CN103289959B

CN103289959B - 植物微染色体及其制备方法和用途

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Publication number: CN103289959B
Application number: CN201210048564.3A
Authority: CN
Inventors: 徐春晖; 于为常
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK; Shenzhen Research Institute of CUHK
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: CN103289959A

Abstract

提供了在植物细胞中产生微染色体的方法，包括用含有端粒重复序列的第一载体和含有重组位点的第二载体转化植物细胞。还提供了制备分离的微染色体的方法，以及制备转基因植物的方法。

Description

植物微染色体及其制备方法和用途

发明领域

本申请通常涉及分子生物学和基因工程领域。更具体而言，本申请涉及植物微染色体及其制备方法和用途。

发明背景

以传统的农杆菌或者基因枪方法转化植物时，所能同时转移的基因数目非常有限，仅为一个至几个。利用改进的方法如BIBAC(Hamiltonetal.，1996；Vegaetal.，2008)或TAC(Liuetal.，1999)，可以向植物转化长至80到150kb的片段，但是将多个基因构建到如此大的载体上还有很多困难。为了将多个基因整合在一起，通常采用的策略是分别进行各个基因的转化，再在后期的育种中进行整合。因此，利用传统的遗传育种方法完成多个基因在一个种质中的整合需要很多年的时间。解决这个问题的一个可靠的手段是将所有的基因整合在一个额外的染色体(即微染色体)上，这样所有的基因都形成一个紧密连锁群，在遗传杂交中将与一个基因位点的行为一致。并且微染色体是独立于基因组中的其他基因的，因此没有连锁累赘的问题，这个优点是单个基因位点所不具备的。利用这种技术，很多基因甚至整个生化合成途径都可以在目标作物中表达，以提高其产量与品质，保护植物免于生物和非生物胁迫的伤害，或者用来生产医疗药物等。鉴于微染色体具有如此多的优点，因此非常有必要在植物中进行其构建，以运用于植物的基因工程之中。

构建微染色体的途径主要有两个。第一种是“自下而上”(bottomup)的方式，即：将克隆的染色体原件(包括着丝粒阵列、端粒重复序列和复制起始位点等)在体外整合到一个载体，转化培养细胞，以期能够产生微染色体。这个途径在哺乳动物或人类微染色体构建中使用的非常广泛(Basuetal.，2005a；Basuetal.，2005b；deJongetal.，1999；Ebersoleetal.，2000；Harringtonetal.，1997；Henningetal.，1999；Masumotoetal.，1998；Ruddetal.，2003；Suzukietal.，2006；Teleniusetal.，1999)。在玉米中，Ananiev等人构建了含有端粒重复序列的玉米着丝粒BAC克隆并利用它进行了转化，得到了微染色体(Zieleretal.，2009；Ananievetal.，2009)。Lin等人已经构建了用于水稻微染色体从头构建的载体(Linetal.，2011)，但是还没有进行体内验证。

第二种是“自上而下”(top-down)的途径。这种途径利用了含有端粒重复序列的载体来造成内源染色体的断裂，从而可以获得微染色体。这种途径在哺乳动物或人类细胞中也有很多研究(Barnettetal.，1993；Farretal.，1995；Helleretal.，1996；Millsetal.，1999；Safferyetal.，2001)，在植物包括玉米和拟南芥中也有报道(Nelsonetal.，2011；Teoetal.，2011；Yuetal.，2007；Yuetal.，2006)。Yu等人构建了含有2.6kb拟南芥端粒序列的载体并利用它转化玉米，同时获得了A染色体和B染色体来源的微染色体(Yuetal.，2006，2007，美国专利号7993913)。这种技术依赖于端粒序列，由于它在多数植物中都是保守的，因此也可以应用于其他植物中。事实也证明的确如此。在拟南芥中，两个研究组报道了利用不同长度的拟南芥端粒重复序列成功导致了拟南芥染色体的断裂：利用809bp的端粒重复序列，Teo等人在四倍体拟南芥中获得了26％的断裂效率，并且观察到由断裂的染色体形成的微染色体(Teoetal.，2011)；Nelson等人利用不同长度的端粒重复序列进行转化，尝试寻找与端粒介导染色体断裂有关的参数，发现2.6kb的端粒重复可以以高达56％的频率造成四倍体拟南芥的染色体断裂(Nelsonetal.，2011)。

发明简述

第一方面，本申请涉及在植物细胞中产生微染色体的方法，包括用以下转化植物细胞：

a.含有端粒重复序列的第一载体；

b.含有重组位点的第二载体；

其中所述含有端粒重复序列的第一载体和所述含有重组位点的第二载体在转化之前未被可操作连接。

在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的至少2个拷贝的端粒序列。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的至少3个拷贝的端粒序列。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的30-900个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成，在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的30-800个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的40-600个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的50-500个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的60-400个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的70-300个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的80-200个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的100-300个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的150-250个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的170-220个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的180-190个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。在一个实施方案中，所述端粒重复序列含有可操作连接的180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190个拷贝的SEQIDNO：1或由其组成。所述端粒重复序列可以是TTTAGGG的串联，也可含有其他序列以方便克隆连接，只要所述端粒重复序列可以在插入内源染色体过程中导致染色体断裂。

在一个实施方案中，所述端粒序列来自植物。在一个实施方案中，所述端粒序列来自拟南芥或水稻。

在一个实施方案中，所述端粒序列含有可操作连接的10-300个拷贝SEQIDNO：1，或含有20-200个拷贝的SEQIDNO：1，或含有30-100个拷贝的SEQIDNO：1，或含有50-80个拷贝的SEQIDNO：1，或含有55-70个拷贝的SEQIDNO：1，或含有55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个拷贝的SEQIDNO：1，，或者所述端粒序列由上述组成。

在一个实施方案中，所述载体是质粒、噬菌体或病毒载体。在一个实施方案中，所述载体是质粒。

在一个实施方案中，所述重组位点选自lox位点、FRT位点、Rs位点或上述的任意组合。

在一个实施方案中，所述含有重组位点的第二载体还包含可操作连接的重组酶基因。

在一个实施方案中，所述含有lox位点的载体还包含cre基因。在一个实施方案中，所述含有FRT位点的载体还包含flp基因。在一个实施方案中，所述含有Rs位点的载体还包含R基因。

