BG66460B1 - Антитела срещу рецептора за инсулинподобния растежен фактор i - Google Patents

Антитела срещу рецептора за инсулинподобния растежен фактор i Download PDF

Info

Publication number
BG66460B1
BG66460B1 BG108037A BG10803703A BG66460B1 BG 66460 B1 BG66460 B1 BG 66460B1 BG 108037 A BG108037 A BG 108037A BG 10803703 A BG10803703 A BG 10803703A BG 66460 B1 BG66460 B1 BG 66460B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
antibody
igf
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
BG108037A
Other languages
English (en)
Other versions
BG108037A (bg
Inventor
Bruce Cohen
James Moyer
Jean Beebe
Jose Corvalan
Michael Gallo
Penelope Miller
Original Assignee
Inc, Amgen
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG66460(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Inc, Amgen, Pfizer Inc. filed Critical Inc, Amgen
Publication of BG108037A publication Critical patent/BG108037A/bg
Priority to BG10111652A priority Critical patent/BG111652A/bg
Publication of BG66460B1 publication Critical patent/BG66460B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells

Abstract

Изобретението се отнася до антитела и техни антигенсвързващи части, които се свързват специфично с рецептора за инсулинподобния растежен фактор (IGF-IR), който за предпочитане е човешки IGF-IR. Изобретението се отнася и до човешки анти-IGF-IR антитела, включващи химерни, двойно специфични, едноверижни антитела или техни части от рекомбинантни белтъци, изолирани тежки и леки вериги на имуноглобулинови молекули, получени от анти-IGF-IR антителата и молекули нуклеинови киселини, кодиращи такива молекули. Създадени са и методи за приготвяне на анти-IGF-IR антитела, фармацевтични състави, включващи тези антитела, и методи за използване на антителата и техни състави за диагностика и лечение. Изобретението се отнася също до методи за генна терапия, използващи молекулите, кодиращи тежки и/или леки имуноглобулинови молекули, които включват човешките анти-IGF-IR антитела, и до методи за генна терапия и до трансгенни животни, включващи молекули нуклеинови киселини съгласно изобретението.

Description

Област на техниката
Инсулинподобният растежен фактор (1GF1) е 7.5-kD полипептид, който циркулира в плазмата във високи концентрации и може да се открие в повечето тъкани. IGF-I стимулира клетъчната диференцировка и клетъчната пролиферация и е необходим за повечето типове клетки на бозайници за поддържане на тяхната пролиферация. Тези клетъчни типове включват между другите, човешки диплоидни фибробласти, епителни клетки, гладкомускулни клетки, Т-лимфоцити, нервни клетки, миелоидни клетки, хондроцити, остеобласти и стволови клетки на костния мозък. За преглед на много разнообразните типове клетки, при които IGF-I/ рецептора за IGF-I взаимодействието медиира клетъчната пролиферация, виж Goldring et al., Eukar. Gene Express., 1:31-326 (1991).
Първата стъпка в трансдукционния път, водещ до IGF-I-стимулирана клетъчна пролиферация или диференцировка, е свързването на 1GF-I или 1GF-II (или инсулин в свръхфизиологични концентрации) с рецептора за IGFI. IGF-I рецепторът е съставен от два типа субединици: алфа субединица (130-135 kD белтък, който е изцяло извънклетъчен и функционира в лигандното свързване) и бета субединица (95kD трансмембранен белтък, с трансмембранни и цитоплазмени домени). IGF-IR принадлежи на семейството на рецепторите за тирозин киназния растежен фактор (Ullrich et al., Cell 61:203-212, 1990) и е структурно подобен на инсулиновия рецептор (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). IGF-IR първоначално се синтезира като едноверижен про-рецепторен полипептид, който се модифицира, чрез гликозилиране, протеолитично разграждане и ковалентно свързване, за да се сглоби като зрял 460-kD хетеротетрамер, съставен от две алфа субединици и две бета субединици. Бета субединицата(е) притежава лиганд-активируема тирозин киназна активност. Тази активност е включена в сигналните пътища, медииращи лигандното действие, което включва автофосфорилиране на бета субединицата и фосфорилиране на IGF-IR субстратите.
In vivo, нивата на серумен IGF-1 са зависими от присъствието на хипофизен растежен 5 хормон (GH). Въпреки че черният дроб е главното място на GH-зависимата IGF-I синтеза, последната работа показва, че повечето от нормалните тъкани също продуцират IGF-L Голям брой неопластични тъкани също могат да 10 продуцират IGF-1. Следователно 1GF-I може да действа, като регулатор на нормалната и анормална клетъчна пролиферация, чрез автокринни или паракринни, а също така и чрез ендокринни механизми. IGF-I и IGF-I1 се 15 свързват in vivo с IGF свързващи белтъци (IGFBPs). Наличността на свободния IGF за взаимодействие с IGF-IR се модулира чрез IGFBPs. За преглед на IGFBPs и IGF-I, виж Grimberg et al., J. Cell. Physiol. 183: 1-9, 2000.
Има ясно доказателство за ролята на IGF1 и/или IGF-IR за in vitro и in vivo поддържането на туморните клетки. Нивата на 1GF-IR се повишават в туморите на белия дроб (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668,1993;
Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Cancer Res., 50:25112517,1990), на гърдата (Pollak et al., Cancer Lett. 38:223-230, 1987; Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 30 1990; Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), на простатата и на дебелото черво (Remaole Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609616, 1992; Guo et aL, Gastroenterol. 102: 1 Mill 08, 1992). Липсата на регулирана експресия 35 на IGF-I в епител на простата, води до неоплазия в трансгенни мишки (DiGiovanni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3455-60,2000). В допълнение, изглежда, че IGF-I е автокринен стимулатор на човешките глиоми (Sandberg-Nordqvist et aL, 40 Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), докато IGF-I стимулира растежа на фибросаркомите, които свръхекспресират IGF-IR (Butler et al., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). По-нататък индивиди c високо нормални нива на IGF-I са с повишен 45 риск за общи ракови заболявания, в сравнение с индивиди с нива на IGF-I в ниско нормалния обхват (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Много от тези туморни клетъчни типове отговарят на IGF-1 с пролифе50 ративен сигнал в култура (Nakanishi et al., J. Clin.
66460 Bl
Invest. 82: 354-359, 1988; Freed et al., J. Mol. Endocrinol. 3:509-514,1989) и постулират in vivo автокринни или паракринни обратни връзки за пролиферация (LeRoith et al., Endocrine Revs. 16: 143-163,1995; Yee et al., Mol. Endocrinol. 3: 509514, 1989). За преглед на ролята на 1GF-I рецептора за IGF-I взаимодействията, с която те участват при растежа на много човешки тумори, виж Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
Повишените нива на IGF-1, също корелират с някои не-ракови патологични състояния, включващи акромегалия и гигантизъм (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), докато анормалната функция на IGF-1/рецептора за IGF-1 участва при псориазис (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), атеросклероза и гладкомускулна рестеноза на кръвоносните съдове, последвана от ангиопластия (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Повишените нива на IGF-1 също могат да са проблем при диабет или при негови усложнения, такива като микроваскуларна пролиферация (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Понижените нива на IGF-1, които се появяват между другото, в случаите когато серумните нива на GH са понижени или когато се наблюдава нечувствителност или резистентност към GH, са свързани с такива нарушения като нисък ръст (Laron, Paediatr. Drugs 1:155-159,1999), невропатия, намалена мускулна маса и остеопороза (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
Показано е, чрез използването на антисенс експресионни вектори или антисенс олигонуклеотиди към IGF-IR РНК, че намесата на IGFIR води до инхибиране на IGF-I-медиирания или IGF-11-медиирания клетъчен растеж (виж, например Wraight et al., Nat. Biotech. 18:521-526, 2000). Антисенс стратегията е успешна за инхибиране на клетъчна пролиферация в някои нормални клетъчни типове и човешки туморни клетъчни линии. Растежът също може да се инхибира, като се използват пептидни аналози на IGF-I (Pietrzkowski et al., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992; and Pietrzkowski et al., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992) или вектор, експресиращ антисенс РНК към 1GF-1 РНК (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). В допълнение, антитела срещу IGF-IR (Arteaga et al., Breast Cane. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992; и Kalebic et al., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) и негативни доминантни мутанти на IGF-IR (Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 2181-2185, 1994; Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 and Jiang et al., Oncogene 18:6071-77,1999) могат да анулират трансформирания фенотип, да инхибират туморогенезата и да индуцират загуба на метастатичния фенотип.
Също така, IGF-I е важен за регулирането на апоптозата. Апоптозата, която е програмирана клетъчна смърт, участва в много процеси, свързани с развитието, включващи зреенето на имунната и нервната система. В допълнение на нейната роля за развитието, апоптозата също участва като важен клетъчен защитник срещу туморогенеза (Williams, Cell 65:1097-1098,1991; Lane, Nature 362: 786787, 1993). Потискането на програмата заапоптоза, чрез много генетични увреждания, може да допринесе до малигнено развитие и прогресия.
IGF-I защитава от апоптоза, индуцирана от намаляването на цитокини в 1L-3 зависимите хемопоетични клетки (Rodriguez-Tarduchy, G. et al., J. Immunol. 149: 535540, 1992) и от липса на серум в Rat-1/mycER клетки (Harrington, Е., et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). Антиапоптозната функция на IGF-I е важна за етапа от клетъчния цикъл, след предаване на сигнала и също в клетки с блокиран клетъчен цикъл, чрез етопозид или тимидин. Демонстрирането, че с-тус инициираните фибробласти, са зависими от IGF-I за тяхното оцеляване предполага, че има важна роля за IGF-IR при поддържането на туморните клетки, чрез специфично инхибиране на апоптозата, което е роля, различна от пролиферативните ефекти на IGF-I или IGF-IR. Това може да е подобно на ролята, която се счита, че играе, чрез други антиапоптозни гени, такива като bcl-2 за подпомагане на туморната преживяемост (McDonnell et al., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry et aL, Nature 348: 334-336, 1990).
Защитните ефекти на IGF-I върху апоптозата зависят от присъствието на IGF-IR върху клетки, за да взаимодействат с IGF-1 (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Осигурена е също така, подкрепа за антиапоптозна функция на IGF-IR при поддържането на туморните клетки, чрез изследване, което използва антисенс олигонуклеотиди към IGFIR, което идентифицира количествена връзка между нивата на IGF-IR, степента на апоптоза и туморогенния потенциал на плъши сингенен тумор (Rescinoffet al., Cancer Res. 55:3739-3741, 1995). Намерено е, че свръхекспресията на IGFIR защитава туморните клетки in vitro от 5 етопозид-индуцирана апоптоза (Sell et al., Cancer Res. 55: 303-306, 1995) и още повече, че намаляването на нивата IGF-IR под тези, характерни за дивия тип, води до масивна апоптоза на туморните клетки in vivo (Resnicoff 10 et al., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Потенциални стратегии за индуциране на апоптоза или за инхибиране на клетъчната пролиферация, свързана с повишаване на IGFI, повишаване на IGF-II и/или повишаване на нивата на рецептора 1GF-IR, включват потискане на нивата на IGF-I или нивата на IGF-II или предотвратяване на свързването на IGF-I с IGFIR. Например, използван е дълго-действащия соматостатинов аналог октреотид за редуциране 20 на IGF синтезата и/или секрецията. Използва се разтворим IGF-IR за индуциране на апоптоза в туморни клетки in vivo и за инхибиране на туморогенезата в експериментална животинска система (D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56:4013- 25 20, 1996). В допълнение, се използват IGF-IR антисенс олигонуклеотиди, пептидни аналози на IGF-I и антитела срещу 1GF-1R, за намаляване на експресията на IGF-I или IGF-IR (виж погоре). Нито едно от тези съединения, обаче, не е 30 подходящо за прилагане на хора за по-дълъг период от време. Също така, въпреки че IGF-I се прилага на пациенти за лечение на нисък ръст, остеопороза, намалена мускулна маса, невропатия или диабет, свързването на IGF-I с 35 IGFBPs често може да доведе до трудности или неефективност на лечението с IGF-I.
Съгласно и в светлината на значенията на IGF-I и 1GF-IR, които имат при такива нарушения, като рак и други пролиферативни 40 нарушения, когато IGF-I и/или IGF-IR са свръхекспресирани и значенията в случаите, когато нивата на IGF-I и IGF-IR са много ниски, при нарушения, такива като нисък ръст и слабост, когато или IGF-1 и/или IGF-IR са експресирани 45 в по-ниски нива, ще бъде желателно да се създадат антитела срещу IGF-IR, които могат да бъдат използвани или за инхибирането или за стимулирането на IGF-IR. Въпреки, че е съобщено че анти-IGF-IR антителата са намерени
В1 в определени пациенти с автоимунни заболявания, нито едно от тези антитела не е пречистено и за нито едно не е показано, че е подходящо за инхибиране на активността на 1GFI, за диагностика или клинични процедури. Виж, например Thompson et al., Pediat. Res. 32:455459, 1988; Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightmanetai., Autoimmunity 16:251-257,1993; Drexhage et al., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994. Следователно е желателно, да се получат високо-афинитетни човешки анти-IGF-IR антитела, които биха могли да се използват за лечение на заболявания при хора.
Кратко описание на фигурите
Фигури 1А-1С показват съпоставяне на нуклеотидните секвенции на вариабилните области на леката верига от шест човешки антиIGF-IR антитела, една спрямо друга и спрямо секвенциите на родителската линия. Фигура 1А показва съпоставянето на нуклеотидните секвенции на вариабилната област на леката верига (VL) на антитела 2.12.1 (SEQ ID NO: 1), 2.13.2 (SEQ ID NO: 5), 2.14.3 (SEQ ID NO: 9) и 4.9.2 (SEQ ID NO: 13) една спрямо друга, и спрямо секвенцията на родителската линия Vk А30 (SEQ ID NO: 39).
Фигура IB показва съпоставяне на нуклеотидната секвенция на VL от антитяло 4.17.3 (SEQ ID NO: 17) спрямо секвенцията на родителската линия Vk О 12 (SEQ ID NO: 41).
Фигура IC показва съпоставянето на нуклеотидната секвенция на VL на антитяло 6.1.1 (SEQ ID NO: 21) спрямо секвенцията на родителската линия Vk А27 (SEQ ID NO: 37). Съпоставянията, показват също така областите CDR от VL от всяко антитяло. Консенсусните секвенции на Фигури 1А - 1С са показани съответно в SEQ ID NOS: 53-55.
Фигури 2A-2D показват, съпоставяния на нуклеотидните секвенции от вариабилните области на тежката верига от шест човешки антиIGF-IR антитела, една спрямо друга и спрямо секвенциите на родителската линия.
Фигура 2А показва съпоставянето на нуклеотидната секвенция на VH от антитяло 2.12.1 (SEQ ID NO: 3) спрямо секвенцията на родителската линия VH DP-35 (SEQ ID NO: 29).
Фигура 2В показва съпоставянето в на 5θ нуклеотидната секвенция на VH от антитяло 2.14.3
- ·. - ·. жтя!№|^<^£гаййШ>^!?!|А*Я>)Уц&М1^Х1Й№ЖИЗ-ВНЯ^*«и^>^|ЙМ;*^!ЗИ8ВД '
66460 Bl (SEQ ID NO: 11) спрямо секвенцията на родителската линия VIV-4/4.35 (SEQ ID NO: 43). Фигури 2C-1 и 2С-2 показват съпоставянето на нуклеотидната секвенция на VH от антитела 2.13.2 (SEQ ID NO: 7), 4.9.2 (SEQ ID NO: 15) и 6.1.1 5 (SEQ ID NO: 23) една спрямо друга и спрямо секвенцията на родителската линия VH DP-47 (SEQ ID NO: 31). Фигура 2D показва съпоставянето на нуклеотидната секвенция на VH от антитяло 4.17.3 (SEQ ID NO: 19) спрямо 10 секвенцията на родителската линия VH DP-71 (SEQ ID NO: 35). Съпоставянето, също показва областите CDR на антителата. Консенсусните секвенции на Фигури 2A-2D са показани съответно в SEQ ID NOS: 56-59. 15
Фигура 3 показва, че анти-IGF-IR антителата 2.13.2, 4.9.2 и 2.12.1 инхибират свързването на IGF-I с 3T3-IGF-IR клетки.
Фигура 4 показва, че анти-IGF-IR антитялото 4.9.2 инхибира IGF-1-рецептор 20 индуцираното тирозиново фосфорилиране (горен панел) и индуцира намаляването на IGF-IR на клетъчната повърхност (долен панел).
Фигура 5 показва, че анти-IGF-IR антителата 2.13.2 и 4.9.2 редуцират IGF-IR 25 фосфотирозиновия сигнал в 3T3-IGF-IR тумори.
Фигура 6 показва, че анти-IGF-IR антителата 2.13.2 и 4.9.2 редуцират IGF-IR в ЗТЗIGF-IR тумори.
Фигура 7 показва, че анти-IGF-IR 30 антитялото 2.13.2 само потиска ту морния растеж на 3T3-IGF-IR in vivo (ляв панел) или в комбинация с адриамицин (десен панел).
Фигура 8 показва връзката между серумните нива на анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 35 и намаляването на IGF-IR в 3T3-IGF-IR тумори.
Фигура 9 показва, че многократни дози от анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 само потиска туморния растеж на 3T3-IGF-IR in vivo или в комбинация с адриамицин. 40
Фигура 10 показва, че анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 инхибира в голяма степен туморния растеж in vivo в комбинация с адриамицин.
Фигура 11 показва, че анти-IGF-IR 45 антитялото 2.13.2 само инхибира Colo 205 туморния растеж in vivo или в комбинация с 5дезоксиуридин (5-FU).
Фигура 12 показва, че многократни дози отанти-IGF-IRантитялото 2.13.2 само инхибира 50
Colo 205 туморния растеж in vivo или в комбинация с 5-FU.
Фигура 13 показва, че многократни дози от анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 само инхибира MCF-7 туморния растеж in vivo или в комбинация с таксол.
Фигура 14 показва, че анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 само инхибира MCF-7 туморния растеж in vivo (ляв панел) или в комбинация с адриамицин (десен панел).
Фигура 15 показва, че многократни дози от анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 само инхибира MCF-7 туморния растеж in vivo или в комбинация с тамоксифен.
Фигура 16 показва, че многократни дози от анти-IGF-IR антитялото 2.13.2 само инхибира А431 туморния растеж in vivo или в комбинация с тирозин киназен инхибитор СР - 358, 774 на рецептора за епидермалния растежен фактор (EGF-R).
Фигура 17 показва фармакокинетична оценка на единична интравенозна инжекция на анти-IGF-IR антитяло 2.13.2 в маймуни Cynomologus.
Фигура 18 показва, че комбинацията на анти-IGF-IR антитяло 2.13.2 и адриамицин, повишава намаляването на IGF-IR върху ЗТЗIGF-IR тумори in vivo.
Фигура 19А показва, броят на мутациите в различни области от тежката и лека вериги на 2.13.2 и 2.12.1 сравнени със секвенцията на родителската линия.
Фигури 19A-D показват съпоставяне на аминокиселинните секвенции от тежката и леки вериги на антитела 2.13.2 и 2.12.1 със секвенциите на родителската линия от която те са получени. Фигура 19 В показва съпоставяне на аминокиселинната секвенция на тежката верига на антитяло 2.13.2 (SEQ ID NO: 45) с тази от секвенцията на родителската линия DP47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEQ ID NO: 46). Фигура 19C показва съпоставяне на аминокиселинната секвенция на леката верига на антитялото 2.13.2 (SEQ ID NO: 47) с тази на секвенцията на родителската линия A30/Jk2 (SEQ ID NO: 48). Фигура 19D показва съпоставяне на аминокиселинната секвенция на тежката верига на антитялото 2.12.1 (SEQ ID NO: 49) с тази на секвенцията на родителската линия DP-35 (31 l)/D3-3/JH6 (SEQ ID NO: 50).
66460 Bl
Фигура 19E показва съпоставяне на аминокиселинната секвенция на леката верига на антитялото 2.12.1 (SEQ ID NO: 51) с тази на секвенцията на родителската линия АЗО/Jkl (SEQ ID NO: 52). За Фигури 19 В-Е, сигналните секвенции са дадени е итализиран шрифт, CDRs са подчертани, вариабилните домени са с удебелен шрифт, рамките (FR) на мутациите са маркирани със знака плюс (+) над аминокиселинния остатък и CDR мутациите са маркирани със звездичка над аминокиселинния остатък.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение осигурява изолирано антитяло или негова антигенсвързваща част, която свързва IGF-IR, предимно такова, което свързва IGF-IR на примат и човек, а за предпочитане такова, което е човешко. Изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което инхибира свързването на IGF-I или IGFII е IGF-IR и също така осигурява анти-IGF-IR антитяло, което активира 1GF-IR.
Изобретението осигурява фармацевтичен състав, включващ антитялото и фармацевтично приемлив носител. Фармацевтичният състав може по-нататък да включва друг компонент, такъв като антитуморно средство или реагент за онагледяване.
Изобретението също така, осигурява методи за диагностика и терапия. Методите за диагностика включват метод за диагностика за присъствието или локализацията на IGF-IR тъканната експресия, чрез използването на антиIGF-IR антитяло. Терапевтичен метод, включва прилагането на антитялото на лице, което се нуждае от него, предимно във връзка с прилагането на друго терапевтично средство.
Изобретението осигурява изолирана клетъчна линия, такава като хибридома, която продуцира анти-IGF-IR антитяло.
Изобретението осигурява също така молекули нуклеинови киселини, кодиращи тежката и/или леката верига или антигенсвързващите техни части на анти-IGF-IR антитяло. Изобретението осигурява вектори и клетки-гостоприемници, включващи молекулите нуклеинова киселина, а също така и методи за получаване по рекомбинантен път на поли пептиди, кодирани от молекулите нуклеинова киселина.
Осигурени са също така трансгенни животни, различни от човек които експресират тежката и/или лека верига или техни антигенсвързващи части на анти-IGF-IR антитяло. Изобретението също така, осигурява метод за лечение на лице, което се нуждае от него с ефективно количество молекула нуклеинова киселина, кодираща тежката и/или леката верига или антиген-свързващите техни части на антиIGF-IR антитяло.
Подробно описание на изобретението
Определения и общоприети техники
Ако не е дефинирано тук нещо друго, научните и техническите термини, използвани във връзка с настоящото изобретение, ще имат значенията, които обикновено са разбираеми за специалистите в областта от нивото на техниката. По-нататък, освен ако не се изисква друго във връзка с контекста, термините в единствено число ще включват и множествено число и термините в множествено число, ще включват единствено число. Най-общо, номенклатурите, използвани във връзка със, и техниките за, клетъчна и тъканна култура, молекулярна биология, имунология, микробиология, генетика и химия на белтък и нуклеинова киселина, и хибридизация, описани тук, са общоприети и добре известни от нивото на техниката. Методите и техниките от настоящото изобретение обикновено се изпълняват съгласно конвенционалните методи, добре известни от нивото на техниката и както са описани в различни общоприети и по-специфични справки, които са изцяло цитирани и дискутирани в настоящата спецификация, освен ако не е означено друго. Виж например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), и Harlow и Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990), които са въведени тук, чрез цитираната литература.
Ензимните реакции и техниките за пре
66460 Bl чистване се изпълняват съгласно спецификациите на производителя, като обикновено са извършвани в областта на техниката или, както е описано тук. Номенклатурите използвани тук във връзка с лабораторните методи и техники на 5 аналитичната химия, синтетичната органична химия и медицинската и фармацевтичната химия, описани тук са тези добре известни и обикновено използвани от нивото на техниката. Използвани са стандартни техники за химични синтези, 10 химични анализи, фармацевтични препарати, формулировки и доставяне и лечение на пациенти.
Освен ако не са означени по друг начин, следните термини ще се разбират със следните 15 значения.
Терминът полипептид обхваща нативни или изкуствени белтъци, фрагменти от белтъци и полипептидни аналози на белтъчна секвенция. Полипептид може да бъде мономерен или 20 полимерен.
Терминът изолиран белтък или изолиран полипептид е белтък или полипептид, който въз основа на неговия произход или източник на получаване: (1) не е свързан с естествено 25 свързаните компоненти, които го съпровождат в неговото нативно състояние, (2) е свободен от други белтъци от същия вид, (3) е експресиран от клетка от различен вид, или (4) не се среща в природата. Следователно, полипептидът, който е 30 химично синтезиран или синтезиран в клетъчна система, различна от клетката, от която той естествено произхожда ще бъде изолиран от неговите естествено свързани компоненти. Белтък, може също така да се счита по същество 3 5 свободен от естествено свързани компоненти, чрез изолиране, чрез използването на техники за пречистване на белтък, добре известни от нивото на техниката.
Белтък или полипептид е фактически 40 чист, фактически хомогенен или фактически пречистен, когато най-малко около 60 до 75 % от пробата показва единичен вид от полипептида. Полипептидът или белтъкът може да бъде мономерен или мултимерен. Фактически чист 45 полипептид или белтък обикновено ще включва около 50 %, 60 %, 70 %, 80 % или 90 % W/W от белтъчна проба, по-добре обикновено около 95 % и най-добре ще бъде с чистота над 99 %. Чистотата на белтъка или хомогенността може да 50 е показана чрез няколко начина, добре известни от нивото на техниката, такива като електрофореза на белтъчна проба върху полиакриламиден гел, последвана от визуализиране на единична полипептидна ивица, чрез оцветяване на гела е оцветител, добре известен от нивото на техниката. За определени цели, по-висока степен на разделяне може да се осигури, чрез използването на HPLC или други средства за пречистване, добре известни от нивото на техниката.
Терминът полипептиден фрагмент, както се използва тук, се отнася до полипептид, който има делеция в амино-края и/или в карбоксилния край, но където останалата аминокиселинна секвенция е идентична със съответните позиции в естествено срещащата се секвенция. Фрагментите обикновено са дълги най-малко 5, 6, 8 или 10 аминокиселини, за предпочитане с дължина най-малко 14 аминокиселини, а найдобре с дължина най-малко 20 аминокиселини, обикновено с дължина най-малко 50 аминокиселини, а най-добре с дължина наймалко 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокиселини.
Както се използва тук, терминът полипептиден аналог се отнася до полипептид, който включва сегмент, дълъг най-малко 25 аминокиселини, който е по същество идентичен с част от аминокиселинната секвенция и който има най-малко една от следните характеристики: (1) при подходящи условия за свързване, се свързва специфично с IGF-1R (2) способност да блокира свързването на IGF-I или IGF-II с IGF-1R, или (3) способност да редуцира in vitro или in vivo експресията върху клетъчната повърхност на IGF-IR, или тирозиновото фосфорилиране. Обикновено полипептидните аналози включват консервативно аминокиселинно заместване (или въвеждане или делеция) по отношение на естествено срещащата се секвенция. Обикновено аналозите са дълги най-малко 20 аминокиселини, по-добре е да са най-малко дълги 50, 60, 70, 80,90, 100, 150 или 200 аминокиселини, или по-дълги и често могат да бъдат толкова дълги, колкото естествено срещащия се полипептид.
Предпочитани аминокиселинни замествания са тези, които: (1) редуцират предразположението към протеолиза, (2) о
66460 Bl редуцират предразположението към окисление, (3) променят афинитета към образуване на белтъчни комплекси, (4) променят афинитетите на свързване и (4) придават или модифицират други физикохимични или функционални свойства на тези аналози. Аналозите могат да включват различни мутеини на секвенция, различна от секвенцията на естествено появилия се пептид. Например, единични или множествени аминокиселинни замествания (предимно консервативни аминокиселинни замествания) могат да се направят в естествено възникналата секвенция (предимно в участък от полипептида, който е извън домена (домените), образуващи вътремолекулни контакти. Консервативното аминокиселинно заместване не трябва да променя по същество структурните характеристики на родителската секвенция (например, заместването на аминокиселината не трябва да има способност да разруши спиралата, която присъства в родителската секвенция, или да разруши други типове вторична структура, които характеризират родителската секвенция). Примери за изкуствено разпозната полипептидна вторична и третична структура са описани в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman и Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden и J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); и Thornton et al. Nature 354: 105 (1991), всеки от които са въведени тук, чрез цитираната литература.
