Blot超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司，Cat.No.P1010)中显色，至观察到有荧光带出现，用X-光片压片或直接照相，经冲洗后获得清晰图片。同时把剩下的蛋白提取上清用Bio-Rad protein assay kit测定总蛋白浓度，用Pharmacia公司生产的Image Scanner扫描杂交带，用Imaster软件测量灰度值，计算Vip3A蛋白表达量。
同时以转入Vip3A优化基因的T0代烟草植株为正对照，以转入空载体pBin438的T0代烟草植株为负对照。实验设3次重复，取平均数。
Western blot分析结果如图8所示(泳道1为实施例2中改造后的Vip3A优化基因在大肠杆菌中表达的50ng Vip3A蛋白的杂交结果；泳道2为转入空载体pBin438的T0代烟草植株中Vip3A蛋白的杂交结果；泳道3-4为转入优化基因Vip3A的T0代烟草植株中Vip3A蛋白的杂交结果；泳道5-8为转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株中Vip3A蛋白的杂交结果)。结果表明：特异免疫反应的蛋白分子量即表达的Vip3A蛋白分子量与实施例2中2.34kb的优化Vip3A基因片段在大肠杆菌中表达产物大小基本一致(泳道1，大约为88kD)，表明Vip3A优化基因和融合基因TVip3A都能在烟草植株中正确表达杀虫蛋白。
实验结果如表5所示。分别测得转入融合基因TVip3A的T0代抗虫烟草植株、转入Vip3A优化基因的T0代烟草植株和转入空载体pBin438的T0代烟草植株的新鲜叶片中平均总蛋白浓度为0.85ug/ul，1.37ug/ul，1.02ug/ul；因此三种植株上样液(18ul蛋白提取液和2ul上样缓冲液)平均总蛋白的量为15.3ug，24.7ug，18.4ug；分别测得转入融合基因TVip3A的T0代抗虫烟草植株、转入Vip3A优化基因的T0代烟草植株和转入空载体pBin438的T0代烟草植株中杀虫蛋白即Vip3A蛋白的平均表达量(上样蛋白里所含的毒蛋白总量)为29.5ng，5.9ng，0；因此三种植株中杀虫蛋白平均表达量占叶片总可溶性蛋白表达量的0.193％，0.024％，0％。
             表5三种植株的Vip3A蛋白表达量测定平均结果
  转入融合基因TVip3A的T0代植株   转入优化基因Vip3A的T0代植株  转入空载体pBin438的T0代烟草植株(CK)
  叶片中平均总蛋白浓度   0.85ug/ul   1.37ug/ul  1.02ug/ul
  18ul上样液中总蛋白量   15.3ug   24.7ug  18.4ug
  18ul上样液中Vip3A蛋白含量   29.5ng   5.9ng  0ng
  Vip3A蛋白占总蛋白比例   0.193％   0.024％  0％
转入改造后的优化Vip3A基因的烟草植株中的杀虫蛋白平均表达量占叶片总可溶性蛋白的0.024％，而转入融合基因TVip3A的烟草植株中的杀虫蛋白平均表达量占叶片总可溶性蛋白的0.193％，为前者的8倍，表明加了叶绿体和线粒体分泌信号肽，使Vip3A蛋白定位在叶绿体中，从而增加了Vip3A蛋白的稳定性，并使该蛋白在叶绿体中积累，显著地增加Vip3A蛋白的含量。
2、抗虫转基因烟草植株中叶绿体里的抗虫蛋白(Vip3A蛋白)量占叶绿体中总蛋白量的比例的分析
参照(Jensen R G，Bassham J A.Photosynthesis by isolated chloroplasts.Proc NatlAcad Sci USA，1966，56：1095-1101)报道的叶绿体提取方法，提取转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株中的叶绿体。具体方法如下：取500mg新鲜叶片，加入3ml冰冷的buffer A(0.35M蔗糖，0.05M Tris-HCl pH8.0，0.005M EDTA，0.1％BSA，0.1％(v/v)β-巯基乙醇)，在冰上研磨成匀浆状，用8层纱布过滤后，用700g离心10分钟，上清转到一新管中，再用1000g离心15分钟，丢弃上清，用buffer A重悬沉淀，1000g离心15分钟，丢弃上清，加入20ml buffer B(0.05M山梨醇，0.05MTris-HCl，0.015M MgCl2，pH8.0)重悬沉淀，即得叶绿体悬浮液，显微镜下观察和用血球计数板计数叶绿体的数量。
