KR100830082B1 - 인슐린 유사 성장 인자 ι수용체에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR), 바람직하게는 인간 IGF-IR에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-IGF-IR 항체에 관한 것이며, 여기에는 키메라 항체, 이중 특이적 항체, 유도체화된 항체, 단일 사슬 항체 또는 융합 단백질의 일부가 포함된다. 본 발명은 또한 항-IGF-IR 항체에서 유래된 분리된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자 및 이 분자를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-IGF-IR 항체의 제조 방법, 이 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 진단 및 치료에 상기 항체와 이 항체의 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-IGF-IR 항체를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 암호화하는 핵산 분자를 이용하는 유전자 치료법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 유전자 치료법 및 형질전환 동물에 관한 것이다.

Description

인슐린 유사 성장 인자 Ι수용체에 대한 항체{ANTIBODIES TO INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR I RECEPTOR}
본 출원은 2001년 1월 5일에 출원된 미국 가명세서 출원 제60/259,927호의 우선권 이익을 주장한다.
인슐린 유사 성장 인자(IGF-I)는 혈장에서 고농도로 순환하며 대부분의 조직에서 검출되는 7.5 kD의 폴리펩티드이다. IGF-I은 세포 분화 및 세포 증식을 자극하며, 지속적인 증식을 위해 대부분의 포유동물 세포 유형에서 필요로 한다. 상기 세포 유형에는, 특히 인간 배수 섬유아 세포, 상피 세포, 평활근 세포, T 림프구, 신경 세포, 골수성 세포, 연골 세포, 골아 세포 및 골수 줄기 세포가 포함된다. IGF-I/IGF-I 수용체 상호작용이 세포 증식을 매개하는 다양한 세포 유형에 대한 개요는 Goldring 등의 문헌[Eukar. Gene. Express. 1:31-326(1991)]을 참조하라.
IGF-I-자극 세포 증식 또는 분화로 이르게 하는 신호전달 경로에 있어서 첫번째 단계는 IGF-I 또는 IGF-II(또는 생리적 농도 이상의 농도의 인슐린)가 IGF-I 수용체에 결합하는 것이다. IGF-I 수용체는 두가지 유형의 서브유닛, 즉 알파 서브유닛(전체적으로 세포외 단백질로서, 리간드 결합에 관여하는 130-135 kD 단백질) 및 베타 서브유닛(경막 도메인과 세포질 도메인을 갖는 95 kD의 경막 단백질)으로 구성된다. IGF-IR은 티로신 키나제 성장 인자 수용체 계열에 속하며[Ullrich 등, Cell 61: 203-212, 1990], 인슐린 수용체와 구조적으로 유사하다[Ullrich 등, EMBO J. 5:2503-2512, 1986]. IGF-IR은 처음엔 단일 사슬의 전구 수용체 폴리펩티드로서 합성되며, 이것은 글리코실화, 단백질 분해 절단 및 공유 결합에 의해 프로세싱되어 두개의 알파 서브유닛과 두개의 베타 서브유닛을 포함하는 성숙한 460 kD의 헤테로사량체로 어셈블링된다. 베타 서브유닛(들)은 리간드에 의해 활성화되는 티로신 키나제 활성을 보유한다. 이 활성은 베타 서브유닛의 자가 인산화 및 IGF-IR 기질의 인산화를 포함하는 리간드 작용을 매개하는 신호전달 경로와 관련되어 있다.
생체내에서, IGF-I의 혈청 농도는 뇌하수체 성장 호르몬(GH)의 존재에 의존한다. 간이 GH 의존적 IGF-I 합성의 주요 조직이지만, 최근의 연구에 의하면 정상 조직의 대부분이 IGF-I을 생산하는 것으로 나타난다. 다양한 신생물 조직 역시 IGF-I을 생산할 수 있다. 따라서 IGF-I은 자가분비 또는 측분비뿐만 아나라 내분비 메카니즘을 통해 정상 및 비정상 세포 증식의 조절자로서의 역할을 할 수 있다. IGF-I 및 IGF-II는 생체내에서 IGF 결합 단백질(IGFBP)에 결합한다. IGF-IR과의 상호작용에 대한 유리 IGF의 이용률은 IGFBP에 의해 조절된다. IGFBP 및 IGF-I에 대한 개요는 문헌[Grimberg 등, J. Cell. Physiol. 183:1-9, 2000]을 참조하라.
IGF-I 및/또는 IGF-IR이 시험관내와 생체내에서 종양 세포를 유지하는 역할을 한다는 많은 증거가 있다. IGF-IR 농도는 폐 종양[Kaiser 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 119:665-668, 1993; Moody 등, Life Sciences 52:1161-1173, 1993; Macauley 등, Cancer Res., 50:2511-2517, 1990], 유방 종양[Pollak 등, Cancer Lett. 38:223-230, 1987; Foekens 등, Cancer Res. 49:7002-7009, 1989; Cullen 등, Cancer Res. 49:7002-7009, 1990; Arteaga 등, J. Clin. Invest. 84:1418-1423, 1989], 전립선 종양 및 결장 종양[Remaole-Bennet 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. 75:609-616, 1992; Guo 등, Gastroenterol. 102:1101-1108, 1992]에서 증가한다. 전립선 상피에서의 IGF-I 발현의 부조절(deregulation)은 형질전환 마우스에서 신생물 형성을 초래한다[DiGiovanni 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3455-60, 2000]. 또한, IGF-I은 인간 신경교종의 내분비 자극제인 반면[Sandberg-Nordqvist 등, Cancer Res. 53:2475-2478, 1993], IGF-I은 IGF-IR을 과발현한 섬유육종의 성장을 자극하는 것으로 나타난다[Butler 등, Cancer Res. 58:3021-27, 1998]. 또한, IGF-I의 농도가 "높은 정상(high normal)" 범위인 사람은 IGF-I의 농도가 "낮은 정상(low normal)" 범위인 사람에 비해 일반 암의 발생 위험이 높았다[Rosen 등, Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999]. 이들 종양 세포 유형의 다수는 배양시 증식 시그널을 가하면 IGF-I에 반응하여[Nakanishi 등, J. Clin. Invset. 82: 354-359, 1988; Freed 등, J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989], 생체내에서의 증식에 대한 내분비 또는 측분비 루프를 가정하게 되었다[LeRoith 등, Endocrine Revs. 16:143-163, 1995; Yee 등, Mol. Endocrinol. 3:509-514, 1989]. 각종 인간 종양 성장에 있어서의 IGF-I/IGF-I 수용체 상호작용의 역할에 대한 개요는 문헌[Macaulay, Br. J. Cancer, 65:311-320, 1992]을 참조하라.
증가된 IGF-I 농도는 또한 선단비대증 및 거인증을 비롯한 몇종의 비암성 병 리적 상태와 서로 관련이 있으며[Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65:343, 347-349, 1998], 비정상적인 IGF-I/IGF-I 수용체 기능은 건선[Wraight 등, Nat. Biotech. 18:521-526, 2000], 혈관형성술 후의 혈관의 아테롬성경화증 및 평활근 세포의 재발협착증[Bayes-Genis 등, Circ. Res. 86:125-130, 2000]과 관련이 있다. 증가된 IGF-I 농도는 또한 미소혈관 증식과 같은 당뇨병 및 이의 합병증에 있어서도 문제가 될 수 있다[Smith 등, Nat. Med. 5:1390-1395, 1999]. 특히, GH 혈청 농도가 감소되었거나 GH에 대한 비감응성 또는 내성이 있는 경우에 발생하는 IGF-I의 농도 감소는 소인증[Laron, Paediatr. Drugs 1:155-159, 1999], 신경장해, 근육량의 감소 및 골다공증[Rosen 등, Trends Endocrinol. Metab. 10:136-141, 1999]과 같은 장애와 관련이 있다.
IGF-IR RNA에 대한 안티센스 발현 벡터 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 IGF-IR을 간섭하면 IGF-I 매개 또는 IGF-II 매개 세포 성장이 억제된다는 것이 확인되었다[참조: Wraight 등, Nat. Biotech. 18:521-526, 2000]. 안티센스 사용법은 몇몇 정상 세포 유형과 인간 종양 세포주에서 세포 증식을 억제하는 데 성공적이었다. 성장은 IGF-I의 펩티드 유사체를 사용하거나[Pietrzkowski 등, Cell Growth & Diff. 3:199-205, 1992; 및 Pietrzkowski 등, Mol. Cell. Biol., 12:3883-3889, 1992], IGF-I RNA에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 벡터를 사용한 경우에도 억제될 수 있다[Trojan 등, Science 259:94-97, 1992]. 또한, IGF-IR에 대한 항체[Arteaga 등, Breast Canc. Res. Treatm., 22:101-106, 1992; 및 Kalebic 등, Cancer Res. 54:5531-5534, 1994] 및 IGF-IR의 우성 음성 돌연변이[Prager 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2181-2185, 1994; Li 등, J. Biol. Chem., 269:32558-32564, 1994 및 Jiang 등, Oncogene 18:6071-77, 1999]는 변형된 표현형을 역행시키고, 종양 발생을 억제하고, 전이 표현형의 감소를 유도할 수 있다.
IGF-I은 또한 아폽토시스의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. 아폽토시스란 세포예정사로서, 면역계 및 신경계의 성숙을 비롯하여 광범위한 각종 발생 과정에 관여한다. 아폽토시스는 발생에 관여할 뿐만 아니라 종양 발생에 대항하는 중요한 세포 보호 수단으로서의 역할을 한다[Williams, Cell 65:1097-1098, 1991; Lane, Nature 362:786-787, 1993]. 다양한 유전적 손상에 의한 아폽토시스 프로그램의 저해는 악성 종양의 발생과 진행에 기여할 수 있다.
IGF-I은 IL-3 의존적 조혈 세포에서 사이토카인 회수에 의해 유도된 아폽토시스[Rodriguez-Tarduchy, G. 등, J. Immunol. 149:535-540, 1992] 및 Rat-1/mycER 세포에서 혈청 회수에 의해 유도된 아폽토시스[Harrington, E., 등, EMBO J. 13:3286-3295, 1994]가 일어나는 것을 막는다. IGF-I의 아폽토시스 방지 기능은 세포 주기로의 진입 후 단계에 있어서 중요하며, 에토포시드 또는 티미딘에 의해 세포 주기 진행이 차단된 세포에 있어서도 중요하다. c-myc에 의해 유도된 섬유아 세포는 그 생존이 IGF-I에 의존적이라는 사실은 IGF-IR이 아폽토시스를 특이적으로 억제함으로써 종양 세포를 유지하는 데 있어서 중요한 역할을 하며, 이 역할은 IGF-I 또는 IGF-IR의 증식 효과와는 상이한 역할임을 제시한다. 이것은 종양 생존을 촉진하는 데 관여하는 것으로 생각되는 bcl-2와 같은 다른 아폽토시스 방지 유전자의 역할[McDonnell 등, Cell 57:79-88, 1989; Hockenberry 등, Nature 348:334-336, 1990]과 유사하다.
IGF-I의 아폽토시스 방지 효과는 세포 상에 존재하는 IGF-IR이 IGF-I와 상호작용하는지에 달려있다[Resnicoff 등, Cancer Res. 55:3739-3741, 1995]. 종양 세포의 유지에 있어서의 IGF-IR의 아폽토시스 방지 기능은 래트의 동계 종양의 IGF-IR 농도, 아폽토시스 정도 및 종양 발생 가능성간의 정량적 관계를 확인한 IGF-IR에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 실험에 의해서도 지지되었다[Rescinoff 등, Cancer Res. 55:3739-3741, 1995]. 과발현된 IGF-IR은 시험관내의 종양 세포를 에토포시드 유도 아폽토시스로부터 보호하는 것으로 확인되었으며[Sell 등, Cancer Res. 55:303-306, 1995], 더욱 더 극적인 것은, 야생형 수준 이하로 IGF-IR 농도를 감소시키면 생체내 종양 세포의 대규모 아폽토시스를 유발한다는 것이었다[Resnicoff 등, Cancer Res. 55:2463-2469, 1995].
증가된 IGF-I, 증가된 IGF-II 및/또는 증가된 IGF-IR 수용체 농도와 관련된 세포 증식을 억제할 수 있는 방법 또는 아폽토시스를 유도할 수 있는 방법으로는 IGF-I 농도 또는 IGF-II 농도를 저하시키거나 또는 IGF-IR에 대한 IGF-I의 결합을 막는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 장시간 작용성 소마토스타틴 유사체 옥트레오타이드는 IGF 합성 및/또는 분비를 감소시키는 데 사용되었다. 가용성 IGF-IR은 생체내 종양 세포의 아폽토시스를 유도하고 실험 동물 시스템에서 종양 발생을 억제하는 데 사용되었다[D'Ambrosio 등, Cancer Res. 56:4013-20, 1996]. 또한, IGF-IR 안티센스 올리고뉴클레오티드, IGF-I의 펩티드 유사체 및 IGF-IR에 대한 항체는 IGF-I 또는 IGF-IR 발현을 감소시키는 데 사용되었다(상기 문헌 참조). 그러나, 이 들 화합물 중 어느 것도 인간 환자에게 장기간 투여하기에는 적합하지 않았다. 게다가 IGF-I은 소인증, 골다공증, 근육량 감소, 신경장해 또는 당뇨병의 치료를 위해 환자에게 투여되었으나, IGFBP에 대한 IGF-I의 결합은 종종 IGF-I을 사용한 치료를 어렵게 하거나 무효가 되게 하였다.
따라서, IGF-I 및/또는 IGF-IR이 과발현된 암 및 기타 증식성 장애와 같은 병에서 IGF-I 및 IGF-IR이 하는 역할과, IGF-I 및/또는 IGF-IR이 저발현된 소인증 및 허약함과 같은 장애에서는 IGF-I 및 IGF-IR이 하는 역할이 거의 없다는 점을 고려하여, IGF-IR을 억제 또는 자극하는 데 사용될 수 있는 IGF-IR에 대한 항체를 생성하는 것이 바람직할 것이다. 항-IGF-IR 항체는 자가면역 질환이 있는 특정 환자에서 발견되었지만, 이들 항체 중 어느 것도 정제되지 않았으며, 어떤 것도 진단 또는 임상적 절차를 위해 IGF-I 활성을 억제하는 데에는 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 예를 들어 문헌[Thompson 등, Pediat. Res. 32:455-459, 1988; Tappy 등, Diabetes 37:1708-1714, 1988; Weightman 등, Autoimmunity 16:251-257, 1993; Drexhage 등, Nether. J. of Med. 45:285-293, 1994]을 참조하라. 따라서, 인간의 병을 치료하는 데 사용될 수 있는 고친화성의 인간 항-IGF-IR 항체를 얻는 것이 바람직할 것이다.
도 1A∼1C는 6 가지의 인간 항-IGF-IR 항체로부터의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열의 서로에 대한, 그리고 생식선 서열에 대한 정렬도를 도시한 것이다. 도 1A는 항체 2.12.1(서열 번호 1), 2.13.2(서열 번호 5), 2.14.3(서열 번호 9) 및 4.9.2(서열 번호 13)의 경쇄(VL)의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열의 서로에 대한, 그리고 생식선 VκA30 서열(서열 번호 39)에 대한 정렬도를 나타낸 것이다. 도 1B는 생식선 VκO12 서열(서열 번호 41)에 대한 항체 4.17.3의 VL의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 17)의 정렬도를 나타낸 것이다. 도 1C는 생식선 VκA27 서열(서열 번호 37)에 대한 항체 6.1.1의 VL의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 21)의 정렬도를 나타낸 것이다. 이 정렬도는 또한 각 항체로부터의 VL의 CDR 영역을 도시한다. 도 1A∼1C에 대한 컨센서스 서열은 서열 번호 53∼55에 각각 도시되어 있다.
도 2A∼2D는 6 가지의 인간 항-IGF-IR 항체로부터의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열의 서로에 대한, 그리고 생식선 서열에 대한 정렬도를 도시한 것이다. 도 2A는 생식선 VH DP-35 서열(서열 번호 29)에 대한 항체 2.12.1의 VH의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3)의 정렬도를 도시한 것이다. 도 2B는 생식선 VIV-4/4.35 서열(서열 번호 43)에 대한 항체 2.14.3의 VH의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 11)의 정렬도를 도시한 것이다. 도 2C-1 및 2C-2는 항체 2.13.2(서열 번호 7), 4.9.2(서열 번호 15) 및 6.1.1(서열 번호 23)의 VH의 뉴클레오티드 서열의 서로에 대한, 그리고 생식선 VH DP-47 서열(서열 번호 31)에 대한 정렬도를 나타낸 것이다. 도 2D는 생식선 VH DP-71 서열(서열 번호 35)에 대한 항체 4.17.3의 VH의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 19)의 정렬도를 도시한 것이다. 이 정렬도는 또한 항체의 CDR 영역을 도시한다. 도 2A∼2D에 대한 컨센서스 서열은 서열 번호 56∼59에 각각 도시되어 있다.
도 3은 항-IGF-IR 항체 2.13.2, 4.9.2 및 2.12.1가 3T3-IGF-IR 세포에 대한 IGF-I의 결합을 억제함을 보여준다.
도 4는 항-IGF-IR 항체 4.9.2가 IGF-I 유도 수용체 티로신 인산화를 억제하고(윗쪽 패널), 세포 표면에서의 IGF-IR의 하향조절을 유도한다(아랫쪽 패널)는 것을 보여준다.
도 5는 항-IGF-IR 항체 2.13.2 및 4.9.2가 3T3-IGF-IR 종양에서 IGF-IR 포스포티로신 시그널을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 6은 항-IGF-IR 항체 2.13.2 및 4.9.2가 3T3-IGF-IR 종양에서 IGF-IR을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 7은 항-IGF-IR 항체 2.13.2가 3T3-IGF-IR 생체내 종양 성장을 단독으로(왼쪽 패널) 또는 아드리아마이신과 함께(오른쪽 패널) 억제한다는 것을 보여준다.
도 8은 3T3-IGF-IR 종양에서의 항-IGF-IR 항체 2.13.2 혈청 농도와 IGF-IR 하향조절간의 관계를 나타낸 것이다.
도 9는 항-IGF-IR 항체 2.13.2를 단독으로 또는 아드리아마이신과 함께 다회 투여시 생체내 3T3-IGF-IR 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 10은 항-IGF-IR 항체 2.13.2가 아드리아마이신과 함께 생체내 큰 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 11은 항-IGF-IR 항체 2.13.2가 단독으로 또는 5-데옥시유리딘(5-FU)과 함께 생체내 Colo 205 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 12는 항-IGF-IR 항체 2.13.2를 단독으로 또는 5-FU와 함께 다회 투여시 생체내 Colo 205 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 13은 항-IGF-IR 항체 2.13.2를 단독으로 또는 택솔과 함께 다회 투여시 생체내 MCF-7 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 14는 항-IGF-IR 항체 2.13.2가 단독으로(왼쪽 패널) 또는 아드리아마이신과 함께(오른쪽 패널) 생체내 MCF-7 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 15는 항-IGF-IR 항체 2.13.2를 단독으로 또는 태목시펜과 함께 다회 투여시 생체내 MCF-7 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 16은 항-IGF-IR 항체 2.13.2를 단독으로 또는 표피 성장 인자 수용체(EGF-R) 티로신 키나제 억제제 CP-358,774와 함께 다회 투여시 생체내 A431 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
도 17은 사이노몰구스 원숭이에게 항-IGF-IR 항체 2.13.2를 1회 정맥 주사한 후의 약력학 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 항-IGF-IR 항체 2.13.2 및 아드리아마이신을 병용하면 생체내 3T3-IGF-IR 종양 상의 IGF-IR의 하향 조절을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 19A는 생식선 서열과 비교하여 항체 2.13.2 및 2.12.1의 중쇄 및 경쇄의 여러 영역에서 발생한 돌연변이의 수를 나타낸 것이다.
도 19A∼D는 항체 2.13.2 및 2.12.1의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열과 이것이 유래된 생식선 서열을 함께 정렬한 것을 나타낸 것이다. 도 19B는 항체 2.13.2의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 45)과 생식선 서열 DP-47(3-23)/D6-19/JH6의 아미노산 서열(서열 번호 46)을 함께 정렬한 것을 나타낸 것이다. 도 19C는 항체 2.13.2의 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 47)과 생식선 서열 A30/Jk2의 아미노산 서열(서열 번호 48)을 함께 정렬한 것을 나타낸 것이다. 도 19D는 항체 2.12.1의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 49)과 생식선 서열 DP-35(3-11)/D3-3/JH6의 아미노산 서열(서열 번호 50)을 함께 정렬한 것을 나타낸 것이다. 도 19E는 항체 2.12.1의 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 51)과 생식선 서열 A30/Jk1의 아미노산 서열(서열 번호 52)을 함께 정렬한 것을 나타낸 것이다. 도 19B∼E에서, 시그널 서열은 이탤릭체로 표시하고 CDR에는 밑줄을 그었으며, 불변 도메인은 진한 글씨로 표시하고, 프레임워크(FR) 돌연변이는 아미노산 잔기 위에 플러스 표시("+")로 강조하였고, CDR 돌연변이는 아미노산 잔기 위에 별표로 강조하였다.
발명의 개요
본 발명은 IGF-IR에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부, 바람직하게는 영장류 및 인간 IGF-IR에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부, 더욱 바람직하게는 IGF-IR에 결합하는 분리된 인간 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 IGF-IR에 대한 IGF-I 또는 IGF-II의 결합을 억제하는 항-IGF-IR 항체를 제공하며, 또한 IGF-IR을 활성화시키는 항-IGF-IR 항체를 제공한다.
본 발명은 항체와 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이 약학 조성물은 또다른 성분, 예컨대 항종양제 또는 영상제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 진단 및 치료 방법을 제공한다. 진단 방법은 항-IGF-IR 항체를 사용하여 IGF-IR 발현 조직의 존재 또는 위치를 진단하는 방법을 포함한다. 치 료 방법은 항체를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것, 바람직하게는 항체와 다른 치료제를 함께 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 항-IGF-IR 항체를 생산하는 분리된 세포주, 예컨대 하이브리도마를 제공한다.
본 발명은 또한 항-IGF-IR 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합 부를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공할 뿐만 아니라, 이 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 재조합에 의해 생산하는 방법도 제공한다.
항-IGF-IR 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 비인간 형질전환 동물 역시 제공한다. 본 발명은 또한 항-IGF-IR 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자의 유효량을 이를 필요로 하는 피험체에게 처리하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
정의 및 일반적 기법
본 명세서에서 달리 정의하지 않는다면 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 문맥상 다른 의미를 요하지 않는다면 단수로 나타낸 용어는 복수 형태를 포함하며, 복수 용어는 단수 용어를 포함한다. 일반적으로 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이러한 것들의 기법은 잘 알려져 있는 것으로 당업계에서 통상적으로 이용된다. 본 발명의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 주지된 통상적 방법에 따라, 다른 언급이 없다면 본 명세서 전반에 걸쳐 인용 및 기술된 다양한 일반적 참고 문헌 및 보다 특수한 참고 문헌에 기술된 대로 수행된다. 참고 문헌의 예로는 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992), 및 Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1990)]이 있으며, 이들은 모두 본원에서 참고 문헌으로 포함한다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조업자의 설명서에 따라서 당업계에서 통상적으로 실시하는 대로, 또는 본원에서 기술하는 대로 수행한다. 본원에서 기술하는 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 화학 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 실험 절차 및 기법은 당업계에 널리 공지되어 있으며 통상적으로 이용되고 있다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제 제조, 제형화 및 전달 및 환자의 치료에는 표준 기법이 이용된다.
하기 용어들은 다른 언급이 없다면 아래에서 설명하는 의미를 갖는 것으로 이해하면 된다.
"폴리펩티드"란 용어는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
"분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩티드"란 용어는 유래 기원 또는 소스의 측면에서 (1) 그 천연 상태에서 수반되는 자연적 회합 성분들과 회합되어 있지 않 거나, (2) 같은 종 유래의 다른 단백질이 없거나, (3) 다른 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연 상태에는 나타나지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 또는 그것의 자연적 기원인 세포와는 다른 세포계 에서 합성되는 폴리펩티드는 그것이 자연적으로 회합된 성분들과는 "분리된" 상태가 될 것이다. 단백질은 또한 당업계에 잘 알려진 단백질 정제 기법을 이용하여 분리에 의해 자연적으로 회합된 성분들이 실질적으로 제거되도록 할 수 있다.