Непептидните аналози, често се използват във фармацевтичната индустрия като лекарствени препарати с качества аналогични на тези на пептида - матрица. Тези типове непептидни съединения са наречени пептидни имитатори или пептидо-имитатори. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber и Freidinger TINS p. 392 (1985); и Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), които са въведени тук, чрез цитираната литература. Такива съединения, често са разработени с помощта на компютърно молекулно моделиране. Пептидните имитатори, които са структурно подобни на терапевтично използваните пептиди могат да се използват за получаването на еквивалентен терапевтичен или профилактичен ефект. Обикновено пептидоимитаторът е структурно подобен на полипептида парадигма (т.е. полипептида, който има желаните биохимична или фармакологична активност), такъв като човешко антитяло, но което има една или повече пептидни връзки, заместени по избор с връзка, избрана от групата, включваща, -СН25 NH2-,-CH2-S-, - СН2-СН2-, -СН=СН- (cis и trans), -СОСН2-,-СН (OH) СН2- и -CH2SO-, чрез методи добре известни от нивото на техниката. Също така, може да се използва систематично заместване на една или повече 10 аминокиселини от консенсусната секвенция с Dаминокиселина от същия тип (например, Dлизин, вместо L-лизин), за да се създадат постабилни пептиди. В допълнение, нарушаването на пептидите включва консенсусна секвенция 15 или по същество може да бъде създадена вариация на идентична консенсусна секвенция, чрез методите известни от нивото на техниката (Rizo и Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), въведени тук чрез цитираната 20 литература); например, чрез добавяне на вътрешни цистеинови остатъци, способни да образуват вътремолекулни дисулфидни връзки, които да направят пептида цикличен.
Имуноглобулинът е тетрамерна моле25 кула. В естествено срещащите се имуноглобулини, всеки тетрамер е съставен от две идентични части от полипептидните вериги, като всяка двойка има една лека (около 25 kDa) и една тежка верига (около 50-70 kDa). Амино30 крайната част на всяка верига включва вариабилна област от около 100 до 110 или повече аминокиселини, отговорни предимно за антигенното разпознаване. Участъкът на карбоксилния край на всяка верига определя 35 константната област, отговорна преди всичко за ефекторната функция. Човешките леки вериги са класифицирани като к и λ, леки вериги. Тежките вериги са класифицирани като μ, Δ , γ , а или и определят изотипа на антитялото, такъв като 40 съответно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В леката и тежка вериги, вариабилните и константните области са свързани с J област от около 12 или повече аминокиселини, с тежката верига, включваща също така D област от около още 45 10 аминокиселини. Виж най-общо, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (въведен тук, изцяло чрез цитираната литература, за всякакви цели). Вариабилните области на всяка двойка лека/ 50 тежка вериги формират антитяло-свързващото
66460 Bl място, така че интактния имуноглобулин има две свързващи места.
Имуноглобулиновите вериги показват същата обща структура на относително консервативните оградени в области рамка (FR), свързани чрез три хипер-вариабилни области, също така наречени комплементарно детерминиращи области CDRs. CDRs от двете вериги на всяка двойка се съпоставят, чрез очертаните области, които позволяват свързването със специфичен епитоп. От N-края до С-края, и двете и леката и тежката вериги, включват домените FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Означението на аминокиселините за всеки домен е съгласно определенията на Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia& Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).
Антитяло се отнася до интактен имуноглобулин или до негова антиген-свързваща част, който се конкурира с интактното антитяло за специфично свързване. Антиген-свързващи части могат да се получат, чрез рекомбинантни ДНК техники или чрез ензимно или химично разграждане на интактни антитела. Антигенсвързващите части включват, между другото, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, dAb и фрагменти на комплементарна детерминираща област (CDR), едноверижни антитела (scFv), химерни антитела, двойни антитела и полипептиди, които съдържат най-малко част от имуноглобулина, която е достатъчна за да доведе до специфично свързване на антигена с полипептида.
Както се използва тук, антитяло, което се отнася до такива, като например 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1 е антитяло, което е получено от хибридома със същото име. Например, антитяло 2.12.1 е получено от хибридома 2.12.1.
Fab фрагмент е моновалентен фрагмент, включващ VL, VH, CL и CH I домени; F (ab')2 фрагмент е двувалентен фрагмент, включващ два Fab фрагмента, свързани чрез дисулфиден мост в шарнирната област; Fd фрагмент, включва VH и СН1 домени; Fv фрагмент, включва VL и VH домени от едното рамо от антитяло; и dAb фрагмент (Ward et al., Nature 341: 544-546,1989) включва VH домен.
Едноверижно антитяло (scFv) е антитяло, в което VL и VH областите са сдвоени, за да се образуват моновалентни молекули, чрез синтетичен линкер, който им позволява да направят единична белтъчна верига (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Двойните антитела са двувалентни, двойно специфични антитела, в които VH и VL домените се експресират върху една полипептидна верига, но чрез използване на линкер, който е много къс, за да позволи сдвояването между два домена на същата верига и по този начин насочва домените да се сдвоят с комплементарните домени от друга верига и така създават две антиген-свързващи места (виж например, Holliger, Р., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, и Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). Един или повече CDRs могат да бъдат ковалентно или нековалентно въведени в молекула, която го прави имуноадхезин. Имуноадхезин може да инкорпорира CDR(s) като част от по-голяма полипептидна верига, може ковалентно да се свърже със CDR(s) от друга полипептидна верига или може нековалентно да въведе CDR(s). CDRs позволяват на имуноадхезина да се свърже специфично към определен интересуващ ни антиген.
Антитяло може да има едно или повече свързващи места. Ако са повече от едно свързващо място, свързващите места могат да са идентични едно с друго или може да са различни. Например, естествено срещащ се имуноглобулин има две идентични свързващи места, едноверижно антитяло или Fab фрагмент има едно свързващо място, докато двойно специфичното и двойно функционалното антитяло има две различни свързващи места.
Изолирано антитяло е антитяло, което (1) не е свързано с естествено асоциирани компоненти, включващи други естествено асоциирани антитела, които съпровождат неговото нативно състояние, (2) е свободно от други белтъци от същите видове, (3) се експресира от клетка от различни видове, или (4) не се среща в природата.
Примери за изолирани антитела, включват анти-IGF-IR антитяло, което е афинитетно пречистено, чрез използване на IGF-IR и е изолирано антитяло, анти-IGF-IR антитяло, което e in vitro синтезирано от хибридома или друга клетъчна линия и човешко анти-IGF-IR антитяло, получено от трансгенна мишка.
Терминът човешко антитяло включва всички антитела, които имат една или повече вариабилни и константни области, получени от секвенции на човешки имуноглобулин.
В предпочитан вариант, всички вариабилни и константни домени са получени от секвенции на човешки имуноглобулин (напълно човешко антитяло). Тези антитела могат да бъдат получени по различни начини, както е описано по-долу.
Антитяло, наподобяващо човешко антитяло, е антитяло, което е получено от видове, различни от човек, в което определени аминокиселини в рамката и константните домени на тежката и леката верига, са мутирали, така че да се избегне или неутрализира имунния отговор в хора. От друга страна, антитялото наподобяващо човешко антитяло, може да се получи чрез свързване по рекомбинантен път на константни домени от човешко антитяло, с вариабилните домени на видове, различни от човек. Примери, затова как се получават антитела, наподобяващи човешките антитела могат да се намерят в United States Патенти Номера: 6,054,297, 5,886,152 и 5,877,293.
Терминът химерно антитяло се отнася до антитяло, което съдържа една или повече области от едно антитяло и една или повече области от едно или повече други антитела. В предпочитан вариант един или повече от CDRs са получени от човешко анти-IGF-IR антитяло. В попредпочитан вариант, всички CDRs са получени от човешко анти-IGF-IR антитяло. В друг 35 предпочитан вариант, CDRs от повече от едно човешко анти-IGF-IR антитела са смесени и съчетани в химерно антитяло. Например, химерно антитяло може да включва CDR1 от леката верига на първото човешко анти-IGF-IR антитяло, която 40 може да се комбинира с CDR2 и CDR3 от леката верига на второ човешко анти-IGF-IR антитяло и CDRs от тежката верига могат да се получат от трето анти-IGF-IR антитяло. По-нататък, ограничените области могат да се получат от едно 45 от същите анти-IGF-IR антитела, от едно или повече различни антитела, такива като човешко антитяло, или от антитяло, наподобяващо човешките антитела.
Неутрализиращо антитяло или
460 В1 инхибиращо антитяло е антитяло, което инхибира свързването на IGF-IR с IGF-I, където излишъка от анти-IGF-IR антитялото редуцира количеството на IGF-I свързан с 1GF-1R, най 5 малко с около 20 %. В предпочитан вариант, антитялото редуцира количеството на IGF-I свързан с 1GF-IR най малко с около 40 %, за предпочитане с 60 % и даже още по-добре с 80 %, или даже най-добре с 85 %. Редукцията в 10 свързването може да се измери, чрез което и да е средство известно на специалист от нивото на техниката, например както се измерва в анализ за in vitro конкурентно свързване. Пример за измерване на редукцията на свързването на IGF15 I с IGF-IR е представен по-долу в Пример IV.
Активиращо антитяло е антитяло, което активира IGF-IR най-малко с около 20 %, когато е добавено към клетка, тъкан или организъм, експресиращ IGF-IR. В предпочитан вариант, 20 антитялото активира активността на IGF-IR наймалко с около 40 %, още по-добре с 60 %, даже по-добре с 80 %, или даже най-добре с 85 %. В по-предпочитан вариант, активиращото антитяло се добавя в присъствието на 1GF-I или IGF-II. В 25 друг предпочитан вариант, активността на активиращото антитяло се измерва, чрез определяне на количеството на тирозиново автофосфорилиране на IGF-IR.
Фрагменти или аналози от антителата могат да бъдат приготвени веднага от специалистите от нивото на техниката, съгласно ръководствата на тази спецификация. Предпочитани фрагменти на амино- и карбоксилни краища или аналози, се срещат близо до границите на функционалните домени. Структурни и функционални домени могат да бъдат идентифицирани, чрез сравняване на данни от нуклеотидна и/или аминокиселинна секвенция, с такива публикувани в общоприети и специфични бази данни. За предпочитане, компютризираните методи за сравнение се използват, за да се идентифицират секвенционни мотиви или предсказани конформации на домени на белтъци, които се срещат в други белтъци с известна структура и/или функция. Известни са методи за идентифициране на белтъчни секвенции, които имат известна нагъната триизмерна структура. Bowie et al. Science 253: 164 (1991).
Терминът повърхностен плазмон резонанс, както се използва тук се отнася до оптично
1
66460 Bl явление, което позволява анализ на real-time биоспецифични взаимодействия, чрез детекция на промени в белтъчните концентрации в обхвата на биосензорен матрикс, например чрез използване на система BlAcore (Pharmacia Bio- 5 sensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N. J.). За последващи описания, виж Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627;
Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125- 10 131; и Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Терминът Koff се отнася до константа на забавянето на скоростта на разпадане на антитялото от комплекса антиген/антитяло. 15
Терминът Kd се отнася до константа на дисоцииране на определено взаимодействие антитяло-антиген.
Терминът епитоп включва всяка една белтъчна детерминанта, способна да се свърже 20 специфично с имуноглобулин или Т-клетъчен рецептор. Епитопните детерминанти обикновено се състоят от химично активни повърхностни групировки от молекули, такива като аминокиселинни или странични вериги на захари, и 25 обикновено имат специфични триизмерно структурни характеристики, така както и специфични характеристики на заряда. Казва се, че антитялото се свързва специфично с антиген, когато дисоциационната константа е < 1 microM, за предпо- 30 читане < 100 microM и най-добре < 10 пМ.
Както се използват тук, двадесетте конвенционални аминокиселини и техните съкращения се използват съгласно конвенционалната употреба. Виж, Immunology-A Synthesis (2nd Edition, 35 Е. S. Golub и D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), която е въведена тук, чрез цитираната литература. Стереоизомери (например, D-аминокиселини) от двадесетте конвенционални аминокиселини, неестествените 40 аминокиселини, такива като алфа-, алфа-двойно заместените аминокиселини, N-алкил аминокиселините, млечната киселина и други неконвенционални аминокиселини, могат също така да бъдат подходящи компоненти за полипептидите 45 от настоящото изобретение. Примери за неконвенционални аминокиселини включват: 4хидроксипролин, гама-карбоксиглутамат, епсилон-N, N, N-триметиллизин, епсилон-Nацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N- 50 формилметионин, 3-метилхистидин, 5хидроксилизин, епсилон-Я-метиларгинин и други подобни аминокиселини и иминокиселини (например 4-хидроксипролин). При означенията на полипептидите, използвани тук вляво се разполага амино-края, а в дясно карбоксилният край, съгласно използвания стандарт и конвенция.
Терминът полинуклеотид тук се отнася за да означи полимерна форма нуклеотиди с дължина най-малко 10 бази, или рибонуклеотиди, или дезоксирибонуклеотиди или модифицирана форма на всеки един тип нуклеотид. Терминът включва едноверижна или двойноверижна форма ДНК.
Терминът изолиран полинуклеотид, както се използва тук ще означава полинуклеотид от геномна, кДНК или със синтетичен произход или някаква тяхна комбинация, като в зависимост от нейния произход изолираният полинуклеотид (1) не е свързан с целия или част от полинуклеотида, в който изолираният полинуклеотид е намерен в природата, (2) е свързан по оперативен път с полинуклеотид, който не е свързан по природа, или (3) не се среща по природа като част от по-голяма секвенция.
Терминът олигонуклеотид както се отнася тук, включва естествено срещащи се и модифицирани нуклеотиди, свързани заедно чрез естествено срещащи се и неестествено срещащи се олигонуклеотидни връзки. Олигонуклеотидите са полинуклеотидни подтипове, които обикновено включват дължина до 200 бази или по-малко. Предимно олигонуклеотидите са с дължина 10 до 60 бази, аощепо-добре 12,13,14,15, 16, 17, 18,19 или 20 до 40 бази. Олигонуклеотидите обикновено са от една верига, например за сонди; въпреки че олигонуклеотидите могат да бъдат двойно верижни, например за конструиране на мутантен ген. Олигонуклеотидите от изобретението могат да бъдат или сенс или антисенс олигонуклеотиди.
Терминът естествено срещащи се нуклеотиди, както се отнася тук, включва дезоксирибонуклеотиди и рибонуклеотиди. Терминът модифицирани нуклеотиди както се отнася тук включва нуклеотиди с модифицирани или заместени захарни групи и други подобни.
о
Терминът олигонуклеотидни връзки, както се отнася тук, включва олигонуклеотидни, такива като фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфороаниладат, фосфороамидат и други подобни. Виж, например LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Патент No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), описанията на всяко от които са включени тук, чрез цитираната литература. Ако е желателно, олигонуклеотидът може да включва белег за детекция.
Секвенции свързани по оперативен път, включват както секвенции контролиращи експресията, които са в близост до интересуващия ни ген, така и такива, които контролират in trans или отдалече, интересуващия ни ген. Използваният тук термин секвенции контролиращи експресията, се отнася до полинуклео- 25 тидни секвенции, които са необходими да окажат ефект върху експресията и зреенето на кодиращите секвенции, към които те са лигирани. Секвенциите, контролиращи експресията, включват подходящи инициатори на 30 транскрипцията, терминацията, промоторни и енхансерни секвенции; сигнали за ефективно зреене на РНК, такива като сигнали за сплайсинг или полиаденилиране; секвенции, които стабилизират цитоплазмената иРНК; секвенции, 35 които повишават ефективността на транслацията (т.е. Kozak консенсусна секвенция); секвенции, които повишават стабилност на белтъка; и когато е необходимо, секвенции, които повишават секрецията на белтъка. Природата на такива 40 контролиращи секвенции е различна, в зависимост от организма гостоприемник; в прокариотите, такива контролиращи секвенции обикновено включват промотор, рибозомно свързващо място и секвенция отговорна за прекратяване на транскрипцията; в еукариотите, обикновено такива контролиращи секвенции включват промотори и секвенция, отговорна за прекратяване на транскрипцията. Терминът контролиращи секвенции има за цел да включи,
460 В1 най-малко всички компоненти, които присъстват и са съществени за експресията и зреенето, и които също могат да включат допълнителни компоненти, чието присъствие е предимство, 5 например лидерни секвенции и секвенции, съпровождащи рекомбинантното свързване.
Терминът вектор, както се използва тук, има за цел да включи молекула нуклеинова киселина, способна да транспортира друга 10 нуклеинова киселина, към която тя е прикрепена. Един тип вектор е плазмид, който се отнася до кръгова, двойно верижна ДНК примковидна структура, към която могат да бъдат лигирани допълнителни ДНК сегменти. Друг тип вектор е 15 вирусен вектор, където допълнителните ДНК сегменти могат да бъдат лигирани във вирусния геном.
Определени типове вектори са способни на автономна репликация в клетка гостоприемник, в която те се въвеждат (например, бактериални вектори, които имат начало на репликация, характерно за бактериалните клетки и епизомални вектори, характерни за бозайници). Други вектори (например неепизомални вектори, характерни за бозайници) могат да бъдат интегрирани в генома на клетка гостоприемник, чрез въвеждане в клетка гостоприемник и последваща репликация заедно с генома на гостоприемника. Още повече, определени типове вектори, са способни да насочват експресията на гени, към които те са свързани по оперативен път.
Такива вектори, се отнасят тук до рекомбинантни експресионни вектори (или просто до експресионни вектори). Най-общо, експресионните вектори, които се използват за рекомбинантните ДНК техники, често са под формата на плазмиди. В настоящата спецификация, плазмид и вектор могат да се използват взаимнозаменяемо, като плазмидът е по-често използвана форма от вектор. Изобретението, обаче, има за цел да включи други форми на експресионни вектори, такива, като вирусни вектори (например, ретровируси с дефектна репликация, аденовируси и аденоасоциирани 45 вируси), които изпълняват еквивалентни функции.
Терминът рекомбинантна клетка гостоприемник (или просто клетка гостоприемник), както се използва тук, има за цел да се отнася 50 до клетка, в която е въведен рекомбинантния
66460 Bl експресионен вектор. Ще стане ясно, че такива термини имат за цел да се отнасят не само до определена клетка - обект, но също така и до поколение на такава клетка. Тъй като някои модификации, могат да се срещат успешно в 5 поколенията, или поради мутация или поради влияние на околната среда, такова поколение фактически може да не бъде идентично с родителската клетка, но все още е включено в обхвата на термина клетка гостоприемник, както 10 се използва тук.
Както се отнася тук, терминът селективно хибридизиран означава специфично свързан и свързан с възможност за детектиране. Полинуклеотиди, олигонуклеотиди и техни 15 фрагменти, съгласно изобретението, селективно хибридизират с вериги нуклеинови киселини при условия за хибридизация и промиване, които намаляват до минимум големи количества от детектираното свързване с неспецифични 20 нуклеинови киселини. Могат да бъдат използвани условия за висока степен на хибридизация или строго специфични условия, за да се постигнат условия за селективна хибридизация, както е известно от нивото на техниката и както е 25 дискутирано тук. Пример за условия на висока степен на хибридизация или строго специфични условия, е метод за инкубиране на полинуклеотид с друг полинуклеотид, където единият полинуклеотид може да се свърже към 30 твърда подложка, такава като мембрана, в буфер за хибридизация 6 х SSPE или SSC, 50 % формамид, 5 х реагент на Denhardt, 0.5 % SDS, 100 microg/ml денатурирана и фрагментирана ДНК от сперма на пъстърва при температура за 35 хибридизация от 42°С в продължение на 12-16 h и последващо двукратно промиване при 5 5 °C, като се използва буфер за промиване 1 х SSC, 0.5 % SDS. Виж също така Sambrook et al., погоре, pp. 9.50-9.55. 40
Терминът процент секвенционна идентичност в контекста на секвенциите нуклеинови киселини, се отнася до остатъци в две секвенции, които са еднакви, когато се съпоставят за максимално съответствие. 45 Дължината на секвенционната идентичност при сравнението, може да обхваща около най-малко девет нуклеотида, обикновено най-малко около 18 нуклеотида, още по-често, най-малко около 24 нуклеотида, а обикновено най-малко около 28 50 нуклеотида, и още по-често, най-малко около 32 нуклеотида, а за предпочитане най-малко около 36, 48 или повече нуклеотида. Съществува известен брой различни алгоритми, известни в областта от нивото на техниката, които могат да се използват, за да се измери идентичността в нуклеотидната секвенция. Например, полинуклеотидните секвенции могат да се сравняват, като се използва FASTA, Gap или Bestfit, които са програми от пакета Wisconsin, Версия 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, които включват, например програмите FASTA 2 и FASTA 3, осигуряват съпоставянията и процента секвенционна идентичност на най-добре припокриващите се области между дадена и търсена секвенции (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); въведени тук, чрез цитираната литература). Използват се зададените в програмата параметри или алгоритми, освен ако не е оказано друго. Например, процентът секвенционна идентичност между секвенциите нуклеинови киселини, може да се определи, като се използва FASTA с нейните зададени параметри (размер на думата 6 и NOPAM фактор за отчитане на матрицата) или чрез използване Gap с нейните зададени параметри, както се осигурява в GCG Версия 6.1, въведена тук, чрез цитираната литература.
Отнасянето към секвенция нуклеинова киселина, обхваща и нейната комплементарна, освен ако не е специфицирано друго. Следователно, отнасянето към нуклеинова киселина, която има определена секвенция ще се разбира, че обхваща нейната комплементарна верига, с нейната комплементарна секвенция.
В областта на молекулярната биология, изследователите използват взаимнозаменяемо термините процент секвенционна идентичност, процент на секвенционно сходство и процент секвенционна хомология. В тази заявка, тези термини ще имат същото значение само по отношение на секвенциите нуклеинови киселини.
Терминът сходство по същество или секвенционно сходство по същество, когато се отнася до нуклеинова киселина или неин м
фрагмент, показва, че когато съществува оптимално съпоставяне с подходящи нуклеотидни въвеждания или делеции с друга нуклеинова киселина (или нейна комплементарна верига), тогава се наблюдава идентична нуклеотидна секвенция, най-малко около 85 %, по-добре, най-малко около 90 %, а още по-добре най-малко около 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %, от нуклеотидните бази, измерена чрез всеки един добре известен алгоритъм за секвенционна идентичност, такъв като FASTA, BLAST или Gap, както е дискутирано по-горе.
Когато се прилага към полипептиди, терминът идентичност по същество означава, че две пептидни секвенции, когато се съпоставят оптимално, така както, чрез програмите GAP или BESTFIT, като се използват зададените gap тегла, те притежават най-малко 75 % или 80 % секвенционна идентичност, за предпочитане най-малко 90 % или 95 % секвенционна идентичност, даже най-добре най-малко 98 % или 99 % секвенционна идентичност. За предпочитане, позициите в остатъците, които не са идентични, се различават по консервативните аминокиселинни замествания. Консервативно амино- 25 киселинно заместване е това, при което аминокиселинният остатък е заместен е друг аминокиселинен остатък, който има странична верига (R група) с подобни химични свойства (например, заряд или хидрофобност). Най-общо, 30 консервативното аминокиселинно заместване няма да промени по същество функционалните свойства на белтъка. В случаите, където две или повече аминокиселинни секвенции се различават една от друга по консервативните замествания, 35 процента секвенционна идентичност или степента на сходство могат да се нагласят в по-голяма степен, така че да се коригират по отношение на консервативната природа на заместването. Смисълът на такива корекции е добре известен 40 за специалистите от нивото на техниката. Виж например Pearson, Methods Mol. Biol. 24:307-31 (1994), включен тук, чрез цитираната литература. Примери за групи от аминокиселини, които имат странични вериги с подобни химични свойства, 45 включват 1) алифатни странични вериги: глицин, аланин, валин, левцин и изолевцин; 2) алифатнохидроксилни странични вериги: серин и треонин; 3) амидсъдържащи странични вериги: аспаргин и глутамин; 4) ароматни странични вериги:
460 В1 фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основни странични вериги: лизин, аргинин и хистидин; и 6) сярасъдържащи странични вериги са цистеин и метионин. Предпочитани групи за 5 консервативни аминокиселинни замествания са цистеин и метионин. Предпочитани групи за консервативни аминокиселинни замествания са: валин-левцин-изолевцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат 10 и аспаргин-глутамин.
От друга страна, консервативно заместване е всяка една промяна, която има положителна стойност за РАМ250 logвероятностната матрица, описана в Gonnet et al., 15 Science 256: 1443.45 (1992), въведена, тук чрез цитираната литература. Умерено консервативно заместване, е всяка една промяна, която няма отрицателна стойност за РАМ250 logвероятностната матрица.
Секвенционно сходство за полипептиди, което също се отнася до секвенционна идентичност, обикновено се измерва, като се използва софтуер за секвенционен анализ. Софтуерът за анализ на белтъци сравнява подобни секвенции, като използва параметри за сходство, нагласени за различните замествания, делеции и други модификации, включващи консервативните аминокиселинни замествания. Например, GCG съдържа програми, като Gap и Bestfit, които могат да се използват със зададени параметри, за да се определи секвенционната хомология или секвенционната идентичност между близко сходни полипептиди, такива като полипептидни хомолози от различни видове организми, или между див тип белтък и негов мутеин. Виж например, GCG Версия 6.1. Полипептидните секвенции, също могат да се сравняват, като се използва FASTA, чрез използване на зададените в програмата или препоръчани параметри, програма в GCG Версия 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3), което осигурява съпоставяне и процент на секвенционна идентичност на припокриващите се в най-висока степен области, между дадена и търсена секвенции (Pearson (1990); Pearson (2000). Друг предпочитан алгоритъм, при сравнение на секвенция от изобретението с база данни, съдържаща голям брой секвенции от различни организми е компютърната програма BLAST, по50 специално blastp или tblastn, като се използват
66460 Bl зададените в програмата параметри. Виж например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); въведени тук, чрез цитираната литература.
Дължината на сравняваните за хомология полипептидни секвенции, обикновено ще е наймалко около 16 аминокиселинни остатъка, обикновено най-малко 20 аминокиселинни остатъка, по-често 24 остатъка, обикновено наймалко около 28 остатъка, а най-добре да са повече от около 35 остатъка. Когато се търси база данни, съдържаща секвенции от голям брой различни организми, за предпочитане е да се сравнят аминокиселинните секвенции.
Както се използват тук, термините белег или белязан се отнасят до въвеждане на друга молекула в антитялото. В един вариант, маркерът е маркер за детекция, например, въвеждане на белязана с радиоизотоп аминокиселина или прикрепване към полипептида на биотинилирани групи, които могат да се детекгират чрез маркиран авидин (например, стрептавидин съдържащ флуоресцентен маркер или ензимна активност, която може да се детектира чрез оптични или колориметрични методи). В друг вариант, белегът или маркерът могат да са терапевтични, т.е. конюгат на лекарствен препарат или токсин. Могат да се използват, различни методи за белязане на полипептиди и гликопротеини, които са известни в областта от нивото на техниката. Примери за белязане на полипептиди включват, но не се ограничават само до следните: радиоизотопи или нуклеотиди, белязани с радиоизотоп (например, ЗН, 14С, 15N, 35S, 90 Y, 99Тс, 1111η, 1251,1311), флуоресцентни маркери (например, FITC, родамин, лантанид фосфор), ензимни маркери (например, пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза, луцифераза, алкална фосфатаза), хемилуминесцентни маркери, биотинилирани групи, предварително детерминирани полипептидни епитопи, разпознавани от вторичен репортер (например, секвенции от левцинова циповидна структура за сдвояване, свързващи места за втори антитела, метал свързващи домени, tag епитопи), магнитни средства, такива като гадолиниум хелати, токсини, като пертузис токсин, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, етидиев бромид, еметин, митомицин, етопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дихидрокси антрацин дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дехидротестостерон, глюкокортикоиди, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и аналози или техни хомолози.
В някои варианти, маркерите са прикрепени, чрез спейсерни рамена с различни дължини, за да се намали потенциалната етерична пречка.
Терминът средство се използва тук, за да се отбележи химично съединение, смес от химични съединения, биологична макромолекула или екстракт, направен от биологични материали. Терминът фармацевтично средство или лекарствен препарат, както се използва тук се отнася до химично съединение или състав, способен да индуцира желан терапевтичен ефект, когато се прилага по подходящ начин на пациент. Тук са използвани и други химични термини, съгласно конвенционалната употреба от нивото на техниката, както е показано като пример от The McGralv-Hill Dictionay of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), въведен тук, чрез цитираната литература).
Терминът анти-неопластично средство, който се използва тук, се отнася до средства, които имат функционално свойство да инхибира развитието или прогресията на неоплазма в човек, по-специално малигнена (канцерогенна) лезия, такава като например, карцинома, саркома, лимфома или левкемия. Инхибиране на метастазите, често е свойство на антинеопластичните средства.
Терминът пациент, включва човек и ветеринарни обекти.
Човешки анти-IGF-IR антитела и тяхното характеризиране
С човешките антитела се избягват определен тип проблеми, свързани с антителата, които притежават вариабилните и/или константните области на антителата на мишките или плъховете. Наличието на такива секвенции, с миши или плъши произход може да доведе до бързо пречистване на антителата или може да доведе до създаване на имунен отговор от пациента срещу антителата.