在一个实施方案中，所述含有重组位点的载体还包含可操作连接的外源基因。

在一个实施方案中，所述方法还包括用含有外源基因的第三载体转化所述植物细胞。

在一个实施方案中，所述外源基因为筛选标记基因或赋予所述植物细胞选自以下的性状的基因：诸如营养组成或含量改变、可消化性改变的代谢改变，诸如不育性和育性恢复的可育性改变，以及诸如抗虫性、抗菌性、抗病性、除草剂抗性、抗寒性、抗旱性、抗盐性、抗热性、抗重金属特性的抗胁迫抗性。

在一个实施方案中，所述筛选标记基因选自：诸如新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、潮霉素磷酸转移酶II(HPTII)基因、链霉素抗性基因(SPT)、庆大霉素-3-N-乙酰转移酶基因、博来霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和膦丝菌素抗性基因的抗生素抗性基因，诸如磺胺抗性基因、抗草甘膦基因(EPSPS)、抗绿磺隆基因、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)基因、草甘膦氧化还原酶(GOX)基因和草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因的除草剂抗性基因，硝酸还原酶基因，胞嘧啶脱氢酶基因，色氨酸脱羟酶基因，二氢吡啶二羧酸合成酶基因，天冬氨酸激酶基因，诸如GUS基因的显色基因，磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，以及磷酸木糖异构酶(PXI)基因。

在一个实施方案中，所述转化通过直接基因转移技术进行。

在一个实施方案中，所述转化通过基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法或PEG介导转化法等进行。在一个实施方案中，所述转化通过基因枪法进行。

在一个实施方案中，所述植物细胞来自多倍体植物。在一个实施方案中，所述植物细胞来自两倍或以上倍数的多倍体植物。在一个实施方案中，所述植物细胞来自三倍或以上倍数的多倍体植物。在一个实施方案中，所述植物细胞来自四倍体植物。在一个实施方案中，所述植物细胞来自含有端着丝粒染色体的植物。在一个实施方案中，所述植物细胞来自端三体水稻株系。在一个实施方案中，所述植物细胞来自端三体籼稻株系。在一个实施方案中，所述植物细胞来自中籼3037的端三体株系。

在一个实施方案中，所述微染色体来源于常染色体、B染色体或端着丝粒染色体。在一个实施方案中，所述微染色体来源于端着丝粒染色体。

在一个实施方案中，所述方法还包括利用所述筛选标记筛选含有微染色体的植物细胞。

第二方面，本申请涉及制备分离的微染色体的方法，包括从通过上述方法产生的植物细胞中通过原生质体或微原生质体分离所述微染色体。

第三方面，本申请涉及制备转基因植物细胞的方法，包括实施本文所述的在植物细胞中产生微染色体的方法，在不分离所述微染色体的情况下，含有所述微染色体的植物细胞即是所述的转基因植物细胞。

在一个实施方案中，本申请涉及制备转基因植物细胞的方法，包括用上述分离的微染色体，通过原生质体融合或微原生质体融合技术产生相同或不同种的植物细胞。

在第四方面，本申请涉及制备转基因植物的方法，包括将通过上述方法产生的转基因植物细胞再生为植物。

在第五方面，本申请涉及通过以上方法所制备的转基因植物细胞或植物。

附图简述

图1显示用于产生微染色体的载体的构建示意图。

图2为水稻染色体上的转基因检测，其中，(a)显示含有一个位于染色体内部信号的转基因克隆；(b)含有一个位于染色体末端的信号的转基因克隆；(c)-(f)分别含有2、3、4、5个转基因信号的转基因克隆。箭头：12L端三体染色体；三角：转基因信号。标尺：5微米。

图3显示了水稻微染色体。(a)-(c)显示含有一个转基因信号的微染色体；(d)显示两端均有转基因信号的微染色体；(e)-(f)显示不含潮霉素抗性质粒信号的微染色体；(a)克隆1008-100；(b)克隆1004-111；(c)克隆1004-015；(d)克隆1004-011；(e)1004-001；(f)克隆+79。三角：微染色体。标尺：5微米。

图4显示了水稻微染色体的来源。(a)以12L特异的BAC(箭头)对1004-111进行FISH显示该克隆含有一条12号染色体和一条12L端三体。微染色体(三角)应来源于12号染色体；(b)以12L特异的BAC对1008-100进行FISH的实验结果。该克隆含有三条12号染色体，未发现12L，说明12L被打断并形成了微染色体(三角)，同时12号染色体发生了加倍。(c)、(e)、(g)以9L特异的BAC(箭头)和Os5.8S(小三角)对1004-011进行FISH的实验结果。9L特异的BAC位于9号染色体长臂，Os5.8S位于9号和10号染色体的短臂。该克隆含有两条完整的9号染色体。微染色体(大三角)含有非常靠近着丝粒的Os5.8S信号，说明它们来源于9号染色体，并且有一条9号染色体发生了加倍。(d)、(f)、(h)以转基因所用的载体pCAMBIA1301对1004-011进行FISH的实验结果，pCAMBIA1301用绿色信号标记。(c)、(d)该分裂相含有一条微染色体(大三角)；(e)、(f)该分裂相含有两条微染色体(大三角)；(g)、(h)该分裂相含有一条微染色体(大三角)，另外还含有两条在同一端同时含有转基因信号(h)和Os5.8S(g)信号的染色体，它们应该是同一条染色体加倍后的产物。(a)、(b)、(c)、(e)、(g)中着丝粒特异重复序列CentO以绿色荧光标记；(d)、(f)、(h)中CentO以红色荧光标记。数字表示识别出的染色体。

图5显示了水稻微染色体上的GUS基因表达检测。克隆1004-011和对照为阳性，1004-111和1008-100为阴性。

图6显示了含水稻微染色体的水稻植株分化。(a)分化诱导培养基上的再生情况；(b)培养瓶中的再生植株。

发明详述

本文所用术语“微染色体(minichromosome)”是指通过缺失部分天然染色体而制备的工程染色体。所述植物微染色体是通过向起始植物染色体插入端粒重复序列而使起始植物染色体截短而获得。