샘플의 약 60∼75% 이상이 단일 폴리펩티드 종을 나타낼 때 단백질 또는 폴리펩티드는 "실질적으로 순수한" 상태, "실질적으로 균질한" 상태 또는 "실질적으로 정제된" 상태이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 일반적으로 단백질 샘플의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(w/w)를 차지하며, 보다 일반적으로는 약 95%, 바람직하게는 99% 이상이 순수한 것이다. 단백질 순도 또는 균질성은 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 당업계에 공지된 염색법으로 겔을 염색하여 단일 폴리펩티드 밴드를 시각화하는 방법과 같은 당업계에 잘 알려져 있는 다수의 방법에 의해 나타낼 수 있다. 특정한 목적을 위해서는 HPLC 또는 당업계에 잘 알려진 기타 정제 수단을 이용하여 더 높은 해상도를 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드 단편"이란 용어는 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실이 있지만, 나머지 아미노산 서열은 자연 발생 서열의 대응 위치와 동일한 폴리펩티드를 칭한다. 단편은 통상 아미노산 길이가 5, 6, 8 또는 10개 이상이며, 바람직하게는 14개 이상, 보다 바람직하게는 20개 이상, 통상적으로 50개 이 상, 더욱 더 바람직하게는 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상이다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드 유사체"란 용어는 아미노산 서열의 일부분과 실질적인 동일성을 나타내고 하기 특성 중 하나 이상을 보유하는 25개 이상의 아미노산의 분절로 이루어진 폴리펩티드를 말한다: (1) 적절한 결합 조건하에서 IGF-IR에 특이적으로 결합하는 특성, (2) IGF-IR에 대한 IGF-I 또는 IGF-II 결합을 차단하는 능력, 또는 (3) 시험관내 또는 생체내에서 IGF-IR 세포 표면 발현 또는 티로신 인산화를 감소시키는 능력. 일반적으로 폴리펩티드 유사체는 자연 발생 서열에 대하여 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 통상 그 길이가 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산이며, 종종 전길이 자연 발생 폴리펩티드만큼 길 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키는 것, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키는 것, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화력을 변화시키는 것, (4) 결합 친화력을 변화시키는 것, (5) 이러한 유사체의 기타 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변화시키는 것이다. 유사체는 자연 발생 펩티드 서열과는 다른, 서열의 다양한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 자연 발생 서열(바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에 있는 서열)에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예컨대, 치환 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나, 또는 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 파 괴하는 경향이 있어서는 안된다). 당업계에 인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York(1984); Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991); 및 Thornton 등, Nature 354:105(1991)]에 개시되어 있으며, 이 문헌들은 각각 본원에서 참고 문헌으로 포함한다.
비펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 약물로서 제약 산업에서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물을 "펩티드 모의체"(peptide mimetic 또는 peptidomimetic)라 한다. 문헌[Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986); Veber and Freidinger TINS p. 392(1985); 및 Evans 등, J. Med. Chem. 30:1229(1987)]을 참고로 할 수 있으며, 이들 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 포함한다. 이러한 화합물들은 종종 전산화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적 유용성이 있는 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모의체는 등가의 치료 또는 예방 효과를 산출하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 펩티드 모의체는 전형(paradigm) 폴리펩티드(즉, 목적하는 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 인간 항체와 구조가 유사하지만, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 이루어진 군에서 선택된 결합에 의해 선택적으로 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해서 같은 유형의 D-아미노산(예컨대, L-리신 대신에 D-리신)으로 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 계획적으로 치환할 수도 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 제한된 펩티드를 당업계에 공지된 방법[Rizo 및 Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387(1992), 본원에서 참고로 인용함]에 의해; 예컨대 펩티드를 고리로 만드는 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써 생성할 수 있다.
"면역글로불린"은 사량체 분자이다. 자연 발생적 면역글로불린에서 각 사량체는 두개의 동일한 폴리펩티드 사슬쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50∼70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단부는 항원 인식에 있어서 주된 역할을 하는 약 100∼110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단부는 이펙터 기능에 있어서 주된 역할을 하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 κ및 λ경쇄로 분류된다. 중쇄는 μ, Δ, γ, α또는 ε으로 분류되며, 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에는 가변 영역과 불변 영역이 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함한다. 개괄적인 내용은 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7(Paul W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989), 본원에서 참고 문헌으로 포함함]을 참조하라. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항체 결합 부위를 형성함으로써 완전한 면역글로불린은 두개의 결합 부위를 갖게 된다.
면역글로불린 사슬은 3개의 초가변 영역(이른바 상보성 결정 영역, 즉 CDR이 라 불리기도 함)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)과 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두개의 사슬의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특정 에피토프에 결합될 수 있게 된다. N-말단에서 C-말단에 이르기까지 경쇄 및 중쇄 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 Kabat[Sequences of Proteins of Immunological Interest](국립보건원, Bethesda, Md.(1987 및 1991), 또는 Chothia & Lesk의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)]; Chothia 등의 문헌[Nature 342:878-883(1989)]의 정의에 따라서 이루어진다.
"항체"란 특이적 결합에 대해 완전한 항체와 경쟁하는 완전한 면역글로불린 또는 이의 항원 결합부를 칭한다. 항원 결합부는 재조합 DNA 기법 또는 완전한 항체의 효소적 분해 또는 화학적 분해에 의해 제조할 수 있다. 항원 결합부는 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAv 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 사슬 항체(scFv), 키메라 항체, 다이아바디(diabody) 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 예컨대 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 및 6.1.1로 칭하는 항체는 동일한 명칭의 하이브리도마에서 유래된 항체이다. 예를 들어 항체 2.12.1은 하이브리도마 2.12.1에서 유래된 것이다.
Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH I 도메인으로 이루어진 1가 단편이며, F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 두개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이고, Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성되며, Fv 단편은 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되고, dAb 단편[Ward 등, Nature 341:533-546, 1989]은 VH 도메인으로 구성된다.
단일 사슬 항체(scFv)는 VL 및 VH 영역이 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커를 통해 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 항체이다[Bird 등, Science 242:423-426, 1988 및 Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988]. 다이아바디는 2가의 이중 특이적 항체로서, 이것의 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되나, 두 도메인이 같은 사슬에서 쌍을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 그 도메인들이 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 두개의 항원 결합 부위를 형성하게 한다[참조: Holliger, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993 및 Poljak, R. J. 등, Structure 2:1121-1123, 1994]. 하나 이상의 CDR을 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 한 분자 내에 포함시켜서 면역어드헤신(immunoadhesin)을 만들게 할 수 있다. 면역어드헤신은 더 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)을 포함할 수 있으며, 다른 폴리펩티드 사슬에 CDR(들)을 공유 결합시킬 수 있거나, 또는 CDR(들)을 비공유 결합에 의해 포함할 수 있다. CDR은 면역어드헤신이 목적하는 특정 항원에 특이적으로 결합되도록 한다.
항체는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 이상의 결합 부위가 존재한다면 그 결합 부위는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 천연 면역글로불 린은 두개의 동일한 결합 부위를 가지며, 단일 사슬 항체 또는 Fab 단편은 하나의 결합 부위를 갖는 반면, "이중 특이적" 또는 "이작용성" 항체는 두개의 상이한 결합 부위를 갖는다.
"분리된 항체"는 자연적으로 회합되는 다른 항체를 포함하여 천연 상태에서 수반되는 자연적으로 회합되는 성분들과 회합되어 있지 않거나, (2) 같은 종 유래의 다른 단백질이 없거나. (3) 다른 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연적으로는 나타나지 않는 항체이다. 분리된 항체의 예로는 IGF-IR을 사용하여 친화성 정제한 항-IFR-IR 항체, 시험관내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 합성된 항-IGF-IR 항체 및 형질전환 마우스에서 유래된 인간 항-IGF-IR 항체를 포함한다.
"인간 항체"란 용어는 인간 면역글로불린 서열 유래의 하나 이상의 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 가변 및 불변 도메인 모두 인간 면역글로불린 서열(완전한 인간 항체)에서 유래된 것이다. 이들 항체는 후술하는 바와 같이 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
인간화된 항체는 비인간 종에서 유래된 항체이며, 이때 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 및 불변 도메인 내의 특정 아미노산에는 인간의 면역 반응을 피하거나 파괴하도록 돌연변이가 일어났다. 대안으로 인간화된 항체는 비인간 종의 가변 도메인에 인간 항체 유래의 불변 도메인을 융합시켜서 제조할 수 있다. 인간화된 항체의 제조 방법의 예는 미국 특허 제6,054,297호, 제5,886,152호 및 제5,877,293호에서 찾아볼 수 있다.
"키메라 항체"란 용어는 한 항체에서 유래된 하나 이상의 영역과 하나 이상의 다른 항체에서 유래된 하나 이상의 영역을 포함하는 항체를 말한다. 바람직한 구체예에서, CDR 중 하나 이상은 인간 항-IGF-IR 항체에서 유래된 것이다. 보다 바람직한 구체예에서, CDR 모두는 인간 항-IGF-IR 항체에서 유래된 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서 1종 이상의 인간 항-IGF-IR 항체에서 유래된 CDR을 키메라 항체에서 혼합하여 매치시킨다. 예를 들어, 키메라 항체는 제1 인간 항-IGF-IR 항체의 경쇄 유래의 CDR1을 포함할 수 있으며, 제2의 인간 항-IGF-IR 항체의 경쇄 유래의 CDR2 및 CDR3와 결합될 수 있으며, 중쇄 유래의 CDR은 제3의 항-IGF-IR 항체에서 유래될 수 있다. 또한 프레임워크 영역은 동일한 항-IGF-IR 항체 중 하나, 1종 이상의 상이한 항체, 예컨대 인간 항체에서 유래된 것일 수도 있고, 또는 인간화된 항체에서 유래된 것일 수도 있다.
"중화 항체" 또는 "억제성 항체"란 과량의 항-IGF-IR 항체가 IGF-IR에 결합된 IGF-I의 양을 약 20% 이상 감소시키는 경우 IGF-I에 대한 IGF-IR의 결합을 억제하는 항체를 말한다. 바람직한 구체예에서, 이 항체는 IGF-IR에 결합된 IGF-I의 양을 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 더더욱 바람직하게는 85% 이상 감소시킨다. 결합 감소량은, 예를 들어 시험관내 경쟁적 결합 분석에서 측정되는 바와 같이 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 측정할 수 있다. IGF-IR에 대한 IGF-I의 결합 감소량을 측정하는 방법의 한 예는 하기 실시예 IV에 제시되어 있다.
"활성화 항체"란 IGF-IR을 발현하는 세포, 조직 또는 유기체에 첨가했을 때 IGF-IR을 약 20% 이상 활성화시키는 항체를 말한다. 바람직한 구체예에서 이 항체는 IGF-IR 활성을 40% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 더더욱 바람직하게는 85% 이상 활성화시킨다. 보다 바람직한 구체예에서 활성화 항체는 IGF-I 또는 IGF-II의 존재 하에 첨가된다. 또다른 바람직한 구체예에서 활성화 항체의 활성은 IGF-IR의 티로신 자가 인산화의 양을 결정함으로써 측정된다.
항체의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시에 따라 당업자가 쉽게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 및 카르복시 말단은 기능적 도메인의 경계 부근에 존재한다. 구조적 및 기능적 도메인은 공개 또는 독점 서열 데이터베이스와 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 비교하여 확인할 수 있다. 바람직하게는 공지된 구조 및/또는 기능을 갖는 다른 단백질에 존재하는 서열 모티프 또는 예상 아미노산 구조 도메인을 확인하기 위해 전산화된 비교 방법을 이용한다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하기 위한 방법은 공지되어 있다[Bowie 등, Science 253:164(1991)].
본원에서 사용된 "표면 플라스몬 공명"이란 용어는, 예를 들어 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내에서의 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 이중 특이적 상호작용을 분석할 수 있도록 하는 광학적 현상을 의미한다. 추가 설명에 대해서는 문헌[Jonsson, U. 등(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U. 등(1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B. 등(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnson, B. 등(1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조하라.
용어 "Koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 오프 속도(off rate) 상수이다.
용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수이다.
용어 "에피토프"란 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정소를 포함한다. 에피토프 결정소는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지며, 통상 특수한 3차원적 구조 특성뿐만 아니라 특수한 하전 특성을 갖는다. 해리 상수가 1 μM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 가장 바람직하게는 10 nM 이하일 때 항체가 항원에 특이적으로 결합한다라고 한다.
본 명세서에서 20개의 통상적 아미노산 및 그 약어는 통상적인 용법에 따른다. 본원에서 참고로 인용하는 문헌[Immunology - A Synthesis(2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991)]을 참조하라. 20개의 통상적 아미노산의 입체이성체(예컨대, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨 대 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 기타 비통상적인 아미노산 역시 본 발명의 폴리펩티드의 적합한 성분이 될 수 있다. 비통상적 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, s-N-메틸아르기닌 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(예컨 대, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용된 폴리펩티드 표시법에서는, 표준 용법 및 규정에 따라 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향이 카르복시 말단 방향이다.
"폴리뉴클레오티드"란 용어는 염기 길이가 10개 이상인 뉴클레오티드의 중합체 형태로서, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 둘 중 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어는 한가닥 및 두가닥 형태의 DNA를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "분리된 폴리뉴클레오티드"란 용어는 게놈 DNA, cDNA 또는 합성된 DNA의 폴리뉴클레오티드 또는 이들 중 일부의 조합을 의미하며, 그 기원에 따라 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "분리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 회합되어 있지 않거나, (2) 자연 상태에서 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로(operably) 연결되어 있거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연적으로 나타나지 않는 것이 될 수 있다.
본원에서 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 자연 발생 및 비자연 발생 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결되어 있는 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 이하의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서브세트이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼60 염기이며, 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20∼40 염기이다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 프로브의 경우 일반적으로 한가닥이지 만, 예를 들어 유전자 돌연변이 제조에 사용되는 경우에는 두가닥일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "자연 발생 뉴클레오티드"란 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. "변형된 뉴클레오티드"란 용어는 변형되거나 치환된 당 기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "올리고뉴클레오티드 결합"이란 용어는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포아닐로티오에이트, 포스포아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들어, 문헌[LaPlanche 등 Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec 등 J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein 등, Nucl. Acids Res. 16:3209(1988); Zon 등, Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon 등, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991); Stec 등의 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann 및 Peyman, Chemical Reviews 90:543(1990)]을 참조로 할 수 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에서 참고 문헌으로 포함한다. 올리고뉴클레오티는 필요에 따라 검출을 위해 표지를 포함할 수 있다.
"작동적으로 연결된(operably linked)" 서열은 목적하는 유전자와 연속되는 발현 조절 서열과 목적하는 유전자를 조절하기 위해 일정 거리를 두고 작용하거나 트랜스로 작용하는 발현 조절 서열 둘다를 포함한다. 본 명세서에서 "발현 조절 서열"이란 용어는 이들이 결찰되어 있는 암호화 서열의 발현 및 프로세싱이 일어나도 록 하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열로는 적절한 전사 개시 서열, 전사 종결 서열, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 시그널, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증대시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 강화시키는 서열을 포함하며, 필요에 따라 단백질 분비를 증가시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라진다. 원핵 생물에서는 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하고, 진핵 생물에서는 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열"이란 용어는, 최소한, 발현 및 프로세싱에 필수적으로 존재해야 하는 모든 성분들을 포함하는 것으로, 존재하는 것이 이로운 부가적인 성분들, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"란 용어는 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형으로는 "플라스미드"가 있으며, 이것은 부가적인 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형의 두가닥 DNA 루프를 칭한다. 벡터의 다른 유형으로는 바이러스 벡터가 있으며, 이 경우 부가적 DNA 분절이 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 스스로 복제할 수 있다(예컨대, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입된 후 숙주 세포의 게놈으로 통합되어서, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이 벡터에 작동적으로 연결되어 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있 다. 이러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 칭한다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태를 취한다. 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"는 서로 같은 의미로 사용되는데, 그 이유는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 대등한 역할을 하는 발현 벡터의 다른 형태를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 칭하는 의미이다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그 세포의 자손을 칭하는 의미로 이해되어야 한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 후대에도 나타날 수 있기 때문에, 그 자손은 실제로 어버이 세포와 동일하지는 않지만 본 명세서에서 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 속하는 것으로 볼 수 있다.
"선택적으로 하이브리드화하는"이란 용어는 검출 가능하게 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출 가능한 인식할 만한 양의 결합을 최소화하는 하이브리드화 및 세척 조건하에서 핵산 가닥에 선택적으로 하이브리드화한다. "고엄중도" 또는 "고도로 엄중한" 조건을 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 기술하는 선택적 하이브리드화 조건을 얻기 위해 이용할 수 있다. "고엄중도" 또는 "고도로 엄중한" 조건의 한 예는 6 x SSPE 또는 SSC, 50% 포름아미드, 5 x 덴하르 트 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍/㎖의 변성 및 단편화된 연어 정자 DNA로 이루어진 하이브리드화 완충액에서 42℃의 하이브리드화 온도에서 12∼16 시간 동안 한 폴리뉴클레오티드를 멤브레인과 같은 고체 표면에 고정시킨 후 1 x SSC, 0.5% SDS로 이루어진 세척 완충액을 사용하여 55℃에서 2회 세척하는 과정을 포함하는, 한 폴리뉴클레오티드와 다른 폴리뉴클레오티드를 항온처리하는 방법이다. 이에 대해서는 Sambrook 등의 상기 문헌, pp. 9.50-9.55를 참조하라.
핵산 서열과 관련하여 사용되는 "퍼센트 서열 동일성"이란 용어는 최대 상응성에 대해 정렬하였을 때 동일한 두 서열에서의 잔기를 말한다. 서열 동일성 비교대상의 길이는 연속되는 약 9개 이상의 뉴클레오티드가 될 수 있으며, 일반적으로 약 18개 이상, 더 일반적으로는 약 24개 이상, 통상 약 28개 이상, 보다 통상적으로 약 32개 이상, 바람직하게는 약 36개, 48개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는 데 이용될 수 있는 다수의 상이한 알고리즘이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 이용하여 비교할 수 있으며, 상기 프로그램들은 위스콘신주 매디슨 소재의 유전학 컴퓨터 그룹(GCG)의 위스콘신 패키지 버전 10.0에 속한다. FASTA는, 예컨대 프로그램 FASTA2 및 FASTA3를 포함하며, 의문의 서열과 검색 서열간의 최적 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258(1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84(1998); 모두 본 명세서에서 참고로 인용함]. 다른 언급이 없다면 특정 프로그램 또는 알고 리즘에 대해 디폴트 매개변수를 이용한다. 예를 들어 핵산 서열들간의 퍼센트 서열 동일성은 디폴트 매개변수(단어 크기 6 및 득점 행렬을 위한 NOPAM 팩터)를 이용하는 FASTA를 사용하거나 GCG 버전 6.1(본원에서 참고로 인용함)에 제공된 바와 같은 디폴트 매개변수를 이용하는 Gap을 사용하여 결정할 수 있다.
핵산 서열이라고 말할 때는 다른 언급이 없다면 그 상보 서열을 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산 분자를 칭할 때는 그 상보 서열 가닥을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
분자생물학 분야의 연구자들은 "퍼센트 서열 동일성", "퍼센트 서열 유사성" 및 "퍼센트 서열 상동성"이란 용어를 서로 같은 의미로 사용한다. 본 출원에서 이들 용어는 핵산 서열에 대하여 말할 때만 같은 의미를 갖는다.
핵산 또는 그 단편과 관련하여 사용되는 "실질적인 유사성" 또는 "실질적인 서열 유사성"이란 용어는 다른 핵산(또는 이의 상보 서열 가닥)과 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 대하여 최적으로 정렬하였을 때, 임의의 잘 알려져 있는 서열 동일성의 알고리즘, 예컨대 전술한 바와 같은 FASTA, BLAST 또는 Gap으로 측정시 뉴클레오티드 염기의 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
폴리펩티드와 관련하여 사용되는 "실질적인 동일성"이란 용어는 디폴트 갭 가중치를 이용한 프로그램인 GAP 또는 BESTFIT 등에 의해 최적으로 정렬하였을 때 두 펩티드 서열이 75% 또는 80% 이상, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 서로 다른 것이 바람직하다. "보존적 아미노산 치환"이란 하나의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하 또는 소수성)을 보유하는 측쇄(R기)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것을 의미한다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 다를 경우, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사성 정도는 치환의 보존성을 보정하기 위해 상향으로 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다[참조: Pearson, Methods Mol. Biol. 24:307-31(1994), 본원에서 참고로 인용함]. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 보유하는 아미노산 그룹의 예로는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신; (2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 및 (6) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이 있다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다.
대안으로, 보존적 치환은 본원에서 참고로 인용하는 문헌[Gonnet 등, Science 256:1443-45(1992)]에 개시된 PAM250 로그 우도 행렬에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당히 보존된" 치환이란 PAM250 로그 우도 행렬에서 음의 값이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩티드의 서열 유사성은 서열 동일성이라고도 부르며, 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 비롯하여 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 할당된 유사성 기준을 이용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG는 "Gap" 및 "Bestfit"와 같은 프로그램을 포함하며, 이 프로그램은 서로 다른 종의 유기체에서 유래된 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩티드간의 서열 상동성 또는 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 돌연변이간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위한 디폴트 매개변수를 이용하여 사용할 수 있다[예컨대 GCG 버전 6.1 참조]. 폴리펩티드 서열은 또한 디폴트 또는 추천 매개변수를 이용하는 FASTA를 사용하여 비교할 수 있는데, 이 FASTA는 GCG 버전 6.1에 속하는 프로그램이다. FASTA(예컨대, FASTA2 및 FASTA3)는 의문의 서열과 검색 서열간의 최적 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다[Pearson(1990); Pearson(2000)]. 서로 다른 유기체 유래의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스에 본 발명의 서열을 비교할 때 또다른 바람직한 알고리즘은 프로그램 디폴트 매개변수를 이용하는 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다[참조: Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990); Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-402(1997); 본원에서 참고로 인용함].
상동성을 알기 위해 비교하는 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 약 16개 이상의 아미노산 잔기, 통상적으로 약 20개 이상의 잔기, 보다 통상적으로는 약 24개 이상의 잔기, 통상 약 28개 이상의 잔기, 바람직하게는 약 35개 이상의 잔기이다. 서로 다른 다수의 유기체에서 유래된 서열을 포함하는 데이터베이스를 검색할 때에는 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 "표지" 또는 "표지된"이란 용어는 항체에 다른 분자를 혼입시키는 것을 의미한다. 한 구체예로서 표지는 검출 가능한 마커이며, 예컨대 방사능 표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹된 아비딘(예컨대 광학적 방법 또는 색체계 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 부위의 폴리펩티드에 부착시키는 것이 있다. 또다른 구체예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예컨대 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 또는 당단백질의 다양한 표지 방법이 당업계에 공지되어 있으며 이를 이용할 수 있다. 폴리펩티드 표지의 비제한적인 예로는 방사능 동위원소 또는 방사능 핵종(예컨대, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예컨대, FITC, 로다민, 란탄계열 인광체), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼라인 포스파타제), 화학발광성 마커, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프(예컨대, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 물질, 예컨대 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예컨대 백일해 독소, 택솔, 사이토칼라신 B, 그래미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로케인, 테트라케인, 리도케인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이 신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다. 몇몇 구체예에서 표지에는 잠재적인 공간적 방해를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암이 부착된다.
본 명세서에서 사용된 "작용제(제제)"란 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 고분자, 또는 생물학적 물질로 만들어진 추출물을 칭하는 것이다. 본 명세서에서 사용된 "약제 또는 약물"이란 용어는 환자에게 적절히 투여될 경우 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 칭한다. 본 명세서의 다른 화학 용어는 당업계의 통상적인 용법에 따라 사용되며, 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parkers, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985), 본원에서 참고로 인용함]에 예시되어 있다.
"항신생물제"란 용어는 인간의 신생물, 특히 악성(암) 병변, 예컨대 암종, 육종, 림프종, 또는 백혈병의 발생 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 작용제를 칭한다. 전이의 억제가 종종 항신생물제의 한 특성이다.
환자라는 용어에는 인간과 수의학적 피험체가 포함된다.
인간 항-IGF-IR 항체 및 이의 특성 규명
인간 항체는 마우스 또는 래트의 가변 영역 및/또는 불변 영역을 보유하는 항체와 관련된 문제점 중 일부를 예방할 수 있다. 이러한 마우스 또는 래트 유래 서열의 존재는 항체의 급속한 제거를 초래할 수 있거나, 또는 항체에 대한 환자의 면역 반응의 유발을 유도할 수 있다. 따라서, 한 구체예로서 본 발명은 인간화된 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 면역글로불린 유전자를 설치류 동물에 도입하여 그 설치류 동물이 완전한 인간 항체를 생성하도 록 함으로써 완전한 인간 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 완전한 인간 항-인간 IGF-IR 항체가 더 바람직하다. 완전한 인간 항-IGF-IR 항체는 마우스 또는 마우스에서 유도체화된 모노클로날 항체(Mab)에 내재하는 면역 반응 및 알러지 반응을 최소화함으로써 투여된 항체의 효능과 안전성을 증가시킬 것으로 예상된다. 완전한 인간 항체의 사용은, 반복된 항체 투여를 요할 수 있는 만성 및 재발성 인간 질병, 예컨대 염증 및 암의 치료에 있어서 상당한 이익이 될 것으로 예상할 수 있다. 또다른 구체예에서 본 발명은 보체에 결합하지 않는 항-IGF-IR 항체를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22 중에서 선택된 아미노산, 또는 이들 아미노산으로부터의 하나 이상의 CRD을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또다른 바람직한 구체예로서 항-IGF-IR 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함한다.