重悬的叶绿体，用1000g离心15分钟，弃去上清，控干后加入200ul蛋白提取缓冲液(50mM Na2CO3，1uM Leupeptin，1mM PMSF，0.05％(v/v)巯基乙醇，pH9.5)，12000rpm离心10min，取上清液180ul加入一新管，利用Bio-Rad protein assay kit测定叶绿体中总蛋白浓度，余下的放置冰上备用。
测得的转入融合基因TVip3A的T0代抗虫烟草植株、转入优化基因Vip3A的T0代抗虫烟草植株中叶绿体中的总蛋白浓度分别为689ng/L、746ng/L。
用ELISA方法定量检测叶绿体中Vip3A蛋白含量，用大肠杆菌表达的Vip3A蛋白作正对照和标准曲线。具体方法如下：取叶绿体中总蛋白在酶标板上包被2小时，用溶液I洗板5次后，加入一抗反应液(溶液I(同步骤1中描述)+1％BSA，兔抗Vip3A抗血清，1∶5000倍稀释)中，室温反应2小时；用溶液I洗板5次；然后加入羊抗兔的二抗(Anti-Rabbit IgG(H+L)，HRP Conjugate；Catalog# W4011，Promega Co.Madison，USA)反应液(溶液I+1％BSA，二抗，1∶5000倍稀释)中，室温反应1小时，用溶液I洗板5次，再用溶液II(同步骤1中描述)洗两次。将板甩干后加入TMB(Promaga，Cat.No.G7431)显色液，显色10分钟后用Bio-RadModel 550酶标仪(Bio-Rad，Hercules，California，USA)在660nm波长下检测，根据标准曲线计算蛋白水平。以未转化任何基因的野生型烟草植株为空白对照，并根据空白对照进行数值矫正。
Vip3A蛋白的标准曲线：分别利用大肠杆菌诱导表达的Vip3A蛋白的不同浓度(ng：0，0.625，1.25，2.5，5)绘制标准曲线，Vip3A蛋白量与OD660nm值的函数关系式为y＝10.871x，R2＝0.9488(图9)。
用同样的方法检测转入优化Vip3A基因的T0代烟草植株和转入空载体pBin438的T0代烟草植株中叶绿体里的抗虫蛋白(Vip3A蛋白)含量。
实验设三次重复，取平均数。
测得的转入融合基因TVip3A的T0代抗虫烟草植株、转入优化基因Vip3A的T0代抗虫烟草植株中叶绿体中Vip3A蛋白含量分别为6.06ng/L、0.37ng/L；相应的叶绿体中Vip3A蛋白占叶绿体总蛋白的质量百分含量分别为0.880％、0.050％。
结果表明：在转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株叶绿体中的平均抗虫蛋白(Vip3A蛋白)含量，是转入改造后的Vip3A优化基因的T0代烟草植株的18倍左右(图10，其中，纵坐标是叶绿体中Vip3A蛋白占叶绿体中总蛋白的质量百分含量，TV表示转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株，V表示转入改造后的Vip3A优化基因的T0代烟草植株)，表明加了叶绿体(THI)分泌信号肽后能使Vip3A蛋白定位在叶绿体中，使该蛋白在叶绿体中积累。
二、转基因烟草的抗虫实验
验证转基因烟草对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和斜纹夜蛾(Spodoptera lituraFabricius)的抗性。
分别取转入改造后的Vip3A优化基因的T0代烟草植株、转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株、转入空载体pBin438的T0代烟草植株的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将叶片打孔成大小适合的圆片放入小塑料盒，每盒放2头人工饲养的棉铃虫(3日龄幼虫)，虫试盒加盖后，在25℃放置3-5天后统计幼虫死亡情况。转入融合基因TVip3A的共4个株系(S503、S504、S505和S506)，转入改造后的优化Vip3A基因的共3个株系(S501、S502和S507)，转入空载体pBin438的共1个株系(CK)；从每种株系选5株进行测试，每株重复6次。结果如表6所示。
按照相同方法再检测其对斜纹夜蛾(3日龄幼虫)的抗性。结果如表7所示。
                  表6转基因烟草接种棉铃虫的抗虫实验
         单株的棉铃虫致死数(每株重复6次)               棉铃虫致死情况(每株系)
  植株   I   II   III   IV   V   总致死虫数   总接虫头数   致死率(％)