Следователно, в един вариант, изобретението осигурява антитела, наподобяващи човешките анти-IGF-lR антитела. В предпочитан вариант, изобретението осигурява изцяло човешки анти-IGF-IR антитела, чрез въвеждане на човешки имуноглобулинови гени в гризач, така че гризачът да продуцира изцяло човешки антитела. В още по-предпочитан вариант антителата са изцяло човешките анти-човешки IGF-IR антитела. Очаква се изцяло човешките анти-IGF-IR антитела да намалят до минимум имуногенните и алергични отговори вътрешни за миши или с миши произход моноклонални антитела (Mabs) и следователно да повишат ефикасността и сигурността на прилаганите антитела. Може да се очаква, че използването на изцяло човешки антитела осигурява по същество предимство при лечението на хронични и повтарящи се човешки заболявания, такива като възпаление и рак, които могат да изискват повтаряне на прилагането на антитялото. В друг 20 вариант, изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което не се свързва с комплемент.
В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитяло е 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, 25 анти-IGF-IR антитялото включва лека верига, включваща аминокиселинна секвенция, избрана от SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 или 22, или един или повече CDRs от тези аминокиселинни секвенции. В друг предпочитан вариант антиIGF-IR антитялото включва тежка верига, включваща аминокиселинна секвенция, избрана от SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 или 24 или един или повече CDRs от тези аминокиселинни секвенции.
Класове и подкласове анти-IGF-IR антитела
Антитялото може да бъде IgG, IgM, IgE, IgA или IgD молекула. В предпочитан вариант, антитялото е IgG и е IgG 1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтип. В по-предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото е подклас IgG2. В друг предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото е същия клас и подклас, както антитяло 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1, което е IgG2. 45 Класът и подкласът от анти-IGF-IR антитела може да се определи, чрез метод известен от нивото на техниката. Най-общо класът и подкласът антитяло може да се определи, чрез използване на антитела, които са 50
В1 специфични за определен клас и подклас антитяло. Такива антитела са налични в търговската мрежа. Класът и подкласът могат да бъдат определени, чрез ELISA, Western блок, а също така и чрез други добре известни техники. От друга страна, класът и подкласът могат да се определят чрез секвениране на всички или на част от константните домени на тежките и/или на леките вериги от антителата, сравнявайки 10 техните аминокиселинни секвенции с известни аминокиселинни секвенции от различни класове и подкласове имуноглобулини и определяйки класа или подкласа на антителата.
Видова и молекулна селективност
В друг аспект от изобретението, анти-IGFIR антитялото показва, както видова така и молекулна селективност. В един вариант антиIGF-IR антитялото се свързва с човешки IGFIR, с IGF-IR от явански макак или от макак резус. В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото не се свързва с IGF-IR на мишка, плъх, морско свинче, куче или заек. В друг предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото не се свързва с видове, такива като маймуна порода New World, такава като мармозетка. Съгласно ръководствата на спецификацията, всеки може да определи видовата селективност на анти-IGF-IR антитялото, като използва методите, добре известни от нивото на техниката.
Например, всеки може да определи видовата селективност, като използва Western блот, FACS, ELISA или RIA. В предпочитан вариант, всеки може да определи видовата селективност, като използва Western блот.
В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото, притежава селективност за IGF-IR, която е наймалко 50 пъти по-голяма от неговата селективност спрямо инсулинов рецептор. В предпочитан вариант, селективността на анти-IGF-IR 40 антитялото е повече от 100 пъти по-голяма, от селективността за инсулинов рецептор. В още по-предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото не показва никакви задоволителни специфичности на свързване спрямо който и да е друг белтък, освен IGF-IR. Всеки може да определи селективността на анти-IGF-IR антитялото за IGR-IR, като използва методите, добре известни от нивото на техниката. Например, всеки може да определи селективността, като използва Western блот,
66460 Bl
FACS, ELISA или RIA. В предпочитан вариант, всеки може да определи молекулната селективност, като използва Western блот.
Афинитет на свързване на анти-IGF-IR с IGF-IR 5
В друг вариант от изобретението, анти-IGFIR антителата се свързват с IGF-IR с висок афинитет. В един вариант, анти-IGF-IR антитялото се свързва с IGF-IR с Kd от 1 х 10-8 М или пониска. В още по-предпочитан вариант, антитялото 10 се свързва с IGF-IR с Kd или 1 х 10-9 М или пониска. В даже още по-предпочитан вариант, антитялото се свързва с IGF-IR с Kd или 5 х IDIOM или по-ниска. В друг предпочитан вариант, антитялото се свързва с IGF-IR с Kd или 1x10- 15 10 М или по-ниска. В друг предпочитан вариант, антитялото се свързва с IGF-IR по същество със същата Kd, такава като тази на антитялото избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, 20 антитялото се свързва с IGF-IR по същество със същата Kd, както антитялото, което включва един или повече CDRs от антитялото, избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В също друг предпочитан вариант, антитялото се 25 свързва с IGF-IR по същество със същата Kd, като антитялото, което включва една или повече аминокиселинни секвенции, избрани от SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24.
В друг предпочитан вариант, антитялото се 30 свързва IGF-IR по същество със същата Kd, като тази на антитялото, което включва един или повече CDRs от антитялото, което включва една от аминокиселинните секвенции, избрани от SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. 35
В друг вариант от изобретението, анти-IGFIR антитялото има ниска степен на дисоциация. В един вариант, анти-IGF-IR антитялото има Koff от 1 х 10-4 s-Ι или по-ниска. В един предпочитан вариант, Koff е 5 х 10-5 s-1 или по-ниска. В друг 40 предпочитан вариант, Koff е по същество същата, като тази на антителата, избрани от 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, антитялото свързва IGF-IR по същество със същата Koff, като тази на 45 антитялото, което включва един или повече CDRs от антитяло, избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Също в друг предпочитан вариант, антитялото свързва IGF-IR по същество със същата Koff, като тази на 50 антитялото, което включва една от аминокиселинните секвенции, избрани от SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. В друг предпочитан вариант, антитялото свързва IGF-IR по същество със същата Koff, като тази на антитялото, което включва един или повече CDRs от антитялото, включващо една или повече аминокиселинни секвенции, избрани от SEQ ID NOS : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22.
Афинитетът на свързване и скоростта на дисоциация на анти-IGF-IR антитялото с IGFIR може да се определи, чрез всеки един метод, известен от нивото на техниката. В един вариант, афинитетът на свързване може да се измери чрез конкурентни ELISAs, RIAs или повърхностен плазмон резонанс, такъв като BIAcore. Скоростта на дисоциация също може да се измери чрез повърхностен плазмон резонанс. В по-предпочитан вариант, афинитетът на свързване, свързващата активност и скоростта на дисоциация се измерва, чрез повърхностен плазмон резонанс. Даже в още по-предпочитан вариант, афинитетът на свързване и скоростта на дисоциация се измерва, като се използва BIAcore. Пример за определяне афинитетът на свързване и скоростта на дисоциация е описан по-долу в Пример II.
Полуживот на анти-IGF-IR антителата
Съгласно друг обект на изобретението, анти-IGF-IR антитялото има полуживот in vitro или in vivo най-малко един ден. В предпочитан вариант, антитялото или негова част има полуживот най-малко три дена. В попредпочитан вариант, антитялото или негова част има полуживот от четири дена или повече. В друг вариант, антитялото или негова част има полуживот от осем дена или повече. В друг вариант, антитялото или антиген-свързващата негова част е получена или модифицирана, така че да има по-дълъг полуживот, както е дискутирано по-долу. В друг предпочитан вариант, антитялото може да съдържа точкови мутации за да се повиши нивото на полуживот в серума, както е описано във WO 00/09560, публикуван на 24 Февруари, 2000.
Полуживотьт на антитялото може да бъде измерен чрез всеки един от начините, известни на специалистите от нивото на техниката. Например, полуживотьт на антитялото може да се измери, чрез Western блот, EL1SA или RIA за подходящ период от време. Полуживотьт на антитялото може да се измери във всяко едно от подходящите животни, например маймуна, такава като маймуна cynomologous, примат или човек.
Идентифициране на IGF-IR епитопи, разпознаващи се от анти-IGF-IR антитяло
Изобретението осигурява също така антиIGF-IR антитяло, което се свързва със същия антиген или епитоп, така както и човешкото антиIGF-IR антитяло. По-нататък, изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което се кросконкурира с човешкото анти-IGF-IR антитяло. В предпочитан вариант, човешкото анти-IGF-IR антитяло е 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, човешкото анти-IGF-IR включва един или повече CDRs от антитяло, избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В още попредпочитан вариант, човешкото анти-IGF-IR 20 включва една от аминокиселинните секвенции, избрани от SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18,20,22 или 24. В друг предпочитан вариант, човешкото анти-IGF-IR включва един или повече CDRs от антитяло, което включва една от аминокиселинните секвенции, избрани от SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. В силно предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото е друго човешко антитяло.
Всеки може да определи дали едно антиIGF-IR антитяло се свързва със същия антиген, като използва различни методи, известни в областта на техниката. Например, всеки може да определи, дали анти-IGF-IR антитялото за анализ, се свързва със същия антиген, чрез използване на анти-IGF-IR антитяло, за да се хване антиген, който е известен с това, че се свързва с антиIGF-IR антитялото, такъв като IGF-IR, елуирайки антигена от антитялото и след това определяйки дали антитялото за анализ ще се свърже с 40 елуирания антиген. Всеки може да определи, дали антитялото се свързва със същия епитоп, като анти-IGF-IR антитялото, чрез свързване на анти-IGF-IR антитялото с IGF-IR при условия на насищане и след това, чрез измерване на 45 способността на антитялото за анализ да се свързва с IGF-IR. Ако антитялото за анализ е способно да се свърже с IGF-IR по едно и също време, както анти-IGF-IR антитялото, тогава антитялото за анализ се свързва с различен 50
460 В1 епитоп от този за анти-IGF-IR антитялото. Ако антитялото за анализ, обаче не е способно да се свърже с IGF-1R в същото време, тогава антитялото за анализ се свързва със същия 5 епитоп, като този за човешкото анти-IGF-IR антитяло. Този експеримент може да се проведе, като се използва ELISA, R1A или повърхностен плазмон резонанс. В предпочитан вариант, експериментът се провежда, като се използва 10 повърхностен плазмон резонанс. В попредпочитан вариант се използва BIAcore. Също така, всеки може да определи, дали анти-lGF1R антитялото се крос-конкурира с анти-IGF-IR антитяло. В предпочитан вариант, всеки може да 15 определи, дали анти-IGF-IR антитялото се кросконкурира с друго, чрез използване на същия метод, който се използва за да се измери, дали анти-IGF-IR антитялото е способно да се свърже със същия епитоп, като друго анти-IGF-IR антитяло.
Използване на леката и тежката верига
Изобретението осигурява също така, антиIGF-IR антитяло, което включва вариабилни секвенции, кодирани от човешки к ген. В предпочитан вариант, вариабилните секвенции, са кодирани, или от Vk А27, АЗО или от 012 генното семейство. В предпочитан вариант, вариабилните секвенции са кодирани от човешкото Vk АЗО генно семейство. В още по30 предпочитан вариант, леката верига включва не повече от десет аминокиселинни замествания от родителската линия Vk А27, АЗО или 012, за предпочитане, не повече от шест аминокиселинни замествания и още по-добре, не повече от три 35 аминокиселинни замествания. В предпочитан вариант, аминокиселинните замествания са консервативни замествания.
SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 и 22 осигуряват аминокиселинни секвенции от вариабилните области на шест анти-IGF-IR к леки вериги. SEQ IDNOS: 38,40 и 42 осигуряват аминокиселинните секвенции на три к леки вериги, получени от шест анти-IGF-IR леки вериги на родителската линия. Фигури 1А-1С показват, съпоставяне на нуклеотидните секвенции на вариабилните области от леките вериги от шест анти-IGF-IR антитела, една спрямо друга и спрямо секвенциите на родителската линия, от която те произхождат. Съгласно ръководствата от тази спецификация, ю
66460 Bl всеки специалист в областта би могъл да определи кодираната аминокиселинна секвенция на шест анти-IGF-IR клеки вериги и на к леките вериги на родителската линия и да определи разликите между секвенциите на родителската 5 линия и секвенциите на антитялото.
В предпочитан вариант, VL от анти-IGF-IR антитяло съдържа същите аминокиселинни замествания, по отношение на аминокиселинната секвенция на родителската линия, така както 10 всяко едно или повече от VL на антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Например, VL от анти-IGF-IR антитялото може да съдържа едно или повече аминокиселинни замествания, които да са същите, като тези, 15 присъстващи в антитяло 2.13.2, друго аминокиселинно заместване, което е същото, като това, присъстващо в антитяло 2.14.3 и друго аминокиселинно заместване, което е същото, като това, присъстващо в антитяло 4.9.2. По този 20 начин, всеки може да смеси и съчетае различните характеристики на свързването на антитялото, за да промени, например афинитета на антитялото към IGF-IR или неговата скорост на дисоциация от антигена. В друг вариант, аминокиселинните 25 замествания са направени в същите позиции, както тези, намерени в едно или повече от VL на антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1, но по-скоро са направени консервативни аминокиселинни замествания, 30 отколкото да се използват същите аминокиселини. Например ако аминокиселинното заместване, в сравнение с родителската линия в едно от антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1, е глутамат, всеки може 35 да направи консервативно заместване с аспартат. По подобен начин, ако аминокиселинното заместване е при серин, всеки може да направи консервативно заместване с треонин.
В друг предпочитан вариант, леката верига 40 включва аминокиселинна секвенция, която е същата, като аминокиселинната секвенция на VL на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг, силно предпочитан вариант, леката верига включва аминокиселинни секвенции, 45 които са същите, като тези на CDR областите от леката верига на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, леката верига включва аминокиселинна секвенция най-малко от една CDR област от 50 леката верига на 2.12.1, 2.13.2, 2.14,3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, леката верига включва аминокиселинни секвенции от CDRs от различните леки вериги. В още по-предпочитан вариант, CDRs от различните леки вериги са получени от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, леката верига включва аминокиселинна секвенция избрана от SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 или 22. В друг вариант, леката верига включва аминокиселинна секвенция, кодирана от секвенция нуклеинова киселина, избрана от SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 или 21, или от секвенция нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция, имаща от 1-10 аминокиселинни въвеждания, делеции или замествания в тях. За предпочитане е, аминокиселинните замествания да са консервативни аминокиселинни замествания. В друг вариант, антитялото или част от него включва ламбда лека верига.
Настоящото изобретение, също така осигурява анти-IGF-IR антитяло или част от него, включваща човешка тежка верига или секвенция получена от човешка тежка верига. В един вариант, аминокиселинната секвенция на тежката верига е получена от човешки VH DP35, DP-47, DP-70, DP-71 или VIV-4/4. 35 генно семейство. В предпочитан вариант, аминокиселинната секвенция на тежката верига е получена от човешко VH DP47 генно семейство. В по-предпочитан вариант, тежката верига включва не повече от осем аминокиселинни промени от родителската линия VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 или VIV-4/4. 35, още по-добре не повече от шест аминокиселинни промени и даже най-добре не повече от три аминокиселинни промени.
SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 и 24 осигуряват аминокиселинни секвенции от вариабилните области на шест анти-IGF-IR тежки вериги. SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 36 и 44 осигуряват аминокиселинните секвенции и SEQ ID NOS: 29, 31, 33, 35 и 43 осигуряват нуклеотидните секвенции на тежките вериги на родителската линия, съответно DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 и VIV-4. Фигури 2A-2D показват на аминокиселинните секвенции на вариабилната област на шест анти-IGF-IR антитела, спрямо техните съответстващи
66460 Bl секвенции на родителската линия. Съгласно ръководствата на тази спецификация, всеки специалист може да определи кодираната аминокиселинна секвенция на шестте анти-IGFIR тежки вериги и на тежките вериги на 5 родителската линия и да определи разликите между родителската линия и секвенциите на антитялото.
В предпочитан вариант, VH от анти-lGFIR антитялото, съдържа същите аминокиселинни 10 замествания, сходни с тези на аминокиселинната секвенция на родителската линия, като всяко едно или повече от VH на антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. По подобен начин, както е дискутирано по-горе VH 15 на анти-IGF-IR антитялото може да съдържа едно или повече аминокиселинни замествания, които са същите, като тези, присъстващи в антитяло 2.13.2, друго аминокиселинно заместване, което е същото като това, присъстващо в антитяло 20 2.14.3 и друго аминокиселинно заместване, което е същото като антитяло 4.9.2. По този начин, всеки може да смеси и да съчетае различните характеристики на свързване на антитялото, за да промени, например афинитета на антитялото 25 към IGF-IR или неговата скорост на дисоциация от антигена. В друг вариант, аминокиселинни замествания са направени в същата позиция, като тези намерени във всяко едно или повече от VH на антителата 2.12.1,2.13.2,2.14.3,3.1.1,4.17.3, 30 4.9.2 или 6.1.1, но по-скоро е направено консервативно аминокиселинно заместване, отколкото да се използва същата аминокиселина.
В друг предпочитан вариант, тежката верига включва аминокиселинна секвенция, 35 която е същата като аминокиселинната секвенция на УНна2.12.1,2.13.2,2.14.3,3.1.1,4.9.2,4.17.3 или 6.1.1. В друг силно предпочитан вариант, тежката верига включва аминокиселинни секвенции, които са със същите, както CDR 40 областите на тежката верига на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, тежката верига включва аминокиселинна секвенция, най-малко от една CDR област на тежката верига на 2.12.1,2.13.2, 45 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, тежката верига включва аминокиселинни секвенции от CDRs от различни тежки вериги. В по-предпочитан вариант CDRs от различни тежки вериги са получени от 2.12.1, 50
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, тежките вериги включват аминокиселинна секвенция, избрана от SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 или 24. В друг вариант, тежките вериги включват аминокиселинна секвенция, кодирана от секвенция нуклеинова киселина, избрана от SEQ ID NOS: 3,7,11,15,19 или 23, или секвенция нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция, която има 1-10 аминокиселинни въвеждания, делеции или замествания в тях. В друг вариант, заместванията са замествания с консервативни аминокиселини.
Инхибиране на активността на IGF-1R, чрез анти-IGF-IR антитяло
Инхибиране на свързването на IGF I с IGFIR
В друг вариант, изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което инхибира свързването на IGF-I с IGF-IR или свързването на IGF-II с IGF-IR. В предпочитан вариант, IGFIR е човешки. В друг предпочитан вариант антиIGF-IR антитялото е човешко антитяло. В друг предпочитан вариант, антитялото или част от него инхибира свързването между IGF-IR и IGF-I с IC50 с не повече от 100 пМ. В предпочитан вариант, 1С50 е не повече от 10 пМ. В попредпочитан вариант IC50 е не повече от 5 пМ. IC50 може да бъде измерена, чрез всеки един метод, известен от нивото на техниката. Обикновено IC50 може да бъде измерена чрез EL1SA или RIA. В предпочитан вариант, IC50 се измерва, чрез R1A.
В друг вариант, изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което предотвратява активирането на IGF-IR в присъствието на IGFI. В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото инхибира IGF-IR-индуциранато тирозиново фосфорилиране, което се появява при свързването с рецептора. В друг предпочитан вариант анти-IGF-IR антитялото инхибира появата на подтиснати клетъчни събития. Например, анти-IGF-IR може да инхибира тирозиновото фосфорилиране на She и субстрата на инсулиновия рецептор (IRS) 1 и 2, всеки от които обикновено са фосфорилирани, когато клетките са третирани с IGF-I (Kim et al., J. Biol. Chern. 273: 34543-34550, 1998). Всеки може да определи, дали анти-IGF-IR антитялото може да предотврати активирането на IGF-IR в
66460 Bl присъствие на IGF-1, чрез определяне на нивата на автофосфорилиране на IGF-IR, She, IRS-1 или IRS-2 чрез Western блот или имунопреципитация. В предпочитан вариант, всеки може да определи нивата на автофосфорилиране на IGF-IR, чрез 5 Western блот. Виж например Пример VII.
В друг аспект на изобретението, антитялото води до намаляване на IGF-IR от клетки, третирани с антитялото. В един вариант IGF-IR се интернализира в цитоплазмата на клетката. 10 След като анти-IGF-IR антитялото се свърже с 1GF-IR, антитялото се интернализира, както е показано чрез конфокална микроскопия. Без да искаме да се обвързваме с която и да е теория, счита се че антитяло-IGF-IR комплексът се 15 интернализира в лизозомите и се разгражда. Всеки може да измери намаляването на IGF-IR, чрез всеки един метод, известен от нивото на техниката, включващ имунопреципитация, конфокална микроскопия или Western блот, Виж, 20 например Пример VII.
В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 2.12.1,2.13.2,2.14.3,3.1.1,4.9.2, или 6.1.1, или включва тежка верига, лека верига или антиген свързваща тяхна част. 25
Активиране на IGF-IR, чрез анти-IGF-IR антитяло
Друг аспект от настоящото изобретение включва активиране на анти-IGF-IR антитела. Активиращото антитяло се различава от 30 инхибиращото антитяло, поради това че то умножава или замества ефектите на 1GF-I върху IGF-IR. В един вариант, активиращото антитяло е способно да свърже IGF-IR и да се активира в отсъствието на 1GF-I. Този тип активиращо 35 антитяло е по същество имитатор на IGF-1. В друг вариант, активиращото антитяло, умножава ефекта на IGF-I върху IGF-IR.
Този тип антитяло не активира само IGFIR, но по-скоро увеличава активирането на IGF- 40 1R в присъствие на IGF-1. Анти-IGF-IR антитялото имитатор, може да се различи лесно от амплифициращото анти-IGF-IR антитяло, чрез in vitro третиране на клетките с антитяло в присъствието или отсъствието на ниски нива от 45 IGF-1. Ако антитялото е способно да доведе до активирането на IGF-IR в отсъствие на IGF-1, например да повиши 1GF-IR тирозиновото фосфорилиране, тогава антитялото е антитяло имитатор. Ако антитялото не може да доведе до 50 активирането на 1GF-IR в отсъствие на IGF-I, но е способно да амплифицира количествено активирането на IGF-IR, тогава антитялото е амплифициращо антитяло. В предпочитан вариант, активиращото антитяло е 4.17.3. В друг предпочитан вариант, антитялото включва една или повече CDRs от 4.17.3. В друг предпочитан вариант, антитялото е антитяло, получено както или от секвенции на родителска линия 012 (лека верига) и/или D71 (тежка верига).
In vivo инхибиране на IGF-IR тирозиновото фосфорилиране, нивата на IGF-1R и туморният клетъчен растеж, чрез анти-IGF-IR антитела
Друг вариант от изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което инхибира IGF-IR тирозиновото фосфорилиране и in vivo нивата на рецептора. В един вариант, прилагането на анти-IGF-IR антитяло на животно, води до редукция на IGF-IR фосфотирозиновия сигнал в IGF-IR-експресиращите тумори. В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото води до редукция във фосфотирозиновия сигнал, поне с 20 %. В още по-предпочитан вариант анти-IGFIR антитяло води до намаляване на фосфотирозиновия сигнал, поне с 60 %, а най-добре с 50 %. В даже по-предпочитан вариант, антитялото води до намаляване на фосфотирозиновия сигнал, поне с 40 %, още по-добре с 30 %, даже най-добре с 20 %. В предпочитан вариант, антитялото се прилага приблизително 24 h преди да се измерят нивата на тирозиново фосфорилиране. Нивата на тирозиново фосфорилиране могат да се измерят, чрез всеки от методите, известни в областта на техниката, такива като тези, описани по-долу. Виж например, Пример Ill и Фигура 5. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 2.12.1,2.13.2, 2.14.3,3.1.1,4.9.2 или 6.1.1, или включва тежка верига, лека верига или тяхна антиген свързваща част.
В друг вариант, прилагането на анти-IGFIR антитяло на животно води до редукция в нивата на IGF-IR в IGF-IR-експресиращи тумори. В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото води до редукция в нивата на рецептора, най-малко с 20 %, в сравнение с нетретирани животни. В още по-предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото води до намаляване на нивата на рецептора, поне с 60
66460 Bl с 60 %, 65 %, 70 % или 75 %, а най-добре с 80 %, 85 % или 90 % след период от 22 - 24 дни. Виж, например Фигура 7 и Пример IX. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 5 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1, или включва тежка верига, лека верига или антиген свързваща тяхна част.
Индукция на апоптозата, чрез анти-IGFIR антитела
Друг вариант от изобретението осигурява анти-IGF-IR антитяло, което индуцира клетъчна смърт. В един вариант, антитялото причинява апоптоза. Антитялото може in vivo или in vitro да индуцира апоптоза. Обикновено туморните клетки са по-чувствителни към апоптоза, в сравнение с нормалните клетки, така че прилагането на анти-IGF-IR антитяло води до апоптоза предимно на туморните клетки, отколкото на нормалните клетки. В друг вариант, прилагането на анти-IGF-IR антитяло намалява нивата на ензим, akt, който участва във фосфатидил инозитол (PI) киназния път.
PI киназният път, на свой ред, участва в клетъчната пролиферация и предотвратява апоптозата. Следователно, инхибирането на akt може да доведе до апоптоза. В още попредпочитан вариант, антитялото се прилага in vivo за да доведе до апоптоза при IGF-IRекспресираща клетка. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2 или 6.1.1, или включва тежка верига, лека верига или антиген-свързваща тяхна част.
Методи за получаване на антитела и антитяло-продуциращи клетъчни линии
Имунизация
В един вариант от настоящото изобретение, човешките антитела, включващи някои или всички човешки имуноглобулинови локуси са получени чрез имунизация на животни, различни 40 от човек с IGF-IR антиген. В предпочитан вариант, животно различно от човек е XENOMOUSE™, който е конструиран по инженерен път миши щам, включващ големи фрагменти от човешки имуноглобулинови 45 локуси и е в тези патенти, могат да се модифицират както е описано в United States Патент 5,994,619. В предпочитан вариант, животните, различни от човек могат да са плъхове, овце, прасета, кози, говеда или коне.
В друг вариант, животните различни от %, по-добре е 50 % от нивата на рецептора в нетретираното животно. В даже още попредпочитан вариант, антитялото води до намаляване на нивата на рецептора поне с 40 %, по-добре с 30 %. В предпочитан вариант, антитялото се прилага приблизително 24 h преди да се измерят нивата на IGF-IR. Нивата на IGFIR могат да бъдат измерени чрез който и да е метод, известен в областта на техниката, такива като тези описани по-долу. Виж например, Пример VIII и Фигура 6. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2 или 6.1.1, или включва тежка верига, лека верига или тяхна антиген-свързваща част.
В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото 15 инхибира in vivo туморния клетъчен растеж. Туморната клетка може да бъде получена от всеки един клетъчен тип, включващ, без ограничения, епидермална, епителна, ендотелна, левкемична, саркомна, клетка от множествена 20 миелома или мезодермални клетки. Примери за туморни клетки включват А 549 (не-малка клетъчна белодробна карцинома) клетки, MCF7 клетки, Colo 205 клетки, 3T3/IGF-IR клетки и А431 клетки. В предпочитан вариант, антитялото 25 инхибира туморния клетъчен растеж, в сравнение с растежа на тумора при нетретираните животни. В по-предпочитан вариант, антитялото инхибира туморния клетъчен растеж с 50 %. В още попредпочитан вариант, антитялото инхибира 30 туморния клетъчен растеж с 60 %, 65 %, 70 % или 75 %. В един вариант, инхибирането на туморния клетъчен растеж се измерва най-малко 7 дни след като е започнало третирането на животното с антитяло. В още по-предпочитан вариант, инхибирането на туморния клетъчен растеж се измерва най-малко 14 дни, след като е започнало третирането на животните с антитяло. В друг предпочитан вариант, е приложено друго анти-неопластично средство на животно, заедно с анти-IGF-IR антитяло. В предпочитан вариант, анти-неопластичното средство е способно също да инхибира туморния клетъчен растеж. В даже още по-предпочитан вариант, антинеопластичното средство е адриамицин, таксол, тамоксифен, 5-флуордезоксиуридин (5-FU) или СР-358,774. В предпочитан вариант, съпътстващото прилагане на анти-неопластично средство и анти-IGF-IR антитяло, инхибира туморния клетъчен растеж поне с 50 %, по-добре
66460 Bl човек, включващи човешки имуноглобулинови гении локуси са животни, които имат минилокус на човешки имуноглобулини. В подхода на мини-локуса, екзогенният 1g локус е имитиран чрез въвеждането на отделни гени от 1g локус. 5 Следователно, един или повече VH гени, един или повече DH гени, един или повече JH гени, mu константна област и втора константна област (за предпочитане гама константна област) се образуват в конструкт за въвеждане в животно. 10 Този подход е описан, между другото в U. S. Патент No. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, и 5,643,763, въведени тук, 15 чрез цитираната литература.