항-IGF-IR 항체의 클래스 및 서브클래스
항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 구체예에서 항체는 IgG이며, IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형이 있다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 서브클래스 IgG2이다. 또다른 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1과 동일한 클래스 및 서브클래스로서 IgG2이다.
항-IGF-IR 항체의 클래스 및 서브클래스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로 항체의 클래스 및 서브클래스는 항체의 특정 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 항체는 시판된다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 웨스턴 블롯 및 기타 기법으로 결정할 수 있다. 대안으로 클래스 및 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부를 시퀀싱하고, 이들 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지된 아미노산 서열과 비교한 후 그 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정하는 과정에 의해 결정될 수 있다.
종 및 분자 선택성
본 발명의 또다른 양태에서 항-IGF-IR 항체는 종과 분자 선택성을 모두 나타낸다. 한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 인간, 사이노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이의 IGF-IR에 결합한다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 마우스, 래트, 기니 피그, 개 또는 토끼 IGF-IR에 결합하지 않는다. 또다른 바람직한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체는 마모셋과 같은 신대륙 원숭이 종에 결합하지 않는다. 명세서의 교시에 따라 당업계에 공지된 방법을 이용하여 항-IGF-IR 항체에 대한 종 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어 웨스턴 블롯, FACS, ELISA 또는 RIA를 이용하여 종 선택성을 결정할 수 있다. 바람직한 구체예에서 웨스턴 블롯을 이용하여 종 선택성을 결정할 수 있다.
또다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 인슐린 수용체에 대한 선택성보다 50배 이상 더 큰 IGF-IR에 대한 선택성을 보유한다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항 체의 선택성은 인슐린 수용체에 대한 선택성보다 100배 더 크다. 보다 더 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 IGF-IR 외의 임의의 다른 단백질에 어떠한 인식할 만한 특이적인 결합을 나타내지 않는다. 본 명세서의 교시에 따라 당업계에 공지된 방법을 이용하여 IGF-IR에 대한 항-IGF-IR 항체의 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS, ELISA 또는 RIA를 이용하여 선택성을 결정할 수 있다. 바람직한 구체예에서 웨스턴 블롯을 이용하여 분자 선택성을 결정할 수 있다.
IGF-IR에 대한 항-IGF-IR의 결합 친화력
본 발명의 또다른 양태에서 항-IGF-IR 항체는 IGF-IR에 높은 친화력으로 결합한다. 한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 Kd = 1 x 10-8 M 이하로 IGF-IR에 결합한다. 보다 바람직한 구체예에서 항체는 Kd = 1 x 10-9 M 이하로 IGF-IR에 결합한다. 보다 바람직한 구체예에서 항체는 Kd = 5 x 10-10 M 이하로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 Kd = 1 x 10-10 M 이하로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중에서 선택되는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중에서 선택되는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 중에서 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 중에서 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 IGF-IR에 결합한다.
본 발명의 또다른 양태에서 항-IGF-IR 항체는 낮은 해리 속도를 갖는다. 한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 Koff가 1 x 10-4 s-1 이하이다. 바람직한 구체예에서 Koff는 5 x 10-5 s-1 이하이다. 또다른 바람직한 구체예에서 Koff 는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중에서 선택되는 항체와 실질적으로 동일하다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중에서 선택되는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 중에서 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 IGF-IR에 결합한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 중에서 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 IGF-IR에 결합한 다.
IGF-IR에 대한 항-IGF-IR 항체의 결합 친화력 및 해리 속도는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 한 구체예에서 결합 친화력은 경쟁적 ELISA, RIA 또는 표면 플라스몬 공명, 예컨대 BIAcore에 의해 측정할 수 있다. 해리 속도 역시 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서 결합 친화력 및 해리 속도는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 결합 친화력 및 해리 속도는 BIAcore를 이용하여 측정한다. 결합 친화력 및 해리 속도를 결정하는 한 예를 하기 실시예 II에 기재하였다.
항-IGF-IR 항체의 반감기
본 발명의 또다른 목적에 따르면 항-IGF-IR 항체는 시험관내 또는 생체내에서 반감기가 1일 이상이다. 바람직한 구체예에서 항체 또는 이의 일부분의 반감기는 3일 이상이다. 보다 바람직한 구체예에서 항체 또는 이의 일부분의 반감기는 4일 이상이다. 또다른 구체예에서 항체 또는 이의 일부분의 반감기는 8일 이상이다. 또다른 구체예에서 항체 또는 이의 항원 결합부는 후술하는 바와 같이 반감기를 증가시키기 위해 유도체화시키거나 변형시킨다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 2000년 2월 24일에 공개된 WO 00/09560에 기재된 바와 같이 혈청 반감기를 증가시키기 위해 점 돌연변이를 포함할 수 있다.
항체 반감기는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어 항체 반감기는 웨스턴 블롯, ELISA 또는 RIA에 의해 적절한 시기 동안 측정할 수 있다. 항체 반감기는 임의의 적절한 동물, 예컨대 사이노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 영장류 동물 또는 인간에서 측정할 수 있다.
항-IGF-IR 항체에 의해 인식되는 IGF-IR 에피토프의 동정
본 발명은 또한 인간 항-IGF-IR 항체와 동일한 항원 또는 에피토프에 결합하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 항-IGF-IR 항체와 서로 경쟁하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서 인간 항-IGF-IR 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1이다. 또다른 바람직한 구체예에서 인간 항-IGF-IR은 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중에서 선택되는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 인간 항-IGF-IR은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 중에서 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 인간 항-IGF-IR은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 중에서 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함한다. 매우 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 또다른 인간 항체이다.
당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 항-IGF-IR 항체가 동일한 항원에 결합하는지를 결정할 수 있다. 예를 들어 항-IGF-IR 항체를 사용하여 IGF-IR과 같은 항-IGF-IR 항체에 결합하는 것으로 알려진 항원을 포획하고, 그 항체로부터 항원을 용출시킨 다음, 테스트 항체가 용출된 항원에 결합하는지를 결정함으로써 테스트 항-IGF-IR 항체가 동일한 항원에 결합하는지를 결정할 수 있다. 포화 조건하에 항-IGF-IR 항체를 IGF-IR에 결합시킨 다음, 테스트 항체의 IGF-IR에 대한 결합 능력을 측정함으로써 그 항체가 항-IGF-IR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정할 수 있다. 테스트 항체가 항-IGF-IR 항체와 동시에 IGF-IR에 결합할 수 있다면, 그 테스트 항체는 항-IGF-IR 항체와 다른 에피토프에 결합하는 것이다. 그러나, 테스트 항체가 IGF-IR에 동시에 결합하지 못한다면 그 테스트 항체는 인간 항-IGF-IR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것이다. 이 실험은 ELISA, RIA 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 수행할 수 있다. 바람직한 구체예에서 이 실험은 표면 플라스몬 공명을 이용하여 수행한다. 보다 바람직한 구체예는 BIAcore를 이용하는 것이다. 또한, 항-IGF-IR 항체가 항-IGF-IR 항체와 서로 경쟁하는지를 결정할 수 있다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체가 또다른 항-IGF-IR 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는지를 측정하기 위해 이용되는 것과 동일한 방법을 이용하여 항-IGF-IR 항체가 다른 항-IGF-IR 항체와 서로 경쟁하는지를 결정할 수 있다.
경쇄 및 중쇄 용법
본 발명은 또한 인간 κ유전자에 의해 암호화되는 가변 서열을 포함하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서 가변 서열은 VκA27, A30 또는 O12 유전자 계열에 의해 암호화된다. 바람직한 구체예에서 가변 서열은 인간 VκA30 유전자 계열에 의해 암호화된다. 보다 바람직한 구체예에서 경쇄는 생식선 VκA27, A30 또는 O12로부터 10개 이하의 아미노산 치환, 바람직하게는 6개 이하의 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 구체예에서 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 및 22는 6 가지의 항-IGF-IR κ경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 제공한다. 서열 번호 38, 40 및 42는 6 가지의 항-IGF κ경 쇄가 유래된 3 가지의 생식선 κ경쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 도 1A-1C는 6 가지의 항-IGF-IR 항체의 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 서로에 대해, 그리고 이들이 유래된 생식선 서열에 대해 정렬시킨 정렬도를 도시한 것이다. 본 명세서의 교시에 따라 당업자는 6 가지의 항-IGF-IR κ경쇄 및 생식선 κ경쇄의 암호화된 아미노산 서열을 결정할 수 있고, 생식선 서열과 항체 서열간의 차이를 확인할 수 있다.
바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체의 VL은 생식선 아미노산 서열에 비해 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 VL 중 어느 하나 이상과 동일한 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어 항-IGF-IR 항체의 VL은 항체 2.13.2에 존재하는 것과 동일한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 항체 2.14.3에 존재하는 것과 동일한 또다른 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 항체 4.9.2와 동일한 또다른 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 예컨대 IGF-IR에 대한 항체의 친화력 또는 항원으로부터의 해리 속도를 변화시키기 위해 서로 다른 항체 결합 특징들을 혼합하여 매치시킬 수 있다. 또다른 구체예에서 아미노산 치환은 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 VL 중 임의의 하나 이상에서 발견되는 것과 동일한 위치에서 이루어지지만, 동일한 아미노산을 사용하기보다는 아미노산 치환이 이루어진다. 예를 들어 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중 하나의 생식선과 비교한 아미노산 치환이 글루타메이트일 경우 아스파르테이트로 보존적으로 치환시킬 수 있다. 유사하게 아미노산 치환이 세린일 경우 트레오닌으로 보존적으로 치환 시킬 수 있다.
또다른 바람직한 구체예에서 경쇄는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 매우 바람직한 구체예에서 경쇄는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 경쇄의 CDR 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 경쇄는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 경쇄의 하나 이상의 CDR 영역 유래의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 경쇄는 상이한 경쇄 유래의 CDR로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 상이한 경쇄 유래의 CDR은 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1로부터 얻어진다. 또다른 바람직한 구체예에서 경쇄는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서 경쇄는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17 또는 21 중에서 선택된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 그로부터 1-10개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 또다른 구체예에서 항체 또는 이의 일부분은 람다 경쇄를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 중쇄 또는 인간 중쇄 유래의 서열을 포함하는 항-IGF-IR 항체 또는 이의 일부분을 제공한다. 한 구체예에서 중쇄 아미노산 서열은 인간 VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 또는 VIV-4/4.35 유전자 계열에서 유래된 것이다. 바람직한 구체예에서 중쇄 아미노산 서열은 인간 VH DP-47 유전자 계열에서 유래된 것이다. 보다 바람직한 구체예에서 중쇄는 생식선 VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 또는 VIV-4/4.35로부터 8개 이하의 아미노산 변화, 보다 바람직하게는 6개 이하의 아미노산 변화, 더욱 더 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 및 24는 6 가지의 항-IGF-IR 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 제공한다. 서열 번호 30, 32, 34, 36 및 44는 생식선 중쇄 DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 및 VIV-4의 아미노산 서열을 제공하며, 서열 번호 29, 31, 33, 35 및 43은 생식선 중쇄 DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 및 VIV-4의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 도 2A-2D는 이들의 상응하는 생식선 서열에 대해 6 가지의 항-IGF-IR 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 정렬한 것을 도시한다. 본 명세서의 교시에 따라 당업자는 6 가지의 항-IGF-IR 중쇄 및 생식선 중쇄의 암호화된 아미노산 서열을 결정하고, 생식선 서열과 항체 서열간의 차이를 결정할 수 있다.
바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체의 VH는 생식선 아미노산 서열에 비해 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 VH 중 어느 하나 이상과 동일한 아미노산 치환을 포함한다. 전술한 것과 유사하게 항-IGF-IR 항체의 VH는 항체 2.13.2에 존재하는 것과 동일한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 항체 2.14.3에 존재하는 것과 동일한 또다른 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 항체 4.9.2와 동일한 또다른 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 예컨대 IGF-IR에 대한 항체의 친화력 또는 항원으로부터의 해리 속도를 변화시키기 위해 상이한 항체 결합 특징들을 혼합하여 매치시킬 수 있다. 또다른 구체예에서 아미노산 치환은 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.17.3, 4.9.2 또는 6.1.1의 VH 중 임의의 하나 이상에서 발견되는 것과 동일한 위치에서 이루어지지만, 동일한 아미노산을 사용하기 보다는 보존적 아미노산 치환이 이루어진다.
또다른 구체예에서, 중쇄는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 VH의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 매우 바람직한 구체예에서 중쇄는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 중쇄의 CDR 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 중쇄는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 중쇄의 하나 이상의 CDR 유래의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서 중쇄는 서로 다른 중쇄 유래의 CDR의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서 서로 다른 중쇄 유래의 CDR은 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1로부터 얻어진다. 또다른 바람직한 구체예에서 중쇄는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서 중쇄는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19 또는 23 중에서 선택된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 그로부터 1-10개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
항-IGF-IR 항체에 의한 IGF-IR 활성의 억제
IGF-IR에 대한 IGF-I의 결합의 억제
또다른 구체예에서 본 발명은 IGF-IR에 대한 IGF-I의 결합 또는 IGF-IR에 대한 IGF-II의 결합을 억제하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서 IGF-IR은 인간의 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 인간 항체이다. 또다른 구체예에서 항체 또는 이의 일부분은 IGF-IR과 IGF-I간의 결합을 100 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 바람직한 구체예에서 IC50은 10 nM 이하이다. 보다 바람직한 구체예에서 IC50은 5 nM 이하이다. IC50은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로 IC50은 ELISA 또는 RIA로 측정할 수 있다. 바람직한 구체예에서 IC50은 RIA로 측정한다.
또다른 구체예에서 본 발명은 IGF-I의 존재 하에 IGF-IR의 활성화를 막는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 수용체가 점유되면 발생하는 IGF-IR 유도 티로신 인산화를 억제한다. 또다른 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 하류 세포 반응이 일어나는 것을 막는다. 예를 들어, 항-IGF-IR은 IGF-I로 세포를 처리하면 정상적으로는 인산화되는 것인 Shc 및 인슐린 수용체 기질(IRS) 1 및 2의 티로신 인산화를 억제 할 수 있다[Kim 등, J. Biol. Chem. 273:34543-34550, 1998]. 항-IGF-IR 항체가 IGF-I의 존재 하에 IGF-IR의 활성화를 막을 수 있는지를 웨스턴 블롯 또는 면역침전법에 의해 IGF-IR, Shc, IRS-1 또는 IRS-2의 자가 인산화 정도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 바람직한 구체예로서 웨스턴 블롯에 의해 IGF-IR의 자가 인산화 정도를 측정할 수 있다. 예컨대 실시예 VII를 참조하라.
본 발명의 또다른 양태에서 항체는 항체로 처리된 세포로부터 IGF-IR의 하향조절을 유도한다. 한 구체예에서 IGF-IR은 세포의 세포질로 내부화된다. 항-IGF-IR 항체가 IGF-IR에 결합되면 이 항체는 내부화되는데, 이는 공초점 현미경으로 관찰된다. 어떤 이론에 구속되기를 원하지는 않지만 항체-IGF-IR 복합체는 리소좀으로 내부화되어 분해되는 것으로 생각된다. IGF-IR의 하향 조절은 면역침전법, 공초점 현미경 또는 웨스턴 블롯을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예컨대 실시예 VII을 참조하라. 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합 영역을 포함한다.
항-IGF-IR 항체에 의한 IGF-IR의 활성화
본 발명의 또다른 양태는 항-IGF-IR 항체를 활성화시키는 것을 포함한다. 활성화 항체는 IGF-IR에 대한 IGF-I의 효과를 증폭 또는 대체한다는 점에서 억제성 항체와는 다르다. 한 구체예에서 활성화 항체는 IGF-IR에 결합할 수 있으며 IGF-I의 부재 하에 항체가 활성화되도록 한다. 이러한 유형의 활성화 항체는 실질적으로 IGF-I의 모의체이다. 또다른 구체예에서 활성화 항체는 IGF-IR에 대한 IGF-I의 효과를 증폭시킨다. 이러한 유형의 항체는 스스로 IGF-IR을 활성화시키지는 못하지만, IGF-I의 존재 하에 IGF-IR의 활성화를 증가시킨다. 모의 항-IGF-IR 항체는, 저농도의 IGF-I의 존재 또는 부재 하에 시험관내에서 세포를 항체로 처리함으로써 증폭 항-IGF-IR 항체와 쉽게 구별할 수 있다. 항체가 IGF-I의 부재 하에 IGF-IR 활성화를 유도할 수 있다면, 예컨대 IGF-IR 티로신 인산화를 증가시킬 수 있다면 그 항 체는 모의 항체이다. 항체가 IGF-I 부재시에는 IGF-IR 활성화를 유도할 수 없지만 IGF-IR 활성화의 양을 증폭시킬 수 있다면 그 항체는 증폭 항체이다. 바람직한 구체예에서 활성화 항체는 4.17.3이다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 4.17.3 유래의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 항체는 생식선 서열 O12(경쇄) 및/또는 D71(중쇄) 중 어느 하나 또는 둘다로부터 유래된 것이다.
항-IGF-IR 항체에 의한 생체내에서의 IGF-IR 티로신 인산화, IGF-IR 농도 및 종양 세포 성장의 억제
본 발명의 또다른 구체예는 생체내에서 IGF-IR 티로신 인산화 및 수용체 농도를 억제하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체를 동물에게 투여하면 IGF-IR 발현 종양에서 IGF-IR 포스포티로신 시그널의 감소를 유발한다. 바람직한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체는 포스포티로신 시그널을 20% 이상 감소시킨다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 포스포티로신 시그널을 60% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상 감소시킨다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 항체는 포스포티로신 시그널을 40% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 더 바람직하게는 20% 이상 감소시킨다. 바람직한 구체예에서 항체는 티로신 인산화 정도를 측정하기 약 24 시간 전에 투여한다. 티로신 인산화 정도는 후술하는 방법과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예컨대 실시예 III 및 도 5를 참조하라. 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
또다른 구체예에서 동물에게 항-IGF-IR 항체를 투여하면 IGF-IR 발현 종양에서 IGF-IR 농도의 감소를 유발한다. 바람직한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체는 미처리 동물에 비해 20% 이상 수용체 농도를 감소시킨다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 수용체 농도를 미처리 동물에서의 수용체 농도의 60% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상 감소시킨다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 항체는 수용체 농도를 40% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상 감소시킨다. 바람직한 구체예에서 항체는 IGF-IR 농도를 측정하기 약 24 시간 전에 투여된다. IGF-IR 농도는 후술하는 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예컨대 실시예 VIII 및 도 6을 참조하라. 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
또다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 생체내 종양 세포 성장을 억제한다. 종양 세포는 비제한적으로 표피, 상피, 내피, 백혈병, 육종, 다발성 골수종 또는 중배엽 세포를 비롯하여 임의의 세포 유형에서 유래된 것일 수 있다. 종양 세포의 예로는 A549(비-소세포 폐암) 세포, MCF-7 세포, Colo 205 세포, 3T3/IGF-IR 세포 및 A431 세포를 들 수 있다. 바람직한 구체예에서 항체는 미처리 동물의 종양 성장에 비해 종양 세포 성장을 억제한다. 보다 바람직한 구체예에서 항체는 종양 세포 성장을 50%까지 억제한다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 항체는 종양 세포 성장을 60%, 65%, 70% 또는 75% 억제한다. 한 구체예에서 종양 세포 성장의 억제는 동물을 항체로 처리하기 시작한 지 적어도 7일 후에 측정한다. 보다 바람직한 구체예에서 종양 세포 성장의 억제는 동물을 항체로 처리하기 시작한 지 적어도 14일 후에 측정한다. 또다른 바람직한 구체예에서 다른 항신생물제를 항-IGF-IR 항체와 동물에게 함께 투여한다. 바람직한 구체예에서 항신생물제는 종양 세포 성장을 추가로 억제할 수 있다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 항신생물제는 아드리아마이신, 택솔, 태목시펜, 5-플루오로데옥시유리딘(5-FU) 또는 CP-358,744이다. 바람직한 구체예에서 항신생물제와 항-IGF-IR의 동시 투여는 22∼24일 후 종양 세포 성장을 50% 이상, 보다 바람직하게는 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 85% 또는 90% 이상 억제한다. 예컨대 도 7 및 실시예 IX를 참조하라. 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
항-IGF-IR 항체에 의한 아폽토시스의 유도
본 발명의 또다른 양태는 세포 사멸을 유도하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 한 구체예에서 항체는 아폽토시스를 유도한다. 항체는 생체내 또는 시험관내에서 아폽토시스를 유도할 수 있다. 일반적으로 종양 세포는 정상 세포보다 아폽토시스에 더 민감하므로 항-IGF-IR 항체의 투여는 정상 세포보다 종양 세포의 아폽토시스를 우선적으로 유발시킨다. 또다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체의 투여는 효소 akt의 농도를 감소시키는데, 이 효소는 포스파티딜 이노시톨(PI) 키나제 경로에 관여하는 효소이다. PI 키나제 경로는 세포 증식과 아폽토시스의 예방에 관여한다. 따라서, akt를 억제하면 아폽토시스를 유도할 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서 항체는 생체내에 투여되어 IGF-IR 발현 세포의 아폽토시스를 유도한다. 바람직한 구 체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
항체 및 항체 생산 세포주의 제조 방법
면역화
본 발명의 한 구체예에서 인간 항체는 인간 면역글로불린 로커스의 일부 또는 전부를 포함하는 비인간 동물을 IGF-IR 항원으로 면역화시켜서 인간 항체를 생산한다. 바람직한 구체예에서 비인간 동물은 XENOMOUSETM이며, 이 동물은 인간 면역글로불린 로커스의 대형 단편을 포함하고 마우스 항체 생산에 결함이 있는 조작된 마우스 종이다[참조: Green 등, Nature Genetics 7:13-21(1994) 및 미국 특허 제5,916,771호, 제5,939,598호, 제5,985,615호, 제5,998,209호, 제6,075,181호, 제6,091,001호, 제6,114,598호 및 제6,130,364호; 1991년 7월 25일에 공개된 WO 91/10741, 1994년 2월 3일에 공개된 WO 94/02602, 1996년 10월 31일에 공개된 WO 96/34096 및 WO 96/33735, 1998년 4월 23일에 공개된 WO 98/16654, 1998년 6월 11일에 공개된 WO 98/24893, 1998년 11월 12일에 공개된 WO 98/50433, 1999년 9월 10일에 공개된 WO 99/45031, 1999년 10월 21일에 공개된 WO 99/53049, 2000년 2월 24일에 공개된 WO 00/09560 및 2000년 6월 29일에 공개된 WO 00/037504]. XENOMOUSETM는 완전한 인간 항체를 성인과 유사한 레퍼토리로 생산하며, 항원 특이적 인간 Mab를 생산한다. 2세대 XENOMOUSETM는 인간 중쇄 로커스 및 κ경쇄 로커스의 106 염기 규모의 생식선 구성의 YAC 단편의 도입을 통해 인간 항체 레퍼토리의 약 80%를 포 함한다[참조: Mendez 등, Nature Genetics 15:146-156(1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495(1998), 상기 문헌은 본원에서 참고로 인용함].
본 발명은 또한 인간 면역글로불린 로커스를 포함하는 비인간 형질전환 동물을 면역화시켜서 비인간, 비마우스 동물로부터 항-IGF-IR 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 앞서 설명한 방법을 이용하여 상기 동물로부터 항체를 제조할 수 있다. 상기 특허에 개시된 방법들은 미국 특허 제5,994,619호에 개시된 대로 변형시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서 비인간 동물은 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말일 수 있다.
또다른 구체예에서 인간 면역글로불린 유전자 로커스를 포함하는 비인간 동물은 인간 면역글로불린의 "미니로커스"를 갖는 동물이다. 미니로커스 이용법에서 외생 Ig 로커스는 Ig 로커스 유래의 개별 유전자를 포함시킴으로써 모의된다. 따라서 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변 영역, 및 제2의 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)이 동물에 삽입하기 위한 구성물로 형성된다. 이러한 방법에 대해서는, 특히 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,591,669호, 제5,612,205호, 제5,721,367호, 제5,789,215호 및 제5,643,763호에 기재되어 있으며, 이들 특허 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 포함한다.
미니로커스 이용법의 장점은 Ig 로커스의 일부분을 포함하는 구성물을 만들어 동물에 도입할 수 있는 신속한 방법이라는 것이다. 그러나, 미니로커스 이용법이 지닐 수 있는 단점은 전체 B-세포 발생을 지지하기에 충분한 면역글로불린 다양성이 존재하지 않아서 항체 생산성이 더 낮을 수 있다는 것이다.
인간-항-IGF-IR 항체를 생산하기 위해서 인간 면역글로불린 로커스의 일부 또는 전부를 포함하는 비인간 동물을 IGF-IR 항원으로 면역화시키고, 항체 또는 항체 생산 세포를 그 동물로부터 분리한다. IGF-IR 항원은 분리 및/또는 정제된 IGF-IR일 수 있으며, IGF-IR은 인간 IGF-IR인 것이 바람직하다. 또다른 구체예에서 IGF-IR 항원은 IGF-IR의 단편, 바람직하게는 IGF-IR의 세포외 도메인이다. 또다른 구체예에서 IGF-IR 항원은 IGF-IR의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단편이다. 또다른 구체예에서 IGF-IR 항원은 세포 표면 상에 IGF-IR을 발현하는 세포, 바람직하게는 세포 표면 상에 IGF-IR을 과발현하는 세포이다.