  S501   10   7   9   11   8   45   60   75
  S502   9   9   10   9   10   47   60   78
  S507   9   9   7   10   8   43   60   72
  S503   12   12   12   12   12   60   60   100
  S504   12   12   11   12   12   59   60   98
  S505   12   12   12   12   12   60   60   100
  S506   12   12   12   12   12   60   60   100
  CK   0   0   0   0   0   0   60   0
                      表7转基因烟草接种斜纹夜蛾的抗虫实验
            单株的斜纹夜蛾致死数(每株重复6次)                  斜纹夜蛾致死情况(每株系)
  植株   I   II   III   IV   V   总致死虫数   总接虫头数   致死率(％)
  S501   9   11   10   11   9   50   60   83
  S502   10   11   9   10   8   48   60   80
  S507   8   11   10   9   9   47   60   78
  S503   12   12   12   12   12   60   60   100
  S504   12   12   12   12   12   60   60   100
  S505   12   12   12   12   12   60   60   100
  S506   12   12   12   12   12   60   60   100
  CK   0   0   0   0   0   0   60   0
结果表明：转入融合基因TVip3A的T0代烟草株系和转入Vip3A优化基因的T0代烟草株系中都可选到对棉铃虫和斜纹夜蛾具有一定抗性的植株，但转入融合基因TVip3A的T0代烟草株系的试虫死亡率显著高于转入改造后的优化Vip3A基因的T0代株系。转入融合基因TVip3A的T0代株系的试虫死亡率均在95％以上，大部分株系的试虫死亡率为100％；而转入改造后的优化Vip3A基因的T0代株系的试虫死亡率一般在85％以下，但也都在70％以上。
由此证明转入融合基因TVip3A的烟草植株具有较高抗虫能力，与叶绿体中Vip3A蛋白表达的检测结果是一致的，即表达和积累Vip3A蛋白水平高的转TVip3A基因的植株具有较高的抗虫能力，因此转TVip3A的植株能够较易的筛选获得高抗虫性株系，这对抗虫育种的研究具有很高的应用价值。
三、转入的融合基因TVip3A在转基因植株中的遗传稳定性检测
为了了解转基因植株的遗传稳定性，对部分植株的自交一代植株的卡那霉素抗性及抗虫性进行检测。
取转入融合基因TVip3A的T0代烟草植株自交一代的种子(T1)，按照无菌苗的操作方法，将灭菌后的种子转移到含有200mg/ml卡那霉素的MS平板培养基上，置光照培养箱内培养，待幼苗长出一对真叶后不抗卡那霉素的植株很快变为白色，而抗卡那霉素的小苗仍保持绿色，计各个株系的绿苗数和白苗数，统计卡那霉素抗性的分离比。同时对子代植株(T1)进行抗虫试验，方法同步骤二所述，统计抗虫性在子一代的分离情况。实验设3次重复。
实验结果如表8所示。结果表明：由表达载体带到植物染色体组中的nptII基因(卡那霉素抗性基因)在转基因植物子代是按单基因分离规律进行遗传的，从子代中选到转基因纯合系，而且与nptII紧密连锁的TVip3A基因的抗虫性也显示出3∶1的分离特点，初步表明合成的融合基因TVip3A在转基因植株后代也可以稳定遗传。
表8转TVip3A基因的烟草植株后代抗虫性和抗卡那霉素的分离情况。
  株系号(T1)   KanR株数   KanS株数   分离比(置信度P)   抗虫株数   感虫株数   分离比(置信度P)
  S503   145   52   3∶1(0.99)   35   14   3∶1(0.95)
  S504   173   59   3∶1(0.99)   29   12   3∶1(0.95)
  S505   114   42   3∶1(0.95)   31   10   3∶1(0.99)
  S506   136   47   3∶1(0.99)   33   9   3∶1(0.95)