本文所用术语“端粒”是指在真核细胞染色体末端发现的结构。端粒的功能是通过保护染色体末端，以免重组、与其它染色体融合或被核酸酶降解。它们允许细胞区分随机DNA断裂与染色体末端。它们在确定正常细胞分裂次数方面也起到重要作用。端粒是线状染色体末端的高度重复DNA区，其功能是作为可任意使用的缓冲物质。每当线状真核染色体在晚S期复制时，DNA聚合酶复合物不能一路复制到染色体末端；如果没有端粒，这将会很快导致维持细胞活性所需的重要遗传信息的丢失。

本文所用术语“端粒基序”是指端粒序列中的重复单位，该重复单位的例子如TTTAGGG(SEQIDNO.1)。

本文所用术语“端粒重复序列”是指至少2个拷贝的端粒序列，即含有可操作连接的至少2个拷贝的端粒序列，或者其可以包含多个拷贝的端粒基序。端粒重复序列可以是TTTAGGG的串联，也可含有其他序列以方便克隆连接，只要所述端粒重复序列可以在插入内源染色体过程中导致染色体断裂。所述其他序列包括用于DNA克隆的限制性内切酶位点等非编码序列，只要其不影响所述端粒重复序列发挥断裂染色体的功能即可。

本文所用术语“载体”是一种为插入片段提供有用的生物学或生物化学性质的核酸分子(优选地DNA)。例子包括：质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和能够复制或在体外或在宿主细胞内复制的其它序列，或能够将目的核酸片段转运到宿主细胞内所需位置的序列。载体可含有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点，在该位点处序列能够以一种可测定的方式酶切，而不丧失载体的基本生物学功能，并且为了发生复制和克隆，一种核酸片段能够剪接入该位点内。载体还能提供引物位点，例如用于PCR，转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、选择性标记等。显然，为了将一种片段克隆入根据本发明使用的克隆载体内，也能应用不需要使用重组、转座或限制性酶的插入希望的核酸片段的方法(例如，但不限于：PCR片段的UDG克隆(美国专利号5,334,575，在此完整引用作为参考)、TA克隆、PCR克隆(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)(也称为直接连接克隆)等)。克隆载体还能含有一种或多种适于鉴定克隆载体转化的细胞的筛选标记。

本文所用术语“重组”是指两个不同的分离的序列区段的人工组合，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作将所述分离的核酸区段可操作地连接在一起，使其各自能够表达其编码的肽或蛋白或发挥其生物功能。

本文所用术语“重组位点”是参与重组蛋白引起的整合/重组反应的核酸分子上的一种识别序列。重组位点是有关核酸分子上的不连续核酸部分或片段，在整合或重组的最初阶段可被位点特异的重组蛋白识别并结合。例如，Cre重组酶的重组位点是loxP，它是34碱基对的序列，由位于8碱基对核心序列侧翼的两个13碱基对的反向重复序列(作为重组酶结合位点)组成。参见Sauer，B.，CurrentOpinioninBiotechnology5：521-527(1994)的图1a。识别序列的其它例子包括此处所述的attB、attP、attL和attR序列，及其突变体、片段、变体和衍生物，它们可被重组蛋白(Int)和辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)识别。参见Landy，CurrentOpinioninBiotechnology3：699-707(1993)。本文所用术语“重组酶”为在特殊重组位点之间实现重组的蛋白质

本文所用术语“筛选标记”是一种核酸片段，它可使人们通常在特定条件下选择一种分子(例如复制子)或含有它的细胞。这些标记可能编码一种活性，例如，但不限于：RNA、肽或蛋白质的产生，或者能为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等提供结合位点。筛选标记的例子包括但不限于：(1)编码提供有毒化合物(例如抗生素)抗性的产物的核酸片段；(2)编码在受体细胞中缺乏的产物(例如tRNA基因、营养缺陷标记)的核酸片段；(3)编码可抑制基因产物活性的产物的核酸片段；(4)编码易于鉴定的产物(例如表型标记物，如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)和细胞表面蛋白)的核酸片段；(5)可结合不利于细胞存活和/或功能的产物的核酸片段；(6)可抑制以上1-5所述任一种核酸片段的活性的核酸片段；(7)可结合可修饰一种底物的产物(例如限制性内切核酸酶)的核酸片段；(8)能用来分离或鉴定希望的分子(例如特异蛋白质结合位点)的核酸片段；(9)编码一种可能无功能(例如对于分子亚群的PCR扩增)的特异核苷酸序列的核酸片段；(10)核酸片段，当缺乏时，直接或间接地提供对特定化合物的抗性或敏感性；和/或(11)编码在受体细胞中有毒的产物的核酸片段。

本文所用术语“B染色体”是指染色体组中除基本染色体外，所含的多余染色体或染色体断片。它们的数目和大小变化很多，一般在顶端都具有着丝粒，大多含有较多的异染色质。在减数分裂时不能和同样的常染色体配对，而且B染色体彼此之间配对能力也很差。在个体间数目和形状的变化是很显著的，同一个体的细胞中数目也有变化。已知在植物(玉米、黑麦、酸模等)和动物(蝗虫、鸡等)中都有B染色体存在。

本文所用术语“端着丝粒染色体”是指着丝粒位于染色体的7/8以远区段的染色体。本文所用术语“端三体”是指有机体的染色体组中含有一条或多条除天然染色体之外的端着丝粒染色体。

术语“染色体组”是指以下：(1)在生物体、或病毒或细胞器的每个细胞中都存在的遗传材料的完全互补序列(基因和非编码序列)；和/或(2)作为来自一个亲本的(单倍体)单位而遗传的一整套染色体。

本文所用术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子及其后代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。术语“植物器官”是指组成形态和功能独特的植物部分的植物组织或一组组织。植物组织可以在植物或植物器官、组织或细胞培养物中。“后代”包括植物的任何后续世代。

在一个实施方案中，用于产生微染色体的载体至少需要两个元件：可以在插入内源染色体过程中导致染色体断裂的端粒序列和未来向微染色体整合基因所需要的位点特异重组系统。所述载体还可以包括用于筛选转基因事件的筛选标记。这些元件通常是转化之前构建在一起的。

