KR101470700B1 - 표적 항암제의 내성 극복 방법 - Google Patents

표적 항암제의 내성 극복 방법 Download PDF

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Abstract

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 표적 항암제 내성 억제용 약학적 조성물, 항암 보조제 등을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물을 종래 표적 항암제로 병용 투여할 경우, 항암치료효과를 증가시킬 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 인테그린 β3에 대한 표적 항암제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

표적 항암제의 내성 극복 방법{Method for overcoming resistance to anti-cancer agents}
본 발명은 표적 항암제의 내성 극복 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인슐린유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R) 표적 항암제 등의 내성 극복 방법에 관한 것이다.
인슐린유사 성장인자-1 수용체(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF-1R)는 악성종양으로의 전환, 혈관신생, 암 세포 증식, 생존, 침윤 등 종양 형성에 중요한 역할을 수행하는 신호전달 체계로 보고되어 왔다 (Basega, 1999; Pollak et al., 2004). IGF 매개 신호전달은 두 개의 수용체 (IGF-1R, IGF-2R)와 리간드(IGF-1, IGF-2, 인슐린), 및 IGF의 생물학적 이용 가능성을 조절하는 6개 이상의 IGF-결합 단백질(IGFBPs)에 의해 이루어지며, 높은 수준의 IGF 생성, IGF-1R의 과발현 및/또는 IGFBP의 발현, IGF-2R 이형접합성(heterozygosity)의 감소 및 IGF-2 쌍대립인자의 발현(biallelic expression)은 여러 종류의 암의 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다 (Chang et al., 2002a; Chang et al., 2002b; Jamieson et al., 2003; Kim et al., 2009; Larsson et al., 2005; Moorehead et al., 2003; Papadimitrakopoulou et al., 2006; Wu et al., 2004; Zhan et al., 1995). 이러한 점에 따라 IGF 수용체 매개 신호전달 체계는 항암제 개발을 위한 주요한 표적으로 여겨지고 있다.
IGF 수용체에 대한 표적 항암제의 암 환자에서의 효력을 확인하는 많은 임상 시험이 진행 중인데, 이를 위한 방법은 크게 IGF-1R에 대한 단일클론항체 (mAbs) 또는 IGF-1R에 대한 저분자 티로신 키나아제 저해제 (TKIs)를 활용하는 것이다 (Bahr and Groner, 2004; Garcia-Echeverria, 2006).
항-IGF-1R mAbs는 단일 제제(agent)로서 임상 1상 시험에서 약한 부작용이 보고되었다(Olmos et al., 2009; Tolcher et al., 2009). 항-IGF-1R mAb ANG-479, R1507, 또는 피지투무맙(figitumumab)으로 처리한 유잉육종(Ewing's sarcoma) 환자는 산발적 항종양 반응을 보였다 (Kurzrock et al., 2010; Olmos et al., 2010; Pappo et al., 2010; Quek et al., 2010; Tap et al., 2010). 그러나, 최근 재발성 또는 전이성 두경부암 (두경부 편평상피세포암, HNSCC), 비소세포폐암 (NSCLC), 및 직장암 환자에 대한 임상 2상 및 3상 연구에서 항-IGF-1R mAb는 항암 효능을 나타내지 못하였는데 (Businesswire., 2009; Patel S, 2009; Reidy et al, 2010; Schmitz, 2010), 이러한 점을 설명할 수 있는 이들 단일클론항체에 대한 선천적 및/또는 후천적 내성을 설명하는 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다.
인테그린은 부착 수용체(adhesive receptors) 군에 속하는 것으로서, 8종의 β(β)와 18종의 알파(α) 서브유닛으로 이루어져 있다 (Bikle, 2008; Hynes, 2002). 인테그린이 리간드에 결합하여 활성화되면, FAK(focal adhesion kinase)의 397번째 티로신잔기 (Y397)에서 자가인산화를 유도한다. 이 자가인산화는 p85 결합 PI3K 활성화 (Chen et al., 1996), Src의 보충 및 FAK의 Try861과 Tyr925에서 Src-의존적 인산화와 Tyr845에서 상피성장인자 수용체 (EGFR)의 인산화를 매개한다 (Alghisi and Ruegg, 2006; Desgrosellier and Cheresh, 2009; Horne et al., 2005; Hynes, 2002). FAK의 N-말단 도메인은 β1 및 β3 인테그린과 상호작용 (Schaller et al., 1992; Schaller et al., 1995)하는 반면, FAK의 C-말단 도메인은 몇몇 단백질의 Src 호몰로지2, Src 호몰로지3 (SH2, SH3) 도메인과 결합한다 (Malik and Parsons, 1996). 인테그린 αvβ3에 대한 단일클론항체(mAbs)와 저분자 길항제(antagonist)는 몇몇 동물 모델에서 종양 성장 및 혈관신생을 저해하는 것으로 밝혀졌다 (Dayam et al., 2006; Kumar et al., 2001; Trikha et al., 2002). 인테그린 αvβ3이 세포 증식, 전이, 항생제 내성에 관여하고, 몇몇 종양의 성장 및 진행을 자극한다는 기존 연구 성과가 보고되었다 (Brozovic et al., 2008; Hood and Cheresh, 2002; Stefanidakis and Koivunen, 2006). 그 중에서도 특히 최근의 연구결과는 IGF-1과 인테그린 αvβ3가 직접적으로 결합한다는 것을 보여 주었으며 (Saegusa et al., 2009), IGF 시스템과 특정 인테그린 신호 사이의 직접적인 조절 기작을 제안하고 있다.
현재 암 세포에 대한 선택성을 개선한 표적 항암제가 개발되어 임상에서 활발히 이용되고 있으나, 표적 항암제에 대한 1차 및 획득 내성이 보고되고 있으며, 특히 인슐린유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R) 표적 항체에 대한 임상 시험이 진행 중이나 항암제 내성 및 재발로 인한 치료 효과 저하가 보고되었다.
이에 본 발명자들은, 항-IGF-1R 단일클론항체 기반 치료에 대한 적당한 responder를 선별하기 위한 예측 바이오마커를 동정하고, IGF-1R 단일클론항체에 대한 내성을 조절하는 메카니즘을 확인하였으며, 이에 더하여 IGF-1R 단일클론항체에 대한 내성을 차단하기 위한 2차 제제(second agent)를 발견함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 표적 항암제 내성 극복을 위한 약학적 조성물, 표적 항암제 내성을 극복하는 방법 등을 제공하고자 하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 표적 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하고, 항암제의 항증식성 효과를 증가시키는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 표적 항암제와 병용 투여하는 단계를 포함하는 항암 효과 증진 방법을 제공한다.
본 발명에서, 바람직하게 상기 항암제는 인슐린유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R, insulin-like growth factor-1 receptor) 표적 항암제이며, 보다 바람직하게는 항-인슐린유사 성장인자-1 수용체(anti-IGF-1R) 단일클론항체인 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 또는 Src siRNA는 항-인슐린유사 성장인자-1 수용체(anti-IGF-1R) 단일클론항체의 인슐린유사 성장인자 의존 효과를 억제하거나, Src, EGFR, Akt, FAK 또는 mTOR의 인산화를 억제하거나, p-Src, p-EGFR, p-Akt, p-FAK 또는 p-TOR의 탈인산화를 유도하는 메커니즘을 통하여 표적 항암제 내성을 억제하는 작용을 한다.
특히, 본 발명에서 상기 Src의 인산화는 티로신 416 (tyrosine 416, Y416) 위치에서 일어날 수 있으며, 상기 EGFR의 인산화는 티로신 1068 (tyrosine 1068, Y1068) 및 티로신 845 (tyrosine 845, Y845) 위치에서 일어날 수 있고, 상기 FAK의 인산화는 티로신 861 (tyrosine 861, Y861) 위치에서 일어날 수 있다.
본 발명은, 인슐린유사 성장인자 표적 단일클론항체 및 이와 유사한 항암제의 내성과 관련된 신호전달체계를 차단함으로서 인슐린 유사 성장인자 표적 항암제를 포함한 표적 항암제에 대한 내성을 극복할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물을 종래 표적 항암제로 병용 투여할 경우, 항암치료효과를 증가시킬 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 인테그린 β3에 대한 표적 항암제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 IGF-1이 유도하는 IGF-1R의 인산화에 대한 β식스투무맙의 농도 의존적인 억제 작용을 나타낸 것이다.
도 2는 여러 사람 두경부암 및 폐암세포에 대하여 통상적인 이차원 배양 시스템 (2D culture system)을 적용하였을 때 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 사람 두경부암 세포인 LN686 및 UMSCC38과 사람 폐암세포인 A549m에서 1% FBS가 함유된 배양액에 포함된 식스투무맙 (25 μg/ml) 처리에 의한 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 soft agar를 활용한 삼차원 세포 배양 시스템에서 OSC19와 A549 세포의 콜로니 생성에 대한 식스투무맙의 농도 의존적인 억제 효능을 나타낸 것이다.
도 5는 polyHEMA-coated plate (PCP)를 활용한 삼차원 유사 세포 배양 시스템에서 LN686, FADU, OSC19 세포의 식스투무맙에 대한 반응성을 나타낸 것이다.
도 6은 polyHEMA-coated plate (PCP) 및 ultra-low attached plate (UAP)를 활용한 삼차원 유사 세포 배양 시스템에서 대조군 및 식스투무맙을 1, 3, 5, 7일 동안 처리한 실험군에서의 세포 수의 변화를 측정한 것이다.