동물의 면역화는 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다[참조: Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990]. 비인간 동물, 예컨대 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[참조: Harlow 및 Lane의 문헌, 미국 특허 제5,994,619호]. 바람직한 구체예에서 IGF-IR 항원을 보조제와 함께 투여하여 면역 반응을 촉진시킨다. 이러한 보조제에는 완전 또는 불완전 프로인트 보조제, RIBI(무라밀 디펩티드) 또는 ISCOM(면역자극성 복합체)가 있다. 이러한 보조제는 폴리펩티드를 국소 퇴적물 내에 고립시켜 폴리펩티드가 빨리 분산되는 것을 막을 수 있거 나, 또는 숙주가 대식세포 및 면역계의 다른 구성요소들에 대해 주화성인 인자를 분비하도록 자극하는 성분들을 포함한다. 바람직하게는 폴리펩티드가 투여될 경우 면역화 스케줄은 수주일에 걸쳐 폴리펩티드를 2회 이상 투여하는 것을 포함한다.
실시예 I은 인산염 완충 염수 중의 전길이 인간 IGF-IR로 XENOMOUSETM를 면역화시키는 프로토콜을 제공한다.
항체 및 항체 생산 세포주의 제조
IGF-IR 항원으로 동물을 면역화시킨 후, 그 동물로부터 항체 및/또는 항체 생산 세포를 얻을 수 있다. 동물로부터 채혈하거나 죽여서 그 동물로부터 항-IGF-IR 항체 함유 혈청을 얻는다. 이 혈청은 동물로부터 취한 상태 그대로 사용할 수도 있고, 그 혈청으로부터 면역글로불린 분획을 얻을 수도 있으며, 또는 혈청으로부터 항-IGF-IR 항체를 정제할 수도 있다. 이러한 방식으로 얻은 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이며, 이것은 얻을 수 있는 항체의 양이 제한적이고 폴리클로날 항체는 잡다한 특성들을 나타낸다는 단점이 있다.
또다른 구체예에서, 면역화된 동물로부터 항체 생산 무한 증식 하이브리도마를 제조할 수 있다. 면역화 후 그 동물을 죽이고 비장 B 세포를 무한 증식 골수종 세포와 융합하는데, 이 과정 역시 당업계에 잘 알려져 있다[참조: Harlow 및 Lane의 상기 문헌]. 바람직한 구체예에서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다(비-분비성 세포주). 융합 및 항생제 선별 후에 IGF-IR, 그 일부, 또는 IGF-IR을 발현하는 세포를 이용하여 하이브리도마를 스크리닝한다. 바람직한 구체예에서 초기 스크리닝은 효소 결합 면역분석(ELISA) 또는 방사능 면역분석(RIA), 바람직하게는 ELISA를 이용하여 수행한다. ELISA 스크리닝의 한 예는 WO 00/37504에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고로 인용한다.
또다른 구체예에서 항원 생산 세포를 자가면역 질환이 있거나 항-IGF-IR 항체를 발현하는 인간으로부터 얻을 수 있다. 항-IGF-IR 항체를 발현하는 세포는 백혈구를 분리하여 이 세포로 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 실시하거나, 또는 IGF-IR 또는 그 일부로 코팅된 플레이트 상에서의 패닝에 의해 분리할 수 있다. 이들 세포는 인간의 비분비성 골수종과 융합시켜서 인간 항-IGF-IR 항체를 발현하는 인간 하이브리도마를 제조할 수 있다. 일반적으로, 항-IGF-IR 항체는 IGF-IR에 대한 친화력이 낮을 가능성이 있기 때문에 덜 바람직하다.
항-IGF-IR 항체 생산 하이브로도마를 선별하고 클로닝한 후, 아래에서 추가로 설명하는 바와 같이, 왕성한 하이브리도마 성장, 높은 항체 생산성 및 바람직한 항체 특성을 비롯하여 바람직한 특성들에 대해 추가로 스크리닝한다. 하이브리도마는 동계 동물이나 면역계에 결함이 있는 동물, 예컨대 누드 마우스의 생체내에서 배양하여 증폭시킬 수 있거나, 또는 시험관내 세포 배양을 통해 증폭시킬 수 있다. 하이브리도마의 선별, 클로닝 및 증폭 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
바람직하게는 면역화된 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비인간 동물이며, 비장 B 세포는 비인간 동물과 동일한 종에서 유래된 골수종에 융합시킨다. 보다 바람직하게는 면역화된 동물은 XENOMOUSETM이고, 골수종 세포주는 비-분비 성 마우스 골수종 세포주이며, 예컨대 골수종 세포주는 NSO-bcl2이다. 예컨대 실시예 I을 참조하라.
본 발명은 일 양태로서 인간 항-IGF-IR 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 바람직한 구체예에서 하이브리도마는 전술한 바와 같이 마우스 하이브리도마이다. 또다른 바람직한 구체예에서 하이브리도마는 비인간, 비마우스 종, 예컨대 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말에서 제조된다. 다른 구체예에서 하이브리도마는 인간 하이브리도마이며, 이때 인간 비분비성 골수종은 항-IGF-IR 항체를 발현하는 인간 세포와 융합된다.
항체를 제조하기 위한 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
핵산
본 발명의 항-IGF-IR 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 한 구체예에서 핵산 분자는 항-IGF-IR 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화한다. 바람직한 구체예에서 단일 핵산 분자는 항-IGF-IR 면역글로불린의 중쇄를 암호화하며, 다른 핵산 분자는 항-IGF-IR 면역글로불린의 경쇄를 암호화한다. 보다 바람직한 구체예에서 암호화된 면역글로불린은 인간 면역글로불린, 바람직하게는 인간 IgG이다. 암호화된 경쇄는 λ사슬 또는 κ사슬일 수 있으며, 바람직하게는 κ사슬이다.
경쇄의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 A30, A27 또는 O12 Vκ유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직한 구체예에서 경쇄는 A30 Vκ유전자로부터 유래된 것이다. 바람직한 구체예에서 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 Jκ1, Jκ2 또는 Jκ4에서 유래된 연결 영역을 포함한다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 경쇄를 암호 화하는 핵산 분자는 생식선 A30 Vκ유전자로부터 10개 이하의 아미노산 변화를 포함하며, 바람직하게는 6개 이하, 보다 더 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
본 발명은 생식선 서열과 비교하여 3개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 경쇄(VL)의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데, 이때 아미노산 변화는 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중 하나의 VL에서 유래된 생식선 서열로부터의 아미노산 변화와 동일하다. 본 발명은 또한 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 경쇄 중 어느 하나의 경쇄의 CDR 중 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 경쇄 중 어느 하나의 CDR 모두의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22 중 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17 또는 21 중 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22 중 어느 하나의 CDR 중 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17 또는 21 중 어느 하나의 CDR 중 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22 중 어느 하나의 CDR 모두의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17 또는 21 중 어느 하나의 CDR 모두의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 전술한 VL과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL, 특히 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17 또는 21 중 하나의 핵산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열을 제공한다. 또다른 구체예에서 본 발명은 전술한 VL을 암호화하는 핵산 분자, 특히 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 고엄중도 조건하에서 하이브리드화하는 VL을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17 또는 21 중 하나의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 고엄중도 조건하에 하이브리드화하는 VL을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 DP-35, DP-47, DP-71 또는 VIV-4/4.35 VH 유전자, 바람직하게는 DP-35 VH 유전자에서 유래된 중쇄(VH)의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또다른 바람직한 구체예에서, VH를 암호화하는 핵산 분자는 JH6 또는 JH5, 보다 바람직하게는 JH6에서 유래된 연결 영역을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 D 분절은 3-3, 6-19 또는 4-17에서 유래된 것이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 VH를 암호화하는 핵산 분자는 생식선 DP-47 유전자로부터 10개 이하의 아미노산 변화, 바람직하게는 6개 이하의 아미노산 변화, 더욱 더 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 매우 바람직한 구체예에서 VH를 암호화하는 핵산 분자는 생식선 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화를 포함하며, 이때 아미노산 변화는 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중 하나의 중쇄의 생식선 서열로부터의 아미노산 변화와 동일하다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 VH는 생식선 서열과 비교하여 3개 이상의 아미노산 변화를 포함하는데, 이 변화는 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중 하나의 VH의 생식선 서열로부터의 변화와 동일하다.
한 구체예에서 핵산 분자는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 VH의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서 핵산 분자는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1의 중쇄의 CDR 중 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.6.1의 중쇄의 CDR 모두의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19 또는 23 중 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 어느 하나의 CDR 중 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19 또는 23 중 어느 하나의 CDR 중 하나 이상의 핵산 서열을 포함한 다. 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 어느 하나의 CDR 모두의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19 또는 23 중 어느 하나의 CDR 모두의 핵산 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 전술한 VH를 암호화하는 아미노산 서열 중 하나와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 VH, 특히 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19 또는 23 중 하나의 핵산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열을 제공한다. 또다른 구체예에서 VH를 암호화하는 핵산 분자는 전술한 VH, 특히 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 암호화하는 핵산 서열에 고엄중도 조건하에 하이브리드화하는 것이다. 본 발명은 또한 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19 또는 23 중 하나의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 고엄중도 조건하에 하이브리드화하는 VH를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
항-IGF-IR 항체의 전체 중쇄와 경쇄 중 어느 하나 또는 둘다 또는 이의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 항-IGF-IR 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 항체를 암호화하는 mRNA를 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[참조: Sambrook 등의 문헌]. 그 mRNA를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 항체 유전자의 cDNA 클로닝에 사용하기 위한 cDNA를 얻을 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서 핵산 분자는 전술한 바와 같은 항-IGF-IR 항체를 발현하는 하이브리도마, 바람직하게는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 형질전환 동물 세포(예, XENOMOUSETM), 비인간 마우스 형질전환 동물 또는 비인간, 비마우스 형질전환 동물 세포를 그 융합 파트너 중 하나로서 갖는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 다른 구체예에서 하이브리도마는 비인간, 비형질전환 동물에서 유래된 것일 수 있으며, 이것을, 예컨대 인간화된 항체의 생산에 사용할 수 있다.
항-IGF-IR 항체의 전체 중쇄를 암호화하는 핵산 분자는 중쇄의 가변 도메인 또는 이의 항원 결합 도메인을 암호화하는 핵산 분자와 중쇄의 불변 도메인을 융합시켜서 제조할 수 있다. 유사하게 항-IGF-IR 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 경쇄의 가변 도메인 또는 이의 항원 결합 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 경쇄의 불변 도메인과 융합시켜서 제조할 수 있다. VH 및 VL 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 이것을 이미 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역 각각을 암호화하는 발현 벡터에 삽입하여, VH 분절이 벡터 내의 중쇄 불변 영역(CH) 분절(들)에 작동적으로 연결되게 하고, VL 분절이 벡터 내의 경쇄 불변 영역(CL) 분절에 작동적으로 연결되게 함으로써 전길이 항체 유전자로 전환시킬 수 있다. 대안으로, VH 또는 VL 사슬을 암호화하는 핵산 분자는, 표준 분자생물학 기법을 이용하여 CH 사슬을 암호화하는 핵산 분자에 VH 사슬을 암호화하는 핵산 분자를 연결(예컨대, 결찰)시킴으로써 전길이 항체 유전자로 전환시킨다. VL 및 CL 사슬을 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 동일한 것을 얻을 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다[참조: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991]. 그 후 전길이 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 이것이 도입된 세포로부터 발현시켜서 항-IGF-IR 항체를 분리할 수 있다.
바람직한 구체예에서 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20 또는 24의 아미노산 서열을 암호화하고, 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18 또는 22의 아미노산 서열을 암호화한다. 서열 번호 28은 항-IGF-IR 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 및 6.1.1의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 서열 번호 27은 상기 영역을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸 것이다. 서열 번호 26은 항-IGF-IR 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 및 6.1.1의 경쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 서열 번호 25는 상기 영역을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸 것이다. 따라서 바람직한 구체예에서 중쇄의 불변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 28을 암호화하고, 경쇄의 불변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 26을 암호화한다. 보다 바람직한 구체예에서 중쇄의 불변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 27의 핵산 서열을 가지며, 불변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 25의 핵산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합 도메인, 또는 항-IGF-IR 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합 도메인 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하고 IGF-IR 항원으로 면역화시킨 비인 간, 비마우스 동물로부터 분리할 수 있다. 다른 구체예에서 핵산 분자는 비형질전환 동물 유래의 항-IGF-IR 항체를 생산하는 세포, 또는 항-IGF-IR 항체를 생산하는 인간 환자로부터 분리할 수 있다. 항-IGF-IR 항체 생산 세포로부터 mRNA를 분리하는 방법은 표준 기법에 의해 분리하고, PCR 및 라이브러리 제조 기법을 이용하여 클로닝 및/또는 증폭시킨 다음, 항-IGF-IR 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 얻기 위한 표준 프로토콜을 이용하여 스크리닝하는 것일 수 있다.
후술하는 바와 같이 핵산 분자를 이용하여 다량의 항-IGF-IR 항체를 재조합에 의해 발현시킬 수 있다. 또한 핵산 분자를 이용하여 아래에서 추가로 설명하는 바와 같은 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 면역어드헤신, 다이아바디, 돌연변이 항체 및 항체 유도체를 생산할 수 있다. 핵산 분자가 비인간 비형질전환 동물에서 유래된 것이라면 그 핵산 분자는 역시 후술하는 바와 같이 항체 인간화에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서 본 발명의 핵산 분자는 특정 항체 서열에 대한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자 프로브는 진단 방법에 이용될 수 있고, 또는 핵산 분자 PCR 프라이머는, 특히 항-IGF-IR 항체의 가변 도메인을 생산하는 데 이용할 핵산 서열을 분리하는 데 이용될 수 있는 DNA 영역을 증폭시키는 데 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 보다 바람직한 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 목적하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역에서 유래된 것이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 CDR 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 암호화한다.
벡터
본 발명은 중쇄 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 경쇄 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 이의 프로브를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체의 일부분을 발현시키기 위해서는 전술한 바와 같이 얻은 부분 또는 전길이 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터에 삽입시켜서 그 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되도록 한다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. 항체 유전자는 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도하는 기능을 수행하도록 벡터에 결찰시킨다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립 가능한 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터에 삽입시킬 수 있다. 바람직한 구체예는 두 유전자를 동일한 발현 벡터에 삽입시키는 것이다. 항체 유전자는 표준 방법(예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 없다면 블런트 엔드 결찰)에 의해 발현 벡터에 삽입시킨다.
편리한 벡터는 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호화하고 임의의 VH 또는 VL 서열이 전술한 바와 같이 쉽게 삽입 및 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 갖는 것이다. 이러한 벡터에서 삽입된 J 영역에 있는 스플라이스 공여체 부위와 인간 C 영역 앞에 있는 스플라이스 수용체 부위간에, 또 인간 CH 엑손 내에 존재하는 스플라이스 영역에서 통상 스플라이싱이 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 암호화 영역 하류의 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포 유래의 항체 사슬의 분비를 촉진하는 시그널 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자를, 시그널 펩티드가 프레임내에서 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터에 클로닝할 수 있다. 시그널 펩티드는 면역글로불린 시그널 펩티드 또는 이종 시그널 펩티드(즉, 비면역글로불린 단백질 유래의 시그널 펩티드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 사슬 유전자 외에도 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. 당업자들은 조절 서열의 선택을 비롯하여 발현 벡터의 디자인이 형질전환시킬 숙주 세포, 원하는 단백질의 발현 정도 등의 선택과 같은 요인에 좌우된다는 것을 알 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현용으로 바람직한 조절 서열로는 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 엘리먼트, 예컨대 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40)(예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마 유래의 프로모터 및/또는 인핸서, 및 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터와 같은 강력한 포유동물 프로모터가 있다. 바이러스 조절 엘리먼트 및 이의 서열에 대한 추가 설명은 미국 특허 제5,168,062호(Stinski), 미국 특허 제4,510,245호(Bell 등) 및 미국 특허 제4,968,615호(Schaffner 등)를 참조하라.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 사슬 유전자와 조절 서열 외에도 추가 서열, 예컨대 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대, 복제 기점) 및 선별 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별 마커는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다[참조: Axel 등의 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호]. 예를 들어, 일반적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 유전자로는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용함) 및 neo 유전자(G418 선별용)를 포함한다.
비하이브리도마 숙주 세포 및 단백질의 재조합 생산 방법
항-IGF-IR 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자, 및 이 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물 세포의 트랜스포메이션에 이용할 수 있다. 트랜스포메이션은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 덱스트란 매개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 트랜스펙션, 원형질 융합, 일렉트로포레이션, 폴리뉴클레오티드(들)를 리포좀으로 캡슐화하는 방법, 바이오리스틱 인젝션 및 DNA를 핵으로 직접 마이크로인젝션하는 방법이 있다. 또한 핵산 분자를 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입할 수 있다. 세포의 트랜스포메이션 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호; 상기 특허는 모두 본원에서 참고로 인용함].
발현용 숙주로서 유용한 포유동물 세포주는 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 모식균 베양 수집소(ATCC)로부터 입수할 수 있는 다수의 무한 증식 세포주를 포함한다. 이들 중에서도 특히 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간암 세포(예, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포 및 다수의 기타 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포에는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포가 포함된다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포가 발현 수준이 높은지를 결정함으로써 선별한다. 사용될 수 있는 다른 세포주에는 곤충 세포주(예, Sf9 세포), 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포가 있다. 중쇄 또는 이의 항원 결합부, 경쇄 및/또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하고, 숙주 세포에서 항체가 발현되도록 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산하거나, 보다 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 그 배양 배지에 항체를 분비시킨다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 세포주 생산으로부터의 본 발명의 항체(또는 이것의 다른 부위)의 발현은 공지된 다수의 기법을 이용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 클루타민 합성 효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정한 조건에서 발현을 증강시키기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0 216 846호, 제0 256 055호 및 제0 323 997호 및 유럽 특허 출원 제89303964.4호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 기술되어 있다.
서로 다른 세포주 또는 형질전환 동물에 의해 발현된 항체는 서로 다른 글리코실화를 보유하게 된다. 그러나 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 암호화된 모든 항체, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글리코실화와 관계없이 본 발명의 일부를 이룬다.
형질전환 동물
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하는 데 사용될 수 있는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 비인간 형질전환 동물을 제공한다. 항체는 염소, 암소, 말, 돼지, 래트, 마우스, 토끼, 햄스터 또는 기타 포유동물의 조직이나 체액, 예컨대 젖, 혈액 또는 뇨에서 생산 및 회수될 수 있다. 예컨대 미국 특허 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호 및 제5,741,957호를 참조하라. 전술한 바와 같이 인간 면역글로불린 로커스를 포함하는 비인간 형질전환 동물은 IGF-IR 또는 그 일부분으로 면역화시켜서 생산할 수 있다.
또다른 구체예에서, 비인간 형질전환 동물은 표준 형질전환 기법에 의해 동물에 본 발명의 1종 이상의 핵산 분자를 도입함으로써 제조할 수 있다[참조: Hogan의 상기 문헌]. 형질전환 동물을 제조하는 데 사용되는 형질전환 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포가 될 수 있다. 형질전환 비인간 유기체는 키메라, 비키메라 이질접합체 및 비키메라 동질접합체일 수 있다[참조: Hogan 등, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press(1999); Jackson 등, Mose Genetics and Trangenics: A Practical Approach, Oxford University Press(2000); 및 Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press(1999)]. 또다른 구체예에서 형질전환 비인간 유기체는 목적하는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 표적화된 파괴 및 치환을 보유할 수 있다. 바람직한 구체예에서 형질전환 동물은 IGF-IR, 바람직하게는 인간 IGF-IR에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고 발현한다. 또다른 구체예에서 형질전환 동물은 변형된 항체, 예컨대 단일 사슬 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 항-IGF-IR 항체는 임의의 형질전환 동물에서 제조할 수 있다. 바람직한 구체예에서 비인간 동물은 마우스, 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 비인간 형질전환 동물은 상기 암호화된 폴리펩티드를 혈액, 젖, 뇨, 타액, 눈물, 점액 및 기타 체액에서 발현한다.
파지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 항-IGF-IR 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 파지 상에서 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, IGF-IR 또는 이의 일부분을 갖는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, IGF-IR에 결합하는 파지를 분리하는 단계, 및 파지로부터 항체를 얻는 단계를 포함한다. 항체의 라이브러리를 제조하는 한가지 방법은 인간 면역글로불린 로커스를 포함하는 비인간 숙주 동물을 IGF-IR 또는 이의 항원 결합부로 면역화시켜서 면역 반응을 일으키는 단계, 숙주 동물 세포로부터 항체 생산을 담당하는 세포를 추출하는 단계, 추출된 세포로 부터 RNA를 분리하는 단계, RNA를 역전사시켜서 cDNA를 제조하는 단계, 프라이머를 사용하여 그 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 cDNA를 파지 디스플레이 벡터에 삽입하여 항체가 파지 상에서 발현되도록 하는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항-IGF-IR 항체는 이러한 방식으로 얻을 수 있다.
본원에 개시된 항-IGF-IR 항체 외에도 본 발명의 재조합 항-IGF-IR 인간 항체는 재조합 조합 항체 라이브러리, 바람직하게는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 분리하고, 인간 림프구 유래의 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 키트는 시판되고 있다[예, the Pharamacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 스트라타진 SurfZAPTM 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612]. 항체 디스플레이 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 데 이용될 수 있는 다른 방법 및 시약들도 있다[참조: Ladner 등, 미국 특허 제5,223,409호; Kang 등, PCT 공개 번호 WO 92/18619; Dower 등, PCT 공개 번호 WO 91/17271; Winter 등, PCT 공개 번호 WO 92/20791; Markland 등, PCT 공개 번호 WO 92/15679; Breitling 등, PCT 공개 번호 WO 93/01288; McCafferty 등, PCT 공개 번호 WO 92/01047; Garrad 등, PCT 공개 번호 WO 92/09690; Fuchs 등(1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay 등(1992) Hum. Antibod. Hybridoma 3:81-85; Huse 등(1989) Science 246:1275-1281; McCafferty 등, Nature(1990) 348:552-554; Griffiths 등(1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins 등(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson 등(1991) Nature 352:624-628; Gram 등(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad 등(1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom 등(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137 및 Barbas 등(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982].
바람직한 구체예에서, 원하는 특성을 갖는 인간 항-IGF-IR 항체를 분리하기 위해 먼저 전술한 바와 같은 인간 항-IGF-IR 항체를 이용함으로써 Hoogenboom 등의 PCT 공개 번호 WO 93/06213에 기재된 에피토프 임프린팅 방법을 이용하여 IGF-IR에 대한 유사한 결합 활성을 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선별한다. 이 방법에 이용된 항체 라이브러리는 McCafferty 등의 PCT 공개 번호 WO 92/01047, McCafferty 등의 문헌[Nature(1990) 348:552-554] 및 Griffiths 등의 문헌(1993) [EMBO J 12:725-734]에 기재된 대로 제조 및 스크리닝한 scFv 라이브러리인 것이 바람직하다. scFv 항체 라이브러리는 항원으로서 인간 IGF-IR을 이용하여 스크리닝하는 것이 바람직하다.
먼저 인간 VL 및 VH 분절을 선별한 후, 처음에 선별된 서로 다른 쌍의 VL 및 VH 분절을 IGF-IR 결합에 대해 스크리닝하는 "혼합 및 매치(mix and match)" 실험을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선별한다. 또한, 항체의 질을 추가로 향상시키기 위해 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 분절을 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서 무작위적으로 돌연변이시킬 수 있으며, 이 과정은 자연 면역 반응 중에 항체의 친화력 성숙에 관여하는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사 한 과정이다. 이러한 시험관내 친화력 성숙은 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시켜서 수행할 수 있으며, 이때 상기 프라이머는 특정 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이킹"하여, 얻어진 PCR 생성물이, VH 및/또는 VL CDR3 영역에 무작위 돌연변이가 도입된 VH 및 VL 분절을 암호화하도록 한다. 이러한 무작위적으로 돌연변이된 VH 및 VL 분절을 IGF-IR에 대한 결합에 대해 재스크리닝할 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-IGF-IR 항체를 스크리닝 및 분리한 후, 디스플레이 패키지(예컨대, 파지 게놈 유래의 것)로부터 선택된 항체를 암호화하는 핵산을 회수하여 표준 재조합 DNA 기법에 의해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 필요하다면, 후술하는 바와 같은 본 발명의 다른 항체 형태를 생성하기 위해 핵산을 추가로 조작할 수 있다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 분리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해 후술하는 바와 같이 항체를 암호화하는 DNA를 재조합 발현 벡터로 클로닝하여 포유동물 숙주 세포로 도입한다.