本发明人发现，所述元件只需要简单地混合用于直接基因转移技术介导的植物转化，就可以有效地导致植物染色体断裂和微染色体的形成。在染色体断裂中使用混合的载体可以为植物染色体改造提供快速的解决方案，并且可以灵活地选择不同的位点特异重组体系以及其他微染色体构建所需的组件，不需要进行提前的整合。它可以节省构建载体所需要的时间，尤其在缺少合适的酶切位点时更是如此。获得的微染色体在两年的继代中稳定存在。在植物中进行人工染色体的构建将为未来以微染色体为基础的基因整合的基因工程提供平台。

利用一个含有端粒序列的载体进行几乎所有可转化植物的微染色体构建工作(Yuetal.，2006)，原因是除了Asparagales属的植物之外(Fajkusetal.，2005；Sykorovaetal.，2003)，几乎所有植物的端粒序列都是保守的，均为端粒基序TTTAGGG(SEQIDNO：1)的重复，仅在长度上具有物种之间的差别。这个观点也受到了相关实验的支持，如玉米和拟南芥都可以有效地由拟南芥端粒介导导致染色体断裂(Nelsonetal.，2011；Teoetal.，2011；Yuetal.，2007；Yuetal.，2006)。我们在这里又提供了进一步的证据，即拟南芥端粒序列可以导致其他植物染色体断裂并产生微染色体。端粒序列可得自与植物细胞相同的植物品种或变种，或者得自相对于植物细胞是不同的植物品种。

例如，含有端粒重复序列的载体可以是含有三个正向重复的拟南芥端粒克隆(约1.3kb)的4T3X质粒。所述4T3X质粒可以包含拟南芥型(Arabidopsis-type)端粒基序TTTAGGG(SEQIDNO：1)的同向重复序列或其衍生物。端粒序列可得自玉米、小麦、燕麦、水稻、拟南芥或大豆。本领域技术人员应当了解的是，端粒重复序列可包含多个端粒序列。例如，在某些实施方案中，本申请的端粒重复序列可包含介于2个-100个、2个-50个或者2个-10个拷贝的端粒序列、3个-5个拷贝的端粒序列，包括3个拷贝的端粒序列。或者本申请的端粒重复序列可以含有30个-900个拷贝的端粒基序TTTAGGG(SEQIDNO：1)，或50-500个拷贝的SEQIDNO：1、或100-250个拷贝的SEQIDNO：1、或150-220个拷贝的SEQIDNO：1或170-200个拷贝的SEQIDNO：1，或180-190个拷贝的SEQIDNO：1或180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由上述组成。

端粒序列可以含有10-300个拷贝的端粒基序TTTAGGG(SEQIDNO：1)。在一个实施方案中，端粒序列含有40-60个拷贝的端粒基序。在一个实施方案中，端粒序列含有55-70个拷贝的端粒基序，或含有20-200个拷贝的SEQIDNO：1，或含有30-100个拷贝的SEQIDNO：1，或含有50-80个拷贝的SEQIDNO：1，或含有55-70个拷贝的SEQIDNO：1，或含有55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒序列由上述组成。端粒介导染色体断裂的效率应该是受转化所用的端粒重复序列的长度影响的。例如，Nelson等人发现尽管100bp的端粒基序重复序列(TTTAGGG)n即可在染色体上产生新的端粒，但是含有2.6kb却更加有效。另外，染色体断裂所需的最短端粒重复序列长度还与植物种类有关。例如，玉米有效染色体断裂所需的端粒重复序列长度(2.6kb)高于拟南芥；800bp(2×)的端粒重复序列在玉米中的效率较低(Vegaetal.，2008)，但是对于拟南芥则足够长。在本申请中没有测试最短的有效端粒重复序列长度，但是发现1.3kb的端重复粒序列已可以有效的造成染色体断裂。新端粒能否产生似乎是双链DNA断裂(DSB)修复和从头开始的端粒形成两种途径竞争的结果(Birchleretal.，2008；Teoetal.，2011)，由于较长的端粒重复序列可能更易于被识别为端粒，因此更容易导致新端粒的形成。

在先前的研究中，构建含有端粒重复序列的载体时，一舨将端粒重复序列置于T-DNA的右边界，这样在农杆菌转化植物时，T-DNA从载体上切下后端粒重复序列是位于末端的。然而，利用基因枪法以含有端粒重复序列的环状质粒转化玉米也被证明是同样有效的。研究表明，新端粒可以在转入的端粒重复序列处产生，也可以在其侧翼产生。在本研究中，我们使用了一个含有端粒重复序列的简单载体，并在环状质粒的状态下进行了水稻转化，有效的造成了染色体的断裂并产生了微染色体。因此，可以根据情况将端粒重复序列放置在载体的任意位置，应用到微染色体的构建中。

重组位点/重组酶系统可以与任何微染色体系统一起使用。在植物细胞中建立了DNA构建体或微染色体之后，能催化正向和反向反应的整合酶和重组酶都可用于引入修饰。可进行不同分子内的修饰，例如给定序列的缺失或倒位。此外，可进行分子间的插入和交换，包括用含有相容的位点特异性重组位点的内源染色体来易位。也可使用重组酶系统，在微染色体内建立靶位点(泊靠位点)，用于随后通过任何方法(包括杂交或直接递送)进行目标多核苷酸的位点特异性整合。

在本申请的某些实施方案中，植物微染色体包含至少一个重组位点/重组酶位点。已在若干种生物中鉴定出重组位点/重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统(Abremski等，1983；美国专利第4,959,317号；美国专利第5,658,772号)、酵母的FLP/FRT系统(Golic和Lindquist，1989)、大肠杆菌(E.coli)的Pin重组酶(Enomoto等，1983)、噬菌体μ的Gin/gix重组酶(Maeser等，1991)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)pSR1质粒的R/RS系统(Onouchi等，1991；Araki等，1992)和鲁氏接合酵母的R重组酶(Onouchi等，1995)。研究表明，所有这些系统都在植物中起作用(O’Gorman等，1991；Maeser等，1991；Onouchi等，1991；Dale和Ow，1991)。一般认为重组位点/重组酶整合系统如Cre/lox或FLP/FRT需要环状DNA中间体。就这些系统而言，Cre/lox和FLP/FRT已得到广泛应用。