注：KanR、KanS分别表示抗卡拉霉素和对卡拉霉素敏感反应。
实施例4、转基因棉花的获得和性能分析
一、转基因棉花的获得
按照实施例1所述的方法分别构建含有pBVip和pBTVip的农杆菌转化子，再将其分别转化棉花的生产品种中35(河南科润生物技术有限公司)，具体转化方法和转基因棉花植株的筛选参照(Wu JH，Zhang XL，Nie YC，Luo，XY.High-efficiency.transformation of Gossypium hirsutum embryogenic calli.mediated by Agrobacteriumtumefaciens and regeneraion.of insect-resistant plants.2005，Plant Breed.124：142-146)。
以转入优化Vip3A基因的抗虫棉花植株作为正对照；以转入空载体pBin438的棉花植株作为负对照。
转基因当代植株用T0代表示，T0代自交产生的种子及由它所长成的植株用T1代表示。
二、转入融合基因TVip3A的烟草植株的验证
用PCR扩增方法进行验证检测。
对T0代转基因棉花植株进行PCR检测，具体实验方法与实施例3中转基因烟草检测方法一致。
PCR检测结果如图11所示(泳道M为DL2000DNA Marker；泳道1为扩增克隆载体pVip3A的结果；泳道2为扩增转入空载体pBin438的T0代棉花中35的结果；泳道3-4为扩增转入优化Vip3A基因的T0代棉花的结果；泳道5-9为扩增转入融合基因TVip3A的T0代棉花的结果)。结果表明：Vip3A优化基因或融合基因TVip3A可能已整合到所检测的棉花植株的染色体组中。
三、抗虫棉花植株的性能检测
(一)转基因抗虫棉花中抗虫蛋白(Vip3A蛋白)的含量检测
用ELISA方法定量检测转基因棉花叶片中Vip3A蛋白含量，具体检测方法同实施例3中转基因烟草检测方法一致。然后计算每克叶片鲜重中Vip3A蛋白含量，用转入空白载体pBin438的T0代棉花株系作为对照进行0校正。结果如图12所示(图12中，纵坐标为每克叶片鲜重中Vip3A蛋白含量，其中，CTV1、CTV2和CTV3为转入融合基因TVip3A的T0代棉花株系，CV1、CV2和CV3为转入优化Vip3A基因的T0代棉花株系)，结果表明，转入融合基因TVip3A的棉花植株的叶片中Vip3A蛋白含量显著高于转入Vip3A优化基因的棉花植株的叶片中Vip3A蛋白含量。
为验证Vip3A蛋白在叶绿体中积累情况，分别取500mg转入融合基因TVip3A的T0代棉花植株的新鲜叶片、转入优化基因Vip3A的T0代棉花植株的新鲜叶片和转入空载体pBin438的T0代棉花植株的新鲜叶片，提取其叶绿体，具体的提取方法如实施例3中所述一致。
再提取叶绿体中的总蛋白，并测总蛋白浓度，具体实验方法如实施例3中所述一致。
用ELISA方法定量检测叶绿体中Vip3A蛋白含量，具体实验方法如实施例3中所述一致。
实验结果如表9所示。实验设3次重复取平均数。
表9三种棉花植株的叶绿体中Vip3A蛋白量测定平均结果
  转入融合基因TVip3A的T0代棉花植株   转入优化基因Vip3A的T0代棉花植株   转入空载体pBin438的T0代棉花植株CK
 叶绿体中总蛋白浓度   0.756ug/ul   0.638ug/ul   0.914ug/ul
 稀释100倍上样100uL叶绿体中总蛋白量   756ng/样孔   638ng/样孔   914ng/样孔
 100uL上样液中Vip3A蛋白含量   7.345ng   0.535ng   0ng
 叶绿体中Vip3A蛋白占叶绿体中总蛋白比例   0.9713％   0.084％   0％
结果表明，转入融合基因TVip3A的T0代棉花株系的叶绿体中的Vip3A蛋白含量比转入优化Vip3A基因的T0代棉花株系的叶绿体中Vip3A蛋白含量高11倍左右(表9)。
(二)抗虫性能检测
分别取转入Vip3A优化基因的T0代棉花植株、转入融合基因TVip3A的T0代棉花植株、转入空载体pBin438的T0代棉花植株的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将叶片打孔成大小适合的圆片放入小塑料盒，每盒放2头人工饲养的棉铃虫(3日龄幼虫)，虫试盒加盖后，在25℃放置3-5天后统计幼虫死亡情况。转入融合基因TVip3A共3个株系(CTV1、CTV2和CTV3)，转入改造后的优化Vip3A基因的共3个株系(CV1、CV2和CV3)，转入空载体pBin438的棉花植株1个株系(CK)；从每种株系选5株进行测试，每株植株重复6次。结果如表10所示。