클래스 전환
본 발명의 또다른 양태는 항-IGF-IR 항체의 클래스를 다른 것으로 전환시킬 수 있는 메카니즘을 제공하는 것이다. 본 발명의 한 양태에서 VL 또는 VH를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 분리하여 그것이 CL 또는 CH를 암호화하는 어떠한 핵산 서열도 포함하지 않도록 한다. 그 후 VL 또는 VH를 암호화하는 핵산 분자를 다른 클래스의 면역글로불린 분자에서 유래된 CL 또는 CH 를 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결시킨다. 이는 전술한 바와 같이 CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 항-IGF-IR 항체를 IgG로 클래스를 전환시킬 수 있다. 또한, 한 IgG 서브클래스에서 다른 것으로, 예컨대 IgG1에서 IgG2로 전환시키기 위해 클래스 전환을 이용할 수 있다. 원하는 이소타입을 포함하는 본 발명의 항체를 생산하는 바람직한 방법은 항-IGF-IR 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 항-IGF-IR 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산을 분리하는 단계, 원하는 이소타입을 갖는 중쇄의 불변 도메인과 중쇄의 가변 영역을 결찰시키는 단계, 세포에서 경쇄 및 결찰된 중쇄를 발현시키는 단계, 및 원하는 이소타입을 갖는 항-IGF-IR을 수집하는 단계를 포함한다.
항체 유도체
당업자에게 공지된 기법 및 방법을 이용하여 항체 유도체를 제조하기 위해 전술한 핵산 분자를 이용할 수 있다.
인간화된 항체
인간 항체 생성과 관련하여 전술한 바와 같이, 감소된 면역원성을 갖는 항체를 제조하는 것이 유리하다. 이는 인간화 기법 및 적절한 라이브러리를 사용하는 디스플레이 기법을 이용하여 어느 정도 달성할 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 쥐 항체 또는 다른 종 유래의 항체를 인간화 또는 영장류화시킬 수 있다[참조: Winter 및 Harris, Immunol Today 14:43-46(1993) 및 Wright 등, Crit. Reviews in Immunol. 12125-168(1992)]. CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인, 및/또 는 프레임워크 도메인을 상응하는 인간 서열로 치환시키는 재조합 DNA 기법에 의해 목적하는 항체를 조작할 수 있다[WO 92/02190 및 미국 특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호, 및 제5,777,085호]. 바람직한 구체예에서 중쇄, 경쇄 또는 중쇄 및 경쇄 둘다의 CDR 모두를 유지시키면서 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인, 및/또는 프레임워크 도메인을 상응하는 인간 서열로 치환시킴으로써 항-IGF-IR 항체를 인간화할 수 있다.
돌연변이 항체
또다른 구체예에서, 돌연변이된 항-IGF-IR 항체를 제조하기 위해 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포를 이용할 수 있다. 항체의 결합 특성을 변화시키기 위해 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에 돌연변이를 유발할 수 있다. 예를 들어, IGF-IR에 대한 항체의 Kd를 증가 또는 감소시키기 위해, Koff를 증가 또는 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변화시키기 위해 CDR 영역의 하나 이상에 돌연변이가 유발될 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 기법은 당업계에 잘 알려져 있다[참조: Sambrook 등의 상기 문헌 및 Ausubel 등의 상기 문헌]. 바람직한 구체예로서 항-IGF-IR 항체의 가변 영역에서 생식선과 비교하여 변화된 것으로 알려진 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발한다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중 하나의 가변 영역 또는 CDR 영역에서 생식선과 비교하여 변화된 것으로 알려진 아미노산 잔기에 하나 이상의 돌연변이를 유발한다. 또다른 구체예에서 아미노산 서열이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24에 제시된 것인 가변 영역 또는 CDR 영역, 또는 아미노산 서열이 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23에 제시된 것인 가변 영역 또는 CDR 영역에서 생식선과 비교하여 변화된 것으로 알려진 아미노산 잔기에 하나 이상의 돌연변이를 유발한다. 또다른 구체예에서 핵산 분자는 프레임워크 영역의 하나 이상에서 돌연변이된다. 항-IGF-IR 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에 돌연변이를 유발할 수 있다. 예컨대 본원에서 참고로 인용하는 2000년 2월 24일에 공개된 WO 00/09560를 참조하라. 한 구체예에서 1개, 3개 또는 5개의 점 돌연변이 및 10개 이하의 점 돌연변이가 존재할 수 있다. 프레임워크 영역 또는 불변 도메인의 돌연변이는 항체의 면역원성을 변화시키기 위해, 또는 다른 분자에 대한 공유 또는 비공유 결합 부위를 제공하기 위해, 또는 보체 고정과 같은 특성을 변화시키기 위해 이루어질 수 있다. 돌연변이는 단일 돌연변이 항체에서 프레임워크 영역, 불변 도메인 및 가변 영역 각각에서 이루어질 수 있다. 대안으로, 돌연변이는 단일 돌연변이 항체에서 프레임워크 영역, 가변 영역 및 불변 도메인 중 하나에서만 이루어질 수 있다.
한 구체예에서 돌연변이 전에 항-IGF-IR 항체와 비교하여 돌연변이된 항-IGF-IR 항체의 VH 또는 VL 영역 중 하나에서 10개 이하의 아미노산 변화가 존재한다. 보다 바람직한 구체예에서 돌연변이 항-IGF-IR 항체의 VH 또는 VL 영역 중 하나에서 5개 이하의 아미노산 변화, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변화가 존재한다. 또다른 구체예로서 불변 도메인에 15개 이하의 아미노산 변화, 보다 바람직하게는 10개 이하의 아미노산 변화, 보다 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변화가 존재한다.
변형된 항체
또다른 구체예에서 다른 폴리펩티드에 연결된 항-IGF-IR 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역어드헤신을 제조할 수 있다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체의 가변 영역만이 폴리펩티드에 연결된다. 또다른 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 연결되고, 항-IGF-IR 항체의 VL 도메인은 제1 폴리펩티드와 회합되어 있는 제2 폴리펩티드에 연결되는데, 이때 VH 및 VL 도메인은 서로 상호작용하여 항체 결합 부위를 형성할 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VH 도메인은 VL 도메인으로부터 분리된다(하기 단일 사슬 항체 설명 참조). 그 후 VH-링커-VL 항체를 목적하는 폴리펩티드에 연결시킨다. 융합 항체는 폴리펩티드를 IGF-IR 발현 세포 또는 조직으로 유도하는 데 있어서 유용하다. 폴리펩티드는 독소, 성장 인자 또는 기타 조절 단백질과 같은 치료제일 수 있고, 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 용이하게 시각화될 수 있는 효소와 같은 진단제일 수 있다. 또한, 2개(또는 2개 이상)의 단일 사슬 항체가 서로 연결되어 있는 융합 항체를 생성할 수 있다. 이것은 단일 폴리펩티드 사슬 상에 2가 또는 다가 항체를 생성하고자 하거나, 또는 이중 특이적 항체를 생성하고자 하는 경우에 유용하다.
단일 사슬 항체(scFv)를 제조하기 위해서는, VH 및 VL을 암호화하는 DNA 단편을 가요성 링커를 암호화하는 다른 단편, 예컨대 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3(서열 번호 60)을 암호화하는 다른 단편에 작동적으로 연결시켜서, VH 및 VL 서열이 연속 단일 사슬 단백질로서 발현될 수 있도록 하고, VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결되도록 한다[참조: Bird 등(1988) Science 242:423-426; Huston 등(1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA. 85:5879-5883; MaCafferty 등, Nature(1990) 348:552-554]. 단일 VH 및 VL만이 사용된다면 단일 사슬 항체는 1가일 수 있으며, 두개의 VH 및 VL이 사용된다면 2가일 수 있으며, 두개 이상의 VH 및 VL이 사용된다면 다가일 수 있다.
또다른 구체예에서 항-IGF-IR 암호화 핵산 분자를 사용하여 다른 변형된 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어 "카파 바디(Kappa body)"[Ill 등, Protein Eng 10:949-57(1997)], "미니바디(Minibody)"[Martin 등, EMBO J 13:5303-9(1994)], "다이아바디(Diabody)"[Holliger 등, PNAS USA 90: 6444-6448(1993)], 또는 "야누신(Janusin)"[Traunecker 등, EMBO J 10:3655-3659(1991) 및 Traunecker 등, "Janusin": new molecular design for bispecific reagents", Int J Cancer Suppl 7:51-52(1992)]을 명세서의 교시에 따라 표준 분자생물학적 기법을 이용하여 제조할 수 있다.
다른 양태에서 키메라 및 이중 특이적 항체를 제조할 수 있다. 서로 다른 항체에서 유래된 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 키메라 항체를 제조할 수 있다. 바람직한 구체예에서 키메라 항체의 CDR은 항-IGF-IR 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 CDR 모두를 포함하고, 프레임워크 영역은 하나 이상의 서로 다른 항체로부터 유래된 것이다. 보다 바람직한 구체예에서 키메라 항체의 CDR은 항-IGF-IR 항 체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 CDR 모두를 포함한다. 프레임워크 영역은 서로 다른 종에서 유래된 것일 수 있고, 바람직한 구체예에서 인간화된 것일 수 있다. 또는, 프레임워크 영역은 다른 인간 항체로부터 유래된 것일 수 있다.
제1 결합 도메인을 통해 IGF-IR에 특이적으로 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해 제2 분자에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체를 제조할 수 있다. 재조합 분자생물학 기법을 통해 이중 특이적 항체를 제조할 수 있거나, 또는 물리적으로 서로 접합시킬 수 있다. 또한, IGF-IR 및 다른 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 VH 및 VL을 포함하는 단일 사슬 항체를 제조할 수 있다. 이러한 이중 특이적 항체는, 예컨대 (i) 및 (ii)[참조: Fanger 등, Immunol. Methods 4:72-81(1994) 및 Wright 및 Harris의 상기 문헌] 및 (iii)[참조: Traunecker 등, Int. J. Cancer(Suppl.) 7:51-52(1992)]와 관련하여 당업계에 공지된 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직한 구체예에서 이중 특이적 항체는 IGF-IR 및 암이나 종양 세포에서 다량으로 발현되는 다른 분자에 결합한다. 보다 바람직한 구체예에서 다른 분자는 erbB2 수용체, VEGF, CD20 또는 EGF-R이다.
한 구체예에서 전술한 변형된 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 또는 6.1.1 중에서 선택된 항체 중 하나에서 유래된 하나 이상의 CDR 또는 가변 영역 중 하나 이상을 이용하여 제조한다. 또다른 구체예에서 변형된 항체는 아미노산 서열이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24에 제시된 것인 가변 영역 중 하나 이상 또는 하나 이상의 CDR 영역, 또는 핵산 서열이 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23에 제시된 것인 가변 영역 중 하나 이상 또는 하나 이상의 CDR 영역을 이용하여 제조한다.
유도체화 및 표지된 항체
본 발명의 항체 또는 항체 일부분을 유도체화하거나 다른 분자(예컨대, 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결시킬 수 있다. 일반적으로 항체 또는 이의 일부분은 IGF-IR 결합이 유도체화 또는 표지에 의해 불리한 영향을 받지 않도록 유도체화한다. 이에 따라 본 발명의 항체 또는 이의 일부분은 본원에 개시된 인간 항-IGF-IR 항체의 완전한 형태 및 변형된 형태를 포함하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체의 일부분을 하나 이상의 다른 분자적 실체, 예컨대 다른 항체(예, 이중 특이적 항체 또는 다이아바디), 검출제, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항체 일부분과 다른 분자와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의해) 기능적으로 연결시킬 수 있다.
유도체화 항체의 한 유형은 두개 이상의 항체(예컨대, 이중 특이적 항체를 제조하기 위해 같은 유형 또는 다른 유형의 항체)를 가교 결합시켜서 제조한다. 적절한 가교제는 적절한 스페이서(예, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 분리된 두가지의 다른 반응기를 갖는 헤테로이기능성(heterobifunctional) 또는 호모이기능성(homobifunctional)(예, 디숙신이미딜 수버레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는 일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 컴퍼니에서 시판된다.
유도체화 항체의 또다른 유형은 표지된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항체 의 일부분을 유도체화할 수 있는 유용한 검출제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란탄계열 인광체 등을 비롯하여 형광 화합물을 포함한다. 항체는 검출에 유용한 효소, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼라인 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등으로 표지할 수 있다. 항체가 검출 가능한 효소로 표지될 경우, 식별할 수 있는 반응 생성물을 생성하기 위해 그 효소가 이용하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어 호스래디쉬 퍼옥시다제가 존재할 경우 과산화수소 및 디아미노벤지딘을 첨가하면 검출 가능한 발색 반응 생성물이 형성된다. 항체는 비오틴으로도 표지할 수 있으며, 이것은 아비딘 또는 스트렙타빈 결합을 간접적으로 측정함으로서 검출한다. 항체는 가돌리늄과 같은 자성 물질로 표지할 수 있다. 항체는 2차 리포터(예컨대, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프로 표지할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표지에 잠재적인 공간적 방해를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 부착한다.
항-IGF-IR 항체를 방사능 표지된 아미노산으로 표지할 수 있다. 방사능 표지는 진단 목적 및 치료 목적 모두에 이용될 수 있다. 예컨대, 방사능 표지는 x-선 또는 기타 진단 기법에 의해 IGF-IR 발현 종양을 검출하는 데 이용될 수 있다. 또한, 방사능 표지는 암 세포 또는 종양에 대한 독소로서 치료 목적으로 이용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 비제한적인 예로는 방사능 동위원소 또는 방사능 핵종 -- 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I가 있다.
항-IGF-IR 항체는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸기 또는 에틸기, 또는 탄수화물기와 같은 화학적 기로 유도체화될 수도 있다. 이들 기는, 예컨대 혈청 반감기를 증가시키거나 조직 결합을 증가시키기 위해 항체의 생물학적 특성을 개선시키는 데 유용하게 이용될 수 있다.
약학 조성물 및 키트
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 치료적 유효량과 약학적 허용 담체를 포함하는, 포유동물의 과증식성 장애의 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 약학 조성물은 뇌암, 폐암, 편평상피 세포암, 방광암, 위암, 췌장암, 유방암, 머리암, 목암, 신세포암, 신장암, 난소암, 전립선암, 결장직장암, 식도암, 부인암 또는 갑상선암 등의 암의 치료용이다. 또다른 구체예에서 상기 약학 조성물은 비제한적인 예로 혈관형성술 후의 재발협착증 및 건선과 같은 비암성 과증식성 장애에 대한 것이다. 또다른 구체예에서 본 발명은 IGF-IR의 활성화를 요하는 포유동물의 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 상기 약학 조성물은 본 발명의 활성화 항체의 치료적 유효량과 약학적 허용 담체를 포함한다. 활성화 항체를 포함하는 약학 조성물은 충분한 IGF-IR 또는 IGF-II가 없는 동물의 치료에 이용될 수 있거나, 또는 골다공증, 허약 또는 포유동물이 활성 성장 호르몬을 거의 분비하지 못하거나 성장 호르몬에 반응할 수 없는 질환의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 항-IGF-IR 항체는 피험체에 투여하기에 적합한 약학 조성물로 혼 입될 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물은 본 발명의 항체 및 약학적 허용 담체를 포함한다. 본원에서 "약학적 허용 담체"는 생리적으로 화합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물질, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 허용 담체의 예로는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합물을 포함한다. 많은 경우 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다. 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제와 같은 미량의 보조 성분과 같은 약학적 허용 성분은 항체 또는 항체의 일부분의 저장 수명 또는 유효성을 증대시킨다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이 조성물은,예를 들어 액체, 반고체 및 고체 형태의 제형, 예컨대 액상 용액(예컨대, 주사액 및 주입액), 분산물 또는 현탁물, 정제, 필, 분말, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 바람직한 제형은 의도하는 투여 방식 및 치료 용도에 좌우된다. 일반적인 바람직한 조성물은 주사액 또는 주입액의 형태로서, 예컨대 다른 항체를 사용한 인간의 수동 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 투여(예컨대, 정맥, 피하, 복강, 근육 주사)이다. 바람직한 구체예에서 항체는 정맥 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 근육 주사 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료 조성물은 통상 제조 및 보관 상태에서 멸균시켜야 하며 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산물, 리포좀, 또는 고농도의 약물에 적합한 그 밖의 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 필요에 따라 적절한 용매 중에 상기 성분 중 하나 또는 상기 성분의 조합물과 함께 필요량의 항-IGF-IR 항체를 혼입시킨 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기한 성분과는 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비이클에 혼입시켜서 제조한다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과시킨 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 필요한 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은 레시틴과 같은 적절한 코팅물질을 사용하거나, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써, 계면활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜서 유도할 수 있다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있지만, 다수의 치료 용도에 있어서 바람직한 투여 경로/방식은 복강 주사, 피하 주사, 근육 주사, 정맥 주사 또는 주입이다. 당업자들이 알고 있는 바와 같이 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 한 구체예에서 본 발명의 항체는 단일 용량으로서 투여될 수 있거나 다수의 용량으로 투여될 수 있다.
특정 구체예에서 활성 화합물은 화합물이 급속 방출되지 않도록 하는 담체와 함께 제조될 수 있는데, 예컨대 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐 전달 시스템과 같은 조절 방출 제형으로 제조될 수 있다. 생분해성, 생화합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토 에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 특허가 허여되어 당업자에게 널리 공지되어 있다[참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, 1978].
특정 구체예에서 본 발명의 항-IGF-IR은, 예컨대 불활성 희석제 또는 흡수할 수 있는 식이성 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물(및 필요에 따라 기타 성분)은 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 넣어서 정제로 압축하거나 또는 피험체의 식이에 직접 혼입시킬 수 있다. 경구 치료 투여의 경우 화합물을 부형제에 혼입시켜서 소화 가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁물, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 비경구 투여가 아니라 다른 경로로 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 이 물질과 동시에 투여할 필요가 있다.
보조 활성 화합물 역시 조성물에 혼입시킬 수 있다. 특정 구체예에서 본 발명의 항-IGF-IR은 1종 이상의 추가 치료제, 예컨대 화학요법제, 항신생물제 또는 항종양제와 공배합하고/하거나 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 항-IGF-IR 항체 를 1종 이상의 추가 치료제와 공배합하고/하거나 동시에 투여할 수 있다. 이러한 제제의 비제한적인 예로는 다른 표적에 결합하는 항체(예컨대, 1종 이상의 성장 인자 또는 시토킨, 이들의 세포 표면 수용체 또는 IGF-I에 결합하는 항체), IGF-I 결합 단백질, 항신생물제, 화학요법제, 항종양제, IGF-IR 또는 IGF-I에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, IGF-IR 활성화를 차단하는 펩티드 유사체, 가용성 IGF-IR, 및/또는 당업계에 공지된 IGF-I의 생산 또는 활성을 억제하는 1종 이상의 화학 물질(예컨대, 옥트레오타이드)을 포함한다. 활성화 항체를 포함하는 약학 조성물의 경우, 항-IGF-IR 항체를 세포 증식을 증가시키거나 아폽토시스를 예방하는 인자와 제형화할 수 있다. 이러한 인자에는 IGF-I와 같은 성장 인자 및/또는 IGF-IR을 활성화시키는 IGF-I의 유사체가 포함된다. 이러한 병용 요법은 항-IGF-IR 항체뿐만 아니라 동시 투여된 제제를 더 낮은 용량으로 요하여 각종 단독 요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다. 한 구체예에서 항체 및 1종 이상의 추가 치료제를 사용한다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부분의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"이란 원하는 치료 결과를 얻기 위해 필요한 용량 및 그 시간 동안 유효한 용량을 의미한다. 항체 또는 이의 일부분의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 요인, 개체에서 원하는 항체 반응을 유발시키는 항체 또는 항체의 일부분의 능력에 따라 다양할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 치료적 이익 효과가 항체 또는 항체의 일부분의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다. "예방적 유효량"이란 원하는 예방 결과를 얻기 위해 필요한 용량 및 그 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 일반적으로 예방적 용량은 질병의 초기 단계 또는 그 이전에 피험체에 사용되기 때문에 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 작다.
투여 계획은 원하는 최적 반응(예컨대 치료 반응 또는 예방 반응)을 제공하도록 조절할 수 있다. 예를 들어 단일 환을 투여할 수 있으며, 경시적으로 몇개의 분할 용량을 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급에 따라 요구되는 대로 비례적으로 용량을 감소 또는 증가시킬 수 있다. 항체를 포함하는 약학 조성물 또는 항체와 1종 이상의 추가 치료제를 포함하는 조합 치료제를 포함하는 약학 조성물은 단일 또는 다회 투여량용으로 제형화할 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 제형으로 제형화하는 것이 특히 유용하다. 본원에서 사용된 단위 제형이란 치료할 포유동물 피험체를 위한 단위 제형으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 유발하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 세부 사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 얻고자 하는 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성에 대처하기 위해 그러한 활성 화합물의 배합 기술이 안고 있는 제약에 좌우되거나 직접적인 영향을 받는다. 특히 유용한 제형은 20 mM 시트르산나트륨 완충액, pH 5.5, 140 mM NaCl 및 0.2 mg/㎖ 폴리소르베이트 80으로 구성된 완충액 중의 5 mg/㎖의 항-IGF-IR 항체이다.
예를 들어 본 발명의 항체 또는 항체의 일부분의 치료적 또는 예방적 유효량의 비제한적인 범위는 0.1∼100 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.5∼50 mg/kg, 보다 바람직하게는 1∼20 mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 1∼10 mg/kg이다. 투여량 값은 완화시킬 증상의 유형 및 심각도에 따라 달라질 수 있음을 알아야 한다. 임의의 특정 피험체의 경우 개개인의 요구 및 조성물을 투여하는 사람 또는 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 구체적 투여 계획이 조정되어야 하며, 본원에 개시된 투여량 범위는 본 발명 조성물의 범위 또는 실시를 제한하는 것이 아님 을 알아야 한다. 한 구체예에서 항체 또는 이의 항원 결합부의 치료적 또는 예방적 유효량은 1종 이상의 추가 치료제와 함께 투여된다.
다른 양태에서 본 발명은 암 치료를 위해 항-IGF-IR 항체를 한달에 300 mg 미만의 용량으로 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 양태는 항-IGF-IR 항체 및 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 이 키트는 항체 또는 약학 조성물 외에도 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 방법 또는 치료 방법에 이용되는 설명서를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서 키트는 항체 또는 이의 약학 조성물 및 후술하는 방법에 이용될 수 있는 진단제를 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서 키트는 항체 또는 이의 약학 조성물 및 후술하는 방법에 이용될 수 있는 1종 이상의 치료제, 예컨대 추가 항신생물제, 항종양제 또는 화학요법제를 포함한다.
본 발명은 또한 화합물, 염, 용매화물, 또는 전구약물의 양 및 화합요법제의 양을 합하면 비정상적 세포 성장을 억제하기에 효과적인 것인 본 발명의 화합물의 양과 화학요법제의 양을 함께 포함하는, 포유동물에서 비정상적인 세포 성장을 억제하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 다수의 화학요법제가 현재 당업계에 공지되어 있다. 한 구체예에서 화학요법제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 대사길항물질, 삽입(intercalating) 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생존억제제, 생물학적 반응 변형제, 항호르몬, 예컨대 항안드로겐, 및 항혈관형성제로 이루어진 군에서 선택된다.
항혈관형성제, 예컨대 MMP-2(기질-메탈로프로테인아제 2) 억제제, MMP-9(기질-메탈로프로테인아제 9) 억제제 및 COX-II(시클로옥시게나제 II) 억제제를 본 발명의 화합물과 함께 사용할 수 있다. 유용한 COX-II 억제제의 예로는 CELEBREXTM(알레콕시브), 발데콕시브 및 로페콕시브를 들 수 있다. 유용한 기질 메탈로프로테인아제 억제제의 예는 WO 96/33172(1996년 10월 24일에 공개), WO 96/27583(1996년 3월 7일에 공개), 유럽 특허 출원 제97304971.1(1997년 7월 8일에 출원), 유럽 특허 출원 제99308617.2호(1999년 10월 29일에 출원), WO 98/07697(1998년 2월 26일에 공개), WO 98/03516(1998년 1월 29일에 공개), WO 98/34918(1998년 8월 13일에 공개), WO 98/34915(1998년 8월 13일에 공개), WO 98/33768(1998년 8월 6일에 공개), WO 98/30566(1998년 7월 16일에 공개), 유럽 특허 공개 제606,046호(1994년 7월 13일에 공개), 유럽 특허 공개 제931,788호(1999년 7월 28일에 공개), WO 90/05719(1990년 5월 31일에 공개), WO 99/52910(1999년 10월 21일에 공개), WO 99/52889(1999년 10월 21일에 공개), WO 99/29667(1999년 6월 17일에 공개), PCT 국제 출원 번호 PCT/IB98/01113(1998년 7월 21일에 출원), 유럽 특허 출원 번호 99302232.1(1999년 3월 25일에 출원), 영국 특허 출원 번호 9912961.1(1999년 6월 3일에 출원), 미국 가명세서 출원 제60/148,464호(1999년 8월 12일에 출원), 미국 특허 제5,863,949호(1999년 1월 26일에 등록), 미국 특허 제5,861,510(1999년 1월 19일에 등록), 및 유럽 특허 공개 제780,386호(1997년 6월 25일에 공개)에 개시되어 있으며, 상기 특허는 모두 본원에서 그 전체를 참고 문헌으로 포함한다. 바람직 한 MMP 억제제는 관절통을 나타내지 않는 것이다. 보다 바람직한 것은 다른 기질 메탈로프로테인아제(즉, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 및 MMP-13)에 비해 MMP-2 및/또는 MMP-9를 선택적으로 억제하는 것이다. 본 발명에 유용한 MMP 억제제의 몇몇 구체적인 예로는 AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 및 하기 화합물들을 포함한다: 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-히드록시카르바모일-시클로펜틸)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사비시클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 히드록시아미드; (2R, 3R)1-[4-(2-클로로-4-플루오로-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-히드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 히드록시아미드; 4-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라히드로피란-4-카르복실산 히드록시아미드; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-히드록시카르바모일-시클로부틸)-아미노]-프로피온산; 4-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라히드로-피란-4-카르복실산 히드록시아미드; (R) 3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라히드로-피란-3-카르복실산 히드록시아미드; (2R, 3R) 1-[4-(4-플루오로-2-메틸-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-히드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 히드록시아미드; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-히드록시카르바모일-1-메틸-에틸)-아미노]-프로피온산; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(4-히드록시카르바모일-테트라히드로피란-4-일)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-이시클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 히드록시아미드; 3-엔도-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-이시클로[3.2.1]옥탄- 3-카르복실산 히드록시아미드; 및 (R) 3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라히드로-푸란-3-카르복실산 히드록시아미드; 및 상기 화합물들의 약학적 허용 염 및 용매화물.