Предимство на подхода на мини-локуса е бързината, с която могат да бъдат създадени и въведени в животни конструктите, включващи части от 1g локус. Потенциално неудобство, обаче 20 на подхода на мини-локуса е, че може да липсва достатъчно имуноглобулиново разнообразие, за подкрепа на пълното развитие на В-клетките, например може да има слаба продукция на антитела. 25
За да се получи човешко анти-IGF-IR антитяло, животното различно от човек включва няколко или всички човешки имуноглобулинови локуси и е имунизирано с IGF-IR антиген и антитялото или антитяло-продуциращата клетка се 30 изолира от животното. IGF-IR антигенът може да се изолира дефицитен по отношение на получаването на миши антитела. Виж, например Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) и United States Патенти 5,916,771, 5,939,598, 35 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 и 6,130,364. Виж също WO 1991/ 010741, публикуван на 25 Юли, 1991, WO 1994/ 002602, публикуван на 3 Февруари, 1994, WO 1996/034096 и WO 1996/033735, едновременно 40 публикувани на 31 Октомври, 1996, WO 1998/ 016654, публикуван на 23 Април, 1998, WO 1998/ 024893, публикуван на 11 Юни, 1998, WO 1998/ 050433, публикуван на 12 Ноември, 1998, WO 1999/045031, публикуван на 10 Септември, 1999, 45 WO 1999/053049, публикуван на 21 Октомври, 1999, WO 2000/009560, публикуван на 24 Февруари, 2000 и WO 2000/037504, публикуван на 29 Юни, 2000. XENOMOUSE™ продуцира репертоара на изцяло човешки антитела, 50 лл наподобяващи тези при възрастните хора и създава антиген-специфични човешки Mabs. Второ поколение XENOMOUSE™ съдържа приблизително 80 % от репертоара на човешките антитела, чрез въвеждане на конфигурация на YAC фрагменти от родителската линия, в размер от мега бази от човешки локуси на тежката верига и локуси на к леката верига. Виж Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), описанията на които са въведени тук, чрез цитираната литература.
Изобретението също така осигурява метод за приготвяне на анти-IGF-IR антитела от животни, различни от човек, различни от мишка, чрез имунизиране на трансгенни животни, различни от човек, които включват човешки имуноглобулинови локуси. Всеки може да получи такива животни, като използва методите, непосредствено описани по-горе. Методите описани в тези патенти, могат да се модифицират както е описано в United States Патент 5,994,619. В предпочитан вариант, животните, различни от човек могат да са плъхове, овце, прасета, кози, говеда или коне.
В друг вариант, животните различни от човек, включващи човешки имуноглобулинови генни локуси са животни, които имат минилокус на човешки имуноглобулини. В подхода на мини-локуса, екзогенният 1g локус е имитиран чрез въвеждането на отделни гени от Ig локус. Следователно, един или повече VH гени, един или повече DH гени, един или повече JH гени, mu константна област и втора константна област (за предпочитане гама константна област) се образуват в конструкт за въвеждане в животно. Този подход е описан, между другото в U. S. Патент No. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, и 5,643,763, въведени тук, чрез цитираната литература.
Предимство на подхода на мини-локуса е бързината, с която могат да бъдат създадени и въведени в животни конструктите, включващи части от Ig локус. Потенциално неудобство, обаче на подхода на мини-локуса е, че може да липсва достатъчно имуноглобулиново разнообразие, за подкрепа на пълното развитие на Вклетките, например може да има слаба продукция на антитела.
За да се получи човешко анти-IGF-IR антитяло, животното различно от човек включва няколко или всички човешки имуноглобулинови локуси и е имунизирано с IGF-IR антиген и антитялото или антитяло-продуциращата клетка се изолира от животното. IGF-IR антигенът може да се изолира и/или IGF-IR да се пречисти и за предпочитане е да се пречисти човешки IGF-IR. В друг вариант, IGF-IR антигенът е фрагмент от IGF-IR, предимно извънклетъчния домен на IGFIR. В друг вариант, IGF-1R антигенът е фрагмент, който включва най-малко един епитоп от IGFIR. В друг вариант, IGF-1R антигенът е клетка, която експресира IGF-IR върху нейната клетъчна повърхност, предимно клетка, която свръхекспресира IGF-IR върху нейната клетъчна повърхност.
Имунизацията на животни може да се направи чрез който и да е метод известен в областта от нивото на техниката. Виж, например Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Методи за имунизиране на животни, различни от човек, 25 такива като мишки, плъхове, овце, кози, прасета, говеда и коне, са известни в областта от нивото на техниката. Виж, например Harlow and Lane and United States Патент 5,994,619. В предпочитан вариант IGF-IR антигенът се прилага с адювант, 30 за да стимулира имунния отговор. Такива адюванти, включват пълният адювант на Freund, RIBI (мурамил дипептидил) или ISCOM (имуностимулиращи комплекси). Такива адюванти могат да защитават полипептида от 35 бързо диспергиране, чрез отделянето му в локално място за съхранение, или те могат да съдържат субстанции, които стимулират гостоприемника, да секретира фактори, които са хемотактици за макрофагите и другите 40 компоненти на имунната система. Предимно ако полипептидът се прилага, схемата на имунизация ще включи две или повече прилагания на полипептида, разположени във времето за период от няколко седмици. 45
Пример I осигурява протокол за имунизиране на XENOMOUSE™ с пълната дължина на човешки 1GF-IR във фосфатносолеви буфер.
Получаване на антитела и антитяло- 50
460 В1 продуциращи клетъчни линии
След имунизирането на животно с IGFIR антиген, антителата и/или антитялопродуциращите клетки могат да се получат от 5 животното. Серумът, съдържащ анти-IGF-IR антитяло, е получен от животно чрез взимане на кръв или убиване на животното. Серумът може да се използва, тъй като е получена от животно, имуноглобулиновата фракция може да се получи 10 от серума, или анти-IGF-IR антителата могат да се пречистят от серума. Серумът или имуноглобулините получени по този начин са поликлонални, което е неудобство, понеже количеството на антителата, които могат да се 15 получат е ограничено и поликлоналното антитяло има хетерогенен спектър от качества.
В друг вариант, антитяло-продуциращите безсмъртни хибридоми могат да се приготвят от имунизирано животно. След имунизацията, 20 животното се убива далачните В-клетки се свързват по рекомбинантен път с безсмъртни миеломни клетки, както е добре известно в областта на техниката. Виж например, Harlow and Lane, по-горе. В предпочитан вариант, миеломните клетки не секретират имуноглобулинови полипептиди (не-секреторна клетъчна линия). След сливането и селекцията с антибиотик, хибридомите се скринират, като се използва IGF-IR, тяхна част или клетка експресираща IGF-IR. В предпочитан вариант, инициалният скрининг се провежда, като се използва ензим-свързан имуноанализ (ELISA) или радиоимуноанализ (RIA), за предпочитане ELISA. Пример за ELISA скрининг е осигурен в WO 2000/037504, въведен тук, чрез цитираната литература.
В друг вариант, антитяло продуциращите клетки могат да се приготвят от човек, който има автоимунно нарушение и който експресира антиIGF-IR антитела. Клетките, експресиращи антиIGF-IR антитела могат да се изолират, чрез изолиране на бели кръвни клетки и подлагането им на флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS) или чрез поставянето им върху петрита, покрити с IGF-IR или с част от него. Тези клетки, могат да бъдат свързани по рекомбинантен път с човешка не-секреторна миелома, за да се получат човешки хибридоми, експресиращи човешки анти-IGF-IR антитела. Обикновено, този вариант е най-слабо
66460 Bl предпочитан, защото е вероятно анти-IGF-IR антителата да имат слаб афинитет към IGF-IR.
Избрани са анти-IGF-IR антитяло-продуциращи хибридоми, клонирани са и по-нататък са скринирани за желаните характеристики, 5 включващи добър хибридомен растеж, висока продукция на антитела и желаните характеристики на антителата, както е дискутирано по-нататък подолу. Хибридомите могат да се култивират in vivo и да се размножават в сингенни животни, в 10 животни, при които липсва имунна система, например голи мишки или в in vitro клетъчна култура.
Методи за селекция, клониране и размножаване на хибридомите са добре известни на 15 специалистите от нивото на техниката.
Имунизираните животни са предимно животни, различни от човек, които експресират човешки имуноглобулинови гени и далачните Вклетки, се сливат по рекомбинантен път с 20 миелома, получена от същите видове като животното различно от човек. Още по-добре имунизираното животно, да е XENOMOUSE™ и миеломната клетъчна линия да е не-секреторна миша миелома, такава като миеломната клетъчна 25 линия NSO-bcl2. Виж например, Пример I.
В един вариант, изобретението осигурява хибридоми, които са получени така, че да продуцират човешки анти-IGF-IR антитела. В предпочитан вариант, хибридомите са миши 30 хибридоми, както е описано по-горе. В друг предпочитан вариант, хибридомите са получени в животни, различни от човек, различни от мишки, такива като плъхове, овце, прасета, кози, говеда или коне. В друг вариант, хибридомите са 35 човешки хибридоми, в които човешката, несекреторна миелома е свързана по рекомбинантен път с човешка клетка, експресираща анти-IGFIR антитяло.
Нуклеинови киселини, вектори, клетки- 40 гостоприемници и рекомбинантни методи за приготвяне на антитела
Нуклеинови киселини
Осигурени са молекули нуклеинови киселини, кодиращи анти-IGF-IR антитела от 45 изобретението. В един вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодира тежката и/или лека верига на анти-IGF-IR имуноглобулин. В предпочитан вариант, единична молекула нуклеинова киселина кодира тежката верига на 50 анти-IGF-IR имуноглобулин, а друга молекула нуклеинова киселина, кодира леката верига на анти-IGF-IR имуноглобулин. В още попредпочитан вариант, кодирания имуноглобулин е човешки имуноглобулин, за предпочитане човешки IgG. Кодираната лека верига може да е ламбда верига или капа верига, за предпочитане капа верига.
Молекулата нуклеинова киселина, кодираща вариабилната област на леката верига може да се получи от АЗО, А27 или 012 Vk ген. В предпочитан вариант, леката верига е получена от АЗО Vk ген. В друг предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодираща леката верига, включва свързваща област, получена от JkI, Jk2 или Jk4. В даже още попредпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодираща леката верига, съдържа не повече от десет аминокиселинни промени от АЗО Vk гена на родителската линия, за предпочитане не повече от шест аминокиселинни промени и даже още по-добре, не повече от три аминокиселинни промени.
Изобретението осигурява молекула нуклеинова киселина, която кодира вариабилната област на леката верига (VL) съдържаща, наймалко три аминокиселинни промени, в сравнение със секвенцията на родителската линия, където аминокиселинните промени са идентични с аминокиселинните промени от секвенцията на родителската линия от VL на едно от антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Изобретението осигурява, също така молекула нуклеинова киселина, включваща секвенция на нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинната секвенция на вариабилната област на леката верига на 2.12.1,2.13.2,2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Изобретението, също така осигурява молекула нуклеинова киселина, включваща секвенция нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинната секвенция на един или повече от CDRs на всяка една от леките вериги на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, включва секвенцията на нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинната секвенция на всички от CDRs на която и да е от леките вериги на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг вариант, секвенцията на молекулата на нуклеиновата киселина, включва секвенция на нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция на една от SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 или 22 или включва секвенция нуклеинова киселина на една от SEQ IDNOS: 1,5,9,13,17 или21. В друг предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, включва секвенция нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция на една или повече от CDRs на всяка една от SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 или 22 или включва секвенция нуклеинова киселина, на една или повече от CDRs от всяка една от SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 или 21. В още по-предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина включва секвенция на нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция на всички от CDRs на всяка една от SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 или 22 или включва секвенция нуклеинова киселина на всички CDRs на всяка една от SEQ 20 ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 или 21.
Изобретението осигурява също така, молекули нуклеинови киселини, които кодират аминокиселинна секвенция на VL, която има аминокиселинна секвенция, която е най-малко 25 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентична с VL описана погоре, по-специално с VL, която включва аминокиселинна секвенция от една от SEQ ID NOS: 2,6,10,14,18 или 22. Изобретението, също 30 така осигурява секвенция нуклеинова киселина, която е най-малко 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентична със секвенцията нуклеинова киселина на една от SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 или 21. В друг 35 вариант, изобретението осигурява молекула нуклеинова киселина, кодираща VL, която хибридизира при условия за висока степен на хибридизация с молекула нуклеинова киселина, кодираща VL, както е описано по-горе, по- 40 специално молекула нуклеинова киселина, която включва секвенция на нуклеинова киселина, кодираща аминокиселинна секвенция на SEQ ID NOS:2,6,10,14,18или22. Изобретението, също така осигурява секвенция на нуклеинова 45 киселина, кодираща VL, която хибридизира при условия на висока степен на хибридизация с молекула нуклеинова киселина, включваща секвенция на нуклеинова киселина на една от SEQ IDNOS: 1, 5, 9, 13, 17 или 21. 50
В1
Изобретението също така осигурява молекула нуклеинова киселина, кодираща вариабилна област от тежката верига (VH), получена от VH гена на DP-35, DP-47, DP-71 5 или Vit-4/4. 35, за предпочитане VH гена на DP35. В друг предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодираща VH включва свързваща област, получена от JH6 или JH5, още по-добре JH6. В друг предпочитан вариант, D 10 сегментът е получен от 3-3,6-19 или 4-17. Даже в още по-предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодираща VH съдържа не повече от десет аминокиселинни промени от гена на DP-47 родителската линия, за предпочитане 15 не повече от шест аминокиселинни промени, и даже още по-добре не повече от три аминокиселинни промени. В силно предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодираща VH съдържа, най-малко една аминокиселинна промяна, в сравнение със секвенцията на родителската линия, където аминокиселинната промяна е идентична с аминокиселинната промяна от секвенцията на родителската линия от тежката верига на едно от антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Даже в още по-предпочитан вариант, VH съдържа най-малко три аминокиселинни промени, в сравнение със секвенциите на родителската линия, където промените са идентични с тези промени от секвенцията на родителската линия от VH на едно от антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1.
В един вариант, молекулата нуклеинова киселина кодира аминокиселинната секвенция на VH на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг вариант, молекулата нуклеинова киселина включва секвенция нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция на една или повече от CDRs на тежката верига на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина включва секвенция нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинните секвенции на всички от CDRs от тежката верига на 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина включва секвенция на нуклеинова киселина, която кодира
66460 Bl аминокисеелинна секвенция на една от SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 или 24 или която включва секвенция на нуклеинова киселина на една от SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 или 23. В друг предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина включва секвенция на нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинна секвенция, на една или повече от CDRs на всяка една от SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 или 24 или включва секвенция на нуклеинова киселина на една или повече от CDRs на всяка една от SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 или 23. В предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина включва секвенция на нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинни секвенции на всички от CDRs на всяка от SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 или 24 или включва секвенция на нуклеинова киселина на всички от CDRs на всяка от SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 или 23.
В друг вариант, молекулата нуклеинова киселина кодира аминокиселинна секвенция на VH, която е най-малко 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентична с една от аминокиселинните секвенции, кодиращи VH, както е описано, непосредствено по-горе, по-специално с VH, която включва аминокиселинна секвенция на една от SEQ ID NOS: 4,8,12,16,20 или 24. Изобретението също така осигурява секвенция нуклеинова киселина, която е най-малко 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентична със секвенция на нуклеинова киселина на една от SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 или 23. В друг вариант на изобретението, молекулата нуклеинова киселина, кодираща VH, е тази, която хибридизира при условия на висока степен на хибридизация със секвенция на нуклеинова киселина, кодираща VH, както е описано по-горе, по-специално с VH, която включва аминокиселинна секвенция на една от SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 или 24. Изобретението също така осигурява секвенция нуклеинова киселина, кодираща VH, която хибридизира при условия на висока степен на хибридизация с молекула нуклеинова киселина, включваща секвенция на нуклеинова киселина на една от SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 или 23.
Молекулата нуклеинова киселина, кодираща или цялата тежка и лека верига на анти-IGFIR антитялото, или техните вариабилни области, може да се получи от всеки един източник, който продуцира анти-IGF-IR антитяло. Методи за изолиране на иРНК, кодираща антитяло, са добре известни от нивото на техниката. Виж, например, Sambrook et al. иРНК може да се използва, за да се получи кДНК, за използване в полимеразна верижна реакция (PCR) или кДНК за клониране на гените на антитялото. В един вариант от изобретението, молекулите нуклеинова киселина могат да се получат от хибридома, която експресира анти-IGF-IR антитялото, както е описано по-горе, за предпочитане хибридома, която има един от нейните партньори за рекомбинантно свързване, трансгенно животно, клетка, която експресира човешки имуноглобулинови гени, такова като XENOMOUSE™, мишо трансгенно животно, различно от човек или трансгенно животно, различно от човек и мишка. В друг вариант, хибридомата се получава от животно, различно от човек, различно от трансгенно животно, което може да се използва например за антитела, наподобяващи човешките антитела.
Молекула нуклеинова киселина, която кодира цялата тежка верига на анти-IGF-IR антитялото, може да се конструира чрез рекомбинантно свързване на молекула нуклеинова киселина, която кодира вариабилния домен на тежката верига или антигенсвързващия неин домен с константния домен на тежка верига. По подобен начин, молекулата нуклеинова киселина, кодираща леката верига на анти-IGF-IR антитялото, може да се конструира чрез рекомбинантно свързване на молекула нуклеинова киселина, кодираща вариабилния домен на лека верига или на антиген-свързващия неин домен с константен домен на лека верига. Молекулите нуклеинова киселина, кодиращи VH и VL веригата могат да се превърнат в гени за пълната дължина на антитялото, чрез въвеждането им в експресионни вектори, които съответно вече кодират константната област на тежката верига и константната област на леката верига, така че VH сегмента, е свързан по оперативен път със сегмент(и) на константната област (СН) във вектор и VL сегмент, който е свързан по оперативен път със сегмент от константната област на леката верига (CL) във вектора.
От друга страна, молекулите нуклеинови
66460 Bl киселини, кодиращи VH или VL веригите, се превръщат в гени за пълната дължина на антитялото, чрез свързване, например лигиране на молекулата нуклеинова киселина, кодираща VH верига с молекула нуклеинова киселина, кодираща СН верига, като се използват стандартните техники на молекулярната биология. Същата може да бъде получена, като се използват молекули нуклеинови киселини, кодиращи VL и CL вериги. Секвенциите на гените, кодиращи константните области на човешките тежки вериги и леки вериги са известни от нивото на техниката. Виж например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Imnzunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Молекулите нуклеинови киселини, кодиращи пълната дължина на тежката и/или лека вериги, след това могат да се експресират от клетка, в която те са въведени и анти-IGF-IR антитялото може да се изолира.
В предпочитан вариант, нуклеиновата киселина, кодираща вариабилната област на тежката верига, кодира аминокиселинна секвенция на SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 или 24 и молекулата нуклеинова киселина, кодираща вариабилната област на леките вериги, кодира аминокиселинна секвенция на SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 или 22. SEQ ID NO: 28 отразява аминокиселинната секвенция SEQ ID NO: 27, която показва секвенцията на нуклеинова киселина, кодираща константната област на тежката верига на анти-IGF-IR антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1. SEQ ID NO: 26 показва аминокиселинната секвенция и SEQ ID NO: 25 показва секвенцията нуклеинова киселина, кодираща константната област на леката верига на анти-IGF-IR антителата 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1. Следователно в предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина, кодираща константния домен на тежката верига, кодира SEQ ID NO: 28, а молекулата нуклеинова киселина, кодираща константният домен на леката верига кодира SEQ ID NO: 26. В по-предпочитан вариант, молекулата нуклеинова киселина кодираща константния домен на тежката верига има секвенция нуклеинова киселина на SEQ ID NO: 27, а молекулата нуклеинова киселина, кодираща константния домен има секвенция на нуклеинова киселина на SEQ ID NO: 25.
В друг вариант, молекула нуклеинова киселина, кодираща или тежката верига на антиIGF-IR антитялото или антиген свързващия неин домен, или леката верига на анти-IGF-IR антитялото или антиген свързващата негова част може да се изолира от животно различно от човек, от животно, различно от мишка, което експресира човешките имуноглобулинови гени и е имунизирано с IGF-IR антиген. В друг вариант, молекулата нуклеинова киселина може да се изолира от анти-IGF-IR антитяло продуцираща клетка, получена от нетрансгенно животно или от пациент - човек, който продуцира анти-IGF-IR антитела. Методи за изолирането на иРНК от анти-IGF-IR антитяло-продуциращи клетки, могат да се извършват, чрез стандартни техники за клониране и/или амплифициране, с използване на PCR и техники за библиотеки с конструкти и скриниране, като се използват стандартни протоколи за получаване на молекули нуклеинови киселини, кодиращи анти-IGF-IR тежки и леки вериги.
Молекулите нуклеинова киселина могат да се използват за рекомбинантна експресия на големи количества анти-IGF-IR антитела, както е описано по-долу. Молекулите нуклеинови киселини могат също така да се използват за получаване нахимерни антитела, едноверижни антитела, имуноадхезини, двойни антитела, мутирали антитела и производни на антитела, както е описано по-долу. Ако молекулите нуклеинови киселини са получени от животно, различно от човек, от нетрансгенно животно, молекулите нуклеинови киселини могат да се използват за антитела, наподобяващи човешките, както също така е описано по-долу.
В друг вариант, молекулите нуклеинови киселини от изобретението могат да се използват като сонди или PCR праймери за специфични секвенции от антителата. Например, сонда от молекула нуклеинова киселина, може да се използва в методите за диагностика или PCR праймерна молекула нуклеинова киселина може да се използва за амплифициране на ДНК области, които да се използват между другото, за изолиране на секвенции на нуклеинова киселина, за използване при получаването на различни домени на анти-IGF-IR антитела. В предпочитан вариант, молекулите нуклеинови киселини са олигонуклеотиди. В още по
66460 Bl предпочитан вариант, олигонуклеотидите са от високо вариабилните области на тежките и леки вериги на интересуващото ни антитяло. В даже още по-предпочитан вариант, олигонуклеотидите кодират всички или част от една или повече от 5 CDRs.
Вектори
Изобретението осигурява вектори, включващи молекули нуклеинови киселини от изобретението, които кодират тежката верига или 10 нейна антиген-свързваща част.
Изобретението осигурява вектори, включващи молекули нуклеинови киселини от изобретението, които кодират леката верига или антиген-свързваща нейна част. Изобретението 15 също така осигурява вектори, включващи молекули нуклеинови киселини, кодиращи рекомбинантни белтъци, модифицирани антитела, фрагменти от антитела и техни сонди.
За да експресират антитела, или части от 20 антителата от изобретението, ДНКите кодиращи част или пълната дължина на леката или тежка вериги, получени както е описано по-горе, се въвеждат в експресионни вектори, така че, гените са оперативно свързани със секвенции, 25 контролиращи транскрипцията и транслацията. Експресионните вектори включват плазмиди, ретровируси, козмиди, YACs, EBV получени епизоми и други подобни. Генът за антитялото се лигира във вектор, така че секвенциите, 30 контролиращи транскрипцията и транслацията във вектора, обслужват целевата функция за регулиране на транскрипцията и транслацията на гена за антитялото. Експресионният вектор и секвенциите за контролиране на експресията са 35 избрани за да са съвместими с експресията в клетката гостоприемник, която се използва. Генът за леката верига на антитялото и генът за тежката верига на антитялото могат да бъдат въведени в отделен вектор. В предпочитан вариант, и двата 40 гена се въвеждат в същия експресионен вектор. Гените за антитялото се въвеждат в експресионния вектор, чрез стандартни методи (например, лигиране на комплементарни рестриктазни места на генния фрагмент на антитялото и на вектора, 45 или на тъпи краища за лигиране, ако не присъстват рестриктазни места).
Удобен вектор е този, който кодира пълната функционална човешка СН или CL имуноглобулинова секвенция, с подходящи рестрик- 50 тазни места, конструирани така че всяка от VH или VL секвенциите, да могат лесно да се въведат и експресират, както е описано по-горе.
В тези вектори, обикновено сплайсингът става между донорното сплайсинг място във въведената J област и сплайсинг акцепторното място, предхождащо човешката С област и също така при сплайсинг областите, които се срещат в човешките СН екзони. Полиаденилирането и терминирането на транскрипцията стават в нативните места от хромозомата, разположени downstream от кодиращите области. Рекомбинантният експресионен вектор, може също така да кодира сигнален пептид, който улеснява секрецията на веригата на антитялото от клеткатагостоприемник. Генът за веригата на антитялото може да се клонира във вектор, така че сигналния пептид е свързан в рамка на гена за аминокрая на веригата на антитялото. Сигналният пептид може да е имуноглобулинов сигнален пептид или хетероложен сигнален пептид (т.е. сигнален пептид от неимуноглобулинов белтък).
В допълнение на гените за веригата за антитялото, рекомбинантните експресионни вектори от изобретението носят регулаторни секвенции, които контролират експресията на гените за веригата на антитялото в клетката гостоприемник. Ще стане очевидно на специалистите от нивото на техниката, че моделът експресионен вектор, включително селекцията на регулаторни секвенции може да зависи от такива фактори, като избор на клетка гостоприемник за трансформация, от нивото на експресия на желания белтък и т.н. Предпочитани регулаторни секвенции за експресия в клетка-гостоприемник от бозайник включва вирусни елементи, които инициират високи нива на експресия на белтък в клетките на бозайника, такива като промотори и/или енхансери, получени от ретровирусни LTRs, цитомегаловирус (CMV) (такива като CMV промотор/ енхансер), Simian Virus 40 (SV40) (такива като SV40 промотор/енхансер), аденовирус (например главният аденовирусен промотор за късна експресия (AdMLP)), полиома и силните промотори за бозайници, такива като нативните имуноглобулинови и актиновите промотори. За допълнително описание на вирусните регулаторни елементи и техни секвенции, виж например, U. S. Патент No. 5,168,062 на Stinski,
U. S. Патент No. 4,510,245 на Bell et al. и U. S. Патент No. 4,968,615 на Schaffner et al.
В допълнение към гените за веригата на антитялото и регулаторните секвенции, рекомбинантните експресионни вектори от изобретението могат да носят допълнителни секвенции, такива като секвенции, които регулират репликацията на вектора в клетката-гостоприемник (например, начало на репликация) и генни маркери за селекция. Гениите маркери за селекция улесняват селекцията на клетките гостоприемник, в които е въведен вектора (виж например, U. S. Патенти Nos. 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017, всички на Axel et al.). Например, типични генни маркери за селекция, са гените придаващи резистентност на клетката гостоприемник, в която е въведен вектора към лекарствени препарати, такива като G418, хигромицин или метотрексат. Предпочитани генни маркери за селекция, включват гена за дихидрофолат редуктазата (DHFR) (за използване за размножаване на dhfr-клекти гостоприемници, селектирани по метотрексат) и генът пео (за селекция на G418).
Нехибридомни клетки гостоприемници и методи за рекомбинантно получаване на белтък
Молекулите нуклеинови киселини, кодиращи тежката верига или нейната антиген-свързваща част и/или леката верига или нейната антиген-свързваща част на анти-IGF-IR анти- 30 тялото и векторите, включващи тези молекули нуклеинови киселини, могат да се използват за трансформация на подходяща клетка гостоприемник на бозайник. Трансформацията може да стане, чрез всеки един от известните методи за 35 въвеждане на полинуклеотиди в клеткагостоприемник. Методите за въвеждане на хетероложни полинуклеотиди в клетки от бозайници са добре известни в областта от нивото на техниката и включват декстран-медиирана 40 трансфекция, калциево-фосфатна преципитация, polybrene-медиирана трансфекция, протопластно свързване, електропорация, инкапсулиране на полинуклеотид(и) в липозоми, biolistic инжекция и директно микроинжектиране на ДНК в ядрата. 45 В допълнение, молекулите нуклеинова киселина, могат да се въведат в клетки от бозайник, чрез вирусни вектори. Методите за трансформиране на клетки са добре известни в областта от нивото на техниката. Виж, например U. S. Патенти Nos. 50
460 Bl
4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455 (които патенти са въведени тук, чрез цитираната литература).