도 7은 polyHEMA-coated plate (PCP) 및 ultra-low attached plate (UAP)를 활용한 삼차원 유사 세포 배양 시스템에서 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과를 13종의 사람 두경부암 세포와 6종의 사람 폐암 세포에서 평가하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 soft agar를 이용한 삼차원 세포 배양 시스템에서 10종의 사람 두경부암 세포와 6종의 사람 폐암 세포에서의 식스투무맙의 암세포 성장 저해 효과를 평가하고 그 결과를 도식화한 것이다.
도 9는 사람 두경부암 세포인 LN686, UMSCC38과 사람 폐암 세포인 H226B, A549m을 누드 마우스에 이식한 xenograft model에서 식스투무맙의 항암 효과를 평가한 것이다.
도 10은 식스투무맙에 저항성이 있는 LN686세포와 감수성이 있는 OSC19 세포에서 IGF-1이 매개하는 신호전달에 대한 식스투무맙의 조절 작용을 나타낸 것이다.
도 11은 식스투무맙에 저항성이 있는 세포군과 감수성이 있는 세포군에서 식스투무맙에 의한 IGF-1R 매개 신호전달의 발현 및 활성화의 차이를 나타낸 것이다.
도 12는 식스투무맙에 저항성이 있는 세포군에서 식스투무맙에 의한 epidermal growth factor receptor (EGFR)의 인산화 증가, Src 인산화 증가 및 Src에 의해서만 인산화되는 것으로 알려져 있는 EGFR의 티로신 잔기 (Y845)의 인산화 증가를 확인하고 이를 식스투무맙에 감수성이 있는 세포군과 비교한 것이다.
도 13은 도 12의 결과를 정량화하여 수치로 나타낸 것이다.
도 14는 LN686세포에 식스투무맙을 0.5, 1, 3, 6, 72시간 동안 처리하였을 때 10% FBS에 의한 IGF-1R 인산화 억제 활성 및 처리 시간 의존적인 EGFR과 그 하위 신호전달의 활성화 촉진 작용을 나타낸 것이다.
도 15는 식스투무맙 처리 시간이 증가함에 따라 인테그린 β3과 Src 및 FAK의 복합체 형성이 증가됨을 나타낸 것이다.
도 16은 IGF-1 또는 식스투무맙의 처리 시간을 증가시켰을 때 IGF-1R 및 EGFR 매개 신호전달의 변화를 나타내며, 식스투무맙에 의하여 Src, FAK, Akt 및 mTOR의 인산화가 증가됨을 제시한 것이다.
도 17은 IGF-1의 처리 농도가 증가함에 따라 인테그린 β3과 Src 및 FAK의 복합체 형성이 증가됨을 나타낸 것이다.
도 18은 LN686세포에 식스투무맙만 처리하였을 때에는 Src, Akt 및 EGFR의 티로신 잔기 (Y845)의 인산화 증가 효과를 나타내지 않음을 제시한 것이다.
도 19는 IGF-1의 자극 하에 식스투무맙에 의하여 인테그린 β1과의 복합체 형성은 증가되지 않음을 나타낸 것이다.
도 20은 10% FBS 존재 하에서 식스투무맙의 처리 시간을 증가시켰을 때 인테그린 β3과 Src 및 FAK의 복합체 형성이 증가됨을 나타낸 것이다.
도 21은 IGF-1의 처리 농도가 증가함에 따라 인테그린 β3과 Src 및 FAK의 복합체 형성이 증가되는 반면 인테그린 β1과의 복합체 형성은 증가되지 않음을 나타낸 것이다.
도 22는 IGF-1 또는 식스투무맙의 처리 시간을 증가시켰을 때 IGF-1R 및 EGFR 매개 신호전달의 변화를 나타내며, 식스투무맙에 의하여 Src, FAK, Akt 및 mTOR의 인산화가 증가됨을 제시한 것이다.
도 23은 IGF-1를 처리하였을 때 인테그린 β3과 Src 및 FAK의 복합체 형성이 증가됨을 나타낸 것이다.
도 24는 IGF-1에 의한 세포 부착 (adhesion) 증가 작용이 IGF-1R 및 인테그린 β3에 대한 siRNA로 그 유전자 발현을 억제하였을 때 유의적으로 감소됨을 나타낸 것이다.
도 25는 식스투무맙에 의하여 IGF-1과 인테그린 β3과의 결합이 증가함을 나타낸 것이다.
도 26 중 a는 일반적인 2차원 배양 조건과 polyHEMA-coated plate를 이용한 삼차원 유사 배양 조건에서 인테그린 β1 및 β3의 발현을 비교하였을 때 β1의 발현은 삼차원 유사 배양 조건에서 감소하는 반면 β3의 발현은 차이가 없음을 나타낸 것이다. b는 인테그린 β3의 발현 정도와 식스투무맙에 대한 감수성이 상관 관계를 지님을 나타낸 것이다.
도 27은 LN686, FADU, OSC19 세포에서 인테그린 β3 중화 항체 (neutralizing antibody)에 의한 Src, EGFR, Akt 인산화 억제 작용을 나타낸 것이다.
도 28은 LN686, FADU, OSC19 세포에서 Src-family kinase (SFK) 억제제인 PP2에 의한 Src, EGFR, Akt 인산화 억제 작용을 나타낸 것이다.
도 29는 LN686 및 FADU 세포에서 인테그린 β3 중화 항체 (neutralizing antibody) 및 PP2의 병용 투여에 의한 식스투무맙이 유도하는 Src, FAK, EGFR, Akt, mTOR 인산화에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 30은 LN686 및 FADU 세포에서 인테그린 β1 중화 항체 (neutralizing antibody)의 병용 투여로는 식스투무맙이 유도하는 Src, FAK, EGFR, Akt, mTOR 인산화에 대한 억제 효과가 없음을 나타낸 것이다.
도 31은 인테그린 β3 중화 항체 (neutralizing antibody) 및 PP2의 병용 투여에 의한 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과 상승 작용을 나타낸 것이다.
도 32는 LN686 및 FADU 세포에서 Src siRNA의 transfection으로 Src 발현을 저해하였을 때 식스투무맙이 유도하는 Src, FAK, EGFR, Akt, mTOR 인산화에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 33은 LN686 및 FADU 세포에서 Src siRNA의 transfection으로 Src 발현을 저해하였을 때 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과 상승 작용을 나타낸 것이다.
도 34는 LN686세포를 이용한 tumor xenograft model에서 C-terminal Src kinase (CSK) 발현 유도 adenovirus infection으로 Src를 불활성화 시켰을 때 식스투무맙의 항암 효과를 증강시키는 효과를 종양 부피의 변화를 통하여 나타낸 것이다.
도 35는 LN686세포를 이용한 tumor xenograft model에서 C-terminal Src kinase (CSK) 발현 유도 adenovirus infection으로 Src를 불활성화 시켰을 때 식스투무맙의 항암 효과 증강 작용을 종말점에서의 종양 무게의 변화를 통하여 나타낸 것이다.
도 36은 도 33은 인테그린 β3 siRNA의 transfection으로 Src 발현을 저해하거나 PP2 또는 인테그린 β3 중화 항체 (neutralizing antibody)를 병용 투여하였을 때 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과 상승 작용을 나타낸 것이다.
도 37은 PP2 또는 인테그린 β3 중화 항체 (neutralizing antibody)를 식스투무맙과 병용 투여하였을 때 caspase-3/CPP32 활성 상승 및 caspase-3의 cleavage가 증가함을 나타낸 것이다.
도 38은 LN686세포를 이용한 tumor xenograft model에서 인테그린 β3 siRNA로 인테그린 β3 발현을 저해하였을 때 식스투무맙의 항암 효과 증강 작용을 종양 부피의 변화를 통하여 나타낸 것이다.
도 39는 LN686세포를 이용한 tumor xenograft model에서 인테그린 β3 siRNA를 단독 또는 식스투무맙과 병용 투여하였을 때 Src 인산화, 인테그린 β3의 발현 및 apoptosis 증가 촉진 작용을 나타낸 것이다.
도 40은 LN686세포를 이용한 tumor xenograft model에서 SFK 억제제인 다사티닙 (Dasatinib) 병용에 의하여 식스투무맙의 항암 효과가 증강됨을 종양 부피의 변화를 통하여 나타낸 것이다.
도 41은 LN686세포를 이용한 tumor xenograft model에서 SFK 억제제인 다사티닙을 단독 또는 식스투무맙과 병용 투여하였을 때 Src 인산화, 인테그린 β3의 발현 및 apoptosis 증가 촉진 작용을 나타낸 것이다.
도 42는 본 연구의 연구 결과를 모식도로 나타낸 것으로, 식스투무맙으로 IGFR을 억제하였을 때 IGF-1이 인테그린 β3에 결합하여 인테그린이 매개하는 FAK, Src, Akt, mTOR의 활성화를 유도함으로서 내성을 나타내고, 인테그린 β3 및 Src 억제제를 병용함으로서 이러한 내성을 극복할 수 있음을 제시한 것이다.
도 43은 IGF-1의 존재 하에 식스투무맙에 의하여 Src 및 FAK의 인산화가 증가하고 이러한 작용이 IGF-1 및 인테그린 β3 중화항체에 의하여 억제됨을 나타낸 것이다.