본 발명의 화합물은 신호 전달 억제제, 예컨대 EGF-R(상피 성장 인자 수용체) 반응을 억제할 수 있는 제제, 예컨대 EGF-R 항체, EGF 항체 및 EGF-R 억제제인 분자; VEGF(혈관 내피 성장 인자) 억제제, 예컨대 VEGF 수용체 및 VEGF를 억제할 수 있는 분자; 및 erbB2 수용체 억제제, 예컨대 erbB2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체, 예컨대 HERCEPTINTM(제네틱 인코포레이티드)와 함께 사용할 수 있다. EGF-R 억제제는, 예를 들어 WO 95/19970(1995년 7월 27일에 공개), WO 98/14451(1998년 4월 9일에 공개), WO 98/02434(1998년 1월 22일에 공개), 및 미국 특허 제5,747,498호(1998년 5월 5일에 등록)에 개시된 것이 있으며, 이러한 성분은 본원에 개시된 대로 본 발명에 사용될 수 있다. EGFR 억제제의 비제한적인 예로는 모노클로날 항체 C225 및 항-EGFR 22Mab(임클론 시스템즈 인코로페이티드), ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200(머크 KgaA), EMD-5590(머크 KgaA), MDX-447/H-477(메다렉스 인코포레이티드 및 머크 KgaA), 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839(아스트라제네카), PKI-166(노바티스), PKI-166/CGP-75166(노바티스), PTK 787(노바티스), CP 701(세팔론), 레플루노마이드(파마시아/수겐), CI-1033(워너 램버트 파크 데이비스), CI-1033/PD 183,805(워너 램버트 파크 데이비스), CL-387,785(와이어스-아이어스트), BBR-1611(뵈링거 만하임 GmbH/로쉐), 나아미딘 A( 브리스톨 마이어스 스큅), RC-3940-II(파마시아), BIBX-1382(뵈링거 인겔하임), OLX-103(머크 & 컴퍼니), VRCTC-310(벤텍 리서치), EGF 융합 독소(세라겐 인코포레이티드), DAB-389(세라겐/릴간드), ZM-252808(임페리얼 캔서 리서치 펀드), RG-50864(INSERM), LFM-A12(파커 휴즈 캔서 센터), WHI-P97(파커 휴즈 캔서 센터), GW-282974(글락소), KT-8391(교와 하코) 및 EGF-R 백신(요크 메디칼/센트로 드 이뮤놀로지아 몰리큘러(CIM))을 들 수 있다. 상기 EGF-R-억제제 및 기타 억제제를 본 발명에 사용할 수 있다.
VEGF 억제제, 예컨대 SU-5416 및 SU-6668(수겐 인코포레이티드), SH-268(쉐링), 및 NX-1838(넥스타) 역시 본 발명의 화합물과 함께 사용할 수 있다. VEGF 억제제는, 예를 들어 WO 99/24440(1999년 5월 20일에 공개), PCT 국제 출원 PCT/IB99/00797(1999년 5월 3일에 출원), WO 95/21613(1995년 8월 17일에 공개), WO 99/61422(1999년 12월 2일에 공개), 미국 특허 제5,834,504호(1998년 11월 10일에 등록), WO 98/50356(1998년 11월 12일에 공개), 미국 특허 제5,883,113호(1999년 3월 16일에 등록), 미국 특허 제5,886,020호(1999년 3월 23일에 등록), 미국 특허 제5,792,783호(1998년 8월 11일에 등록), WO 99/10349(1999년 3월 4일에 공개), WO 97/32856(1997년 9월 12일에 공개), WO 97/22596(1997년 6월 26일에 공개), WO 98/54093(1998년 12월 3일에 공개), WO 98/02438(1998년 1월 22일에 공개), WO 99/16755(1999년 4월 8일에 공개), 및 WO 98/02437(1998년 1월 22일에 공개)에 개시되어 있으며, 상기 특허는 모두 그 전체를 본원에서 참고 문헌으로 포함한다. 본 발명에 유용한 몇가지 구체적인 VEGF 억제제의 다른 예로는 IM862(시트란 인코포레 이티드); 제네텍 인코포레이티드의 항-VEGF 모노클로날 항체; 및 리보자임 및 카이런에서 입수 가능한 합성 리보자임인 앤지오자임이 있다. 상기한 것 및 기타 VEGF 억제제를 본원에 개시된 본 발명에 사용할 수 있다.
ErbB2 수용체 억제제, 예컨대 GW-282974(글락소 웰컴 plc) 및 모노클로날 항체 AR-209(아로넥스 파마수티컬 인코포레이티드) 및 2B-1(카이런) 역시 본 발명의 화합물과 함께 사용할 수 있으며, 상기 억제제의 예는 WO 98/02434(1998년 1월 22일에 공개), WO 99/35146(1999년 7월 15일에 공개), WO 99/35132(1999년 7월 15일에 공개), WO 98/02437(1998년 1월 22일에 공개), WO 97/13760(1999년 4월 17일에 공개), WO 95/19970(1995년 7월 27일에 공개), 미국 특허 제5,587,458호(1996년 12월 24일에 등록) 및 미국 특허 제5,877,305호(1999년 3월 2일에 등록)에 개시된 것이 있으며, 상기 문헌은 모두 본원에서 참고로 인용한다. 본 발명에 유용한 ErbB2 수용체 억제제는 1999년 1월 27일에 출원된 미국 가명세서 출원 제60/117,341호, 및 1999년 1월 27일에 출원된 제60/117,346호에 개시되어 있으며, 상기 특허는 모두 본원에서 참고로 인용한다. 상기 PCT 출원, 미국 특허 및 미국 가명세서 출원에 개시된 erbB2 수용체 억제제 화합물 및 성분뿐만 아니라 erbB2 수용체를 억제하는 기타 화합물 및 성분을 본 발명에 따라 본 발명의 화합물과 함께 사용할 수 있다.
생존억제제는 항-IGF-IR 항체 및 항-인테그린 항체와 같은 항-인테그린 제제를 포함한다.
진단적 사용 방법
시험관내 또는 생체내에서 생물학적 샘플 중의 IGF-IR을 검출하기 위해 항- IGF-IR 항체를 사용할 수 있다. 항-IGF-IR 항체는 비제한적인 예로 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역화학법, 웨스턴 블롯 또는 면역침전법을 비롯하여 통상적인 면역분석법에 이용할 수 있다. 본 발명의 항-IGF-IR 항체는 인간에서 유래된 IGF-IR를 검출하는 데 이용될 수 있다. 또다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 사이노몰구스 및 레서스 원숭이, 침팬지 및 유인원과 같은 구대륙 영장류 유래의 IGF-IR을 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플과 본 발명의 항-IGF-IR 항체를 접촉시키는 단계 및 항-IGF-IR에 결합된 항체를 검출하여 생물학적 샘플 중의 IGF-IR을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 항-IGF-IR을 검출하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서 항-IGF-IR 항체를 검출 가능한 표지로 직접 표지한다. 또다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체(1차 항체)는 표지하지 않고, 2차 항체 또는 항-IGF-IR 항체에 결합하는 다른 분자는 표지한다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 특수한 종 및 클래스의 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 선택한다. 예를 들어, 항-IGF-IR 항체가 인간 IgG라면, 2차 항체는 항-인간 IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자의 비제한적인 예로는 단백질 A 및 단백질 G가 있으며, 이들 둘다, 예컨대 피어스 케미칼 컴퍼니에서 시판된다.
2차 항체에 적합한 표지는 앞서 개시하였으며, 각종 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 자성 물질 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있으며, 적합한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있고, 적합한 형광 물질로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레 세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고, 발광 물질의 예로는 루미놀이 있고, 자성 물질의 예로는 가돌리늄이 있으며, 적합한 방사능 활성 물질의 예로는 125I, 131I, 35 S 또는 3H를 들 수 있다.
또다른 구체예에서 검출 가능한 성분으로 표지한 IGF-IR 표준물질 및 비표지항-IGF-IR 항체를 사용하는 경쟁 면역분석법에 의해 생물학적 샘플 중의 IGF-IR을 분석할 수 있다. 이 분석에서, 생물학적 샘플, 표지된 IGF-IR 표준물질 및 항-IGF-IR 항체를 조합하고, 비표지 항체에 결합된 표지된 IGF-IR 표준물질의 양을 측정한다. 생물학적 샘플 중의 IGF-IR의 양은 항-IGF-IR 항체에 결합된 표지된 IGF-IR 표준물질의 양에 반비례한다.
전술한 면역분석법은 여러 목적으로 이용할 수 있다. 한 구체예에서 세포 배양물 중의 세포에서 IGF-IR을 검출하기 위해 항-IGF-IR 항체를 이용할 수 있다. 바람직한 구체예에서 각종 화합물로 세포를 처리한 후 IGF-IR의 티로신 인산화, 티로신 자가 인산화 정도 및/또는 세포 표면 상의 IGF-IR의 양을 측정하기 위해 항-IGF-IR 항체를 이용할 수 있다. 이 방법은 IGF-IR을 활성화시키거나 억제하는 데 사용될 수 있는 화합물을 테스트하는 데 이용될 수 있다. 이 방법에서 한 세포 샘플을 일정 시간 동안 테스트 화합물로 처리하고 다른 샘플은 처리하지 않고 둔다. 티로신 자가 인산화를 측정하고자 한다면 세포를 용해시키고 전술한 면역분석법 또는 실시예 III에 기재된 면역분석법(ELISA 이용)을 이용하여 IGF-IR의 티로신 인산 화를 측정한다. IGF-IR의 총 농도를 측정하고자 한다면 세포를 용해시키고 전술한 면역분석법 중 하나를 이용하여 총 IGF-IR 농도를 측정한다.
IGF-IR 티로신 인산화의 측정 또는 총 IGF-IR 농도를 측정하기 위한 바람직한 면역분석법은 ELISA 또는 웨스턴 블롯이다. IGF-IR의 세포 표면 농도만을 측정하고자 한다면 세포를 용해시키지 않고 전술한 면역분석법 중 하나를 이용하여 IGF-IR의 세포 표면 농도를 측정한다. IGF-IR의 세포 표면 농도를 측정하기 위한 바람직한 면역분석법은 비오틴 또는 125I와 같은 검출 가능한 표지로 세포 표면 단백질을 표지하는 단계, IGF-IR을 항-IGF-IR 항체로 면역침전시키는 단계 및 표지된 IGF-IR을 검출하는 단계를 포함한다. IGF-IR의 국소화, 예컨대 세포 표면 농도를 측정하기 위한 또다른 바람직한 면역분석법은 면역조직화학법을 이용하는 것이다. ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 완전한 막 단백질의 세포 표면 표지 및 면역침전법과 같은 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[Harlow 및 Lane의 상기 문헌 참조]. 또한, 면역분석법은 IGF-IR의 활성화 또는 억제를 위한 다수의 화합물을 테스트하기 위한 고처리량 스크리닝을 위해 규모를 확대할 수 있다.
조직 또는 조직 유래의 세포 내의 IGF-IR의 농도를 측정하는 데에도 본 발명의 항-IGF-IR 항체를 이용할 수 있다. 바람직한 구체예에서 조직은 유병 조직이다. 보다 바람직한 구체예에서 조직은 종양 또는 이의 생검이다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예에서 조직 또는 이의 생검은 환자로부터 절제한다. 그 후 전술한 방법에 의해, 예컨대 IGF-IR 농도, IGF-IR의 세포 표면 농도, IGF-IR의 티로신 인산화 정도, 또는 IGF-IR의 국소화를 측정하기 위한 면역분석법에 상기 조직 또는 그 생검을 사용한다. 이 방법은 종양이 IGF-IR을 고농도로 발현하는지를 결정하는 데 이용될 수 있다.
전술한 진단 방법은 종양이 고농도의 IGF-IR을 발현하는지를 결정하는 데 이용할 수 있으며, 고농도의 IGF-IR 발현은 종양이 항-IGF-IR 항체를 사용한 치료에 잘 반응한다는 것을 암시할 수 있다. 진단 방법은 또한 종양이 고농도의 IGF-IR을 발현한다면 종양이 암이 될 가능성 있음을, 또는 IGF-IR를 저농도로 발현한다면 양성임을 결정하는 데 이용될 수 있다. 또한, 진단 방법은 항-IGF-IR 항체를 사용한 치료(하기 참조)가 종양이 저농도의 IGF-IR을 발현하도록 하고/하거나 낮은 정도의 티로신 자가인산화를 나타내도록 하는지를 결정하도록 하는 데 이용될 수 있으며, 따라서 치료가 성공적일지를 결정하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로, 항-IGF-IR 항체가 티로신 인산화를 감소시키는지를 결정하는 방법은 목적하는 세포 또는 조직 내의 티로신 인산화 정도를 측정하는 단계, 세포 또는 조직을 항-IGF-IR 항체 또는 이의 항원 결합부와 항온처리하는 단계 및 세포 또는 조직 내의 티로신 인산화 정도를 재측정하는 단계를 포함한다. IGF-IR 또는 다른 단백질(들)의 티로신 인산화를 측정할 수 있다. 진단 방법을 이용하여 조직 또는 세포가 충분히 높은 농도의 IGF-IR을 발현하는지, 또는 충분히 높은 농도의 활성화된 IGF-IR을 발현하는지를 결정할 수 있으며, 상기한 경우는 소인증, 골다공증 또는 당뇨병 환자에서 나타나는 현상이다. IGF-IR 또는 활성 IGF-IR의 농도가 너무 낮은 진단은 IGF-IR 농도 또는 활성을 증가시키기 위한 활성화 항-IGF-IR 항체, IGF-I 또는 기타 치료제를 사 용한 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 IGF-IR을 발현하는 조직 및 기관의 위치를 파악하기 위해 생체내에서 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 IGF-IR 발현 종양의 위치를 지정하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 항-IGF-IR 항체의 장점은 이들이 투여시 면역 반응을 일으키지 않는다는 것이다. 이 방법은 항-IGF-IR 항체 또는 이의 약학 조성물을 이러한 진단 테스트를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계 및 환자를 대상으로 IGF-IR 발현 조직의 위치를 결정하기 위한 영상화 분석을 실시하는 단계를 포함한다. 영상화 분석은 의약 분야에 잘 알려져 있으며, 비제한적인 예로 x-선 분석, 자기 공명 영상(MRI) 또는 전산화된 x-선 단층촬영법(CE)을 포함한다. 또다른 방법의 구체예에서 환자를 대상으로 영상화 분석을 하기 보다는 목적하는 조직이 IGF-IR을 발현하는지를 결정하기 위해 환자로부터 생검을 취한다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체를 환자에서 영상화할 수 있는 검출 가능한 제제로 표지할 수 있다. 예를 들어, 항체를 x-선 분석에 이용할 수 있는 바륨과 같은 조영제, 또는 MRI 또는 CE에 이용할 수 있는 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성 조영제로 표지할 수 있다. 다른 표지제의 비제한적인 예로는 99Tc와 같은 방사능 동위원소가 있다. 또다른 구체예에서, 항-IGF-IR 항체를 표지하지 않고, 검출 가능하며 항-IGF-IR 항체에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 기타 분자를 투여함으로써 영상화한다.
치료적 사용 방법
또다른 구체예에서 본 발명은 항-IGF-IR 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 IGF-IR 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 항체 유형 중 어떠한 것도 치료용으로 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다. 또다른 바람직한 구체예에서 IGF-IR은 인간의 것이며, 환자는 인간 환자이다. 또는 환자는 항-IGF-IR 항체가 교차 반응하는 IGF-IR을 발현하는 포유동물일 수 있다. 항체가 수의학적 목적으로, 또는 인간 질병의 동물 모델로서 교차 결합하는 IGF-IR을 발현하는 비인간 포유동물(즉, 영장류, 또는 사이노몰구스 또는 레서스 원숭이)에게 항체를 투여할 수 있다. 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는 데 유용할 수 있다.
본원에서, "IGF-IR 활성이 유해한 병"이란 용어는 그 병이 있는 환자에서의 고농도의 IGF-IR의 존재가 그 병의 병리생리학적 원인이 되거나 그 병의 악화에 기여하는 요인인 것으로 확인되었거나 의심이 되는 질환 또는 기타 병을 포함한다. 따라서, 고농도의 IGF-IR 활성이 해로운 병은 IGF-IR 활성의 억제가 병의 증상 및/또는 진행을 완화시키는 것으로 예상되는 병이다. 이러한 병은 병을 앓고 있는 피험체의 손상된 세포 또는 조직에서 세포 표면 상의 IGF-IR의 농도의 증가 또는 IGF-IR의 증가된 티로신 자가 인산화를 통해 확인할 수 있다. IGF-IR 농도의 증가는, 예컨대 전술한 바와 같은 항-IGF-IR 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 항-IGF-IR 항체를 IGF-IR 발현 종양이 있는 환자에게 투여할 수 있다. 종양은 고형 종양일 수 있거나, 또는 림프종과 같은 비-고형 종양 일 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체를 암성 IGF-IR 발현 종양을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체를 폐, 유방, 전립선 또는 결장의 종양이 있는 환자에게 투여한다. 매우 바람직한 구체예에서 이 방법은 종양의 중량 또는 용적을 증가시키지 않거나, 또는 중량 또는 용적을 감소시킨다. 또다른 구체예에서 이 방법은 종양 상의 IGF-IR이 내부화되도록 한다. 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 고농도의 IGF-I을 부적절하게 발현하는 환자에게 투여될 수 있다. IGF-I의 고농도 발현은 각종 일반 암을 야기시킬 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 전립선 암, 신경교종 또는 섬유육종 환자에게 투여된다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 이 방법은 암이 비정상적으로 증식하는 것을 중단시키거나, 또는 암의 중량 또는 용적이 증가되지 않도록 하거나, 중량 또는 용적을 감소시킨다.
한 구체예에서 상기 방법은 뇌암, 편평상피 세포암, 방광암, 위암, 췌장암, 유방암, 머리암, 목암, 식도암, 전립선암, 직장결장암, 폐암, 신세포암, 신장암, 난소암, 부인암 또는 갑상선암과 같은 암의 치료와 관련된 것이다. 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 화합물로 치료할 수 있는 환자의 예는 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 및 목암, 피부 또는 안구 흑색종, 비뇨기암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 결장암, 유방암, 부인과 종양(예컨대, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종 또는 외음부 암종), 호지킨병, 식도암, 작은창자암, 내분비계암(예컨대, 갑상선암, 부갑상선암, 부신선암), 연질 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 소아 고형암, 림프성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암(예컨대, 신세포 암종, 골반 신장 암종), 또는 중추 신경계의 신생물 형성(예컨대, 1차 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마)이 있는 것으로 진단된 환자를 포함한다.
항체는 1회 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 다회 투여된다. 항체는 1일 3회에서부터 6개월마다 1회까지 투여될 수 있다. 투여 스케줄은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회 및 6개월에 1회로 할 수 있다. 항체는 경구, 점막, 협측, 비강내, 흡입, 정맥, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통해 투여할 수 있다. 항체는 종양 부위와 떨어져 있는 부위에 투여할 수 있다. 항체는 미니펌프를 통해 연속적으로 투여할 수도 있다. 항체는 또한 1회, 2회 이상, 또는 최소한 증상이 치료되거나 완화되거나 치유될 때까지 투여할 수 있다. 항체가 종양 또는 암의 성장을 중단시키거나 또는 그 중량 또는 용적을 감소시킨다면 일반적으로 종양이 존재하는 한은 항체를 투여한다. 항체는 일반적으로 전술한 바와 같이 약학 조성물의 일부로서 투여된다. 항체의 투여량은 일반적으로 0.1∼100 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.5∼50 mg/kg, 보다 바람직하게는 1∼20 mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 1∼10 mg/kg에 속한다. 항체의 혈청 농도는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 예컨대 하기 실시예 XVII을 참조하라. 항체는 또한 암 또는 종양의 발생을 막기 위한 예방의 목적으로 투여될 수 있다. 이는 특히 IGF-I의 농도가 "높은 정상" 범위인 환자에 유용할 수 있는데, 왜냐하면 이들 환자는 일반 암의 발생 위험이 더 높은 것으로 나타났기 때문이다. 상기 Rosen 등의 문헌을 참조하라.
또다른 양태에서 항-IGF-IR 항체를 항신생물 약물 또는 분자와 같은 다른 치료제와 함께 암 또는 종양과 같은 과증식성 질환을 가진 환자에게 동시에 투여할 수 있다. 일 양태에서 본 발명은 과증식성 질환이 있는 포유동물에게 본 발명의 화합물의 치료적 유효량과 함께 비제한적인 예로 유사분열 억제제, 알킬화제, 대사길항물질, 삽입제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항호르몬, 키나제 억제제, 기질 메탈로프로테아제 억제제, 유전자 요법제 및 항안드로겐으로 이루어진 군에서 선택된 항종양제를 투여하는 것을 포함하는 상기 포유동물의 과증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 보다 바람직한 구체예에서 항체는 아드리아마이신 또는 택솔과 같은 항신생물제와 함께 투여할 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체 요법 또는 병용 요법은 방사선 요법, 화학 요법, 광역학 요법, 수술 또는 기타 면역요법과 함께 투여된다. 또다른 바람직한 구체예에서 항체는 다른 항체와 함께 투여된다. 예를 들어, 항-IGF-IR 항체는 종양 또는 암 세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 항체 또는 기타 제제, 예컨대 erbB2 수용체, EGF-R, CD20 또는 VEGF를 억제하는 항체 또는 제제와 함께 투여될 수 있다.
항체와 추가 치료제의 동시 투여(병용 요법)는 항-IGF-IR 항체 및 추가 치료제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 방법, 및 하나는 항-IGF-IR 항체를 포함하고 다른 하나(또는 그 이상)는 추가 치료제(들)를 포함하는 것인 2 이상의 개별 약 학 조성물을 투여하는 방법을 포함한다. 또한, 동시 투여 또는 병용 요법은 일반적으로 항체와 추가 치료제를 동시에 같이 투여하는 것을 의미하지만, 이것은 항체와 추가 치료제를 서로 다른 시기에 투여하는 경우도 포함한다. 예를 들어, 항체는 3일에 1회 투여할 수 있는 반면, 추가 치료제는 1일에 1회 투여할 수 있다. 또는, 항체는 추가 치료제로 질환을 치료하기 전에 또는 후에 투여할 수 있다. 마찬가지로 항-IGF-IR 항체의 투여는 방사선 요법, 화학 요법, 광역학 요법, 수술 또는 기타 면역 요법과 같은 기타 요법을 실시하기 전에 또는 후에 투여할 수 있다.
항체 및 1종 이상의 추가 치료제(병용 요법)는 1회, 2회, 또는 최소한 증상이 치료, 완화 또는 치유될 때까지 투여할 수 있다. 바람직하게는 병용 요법은 여러회 투여한다. 병용 요법은 1일 3회에서부터 6개월마다 1회까지 투여될 수 있다. 투여 스케줄은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회 및 6개월에 1회로 할 수 있거나, 또는 미니펌프를 통해 연속 투여할 수 있다. 병용 요법은 경구, 점막, 협측, 비강내, 흡입, 정맥, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통해 투여할 수 있다. 병용 요법은 종양 부위와 떨어져 있는 부위에 투여할 수 있다. 항체가 종양 또는 암의 성장을 중단시키거나 또는 그 중량 또는 용적을 감소시킨다면 종양이 존재하는 한은 일반적으로 병용 요법을 투여한다.