Клетъчните линии от бозайници, налични 5 като клетки гостоприемници за експресия, са добре известни от нивото на техниката и включват много безсмъртни клетъчни линии, налични в American Type Culture Collection (ATCC). Те включват, между другото, клетки от 10 яйчник на китайски хамстер (СНО), NSO, SP2 клетки, HeLa клетки, клетки от бъбрек на хамстер - бебе (ВНК), клетки от маймунски бъбрек (COS), клетки от човешки чернодробен клетъчен карцином (например, Hep G2), А549 15 клетки, ЗТЗ клетки и някои други клетъчни линии. Клетките-гостоприемници от бозайник, включват човешки, миши, плъши, кучешки, маймунски, клетки от прасе, коза, говедо, кон и хамстер. Избрани са специално предпочитани 20 клетъчни линии, чрез определянето нивата кои клетъчни линии имат високи нива на експресия. Други клетъчни линии, които могат да се използват са клетъчни линии от насекоми, такива като Sf9 клетки, клетки от земноводни, бактериални клетки, растителни клетки и клетки от гъби. Когато рекомбинантните експресионни вектори, кодиращи тежката верига или нейната антиген-свързваща част, леката верига и/или нейната антиген свързваща част, са въведени в клетка гостоприемник от бозайник, антителата получени, чрез култивиране на клетките гостоприемник за достатъчен период от време за да позволи експресирането на антитяло в клетките гостоприемници, а още по-добре секреция на антитяло в културалната среда, в която се отглеждат клетките гостоприемници. Антителата могат да се отделят от културалната среда, като се използват стандартни методи за пречистване на белтъци.
По-нататък, експресията на антителата от изобретението (или на други техни групи) от продукцията на клетъчни линии, може да се повиши, като се използват известен брой известни техники. Например, глутамин синтетазната генна експресионна система (GS система) е често използван подход за повишаване на експресията при определени условия.
GS системата е дискутирана като цяло или частично във връзка с Европейски Патенти Nos. 0 216 846, 0 256 055 и 0 323 997 и Европейска
66460 Bl
Патента Заявка 893039644.
Вероятно, антителата експресирани от различни клетъчни линии или в трансгенни животни, ще се различават едно от друго по гликозилирането. Всички антитела, обаче, кодирани от молекули нуклеинови киселини, или включващи аминокиселинните секвенции, осигурени тук, са част от настоящото изобретение, независимо от гликозилирането на антителата.
Трансгенни животни
Изобретението също така осигурява, трансгенни животни, различни от човек, включващи една или повече молекули нуклеинови киселини от изобретението, които могат да се използват за получаване на антитела от изобретението. Антителата могат да се получат и изолират от тъканни или телесни течности, такива като мляко, кръв или урина на кози, крави, коне, прасета, плъхове, мишки, зайци, хамстери или други бозайници. Виж, например U. S. Патенти Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 и 5,741,957. Както е описано по-горе, трансгенните животни, различни от човек, които включват човешки имуноглобулинови локуси, могат да се получат, чрез имунизиране с IGF-IR или с част от него.
В друг вариант, трансгенните животни, различни от човек са получени, чрез въвеждане в животното на една или повече молекули нуклеинови киселини от изобретението, чрез стандартни трансгенни техники. Виж например Hogan, по-горе. Трансгенните клетки, използвани за да се направи трансгенно животно, могат да са ембрионални стволови клетки или соматични клетки. Трансгенните организми, различни от човек могат да са химерни, не-химерни, хетерозиготни и не-химерни хомозиготни. Виж, например Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mose Genetics and Transaenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); и Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). В друг вариант, трансгенните, различни от човек организми, могат да имат таргетно разрушаване и заместване, което кодира интересуващите ни тежка верига и/или лека верига. В предпочитан вариант, трансгенните животни включват и експресират молекули нуклеинови киселини, които кодират тежка и лека вериги, които се свързват специфично с IGF-1R, предимно с човешки IGF-IR. В друг вариант, трансгенните животни включват молекули нуклеинови киселини, кодиращи модифицирано антитяло, такова като едноверижно антитяло, химерно антитяло или антитяло, наподобяващо човешките антитела. Анти-IGFIR антителата могат да се направят във всяко едно трансгенно животно. В предпочитан вариант, животните, различни от човек са, мишки, плъхове, овце, прасета, кози, говеда или коне. Трансгенното животно, различно от човек, експресира споменатите кодирани полипептиди в кръвта, млякото, урината, слюнката течност, сълзите, мукозата и други телесни течности.
Фагови библиотеки
Изобретението осигурява метод за получаване на анти-IGF-IR антитяло или негова антиген свързваща част, включващи етапи на синтезиране на библиотека от човешки антитела върху фаги, скриниране на библиотеките с IGFIR или с негова част, изолиране на фага, който свързва IGF-IR и получаване на антитялото от фага.
Един метод за приготвяне на библиотека от антитела, включва етапите на имунизиране на животно гостоприемник, различно от човек, включващо човешки имуноглобулинов локус с IGF-IR или негова антигенна част, за да се предизвика имунен отговор; изолиране на клетки от животното гостоприемник, които клетки отговарят за получаването на антитела; изолиране на РНК от изолираните клетки; обратна транскрипция на РНК, за да се получи кДНК; амплифициране на кДНК, като се използва праймер и въвеждане на кДНК във фагов вектор, така че антителата да се експресират върху фага. По този начин, могат да се получат рекомбинантните анти-IGF-IR антитела от изобретението.
Рекомбинантните анти-IGF-IR човешки антитела от изобретението, в допълнение към анти-IGF-IR антителата описани тук могат да се изолират, чрез скрининг на комбинирана библиотека от рекомбинантни антитела, за предпочитане scFv фагова библиотека, направена като се използват човешки VL и VH кДНКи, приготвени от иРНК, получена от човешки лимфоцити. Методите за приготвяне и
66460 Bl скриниране на такива библиотеки са известни от нивото на техниката. В търговската мрежа са налични китове за създаване на фагови библиотеки (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, каталожен no. 27-9400- 5 01; и Stratagene SurfZAP™ phage display kit, каталожен no. 240612). Също така, могат да се използват други методи и реагенти за получаване и скриниране на библиотеки на антитела (виж, например, Ladner et al. U. S. ПатентЬю. 5,223,409; 10 Kang et al. PCT Публикация No. WO 1992/ 018619; Dower et al. PCT Публикация No. WO 1991/017271; Winter et al. PCT Публикация No. WO 1992/020791; Markland et al. PCT Публикация No. WO 1992/015679; Breitling et al. 15 PCT Публикация No. WO 1993/001288; McCafferty et al. PCT Публикация No. WO 1992/ 001047; Garrard et al. PCT Публикация No. WO 1992/009690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. 20 Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624- 25 628; Gram etal. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; and Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982. 30
В предпочитан вариант, който е описан тук, за изолиране на човешки анти-IGF-IR антитела с желани характеристики, се използва първо човешко анти-IGF-IR антитяло за селекция на секвенциите на човешките тежка и лека вериги, 3 5 които имат сходство в свързващата активност спрямо IGF-IR, чрез използване на методи за въвеждане на епитоп, описани в Hoogenboom et al., РСТ Публикация No. WO 1993/006213. Библиотеките от антитела, които се използват в 40 този метод са предимно scFv библиотеки, направени и скринирани, както е описано в McCafferty et al., РСТ Публикация No. WO 1992/ 001047, McCaffertyetal.,Nature(1990)348: 552554; and Griffiths et al., (1993) EMBO J 12: 725- 45 734. ScFv библиотеките за антитела, за предпочитане се скринират, чрез използване на човешки IGF-IR, като антиген.
Веднъж, като са избрани, човешките VL и
VH сегменти, се провеждат експерименти за 50 смесване и съчетаване, в които различните двойки от първоначално избраните VL и VH сегменти са скринирани за IGF-IR свързване, за да се избере предпочитаната комбинация VL/ VH двойка. В допълнение, за да се подобри понататък качеството на антитялото, VL и VH сегментите на предпочитаната VL/VH двойка (двойки) могат случайно да мутират, за предпочитане в CDR3 областта на VH и/или VL, в процес, аналогичен на in vivo процеса на соматична мутация, отговорен за афинитетно зреене на антителата по време на естествения имунен отговор. Това in vitro афинитетно зреене, може да се осъществи чрез амплификация на VH и VL областите, като се използват PCR праймери, комплементарни съответно на VH CDR3 или VL CDR3, които праймери са снадени със случайна смес от четирите нуклеотидни бази, в определени позиции, така че получените PCR продукти кодират VH и VL сегменти, в които случайните мутации са въведени в VH и/или VL CDR3 областите. Тези случайни мутации във VH и VL сегментите, могат да се скринират отново за свързване с IGF-IR.
След скриниране и изолиране на антиIGF-IR антитялото от изобретението, от рекомбинантна имуноглобулинова библиотека, нуклеиновата киселина, кодираща селектираното антитяло, може да бъде изолирана от библиотеката (например от фаговия геном) и субклонирана в други експресионни вектори, чрез стандартни ДНК рекомбинантни техники. Ако е желателно, нуклеиновата киселина понататък може да бъде обработена, за да се създадат други форми на антитялото от изобретението, както е описано по-долу. За експресия на рекомбинантно човешко антитяло, изолирано чрез скриниране на комбинирана библиотека, ДНК кодираща антитялото се клонира в рекомбинантен експресионен вектор и се въвежда в клетка гостоприемния от бозайник, както е описано по-горе.
Превръщане на антителата от един клас в Друг
Друг аспект от настоящото изобретение е да се осигури механизъм, чрез който класът от анти-IGF-IR антитяло може да се превърне от един клас в друг. В един аспект от изобретението, е изолирана молекулата нуклеинова киселина, кодираща VL или VH, като се използват добре
66460 Bl познати методи от нивото на техниката, така че да не включва всяка една от секвенциите нуклеинови киселини, кодиращи CL или СН. Молекулата нуклеинова киселина, кодираща VL или VH след това се свързва по оперативен път 5 със секвенция нуклеинова киселина, кодираща CL или СН от молекула от различен имуноглобулинов клас. Това може да се направи, като се използва вектор или молекула нуклеинова киселина, която включва CL или СН 10 верига, както е описано по-горе. Например, антиIGF-IR антитяло, което по произход е IgM може да се превърне в IgG клас. Също така, превръщането от клас в клас може да се използва, за да се превърне един IgG подклас в 15 друг, например от IgGI в IgG2. Предпочитан метод за получаване на антитяло от изобретението, включващо желаните изотипове, включва етапи на изолиране на нуклеинова киселина, кодираща тежка верига на анти-IGF-IR антитяло и 20 нуклеинова киселина, кодираща лека верига на анти-IGF-IR антитяло, получаване на вариабилна област на тежката верига, лигиране на вариабилната област на тежката верига с константен домен от тежката верига на желания 25 изотип, експресиране на леката верига и лигиране на тежката верига в клетка, и събиране на антиIGF-IR антителата от желания изотип.
Производни на антителата
Всеки може да използва молекулите 30 нуклеинови киселини, описани по-горе, за да се създадат производни на антителата, чрез използване на техники и методи известни на тези, които са специалисти от нивото на техниката.
Антитела, наподобяващи човешките 35 антитела
Както е дискутирано по-горе, във връзка със създаването на човешки антитела, съществуват предимства за получаване на антитела с намалена имуногенност. Това може 40 да бъде направено до известна степен, като се използват техниките за получаване на антитела, наподобяващи човешките и техниките за използване на подходящи библиотеки. Ще бъде оценено, че мишите антитела или антителата от 45 други видове могат да се направят, така че да наподобяват човешките или тези на приматите, като се използват техники, добре известни в областта от нивото на техниката. Виж например, Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) 50
7/1 и Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125168 (1992). Интересуващото ни антитяло може да се конструира чрез рекомбинантни ДНК техники за да замести CHI, СН2, СНЗ, шарнирните домени и/или рамковия домен със съответстващата човешка секвенция (виж WO 1992/002190 и U. S. ПатентиНо8.5,530,101,5,585,089,5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 и 5,777,085). В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото може да бъде направено, за да наподобява човешкото, чрез заместване на СН 1, СН2, СНЗ, свързващите домени и/или ограничения в рамка домен със съответстващите човешки секвенции, когато те поддържат всички от CDRs на тежките вериги, на леките вериги или както на тежките, така и на леките вериги.
Мутантни антитела
В друг вариант, молекулите нуклеинови киселини, векторите и клетките гостоприемници могат да се използват, за да се направят мутантни анти-IGF-IR. Антителата могат да мутират във вариабилните домени на тежката и/или лека вериги, за да се промени свързващото свойство на антитялото. Например, мутацията може да се направи в една или повече CDR области, за да се повиши или понижи Kd на антитялото за IGFIR, за да се повиши или понижи Koff, или да се промени специфичното свързване на антитялото. Техниките за място насочена-мутагенеза са добре известни от нивото на техниката. Виж например, Sambrook et al. and Ausubel et al., norope. В предпочитан вариант, мутациите са направени в аминокиселинни остатъци, за които се знае, че са променени по отношение на родителската линия, във вариабилната област на анти-IGF-IR антитялото. В още по-предпочитан вариант, са направени една или повече мутации в аминокиселинен остатък, който е известен с това, че е променен спрямо родителската линия във вариабилната област или в CDR областта на едно или повече от анти-IGF-IR антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В друг вариант, една или повече мутации са направени в аминокиселинен остатък, за който се знае, че е променен, спрямо родителската линия във вариабилната област или CDR областта, чиято аминокиселинна секвенция е представена в SEQ ID NOS: 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 или чиято секвенция нуклеинова киселина е представена в SEQ ID NOS: 1,3,5, Ί, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21 или 23. В друг вариант, молекулите нуклеинова киселина са мутирали в една или повече ограничени области. Една мутация може да се направи в ограничена област или константен домен, за да се повиши полуживота на анти-IGFIR антитялото. Виж, например, WO 2000/009560, публикуван на 24 Февруари, 2000, въведен тук, чрез цитираната литература. В един вариант, може да има три или пет точкови мутации и не повече от десет точкови мутации. Мутацията в ограничената област или константен домен, може също да промени имуногенността на антитялото, за да осигури място за ковалентно или нековалентно свързване с друга молекула или да промени свойствата на комплементарното фиксиране. Мутациите могат да се направят във всяка от ограничените области, в константния домен и вариабилните области на единично мутирало антитяло. От друга страна, мутациите могат да се направят в една единствена от ограничените области, от вариабилните области или от константните домени в единично мутирало антитяло.
В един вариант, съществуват не повече от 25 десет аминокиселинни промени или във VH или VL областите от мутиралото анти-IGF-IR антитяло, в сравнение с анти-IGF-IR преди мутацията. В по-предпочитан вариант, съществуват не повече от пет аминокиселинни промени или във VH или VL областите на мутиралото анти-IGF-IR антитяло, още по-добре не повече от три аминокиселинни промени. В друг вариант, съществуват не повече от петнадесет аминокиселинни промени в константните домени, за предпочитане, не повече от десет аминокиселинни промени, даже найдобре не повече от пет аминокиселинни промени.
Модифицирани антитела
В друг вариант, могат да бъдат направени рекомбинантно свързано антитяло или имуноадхезин, които включват цялото или част от анти-IGF-IR антитялото, свързано с друг полипептид. В предпочитан вариант, само вариабилните области на анти-IGF-IR антитялото 45 са свързани с полипептида. В друг предпочитан вариант, VH домена на анти-IGF-IR антитялото е свързан с първи полипептид, докато VL домена на анти-IGF-IR антитялото е свързан с втори полипептид, който се свързва с първия 50
460 В1 полипептид по такъв начин, че VH и VL домените могат да си взаимодействат един с друг, за да образуват свързващото място на антитялото. В друг вариант, VH домена е отделен от VL домена, чрез линкер, така че VH и VL домените могат да взаимодействат един с друг (виж по-долу както е дадено за Едноверижни антитела).
VH-линкер-VL антитялото, след това се свързва с интересуващия ни полипептид.
Рекомбинантното антитяло се използва за насочване на полипептид в lGF-IR-експресираща клетка или тъкан. Полипептидът може да е терапевтично средство, такова като токсин, растежен фактор или друг регулаторен белтък, 15 или може да е диагностично средство, такова като ензим, който може лесно да се визуализира, такъв като пероксидаза от хрян. В допълнение могат да се направят рекомбинантно свързани антитела, в които две (или повече) едноверижни антитела са свързани едно с друго. Това е полезно, ако е необходимо да се създаде двувалентно или поливалентно антитяло върху една полипептидна верига или ако е желателно да се направи двойно специфично антитяло.
За да се направи едноверижно антитяло, ДНК фрагментите, кодиращи (scFv) VH и VL, се свързват по оперативен път с друг фрагмент, кодиращ гъвкав линкер, например кодиращ аминокиселинна секвенция (Gly4-Ser)3 (SEQ ID 30 NO: 60), така че VH и VL секвенциите да могат да се експресират като съседни едноверижни белтъци, с VL и VH области, свързани с гъвкавия линкер (виж например Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554). Едноверижните антитела, могат да бъдат едновалентни, ако се използват само единични VH и VL, бивалентни ако се използват две VH и VL, и поливалентни ако се използват повече от две VH и VL.
В друг вариант, други модифицирани антитела могат да се приготвят, като се използва анти-IGF-IR кодиращи молекули нуклеинови киселини. Например, като се използват стандартни техники на молекулярната биология, съгласно ръководствата от спецификацията, могат да се приготвят Капа антитела (III et al., Protein Eng 10:949-57 (1997)),Мини-антитела (Martin etal.,EMBO J 13:53039(1994)), Двойни антитела (Holliger et al., PNAS USA 90: 644466460 Bl
6448 (1993)), или Двойно-лицеви (Traunecker et al., EMBO J 10:3655-3659 (1991) и Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Cancer Suppl 7: 51-52 (1992)).
В друг вариант, могат да се направят 5 химерни и двойно специфични антитела. Химерно антитяло може да се направи, така че да включва CDRs и ограничени области от различни антитела. В предпочитан вариант CDRs на химерните антитела, включват всички от CDRs 10 на вариабилната област, на леката верига или тежката верига на анти-IGF-IR антитялото, докато рамковите области са получени от едно или повече различни антитела. В по-предпочитан вариант, CDRs на химерното антитяло, включва 15 всички от CDRs от вариабилните области на леката верига и тежката верига на анти-IGF-IR антитялото. Ограничените области могат да се получат от различни видове и в предпочитан вариант, могат да наподобяват човешките 20 антитела. От друга страна ограничените области могат да са от друго човешко антитяло.
Двойно специфичното антитяло, може да се получи, така че да свързва специфично IGFIR, чрез един свързващ домен и към втора 25 молекула, чрез втори свързващ домен. Двойно специфичното антитяло може да се получи, чрез рекомбинантни техники на молекулярната биология, или могат да се свържат заедно физически. В допълнение, може да се направи едно- 30 верижно антитяло, съдържащо повече от една VH и VL, което да се свързва специфично с IGF-IR и с друга молекула. Такива двойно специфични антитела могат да се направят, като се използват техники, които са добре известни, например във 35 връзка с (i) и (й), виж например, Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) и Wright and Harris, по-горе и във връзка c (iii) виж например, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). В предпочитан вариант, двойно- 40 специфичното антитяло, експресирано с високи нива в ракови или туморни клетки, се свързва с 1GF-IR и с друга молекула. В по-предпочитан вариант, другата молекула е егЬВ2 рецептор, VEGF, CD20 или EGF-R. 45
В един вариант, модифицираните антитела, описани по-горе се приготвят, като се използва една или повече вариабилни области, на една или повече от CDR области от едно от антителата, избрани от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 50
4.17.3 или 6.1.1. В друг вариант, модифицираните антитела се приготвят, като се използва една или повече от вариабилните области или една или повече CDR области, чиято аминокиселинна секвенция е представени в SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 или чиято секвенция нуклеинова киселина е представена в SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23.
Дериватизирани и белязани антитела
Антитяло или част от антитяло от изобретението може да бъде дериватизирано или свързано с друга молекула (например, друг пептид или белтък). Обикновено, антителата или тяхна част, се получават така, че IGF-1R свързващата част, не се засяга негативно от дериватизацията или белязането. Съответно, антителата и частите на антителата от изобретението имат за цел да включат както интактни, така и модифицирани форми на човешките анти-IGFIR антитела, описани тук. Например, антитяло или част от антитяло от изобретението, може да е функционално свързано (чрез химично свързване, генетично рекомбинантно свързване, не-ковалентно асоцииране, или по друг начин) с една или повече други молекулни единици, такива като друго антитяло, (например, двойноспецифично антитяло или двойно антитяло), средство за детекция, цитотоксично средство, фармацевтично средство и/или белтък или пептид, който може да медиира свързването на антитялото или частта от антитялото с друга молекула (такава като стрептавидинова сърцевинна област или полихистидинов tag).
Един тип дериватизирано антитяло се получава чрез кръстосано свързване на две или повече антитела (от същия тип или от различни типове, например за да се направят двойно специфични антитела). Подходящи линкери за кръстосано свързване, включват тези, които са хетеро-двойно-функционални, които имат две различни реактивни групи, разделени чрез подходящ спейсер (например т-малеимидобензоил-Л-хидроксисукцинимид естер) или хомо-двойно-функционални (например, дисукцинимидил суберат). Такива линкери са налични от Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Друг тип дериватизирано антитяло е белязано антитяло. Полезни средства за детекция, с които може да бъде дериватизирано антитялото
66460 Bl или част от антитялото от изобретението, включват флуоресцентни съединения, включващи флуоресцин, флуоресцин изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1 -нафталенсулфонил хлорид, фикоеретрин, лантанид фосфор и други подобни. Антитялото може също да се бележи чрез ензими, които се използват за детекция, такива като пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза, луцифераза, алкална фосфатаза, глюкозооксидаза и други подобни. Когато антитяло е белязано с ензим за детекция, то се детектира, чрез допълнително добавяне на реагенти, които ензимът използва, за да се получи продукт от реакцията, който може да бъде видян. Например, когато присъства пероксидаза от хрян, добавянето на водороден прекис и диаминобензидин, води до продукт на цветна реакция, който може да се види. Едно антитяло също може да се бележи с биотин и да се детектира, чрез индиректно измерване на свързването на авидин или стрептавидин. Антитяло може да се бележи с магнитни средства, такива като гадолиниум. Антитяло може също да се бележи с предварително определени полипептидни епитопи, които се разпознават от вторичен репортер (например, левцинови циповидни сдвояващи секвенции, свързващи места за вторично антитяло, металсвързващи домени, tag епитопи). В някои варианти, маркерите трябва да бъдат прикрепени, чрез спейсерни рамена с различни дължини, за да се намали потенциалното етерично препятствие.
Анти-IGF-IR антитялото, може също така да бъде белязано с аминокиселина, свързана с радиоизотоп. Радио-белега може да се използва, както за диагностични, така и за терапевтични цели. Например, радио-белегът може да се използва за детектиране на IGF-IR-експресиращи тумори, чрез рентгеново облъчване или други диагностични техники. Също така радио белега може да се използва терапевтично, като токсин за ракови клетки или тумори. Примери за маркери за полипептиди могат да включат, но не се ограничават само до следните радиоизотопи или радионуклеотиди - ЗН, 14С, 15N, 35S, 90Y,99Tc, 111Ιη,125Ι, 1311.
Анти-IGF-IR антитялото може също така да е дериватизирано с химична група, такава като полиетилен гликол (PEG), метилова или етилова група или въглехидратна група. Тези групи могат да се използват за да подобрят биологичните характеристики на антитялото, например да се повиши полуживота в серума или да повиши тъканното свързване.
Фармацевтични състави и китове
Изобретението се отнася също така и до фармацевтичен състав за лечение на хиперпролиферативно нарушение в бозайник, който включва терапевтично ефективно количество от съединение от изобретението и фармацевтично приемлив носител. В един вариант, споменатият фармацевтичен състав е за лечение на рак, такъв като рак на мозъка, на белия дроб, на сквамозните клетки, на пикочния мехур, на стомаха, на панкреаса, на гърдите, на главата, на врата, ренален рак, рак на бъбрека, на яйчника, на простатата, колоректален рак, езофагиален, гинекологичен рак или рак на щитовидната жлеза. В друг вариант, споменатият фармацевтичен състав се отнася до неракови хиперпролиферативни нарушения, такива като, без ограничена рестеноза след ангиопластия и псориазис. В друг вариант, изобретението се отнася до фармацевтични състави за лечение на бозайник, което изисква активиране на IGF-IR, където фармацевтичният състав включва терапевтично ефективно количество от активиращо антитяло от изобретението и фармацевтично приемлив носител. Фармацевтични състави, включващи активиращи антитела могат да се използват за лечение на животни, при които липсва достатъчно IGF-I или IGF-I1, или могат да се използват за лечение на остеопороза, слабост или нарушения, в които бозайникът секретира прекадено малко растежен хормон или не е способен да отговаря на растежния хормон.
Анти-IGF-IR антителата от изобретението могат да се въведат във фармацевтични състави, подходящи за прилагане в лица. Обикновено фармацевтичният състав включва антитяло от изобретението и фармацевтично приемлив носител. Както се използва тук, фармацевтично приемлив носител включва всеки един и всички разтворители, дисперсионни среди, покрития, антибактериални и противогъбни средства, изотонични и забавящи абсорбцията средства и други подобни, които са физиологично съвместими. Примери за фармацевтично приемливи носители включват един или повече от вода, солеви разтвор, фосфатно-солеви буфер, декстроза, глицерол, етанол и други подобни, също
66460 Bl така и техни комбинации. В много от случаите се предпочита да се включат изотонични средства, например захари, полиалкохоли, такива като манитол, сорбитол или натриев хлорид в състава. Фармацевтично приемливи субстанции, такива 5 като овлажнители или малки количества от ауксиларни субстанции, такива като овлажнители или емулгиращи средства, консерванти или буфери, които повишават собствения живот или ефективността на антитялото или на частта от 10 антитялото.
Съставите от това изобретение могат да бъдат разнообразни форми. Те включват, например, течни, полутвърди и твърди дозирани форми, такива като течни разтвори (например 15 разтвори за инжекция или инфузия), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, прахове, липозоми и супозитории. Предпочитаната форма зависи от целящия метод на прилагане и от терапевтичното приложение. Типично предпо- 20 читани състави са под формата на разтвори за инжекция или инфузия, такива като състави, подобни на тези, използвани за пасивна имунизация на хора с други антитела. Предпочитан метод на прилагане е парентерален (например, 25 интравенозно, подкожно, интраперитонеално, вътремускулно). В предпочитан вариант, антитялото се прилага, чрез интравенозна инфузия или инжекция. В друг предпочитан вариант, антитялото се прилага, чрез 30 вътремускулна или подкожна инжекция.
Терапевтичните състави обикновено трябва да са стерилни и стабилни при условията на производство и съхранение. Съставът може да е формулиран като разтвор, микроемулсия, 35 дисперсия, липозома или други установени структури, подходящи за високи концентрации от лекарствен препарат. Стерилни инжекционни разтвори могат да се приготвят, чрез въвеждането на анти-IGF-IR антитяло в желано количество в 40 подходящ разтворител, самостоятелно или в комбинация от съставките, изброени по-горе, а ако е желателно и последвани от филтърна стерилизация. Обикновено, дисперсиите се приготвят, чрез въвеждане на активно съединение 45 в стерилно средство, което съдържа основна дисперсионна среда и желаните други съставки, от тези изброени по-горе. В случаите на стерилни прахове, за приготвяне на стерилни разтвори за инжекция, предпочитаните методи за приготвяне 50 са вакуумно изсушаване и изсушаване, чрез замразяване, което води до получаване на прах от активната съставка плюс всеки един допълнителен желан компонент от предварително, стерилизиран чрез филтруване техен разтвор. Подходящият флуидитет на разтвора може да се поддържа, например, чрез използване на покрития, такива като лецитин, чрез поддържане на желания размер на частиците в случая на дисперсия и чрез използване на сърфактанти. Продължителна абсорбция на състава за инжектиране, може да се придаде чрез включване на средство, което забавя абсорбцията в състава, например моностеаратни соли и желатин.
Антителата от настоящото изобретение могат да се приложат чрез различни методи, известни от нивото на техниката, въпреки че пътят/начина на прилагане за много терапевтични приложения, за предпочитане е интраперитонеален, подкожен, вътремускулен и интравенозен или инфузия. Както ще бъде оценено от специалистите от нивото на техниката, пътят и/или начина на прилагане ще варира в зависимост от желаните резултати. В един вариант, антителата от настоящото изобретение могат да се прилагат, като единична доза или могат да се прилагат като многократни дози.
В определени варианти, активното съединение може да се приготви с носител, който ще защити съединението срещу бързо освобождаване, такова като формулировка за контролирано освобождаване, включващо импланти, трансдермални лепенки и системи за микро-капсулирано доставяне. Могат да се използват биодеградиращи, биосъвместими полимери такива като етилен винил ацетат, полианхидриди, полигликолови киселини, колаген, полиортоестери и полимлечна киселина. Много методи за приготвяне на такива състави са патентовани или повсеместно известни на специалистите от нивото на техниката. Виж например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В определени варианти, анти-IGF-IR от изобретението могат да се прилагат орално, например с инертен разредител или с носител, който може да се асимилира като храна.