도 44는 인테그린 β3 중의 IGF-1의 결합에 필수적인 아미노산 서열 (CYDMKTTC, residues 177-184)을 해당 위치의 인테그린 β1 중의 아미노산 서열 (CTSEQNC, residues 187-193)로 치환한 변이된 인테그린 β3 발현 벡터를 transfection 시킨 세포에서 IGF-1 존재 하에 식스투무맙에 의한 Src 및 FAK 인산화가 나타나지 않음을 제시한 것이다.
도 45는 IGF-1 존재 하에 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)에 부착시킨 세포에서 식스투무맙 처리에 의하여 Src의 인산화가 증가하고 이러한 작용이 IGF-1 및 인테그린 β3 중화항체에 의하여 억제됨을 나타낸 것이다.
도 46은 IGF-1 존재 하에 세포외기질에 부착시킨 세포에서 식스투무맙 처리에 의하여 FAK의 인산화가 증가하고 이러한 작용이 IGF-1 및 인테그린 β3 중화항체에 의하여 억제됨을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 선행 연구결과에 기초하여, IGF-1이 인테그린 β3와 직접적으로 결합하고, 환자들이 IGF-1R과 인테그린 β3이 공동 발현하는 종양을 갖고 있다면, IGF-1R에 결합하지 못한 IGF-1은 인테그린 β3을 통하여 신호를 전달할 것이고, 이는 항-IGF-1R mAbs에 대한 내성을 나타낼 것이라는 가설을 세웠으며, 이를 바탕으로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 실시예에 사용된 세포는 10% FBS를 보충한 RPMI 1640 (Life Technologies, Gaitheburg, MD)에서 유지되었다. 초기 사람 두경부 편평세포암 (head and neck squamous cancer cells; HNSCC) 조직 표본은 MD 앤더슨 암센터 (MD Anderson Cancer Center)에서 절제 수술을 한 환자로부터 얻었다.
인간 HNSCC 세포주 (UMSCC1, UMSCC2, UMSCC4, UMSCC6, UMSCC11A, UMSCC14A, and UMSCC38)는 Dr. T. Carey (University of Michigan, Ann Arbor, MI)에게서 얻었으며, LN686, FADU, TR146, HN30 and OSC19 세포는 Dr. Jeffrey Myers (MD Anderson Cancer Center)에게 얻었다. SqCC/Y1 세포는 Dr. M. Reiss (Yale University, New Haven, CT)가 제공하였다. H226B and H226Br NSCLC 세포주는 Dr. Jack Roth (MD Anderson Cancer Center)에게서 얻었다. 사람 NSCLC (H596, H460, H1299, A549, H358) 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. 흉선을 제거한 누드 마우스(Athymic nude mice)는 Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN)에서 구입하였다. 인간 재조합 IGF-I, IGF-II, and EGF and IGF-1 Ab는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였다. Humanized anti-IGF-1R mAb인 식스투무맙(cixutumumab) 및 humanized anti-EGFR mAb인 cetuximab (Erbitux)은 ImClone Systems (New York, New York)에서 제공받았으며, 다사티닙(dasatinib)은 MD Anderson 구내 약국에서 구입하였다. Src 저해제(inhibitor)인 PP2와 IGF-IR TKI AG1024는 Calbiochem-Novabiochem (Alexandria, New South Wales, Australia)에서 구입하였다. 재조합 인간 IGF-1R(Glu31-Asp741), IGF-1, 및 EGF 단백질은 R&D system에서 구입하였다. 재조합 인테그린 β3 단백질은 Dr. Yoko K. Takada (University of California Davis School of Medicine)가 제공하였다. 인테그린 β1 (AIIB2) 및 인테그린 β3 (B3A)에 대한 중성화 항체는 Millipore (Temecula, CA)에서 구입하였다. 기타 실험재료(material)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 또한 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 본 발명의 일 구현예로, 상기 약학적 조성물은 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
세포 증식
세포를 96 well polyHEMA-coated plates (PCPs) 또는 ultra-low attached plates (UAPs)에서 평판배양하고, IgG1 (25 μg/mL), 식스투무맙 (25 μg/mL), PP2 (10 μM), 인테그린 β3 중성화 항체 B3A (10 μg/mL)를 단독 또는 병용으로 10% FBS가 함유된 배양액에 처리하였다. 암세포 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 또는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay를 실시하였고, anchorage가 없는 상태에서의 콜로니 생성 여부를 평가하기 위하여 기존의 방법 (Morgillo et al., 2006)대로 soft agar colony formation assay를 실시하였다.
Poly-(HEMA [poly-2-hydroxyethyl methacrylate])-coated plates (PCPs)는 종래 알려진 방법(Fukazawa et al., 1995)으로 제조하였다. 간단히, 조직 배양 플레이트를 에탄올을 증발시키는 동안 37℃에서 poly-(HEMA) (10 mg/mL in 95% ethanol)로 2번 코팅하고, phosphate-buffered saline (PBS)로 수차례 세척하였다.
바이러스로 실험하기 위하여, serum-free 배지에서 2시간 동안 Ad-CSK 또는 Ad EV를 세포 1개당 10 particle forming units (pfu)으로 감염시켰다. 배양 7일 후, 세포 증식성을 MTT assay 및 MTS assay로 측정하였다.
6개의 복제 웰(well)을 각각의 분석에 사용하였으며, 적어도 3개의 독립적인 실험을 수행하였다. anchorage가 없는 상태에서의 콜로니 생성 여부를 평가하기 위하여, 세포는 well 당 2 X 103 농도로 0.8% 아가로 사전 코팅된 12-well 플레이트에 0.4% 아가 배지에 섞어 고정한 다음 식스투무맙 (25 μg/mL)가 포함된 성장 배지에서 4~6주 동안 배양하였다. 그 다음으로 세포를 PBS에서 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하고, 지름이 0.2 mm 이상인 콜로니의 수를 세었다. 독립적인 실험을 3번씩 반복 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석 및 면역침전법
본 발명자들은 기존의 방법(Morgillo et al., 2006)에 따라 전체 단백질 분리, 웨스턴 분석, 면역침강법 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, 전체 세포 용해물을 인테그린 β3, 인테그린 β1 및 IgG에 대한 항체로 면역침강시켰다. 단백질 A 아가로스의 침강물(precipitate)은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동 하였고, polyvinylidene difluoride (PVDF) 재질로 된 멤브레인 (membrane)으로 이동시켰다. 멤브레인은 하기 항원에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였고, 항원-항체 복합체를 enhanced chemiluminescence plus kits (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 이용하여 확인하였다.
(항원 : phospho-Akt (S473), Akt, phospho-IGF-1R (Y1131), phospho-mTOR (S2248), mTOR, phospho-p70S6K (T389), p70S6K, phospho-S6K (S235/236), S6K, phospho-4EBP1 (T37/46), 4EBP1, phospho-EGFR (Y845), phospho-EGFR (Y1068), EGFR (Cell Signaling Technology); IGF-1Rb (C20), phospho-ERK (T202/204), ERK, phospho-Src (Y416), Src, PI3-kinase p85α, Csk (C-20), His (H-15) (Santa Cruz Biotechnology); phospho-FAK (Y861), FAK (BD Biosciences); and integrin β3 (B3A) and integrin β1 (AIIB2) (Millipore))
동물 실험
모든 동물 실험과정은 Institutional Animal Care 및 MD Anderson Cancer Center의 Use Committee에서 허가된 프로토콜에 따라 진행되었다.
누드 마우스 등의 옆부분 (dorsal flank site) (1 X 106 cells/mouse in 100 mL of PBS)에 LN686, UMNSCC38, H226B 또는 A549m 세포를 피하 주사하여 이종이식 종양을 발생시켰다. HNSCC 이종이식 종양에 관하여, 구강 편평세포암(squamous carcinoma)의 폐엽절제술(lobectomy)을 받은 아무런 처리하지 않은 환자로부터 1차 인간 종양 시료를 모았다. 종양은 2-㎣ 조각으로 잘게 썰었고, 누드 마우스 피부 아래에 심었다 (마우스 1마리 당 1조각). 종양이 80~100 ㎣에 이르렀을 때를 0일로 정하고, 마우스를 식스투무맙 (10 mg/kg, i.p., 1주일에 1~2번), Ad-EV (3 X 1011 pfu, 종양 내 주사, 1주일에 1번), Ad-CSK (3 X 1011 pfu, 종양 내 주사, 1주일에 1번), siCon, si인테그린 β3 (5 mg/mouse, i.p., 1주일에 1번), dasatinib (20 mg/kg, 위관영양법(oral gavage)으로 매일), 식스투무맙과 Ad-CSK, 또는 식스투무맙과 다사티닙(dasatinib)으로 처리하였다.
리포좀 제조 ( Liposomal preperation )
사용된 지질(lipid)은 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine/1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (sodiumsalt) 또는 a pegylated version of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine/cholesterol/1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy-(polyethylene glycol)-2000] 이다. 이 지질은 tert-butanol에 용해되었고 멸균을 위해 0.22-mm짜리 필터로 여과하였다. 지질 용액이 담긴 유리병을 드라이아이스-아세톤 수조에서 냉동시키고, tert-butanol을 제거하기 위하여 동결건조 시켰다. 유리병은 -20℃에서 보관하였고, 사용하기 전에 실온에서 녹였다.