또다른 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 방사능 표지, 면역독소 또는 독소로 표지하거나, 또는 이것은 독성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 항-IGF-IR 항체 또는 항-IGF-IR 항체 융합 단백질은 방사능 표지, 면역 독소, 독소 또는 독성 펩티 드를 IGF-IR 발현 종양 또는 암 세포로 유도한다. 바람직한 구체예에서 방사능 표지, 면역 독소, 독소 또는 독성 펩티드는 항-IGF-IR 항체가 종양 또는 암 세포의 표면 상의 IGF-IR에 결합한 후에 내부화된다.
또다른 양태에서 항-IGF-IR 항체는 이를 필요로 하는 환자에서 특정 세포의 아폽토시스를 유도하기 위해 치료 목적으로 사용될 수 있다. 많은 경우 아폽토시스의 대상이 되는 세포는 암 세포 또는 종양 세포이다. 따라서 바람직한 구체예에서 본 발명은 항-IGF-IR 항체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 아폽토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서 항체는 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 또는 6.1.1 중에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
또다른 양태에서 항-IGF-IR 항체는 고농도의 IGF-I 및/또는 IGF-IR이 비암성 증상 또는 병과 관련이 있는 비암성 증상을 치료하는 데 이용될 수 있다. 한 구체예에서 이 방법은 고농도 또는 고활성의 IGF-I 및/또는 IGF-IR에 의해 야기되거나 심화된 비암성 병리적 증상을 가진 환자에게 항-IGF-IR 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서 비암성 병리적 증상으로는 선단비대증, 거인증, 건선, 아테롬성경화증, 혈관의 평활근 재협착증 또는 부적절한 미소혈관 증식, 예컨대 당뇨 합병증에서, 특히 눈에서 발견되는 것과 같은 상기 증상을 들 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 비암성 병리적 증상의 진행을 늦춘다. 보다 바람직한 구체예에서 항-IGF-IR 항체는 비암성 병리적 증상을 중단시키거나 적어도 부분적으로 역행시킨다.
또다른 양태에서 본 발명은 활성화 항-IGF-IR 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서 활성화 항체 또는 약학 조성물을 IGF-IR 활성을 증가시키기에 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여한다. 보다 바람직한 구체예에서 활성화 항체는 정상적 IGF-IR 활성을 회복시킬 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서 활성화 항체를 소인증, 신경장해, 근육량 감소 또는 골다공증 환자에게 투여할 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서 활성화 항체는 세포 증식을 증가시키거나, 아폽토시스를 예방하거나 또는 IGF-IR 활성을 증가시키는 1종 이상이 다른 인자와 함께 투여할 수 있다. 그러한 인자로는 IGF-I와 같은 성장 인자 및/또는 IGF-IR을 활성화시키는 IGF-I의 유사체를 포함한다. 바람직한 구체예에서 항체는 4.17.3에서 선택되거나, 또는 이의 중쇄, 경쇄 또는 항원 결합부를 포함한다.
유전자 치료
본 발명의 핵산 분자는 유전자 치료를 통해 이를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 유전자 치료는 생체내에서 또는 생체외에서 이루어질 수 있다. 바람직한 구체예에서 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 환자에게 투여한다. 보다 바람직한 구체예에서 B 세포는 항체 생산 전문 세포이기 때문에 핵산 분자를 이들이 B 세포의 염색체에 안정하게 통합되도록 투여한다. 바람직한 구체예에서 전구체 B 세포를 생체외에서 트랜스펙션 또는 감염시켜서 이를 필요로 하는 환자에게 재이식한다. 또다른 구체예에서 전구체 B 세포 또는 기타 세포를 원하는 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려진 바이러스를 사용하여 생체내 감염시킨다. 유전자 치료에 사용되는 일반적인 벡터로는 리포좀, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함한다. 생체내 또는 생체외 감염 후에 치료한 환자로부터 샘플을 취하여 당업계에 공지되어 있고 본원에서 기술하는 임의의 면역분석법을 이용하여 항체 발현 수준을 모니터할 수 있다.
바람직한 구체예에서 유전자 치료법은 인간 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부 또는 이의 일부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자의 유효량을 투여하는 단계 및 그 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 또다른 구체예에서 유전자 치료법은 인간 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합부 또는 이의 일부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자의 유효량을 투여하는 단계 및 그 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서 유전자 치료법은 인간 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부 또는 이의 일부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자의 유효량 및 인간 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합부 또는 이의 일부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자의 유효량을 투여하는 단계 및 상기 핵산 분자들을 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 치료법은 또한 또다른 항암제, 예컨대 택솔, 태목시펜, 5-FU, 아드리아마이신 또는 CP-358,774를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록 하기 실시예를 기술한다. 이 실시예는 단지 예시를 목적으로 하며 어떤 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 I: 항-IGF-IR 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조
본 발명의 항체를 후술하는 바와 같이 제조, 선별 및 분석하였다.
면역화 및 하이브리도마 제조
8∼10주령의 XENOMICETM에 인간 IGF-IR의 세포외 도메인(10 ㎍/용량/마우스), 또는 3T3-IGF-IR 또는 300.19-IGF-IR 세포를 복강 또는 뒷발에 주사하였다. 상기 3T3-IGF-IR 또는 300.19-IGF-IR 세포는 둘다 플라즈마 멤브레인 상에 인간 IGF-IR을 발현하는 트랜스펙션된 세포주이다(10 x 106 세포/용량/마우스). 이 용량을 3∼8주에 걸쳐 5∼7회 반복 투여하였다. 융합 4일 전에 마우스에 PBS 중의 인간 IGF-IR의 세포외 도메인의 마지막 접종을 실시하였다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 및 림프절 림프구를 비분비성 흑색종 P3-X63-Ag8.653 세포주와 융합시키고, 공지된 바와 같이 HAT 선별을 실시하였다[Galfre 및 Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981]. 모두 IGF-IR 특이적 인간 IgG2κ항체를 분비하는 일군의 하이브리도마를 회수하였다. 후속 실험을 위해 IGF-IR에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 7개의 하이브리도마를 선별하고, 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 및 6.1.1로 명명하였다.
하이브리도마 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 및 4.17.3은 미국 버지니아주 20110-2209 매너사스 불러버드 대학 10801에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)에 2000년 12월 12일에 기탁하였으며, 하기 기탁 번호를 부여받았다.
하이브리도마 기탁 번호
2.12.1 PTA-2792
2.13.2 PTA-2788
2.14.3 PTA-2790
3.1.1 PTA-2791
4.9.2 PTA-2789
4.17.3 PTA-2793
실시예 II: BIAcore에 의한 완전한 인간 항-IGF-IR 모노클로날 항체의 친화력 상수(K d )의 결정
본 발명자들은 제조업자의 프로토콜에 따라서 BIAcore 3000 장치를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 정제된 항체의 친화력을 측정하였다.
프로토콜 1
역학 분석을 실시하기 위해 BIAcore의 센서칩 표면에 단백질 A를 고정시켰다. 그 후 센서칩은 본 발명의 항-IGF-IR 항체를 포획하는 데 이용하였다. 상이한 농도의 IGF-IR의 세포외 도메인을 센서칩 상에 주사하고, 항-IGF-IR 항체와 IGF-IR의 세포외 도메인간의 상호작용의 결합 및 해리 역학을 분석하였다. 데이터는 BIAcore에서 제공하는 BIA 평가 소프트웨어에서 이용할 수 있는 기본값 드리프트 모델을 사용하여 글로벌 핏 랭뮤어(global fit Langmuir) 1:1로 평가하였다.
프로토콜 2
BIAcore 측정은 Fagerstam 등의 문헌["Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping.", J. Mol. Recog. 3:208-214(1990)]에 기술된 것과 실질적으로 동일하게 수행하였다.
하기 표 I은 본 발명의 대표적인 항-IGF-IR 항체에 대한 친화력 측정값을 기재한 것이다.
모노클로날 항체 Kd(M) 프로토콜 I Kd(M) 프로토콜 2
2.12.1 7.37 x 10-9
2.13.2 3.5 x 10-9 1.53 x 10-9
2.14.3 6.41 x 10-10
3.1.1 1.15 x 10-9
4.9.2 6.84 x 10-10 4.27 x 10-10
4.17.3 1.3 x 10-8
6.1.1 5.65 x 10-10

상기 역학 분석은 본 발명에 따라 제조된 항체가 IGF-IR의 세포외 도메인에 대한 높은 친화력과 강력한 결합 상수를 보유한다는 것을 나타낸다.
실시예 III: IGF-IR의 IGF-I 유도 인산화의 항체 매개 억제
본 발명자들은 본 발명의 항체가 IGF-IR의 IGF-I 매개 활성화를 차단할 수 있는지를 결정하기 위한 ELISA 실험을 실시하였다. IGF-IR의 IGF-I 매개 활성화는 수용체와 관련된 티로신 인산화의 증가에 의해 검출되었다.
ELISA 플레이트 준비
본 발명자들은 ReactiBind Protein G-코팅 96웰 플레이트(피어스)의 각 웰에 블로킹 완충액 100 ㎕(Tris 완충 염수[TBS] 중의 3% 소 혈청 알부민[BSA])를 첨가하여 ELISA 캡쳐 플레이트를 준비하고, 이 플레이트를 실온에서 30분간 진탕시켜서 항온처리하였다. 블로킹 완충액 중에 토끼 범특이적(pan-specific) SC-713 항-IGF- IR 항체(산타 크루즈)를 5 ㎍/㎖의 농도로 희석시키고, 희석된 항체 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 실온에서 60∼90분간 진탕시키면서 항온처리하였다. 그 후 플레이트를 세척 완충액(TBS + 0.1% Tween 20)으로 5회 세척하고, 남아 있는 완충액을 종이 타월에 살짝 흡수시켜 제거하였다. 이들 플레이트는 용해물을 첨가하기 전에는 건조되지 않도록 하였다.
IGF-IR 발현 세포로부터 용해물의 준비
본 발명자들은 96웰의 U자형 바닥 플레이트에 100 ㎕의 성장 배지(DMEM 고글루코스 농도의 배지, L-글루타민(0.29 mg/㎖), 10% 열 불활성화 FBS, 및 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 각각 500 ㎍/㎖씩 보충된 것) 중에 IGF-IR-트랜스펙션 NIH-3T3 세포(5 x 104/㎖)를 넣었다. 본 발명자들은 이 플레이트를 37℃, 5% CO2에 밤새 두어 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 플레이트에서 배지를 따라내고 웰당 100 ㎕의 새로운 배양 배지로 대체하였다. 테스트를 위해 잠재적 항-IGF-IR 항체를 배양 배지 중에서 원하는 최종 농도의 5배로 희석시켜서 웰당 25 ㎕씩 첨가하였다. 모든 샘플은 3개씩 수행하였다. 그 후 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 600 ng/㎖ IGF-1(배양 배지 중에서 준비) 25 ㎕/웰로 자극시키고, 그 플레이트를 실온에서 10분간 항온처리하였다. 그 후 플레이트를 뒤집어서 배지를 따라내고 종이 타월에 살짝 흡수시켜 제거한 후 용해 완충액(50 ㎖당 50 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1.6 mM NaVO4, 1% Triton X-100, 1% 글리세롤, 사용하기 직전에 EDTA가 없는 1종의 프로테아제 억 제제 정제[로쉐 몰리큘러 사이언시즈]를 보충함) 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 5분간 진탕시켜서 부착된 세포를 용해시켰다. 각 웰에 200 ㎕의 희석 완충액(50 mM HEPES, pH 7.4, 1.6 mM NaVO4)을 첨가하고, 피펫을 빨아올렸다 내렸다 하여 혼합하였다. 각 웰로부터 100 ㎕의 용해물을 취하여 전술한 바와 같이 준비한 ELISA 캡쳐 플레이트의 각 웰에 옮겨서 실온에서 2 시간 동안 약하게 진탕시키면서 항온처리하였다.
항-티로신-포스페이트(pTYR) 항체를 사용한 ELISA
본 발명자들은 플레이트를 뒤집어 세포 용해물을 제거하고, 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한 후 완충액을 종이 타월에 살짝 흡수시켜 제거하였다. 0.2 ㎍/㎖의 농도로 블로킹 완충액 중에 희석시킨 pTYR 특이적 항체(HRP-PY54)를 웰당 100 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 30분간 진탕시키면서 플레이트를 항온처리하였다. 그 후 이 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척하고 종이 타월로 완충액을 흡수 제거하였다.
TMB 퍼옥시다제 기질 용액(키르케가드 & 페리)을 웰당 100 ㎕씩 첨가하고 발색이 일어나도록 진탕시키면서 항온처리하여(약 2∼10분) HRP-PY54 항체의 결합을 검출하였다. TMB 중지 용액(키르케가드 & 페리)을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 발색 반응을 중단시켰다. 그 후 플레이트를 실온에서 10초간 진탕시켜서 용액을 혼합하고 OD450nm에서의 측정값으로 정량하였다.
표 II 및 도 4에는 본 발명의 몇가지 항체를 사용하여 수행한 실험의 결과를 나타내었다. 이 실험 결과는 증가된 수용체 관련 티로신 인산화에 의해 입증되는 바와 같이 IGF-IR의 IGF-I 매개 활성화를 차단하는 본 발명의 항체의 능력을 입증한다. 또한, 이 결과는 본 발명의 항체의 상대적 효능을 정량하는 데 이용될 수 있다.
모노클로날 항체 IC50(㎍/㎖)
2.12.1 0.172
2.13.2 0.0812
2.14.3 0.325
4.9.2 0.0324

실시예IV: IGF-I/IGF-IR 결합의 항체 매개 차단
본 발명자들은 세포계 분석으로 IGF-IR에 대한 IGF-I의 결합을 억제하는 본 발명의 항체의 능력을 정량하기 위한 ELISA 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 96웰의 U자형 바닥 플레이트에 L-글루타민(0.29 mg/㎖), 10% 열 불활성화 FBS, 및 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 각각 500 ㎍/㎖ 보충된 100 ㎕의 DMEM 고글루코스 배지 중에 IGF-IR-트랜스펙션 NIH-3T3 세포(5 x 104/㎖)를 도말하였다. 그 후 이 플레이트를 37℃, 5% CO2에 밤새 두어 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 그 후 플레이트에서 배지를 따라내고 웰당 100 ㎕의 새로운 배양 배지로 대체하였다. 테스트를 위해 항체를 분석 배지(DMEM 고글루코스 배지, L-글루타민, 10% 열 불활성화 FBS, 200 ㎍/㎖ BSA, 및 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 각각 500 ㎍/㎖ 보충됨)에 희석시켜서 원하는 최종 농도가 되도록 한 다음 웰당 50 ㎕씩 첨가하였다. 모든 샘플은 3개씩 수행하였다. 그 후 플레이트를 37℃에서 10분간 항온처리하였다. [125I]-IGF-I을 분석 배지 중에 1 μCi/㎖ 농도가 되도록 희석시키고 플레이트 웰당 50 ㎕씩 첨가하였다. 백그라운드 방사능 활성을 알기 위한 대조군으로서 콜드 IGF-I을 최종 농도가 100 ng/㎖이 되도록 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 10분간 항온처리하고 종이 타월에 살짝 흡수시켜 배지를 제거한 후 분석 배지로 2회 세척하였다. 그 후 세포에 0.1 N NaOH, 0.1% SDS 50 ㎕를 첨가하고 이 플레이트를 실온에서 5분간 진탕시켜서 세포를 용해시켰다. 그 후 샘플을 신틸레이션 플레이트로 옮겨서 OptiPhase Supermix 150 ㎕를 첨가하여 왈락 마이크로-베타 카운터 상에서 시그널을 판독하였다.
표 III 및 도 3은 본 발명의 대표적인 3가지 항체를 사용하여 수행한 실험의 결과를 나타낸 것이다. 이 실험은 본 발명의 항체가 IGF-IR 과발현 세포에 대한 [125I]-IGF-I의 결합을 특이적으로 억제한다는 것을 보여준다.
모노클로날 항체 IC50
2.12.1 0.45 ㎍/㎖
2.13.2 0.18 ㎍/㎖
4.9.2 0.1 ㎍/㎖

실시예 V: 에피토프 맵핑 실험
본 발명의 항체가 IGF-IR을 인식한다는 것을 입증한 후 본 발명자들은 본 발명의 몇가지 항체를 사용하여 에피토프 맵핑 실험을 수행하였다. 이 실험은 특히 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 및 4.9.2 항체에 중점을 두었다.
본 발명자들은 본 발명의 항체들이 IGF-IR 분자 상의 같은 부위에 결합하는지 다른 부위에 결합하는지를 확인하기 위한 BIAcore 경쟁 실험을 수행하였다. 실시예 II에서 전술한 바와 같이 IGF-IR의 세포외 도메인(ECD)을 BIAcore 센서칩에 결합시켰다. 본 발명의 제1 항체를 포화 조건하에 센서칩에 결합된 IGF-IR에 결합시켰다. 그 후 다음의 본 발명의 제2의 항체가 IGF-IR에 결합하는 것에 대해 제1의 항체와 경쟁하는 능력을 측정하였다. 이 기법에 의해 본 발명의 항체에 여러가지 결합 그룹들을 할당할 수 있다.
본 발명자들은 항체 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 및 4.9.2를 사용하여 이 실험을 수행하였다. 2.13.2 및 4.9.2는 IGF-IR의 세포외 도메인 상의 동일한 부위에 대해 경쟁하는 것이 관찰되었다. 다른 항체 2.12.1 및 2.14.3은 둘이 서로 다르고, 2.13.2 및 4.9.2가 결합된 부위와도 다른 IGF-IR 상의 부위에 결합한다.
실시예 VI: 본 발명의 항체의 종간 교차활성
본 발명의 항체의 종간 교차활성을 측정하기 위해 본 발명자들은 면역침전법, IGF-I 유도 수용체 인산화의 항체 매개 차단 및 FACS 분석을 비롯하여 몇가지 실험을 수행하였다.
면역침전 실험을 수행하기 위해 본 발명자들은 T25 플라스크 중의 L-글루타민(0.29 mg/㎖), 10% 열 불활성화 FBS, 및 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 각각 500 ㎍/㎖ 보충된 DMEM 고글루코스 배지에 세포를 도말하였다. 그 후 행크 완충 염수 용액(HBSS; 깁코 BRL)에 본 발명의 항체 100 ㎕를 첨가하여 농도가 1 ㎍/㎖가 되게 하였다. 본 발명자들은 37℃의 항온처리기에서 플레이트를 30분간 항온처리한 후 100 ng/㎖의 IGF-I을 실온에서 10분간 처리하여 세포를 자극하였다. 본 발명자들은 세포를 RIPA 완충액(Harlow 및 Lane의 상기 문헌 참조) 중에서 용해시키고, 2 ㎍의 범특이적 SC-713 항-IGF-IR 항체(산타 크루즈) + 단백질 A 아가로스 비드를 사용하여 4℃에서 1 시간 동안 IGF-IR을 면역침전시켰다. 비드를 펠릿화하고, PBS/T(PBS + 0.1% Tween-20)로 3회 세척한 후 5% βME를 함유하는 40 ㎕의 Laemmli 완충액 중에서 비드를 끓였다.
그 후 전술한 바와 같이 준비한 샘플을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 4∼10% 구배의 NovexTM 겔 상의 각 레인에 각 샘플을 12 ㎕씩 로딩하고 1 x MES 완충액(NovexTM)으로 전개시켰다. 겔은 150 V에서 1 시간 또는 200 V에서 약 30분간 전개시켰다. 그 후 10% 메탄올을 함유한 NovexTM 트랜스퍼 완충액 중에서 100 mA에서 밤새도록, 또는 250 mA에서 1∼1.5 시간 동안 겔을 멤브레인으로 이전시켰다. 그 후 멤브레인을 완전히 건조시킨 다음 Superblock(피어스 케미칼 컴퍼니)을 함유하는 TBS(Tris 완충 염수, pH 8.0)로 실온에서 블로킹시켰다. IGF-IR 블로킹 항체 SC713(산타 크루즈)를 첨가하여 면역침점된 IGF-IR을 검출하였다.
이 실험은 본 발명의 항체, 구체적으로 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 및 4.9.2를 사용하여 다양한 동물로부터 유래된 세포에 대해 수행하였다. 본 발명자들은 항체 2.12.1, 2.13.2 및 4.9.2가 인간 IGF-IR에는 결합할 수 있으나, 개, 기니 피그, 토끼의 IGF-IR에는 결합할 수 없음을 발견하였다. 또한, 이들 항체는 구대륙 원숭이 에서 유래된 COS7 및 레서스 IGF-IR에는 결합할 수 있으나 신대륙 원숭이인 마모셋 유래의 IGF-IR에는 결합할 수 없었다. 이러한 실험은 상기 항체가 매우 특이적임을 암시하는 것이다.
비인간 영장류에서의 IGF-I/IGF-IR 결합의 항체 매개 차단
본 발명의 항체가 구대륙 원숭이 유래의 IGF-IR을 인식한다는 본 발명자들의 관찰에 따라 이 항체들이 상기 구대륙 원숭이 유래의 세포에서 IGF-I/IGF-IR 결합을 차단할 수 있는지를 테스트하였다. 본 발명자들은 T25 플라스크 내의 L-글루타민, 10% 열 불활성화 FBS, 및 제테티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 각각 500 ㎍/㎖ 보충된 DMEM 고글루코스 배지에 세포를 도말하였다. 그 후 본 발명의 항체, 또는 대조군으로서 항체가 없는 배지를 첨가하고, 100 ng/㎖의 IGF-I로 실온에서 10분간 세포를 자극하였다. 자극 후, 세포를 용해시키고 전술한 바와 같이 범특이적 IGF-IR 항체 SC713으로 IGF-IR을 면역침전시켰다. 그 후 HRP-PY54 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 전술한 바와 같이 활성화된 IGF-IR에서 인산화된 티로신을 검출하였다.
본 발명자들은 본 발명의 항체, 특히 2.13.2 및 4.9.2가 COS7 및 레서스 세포 모두에서 IGF-IR의 IGF-I 유도 인산화를 차단할 수 있다는 사실을 관찰하였다. 관찰된 억제에 대한 IC50은 COS7 및 레서스 IGF-IR 각각에 대해 0.02 ㎍/㎖ 및 0.005 ㎍/㎖였다.
본 발명의 항체의 종간 상호 친화력의 측정
본 발명자들은 다른 동물, 특히 전술한 바와 같은 구대륙 원숭이 유래의 IGF-IR에 대한 본 발명의 항체의 친화력을 측정하는 FACS 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 인간 및 원숭이 세포(5 x 105)의 분액과 함께, 본 발명의 비오틴화 항-IGF-IR 항체 또는 음성 대조군으로서 비오틴화 항-키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 항체(아브게닉스)를 농도를 증가시키면서 얼음 위에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 후 스트렙타비딘-접합 RPE(피코에리트린)와 함께 얼음 위에서 30분간 샘플을 항온처리하였다. 유동 세포 계측법에 의해 결합 정도를 측정하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 형광 강도(F12-H) 대 세포 수(카운트)의 히스토그램을 분석하였다. 평균 형광 강도 대 항체 농도의 그래프로부터 각 항체에 대한 결합력(Kd)을 계산하였다. 대부분의 실험에서 배양된 인간 MCF-7 세포 및 레서스 또는 사이노몰구스 조직 배양 세포에서 결합력을 측정하였다. 세포 농도 범위 전체에 대해 결합력을 측정함으로써 항체의 고갈에 대해 조절하였다.
본 발명자들은 인간, 레서스 및 사이노몰구스 세포에 결합하는 본 발명의 항체, 특히 2.13.2 및 4.9.2의 능력을 테스트하기 위해 전술한 FACS 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 테스트한 모든 세포주에 있어서 최대 결합력(Kd)의 1/2이 0.1 ㎍/㎖임을 관찰하였다.
실시예 VII: IGF-I 수용체 하향 조절
본 발명자들은 [125I]-표지된 IGF-I을 첨가한 것까지는 실시예 IV에 기술된 것과 실질적으로 동일하게 차단 실험을 수행하였다. 이 시점에서 50% 메탄올을 함유하는 Laemmli 완충액 40 ㎕ 중에 세포를 넣어 끓였다. 그 후 실시예 VI에 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 실시하고, IGF-IR의 농도를 정량하기 위해 범특이적 IGF-IR 항체 SC713을 이용하고, 활성화된 IGF-IR에서 인산화된 티로신 농도를 모니터하기 위해 HRP-PY54 항체를 이용하여 블롯을 프로빙하여 샘플을 분석하였다.
앞서 관찰한 바와 같이(실시예 III), 본 발명자들은 본 발명의 항체로 세포를 처리한 후 IGF-IR의 IGF-I 유도 인산화가 차단되었음을 관찰하였다(도 4). 또한, 이와 같이 IGF-I 유도 인산화가 차단된 후 이들 세포에서 IGF-IR이 하향조절되었음을 관찰하였다. 예로서 도 4를 참조하라. 본 발명의 항체의 존재 하에 IGF-I로 자극한지 16 시간 후 IGF-IR 농도는 최대로 감소되었다.