зе
66460 Bl
Съединението (и ако е желателно други компоненти) може също така да бъде включено в твърда или мека желатинова капсула, компресирано в таблетки или въведено директно в диетата на лицето. За орално терапевтично приложение, съединенията могат да се въведат с ексципиенти и да се използват под формата на поемащи се с храната таблетки, поставящи се в устната кухина таблетки, хапчета, капсули, еликсири, суспензии, сиропи, вафлички и други подобни. За прилагане на съединението от изобретението, чрез други парентерални приложения, ако е необходимо те се покриват със съединение или се прилагат със съпътстващ съединението материал, който да предпази неговото инактивиране.
Допълнителни активни съединения могат също така да се въведат в съставите. В определени варианти, анти-IGF-IR от изобретението е формулирано заедно с и/или приложено заедно с едно или повече допълнителни терапевтични средства, такива като хемотерапевтично средство, антинеопластично средство или антитуморно средство. Например, анти-IGF-IR антитялото може да се формулира заедно с и/ или да се приложи заедно с едно или повече допълнителни терапевтични средства. Тези средства включват без ограничение, антитела, които се свързват с други прицелни молекули (например антитела, които се свързват с един или повече растежни фактори или цитокини, техни клетъчно повърхностни рецептори или IGF-I), IGF-I свързващи белтъци, антинеопластични средства, хемотерапевтични средства, антитуморни средства, антисенс олигонуклеотиди срещу 1GF-IR или IGF-I, пептидни аналози, които блокират IGF-IR активирането, разтворим IGF-IR и/или едно или повече химични средства, които инхибират продукцията или активността на IGF-I, които са от нивото на техниката, например октреотид. За фармацевтичен състав, включващ активиращо антитяло, анти-IGF-IR антитялото може да бъде формулирано с фактор, който повишава клетъчната пролиферация или предотвратява апоптозата. Такива фактори включват растежни фактори, като IGF-I и/или аналози на IGF-I, които активират IGF-IR. Такива комбинирани терапии могат да изискват по-ниски дози от анти-IGF-IR антитяло, а също така и съпътстващи прилагането средства, като по този начин се избягват възможни токсични ефекти или усложнения, свързани с различните монотерапии. В един вариант, антитялото е с едно или повече допълнително терапевтично средство.
Фармацевтичните състави от изобретението могат да включват терапевтично ефективно количество или профилактично ефективно количество от антитяло или част от антитяло от изобретението. Терапевтично ефективно количество се отнася до количество, ефективно по отношение на дозите и за необходимите периоди от време, за да се постигне желаният терапевтичен резултат. Терапевтично ефективно количество от антитялото или част от антитялото може да варира, съгласно фактори, такива като състояние на заболяването, възраст, пол, тегло на индивида и способност на антитялото или на част от антитялото да осъществи желан отговор в индивида. Терапевтично ефективно количество, също така е това, при което всеки един от токсичните или негативни ефекти на антитялото или на частта от антитялото са преодолени чрез терапевтичните благоприятни ефекти. Профилактично ефективно количество се отнася до ефективно количество в дози и за необходими периоди от време, за да се постигне желаният профилактичен резултат. Обикновено, тъй като профилактичната доза се използва в лица преди или на по-ранен етап от заболяването, профилактично ефективното количество ще бъде по-малко от терапевтично ефективното количество.
Дозовите режими могат да се нагласят, така че да осигурят оптимален желан отговор (например, терапевтичен или профилактичен отговор). Например, единичен болус може да се приложи на няколко разделени дози, които могат да бъдат въведени за определено време, или дозата може да бъде пропорционално намалена или повишена както е показано при крайна нужда на терапевтична ситуация. Фармацевтичен състав, включващ антитялото или включващ комбинирана терапия, включваща антитялото и едно или повече допълнителни терапевтични средства, може да се формулира за единични или многократни дози. Със специално предимство са формулираните парентерални състави под единично дозирана форма за леснота на прилагане и еднозначност на дозата. Единично дозираната форма, която се използва тук, се
66460 Bl отнася до физични дискретни единици, нагласени като единични дози за прилагане в бозайник, който трябва да се лекува; всяка единица съдържа предварително определено количество от активно съединение, заедно с необходимия фармацевтичен 5 носител, изчислено за да се получи желаният терапевтичен ефект. Спецификацията за единично дозираните форми от изобретението са продиктувани от и директно зависят от (а) уникалните характеристики на активното съединение 10 и определения терапевтичен или профилактичен ефект, който трябва да се постигне и (б) ограниченията, присъщи от нивото на техниката за съединения, при приготвянето на активна съставка за лечение на чувствителност в индивиди. 15 Специално използвана формулировка е 5 mg/ml анти-IGF-IR антитяло в буфер, съставен от 20 тМ натриев цитрат, pH 5.5,140 mMNaCl и 0.2 mg/ml полисорбат 80.
Примерен, нелимитиращ обхват за 20 терапевтично или профилактично ефективно количество от антитяло или част от антитяло от изобретението е 0.1 -100 mg/kg, още по-добре 0.550 mg/kg, по-добре 1-20 mg/kg, и даже най-добре 1-10 mg/kg. Трябва да се отбележи, че оценките 25 за дозата могат да варират с типа и остротата на болестното състояние, което трябва да се облекчи. Също така, трябва да се разбере, че за всяко отделно лице, специфичните дозови режими трябва да се нагласят за периода от време, 3 0 съгласно индивида, който се нуждае и професионалната оценка на човека, който прилага или контролира прилагането на съставите, и че заявените тук дозови интервали са дадени само като пример и нямат за цел да ограничат обхвата 3 5 или практическото използване на заявените състави. В един вариант, терапевтично или профилактично ефективно количество от антитяло или антиген свързваща негова част, се прилага заедно с едно или повече допълнителни терапев- 40 тични средства.
В друг вариант, изобретението се отнася до прилагане на анти-IGF-IR антитяло за лечение на рак в доза по-малка от 300 mg на месец.
Друг вариант от настоящото изобретение 45 осигурява китове, включващи анти-IGF-IR антитела и фармацевтични състави, включващи тези антитела. Китът може да включва, в допълнение към антитялото или към фармацевтичния състав, диагностични или 50 терапевтични средства. Китът може да включва също така инструкции за използване в диагностичен или терапевтичен метод. В предпочитан вариант, китът включва антитялото или фармацевтичен негов състав и диагностично средство, които могат да се използват в метод описан по-долу. В друг вариант, китът включва антитялото или фармацевтичен негов състав и едно или повече терапевтични средства, такива като допълнително антинеопластично средство, антитуморно средство или хемотерапевтично средство, което може да се използва в метод описан по-долу.
Това изобретение също така се отнася до фармацевтични състави за потискане на анормален клетъчен растеж в бозайник, които включват количество от съединение от изобретението в комбинация с количество от хемотерапевтично средство, където количествата от съединението, сол, солват или пролекарствен препарат и хемотерапевтичното средство са ефективни заедно за инхибиране на анормалния клетъчен растеж. Много хемотерапевтични средства понастоящем са известни от нивото на техниката. В един вариант, хемотерапевтичните средства са избрани от групата, включваща инхибитори на митозата, алкилиращи средства, антиметаболити, интеркалиращи се антибиотици, инхибитори на растежните фактори, инхибитори на клетъчния цикъл, ензими, инхибитори на топоизомеразата, средства срещу оцеляване, модификатори на биологичния отговор, антихормони, например антиандрогенни и антиангиогенни средства.
Във връзка със съединението от изобретението, могат да се използват антиангиогенни средства, такива като инхибитори на ММР-2 (матрикс металопротеиназа 2), инхибитори на ММР-9 (матрикс металопротеиназа 9) и инхибитори на СОХ-П (циклооксигеназа II). Примери за полезни инхибитори на СОХ-П включват CELEBREX™ (алекоксиб), валдекоксиб и рофекоксиб. Примери за полезни инхибитори на матрикс металопротеинази са описани в WO 1996/033172 (публикуван на 24 Октомври, 1996), WO 1996/027583 (публикуван на 7 Март, 1996), Европейски Патент Заявка No. 97304971.1 (заявена на 8 Юли, 1997), Европейски Патент Заявка No. 99308617.2 (заявена на 29 Октомври, 1999), WO 1998/007697
66460 Bl (публикуван 26 Февруари, 1998), WO 1998/ 003516 (публикуван 29 Януари, 1998), WO 1998/ 034918 (публикуван на 13 Август, 1998), WO 1998/034915 (публикуван на 13 Август, 1998), WO 1998/033768 (публикуван 6 Август, 1998), 5 WO 1998/030566 (публикуван на 16 Юли, 1998), Европейски Патент Публикация 606,046 (публикуван на 13 Юли, 1994), Европейски Патент Публикация 931,788 (публикуван на 28 Юли, 1999), WO 1990/005719 (публикуван на 31 10 Май, 1990), WO 1999/052910 (публикуван на 21 Октомври, 1999), WO 1999/052889 (публикуван на 21 Октомври, 1999), WO 1999/029667 (публикуван на 17 Юни, 1999), РСТ Международна заявка No. РСТ/IB 1998/001113 (заявена на 15 21 Юли, 1998), Европейски Патент Заявка No.
99302232.1 (заявена на 25 Март, 1999), Great Britain Патент заявка номер 9912961.1 (заявена на 3 Юни, 1999), United States Provisional Заявка No. 60/148,464 (заявена на 12 Август, 1999), 20 United States Патент 5,863,949 (публикуван на 26 Януари, 1999), United States Патент 5,861,510 (публикуван на 19 Януари, 1999) и Европейски Патент Публикация 780,386 (публикуван на 25 Юни, 1997), всички от тях са изцяло въведени 25 тук, чрез цитираната литература. Предпочитани ММР инхибитори са тези, които не показват артралгия. Още по-предпочитани са тези, които селективно инхибират ММР-2 и/или ММР-9 сходни на други матрикс металопротеинази (т.е. 30 ММР-1, ММР-3, ММР-4, ММР-5, ММР-6, ММР-7, ММР-8, ММР-10, ММР-11, ММР-12 и ММР-13). Някои специфични примери за ММР инхибитори, които са полезни в настоящото изобретение caAG-3340,RO 32-3555, RS 13-0830 35 и следните изброени съединения: 3-[[4-(4флуоро-фенокси)-бензенсулфонил]-(1хидрокси-карбамоил-циклопентил)-амино]пропионова киселина; 3-екзо-3-[4-(4-флуорофенокси)-бензенсулфониламино]-8-окса- 40 бицикло [3.2.1] октан-3-карбоксилна киселина хидроксиамид; (2R, 3R) 1-[4-(2-хлоро-4флуоро-бензилокси)-бензенсулфонил]-3хидрокси-З-метил-пиперидин-2-карбоксилна киселина хидроксиамид; 4-[4-(4-флуоро- 45 фенокси)-бензенсулфониламино]тетрахидропиран-4-карбоксилна киселина хидроксиамид; 3-[[4-(4-флуоро-фенокси)бензенсулфонил]-(1-хидроксикарбамоилциклобутил)-амино]-пропионова киселина; 4-[4- 50 (4-хлорофенокси)-бензенсулфониламино]тетрахидропиран-4-карбоксилна киселина хидроксиамид; (R) 3-[4-(4-хлоро-фенокси)бензенсулфониламино]-тетрахидро-пиран-3карбоксилна киселина хидроксиамид; (2R, 3R) 1-[4-(4-флуоро-2-метил-бензилокси)-бензенсулфонил]-3-хидрокси-3-метил-пиперидин-2карбоксилна киселина хидроксиамид; 3-[[4-(4флуоро-фенокси)-бензенсулфонил]-( 1 хидроксикарбамоил-1 -метил-етил)-амино]пропионова киселина; 3-[[4-(4-флуорофенокси)-бензенсулфонил]-(4-хидроксикарбамоил-тетрахидро-пиран-4-ил)-амино]-пропионова киселина; 3-екзо-3-[4-(4-хлоро-фенокси)бензенсулфониламино]-8-окса-ицикло [3.2.1] октан-3-карбоксилна киселина хидроксиамид; 3ендо-3-[4-(4-флуоро-фенокси)-бензенсулфониламино]-8-окса-ицикло [3.2.1] октан-3карбоксилна киселина хидроксиамид; и (R) 3[4-(4-флуоро-фенокси)-бензенсулфониламино]тетрахидрофуран-3-карбоксилна киселина хидроксиамид; и фармацевтично приемливи соли и солвати на споменатите съединения.
Съединение от изобретението, може също така да се използва с инхибитори на сигналната трансдукция, такива като средствата, които могат да инхибират отговорите на EGF-R (рецептора за епидермалния растежен фактор), такива като EGF-R антителата, EGF антитела и молекули, които са инхибитори на EGF-R; инхибитори на VEGF (васкуларен ендотелен растежен фактор), такива като VEGF рецепторите и молекулите, които могат да инхибират VEGF; и инхибиторите на егЬВ2 рецептора, такива като органични молекули или антитела, които се свързват с егЬВ2 рецептора, например, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Инхибиторите на EGF-R са описани, например в WO 1995/019970 (публикуван на 27 Юли, 1995), WO 1998/014451 (публикуван на 9 Април, 1998), WO 1998/002434 (публикуван на 22 Януари, 1998), и United States Патент 5,747,498 (публикуван на 5 Май, 1998) и такива субстанции могат да се използват в настоящото изобретение, както е описано тук. EGFRинхибиращите средства включат, но не се ограничават до моноклонални антитела С225 и анти-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA),
Λ 1
66460 Bl и съединенията ZD1834, ZD-1838 и ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), РК1-166/ CGP75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), лефлуномид (Pharmacia/Sugen), Cl1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 5 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-3 87,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), B1BX1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & 10 Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF рекомбинантно свързан токсин (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI- 15 P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) и EGF-R Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Тези и други EGF-R инхибиращи средства могат да се използват в настоящото 20 изобретение.
VEGF инхибиторите, например SU-5416 и SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Sobering) и NX1838 (NeXstar) също могат да се комбинират със съединение от настоящото изобретение. VEGF 25 инхибиторите са описани, например в WO 1999/ 024440 (публикуван на 20 Май, 1999), РСТ Международна Заявка PCT/IB99/00797 (заявена на 3 Май 3,1999), в WO 1995/021613 (публикуван на 17 Август, 1995), WO 1999/ 30 061422 (публикуван на 2 Декември, 1999), United States Патент 5,834,504 (публикуван на 10 Ноември, 1998), WO 1998/050356 (публикуван на 12 Ноември, 1998), United States Патент 5,883,113 (публикуван на 16 Март, 1999), United 35 States Патент 5,886,020 (публикуван на 23 Март, 1999), United States Патент 5,792,783 (публикуван на 11 Август, 1998), WO 1999/010349 (публикуван на 4 Март, 1999), WO 1997/032856 (публикуван на 12 Септември, 1997), WO 1997/ 40 022596 (публикуван на 26 Юни, 1997), WO 1998/ 054093 (публикуван на 3 Декември, 1998), WO 1998/002438 (публикуван на 22 Януари, 1998), WO 1999/016755 (публикуван на 8 Април, 1999) и WO 1998/002437 (публикуван на 22 Януари, 45 1998), всички от които са въведени изцяло тук, чрез цитираната литература. Други примери от някои специфични VEGF инхибитори, използвани в настоящото изобретение са IM862 (Cytran Inc.); анти-VEGF моноклонално антитяло от Genentech, 50
Inc.; и ангиозим, синтетичен рибозим от Ribozyme and Chiron. Тези и други VEGF инхибитори могат да се използват в настоящото изобретение, както е описано тук.
ЕгЬВ2 рецепторните инхибитори, такива като GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) и моноклоналните антитела AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) и 2В-1 (Chiron), могат понататък да се комбинират със съединение от изобретението, например тези, показани във WO 1998/002434 (публикуван на 22 Януари, 1998), WO 1999/035146 (публикуван на 15 Юли, 1999), WO 1999/035132 (публикуван на 15 Юли, 1999), WO 1998/002437 (публикуван на 22 Януари, 1998), WO 1997/013760 (публикуван на 17 Април, 1997), WO 1995/019970 (публикуван на 27 Юли, 1995), United States Патент 5,587,458 (публикуван на 24 Декември, 1996) и United States Патент 5,877,305 (публикуван на 2 Март, 1999), които са изцяло въведени тук, чрез цитираната литература. ЕгЬВ2 рецепторните инхибитори, използвани в настоящото изобретение са също така описани в United States Provisional Заявкаио. 60/117,341, заявена на 27 Януари, 1999 и в United States Provisional Заявка No. 60/117, 346, заявена на 27 Януари, 1999 и двете въведени тук изцяло, чрез цитираната литература. Инхибиторните съединения на егЬВ2 рецептора и субстанцията, описана в гореспоменатите РСТ заявки, U. S. Патенти и U. S. provisional заявки, а също така и други съединения и субстанции, които инхибират егЬВ2 рецептора, могат да се използват със съединението от настоящото изобретение, съгласно настоящото изобретение.
Средства срещу оцеляване, включват анти-IGF-IR антитела и анти-интегринови средства, такива като анти-интегринови антитела.
Използвани диагностични методи
Анти-IGF-IR антителата могат да се използват за in vitro или in vivo детекция на IGFIR в биологична проба. Анти-IGF-IR антителата могат да се използват в конвенционален имуноанализ, включващ без ограничения ELISA, RIA, FACS, тъканна имунохистохимия, Western блот или имунопреципитация. АнтиIGF-IR антителата от изобретението могат да се използват за детектиране на 1GF-IR от хора. В друг вариант, анти-IGF-IR антителата могат да се използват за детектиране на IGF-IR от
66460 Bl примати вид Old World, такива като маймуните явански макак и макак резус, шимпанзета и човекоподобни маймуни. Изобретението осигурява метод за детектиране на анти-IGF-IR в биологична проба, включващ осъществяване 5 на контакт на биологичната проба с анти-IGF-IR антитяло от изобретението и детекция на свързаното антитяло, свързано с анти-IGF-IR, за да се детектира IGF-IR в биологичната проба. В един вариант, анти-IGF-IR антитялото се бележи 10 директно с маркер, който може да се детектира. В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото (първото антитяло) не е белязано, а е белязано второто антитяло или друга молекула, която може да се свърже с анти-IGF-IR антитялото. Както е добре 15 известно, на специалистите от нивото на техниката, второ антитяло се избира, така че специфично да свързва специфични видове и класове от първото антитяло. Например, ако антиIGF-IR антитялото е човешко IgG, тогава 20 второто антитяло може да е античовешко IgG. Други молекули, които могат да свързват антителата, включват, но не се ограничават само до Протеин А и Протеин G и двата от които са налични в търговската мрежа, например от Pierce 25 Chemical Co.
Подходящи маркери за антитялото или втори антитела, са описани по-горе и включват различни ензими, простетични групи, флуоресцентни материали, луминесцентни 30 материали, магнитни средства и радиоизотопни материали. Примери за подходящи ензими включват пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинестераза; примери за комплекси с подходящи 3 5 простетични групи включват стрептавидин/ биотин и авидин/биотин; примери за подходящи флуоресцентни материали включват умбелиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеин, 40 данзил хлорид или фикоеритрин; пример за луминесцентен материал включва луминол; пример за магнитно средство включва гадолиниум; примери за подходящи радиоактивни материали, включват 1251, 1311, 35S или 2Н. 45
В алтернативен вариант, IGF-IR може да бъде анализиран в биологична проба, чрез конкурентен имуноанализ, използващ IGF-IR стандарти, белязани със субстанция за детекция и небелязани анти-IGF-IR антитела. В този 50 анализ, биологичната проба, белязаните IGF-IR стандарти и анти-IGF-IR антитялото са комбинирани и се определя количеството на белязания 1GF-1R стандарт, свързан с небелязаното антитяло. Количеството на IGF-IR в биологичната проба е обратно пропорционално на количеството белязан IGF-IR стандарт, свързан с анти-IGF-IR антитяло.
Всеки може да използва имуноанализите, описани по-горе за известен брой цели. В един вариант, анти-IGF-IR антителата могат да се използват за детекция на IGF-IR в клетки в клетъчна култура. В предпочитан вариант, антиIGF-IR антителата могат да се използват, за определяне на нивото натирозиново фосфорилиране, тирозиново автофосфорилиране на IGF-IR и/или на количеството на IGF-IR върху клетъчната повърхност след третиране на клетките с различни съединения. Този метод може да се използва, за да се анализират съединенията, които могат да се използват, за да се активира или инхибира IGF-IR. В този метод, една проба от клетки се третира със съединение за анализ, за период от време, докато друга проба остава нетретирана. Ако трябва да се измери тирозиновото автофосфорилиране, клетките се лизират и се измерва тирозиновото фосфорилиране на IGF-IR, чрез използване на имуноанализ описан по-горе или чрез ELISA, както е описано в Пример III. Ако се измери тоталното ниво на 1GF-IR, клетките се лизират и тоталното ниво на IGF-IR се измерва, като се използва един от имуноанализите, описани погоре.
Предпочитан имуноанализ за определяне на тирозиновото фосфорилиране на IGF-IR или за измерване на тоталните нива на IGF-IR е ELISA или Western блот. Ако е необходимо да се измери само нивото на IGF-IR на клетъчната повърхност, клетките не се лизират и нивата на IGF-1R на клетъчната повърхност се измерват, като се използва един от имуноанализите описани по-горе. Предпочитан имуноанализ за определяне на нивата на 1GF-IR на клетъчната повърхност, включва етапите на белязане на белтъците върху клетъчната повърхност с белег за детекция, такъв като биотин или 1251, имунопреципитация на IGF-IR с анти-IGF-IR антитяло и след това детектиране на белязан IGF-IR. Друг предпочитан имуноанализ за определяне на
66460 Bl локализацията на IGF-IR, например нивата на клетъчната повърхност, е чрез използване на имунохистохимията. Известни от нивото на техниката, са също така методи, такива като ELISA, RIA, Western блот, имунохистохимия, белязане на интегралните мембранни белтъци от клетъчната повърхност и имунопреципитация. Виж например, Harlow and Lane, по-горе. Също така, имуноанализите могат да дадат оценка за високо количествен скрининг, за да се анализират голям брой съединения, или за активирането или за инхибирането на IGF-IR.
Анти-IGF-IR антителата от изобретението могат също така да се използват за определяне на нивата на IGF-IR в тъкан или клетки, получени от тъканта. В предпочитан вариант, тъканта е тъкан от заболял. В по-предпочитан вариант, тъканта е туморна тъкан или биопсия от нея. В предпочитан вариант от метода, тъканта или нейната биопсия е изрязана от пациент. Тъкан или биопсията, след това се използва в имуноанализ за определяне например на нивата на IGF-IR, нивата на IGF-IR от клетъчната повърхност, нивата на тирозиновото фосфорилиране на IGF-IR, или локализацията на IGF-IR чрез методите дискутирани по-горе. Методът може да се използва за определяне, ако туморът експресира високи нива от IGF-IR.
Гореописаният диагностичен метод може да се използва за определяне, дали туморът експресира високи нива на IGF-IR, което може да е индикация, че туморът ще отговори добре на лечението с анти-IGF-IR антитяло. Диагностичният метод, също така може да се използва за определяне, дали туморът е потенциално канцерогенен, ако експресира високи нива от IGF-IR или е доброкачествен, ако експресира ниски нива от IGF-IR.
По-нататък, диагностичният метод, може също така да се използва, за да се определи, дали лечението с анти-IGF-IR антитяло (виж по-долу), води до туморна експресия на ниски нива на IGFIR и/или до експресия на ниски нива на тирозиново автофосфорилиране и по този начин може да се използва за оценка, дали лечението е успешно. Обикновено, метод за оценка дали антиIGF-IR антитялото намалява тирозиновото фосфорилиране, включва етапи на измерване на нивото на тирозиново фосфорилиране в интересуващата ни клетка или тъкан, инкубиране на клетката или тъканта с анти-IGF-IR антитяло или негова антиген-свързваща част, след това ново измерване на нивото на тирозиновото фосфорилиране в клетката или тъканта. Може да се измери тирозиновото фосфорилиране на IGF-IR или на друг белтък (белтъци). Също така, диагностичният метод може да се използва за определяне дали тъканта или клетката не експресира достатъчно високи нива на 1GF-IR или достатъчно високи нива на активиран IGFIR, което може да бъде в случай на индивиди с джуджевизъм, остеопороза или диабет. Диагноза, че нивата на IGF-IR или на активен IGF-IR са прекадено ниски, може да се използва за лечение с активирани анти-IGF-IR антитела, 1GF-I или други терапевтични средства, за повишаване на нивата или активността на IGF-IR.
Антителата от настоящото изобретение могат също така да се използват in vivo за локализиране на тъканите и органите, които експресират IGF-IR. В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антителата могат да се използват за локализиране на IGF-IR-експресиращи тумори. Предимството на анти-IGF-IR антителата от настоящото изобретение е това, че те няма да доведат до имунен отговор при прилагането им. Методът включва етапи на прилагане на антиIGF-IR антитяло или на негов фармацевтичен състав на пациент, който се нуждае от такъв диагностичен тест и подлагане на пациента на образен анализ, за определяне на локализацията на IGF-IR-експресиращи тъкани. Образният анализ, също са добре известни в областта на медицината и включва, без да се ограничават до, рентгенов анализ, образ чрез магнитен резонанс (MRI) или компютърна томография (СЕ). В друг вариант от метода, биопсия се получава от пациент, по-скоро за определяне дали интересуващата ни тъкан експресира IGFIR, отколкото да се подложи пациента на образен анализ. В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антителата могат да се бележат със средство за детекция, което може да даде образ в пациент. Например антитялото може да се бележи с контрастиращо средство, такова като барий, който може да се използва за рентгенов анализ или магнитно контрастиращо средство, такова като гадолиниум хелат, който може да се използва за MRI или СЕ. Други средства за белязане включват, но не се ограничават до
66460 Bl радиоизотопи, такъв като 99Тс. В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото няма да е белязано и ще дава образ чрез въвеждане на второ антитяло или друга молекула за детекция, която може да се свърже с анти-IGF-IR антитяло. 5
Използване на терапевтични методи В друг вариант, изобретението осигурява метод за инхибиране на активността на 1GF-IR, чрез прилагане на анти-IGF-IR антитяло в пациент, който се нуждае от него. 10
Всеки един от видовете антитела, описани тук могат да се използват терапевтично. В предпочитан вариант анти-IGF-IR антитялото е човешко, химерно или антитяло, наподобяващо човешките антитела. В друг предпочитан вариант, 15 IGF-IR е човешки и пациента е човек. От друга страна, пациента може да е бозайник, който експресира IGF-IR, така че анти-IGF-IR антитялото да реагира кръстосано с него. Антитялото може да се прилага в бозайник, различен от 20 човек, който експресира IGF-IR, с който антитялото да реагира кръстосано (т.е. примат или маймуни вид cynomologous или rhesus) с ветеринарни цели или като животински модел за човешко заболяване. Такива животински 25 модели могат да се използват за оценка на терапевтична ефективност на антителата от изобретението.
Както се използва тук, терминът нарушение, при което IGF-IR активността е негативна 3 0 цели да включи заболявания и други нарушения, при които е показано, че присъствието на високи нива на IGF-IR в лицето, страдащо от нарушението са или вероятно са свързани с патофизиологията на нарушението или са фактор, 3 5 който допринася за влошаване на нарушението. Съответно, нарушение, в което високите нива IGF-IR активност е негативна, е нарушение, при което инхибирането на активността на IGF-IR се очаква да облекчи симптомите и/или развитието 40 на нарушението. Такива нарушения могат да се докажат, например чрез повишени нива на IGFIR върху клетъчна повърхност или с повишаване натирозиновото автофосфорилиране на IGF-IR в засегнатите клетки или тъкани, на страдащият 45 от нарушението субект. Повишаването на нивата на IGF-IR може да се наблюдава, например, като се използва анти-IGF-IR антитяло, както е описано по-горе.
В предпочитан вариант, анти-IGF-IR антит- 5 0 яло може да бъде приложено на пациент, който има IGF-IR-експресиращ тумор. Туморът може да бъде твърд тумор или нетвърд тумор, такъв като лимфом. В по-предпочитан вариант, антиIGF-IR антитялото може да се приложи на пациент, който има IGF-IR-експресиращ тумор, който е канцерогенен. Даже в още попредпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото се прилага в пациент, който има тумор на белия дроб, на гърдите, на простатата или на дебелото черво. В силно предпочитан вариант, методът води до спиране на нарастването на тумора на тегло или обем, или до намаляване на теглото и обема. В друг вариант, методът води до интернализиране на IGF-IR в тумора. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, или 6.1.1, или включва тежката верига, леката верига или тяхна антиген свързваща част.