효소-연결 면역흡착 분석
IGF-1 (1 또는 2 ㎍)을 96-well 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)의 well에 코팅한 후, 1 mM MnCl2가 첨가된 HEPES-Tyrode 버퍼에서 실온에서 2시간 동안 식스투무맙 (10 ㎍/㎖)의 존재 또는 부존재 하에서, 재조합 인테그린 β3 (0.5 ㎍/㎖) 및/또는 IGF-1R (0.1 또는 0.5 ㎍/㎖) 단백질과 함께 배양하였다. 결합한 β3와 IGF-1R 단백질의 level은 항-His 또는 항-IGF-1R mAbs와 아비딘 표지된(avidin-labeled) 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 항-마우스 또는 항-래빗 IgG를 사용하여 확인하였다.
통계 분석
MTT 및 MTS assay로부터 얻은 데이터는 스튜던트 t 테스트(Student t test)를 이용하여 분석하였다. 8개 샘플의 모든 평균 및 95% 신뢰구간(CI)은 Microsoft Excel software(version 5.0; Microsoft Corporation, Seattle, WA)를 이용하여 계산하였다. 그룹 간의 세포 생존 비교 및 조합 처리 그룹과 단일 시약 처리 그룹에서 종양 성장의 차이점은 2 X 2 팩토리얼 디자인의 편차 분석(analysis of variance in a 2 X 2 factorial design)에 의하여 분석하였다. 모든 통계 분석에서, two-sided P value가 0.05 미만인 경우를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실시예 1. 항- IGF -1R 단일클론항체에 대한 내성을 가진 암세포 동정
항-IGF-1R 단일클론항체에 대한 내성을 가진 두경부암 세포 및 비소세포폐암 세포를 동정하였다. 구체적으로, TCP (tissue culture plates)에서 배양한 두경부암 세포주 13개와 비소세포폐암 세포주 6개의 패널에 25 ㎍/㎖ 식스투무맙을 처리했다.
LN686 세포에 지시된 양의 식스투무맙을 6시간 동안 처리하고, 100 ng/㎖ IGF-1을 30분 동안 처리하여 활성화시켰다. p-IGF-1R (Y1131)과 IGF-1R을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 13개 두경부암 세포주와 6개의 비소세포폐암 세포주를 식스투무맙으로 72시간 동안 처리한 후, 세포 생존율은 MTT assay로 확인하여 대조군 그룹 (CTRL)에 대한 시료 처리군의 흡광도 수치의 비율을 계산하여 평가한 결과를 도 2에 나타내었다.
또한, LN686, UMSCC38, A549m 세포주에 1% FBS 함유 배지에 희석한 식스투무맙을 3일 및 5일 동안 처리하였다. 세포 생존율은 MTT assay로 확인하여 대조군 그룹 (CTRL)에 대한 시료 처리군의 흡광도 수치의 비율을 계산하여 평가한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, 식스투무맙 처리 6시간 후 (도 1), 10% 또는 1% FBS 배양 조건에서 (도 2, 도 3) 식스투무맙을 처리하면 IGF-1에 의한 IGF-1R 인산화가 완벽하게 억제되었으나, MTT assay로 암세포 증식 억제 효과를 검색한 결과 식스투무맙을 7일 동안 처리하여도 세포 증식 억제를 나타낸 세포를 확인하지 못하였다. 실험 결과를 제시하지는 않았으나 식스투무맙의 효과는 정상산소 또는 저산소 상태에서 차이를 나타내지 못하였다. 그러므로, 이러한 결과는 식스투무맙이 암세포 증식을 저해하지 못하는 것은 배양 배지에 FBS의 존재여부나 정상산소 또는 저산소 배양 환경에 영향을 받지 않는 것으로 종합될 수 있다.
실시예 2. 삼차원 및 삼차원 유사 배양 조건에서 항- IGF -1R 단일클론항체의 암세포 성장 저해 효과
생체 내(in vivo)와 유사한 3차원 조건에서 배양하는 세포의 성장, 신호전달 과정 및 이에 의한 반응 및 약물에 대한 반응성은 통상적인 TCP에서 자란 세포와 크게 다르다고 알려져 있다 (Mizushima et al., 2009a). 이에 따라 본 발명자들은 PCPs (poly-2-hydroxyethyl methacrylate (polyHEMA)-coated plates)와 UAPs (ultralow attached plates)에서 자랄 때 식스투무맙의 효과를 평가하였다. 이 삼차원 유사 배양 조건은 세포 부착과 확산의 억제를 통하여 삼차원 조건을 모방한 것이다 (Mizushima et al., 2009a).
Soft agar를 이용한 삼차원 배양 조건에서 LN686, FADU, H226B, OSC19, A549m 세포에서 식스투무맙 처리에 의한 콜로니 생성 저해 효과를 도 4에 나타내었으며, 삼차원 유사 배양 조건 (PCP 및 UAP)에서 배양한 LN686, FADU, 및 OSC19 세포의 대표적인 모양을 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 비소세포폐암 및 두경부암 세포는 회전타원체 모양이며, 이 조건에서 7일 내로 자란다. 세포 성장률이 각각의 배양 조건에 따라 다를 수 있기 때문에, 본 발명자들은 세포를 별개의 배양 기간에 계수하였다.
PCP와 UAP에서 자란 LN686, ASDU, 및 OSC19 세포는 매개체(vehicle, Con) 또는 식스투무맙과 함께 일정 시간 동안 배양시킨 후 세포 수를 계수한 결과를 도 6에 나타내었다. 결과값은 평균± 표준편차(SD)로 표시하였고, 통계적 유의성은 t 검정(Student t test)으로 평가하여 그 유의성을 별표로 표시하였다. (P<0.05 and P<0.001)
도 6에 나타낸 바와 같이, 각각의 플레이트 조건에서 LN686, FADU 세포에서는 식스투무맙을 처리하지 않은 것과 25 ㎍/㎖ 식스투무맙을 처리한 세포의 성장률에 차이점이 나타나지 않았다. 대조적으로, 식스투무맙을 처리한 OSC19 세포는 처리하지 않은 세포에 비하여 현저하게 느린 성장률이 관찰되었다.
본 발명자들은 다음으로 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) assay를 통하여 13개의 두경부암 세포주와 6개의 비소세포폐암 세포주에서 식스투무맙에 대한 감수성을 확인하였다. 두경부암 및 비소세포폐암 세포를 FBS 존재 하에서 식스투무맙(25 ㎍/㎖)의 존재 여부에 따라 polyHEMA-coated plates (PCPs) 에서 7일 동안, ultralow attached plates (UAPs)에서 7일 동안 각각 배양시켰다. PCP와 UAP에서 세포의 증식은 MTS assay로 분석하였으며 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 각각의 바(bar)는 대표적인 실험에서 6개의 웰에서 얻은 수치에 대한 평균± 표준편차를 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, PCPs에서 식스투무맙을 처리한 후, 7개의 두경부암 세포주와 2개의 비소세포폐암 세포주 (red)는 세포 생존률이 20% 이하로 저하되었으며, 4개의 두경부암 세포주와 2개의 비소세포폐암 세포주 (blue)는 생존률이 20 ~ 50% 저하되었고, 나머지 2개의 두경부암 세포주와 2개의 비소세포폐암 세포주 (black)는 60% 이상의 생존률 저하를 보였다. 따라서, 본 발명자들은 빨간색 세포주는 "내성(resistant)", 파란색 세포주는 "약한 민감성(mildly sensitive)", 검은색 세포주는 "민감성(sensitive)"라고 정의하였다. UAPs에서 자라는 이 세포주들은 식스투무맙 처리에 대하여 PCPs에서 자란 세포주들과 비슷한 반응을 보인다.
실시예 3. 3차원 배양 조건에서 항- IGF -1R 단일클론항체의 효과
3차원 환경에서 자라는 세포는 PCPs 및 UAPx에서 자라는 세포와 다를 수 있기 때문에,본 발명자들은 3차원 배양 시스템인 soft agar에서 자란 세포에 대하여 식스투무맙 처리 효과를 실험하였다.
두경부암 세포 10종 및 비소세포폐암 세포 6종을 FBS 존재 하에서 식스투무맙(25 ㎍/㎖)의 존재 여부에 따라 soft agar 3차원 세포 배양 시스템에서 4~6주 동안 배양시킨 후, 식스투무맙의 암세포 성장 저해 효과를 도 8에 나타내었다.
PCPs, UAPs, 또는 soft agar에서 자란 세포주 모두 25 ㎍/㎖ IgG를 처리하였을 때에는 처리하지 않은 대조군에 비하여 콜로니 생성이 감소하지 않았으나 (데이터를 제시하지 않음), 도 8에 나타난 바와 같이, 식스투무맙 처리 후 soft agar에서 PCPs 및 UAPs에서 약물에 대해 민감한 비소세포폐암 세포주와 두경부암 세포주는 모두 내성 세포주 및 약한 민감성 세포주에 비하여 적은 콜로니를 형성하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 식스투무맙 내성 세포 (686LN, H226B)와 식스투무맙 민감성 세포 (UMSCC38, A549m)를 이종이식한 누드 마우스에 식스투무맙을 18~33일 동안 처리함으로써 식스투무맙의 생체 내(in vivo) 효과를 살펴보았으며 그 결과를 도 9에 나타내었다. 사전 설정된 LN686, UMSCC38, 226B, 및 A549m 종양 이종이식(n=8)을 식스투무맙 (intraperitoneal; 25 mg/kg) 또는 대조군인 담체(vehicle)로 일주일에 두 번 처리하였다. A549m 세포로부터 대표적인 종양을 나타내었다. 데이터는 지정된 시간의 평균 종양 부피 ± 표준편차 또는 희생 날짜의 무게 ± 표준편차로 나타내었다. (*P < 0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 9에 나타난 바와 같이, 식스투무맙 (25 ㎍/㎏)이 UMSCC38과 A549 이종이식 종양의 성장 및 중량에 있어서 통계적으로 현저한 감소를 유도하는 반면, 686LN 및 H226B 이종이식 세포에서는 현저한 효과가 나타나지 않았다. 이러한 점을 종합하면, 식스투무맙의 암세포 성장 저해 및 항암 활성은 실제 생체 내에서의 종양과 유사한 조건인 3차원 또는 그 유사 시스템을 적용하여야 평가할 수 있을 것으로 여겨진다.