FLP/FRT系统是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)原有的(Golic和Lindquist，1989；有关综述参见Futcher，1988)。酵母中，重组酶(FLP)存在于2μ质粒中，识别作为靶位点的599碱基对(bp)的反向重复序列(FRT)。599bp重复序列内的最小功能序列单元仅包括34bp；被1个不对称的8bp间隔区分隔开的2个13bp反向重复序列，尽管通常存在第3个13bp序列的非必需重复序列(Sauer，1994)。两侧邻接反向重复序列的FRT序列的FLP介导的DNA重排通常导致FRT靶位点之间DNA发生倒位。在这种情况下，两个FRT位点均被保留下来。FLP重组酶还可识别正向重复的FRT靶位点。两侧邻接正向重复的FRT位点的FLP介导的DNA重排通常导致位于FRT靶位点之间的DNA被切下。在这种情况下，切下的DNA以包含一个FRT位点的环状形式释放出来，而第二FRT位点仍保留在模板DNA分子上。FLP重组酶还可介导不同DNA分子上FRT位点之间的重组，例如，FLP重组酶可介导不同染色体上FRT位点之间的重组。Sadowski(1995)指出，由FLP/FRT催化的重组在性质上是可逆的。

由FLP/FRT催化的DNA交换可以在体外进行，因为研究表明纯的FLP重组酶介导FRT位点之间的重组(Meyer-Leon等，1984)。酵母FLP/FRT组合也已用来指导位点特异重组，在大肠杆菌(Cox，1983)和果蝇(Drosophila)基因组中，两者都切下并扩增两侧邻接FRT位点的序列(Golic和Lindquist，1989；Golic，1994)。已采用FLP/FRT指导位点特异性切割部分转基因，所述转基因得自同源重组的玉米和水稻原生质体的质粒DNA(参见例如美国专利第5,527,695号)。在稳定转化的玉米中，已利用FLP/FRT位点定向切割插入玉米基因组的两侧邻接FRT位点的序列(美国专利号5,929,301和6,175,058)。外源DNA的染色体位点特异性靶向细菌和哺乳动物染色体也可受FLP/FRT影响(Huang等，1991；O’Gorman等，1991)，已经表明在非酵母基因组中，这种通过FLP插入FRT位点是可逆的(Huang等，1997)。可以充分改变FRT位点以便发生重组但又是不可逆的(美国专利第6,187,994号)，或者相对于逆向反应更有利于正向反应(Senecoff等，1988)。

第二个已充分表征的重组系统是噬菌体P1的Cre/lox(Abremski等，1983；有关综述参见Craig，1988；Sauer，1994；Ow，1996)。Cre重组酶识别lox靶序列，介导相容性lox位点间的位点特异重组。相容性位点(Compatiblesite)可包含或不包含相同的序列。Lox位点的长度为34碱基对，包含被8bp的其它间隔区核苷酸分隔开的2个13bp反向重复序列。Lox序列包括噬菌体P1的loxP(Albert等，1995)和从大肠杆菌分离的核苷酸序列的loxB、loxL和loxR位点(Hoess等，1982)。已报道的loxP位点的功能变异体包括但不限于lox66、lox71和lox72(Albert等，1995；Langer等，2002)。还可以通过本领域已知的多种合成技术产生Lox序列。用于产生功能性lox位点的合成技术的实例参见Ogilvie等(1981)和Ito等(1982)。

lox位点是一种不对称的核苷酸序列，因此，同一DNA分子上的lox位点彼此之间可能具有相同或相反的方向。相同方向的lox位点间的重组导致位于两个lox位点之间的DNA区段发生缺失。在这种情况下，所得的最初DNA分子末端之间产生连接，lox位点被保留下来。缺失的DNA区段形成仍含有单一lox位点的环状DNA分子。同一DNA分子上相反方向的lox位点间的重组导致位于两个lox位点之间DNA区段的核苷酸序列发生倒位。另外，紧邻位于两个不同DNA分子上的lox位点的DNA区段可能发生彼此交换。所有这些重组事件都是由Cre编码区的产物催化的，并且是可逆的。然而，可以充分改变lox位点，以便重组事件发生但又是抗反向重组反应的(Albert等，1995；Araki等，1997；PCT公布号WO01/11058)，或者使得两个位点是重组酶的“不相容的”重组底物(Hoess等，1986；Trinh和Morrison，2000；Lee和Saito，1988；EP1035208)。还可以通过排除重组酶来源，例如通过育种或使用特定的调节启动子，来防止发生反向反应。

Cre重组酶还可实现位点定向整合。例如，采用Cre重组酶将lacZ报道基因整合到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞基因组中，一个lox位点在lacZ打靶载体上，一个lox位点已先位于CHO基因组DNA内(Fukushige和Sauer，1992)。已经表明，Cre重组酶在以下生物中介导lox位点之间的重组：酵母(Sauer，1987)和植物，例如烟草和拟南芥(参见例如美国专利第5,658,772号；Medberry等，1995；Albert等，1995)以及哺乳动物细胞，例如小鼠(Sauer和Henderson，1988；Fukushige和Sauer，1992；Sauer，1998)。还有研究报道了利用Cre/lox重组系统将大的BAC(细菌微染色体)片段位点特异性整合到植物和真菌基因组中(Choi等，2000)。一般认为，为了实现将位点定向整合到单个基因组lox位点中，必须将包含单个lox位点的环状DNA分子导入细胞。Wallace等人(2000)和Day等人(2000)论述了分别在胚胎干细胞或烟草中应用位点定向整合作为在基因组中预选择可重复表达转基因的位点的方法。

利用多个lox位点，Cre重组酶可发起并实现重组，所述位点包括但不限于loxP和多个野生型loxP位点的变异体，例如lox66(Albert等，1995)。由lox位点指导的DNA交换发生在8bp间隔区，基本上使所涉及的两个lox位点的13bp反向重复序列发生交换。例如，位点定向重组，其中一个DNA分子上的单一lox位点与第二DNA分子上的第二单个lox位点重组，产生其中整合的DNA两侧各邻接lox位点的序列。如果所涉及的不同分子上的单一lox位点相同，则所得到的邻接插入DNA的两个lox位点也相同。然而，如果13bp反向重复序列上起始分子的两个单一lox位点不相同，则所得到的邻接插入DNA的两个lox位点不同于起始lox位点。例如，如果第一单一lox66位点与第二单一lox71位点一起参与位点定向整合，则所得到的邻接插入DNA两侧的lox位点包含loxP和lox72位点序列(Albert等，1995)。