                 表10转基因棉花接种棉铃虫的抗虫性实验
        单株的棉铃虫致死数(每株重复6次)              棉铃虫致死情况(每株系)
  植株   I   II   III   IV   V   总致死虫数   总接虫头数   致死率(％)
  CTV1   12   12   12   12   12   60   60   100
  CTV2   12   12   12   12   12   60   60   100
  CTV3   12   12   12   12   12   12   60   100
  CV1   9   8   10   8   11   46   60   76.7
  CV2   10   8   7   9   9   43   60   71.7
  CV3   7   9   8   8   9   41   60   68.3
  CK   0   0   0   0   0   0   60   0
结果表明：转入融合基因TVip3A的棉花株系和转入Vip3A优化基因棉花株系中都可选到对棉铃虫和斜纹夜蛾具有一定抗性的植株，但转入融合基因TVip3A的棉花株系的试虫死亡率显著高于转入优化Vip3A基因的株系。转入融合基因TVip3A的株系的试虫死亡率均为100％；而转入Vip3A优化基因的株系的试虫死亡率一般在76％以下，但也都在68％以上。
综上所述，Vip3A优化基因在转基因植物中具有杀虫活性，把叶绿体和线粒体分泌信号肽编码序列与该基因有机的组装，构建成融合基因TVip3A转化植物后，获得的转TVip3A基因植株中表达的Vip3A杀虫蛋白的量显著高于转Vip3A优化基因的植株，同时转TVip3A株系的抗虫性也显著高于转Vip3A基因，结果同时表明Vip3A蛋白N端删除32个氨基酸后不影响其抗虫活性。所以本发明提供的叶绿体和线粒体分泌信号肽编码序列TS和人工改造后的Vip3A优化基因的嵌合基因TVip3A能显著的提高Vip3A杀虫蛋白的表达量和稳定性，从而使Vip3A蛋白在细胞内得到积累，显著提高转基因植物的抗虫性，TVip3A是用于植物的抗虫基因工程研究与开发的一种高效杀虫蛋白嵌合基因。
                            序列表
Figure S2008100576627D00291
Figure S2008100576627D00321
Figure S2008100576627D00331
Figure S2008100576627D00341

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗虫性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白编码基因为如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。
4.一种基因，所述基因为如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5’末端第247-2523位；
2)其核苷酸序列如序列表中的序列3所示；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求2、3或4所述基因的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pBin438的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分子或序列表中序列1的自5’末端第247-2523位脱氧核苷酸所示的DNA分子或序列表中序列3所示的DNA分子得到的重组表达载体。
7.含有权利要求2、3或4所述基因的转基因细胞系或重组菌。
8.一种培育抗虫植物的方法，是将权利要求2、3或4所述的基因导入植物细胞中，得到抗虫植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2、3或4所述的基因通过权利要求5或6所述的重组表达载体导入植物细胞中，得到抗虫植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物，优选为烟草或棉花。
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