В друг предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото може да се прилага на пациент, който експресира неподходящо високи нива от IGF-I. Известно е на специалистите от нивото на техниката, че високите нива на експресия на 1GF-1 могат да доведат до различни общоприети ракови състояния. В по-предпочитан вариант, анти-IGFIR антитялото се прилага в пациент с рак на простатата, глиома или фибросаркома. Даже в още по-предпочитан вариант, методът води до спиране на ненормалната пролиферация на рака, или до това, че не се повишава теглото или обема му или се понижава теглото или обема му.
В един вариант, споменатият метод се отнася до лечение на рак, такъв като рак на мозъка, на сквамозните клетки, на пикочния мехур, на стомаха, на панкреаса, на гърдите, на главата, на врата, на езофагуса, на простатата, колоректален рак, на белите дробове, ренален, на бъбрека, на яйчника, гинекологичен рак или рак на щитовидната жлеза. Пациенти, които могат да се лекуват със съединения от изобретението, съгласно методи от това изобретение, включват, например пациенти, които са диагностицирани, че имат белодробен рак, рак на костите, рак на панкреаса, рак на кожата, рак на главата и врата, кожна и вътреокуларна меланома, рак на матката, рак на яйчника, ректален рак, рак в аналната област, рак на стомаха, рак на дебелото черво, рак на гърдата, гинекологични тумори (например маточна саркома, карцином на фалопиевите /1С
66460 Bl тръби, карцином на ендометриума, карцином на шийката на матката, карцином на влагалището или на вулвата), заболяване на Hodgkin's, рак на езофагуса, рак на тънките черва, рак на ендокринната система (например рак на 5 щитовидната жлеза, на околощитовидните жлези, на надбъбречните жлези), саркоми на меките тъкани, рак на уретрата, рак на пениса, рак на простатата, хронична и остра левкемия, твърди тумори в детска възраст, лимфоцитни лимфоми, 10 рак на пикочния мехур, рак на бъбрека или уретрата (например ренална клетъчна карцинома, карцинома на бъбречното легенче), или неоплазми на централната нервна система (например, първичен лимфом на CNS, тумори на гръбначния 15 стълб, глиома на мозъчния ствол или аденом на хипофизата).
Антитялото може да се приложи един път, но по-добре е да се прилага многократно. Антитялото може да се прилага три пъти дневно всеки 20 шест месеца. Прилагането може да е по схема, такава като три пъти дневно, два пъти дневно, един път дневно, на всеки два дена, на всеки три дена, един път надве седмици, един път на месец, един път на всеки два месеца и един път на шест 25 месеца. Антитялото може да се приложи, през устата, чрез мукозата, чрез устната кухина, интраназално, чрез инхалация, интравенозно, подкожно, вътремускулно, парентерално, интратуморно или локално. Антитялото може да 30 се приложи на място, различно от мястото на тумора. Антитялото може също така да се прилага продължително, чрез малка помпа. Антитялото може да се прилага веднъж, най-малко два пъти или най-малко за период от време, докато 35 болестното състояние се третира, облекчи или излекува. Антитялото, обикновено се прилага, докато присъства тумора, при условия, че антитялото води до спиране на растежа или намаляване на обема на рака или тумора. 40 Антитялото, обикновено ще се прилага като част от фармацевтичен състав, както е описано погоре. Дозата от антитялото, обикновено ще е в обхвата от 0.1-100 mg/kg, по-добре 0.5-50 mg/ kg, още по-добре 1-20 mg/kg и даже още по- 45 добре 1-10 mg/kg. Концентрацията на антитялото в серума може да се измери, чрез всеки метод, известен от нивото на техниката. Виж например, Пример XVII по-долу. Антитялото може също така да се прилага профилактично, за да предпази 50 от рак или появата на тумор. Това прилагане може по-специално да е полезно за пациенти, които имат високо нормално ниво от IGF-I, понеже за тези пациенти е показано, че са с голям риск от развиване на общи ракови състояния. Виж Rosen et al., по-горе.
В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото може да се прилага съпътстващо с друго терапевтично средство, такова като антинеопластични лекарствени препарати или други молекули, в пациент, който има хиперпролиферативно нарушение, такова като рак или тумор. В един вариант, изобретението се отнася до метод за лечение на хиперпролиферативно нарушение в бозайник, включващ въвеждане в споменатия бозайник на терапевтично ефективно количество от съединение от изобретението в комбинация с антитуморно средство, избрано от групата, включваща, но не и ограничаваща се до инхибитори на митозата, алкилиращи средства, анти-метаболити, интеркалиращи средства, инхибитори на растежни фактори, инхибитори на клетъчния цикъл, ензими, топоизомеразни инхибитори, модификатори на биологичния отговор, антихормони, киназни инхибитори, инхибитори на матрикс металопротеинази, генетични терапевтици и антиандрогени. В по-предпочитан вариант, антитялото може да се прилага с антинеопластично средство, такова като адриамицин или таксол. В друг вариант, антитялото или комбинираната терапия се прилага заедно с радиотерапия, хемотерапия, фотодинамична терапия, хирургия или имунотерапия. В друг още предпочитан вариант, антитялото ще се прилага с друго антитяло. Например, анти-IGFIR антитялото може да се прилага с антитяло или друго средство, за което се знае, че инхибира тумора или пролиферацията на раковата клетка, например, антитяло или средство, което инхибира егЬВ2 рецептор, EGFR, CD20 или VEGF.
Съпътстващото прилагане на допълнително терапевтично средство с антитялото (комбинирана терапия) обхваща прилагане на фармацевтичен състав, включващ анти-IGF-IR антитялото и друго терапевтично средство и прилагане на два или повече различни фармацевтични състава, единият включващ антиIGF-IR антитялото, а другият (другите), включващи допълнително терапевтично средство (средства). Въпреки че съпътстващото прилагане или комбинирана терапия, обикновено означава, че антитялото и допълнителните терапевтични средства, всеки от които се прилагат по едно и също време, също може да обхване примери, в които антитялото и допълнителните терапевтични средства се прилагат по различно време. Например, антитялото може да се приложи един път на всеки три дни, докато допълнителното терапевтично средство се прилага един път дневно. От друга страна, антитялото може да се приложи, преди или след третирането на нарушението с допълнително терапевтично средство. По подобен начин, прилагането на анти-lGF-IR антитялото може да се приложи преди или след друга терапия, такава като радиотерапия, хемотерапия, фотодинамична терапия, хирургия или друга имунотерапия.
Антитялото и едно или повече допъл- 20 нителни терапевтични средства (комбинирана терапия) може да се приложи веднъж, два пъти или най-малко за период от време, докато болестното състояние не се третира, облекчи или излекува. За предпочитане е комбинираната 25 терапия да се прилага многократно. Комбинираната терапия се прилага от три пъти дневно до един път на всеки шест месеца. Прилагането може да се извърши по схема, такава като три пъти дневно, два пъти дневно, един път дневно, един път на всеки два дни, един път на всеки три дни, един път седмично, един път на всеки две седмици, един път месечно, един път на два месеца, един път на три месеца и един път на всеки шест месеца или може да се прилага продължително, чрез малка помпа. Комбинираната терапия може да се прилага, през устата, през мукозата, чрез устната кухина, интраназално, чрез инхалация, интравенозно, подкожно, вътремускулно, парентерално, вътретуморно или локално. Комбинираната терапия може да се прилага в место, различно от местото на тумора. Комбинираната терапия обикновено ще се прилага за толкова дълго, докато тумора присъства, при условие че антитялото води до спиране на растежа или намаляване на теглото или обема на тумора или рака.
Също така, в друг вариант анти-IGF-IR антитялото е белязано с радио белег, имунотоксин или токсин или е свързано по рекомбинантен път
460 В1 с белтък, включващ пептид на токсин. Анти-IGFIR антитялото или рекомбинантно получен белтък на анти-IGF-IR антитяло, насочва радио белега, имунотоксина, токсина или токсичния пептид 5 към IGF-IR-експресиращия тумор или раковата клетка. В предпочитан вариант, радио белега, имунотоксина или токсичния пептид се интернализират след като анти-IGF-IR антитялото се свърже с IGF-IR върху повърхността на ту10 мора или раковата клетка.
В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото може да се използва терапевтично, за да се индуцира апоптоза на специфични клетки в пациент, който се нуждае от това. В много случаи, прицелните клетки за апоптоза са ракови или туморни клетки, следователно, в предпочитан вариант, изобретението осигурява метод, индуциращ апоптоза, чрез прилагане на терапевтично ефективно количество от анти-IGFIR антитяло на пациент, който се нуждае от него. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1, или включва тежка верига, лека верига или тяхна антиген-свързваща област.
В друг вариант, анти-IGF-IR антитялото може да се използва за лечение на неканцерогенни състояния, при които високите нива на IGFI и/или IGF-IR са свързани с неканцерогенно болестно състояние или заболяване. В един 30 вариант, методът включва етап на прилагане на анти-IGF-IR антитяло в пациент, който има неканцерогенно патологично състояние, причинено или изострено от високи нива или активност на IGF-I и/или IGF-IR. В предпочитан 35 вариант, неканцерогенното патологично състояние е акромегалия, гигантизъм, псориазис, атеросклероза, гладкомускулна рестеноза на кръвоносните съдове или неподходяща микроваскуларна пролиферация, такива като, 40 тази намерена при усложненията на диабети, поспециално усложнения на очите. В попредпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото показва забавяне на развитието на неканцерогенното патологично състояние. В още по45 предпочитан вариант, анти-IGF-IR антитялото спира или противодейства, поне частично на неканцерогенното патологично състояние.
В друг аспект, изобретението осигурява метод за прилагане на активиращо анти-IGF-IR 50 антитяло в пациент, който се нуждае от него. В
66460 Bl един вариант, активиращото антитяло или фармацевтичен състав се прилага в пациент, който се нуждае от него на ефективно количество, за да увеличи активността на IGF-IR. В още попредпочитан вариант, активиращото антитяло, 5 също е способно да възстанови нормалната активност на IGF-IR. В друг предпочитан вариант, активиращото антитяло може да се прилага на пациент, който има малък ръст, невропатия, понижена мускулна маса или 10 остеопороза. В друг предпочитан вариант, активиращото антитяло може да се прилага с един или повече други фактори, които повишават клетъчната пролиферация, предпазват от апоптоза или повишават активността на IGF-IR. Такива 15 фактори, включват растежни фактори, такива като IGF-I и/или аналози на IGF-I, които активират IGF-IR. В предпочитан вариант, антитялото е избрано от 4.17.3 или включва тежката верига, леката верига, или тяхна антиген- 20 свързваща част.
Генна терапия
Молекулите нуклеинови киселини от настоящото изобретение могат да се прилагат в пациент, който се нуждае от тях, чрез генна 25 терапия. Терапията може да е или in vivo или ех vivo. В предпочитан вариант, на пациент се прилагат молекулите нуклеинови киселини, кодиращи както тежка верига, така и лека верига. В по-предпочитан вариант, молекулите 30 нуклеинова киселина се прилагат, така че да се интегрират стабилно в хромозомата на В клетките, понеже тези клетки са специализирани за продукция на антитела. В предпочитан вариант, прекурсорът на В клетките се трансфектира или 35 инфектира ex vivo и се трансплантира отново в пациента, който се нуждае от него. В друг вариант, прекурсорът на В клетките или други клетки се инфектират in vivo, като се използва известен вирус, който инфектира интересуващият ни 40 клетъчен тип. Обикновено векторите, използвани за генна терапия, включват липозоми, плазмиди или вирусни вектори, такива като ретровируси, аденовируси и аденоасоциирани вируси. След или in vivo или ex vivo инфекцията, нивата на 45 експресията на антитялото може да се проследи, като се вземе проба от лекуван пациент и като се използва който и да е от имуноанализите, известен от нивото на техниката, дискутирани тук.
В предпочитан вариант, методът на генна 50 терапия включва етапи на прилагане на ефективно количество от изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща тежката верига или антиген-свързващата нейна част от човешко антитяло или негова част и експресия на молекулата нуклеинова киселина. В друг вариант, методът на генна терапия включва етапи на въвеждане на ефективно количество от изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща леката верига или антиген-свързващата нейна част на човешкото антитяло или на негова част и експресиране на молекулата нуклеинова киселина. В по-предпочитан метод, генно терапевтичният метод включва етапи на прилагане на ефективно количество от изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща тежката верига или антигенсвързващата нейна част на човешко антитяло или част от него, и ефективно количество от изолираната молекула нуклеинова киселина, кодираща леката верига или антиген-свързваща нейна част на човешкото антитяло или на част от него и експресия на молекулите нуклеинова киселина.
Методът на генна терапия, също така включва етап на прилагане на друго антираково средство, такова като таксол, тамоксифен, 5-FU, адриамицин или СР-358,774.
С цел изобретението да бъде разбрано подобре, са изложени следващите примери. Тези примери са само с илюстративна цел и не се тълкуват по никакъв начин като ограничаващи обхвата на изобретението.
Примери за изпълнение на изобретението Пример 1. Създаване на хибридоми, продуциращи анти-IGF-IR антитяло
Антителата от изобретението са приготвени, селектирани и анализирани, както следва.
Имунизиране и създаване на хибридома Осем- и десетседмични мишки XENOMICE™ се имунизират интраперитонеално или в пръстите на задните лапи или с извънклетъчния домен на човешки IGF-IR (10 microg/доза/мишка), или с 3T3-IGF-IR или с 300.19-IGF-1R клетки, които са два пъти трансфектирани клетъчни линии и експресират човешки IGF-IR върху тяхната плазмена мембрана (10x106 клетки/доза/мишка). Тази доза се повтаря от пет до седем пъти през период от три до осем седмици. Четири дена преди ло
66460 Bl сливането, мишките получават крайна инжекция на извънклетъчния домен на човешки 1GF-1R в PBS. Лимфоцитите от далака и лимфните възли от имунизираните мишки се сливат с несекреторна миеломна клетъчна линия P3-X63 - Ag8.653 и се подлагат на HAT селекция, както е описано преди това (Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Получава се панел от хибридоми, всички секретиращи IGF-IR специфични човешки IgG2k антитела.
Седем хибридомни линии, продуциращи моноклонални специфични за 1GF-1R антитела, са избрани за следващо изследване и се означават като 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2. 5 4.17.3 и 6.1.1.
Хибридомите 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3 са депозирани в American Type Culture Collection (ATCC). 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, на 12 Декември, 10 2000 със следните номера за депозит:
Хибридома Номер на депозит
2.12.1..................... ........ .......... РТА-2792......... ..........
2.13.2 РТА-2788
2.14.3---------------- РТА-2790--------------------------
3.1.1 РТА-2791
4.9.2 ------- --------------- ---------- РТА-2789
4.17.3 РТА-2793
Пример II. Определяне на афинитетните константи (Kd) на изцяло човешките анти IGFIR моноклонални антитела, чрез BIAcor
Ние проведохме измервания на афинитета ηθ на пречистените антитела, чрез повърхностен плазмон резонанс, като използвахме апаратура BIAcore 3000, следвайки протоколите на производителя.
Протокол 1 25
Протеин-А се имобилизира върху повърхност на сензорен чип на BIAcore, за провеждането на кинетичните анализи. След това сензорният чип се използва за да улови антиIGF-IR антителата от настоящото изобретение, Различни концентрации от извънклетъчния домен на IGF-IR се инжектират върху сензорния чип и се анализират кинетиките на свързване и дисоциация от взаимодействията между антиIGF-IR антителата и извънклетъчния домен на IGF-IR. Данните са оценени, чрез глобално нагласен Langmuir 1:1, като се използва базово линейни поточни модели, налични в софтуера за BIA оценка, осигурен от BIAcore.
Протокол 2
По същество BIAcore измерванията се провеждат, както е описано от Fagerstam et al. Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping J. Mol. Recog. 3: 208-214, (1990). Таблица I показва списък на афинитетните измервания за представените анти-IGF-IR антитела от настоящото изобретение:
66460 Bl
Таблица I
Моноклонално— Ка(М) 1Q(M) .....
антитяло Протокол 1 Протокол 2
2.12.1 7.37х 10'9 ___________________ _____—— .......-...................-
2.13.2 3.5 х 10'9 1.53 х 10'9
2.14.3 6.41Х1О'10 -------
3.1.1 1.15 х Iff9 __________
4.9.2 6.84 х Ю’10 4.27xlO'10
4.17.3 1.3 х Iff4
--------- 6.1.1 — 5.65Х1010
Кинетичните анализи показват, че ’ jO антителата приготвени съгласно изобретението, притежават високи афинитета и високи константи на свързване с извънклетъчния домен на IGFIR.
Пример III. Антитяло-медиирано ^5 инхибиране на lGF-1-индуцираното фосфорилиране на IGF-IR
За да определим дали антителата от изобретението са способни да блокират IGF-Iмедиираното активиране на IGF-IR, ние проведохме експерименти с ELISA.
IGF-1-медиираното активиране на IGF-IR се детектира, чрез повишаване на рецепторсвързаното тирозиново фосфорилиране.
Приготвяне на плаки за ELISA
Плаките за хващане чрез ELISA се приготвят чрез добавяне по 100 microl блокиращ буфер (3 % говежди серумен албумин [BSA] в Tris-буферен солеви разтвор [TBS]) към всяка ямка от ReactiBind Protein G-покрити 96-ямкови cn плаки (Pierce) и инкубиране на плаките с разклащане в продължение на 30 min на стайна температура. Заешкото pan-специфичен SC-713 анти-IGF-IR антитяло (Santa Cruz) се разрежда в блокиращ буфер до концентрация 5 microg/ml и се добавят по 100 microl от разреденото антитяло към всяка ямка. Ямките се инкубират с разклащане в продължение на 60-90 min на стайна температура. След това плаките се промиват пет пъти с буфер за промиване (TBS + 0.1 % Tween 20) и остатъка от буфера внимателно се попива върху хартиени кърпички. Тези плаки се предпазват от изсушаване преди да се добави лизата.
Приготвяне на лизат от 1GF-IRекспресиращи клетки lGF-IR-трансфектираните NIH-3T3 клетки (5x104/ml) се поставят в 100 microl среда за растеж (среда DMEM с високо съдържание на глюкоза, с добавен L-глутамин (0.29 mg/ml), 10 % топлинно инактивиран FBS и 500 microg/ml
В1
Клетъчните лизати се отстраняват, чрез обръщане на плаките, промиване на плаките пет пъти с буфер за промиване и поливане върху хартиени кърпички. Добавят се по 100 microl на 5 ямка pTYR-специфично антитяло (HRP-PY54), разредено в блокиращ буфер до концентрация 0.2 microg/ml и плаките се инкубират с разклащане в продължение на 30 min на стайна температура.
След това, плаките се промиват пет пъти в буфер за промиване и се попиват върху хартиени кърпички.
Детектиране на свързването на HRP-PY54 антитялото, става чрез добавяне на 100 microl на 15 ямка от ТМВ разтвор на пероксидазен субстрат (Kirkegaard & Perry) и инкубиране с разклащане, докато не се прояви цвят (приблизително от 2 10 min). Цветната реакция се спира, чрез добавяне на 100 microl на ямка от ТМВ стоп 20 разтвор (Kirkegaard & Perry). След това плаките се разклащат за 10 s на стайна температура, за да се смеси разтвора, и се прави количествено измерване при OD450nm.
Таблица II и Фигура 4 показват резултатите от този експеримент, проведен с няколко антитела от изобретението. Резултатите от този експеримент показват способността на антителата от изобретението да блокират IGF-Iмедиираното активиране на IGF-1R, както е показано чрез повишаване на рецепторсвързаното тирозиново фосфорилиране.
По-нататък, тези резултати могат да се използват за количествена оценка на относителната сила на антителата от изобретението.
от всеки от генетицин, пеницилин и стрептомицин) в 96-ямкови плаки с U-образни дъна. Плаките се инкубират на 37°С, 5 % СО2 в продължение на една нощ, за да могат клетките да се прикрепят. Средата се отделя от плаките и се замества със 100 microl прясна среда във всяка ямка. За анализ, потенциалното анти-IGFIR антитяло се разрежда до пет пъти от желаната крайна концентрация в среда за растеж и се добавят по 25 microl на ямка. Всички проби се приготвят трикратно повторени. След това, плаките се инкубират на 37°С в продължение на 1 h. Клетките се стимулират с 25 microl/ямка от 600 ng/ml IGF-1 (приготвен в среда за растеж) и плаките се инкубират на стайна температура в продължение на 10 min. След това средата се отделя чрез обръщане на плаките и внимателно поливане върху хартиени кърпички и лизиране на адхерентните клетки, чрез добавяне на 50 microl лизис буфер (50 mM HEPES, pH 7.4, 10 тМ EDTA, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgC12, 1.6 mM NaVO4, 1% Triton Х-100, 1% глицерол добавен непосредствено преди употреба с една таблетка протеазни инхибитори без EDTA [Roche Molecular Sciences] за 50 ml) и разклащане за 5 25 min на стайна температура. Добавят се 200 microl буфер за разреждане (50 mM HEPES, pH 7.4, 1.6 mM NaVO4) към всяка ямка и се смесват, чрез пипетиране нагоре-надолу. 100 microl от лизата се прехвърлят от всяка ямка, към всяка 30 ямка от плаката за хващане чрез ELISA, приготвена както е описано по-горе и се инкубират, чрез внимателно разклащане, за 2 h на стайна температура.
ELISA с анти-тирозин-фосфатни (pTYR) 35 антитела
66460 Bl
Таблица Π
Моноклонално антитяло IC5o(ug/ml)
2.12.1 0.172
2.13.2 0.0812
------- --------2.14.3 0.325
4.9.2 _____ 0.0324 ...................
Пример IV. Антитяло-медиирано блокиране 20 на свързването IGF-I/IGF-1R
За да се направи количествена оценка на способността на антителата от изобретението да инхибират свързването на IGF-I с IGF-IR се провежда ELISA на базата на клетъчен анализ. 25 IGF-IR-трансфектирани NIH-3T3 клетки (5 х 104/ ml), се посяват в DMEM с високо глюкозно съдържание, допълнена с L-глутамин (0.29 mg/ ml), 10 % топлинно-инактивиран FBS и 500 microg/ml от всеки от генетицин, пеницилин и 30 стрептомицин по 100 microl в 96-ямкови плаки с U-образно дъно. След това плаките се инкубират на 37°С, 5 % СО2 в продължение на една нощ, за да се осъществи прикрепването. След това, средата се премахва от плаките и се замества със 3 5 100 microl прясна среда във всяка ямка. Антителата за анализа, се разреждат до желаната крайна концентрация и се добавят по 50 microl на ямка, в среда за анализ (DMEM с високо съдържание на глюкоза, с добавен L-глутамин, 10 % топлинно- 40 инактивиран FBS, 200 microg/ml BSA и 500 microg/ml от всеки от генецитин, пеницилин и стрептомицин). Всички проби се приготвят трикратно. След това, плаките се инкубират на
37°С, в продължение на 10 min. [125I]-IGF-1 се разрежда до концентрация от 1 microCi/ml в среда за анализ и се добавят по 50 microl във всяка ямка от плаката. Като контрола за фонова радиоактивност, се добавя изстуден IGF-I в крайна концентрация от 100 ng/ml. Плаките се инкубират в продължение на 10 min при 37°С, средата се премахва, чрез внимателно поливане върху хартиени кърпички и се промиват два пъти със среда за анализ. След това, клетките се лизират, чрез добавяне на 50 microl 0.1 N NaOH, 0.1 % SDS и плаките се разклащат в продължение на 5 min на стайна температура. След това, пробите се прехвърлят в сцинтилационна плака, добавят се по 150 microl OptiPhase Supermix и се отчита сигнала с брояч Wallac Micro-Beta counter.
Таблица III и Фигура 3 показват резултатите от този експеримент, проведен с три представителни антитела от изобретението. Този експеримент показва, че антителата от изобретението, специфично инхибират свързването на [125IJ-1GF-I с клетки, свръхекспресиращи IGFIR.
...... £4ΛΖΛ Ι21_._
Таблица III
Моноклонално антитяло _______________1С50_______________
2.12.1 0.45 μβ /ml
2.13.2 0.18 μβ/ml
4. 9.2 ___________0.1 μβ/ml___________
Пример V. Изследвания за епитопно картиране
След като е показано, че антителата от изобретението разпознават IGF-IR, са проведени изследвания за епитопно картиране, с няколко антитела от изобретението. По-специално внимание се обръща на антителата 2.12.1,2.13.2, 2.14.3 и 4.9.2.
Проведени са конкурентни изследвания с BIAcore за определяне, дали антителата от изобретението се свързват същото или различно място от IGF-1R молекулата. Свързват се извънклетъчния домен (ECD) на IGF-IR със сензорен чип BIAcore, както е описано по-горе в Пример II. Свързано е първото антитяло от изобретението с този сензорен чип, свързан с IGF-IR при условия на насищане. След това е измерена способността на последващите втори антитела от изобретението да се конкурират с първото антитяло за свързване с IGF-IR. Тази техника позволява да се определят антителата от това изобретение, към различни групи.
Този експеримент е проведен с антителата 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 и 4.9.2. Ние наблюдаваме, че 2.13.2 и 4.9.2 се конкурират за същото място върху извънклетъчния домен на 1GF-1R. Другите антитела, 2.12.1 и 2.14.3 се свързват с места от IGF-IR, които са различни както едно от друго, така и от местата, с които се свързват 2.13.2 и 4.9.2.
Пример VI. Видове кръстосана реактивност на антителата от изобретението
За да се определят видовете кръстосана реактивност на антителата от изобретението, са проведени няколко експеримента, включващи имунопреципитация, антитяло-медиирано блокиране на IGF-1-индуцираното рецепторно фосфорилиране и FACS анализ.
За да се проведат експериментите с имунопреципитация, клетките се посяват в Т25 15 матраци в DMEM с високо съдържание на глюкоза, допълнена с L-глутамин (0.29 mg/ml), 10 % топлинно-инактивиран FBS, и 500 microg/ ml от всеки от генецитин, пеницилин и стрептомицин до 50 % конфлуентност. След това 20 се добавят 100 microl антитяло от изобретението в буферен солеви разтвор на Hank (HBSS; Gibco BRL) с концентрация 1 microg/ml. Плаките се инкубират в продължение на 30 min на 37°С в инкубатор и след това клетките се стимулират с 25 1GF-I в концентрация 100 ng/ml в продължение на 10 min на стайна температура. Клетките се лизират в RIPA буфер (Harlow and Lane, по-горе) и IGF-IR се имунопреципитира с 2 microg от рапспецифично SC-713 анти-IGF-IR антитяло (Santa 30 Cruz) плюс протеин А агарозни зърна, в продължение на 1 h при 4°С. Зърната се утаяват и се промиват три пъти с PBS/T (PBS + 0.1 % Tween-20), след което зърната се сваряват в 40 microl Laemmli буфер, съдържащ 5 % БетаМЕ.
Пробите се приготвят както е описано погоре и след това се анализират, чрез Western блот. 12 microl от всяка проба се нанасят на всеки старт върху 4 -10 % градиентни Novez™ гелове и се разделят с I X MES буфер (Novex™). Теловете се пускат на 150 V в продължение на 1 h или на 200 V в продължение на приблизително 30 min. След това теловете се прехвърлят върху мембрана в Novex™ буфер за трансфер с 10 % метанол, или в продължение на една нощ на 100 mA или за 1-1.5 h при 250 mA. След това мембраните се изсушават напълно и се блокират на стайна температура с TBS (Tris-буфериран солеви разтвор pH 8.0), съдържащ Superblock (Pierce Chemical Co.). Добавя се 1GF-1R антитялото за блот SC713 (Santa Cruz), за да се
66460 Bl детектира имунопреципитиралия IGF-IR.
Този експеримент се провежда с антитела от изобретението, по-специално с 2.12.1,2.13.2, 4.17.3 и 4.9.2 върху клетки от различни животни. Намерено е, че антителата 2.12.1, 2.13.2 и 4.9.2 5 могат да се свържат, с човешки, но не и с IGFIR от куче, морско свинче, заек. Също така, тези антитела могат да се свържат с COS7 и Rhesus IGF-IR и двете с произход от маймуна вид old world, но не и с IGF-IR от мармозетка, който е 10 маймуна от вид new world. Тези експерименти показват, че антителата са високо специфични.