在两个重组分子上，采用相同的lox或FRT位点的位点定向整合导致插入的DNA两侧邻接相同的重组位点，这是一种易通过重组酶逆转的反应。为了防止插入序列的缺失，通常需要排除重组酶的酶来源，例如，通过分离或通过将重组酶基因置于诱导型启动子的控制下并排除诱导源。或者，本领域技术人员可采用这样设计的位点特异重组序列，以便在整合反应后，所得位点与反向反应不相容或者减速进行重组。

本领域技术人员应当了解的是，可通过本领域已知的任何方法，向一个或多个靶位点(例如lox或FRT)提供整合酶，例如Cre或FLP重组酶。例如，可通过基因和留存在宿主细胞内单独保持的质粒中的合适调控序列的表达而瞬时供应重组酶。重组酶基因和合适的调控序列可插到生物基因组中，并在宿主细胞中稳定表达。或者，可应用有性杂交或育种将重组酶导入含有一个或多个靶lox或FRT位点的细胞中；在这种情况下，含有重组酶基因的生物(例如植物)可与含有lox或FRT靶位点的植物杂交，得自这种杂交的子代可能含有重组酶和一个或多个靶位点。在一些情况下，可将编码所需重组酶的mRNA导入宿主细胞以编码和提供重组酶蛋白。在其它情况下，可将分离的重组酶蛋白导入包含靶重组位点的宿主细胞内。在这些情况的任一种情况下，指导重组酶表达的启动子可以是但不限于组成型或诱导型的方式。本领域技术人员还应当了解的是，重组酶基因(例如Cre或FLP)的基因可以分别从噬菌体P1或酿酒酵母中分离出来，并直接用于新的宿主系统，或者对于转基因宿主中密码子选择的表达，可以使基因序列最优化。本领域技术人员应当了解的是，可用合适的重组酶按类似方式识别天然存在的和合成的靶位点并介导重组。

重组酶介导的基因置换或基因切除的实例通常利用邻接将被置换或切除的序列的两个靶位点。例如，Odell等人(美国专利第5,658,772号)公开了在烟草中使用两个loxP位点和Cre重组酶产生特异性基因置换。还使用Cre/lox系统在转基因植物中以诱导型方式激活并去除转基因(PCT公布号WO01/40492)。Baszczynski等人(美国专利第6，187,994号)公开了在玉米中使用多个不相同的FRT位点和FLP重组酶以产生多种基因变化。Baszczynski等人(美国专利第6,262,341号)还公开了使用具有双靶位点特异性的嵌合Cre/FLP重组酶来实现一侧邻接lox序列、另一侧邻接FRT序列的DNA序列的重组。在这些情况的各种情况中，序列的整合或切除产生了作为部分重组方案的外源DNA片段。然而，位点定向整合只可利用受体基因组中的一个靶位点。

由于在植物转化过程中，端粒重复序列在基因组中是随机插入的，因此染色体断裂也是随机分布的。为了从含有两条臂的正常染色体获得微染色体，至少需要在其两条臂上各造成一次断裂，这样产生的微染色体可以含有尽可能少的基因，以免多余的基因拷贝对植物的生长发育造成不良影响。

因此，B染色体被优先选择作为微染色体构建的材料。但是，由于仅有10％的植物含有B染色体，大多数植物包括重要的粮食作物如水稻、小麦、大豆和棉花等都不含有B染色体，为了对这些植物的染色体进行改造，可以考虑以四倍体为材料，原因是其加倍的染色体组比二倍体有更强的抵抗染色体缺失的能力，并且产生的微染色体也更容易传递到后代去。

与四倍体相比，端三体株系中的端着丝粒染色体只有一条臂，因此只需要进行一次断裂就能形成微染色体(图6)。端着丝粒染色体是由于着丝粒的错误分裂产生的，因此只含有一条臂。与B染色体类似，这条多余染色体的断裂不会影响植物的生长发育，生成的微染色体可以传递到下一代。

籼稻品种中籼3037中已经构建了一套完整的端三体系(Chengetal.，2001b)。我们利用端三体水稻株系中含有的端着丝粒染色体进行了微染色体的构建。微染色体可以同时由端着丝粒染色体和其他正常染色体产生。根据我们的FISH结果，克隆1008-100含有的微染色体应该来自于断裂的12L染色体。除了12L的断裂之外，还有微染色体由其它染色体断裂产生。所有这些微染色体在两年的细胞培养中稳定存在。

实施例

实施例1产生微染色体的质粒构建

图1显示了用于制备植物微染色体的三个质粒的图谱。4T3X含有三个正向重复的克隆的拟南芥端粒(约1.3kb)，该质粒整合到染色体上之后可以诱导新端粒的产生；pED97含有Cre-lox重组系统，可以赋予微染色体整合新基因的能力。pCAMBIA1301含有HptII基因，可以使被转化的水稻细胞抗潮霉素，它还含有GUS基因，被转化的细胞经过组织化学染色后可以呈蓝色。图1中，P35S指CaMV35S启动子；HptII指潮霉素磷酸转移酶II基因；T35S指CaMV35S终止子；GUS指β-葡萄糖苷酸酶基因；Tnos指胭脂碱合成酶基因终止子；Telo指拟南芥端粒重复序列；lox66指lox66重组位点；Cre指Cre重组酶。

实施例2利用质粒轰击水稻愈伤组织

我们混合了三个质粒并用于轰击水稻愈伤组织：4T3X质粒含有约1.3kb的拟南芥端粒序列；pCAMBIA1301含有用作筛选标记的潮霉素抗性基因和GUS报告基因；pED97含有Cre/lox位点特异重组系统，通过该系统可以向微染色体上添加新的基因。每份2微克的上述纯化的质粒DNA按5∶1∶1混合后黏附于1.5毫克0.6微米的金粉颗粒上用BIO-RAD公司的PDS1000/He型基因枪以650PSI的压力轰击水稻愈伤组织。转化后，愈伤组织在含有25毫克/升的潮霉素的培养基上培养两周，然后转移到含50毫克/升的潮霉素的筛选培养基上筛选，使抗性愈伤组织生长。抗潮霉素的克隆以转基因为探针、用FISH进行检测，从而发现染色体断裂和微染色体。