실시예 4. 항- IGF -1R 단일클론항체에 대한 내성 메커니즘 분석
본 발명자들은 두경부암 및 비소세포폐암 세포에서 식스투무맙 처리에 대한 내성을 일으키는 메커니즘을 연구하였다. TCP, PCP, UAP, 또는 soft agar에서 자란 식스투무맙에 내성 (LN686, FADU, 226B, 226Br, H596, and H460) 또는 감수성(UMSCC38, OSC19, H1299, and A549m)을 지닌 세포주에, 식스투무맙을 처리하지 않거나, 25 ㎍/㎖ 식스투무맙을 6시간 동안 처리한 다음, IGF-1를 30분 동안 처리하였다. 여러 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 먼저 PCPs에서 자란 식스투무맙-내성 및 민감성 세포주에서 IGF-1R 매개 신호전달의 활성화에 대한 식스투무맙의 억제 작용을 평가하였다. 6시간 동안 25 ㎍/㎖ 식스투무맙을 처리하면 IGF-1-유도 IGF-1R와 Akt 인산화를 효과적으로 억제하며, TCPs, PCPs, UAPs 뿐만 아니라 soft agar에서 자란 식스투무맙-내성 LN686과 식스투무맙-감수성 OSC19 세포 모두에서 IGF-1R의 총 발현을 억제하였다. 한편, 식스투무맙에 감수성이 있는 OSC19의 경우 식스투무맙에 의해 Akt의 인산화 및 그 하위 신호전달 체계인 mTOR, p70S6K, S6의 인산화도 저해된 반면 식스투무맙에 저항성을 지니는 LN686에서는 이러한 kinase의 인산화가 저해되지 않거나 오히려 증가되는 경향을 나타내었다.
PCP에서 자란 식스투무맙 내성 (LN686, FADU, 226B, 226Br, H596, and H460) 또는 민감성 (UMSCC38, OSC19, H1299, and A549m) 세포주에 식스투무맙을 처리하지 않거나, 25 ㎍/㎖ 식스투무맙을 7일 동안 처리한 다음, 10% FBS를 30분 동안 처리하였다. 여러 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 도 11에 나타내었다.
ERK1/2의 인산화는 식스투무맙에 대한 감수성에 따라 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 시스투무맙의 내성 기전이 Akt 및 그 하위 신호전달의 활성화와 관련이 있음을 암시하며, 따라서 이러한 작용 기전을 살펴보기 위하여 IGF-1R 이외에 Akt, mTOR 등을 활성화시킬 수 있는 다른 신호전달의 활성화에 대한 영향을 확인하였다. 기존 연구에서 인슐린 수용체 (IR)의 발현이 IGF-1R에 대한 mAbs에 대한 내성과 관련 있다고 보고되었다. (Cao et al., 2008; Gong et al., 2009; Huang et al., 2009a; Ulanet et al.; Zha et al., 2009). 그러나, 본 연구 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 약물을 처리하기 전 또는 약물 처리 후 식스투무맙에 민감한 세포와 내성을 지닌 세포에서 인슐린 수용체 발현 차이를 나타내지 못하여, 인슐린 수용체 발현 여부와 식스투무맙의 감수성에는 뚜렷한 관련이 없는 것으로 추정된다.
EGFR과 IGF-1R 신호 사이의 상호 관련성이 IGF-1R과 EGFR의 TKIs에 대한 내성의 주요 작용기전으로 알려지고 있기 때문에 (Buck et al., 2008; Morgillo et al., 2006), 본 발명자들은 다음으로 식스투무맙에 의하여 EGFR 및 Akt의 인산화를 유도하는지 살펴보았다. PCP에서 자란 식스투무맙-내성 (LN686, FADU, 226B, 226Br, H596, and H460) 또는 민감성 (UMSCC38, OSC19, H1299, and A549m) 세포주에 식스투무맙을 처리한 후 10% FBS를 30분 동안 처리하였다. 여러 인산화된 단백질과 액틴은 웨스턴 블롯으로 분석하였으며 그 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 식스투무맙-처리군과 대조군에서의 각 단백질의 발현 수준을 블롯의 density를 측정하여 비교 분석하여 정량화하였고 이를 도 13에 나타내었다.
도 12 및 13에 나타난 바와 같이, 식스투무맙에 내성을 지니는 세포에서 식스투무맙을 처리한지 7일 후 EGFR의 자가인산화 위치인 Tyr1068에서 EGRF의 인산화가 증가되었다. 특히, 식스투무맙에 내성을 지니는 세포주에서 식스투무맙 처리에 의하여 Src의 인산화와 함께 (Y416), Src에 의하여 인산화되는 EGFR 인산화 위치인 타이로신 845번에서 EGFR의 인산화가 증가되었다. 또한 식스투무맙에 내성을 지니는 세포에서 Akt, mTOR, p70S6K, S6, EGFR, Src의 인산화가 증가되는 것으로 나타나, 이러한 신호전달의 인산화가 식스투무맙에 대한 내성과 밀접한 관련이 있는 것으로 생각할 수 있다.
실시예 5. Src 및 인테그린 β3의 활성화에 의한 식스투무맙의 내성 기전 확인
5-1. 웨스턴 블롯을 이용한 확인
EGFR 및 IGF-1R과 같은 성장인자 수용체를 자극하면, c-Src (이하 Src)의 활성이 증가되고 (Yeatman, 2004), Src는 EGFR 및 IGF-1R을 인산화시킨다 (Maa et al., 1995; Peterson et al., 1996). EGFR 및 Src는 둘 다 PI3K/Akt 경로를 활성화시킬 수 있는데, 식스투무맙에 의한 Akt 활성화에 대한 이들의 역할을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 LN686에서 식스투무맙이 유도하는 EGFR 및 Src의 인산화를 모니터링 하였다.
PCP에서 자란 LN686 세포는 인간 IGF-1 중화 단일클론항체 (αIGF-1) (도 15, 도 16)가 있거나 없을 때, 지정된 시간 (도 16) 또는 30분 (도 14, 15, 17) 동안 10% FBS (도 14, 15) 또는 IGF-1 (100 ng/㎖) (도 16, 17) 처리 전, 지정된 시간 동안 식스투무맙 (25 ㎍/㎖)을 처리했다. 제시된 단백질에 대하여 전체 단백질 또는 인테그린 β3 항체와의 면역 침강을 실시한 후 웨스턴 블롯으로 발현을 분석하였다.
또한, PCP에서 자란 LN686 세포에 FBS가 없는 조건에서 식스투무맙 (25 ㎍/mL)를 7일 동안 처리하였다. p-IGF-1R (Y1131), IGF-1R, p-Src (Y416), Src, p-EGFR (Y845), p-EGFR (Y1068), EGFR, p-Akt (S473), 및 Akt를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 도 18에 나타내었다. 10% 혈청(serum)으로 30분동안 자극시킨 LN686 세포는 대조군으로 포함시켰다.
도 14에 나타난 바와 같이, FBS 자극 (10%, 30분)은 IGF-1R, EGFR (Y845, Y1068), Src(Y416), 및 Akt (S473)의 인산화를 유도하였다. p-IGF-1R, p-EGFR (Y845), p-Src (Y416), 및 p-Akt (S473)의 수준은 식스투무맙으로 전처리한지 30분 후에 감소하였고, 이는 IGF-1R의 약물-유도 저해, Src와 PI3K/Akt의 연속적인 불활성 때문인 것으로 추정된다.
식스투무맙 처리 후, IGF-1R은 IGF-1R 수준의 변화 없이 3시간 동안 탈인산화 된 상태로 남아 있었다. 반면에 Src, FAK, p-EGFR (Y845), Akt, 및 mTOR은 식스투무맙 처리 1시간 후 빠르게 재인산화 되었다. IGF-1R 수준은 6시간 후에 감소되었다. p-EGFR (Y1068) 및 EGFR 수준은 식스투무맙 처리 후 6시간 동안 변하지 않았으나 72시간 후 증가하였다. 상기 인산화 된 단백질이 시간대 별로 인산화되는 속도 및 그 강도로 볼 때 식스투무맙에 의하여 IGF-1R이 차단되면 초기에는 IGF-1R의 하위 신호전달이 억제되나, 이후 다른 신호전달이 활성화됨에 따라 EGFR, Akt 등의 신호전달의 활성화되는 것으로 추정된다.