실시예 VIII: 생체내에서 IGF-IR에 대한 본 발명의 항체의 효과
전술한 실시예에서 기술한 바와 같은 본 발명의 항체가 IGF-IR에 미치는 효과가 생체내에서도 나타나는지를 측정하였다. 본 발명자들은 공개된 방법에 따라 무흉선 마우스에서 종양을 유발시켰다[참조: V.A. Pollack 등, "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice," J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739-748(1999)]. 요약하면, 3∼4주령의 무흉선(nu/nu) 마우스에 IGF-IR-트랜스펙션 NIH-3T3 세포(5 x 106)와 마트리겔 제제 0.2 ㎖를 함께 피하 주사하였다. 그 후 정 착된 종양(즉, 약 400 mm3)이 형성된 후 본 발명의 항체를 마우스에 복강 주사하였다.
24 시간 후, 종양을 적출하여 균질화시킨 다음 IGF-IR 농도를 측정하였다. IGF-IR 농도를 측정하기 위해 SC-713 항체를 블로킹 완충액에 희석시켜서 최종 농도가 ( ) ㎍/㎖이 되게 하고, Reacti-Bind 염소 항-토끼(GAR) 코팅 플레이트(피어스)의 각 웰에 100 ㎕를 첨가하였다. 이 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 세척 완충액으로 플레이트를 5회 세척하였다. 그 후 전술한 바와 같이 준비한 종양 샘플의 중량을 측정하고 용해 완충액(1 ㎖/100 mg)에서 이를 균질화하였다. 종양 추출물 12.5 ㎕를 용해 완충액으로 희석시켜서 최종 부피가 100 ㎕가 되게 한 다음, 이것을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 1∼2 시간 동안 진탕시키면서 플레이트를 실온에서 항온처리한 후 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 그 후 블로킹 완충액 중의 100 ㎕의 HRP-PY54 또는 비오틴화 항-IGF-IR 항체를 각 웰에 첨가하고 30분간 진탕시키면서 실온에서 항온처리하였다. 그 후 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척하고 플레이트를 발색시켰다. 웰당 TMB 마이크로웰 기질 100 ㎕를 첨가하여 HRP-PY54로 프로빙된 플레이트를 발색시키고, 0.9 M H2SO4 100 ㎕를 첨가하여 발색 반응을 중단시켰다. 그 후 10초간 진탕시키고 OD450nm를 측정하여 시그널을 정량하였다. 시그널은 총 단백질로 표준화하였다. 각 웰에 블로킹 완충액에 희석시킨 스트렙타비딘-HRP 100 ㎕를 첨가하고, 30분간 진탕시키면서 실온에서 항온처리한 후 HRP-PY54에 대해 전술한 과정을 연속 수행함으로써 항-IGF-IR 항체로 프로빙된 플레이트를 발색시켰다.
본 발명자들은 본 발명의 항체, 특히 2.13.2 및 4.9.2를 복강 주사하면 [IGF-IR 포스포티로신(인산화된 IGF-IR) 및] 총 IGF-IR 단백질의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 IGF-IR 활성이 억제된다는 사실을 관찰하였다(도 6). 또한, 본 발명자들은 IGF-IR 포스포티로신(인산화된 IGF-IR)의 감소를 관찰하였다(도 5). 어떤 이론에 의해 구속되기를 원하지는 않지만, IGF-IR 포스포티로신의 감소된 농도는 항체 처리 후의 생체내 IGF-IR 단백질의 농도 감소에 의한 것일 수 있거나, 또는 IGF-IR 단백질의 농도 감소와 리간드(예컨대, IGF-I 또는 IGF-II)에 의한 활성화 차단으로 인해 나타나는 IGF-IR 상에서의 티로신 인산화의 감소의 복합 효과에 의한 것일 수 있다. 또한, 이러한 억제는 주사된 항체의 용량에 반응적이었다(도 6). 상기 데이터는 본 발명의 항체가 시험관내에서 관찰된 것과 유사한 방식으로 생체내에서 IGF-IR을 표적화할 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 IX: 3T3/IGF-IR 세포 종양의 성장 억제(TGI)
본 발명자들은 본 발명의 항-IGF-IR 항체가 종양 성장을 억제할 수 있는지를 테스트하였다. 전술한 바와 같이 종양을 유도하고(실시예 VIII), 정착되어 뚜렷해진 종양이 형성되면(즉, 6∼9일내에 250 mm3), 단일 용량의 0.20 ㎖의 항체를 마우스에게 복강 주사하였다. 3일마다 한번씩 버니어(Vernier) 캘리퍼를 사용하여 두 직경에 걸쳐 종양 크기를 측정한 후, Geran 등의 문헌["Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems," Cancer Chemother. Rep. 3:1-104]에 기재된 방법에 따라 식 [길이 x [폭]2)/2을 이용하여 용적을 계산하였다.
본 발명의 항체를 사용하여 이 분석을 실시하면서 본 발명자들은 항체 2.13.2의 1회 단독 처리가 IGF-IR-트랜스펙션 NIH-3T3 세포 유도의 종양 성장을 억제한다는 것을 알게 되었다(도 7, 왼쪽 패널). 또한, 단일 용량의 아드리아마이신 7.5 mg/kg의 복강 주사를 병용한 실험에서는 2.13.2의 단일 용량의 투여가 종양 성장의 공지된 억제제인 아드리아마이신의 유효성을 강화시킨다는 사실을 관찰하였다. 아드리아마이신과 본 발명의 항체 2.13.2의 병용 투여는 항체 또는 아드리아마이신을 단독으로 처리한 것에 비해 종양의 성장을 7일 지연시켰음이 확인되었다(도 7, 오른쪽 패널).
실시예 X: 항체 농도와 IGF-IR 하향 조절의 관계
실시예 VIII에 기재된 대로 누드 마우스에서 종양을 유도하였다. 그 후 마우스에 2.13.2 125 ㎍을 실시예 VIII에 기재된 바와 같이 복강 주사하였다. 종양을 추출하고, 실시예 VIII에 기재된 대로 ELISA에 의해 IGF-IR 농도를 측정하였다. 도 8은 시간의 경과에 따른 혈청 2.13.2 항체 농도 및 IGF-IR 수용체 농도를 나타낸 것이다. 이 실험은 IGF-IR이 항체에 의해 하향조절되며, IGF-IR 억제 정도는 항체의 혈청 농도에 비례하는 용량임을 보여준다.
실시예 XI: 항체와 아드이라마이신의 다회 병용 투여는 3T3/IGF-IR 종양의 성장을 억제시킴
실시예 IX에 기재된 대로 누드 마우스에 종양을 유도하였다. 약 250 mm3 크기의 피하 종양이 정착된 마우스에 1일, 8일, 15일 및 22일째 다양한 양의 2.13.2 항체(i.p.) 또는 7.5 mg/kg의 아드리아마이신(i.v.)을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 대로 처리하였다. 도 9는 시간이 경과함에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 7일마다 투여한 항-IGF-IR 항체 처리가 공지된 종양 억제제인 아드리아마이신과 함께 작용하여 종양 성장을 억제하며, 종양 세포 성장의 억제를 강화시킨다는 것을 보여준다.
실시예 XII: 큰 종양의 성장 억제
실시예 IX에 기재된 대로 누드 마우스에 종양을 유도하였다. 2000 mm3보다 약간 작은 커다란 피하 종양이 정착된 마우스에 1일 및 8일째 다양한 양의 2.13.2 항체(i.p.) 또는 7.5 mg/kg의 아드리아마이신(i.v.)을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 대로 처리하였다. 도 10은 시간이 경과함에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 대조군, 항체 단독 및 아드리아마니신 단독 처리 동물군은 5일째 처리를 종료하였으며, 이때 종양의 크기는 2000 mm3를 초과하였다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체와 아드리아마이신의 다회 병용 처리가 큰 종양에 대하여 효능이 크다는 것을 보여준다.
실시예 XIII: 직장결장 세포 종양의 성장 억제
Colo 205 세포(ATCC CCL 222)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 IX에 기재된 대로 누드 마우스에서 종양을 유도하였다. Colo 205 세포는 인간 직장결장 선암 세 포이다. 약 250 mm3 크기의 피하 종양이 정착된 마우스에 다양한 양의 2.13.2 항체(i.p.) 또는 10 mg/kg의 5-플루오로데옥시유리딘(5-FU, i.v.)을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 대로 처리하였다. 도 11은 시간의 경과에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체를 1회 투여한 처리가 단일 제제로서 제공되었을 때 인간 직장결장암 세포 성장을 억제하고, 공지된 종양 억제제인 5-FU의 유효성을 강화시킨다는 것을 보여준다.
Colo 205 종양이 정착된 마우스를 1일, 8일, 15일 및 22일째 500 ㎍ 2.13.2(i.p.), 100 mg/kg 5-FU(i.v.) 또는 이의 조합물을 처리하였다. 도 12는 시간의 경과에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 7일마다 1회 투여한 항-IGF-IR 항체를 사용한 처리가 인간 직장결장암 세포 성장을 억제하고, 5-FU의 유효성을 강화시킨다는 것을 보여준다.
실시예 XIV: 유방암 세포 종양의 성장 억제
실시예 VIII에 기재된 것과 같은 누드 마우스에 생분해성 에스트로겐 펠릿(0.72 mg 17-β-에스트라디올/펠릿, 60일 방출; 이노베이티브 리서치 오브 어메리카)을 이식하였다. 48 시간 후, MCF-7 세포(ATCC HTB-22)를 사용한 것을 제외고는 실시예 IX에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 누드 마우스에서 종양을 유도하였다. 약 250 mm3 크기의 피하 종양이 정착된 마우스에 1일, 4일, 7일, 10일, 13일, 16일, 19일 및 22일째(q3dx7) 50 ㎍의 2.13.2 항체(i.p.), 또는 1일, 2일, 3 일, 4일, 5일째(q1dx5) 6.25 mg/kg의 택솔(i.p.)을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 처리하였다. 도 13은 시간의 경과에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체만을 사용하여 3일에 한번 투여하는 방식으로 처리하였을 때 이 항체가 인간 유방암 세포의 성장을 억제하고, 공지된 유방암 억제제와 병용 투여할 경우 택솔의 유효성을 강화시킨다는 것을 보여준다.
바로 위에서 설명한 것과 같은 MCF-7 세포 유래의 정착된 종양을 가진 마우스에 1일째 다양한 양의 2.13.2 항체를 단독으로(i.p.), 또는 3.75 mg/kg의 아드리아마이신(i.v.)과 함께, 실시예 IX에 기재된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 투여하였다. 도 14는 시간의 경과에 따라 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체의 단독 처리 그 자체가 인간 유방암 세포 성장을 억제하며, 공지된 종양 억제제인 아드리아마이신의 유효성을 강화시킨다는 것을 보여준다.
전술한 바와 같이 MCF-7 세포에서 유래된 정착된 종양을 가진 마우스에 1일, 8일, 15일 및 23일째 2.13.2 항체 250 ㎍(i.p.) 또는 생분해성 태목시펜 펠릿(25 mg/펠릿, 염기 없음, 60일 방출, 이노베이티브 리서치 오브 어메리카)을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 처리하였다. 태목시펜 펠릿은 종양이 정착된 지 1일 후에 이식하였다. 도 15는 시간이 경과함에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체만을 사용하여 7일에 한번 투여하는 방식으로 처리하였을 때 이 항체가 인간 유방암 세포의 성장을 억제하고, 공지된 종양 억제제인 태목시펜의 유효성을 강화시킨다는 것을 보여준다.
실시예 XVI: 피부암 세포 종양의 성장 억제
A431 세포(ATCC CRL 1555)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 IX에 기재된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 누드 마우스에서 종양을 유도하였다. A431 세포는 EGFR을 과발현하는 인간 피부암 세포이다. 약 250 mm3의 피하 종양이 정착된 마우스에 1일, 8일, 15일, 22일 및 29일째 2.13.2 항체 500 ㎍을 처리하거나(i.p.), 또는 CP-358,774 10 mg/kg을 27일간 매일 1회 경구 투여하였는데(p.o.), 이때 상기 제제들을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 것과 동일한 방식으로 처리하였다. CP-358,774는 미국 특허 제5,747,498호 및 Moyer 등의 문헌[Cancer Research 57:4838-4848(1997)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본원에서 참고로 인용한다. 도 16은 시간의 경과에 따른 다양한 처리와 관련하여 나타낸 종양 크기를 도시한 것이다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체를 사용한 처리가 인간 피부암 종양의 성장을 억제하는 공지된 EGF-R 티로신 키나제 억제제인 CP-358,774의 유효성을 강화시킨다는 것을 보여준다.
실시예 XVII: 항-IGF-IR 항체의 생체내에서의 약력학
항-IGF-IR 항체의 약력학을 평가하기 위해 사이노몰구스 원숭이에 아세테이트 완충액 중의 2.13.2 항체 3, 30 또는 100 mg/kg을 정맥 주사하였다. 다양한 시점에 원숭이로부터 혈청을 수집하여 10주가 될 때까지 원숭이의 항-IGF-IR 항체 농 도를 측정하였다. 기능성 혈청 항체 농도를 정량하기 위해, 인간 IGF-IR의 세포외 도메인(IGF-I-sR, R&D 시스템즈, 카탈로그 # 391GR)을 96웰 플레이트에 결합시켰다. 원숭이 혈청(1:100 및 1:15,000으로 희석시킴)을 분석 플레이트에 첨가하여 각 샘플이 표준 곡선의 직선 범위에 들도록 하였으며, 임의의 항-IGF-IR 항체가 IGF-I-sR에 결합하도록 하는 조건하에 항온처리하였다. 플레이트를 세척한 후 표지된 항-인간 IgG 항체를 플레이트에 첨가하여 항-인간 IgF 항체가 항-IGF-IR 항체에 결합하도록 하는 조건하에 항온처리하였다. 그 후 플레이트를 세척하고 발색시켰으며, 대조군 표준 곡선 및 직선 회귀 피트를 이용하여 항-IGF-IR 항체의 양을 정량하였다. 도 17은 시간이 경과함에 따른 혈청 중의 2.13.2의 농도를 나타낸 것이다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체의 반감기가 4.6∼7.7일이며, 용적 분포가 74∼105 ㎖/kg이라는 것을 보여준다. 또한 이 실험은 투여된 양이 원숭이에서 용량 비례적이라는 것을 입증하며, 이는 항-IGF-IR 항체가 최저 용량인 3 mg/kg에서도 체내에서 임의의 유용한 IGF-IR 결합 부위를 포화시켰음을 암시하는 것이다.
실시예 XVIII: 항-IGF-IR 항체 및 아드리아마이신의 병용 요법은 생체내에서 IGF-IR을 하향조절한다
실시예 IX에 기재된 대로 누드 마우스에서 종양을 유도하였다. 약 400 mm3의 피하 종양이 정착된 마우스에 2.13.2 항체 250 ㎍의 1회 주사(i.p.) 또는 7.5 mg/kg의 아드리아마이신(i.v.)을 단일 제제로서 또는 복합 제제로서 실시예 IX에 기재된 대로 처리하였다. 제제 투여 72 시간 후 실시예 VIII에 기재된 대로 종양을 추출하고, 동일한 양의 종양 추출물로 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)을 실시한 후 항-IGF-IR 항체 SC-713(산타 크루즈)를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 18은 대조군 동물의 종양 세포 내의 IGF-IR의 양(각 패널의 처음 3개 레인), 항체만을 처리한 동물의 종양 세포 내의 IGF-IR의 양(윗쪽 패널), 아드리아마이신만을 처리한 동물의 종양 세포 내의 IGF-IR의 양(중간 패널) 및 항체와 아드리아마이신을 둘다 처리한 동물의 종양 세포 내의 IGF-IR의 양(아랫쪽 패널)을 도시한 것이다. 각 레인은 개개의 마우스로부터 적출한 개개의 종양으로부터 얻은 동일한 양의 단백질을 나타낸다. 이 실험은 아드리아마이신만 처리한 것은 IGF-IR 농도에 거의 영향을 주지 못하며, 항체만을 처리한 것은 IGF-IR 농도를 어느 정도 감소시킨다는 것을 보여준다. 놀라운 사실은 아드리아마이신과 항체를 함께 처리하자 IGF-IR의 농도를 현저히 감소시켰다는 것이며, 이것은 아드리아마이신과 항체가 IGF-IR 농도를 크게 하향조절하였음을 입증하는 것이다.
본 명세서에서 인용한 모든 공보 및 특허 출원은 각 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고 문헌으로 포함되는 것처럼 본 명세서에 참고 문헌으로 포함한다. 전술한 발명은 명확한 이해를 위해 예시와 실시예를 통해 어느 정도 상세히 기술하였으나, 당업자라면 본 발명의 교시 내용에 비추어 첨부하는 청구범위의 발명 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면 본 발명에 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 쉽게 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ABGENIX, INC. 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Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 50 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 210 215 220 Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 51 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val Glu Ile 115 120 125 Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 52 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 53 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <220> <221> modified_base <222> (289) <223> a, c, t, g, other or unknown <400> 53 gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120 gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybsns kttyggcsrr 300 gggaccrags tggaratcaw acgaac 326 <210> 54 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <400> 54 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaarctcct gatcyatgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 55 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <220> <221> modified_base <222> (291) <223> a, c, t, g, other or unknown <400> 55 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgya gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325 <210> 56 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <400> 56 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 180 gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300 gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag 376 <210> 57 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <220> <221> modified_base <222> (337) <223> a, c, t, g, other or unknown <400> 57 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt 300 ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag 358 <210> 58 <211> 418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <400> 58 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagst attastggka gtggtggtab yacatwctac 180 gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk 300 ggctrsksyg actyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg 360 gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 418 <210> 59 <211> 364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <400> 59 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc 300 agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gly-Ser Linker <400> 60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (40)

  1. 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서,
    상기 항체 또는 항원 결합부는 IGF-IR 유도 티로신 인산화를 억제하고; 상기 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 여기서, 상기 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열과, 상기 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부:
    a) 각각, 2.12.1 (ATCC 기탁 번호: PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호: PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호: PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호: PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호: PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호: PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의, 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    b) 각각, 서열 번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    c) 각각, 서열 번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    d) 각각, 서열 번호 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    e) 각각, 서열 번호 14의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 16의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    f) 각각, 서열 번호 18의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 20의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
    g) 각각, 서열 번호 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 경쇄의 가변 영역은 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 18 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    b) 중쇄의 가변 영역은 서열 번호 4, 서열 번호 8, 서열 번호 12, 서열 번호 16, 서열 번호 20 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  3. 제2항에 있어서, 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 여기서, 상기 경쇄의 가변 영역과 상기 중쇄의 가변 영역은 각각, 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의, 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합부는
    (a) 마우스, 래트, 개 또는 토끼 IGF-IR에 결합하지 않는 특성;
    (b) 사이노몰구스(cynomologous) 또는 레서스(rhesus) IGF-IR에는 결합하지만 마모셋(marmoset) IGF-IR에는 결합하지 않는 특성;
    (c) IGF-IR에 대한 IGF-I 또는 IGF-II의 결합을 억제하는 특성;
    (d) IGF-IR에 대한 선택성이 인슐린 수용체에 대한 선택성보다 50배 이상 큰 특성;
    (e) 생체내 종양 성장을 억제하는 특성;
    (f) IGF-IR을 발현하는 세포와 함께 항온처리할 때 세포 표면으로부터 IGF-IR이 사라지도록 하는 특성;
    (g) 8 x 10-9 M 이하의 Kd로 IGF-IR에 결합하는 특성; 및
    (h) IGF-IR에 대한 오프 속도(off rate), 즉 Koff가 10-4 이하인 특성
    으로 이루어진 군에서 선택된 1 가지 이상의 특성을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  5. 제4항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합부가 IGF-IR에 대한 IGF-I 또는 IGF-II의 결합을 억제하고, 8 x 10-9 M 이하의 Kd로 IGF-IR에 결합하고, IGF-IR에 대한 선택성이 인슐린 수용체에 대한 선택성보다 50배 이상 큰 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  6. 제4항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합부가 상기 특성들을 모두 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 IGF-IR과 IGF-I 또는 IGF-II간의 결합을 100 nM 미만의 IC50으로 억제하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    (a) 면역글로불린 G(IgG), IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자이거나, 또는 이로부터 유래된 것; 또는
    (b) Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 이중 특이적 항체
    인 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체는 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은
    (a) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792)의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    (b) 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788)의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    (c) 시그널 서열을 갖지 않는 서열 번호 45의 아미노산 서열 및 시그널 서열을 갖지 않는 서열 번호 47의 아미노산 서열; 및
    (d) 시그널 서열을 갖지 않는 서열 번호 49의 아미노산 서열 및 시그널 서열을 갖지 않는 서열 번호 51의 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체는 항체 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792) 또는 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788)의 CDR의 아미노산 서열, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 변화를 갖는 상기 항체의 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  12. 제1항, 제2항, 제3항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부와 약학적 허용 담체를 함유하는, 암의 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 항신생물제, 화학요법제 또는 항종양제를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
  14. 제1항에 따른 항체의 제조 방법으로서,
    (a) IGF-IR을 포함하는 면역원으로 비인간 포유동물을 면역화시키는 단계로서, 상기 포유동물은 자신의 B 세포 중에 인간 항체를 발현할 수 있는 것인 단계;
    (b) 상기 포유동물로부터 B 세포를 분리하는 단계;
    (c) IGF-IR에 결합하는 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해 상기 B 세포, 또는 이로부터 유래된 세포주를 스크리닝하는 단계;
    (d) IGF-IR에 결합하는 항체를 발현하는 세포주를 배양하는 단계; 및
    (e) 상기 세포주로부터 IGF-IR에 결합하는 항체를 분리하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항, 제2항, 제3항, 제9항, 제10항, 및 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체를 생산하는 분리된 세포주.
  16. 제15항에 있어서, 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체, 또는 상기 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산하는 세포주.
  17. 비(非)인간 피험체를 대상으로 IGF-IR 발현 종양의 존재 또는 위치를 진단하는 방법으로서,
    (a) 제1항, 제2항, 제3항, 제9항, 제10항, 및 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합부를 피험체에 주입하는 단계;
    (b) 항체가 결합된 위치를 파악하여 피험체에서의 IGF-IR의 발현 정도를 측정하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서의 발현 정도와 정상의 기준 피험체의 발현 정도 또는 표준 발현 정도를 비교하는 단계; 및
    (d) 종양의 존재 또는 위치를 진단하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항, 제2항, 제3항, 제9항, 제10항, 및 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부 또는 경쇄 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  19. 제18항에 있어서, 핵산 분자는
    (a) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의 중쇄로부터의 하나 이상의 CDR 영역을 암호화하는 핵산 서열;
    (b) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의 중쇄로부터의 3개의 CDR 영역을 암호화하는 핵산 서열;
    (c) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열;
    (d) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의 경쇄로부터의 하나 이상의 CDR 서열을 암호화하는 핵산 서열;
    (e) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 서열을 암호화하는 핵산 서열;
    (f) 2.12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2792), 2.13.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2788), 2.14.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2790), 3.1.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-2791), 4.9.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-2789) 및 4.17.3 (ATCC 기탁 번호 PTA-2793)으로 이루어진 군에서 선택된 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합부의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열;
    (g) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열; 및
    (h) 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23으로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열
    로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하고,
    상기 핵산 분자는 선택적으로 서열 번호 28 또는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
  20. 제18항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 이 벡터는 핵산 분자에 작동적으로(operably) 연결된 발현 조절 서열을 선택적으로 포함하는 것인 벡터.
  21. 제19항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 이 벡터는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 선택적으로 포함하는 것인 벡터.
  22. 제20항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제21항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제18항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제19항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제24항에 기재된 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양한 후 항-IGF-IR 항체 또는 이의 항원 결합부를 회수하는 단계를 포함하는, 항-IGF-IR 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 방법.
  27. 제18항에 따른 핵산을 포함하는 비인간 형질전환 동물로서, 상기 핵산을 발현하는 것인 동물.
  28. 제19항에 따른 핵산을 포함하는 비인간 형질전환 동물로서, 상기 핵산을 발현하는 것인 동물.
  29. 하기를 암호화하는 유효량의 분리된 핵산 분자, 및 약학적 허용 담체를 함유하는 암의 치료용 약학 조성물:
    제1항, 제2항, 제3항, 제9항, 제10항, 및 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부; 경쇄 또는 이의 항원 결합부; 또는 중쇄 및 경쇄 또는 이의 항원 결합부.
  30. IGF-IR에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로서, 서열 번호 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  31. 제30항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 4의 가변 영역 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 2의 가변 영역 아미노산 서열 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  32. 제31항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 4의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 2의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하고 시그널 서열을 갖지 않으며, 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하고 시그널 서열을 갖지 않는 것인 모노클로날 항체.
  34. IGF-IR에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로서, 서열 번호 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  35. 제34항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 8의 가변 영역 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 6의 가변 영역 아미노산 서열 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  36. 제35항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 8의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 6의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하고 시그널 서열을 갖지 않으며, 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하고 시그널 서열을 갖지 않는 것인 모노클로날 항체.
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