为比较实验结果，对两种愈伤组织系进行了转化。一种在轰击之前继代了4至6个月，有4512块愈伤组织被转化，筛选获得了536个抗潮霉素的愈伤组织克隆，转化效率为11.9％。另外一个愈伤系在轰击之前继代了18个月，从854块被轰击的愈伤组织中获得了111个潮霉素抗性克隆，转化效率为13.0％。总计从5367个轰击的愈伤组织中获得了647个潮霉素抗性克隆，总转化效率为12.1％。

染色体断裂

在阳性克隆中，利用FISH从205个克隆中检测到216个转基因事件。其中152个含有1个转基因信号，42个含有2个转基因信号，11个含有3个转基因信号，9个含有4个转基因信号，2个含有5个或更多转基因信号(图2)；总计317个转基因信号，其中111个位于染色体末端(图2b)，位于末端的转基因比例为35％，而在仅利用pCAMBIA1301进行的对照转化中这个比例仅为3.1％(32个信号中1个位于末端)。与此类似，在之前报道的玉米染色体断裂研究中，当转基因载体中含有端粒序列时，46.3-56.5％的转基因信号位于染色体末端，当转基因载体不含端粒序列时，该比例仅为19.0％(Yuetal.，2006)。明显较高的末端转基因信号比例与染色体断裂有关，从中确认了17％的染色体断裂事件(Yuetal.，2006)。本研究没有对染色体断裂予以确认，不过在以端粒序列进行的转化中很容易发现由染色体断裂形成的微染色体，而对照转化中则没有发现微染色体。

微染色体

经细胞学检测发现了6个含有微染色体的转基因克隆(图3)，利用pCAMBIA1301作为探针进行FISH检测，发现其中4个微染色体含有转基因信号(图3a-d)。其中一个微染色体在着丝粒两端均有转基因(图3d)，可能是由于该染色体的两条臂同时断裂所导致的。两个微染色体在利用pCAMBIA1301进行杂交时没有发现转基因信号(图4e-f)。它们可能是由于单独的T3X插入所形成的，也有可能是在染色体断裂之后pCAMBIA1301丢失而导致的。由于在基因组的其他位点有pCAMBIA1301的插入，因此被转化的细胞仍旧具有潮霉素抗性，因此可以被筛选出来，从而使不含有转基因信号的微染色体被保留下来。上述被转化的细胞可以在含潮霉素的筛选培养基上，在28℃黑暗条件下长期培养。创建不含有转基因的微染色体也是有必要的，因为在之后通过位点特异重组向微染色体整合新基因的转化中，还会需要抗生素筛选标记。从端粒重复序列转化的转基因水稻中发现微染色体证明端粒可以在水稻中有效的介导染色体断裂。

含有微染色体的克隆1004-011可以再生植株并生长于培养瓶中，但是在大田中未能存活，因此微染色体没有传递到下一代。不过这些微染色体在两年的愈伤组织培养过程中稳定存在，因此是有丝分裂稳定的。这些微染色体可以通过原生质体或微原生质体技术进行分离，并通过原生质体融合或微原生质体融合技术转移到同种或不同种的其他植物细胞，进而分化成植株。

微染色体的来源

为确定微染色体的来源，以染色体臂特异的探针包括BAC(Chengetal.，2001；Tangetal.2007)和水稻5.8SrDNA(Os5.8S)检测了三个微染色体克隆，即1004-111、1008-100和1004-011。这些克隆均来自于含有一条12L染色体的野生型愈伤组织，在未发生染色体断裂的情况下应含有两条12号染色体和一条12L染色体。

克隆1004-111

该克隆含有25条染色体，包括一个是非常小的微染色体，其转基因信号与着丝粒信号是重叠的(图3b)，表明断裂的位置非常接近着丝粒。随后我们用12L特异的BAC对其染色体进行了FISH分析，发现有两条染色体上有信号(图4a)，一个位于正常的12号染色体上，另外一个位于一条端着丝粒染色体，这应该是原本的端三体染色体12L。我们在这个克隆中没有发现不正常的染色体，因此丢失的12号染色体应该形成了这个微染色体。为了形成微染色体，一个正常的12号染色体需要发生两处断裂以丢失两个臂。与正常的12号染色体着丝粒相比，微染色体的CentO信号要弱(图4a)，所以断裂应该发生在着丝粒区，微染色体只保留了一部分着丝粒。利用pCAMBIA1301进行的FISH在微染色体的另一端没有检测到转基因信号(图3a)，表明pCAMBIA1301没有整合在断裂位点，或者位于断裂位点外，因此在断裂之后丢失了。

克隆1008-100

该克隆含有24-25条染色体。以12LBAC为探针，我们发现三条染色体含有12L的信号，而最初的12L端三体则丢失了(图4b)。因此，微染色体应该由丢失的12L断裂形成，而附加的12号染色体则可能是由于染色体加倍产生的。我们还观察到含有两个着丝粒的融合染色体，如果其两个着丝粒都有活性的话，那么这个染色体有可能会在细胞分裂中形成断裂-融合桥(breakage-fusionbridge，BFB)(Hanetal.，2008)。非整倍体化和染色体重排在其他染色体断裂和微染色体从头形成的研究中也是很常见的(Teoetal.，2011；Ananievetal.，2009)。