Src 활성화에 관여하는 여러 신호전달 중, 인테그린을 통한 신호가 Src를 활성화 한다고 알려져 있으며(Hood and Cheresh, 2002), IGF-1이 인테그린 β3의 특이적 루프(loop)에 직접적으로 결합할 수 있다고 최근 연구에서 보고되었다 (Saegusa et al., 2009). 식스투무맙에 의한 Src 활성화의 메커니즘 연구를 시작하기 위하여, 본 발명자들은 식스투무맙 처리 후 인테그린 β3과 세포 내 단백질과 하류 작동자의 활성화 사이의 IGF-의존적 상호작용에 가능한 변화를 평가하였다.
본 발명자들은 FBS 존재 하에 식스투무맙 처리 시간이 증가함에 따라 인테그린 β3과 Src, 인산화된 Src, p85α와 FAK과의 물리적 결합이 증가됨을 확인하였다 (도 15). 더 나아가, IGF-1R 중화 단일클론항체 (αIGF-1)을 이용하여 IGF-1의 활성을 억제할 경우 인테그린 β3의 세포 내 단백질과 전체 또는 인산화된 Src, FAK, EGFR, Akt, 및 mTOR과의 물리적 결합 유도 에 대한 식스투무맙의 효과가 상실되는 것으로 나타났다. 식스투무맙에 의해 증가된 인테그린 β3 신호는 IGF-1 자극 이후에도 관찰되었다 (도 16, 왼쪽). 식스투무맙 전처리는 IGF-1-유도 Src 및 하류 작동자의 인산화를 10분 이내에 빠르게 차단하였으나, 이 단백질들은 1시간 후에 빠르게 재인산화되며, 식스투무맙 처리 시간이 증가됨에 따라 재인산화되는 정도가 증가되는 것으로 나타났다 (도 16, 오른쪽). αIGF-1 처리 후에 연관성이 차단되었던 것과 같이, IGF-1 존재 하에 식스투무맙을 처리하면 인테그린 β3과 p-Src, p-FAK 또는 p85α의 물리적 결합이 증가되는 것으로 나타났다 (도 17). 반대로, 식스투무맙 단독으로는 IGF-1 자극이 없을 때 EGFR, Src, 또는 Akt 인산화를 유도시키지 못했다 (도 18). IGF-1 존재 하에 인테그린 β1과 p-Src (Y416) 또는 p-FAK (Y861)의 연관성이 관찰되었으나, 식스투무맙 전처리는 이 연관성에 영향을 주지 못했다 (도 19, 오른쪽).
PCP에서 자란 FADU 및 H226Br 세포를 모노클로날 항체 (aIGF-1)를 중성화하는 항-인간 IGF-1의 존재 또는 부존재 하에서 정해진 시간 동안 식스투무맙 (25 μg/mL)로 처리한 후, 10% FBS 또는 IGF-1 (100 ng/mL)로 30분 동안 또는 정해진 시간동안 자극하였다. β3 인테그린 또는 β1 인테그린 면역침강물 (IP)과 전체 세포 용해물 (WCL)은 웨스턴 블롯을 이용하여 p-IGF-1R (Y1131), IGF-1R, p-EGFR (Y845), EGFR, p-Src (Y416), Src, p-Akt (S473), 및 Akt, p-FAK (Y861), PI3K의 p85α subunit, integrin β3 and integrins β1을 분석하였으며 그 결과를 도 20 내지 도 23에 나타내었다.
FADU (도 20 내지 도 22)와 H226Br (도 23) 세포에서도 IGF-1 존재 하에 인테그린 β3와 Src, 인산화된 Src, p85α, 인산화된 FAK의 물리적 상호작용이 증가하며, 식스투무맙 처리에 의해 EGFR, Akt, Src, mTOR, FAK의 인산화가 유도되고, αIGF-1으로 IGF-1의 작용을 중화하면 이러한 상호작용 및 인산화가 억제되는 비슷한 경향을 보여주었다.
본 발명자들은 다음으로 식스투무맙 처리가 두 가지 다른 결함 assay에 의하여 IGF의 인테그린 β3에 대한 결합을 향상시키는지 평가하였다. 첫 번째로, 본 발명자들은 IGF-1R, 인테그린 β3, 또는 H226Br 세포를 siRNA (small interfering RNA)로 트랜스펙션 시킴으로써 발현하지 못하게 하였고, 코팅된 IGF-1에 세포의 부착능을 분석하였다 (Saegusa et al., 2009). 구체적으로 96-well 마이크로타이터 플레이트에 1(+) 또는 2(++) μg/mL 농도로 IGF-1을 코팅시킨 후 scrambled siRNA (siCon), IGF-1R-특이적이거나 인테그린 β3-특이적인 siRNA를 처리 또는 처리하지 않은 H226Br 세포의 접착 여부를 ELISA를 활용하여 평가하였다. siRNA 처리 후 인테그린 β3과 IGF-1R 수준은 웨스턴 블롯으로 검출하였으며 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 H226B 세포가 양에 따라 IGF-1에 부착하는 반면, IGF-1R과 β3 인테그린 발현이 사라진 H226Br 세포는 IGF-1 부착이 줄어들었다는 것을 발견하였다). IGF-1R과 인테그린 β3 siRNA의 공동 트랜스펙션은 H226B 세포의 부착을 각각의 siRNA 단독으로 트랜스펙션했을 때보다 훨씬 효과적으로 억제하였다.
두 번째로, 본 발명자들은 효소-연결 면역 흡착제 assay-타입 인테그린 결합 assay를 수행하였다. 구체적으로 IGF-1로 코팅된 96-well microtiter plates는 식스투무맙 (25 μg/mL)의 존재 또는 부존재 하에서, 재조합 용해성 IGF-1R (rIGF-1R; 5 ㎍/mL) 또는 재조합 용해성 인테그린 β3 (rβ3; 5 ㎍/mL) 단독 또는 조합과 함께 2시간 동안 배양하였으며, 그 결과를 도 25에 나타내었다. 결합된 IGF-1R (왼쪽)와 인테그린 β3 (중간, 오른쪽)은 항-IGF1R과 항-His mAbs를 각각 이용하여 동정하였다. 데이터는 실험결과를 3배한 값의 평균 ± SD를 나타낸다 (*P<0.05; **P=0.01; ***P<0.001).
도 25에 나타난 바와 같이, IGF-1로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plates)에서 식스투무맙이 있거나 없는 조건에서 재조합 가용성 인테그린β3 (rβ3), 재조합 가용성 IGF-1R 단백질 (rIGF-1R)과 함께 배양하였다. 본 발명자들은 rIGF-1R (도 25, 왼쪽)과 rβ3 (도 25, 중간, 오른쪽)이 IGF-1 코팅된 플레이트에 상당히 잘 결합한다는 것을 발견하였다. rβ3이 IGF-1 코팅된 플레이트에 결합하는 것은 첨가량에 따라 rIGF-1R을 첨가하여 억제되었고 이러한 작용은 IGF-1R의 단백질 양이 증가함에 따라 뚜렷해졌다 (도 25, 오른쪽). 이와 같이 rIGF-1R에 의한 IGF-1-rβ3 상호작용이 소실되는 것은 식스투무맙 처리에 의해 현저하게 차단되었다.
5-2. 형광 면역 염색법을 이용한 확인
본 발명자들은 IGF-1 존재 하에 식스투무맙에 의하여 Src 및 FAK의 인산화가 증가한다는 웨스턴 블로팅의 결과를 형광 면역 염색법을 활용하여 재확인하였다. Ultra-low attached plates (UAPs)에서 배양한 LN686 세포에 식스투무맙을 단독 혹은 IGF-1 또는 인테그린 β3 중화항체와 함께 배양한 후 IGF-1을 처리하고 고정한 뒤 Src 및 FAK의 인산화를 확인한 결과, 도 43에 나타난 바와 같이 IGF-1 처리에 의하여 Src 및 FAK의 인산화가 증가하고 식스투무맙 처리에 의하여 인산화가 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 식스투무맙의 이러한 작용이 IGF-1 또는 인테그린 β3 중화항체에 의하여 소실되는 것으로 나타나, 식스투무맙의 Src 및 FAK 인산화 유도 작용은 IGF-1의 존재 하에 인테그린 β3를 매개하여 일어남을 재확인할 수 있었다.
또한 변이된 인테그린 β3를 발현하는 세포의 경우에 식스투무맙에 의한 Src 및 FAK 인산화 증가 작용이 나타나는지 여부를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
기존 문헌에 따라, 인테그린 β3 중 IGF-1 결합에 필수적인 아미노산 서열 (CYDMKTTC, residues 177-184)을 해당 위치의 인테그린 β1 중의 아미노산 서열 (CTSEQNC, residues 187-193)로 치환한 변이된 인테그린 β3 발현 벡터를 제조하였다. 공벡터 또는 변이된 인테그린 β3 발현 벡터를 FADU 세포에 transfection 시켰다. 이 세포들을 평판배양한 후 식스투무맙 (25 μg/ml)을 단독 또는 IGF-1 또는 인테그린 β3 중화 항체와 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 IGF-1 (100 mg/ml)을 1시간 동안 처리한 뒤 세포를 회수하여 PBS로 세척하고 10% formalin으로 2시간 동안 고정하였다. 고정된 세포를 LN686 세포의 경우 파라핀 블록에, FADU 세포의 경우 OCT 블록에 넣은 다음 4 μm의 두께로 섹션을 만들었다. 파라핀 블록의 경우에는 파라핀을 제거하고 알코올에서 물로 바꾸어 주면서 재수화 시켰다. 세포를 다시 PBS에 세척 후 고정하고 0.3% Triton-X 100를 처리하여 permeabilization 시킨 뒤 일차 항체 (pSrc 또는 pFAK)와 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 뒤 형광이 결합되어 있는 2차 항체와 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척한 후 mounting한 다음 confocal microscope으로 관찰하였다.
도 43에 제시한 바와 같이, 변이된 인테그린 β3 발현 벡터를 transfection 시킨 세포에서는 공벡터를 transfection 시킨 세포와 달리 IGF-1 존재 하에서 식스투무맙에 의한 Src 및 FAK 인산화 증가 작용이 나타나지 않는 것으로 나타나, 식스투무맙에 의한 Src 및 FAK 인산화 증가 작용은 식스투무맙에 의하여 IGF-1 이 IGF-1R에 결합하는 것이 차단됨에 의해 IGF-1이 인테그린 β3에 결합하는 것을 매개하여 일어난다는 것을 확인하였다.
세포가 세포외 기질에 결합시 인테그린이 매개하는 신호전달이 활성화되는 것으로 알려져 있으므로, 세포를 세포외 기질에 부착시켜 인테그린에 의한 Src 및 FAK 인산화를 유도시킨 조건에서 식스투무맙에 의한 Src 및 FAK 인산화에 대한 영향을 확인하였다.
ECM (collagen 또는 matrigel)로 코팅된 coverslip을 준비한 뒤, IGF-1 존재 하에서 식스투무맙을 단독 혹은 IGF-1 또는 인테그린 β3 중화항체와 배양한 LN686 세포를 ECM이 코팅된 coverslip에 부착시켰다. 부착된 세포를 4% formaldehyde로 고정한 뒤 Triton X-100 용액으로 permeabilization 시키고 일차 항체 (pSrc 또는 pFAK)와 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 뒤 형광이 결합되어 있는 2차 항체와 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척한 후 mounting한 다음 confocal microscope으로 관찰하였다.
도 45 및 46에 제시한 바와 같이, IGF-1을 처리하면 세포막 부위에서 Src 및 FAK 인산화가 증가되는 것으로 나타났고 식스투무맙은 이러한 작용을 억제하지 못하거나 다소 증가시켰으며, IGF-1 또는 인테그린 β3 중화항체의 동시 처리에 의하여 Src 및 FAK 인산화가 소실되는 것으로 나타나, 지금까지 제시된 바와 일치되는 결과를 확인할 수 있었다.
종합하면, 상기 결과들은 식스투무맙 처리에 의하여 IGF의 IGF-1R에 결합하는 것이 차단됨에 따라, IGF-1이 인테그린 β3에 결합하여 인테그린 β3를 활성화시킴으로서 EGFR와 PI3K/Akt의 FAK/Src 등의 신호전달을 활성화시킨다는 점을 시사한다.
실시예 6. 인테그린 β3 발현 정도와 식스투무맙의 감수성과의 상관 관계
본 발명자들은 TCP 배양 HNSCC 세포계와 PCP 배양 HNSCC 세포계에서 웨스턴블럿분석법으로 인테그린 β3, Src 및 IGF-1R을 분석했다. 식스투무맙-내성군(빨간색), 약한 민감성군(파란색), 및 민감성군(검은색)으로 그룹을 나눈 HNSCC와 NSCLC 세포주를 TCP (T) 또는 PCP (P)에서 배양하였다. 단백질 발현 수준을 분석하기 위하여 웨스턴블롯을 실시하였고 그 결과를 blot의 density를 수치화하여 정량적으로 분석하였다. 각각의 세포에서 인테그린 β3 발현 수준을 액틴 발현 수준으로 보정하여 비교 분석하였으며, 상기 실험 결과를 도 26에 나타내었다.
3차원 배양(3D culture) 상태 세포에 대한 이전의 관찰대로 (Mizushima et al., 2009a), 식스투무맙 내성(붉은색), 다소 민감한(파란색) 및 민감한(검은색) HNSCC 세포주에서 PCP를 활용한 3차원 유사 배양 조건에서는 인테그린 β1 단백질의 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 이와 대조적으로, 인테그린 β3의 경우 일반적인 이차원 배양 및 삼차원 유사 배양 조건에서 그 발현 수준이 유사한 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 PCP (P)를 이용한 삼차원 유사 배양 조건에서 Src 및 IGF-1R의 발현 수준이 일반적인 이차원 배양 조건 (TCP (T))과 비교하여 변화하지 않는다는 것을 관찰했다. 이러한 발견은 3차원 환경의 세포배양에서 인테그린 β3, src 및 IGF-1R의 역할을 시사한다.
다음에 본 발명자들은 인테그린 β3, Src 및 IGF-1R의 발현과 식스투무맙의 감수성과의 관련성을 확인하였다. 식스투무맙에 내성을 보이는 세포주에서 인테그린 β3 발현이 높은 것으로 나타났으나, IGF-1R 또는 Src 발현 수준은 식스투무맙의 감수성과 뚜렷한 관련성을 나타내지 못하였다. 이러한 점은 인테그린 β3 발현 수준이 사람 폐암 및 두경부암 세포에서 식스투무맙의 감수성을 예측할 수 있는 지표가 될 수 있음을 제시한다.
실시예 7. 인테그린 β3 또는 Src 억제제 병용을 통한 식스투무맙의 암세포 성장 저해 및 항암 효과 상승 효과
본 발명자들은 인테그린 β3에 선택적인 mAb (αβ3) 또는 소분자 Src 억제제 (PP2)를 사용하여 인테그린 β3 또는 Src를 억제하였을 때 식스투무맙이 매개하는 인테그린/Src 신호전달의 활성화를 억제하며 이를 통하여 식스투무맙의 암세포 증식 억제 효과가 증강되는지를 확인하였다.
구체적으로, PCP에서 자란 식스투무맙 내성 세포 (LN686 및 FADU)와 식스투무맙 민감 세포(OSC19)에 B3A (0.1-10 mg/mL) 또는 PP2 (0.1-10 mM)로 1시간 동안 처리한 다음 IGF-1 (100 ng/ml)를 처리한 후, 단백질 발현은 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 도 27 및 도 28에 나타내었다.
또한, PCP에서 자란 LN686과 FADU 세포는 IGF-1(100 ng/㎖, 30분)으로 자극하기 전 7일 동안 아무런 처리 없이 그대로 두거나, 식스투무맙 (25 ㎍/㎖) 단독으로 처리하거나, 항-인테그린 β3 단일클론항체 (7E3, 10 ㎍/㎖), PP2(10 μM), 항-인테그린 β1 단일클론항체 (AllB2, 10 ㎍/㎖)로 처리하거나, Ad-EV 또는 Ad-CSK (10 pfu/cell)와 조합하여 처리하였으며, 단백질을 검출하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 도 29 및 도 30에 나타내었다.
도 27 및 도 28에 나타난 바와 같이, 식스투무맙 내성 세포 (LN686 및 FADU)와 식스투무맙 민감 세포(OSC19)에 둘 다 인테그린β3 mAb (B3A, 0.1-10 mg/mL) 또는 PP2 (0.1-10 mM)를 6시간 동안 처리한 뒤 EGFR, Src 및 Akt 발현을 확인한 결과, 이들의 발현에는 영향이 없었으나 이들의 인산화된 단백질의 발현은 감소되었음을 알 수 있다. 또한, 도 29에 나타난 바와 같이, LN686 또는 FaDu 세포에 인테그린β3 mAb (100 μg/mL) 또는 PP2 (10 μM)를 처리함에 따라 식스투무맙에 의해 유도되는 Src, FAK, EGFR, Akt, mTOR의 인산화가 뚜렷하게 억제되었다.
반면, 도 30에 나타난 바와 같이, β1 인테그린을 억제하면 식스투무맙에 의한 Src, FAK, EGFR, Akt, mTOR의 인산화에는 영향을 미치지 못하였음을 알 수 있다.
또한, PCP에서 배양한 LN686, FADU, H226B, OSC19, 및 UMSCC38 세포를 7일 동안 아무런 처리 없이 그대로 두거나, 식스투무맙 (25 ㎍/㎖), 항-인테그린 β3 mAb (αβ3, 10 ㎍/㎖), PP2(10 μM), 또는 이들의 조합으로 처리했다. 세포 증식은 MTS assay로 분석하였으며, 그 결과를 도 31에 나타내었다. 각각의 바(bar)는 여러 반복 실험 중 하나의 대표 실험에서 동일한 시료를 처리한 6개 웰 (well)로부터 얻은 값(value)± SD를 나타낸다.
도 31에 나타난 바와 같이, 인테그린β3 mAb 또는 PP2를 식스투무맙과 동시에 처리하면 식스투무맙 내성 세포 (LN686, FADU 및 H226B)에서 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과가 뚜렷하게 증강되었으나, 식스투무맙에 감수성이 있는 세포 (OSC19 및 UMSCC38)에서는 이러한 현상이 나타나지 않았다.
또한, Src siRNA를 활용하여 Src의 발현을 선택적으로 저해하였을 때 IGF 존재 하에 식스투무맙에 의한 SRC, FAK, Akt와 mTOR의 인산화 작용을 거의 완전히 차단하였고 (도 32) PCP에서 배양된 LN686 및 FADU 세포에서 식스투무맙의 암세포 성장 억제 작용을 뚜렷하게 상승시켰다 (도 33).