克隆1004-011

该克隆含有的微染色体有两个转基因信号，分别位于其两端，着丝粒信号微弱(图3d)，强度类似于8号染色体的着丝粒。因此我们首先用8号染色体臂特异的BAC为探针对该克隆的染色体进行了杂交，但是发现8号染色体并没有缺失，表明该微染色体并非来源于8号染色体。进一步用5.8SrDNA(Os5.8S)分析发现微染色体的一条臂含有Os5.8S信号(图4c、e、f)，Os5.8S的信号还位于9号和10号染色体。因此，对这个克隆进一步以9L特异的BAC和Os5.8S作为探针进行了分析。二倍体粳稻含有4个Os5.8S信号：两个强信号位于9号染色体短臂，靠近着丝粒；两个弱信号位于10号染色体短臂的末端(图4c)(Shishidoetal.2000)。微染色体的Os5.8S信号靠近着丝粒，这与9号染色体上的排列相似，因此该微染色体有很大的可能是来自9号染色体的断裂。该微染色体上的微弱的着丝粒CentO和Os5.8SrDNA信号说明断裂发生在这两个区域内(图4c)。这个克隆的染色体组成很复杂，在不同的细胞中发现了27-28条染色体(图4c-h)。除了上述两个臂均断裂的微染色体外，在某些细胞中还发现了1-2条端着丝粒染色体(图3d，4g-h)。并且图4g和4h中的两个端着丝粒染色体应该是来自于同一条染色体的加倍，原因是它们有相似的形态以及FISH杂交信号。由于它们均含有Os5.8S信号，它们也有可能是来自于9号染色体，更弱的Os5.8S信号则可能是由于缺失的部分更大。

Claims

1.在植物细胞中产生微染色体的方法，包括用以下转化植物细胞：

a.含有端粒重复序列的第一载体；

b.含有重组位点的第二载体；

2.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的至少2个相同或不同的端粒序列，或者所述端粒重复序列由可操作连接的至少2个相同或不同的端粒序列组成。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的至少3个相同或不同的端粒序列，或者所述端粒重复序列由可操作连接的至少3个相同或不同的端粒序列组成。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列来自植物。

5.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列来自拟南芥或水稻。

6.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列含有可操作连接的10-300个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒序列由可操作连接的10-300个拷贝的SEQIDNO：1组成。

7.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列含有20-200个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒序列由20-200个拷贝的SEQIDNO：1组成。

8.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列含有30-100个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒序列由30-100个拷贝的SEQIDNO：1组成。

9.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列含有50-80个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒序列由50-80个拷贝的SEQIDNO：1组成。

10.如权利要求2或3所述的方法，其中所述端粒序列含有55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒序列由55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个拷贝的SEQIDNO：1组成。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的30-900个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由可操作连接的30-900个拷贝的SEQIDNO：1组成。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的50-500个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由可操作连接的50-500个拷贝的SEQIDNO：1组成。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的100-300个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由可操作连接的100-300个拷贝的SEQIDNO：1组成。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的150-250个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由可操作连接的150-250个拷贝的SEQIDNO：1组成。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的170-220个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由可操作连接的170-220个拷贝的SEQIDNO：1组成。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述端粒重复序列含有可操作连接的180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190个拷贝的SEQIDNO：1，或者所述端粒重复序列由可操作连接的180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190个拷贝的SEQIDNO：1组成。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述载体是质粒、噬菌体或病毒载体。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述重组位点选自lox位点，FRT位点，Rs位点，或lox位点、FRT位点、Rs位点的任意组合。

19.如权利要求1-3和11-18中任一项所述的方法，其中所述含有重组位点的第二载体还包含可操作连接的重组酶基因。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述重组酶基因为cre基因，其编码的重组酶针对lox位点；和/或所述重组酶基因为flp基因，其编码的重组酶针对FRT位点；和/或所述重组酶基因为R基因，其编码的重组酶针对Rs位点。

21.如权利要求1-3、11-18和20中任一项所述的方法，其中所述含有重组位点的第二载体还包含可操作连接的外源基因。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述外源基因在所述重组位点处与所述载体可操作地连接。

23.如权利要求1-3、11-18和20中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用含有外源基因的第三载体转化所述植物细胞。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述外源基因为筛选标记基因或赋予所述植物细胞选自以下的性状的基因：代谢改变，可育性改变、和胁迫抗性。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述外源基因为筛选标记基因或赋予所述植物细胞选自以下的性状的基因：代谢改变，可育性改变、和胁迫抗性。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述外源基因为筛选标记基因或赋予所述植物细胞选自以下的性状的基因：代谢改变，可育性改变、和胁迫抗性。

27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述代谢改变选自营养组成或含量改变，可消化性改变；所述可育性改变选自不育性和育性恢复；所述胁迫抗性选自抗虫性、抗菌性、抗病性、除草剂抗性、抗寒性、抗旱性、抗盐性、抗热性和抗重金属特性。

28.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述筛选标记基因选自：抗生素抗性基因，除草剂抗性基因，硝酸还原酶基因，胞嘧啶脱氢酶基因，色氨酸脱羟酶基因，二氢吡啶二羧酸合成酶基因，天冬氨酸激酶基因，显色基因，磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，以及磷酸木糖异构酶(PXI)基因。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述抗生素抗性基因选自：新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、潮霉素磷酸转移酶II(HPTII)基因、链霉素抗性基因(SPT)、庆大霉素-3-N-乙酰转移酶基因、博来霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、膦丝菌素抗性基因；所述除草剂抗性基因选自：磺胺抗性基因、抗草甘膦基因(EPSPS)、抗绿磺隆基因、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)基因、草甘膦氧化还原酶(GOX)基因和草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因；所述显色基因为GUS基因。

30.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述转化通过选自基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法或PEG介导转化法的直接转移技术进行。

31.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自多倍体植物。

32.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自两倍或以上倍数的多倍体植物。

33.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自三倍或以上倍数的多倍体植物。

34.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自四倍体植物。

35.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自含有端着丝粒染色体的植物。

36.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自端三体水稻株系。

37.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自端三体籼稻株系。

38.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自中籼3037的端三体株系。

39.如权利要求1-3、11-18、20、22、24-26和29中任一项所述的方法，其中所述微染色体来源于常染色体、B染色体或端着丝粒染色体。

40.如权利要求24-26和29中任一项所述的方法，其还包括利用所述筛选标记筛选含有微染色体的植物细胞。

41.制备分离的微染色体的方法，包括从通过权利要求1-40中任一项所述的方法产生的植物细胞中通过原生质体或微原生质体技术分离所述微染色体。

42.制备转基因植物细胞的方法，包括实施权利要求1-41中任一项所述的方法，从而产生含所述微染色体的转基因植物细胞。

43.制备转基因植物细胞的方法，包括用通过权利要求41所述的方法制备分离的微染色体，通过原生质体融合或微原生质体融合技术产生相同或不同种的植物细胞。

44.制备转基因植物的方法，包括将通过权利要求42或43所述的方法产生的植物细胞再生为植物。