인테그린 β3/Src 신호화 억제 작용에 의한 식스투무맙의 항암 효과 증강 작용을 재확인하기 위해 타이로신 527번을 인산화시켜 Src 활성을 억제하는 c-Src 타이로신 키나아제를 발현시키는 아데노바이러스를 활용하였다 (Yeatman, 2004). 구체적으로, 누드 마우스에 LN686 세포를 이식하여 xenograft 모델을 만든 뒤 (n=8)에 식스투무맙 (25 mg/kg, 복강 내 투여), Ad-EV (3 X 1011 pfu, 종양 내 투여), Ad-CSK (3 X 1011 pfu, 종양 내 투여), 또는 이들의 조합을 1주일에 2번 정해진 시간에 함께 주입하였으며, 그 결과를 도 34 및 도 35에 나타내었다. (바(bar)는 평균 SD; *P < 0.05, **P < 0.01을 나타낸다.)
Ad-CSK는 LN686 세포에서 식스투무맙 유발 Src의 인산화를 감소시켰다. 식스투무맙 및 Ad-CSK를 병용처리할 경우 식스투무맙 또는 Ad-CSK 단독으로 처리하였을 때 보다 더 효과적으로 LN686 이종 이식 종양의 성장을 억제하였다(도 34). 21일 후, 단독 또는 병용 처리 그룹에서 종양의 평균 무게를 측정한 결과 대조군에 비하여 각각 21 % (P <0.001), 96 %, 46 % (P <0.01)였다 (도 35). 이러한 결과는 인테그린 β3/Src 신호화의 불활성화를 통하여 IGF-1R과 인테그린 β3를 동시에 발현하는 두경부암 세포에서 식스투무맙의 내성을 극복할 수 있음을 시사한다.
현재 연구에 활용되는 단일 세포주와는 달리 실제 암세포는 여러 특성을 지니는 세포들로 이루어져 있기 때문에, 이를 실질적으로 반영하기 위하여 사람 두경부암 조직을 확보하여 이를 누드 마우스에 이식한 뒤 식스투무맙과 인테그린 β3 억제제 또는 Src 억제제를 단독 또는 병용 투여하였을 때 식스투무맙의 항암 효능에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 인테그린 β3를 차단하기 위해, 본 발명자들은 siRNAs 또는 인테그린 β3 중화 mAb를 (αβ3) 사용하였다.
HNSCC 환자 종양 조직으로부터 분리하여 배양한 세포에 인테그린 β3 (siβ3)에 대한 2개의 특정 siRNA (#1 또는 #2) 각각, 또는 대조(control) siRNA (siCon) (80 nM)을 24시간 동안 처리하였다 (도 36, 왼쪽). siRNA 처리에 의한 인테그린 β3의 억제 여부는 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 36, 위). 세포에 식스투무맙 (25 ㎍/㎖), PP2(10 μM), 및 인테그린 β3 mAb (αβ3, 10 ㎍/㎖) 또는 이들의 조합을 72시간 동안 처리하였다 (도 36, 오른쪽). 암세포 성장 저해 작용을 MTS assay 로 측정하였다. 데이터는 실험 결과의 평균 ± SD로 나타내었다; n=7, **P < 0.05.
세포로부터 단백질을 추출하여 caspase-3의 활성을 발색 변화로 확인하였고 (도 37, 왼쪽), 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 37, 오른쪽). Caspase 활성화에 의하여 생성되는 p-nitroaniline에 의한 흡광도 증가 여부 (405 nm에서 측정)로 확인하거나 (왼쪽), 활성화된 caspase-3 단백질(cleaved caspase-3)의 단백질 발현 정도의 비교를 통하여 caspase-3의 활성화 증가 여부를 확인하였다.
결과적으로, 도 36에 나타난 바와 같이, 인테그린 β3 의 발현을 저해하는 두 가지의 다른 siRNAs를 적용한 결과 PCPs에서 배양된 HNSCC 세포에 대한 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과를 뚜렷하게 강화하였으며, 도 37에 나타난 바와 같이, 인테그린 β3의 mAb를 사용하거나 억제제 (PP2)를 활용하여 Src를 억제 하였을 때 유사한 식스투무맙의 암세포 성장 억제 효과에 대한 촉진 작용이 관찰되었다.
이러한 결과를 in vivo에서 재확인하기 위하여, 누드 마우스에 사람 두경부암 환자에서 추출한 종양 조직 (2 ㎣)을 이식한 다음, 식스투무맙 (10 mg/kg, ip, 1/wk X 3)을 control siRNA (5 ㎍, iv, 2/wk X 3) 또는 인테그린 β3 siRNA (5 ㎍, iv, 2/wk X 3)와 병용 투여하거나, 다사티닙 (dasatinib)(10 mg/kg, po, daily)과 병용 투여하였다. siRNA는 기존 문헌에 보고된 바와 같이 리포좀을 활용하여 마우스에 투여하였다 (Verma et, al., 2008). 실험 데이터는 지정된 시간의 평균 종양 부피 ± SD로 표시하여 도 38 내지 도 41에 나타내었다.
또한, 종양으로부터 단백질을 분리하여 인테그린 β3, pSrc, 및 pAkt 발현을 확인하였고, 조직의 절편으로부터 TUNEL 염색을 실시하여 apoptosis 증가 여부를 확인하였으며, 이를 도 39 및 도 41에 나타내었다. (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.)
도 38에 제시된 바와 같이, 식스투무맙을 인테그린 β3 siRNA와 병용 투여할 경우 종양의 성장 억제가 유의적으로 뚜렷하게 감소되었고, 이러한 작용은 Src의 인산화 억제 및 apoptosis를 통한 세포 사멸의 증가에 의한 것으로 나타났다 (도 39). 또한 인테그린 β3의 발현이 인테그린 β3 siRNA 처리군에서 유의적으로 감소된 것을 통하여 볼 때 siRNA가 종양 조직에서 효과적으로 작용한 것으로 확인되었다.
도 40에 의하면, 대조군, 식스투무맙 단독 처리 그룹 및 다사티닙 단독 처리 그룹과 식스투무맙과 다사티닙을 동시에 처리한 그룹 사이의 종양의 성장이 유의적으로 뚜렷하게 감소되었다. 또한, 도 41에 제시된 바와 같이 식스투무맙과 다사티닙을 동시에 처리한 군으로부터 확보한 종양에서는 Akt 및 Src의 인산화가 유의적으로 감소되었고, apoptosis 증가의 지표인 TUNEL 염색도 뚜렷하게 증가되었으며, 종양의 성장도 뚜렷하게 감소되었다.
상기와 같은 결과를 종합하면 도 42와 같다. 식스투무맙 처리에 의하여 IGF가 IGFR에 결합하는 것이 억제되면 IGFR에 결합하지 못한 IGF가 인테그린 β3에 결합하여 인테그린이 매개하는 세포 성장 촉진 및 사멸 억제 신호전달의 활성화를 유도함으로서 식스투무맙의 항암 효과에 대한 저항성을 유발하는 것으로 여겨진다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 표적 항암제 내성 억제용 약학적 조성물로서, 상기 표적 항암제는 인슐린유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R, insulin-like growth factor-1 receptor) 표적 항암제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 항암제는 항-인슐린유사 성장인자-1 수용체(anti-IGF-1R) 단일클론항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 또는 Src siRNA는 항-인슐린유사 성장인자-1 수용체(anti-IGF-1R) 단일클론항체의 인슐린유사 성장인자 의존 효과를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 또는 Src siRNA는 Src, EGFR, Akt, FAK 또는 mTOR의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 또는 Src siRNA는 p-Src, p-EGFR, p-Akt, p-FAK 또는 p-TOR의 탈인산화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 Src의 인산화는 티로신 416 (tyrosine 416, Y416) 위치에서 일어나는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 EGFR의 인산화는 티로신 1068 (tyrosine 1068, Y1068) 또는 티로신 845 (tyrosine 845, Y845) 위치에서 일어나는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 FAK의 인산화는 티로신 861 (tyrosine 861, Y861) 위치에서 일어나는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하고, 항암제의 항증식성 효과를 증가시키는 항암 보조제로서, 상기 항암제는 인슐린유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R, insulin-like growth factor-1 receptor) 표적 항암제인 것을 특징으로 하는, 항암 보조제.
  11. 삭제
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 항암제는 항-인슐린유사 성장인자-1 수용체(anti-IGF-1R) 단일클론항체인 것을 특징으로 하는, 항암 보조제.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 또는 Src siRNA는 항-인슐린유사 성장인자-1 수용체(anti-IGF-1R) 단일클론항체의 인슐린유사 성장인자-1 의존 효과를 억제하는 것을 특징으로 하는, 항암 보조제.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. (a) 폐암 또는 두경부암 조직 샘플에서 인테그린 β3의 발현양을 측정하는 단계, 및
    (b) 대조군에 비하여 인테그린 β3의 발현이 높을 경우, 표적 항암제에 대한 내성이 높을 것으로 판단하는 단계를 포함하는 표적 항암제 내성 예측 방법으로서,
    상기 표적 항암제는 인슐린유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R, insulin-like growth factor-1 receptor) 표적 항암제인 것을 특징으로 하는 방법.
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