Антитяло-медиирано блокиране на свързването IGF-I/IGF-IR в примати, различни от човек 15
Съгласно нашите наблюдения, че антителата от изобретението разпознават IGF-IR от маймуни вид old world, анализирана е също така и тяхната способност да блокират свързването IGFI/IGF-IR в клетки, с произход от тези маймуни 20 вид old world. Клетките се засяват в Т25 матраци в DMEM среда с високо съдържание на глюкоза, допълнена с L-глутамин, 10 % топлинноинактивиран FBS и 500 microg/ml от всеки от геницитин, пеницилин и стрептомицин до 50 % 25 конфлуентност. След това се добавя антитяло от изобретението или среда без антитяло, като контрола и клетките се стимулират с 1GF-I с концентрация 100 ng/ml в продължение на 10 min на стайна температура. След стимулиране, 30 клетките се лизират и IGF-IR се имунопреципитира с pan-специфично IGF-IR антитяло SC713, както е описано по-горе. След това се провеждат Western блот анализи, както е описано по-горе, като се използва HRP-PY54 антитяло, за детекция 3 5 на фосфорилиран тирозин в активирания IGF-IR.
Наблюдава се, че антителата от това изобретение, по-специално 2.13.2 и 4.9.2 могат да блокират IGF-1-индуцираното фосфорилиране на IGF-IR, както в COS7, така и в Rhesus клет- 40 ките. IC50 на наблюдаваното инхибиране е съответно 0.02 microg/ml и 0.005 microg/ml за COS7 и Rhesus IGF-IR.
Определяне на кръстосан афинитет на антителата от изобретението от различни видове 45
Проведен е FACS анализ за определяне афинитета на антителата от изобретението към IGF-IR от други животни, по-специално маймуните вид old world, описани по-горе. Аликвоти от човешки и маймунски клетки 50 (5x105) се инкубират в продължение на 1 h върху лед с нарастващи концентрации от биотинилирани анти-IGF-IR антитела от изобретението или с биотинилирано анти-keyhole limpet хемоцианин (KLH) антитяло (Abgenix) като отрицателна контрола. След това пробите се инкубират в продължение на 30 min на лед със стрептавидин-конюгиран RPE (фикоеретрин). Свързването се измерва, чрез флоуцитометрия и хистограмите се анализират по интензитет на флуоресценция (F12-H) спрямо броя клетки (импулси), като се използва CellQuest софтуер. Изчислява се свързването (Kd) за всяко антитяло от графиката от средния интензитет на флуоресценция спрямо концентрацията на антитялото. В повечето експерименти се измерва свързването в култивирани човешки MCF-7 клетки и/или в тъканна култура от rhesus или от cynomologous. Контролът за намаляване на антитялото, се осъществява чрез измерване на свързването за определен обхват от клетъчни концентрации.
Проведени са гореспоменатите FACS анализи, за да се анализира способността на антителата от изобретението, по-специално 2.13.2 и 4.9.2, за свързване с клетки от човек, rhesus и cynomologous. Наблюдават се полу-максимално свързване (Kd) от 0.1 microg/ml за всички анализирани клетъчни линии.
Пример VII. Потискане на IGF-I рецептора Проведени са експерименти за блокиране, както е описано в Пример IV до добавянето на [1251]-белязан IGF-I. На този етап, клетките се сваряват в 40 microl Laemmli буфер, съдържащ 50 % те. След това, пробите се анализират чрез western блот анализ, както е описано по-горе в Пример VI и блотовете се бележат както с рапспецифично IGF-IR антитяло SC713 за количествена оценка на нивата на IGF-IR, така и с HRP-PY54 антитяло, за да се следят нивата на фосфорилирания тирозин в активирания IGFIR.
Както е наблюдавано преди това (Пример III), наблюдава се блокиране на lGF-1-индуцираното фосфорилиране на 1GF-IR след третирането на клетките с антитяло от изобретението (Фигура 4). След това се наблюдава, че това блокиране на IGF-I-индуцираното фосфорилиране е последвано от потискане на IGF-IR в тези клетки. Виж, например Фигура 4. Нивата
66460 Bl на IGF-IR са максимално редуцирани след 16 h стимулиране с IGF-I в присъствието на антитяло от изобретението.
Пример VIII. In vivo ефекти на антителата от изобретението върху IGF-IR 5
Определя се, дали ефектите на антителата от изобретението върху IGF-IR, които са описани в предишните примери, могат да се срещат in vivo. Индуцирани са тумори в мишки, на които е отстранен тимуса, съгласно публикувани 10 методи (V. A. Pollack et al., Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice, J. 15 Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748 (1999).
Накратко, инжектират се подкожно IGFIR-трансфектирани NIH-3T3 клетки (5х 106) в 34-седмични мишки, на които е отстранен тимусът (nulnu) с 0.2 ml от препарат Matrigel. След това 20 мишките се инжектират интраперитонеално с антитяло от изобретението, след като са установени образувалите се тумори (т.е. около 400 mm3).
h по-късно, туморите се екстрахират, 25 хомогенизират и се определя нивото на IGF-IR. За да се определят нивата на IGF-IR, антитялото SC-713 се разрежда в блокиращ буфер до крайна концентрация microg/ml и се добавят по 100 microl към всяка върху покритие от кози анти- 30 заешки Reacti-Bind (GAR) (Pierce). Плаките се инкубират на стайна температура в продължение на 1 h, с разклащане и след това плаките се промиват пет пъти с буфер за промиване. След това, туморните проби се претеглят, както е 35 описано по-горе и се хомогенизират в лизис буфер (1 ml/100 mg). 12.5 microl от туморните екстракти се разреждат в лизис буфер до краен обем 100 microl и се добавят към всяка ямка на 96-ямковата плака. Плаките се инкубират на 40 стайна температура с разклащане, в продължение на 1 -2 h и след това се промиват пет пъти с буфер за промиване. След това към всяка ямка се добавят по 100 microl HRP-PY54 или биотинилирано анти-IGF-IR антитяло в блокиращ 45 буфер и се инкубират на стайна температура с разклащане, в продължение на 30 min. След това, плаките се промиват пет пъти с буфер за промиване и плаките се проявяват. Проявяването на плаките с HRP-PY54 чрез добавяне на 100 50 microl на всяка ямка от ТМВ субстрат за микроямки и проявяването на цветната реакция се спира с добавяне на 100 microl 0.9 М H2SO4. След това се прави количествена оценка на сигнала, чрез разклащане в продължение на 10 s и измерване при OD450nm. Сигналът се нормализира за тотален белтък. Проявените плаки се бележат с анти-IGF-IR антитяло, чрез добавяне към всяка ямка на 100 microl стрептавидин-HRP разреден в блокиращ буфер и инкубиране на стайна температура с разклащане, в продължение на 30 min и след това се продължава, както е описано за HRP-PY54.
Вижда се, че интраперитонеалната инжекция от антитяло от това изобретение, по-специално от 2.13.2 и 4.9.2, води до инхибиране на активността на IGF-IR, която се измерва, чрез намаляване на [както на IGF-IR фосфотирозина (фосфорилиран IGF-IR) така и на] тоталният IGFIR белтък (Фигура 6). Също така се наблюдава намаляване на IGF-IR фосфотирозина (фосфорилираният IGF-IR) (Фигура 5). Без да искаме да се придържаме към която и да е теория, намалените нива на IGF-IR фосфотирозина могат да се дължат на in vivo намалени нива на IGF-IR белтъка, след третиране с антитялото или могат да се дължат на комбинирано намаляване на нивата на IGF-IR белтъка и намаляване на тирозиновото фосфорилиране на IGF-IR, който присъства, поради блокиране на активирането от страна на лиганд (например, IGF-I или IGF-II). Също така, такова инхибиране е отговорно за дозата за инжектиране на антитялото (Фигура 6). Тези данни показват, че антителата от изобретението са способни да насочват in vivo IGF-IR по аналогичен начин на този, който се наблюдава in vitro.
Пример IX. Инхибиране на растежа (TGI) на 3T3/1GF-IR клетъчни тумори
Направен е анализ, дали анти-IGF-IR антителата от изобретението имат функция да инхибират туморния растеж. Индуцирани са тумори, както е описано по-горе (Пример VIII) и когато се установи, образуването на осезаеми тумори (т.е. 250 mm3, в рамките на 6 - 9 дни), мишките се третират с единична доза от 0.20 ml от антитялото, чрез интраперитонеална инжекция. Туморният размер се мери, чрез дебеломер на Vernier през два диаметъра, на всеки трети ден, и се изчислява обема, като се използва
66460 Bl формулата (дължина х [ширина]2)/2, като се използват методи, установени от Geran et al., Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems, Cancer Chemother. Rep. 3:1 -104. 5
Когато се провежда този анализ с антитяло от изобретението, намерено е, че единично третиране само с антитяло 2.13.2 инхибира растежа на lGF-lR-трансфектирани NIH-3T3 клетъчно-индуцирани тумори (Фигура 7, ляв 10 панел). Също така, при комбинирани изследвания с единична интравенозна доза от 7.5 mg/kg, приложена с адриамицин, се наблюдава, че прилагането на единична доза от 2.13.2 повишава ефективността на адриамицина, който е известен 15 инхибитор натуморния растеж. Комбинацията от адриамицин с антитяло от изобретението 2.13.2 показва забавяне на растежа със 7 дни, спрямо третирането само с антитялото или адриамицина (Фигура 7, десен панел). 20
Пример X. Връзка на нивата на антитялото с потискането на IGF-IR
Индуцирани са тумори в голи мишки, както е описано в Пример VIII. Мишките след това се третират със 125 microg от 2.13.2, чрез 25 интраперитонеална инжекция, както е описано в Пример VIII. Туморите се екстрахират и се измерват нивата на IGF-IR, чрез ELISA, както е описано в Пример VIII. Фигура 8 показва серумните нива на 2.13.2 антитялото и нивата на 30 IGF-IR рецептора за периода от време. Експериментът показва, че IGF-IR се потиска от антитялото и че степента на инхибиране на IGFIR е дозо-пропорционална на концентрацията на антитялото в серума. 35
Пример XI. Инхибиране на растежа на ЗТЗ/ IGF-IR тумори с многократни дози от антитяло, комбинирано с адриамицин
Индуцирани са тумори в голи мишки, както е описано в Пример IX. Мишките с 40 установени подкожни тумори, около 250 mm3 се третират на ден 1,8,15 и 22 с различни количества от 2.13.2 антитяло (i. р.) или със 7.5 mg/kg адриамицин (i. v.), или като единични средства, или в комбинация, както е описано в Пример IX. 45 Фигура 9 показва туморният размер спрямо различните третирания през периода от време.
Експериментът показва, че третирането с анти-IGF-IR антитяло, давано на всеки седем дни, инхибира туморния клетъчен растеж и повишава 50 инхибирането на туморния клетъчен растеж в комбинация с адриамицин, който е известен туморен инхибитор.
Пример XII. Инхибиране на растежа на големи тумори
Индуцирани са тумори в голи мишки, както е описано в Пример IX. Мишките с установени големи подкожни тумори, малко помалки от 2000 mm3, се третират на ден 1 и 8 с различни количества от 2.13.2 антитяло (i. р.) или 7.5 mg/kg адриамицин (i.v.), или като единични средства или в комбинация, както е описано в Пример IX. Фигура 10 показва, че по отношение на различните третирания за периода от време.
Експериментите с контролните групи, групите животни само с антитяло или само с адриамицин се преустановяват на ден 5, когато туморният размер превиши 2000 mm3. Експериментът показва, че третирането с антиIGF-IR антитяло в комбинация с адриамицин е високо ефективно, срещу големи тумори, когато се дават многократни дози.
Пример XIII. Инхибиране на растежа на колоректални клетъчни тумори
Индуцирани са тумори в голи мишки, както е описано в Пример IX, с изключение на това, че се използват Colo 205 клетки (АТСС CCL 222). Colo 205 клетките са човешки аденокарциномни колоректални клетки. Мишките с установени подкожни тумори, приблизително 250 mm3 са третирани с различни количества от 2.13.2 антитяло (i. р.) или със 100 mg/kg 5-флуородезоксиуридин (5-FU, i. v.), или като единични средства или в комбинация, както е описано в Пример IX. Фигура 11 показва туморният размер спрямо различните третирания през периода от време. Експериментът показва, че третирането с анти-IGF-IR антитяло, давано еднократно, инхибира човешкият колоректален раков клетъчен растеж, когато е осигурен като единично средство и също така повишава ефективността на 5-FU, който е известен туморен инхибитор.
Мишките с установени Colo 205 тумори се третират на ден 1,8, 15 и 22 с 500 microg 2.13.2 (i. р.), 100 mg/kg 5-FU (i. v.) или c тяхна комбинация.
Фигура 12 показва туморният размер спрямо различните третирания през периода от време. Експериментът показва, че третирането с анти-IGF-IR антитяло, давано един път на всеки седем дни, инхибира клетъчния растеж на човешки колоректален рак и повишава ефективността на 5-FU.
Пример XIV. Инхибиране на растежа на клетъчни тумори на рак на гърдата
Както е описано в Пример VIII, голи мишки са имплантирани с биодеградиращи естрогенни утайки (0.72 mg 17-бета-естрадиол/ утайка, освобождаване на 60 ден; Innovative Research of America). След 48 h, се индуцират тумори в голите мишки, по същество, както е описано в Пример IX, с изключение на това, че се използват MCF-7 клетки (АТСС НТВ-22). MCF-7 клетките са естроген-зависими човешки карциномни клетки от рак на гърдата. Мишките с установени подкожни тумори от приблизително 250 mm3 са третирани с 50 microg 2.13.2 антитяло (i. р.) на ден 1,4, 7, 10, 13,16, 19 и 22 (q3dx7) или с 6.25 mg/kg таксол (i. р.) на ден 1, 2, 3, 4, 5 (qldx5), или като единични средства или в комбинация, описани по същество в Пример IX. Фигура 13 показва туморният размер спрямо различните третирания през периода от време. Експериментът показва, че третирането само с анти-IGF-IR, инхибира растежа на клетъчния рак на гърдата, когато се прилага веднъж на всеки три дни, а също така и повишава ефективността на таксола, който е известен инхибитор на рака на гърдата, когато се дава в комбинация.
Мишките, които имат установени тумори от MCF-7 клетки, описани непосредствено погоре, са третирани на ден 1 с различни количества само от 2.13.2 антитяло (i. р.) или с 3.75 mg/kg адриамицин (i. v.), по същество както е описано в Пример IX. Фигура 14 показва туморният размер спрямо различните третирания през периода от време. 40
Експериментът показва, че еднократното третиране само с анти-IGF-IR антитяло, инхибира клетъчният растеж на рака на гърдата и повишава ефективността на адриамицина, който е известен туморен инхибитор. 45
Мишките, с установени тумори от MCF-7 клетки, описани непосредствено по-горе, са третирани с 250 microg 2.13.2 антитяло (i. р.) на дни 1,8, 15 и 23 или с биодеградираща утайка от тамоксифен (25 mg/утайка, свободна база, с 50
460 В1 освобождаване 60 дена, Innovative Research of America), или като единични средства или в комбинация, по същество както е описано в Пример IX. Тамоксифеновата утайка се 5 имплантира на ден 1 след като е установен тумора. Фигура 15 показва, туморният размер спрямо различните третирания през периода от време. Експериментът показва, че третирането с анти-IGF-IR антитяло, приложено един път на 10 седем дни, инхибира растежа на човешкия рак на гърдата, самостоятелно, или повишава ефективността натамоксифена, който е известен туморен инхибитор.
Пример XVI. Инхибиране на растежа на 15 Епидермоидни карциномни клетъчни тумори
Туморите са индуцирани в голи мишки, по същество както е описано в Пример IX, с изключение на това, че използват А431 клетки (АТСС CRL 1555). А431 клетките са човешки клетки от епидермоиден карцином, които свръхекспресират EGFR. Мишките, с установени подкожни тумори, приблизително 250 mm3, се третират на ден 1,8, 15, 22 и 29 с 500 microg 2.13.2 антитяло (i. р.) или се третират един път 25 дневно за 27 дни с 10 mg/kg СР-358,774 давано орално (р. о.), или като единични средства, или в комбинация, както е описано в Пример IX. СР358,774 е описано в United States Патент 5,747,498 и Moyer et al., Cancer Research 57: 30 4838-4848 (1997), въведени тук, чрез цитираната литература. Фигура 16 показва туморният размер спрямо различните третирания през периода от време. Експериментът показва, че третирането с анти-IGF-IR антитялото повишава ефективността 35 на СР-358,774, известен EGF-Rthpo3hh киназен инхибитор, за инхибиране на растежа на човешки епидермоиден карциномен тумор.
Пример XVII. Фармакокинетики на антиIGF-IR антителата in vivo
За да се оценят фармакокинетиките на антиIGF-IR антителата, маймуни от вид, cynomolgus се инжектират интравенозно с 3,30 или 100 mg/ kg от 2.13.2 антитяло в ацетатен буфер. Взима се серум от маймуните в различни периоди от време и се определя концентрацията на нивата на антиIGF-IR антитялото в маймуните, за периоди до десет седмици. За да се направи количествена оценка на функционалните серумни нива на антитялото, извънклетъчния домен на човешкия IGF-IR (IGF-I-sR, R & D Systems, Catalog nm;
66460 Bl
391 GR) се свързва c 96-ямкови плаки. Маймунският серум (в разреждания 1:100 и 1:15,000) се добавя към плаките за анализ, така че всяка проба да е в рамките на линейния обхват от стандартната крива, и се инкубират при 5 условия, при които всяко анти-IGF-IR антитяло, ще се свърже с IGF-1-sR. След промиване на плаките, към плаките се добавя белязаното античовешко IgG антитяло и се инкубира при условия, при които античовешкото IgG антитяло 10 ще се свърже с анти-IGF-IR антитялото. Плаките, след това се промиват и се проявяват, и се използва контролна стандартна крива и линейно регресивно нагласяване, за да се определи количеството на анти-IGF-IR антителата. Фигура 15 17 показва, концентрацията на 2.13.2 в серума през периода от време. Експериментът показва, че полуживота на анти-IGF-IR антитялото е 4.6 до 7.7 дни и че има обемно разпространение от 74-105 ml/kg. Също така, експериментът показва, 20 че даваните количествата, са дозопропорционални в маймуната, което показва, че анти-IGF-IR антитялото насища всички съществуващи IGF-IR свързващи места в тялото, даже при най-ниските дози от 3 mg/kg. 25
Пример XVIII. Комбинирана терапия от анти-IGF-IR и адриамицин потиска in vivo IGFIR
Туморите са индуцирани в голи мишки, както е описано в Пример IX. Мишките с 30 установени подкожни тумори от приблизително 400 mm3 се третират с единична инжекция от 250 microg 2.13.2 антитяло (i. р.) или със 7.5 mg/kg адриамицин (i. v.), или като единични средства или в комбинация, както е описано в Пример IX. 35 72 h след прилагането на средствата, туморите са екстрахирани, както е описано в Пример VIII и еднакви количества от туморните екстракти се разделят електрофоретично, чрез полиакриламиден гел с натриев додецил сулфат (SDS PAGE) и 40 се анализират, чрез western блот, като се използва анти-IGF-IR антитяло SC-713 (Santa Cruz). Фигура 18 показва количествата на IGF-IR в туморни клетки в контролни животни (първите три старта на всеки панел), в животни третирани 45 само с антитяло (горен панел), в животни, третирани само с адриамицин (среден панел) и в животни, третирани с антитяло и адриамицин (долен панел). Всеки старт представя еднакви количества от белтък от отделни тумори от 50 различни мишки.
Експериментът показва, че третирането само с адриамицин има малък ефект върху нивата на IGF-IR и че третирането само с антитялото показва известно намаляване в нивата на IGF-IR. Изненадващо, едновременното третиране с адриамицин и антитялото, показват значително намаляване на нивата на IGF-IR, което показва, че адриамицина и антитялото до голяма степен потискат нивата на IGF-IR.
Всички публикации и патентни заявки, цитирани в тази спецификация са въведени тук, чрез цитираната литература, като за всяка отделна публикация или патентна заявка е посочено специфично и поотделно, как да бъде включена в цитираната литература. Въпреки че гореописаното изобретение е описано в някои подробности, с илюстративна цел и като пример с цел да се изясни и разбере, ще стане веднага очевидно на специалистите от нивото на техниката, че в светлината на указанията от това изобретение, могат да бъдат направени някои промени и модификации, без да се отдалечат от духа и обхвата на приложените патентни претенции.

Claims (39)

  1. Патентни претенции
    1. Моноклонално антитяло, или негова антигенсвързваща част, което се свързва специфично с човешкия рецептор за инсулинподобния растежен фактор I (IGF-IR), където споменатото антитяло включва трите CDR аминокиселинни секвенции от вариабилен домен, избран от групата, съставена от:
    а) вариабилен домен от леката верига на антитяло, избрано от 2.12.1,2.13.2,2.14.3,3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    б) вариабилен домен от леката верига, включващ аминокиселинна секвенция, избрана от групата, съставена от SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 18;
    в) вариабилен домен от тежката верига на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    г) вариабилен домен от тежката верига, включващ аминокиселинна секвенция, избрана от групата, съставена от SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID
    66460 Bl
    NO: 20; и
    д) вариабилни домени от тежката и леката верига на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3.
  2. 2. Антитялото или негова част съгласно претенция 1, където антитялото е човешко.
  3. 3. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 1, където споменатото антитяло включва шестте CDR аминокиселинни секвенции на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2 и 4.17.3.
  4. 4. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 1, където споменатото антитяло или антиген-свързващата част включва лековерижен вариабилен домен, който включва не повече от десет аминокиселинни промени от аминокиселинната секвенция, кодирана от гена на родителската линия АЗО или 012.
  5. 5. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 1, където лековерижният вариабилен домен включва аминокиселинна секвенция, избрана от групата, съставена от SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 18.
  6. 6. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 1, където споменатото антитяло или антиген-свързващата част включва тежковерижен вариабилен домен, който включва не повече от осем аминокиселинни промени от 30 аминокиселинната секвенция, кодирана от гена на родителската линия VH DP47, DP35, DP71 или VIV-4.
  7. 7. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 1, където 35 тежковерижният вариабилен домен включва аминокиселинна секвенция, избрана от групата, съставена от SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 20.
  8. 8. Антитялото или антиген-свързващата 40 част съгласно претенция 1, където споменатото антитяло включва лека верига и тежка верига, които включват аминокиселинни секвенции, избрани от групата, съставена от:
    а) съответно от SEQ ID NO: 2 и SEQ ID 45 NO: 4;
    б) съответно от SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8;
    в) съответно от SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12; 50
    г) съответно от SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16; и
    д) съответно от SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20.
    5
  9. 9. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 1, където споменатото антитяло включва аминокиселинна секвенция от вариабилен домен на тежката верига и аминокиселинна секвенция от вариабилен домен 10 на леката верига на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2 и 4.17.3.
  10. 10. Антитялото съгласно претенция 1, където споменатото антитяло включва тежка 15 верига и лека верига и където аминокиселинните секвенции на тежката верига и на леката верига са избрани от групата, съставена от:
    а) аминокиселинната секвенция на тежката верига и аминокиселинната секвенция на леката 20 верига на 2.12.1;
    б) аминокиселинната секвенция на тежката верига и аминокиселинната секвенция на леката верига на 2.13.2;
    в) аминокиселинната секвенция на SEQ ID
    25 NO: 45 без сигналната секвенция и аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 47 без сигналната секвенция; и
    г) аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 49 без сигналната секвенция и аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 51 без сигналната секвенция.
  11. 11. Антитялото съгласно претенция 1, където антитялото е избрано от групата, съставена от 2.12.1,2.13.2,2.14.3,3.1.1,4.9.2 и 4.17.3, или антитяло със същите аминокиселинни секвенции, както избраното антитяло.
  12. 12. Моноклонално антитяло, което се свързва специфично с IGF-IR, където споменатото антитяло включва тежка верига, чиято аминокиселинна секвенция включва CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинни секвенции в SEQ ID NO: 4 и лека верига, чиято аминокиселинна секвенция включва CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинни секвенции в SEQ ID NO: 2.
  13. 13. Моноклоналното антитяло съгласно претенция 12, където споменатата тежка верига включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 4 и споменатата лека верига включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 2.
  14. 14. Моноклонално антитяло, чиято тежка
    66460 Bl верига включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 49 без сигналната секвенция и чиято лека верига включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 51 без сигналната секвенция. 5
  15. 15. Моноклонално антитяло, което се свързва специфично с 1GF-IR, където споменатото антитяло включва тежка верига, чиято аминокиселинна секвенция включва CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинни секвенции в SEQ 10 ID NO: 8 и лека верига, чиято аминокиселинна секвенция включва CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинни секвенции в SEQ ID NO: 6.
  16. 16. Моноклоналното антитяло съгласно претенция 15, където споменатата тежка верига 15 включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 8 и споменатата лека верига включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 6.
  17. 17. Моноклонално антитяло, чиято тежка верига включва аминокиселинната секвенция на 20 SEQ ID NO: 45 без сигналната секвенция и чиято лека верига включва аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 47 без сигналната секвенция.
  18. 18. Антитялото или антиген-свързващата 25 част съгласно всяка една от претенции от 1 до 17, където антитялото или частта има поне едно свойство, избрано от групата, съставена от:
    а) да не се свързва с миши, плъши, кучешки или заешки IGF-IR; 30
    б) да се свързва с IGF-IR от явански макак или макак резус, но не и с IGF-IR от мармозетка;
    в) да инхибира свързването на IGF-I или на 1GF-II с IGF-IR;
    г) да има селективност за IGF-IR, която 35 да е поне 50 пъти по-голяма, отколкото неговата селективност за инсулинов рецептор;
    д) да инхибира туморния растеж in vivo;
    е) да води до изчезване на 1GF-IR от клетъчната повърхност, когато се инкубира с 40 клетка експресираща IGF-IR;
    ж) да инхибира IGF-IR-индуцираното тирозиново фосфорилиране;
    з) да се свързва с IGF-IR с KD от 8 х 10-
    9 М или по-малко; и 45
    и) да има Koff за IGF-IR от 10-4 s-Ι или по-малко.
  19. 19. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 18, където антитялото или частта притежава всички от споменатите 50
    АП свойства.
  20. 20. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 17, където антитялото или частта притежава поне едно свойство, избрано от групата, съставена от:
    а) кръстосана конкуренция за свързване с IGF-IR с антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    б) да се свързва със същия епитоп на IGFIR както антитялото, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    в) да се свързва със същия антиген като този, с който се свързва антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    г) да се свързва с IGF-1R по същество със същата KD, както антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3; и
    д) да се свързва с 1GF-IR по същество със същата скорост на дисоциация, както антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3.
  21. 21. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно претенция 20, където антитялото или частта включват всички от споменатите свойства.
  22. 22. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 21, където споменатото антитяло или частта потиска свързването между IGF-IR и IGF-I или IGF-II с IC50 с по-малко от 100 пМ.
  23. 23. Антитялото или антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 9, 12, 13, 15 и 16, което е:
    а) имуноглобулин G (IgG), IgM, IgE, IgA или IgD молекула, или е нейно производно; или
    б) Fab фрагмент, F (ab')2 фрагмент, FV фрагмент, едноверижно антитяло, хуманизирано антитяло, химерно антитяло или двойноспецифично антитяло.
  24. 24. Фармацевтичен състав, включващ антитялото или антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23 и фармацевтично приемлив носител.
  25. 25. Фармацевтичен състав съгласно претенция 24, който включва допълнително
    66460 Bl адриамицин, таксол, тамоксифен, СР-358,774 или 5-флуородезоксиуридин (5-FU).
  26. 26. Метод за получаване на антитяло съгласно всяка една от претенции от 1 до 23, включващ етапите на:
    а) имунизиране на бозайник, различен от човек с имуноген, включващ IGF-IR, където бозайникът е способен да експресира човешки антитела в неговите В клетки;
    б) изолиране на В клетки от бозайника;
    в) скриниране на споменатите В клетки или на клетъчни линии, получени от тях, за идентифициране на клетъчна линия, която продуцира антитела, които се свързват с IGFIR;
    г) култивиране на клетъчна линия, която експресира антитела, коитоЗ 1. се свързват с IGFIR; и
    д) изолиране на антитела, които се свързват с IGF-IR от клетъчната линия.
  27. 27. Изолирана клетъчна линия, която е способна да продуцира антитялото или антигенсвързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23.
  28. 28. Клетъчната линия съгласно претенция 27, която е способна да продуцира антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3, или антитяло, което има същите аминокиселинни секвенции, както избраното антитяло.
  29. 29. Изолирана молекула нуклеинова киселина, която включва секвенция от нуклеинова киселина, която кодира тежката верига или нейна антиген-свързваща част, леката верига или нейна антиген-свързваща част или и двете на антитяло или на антиген-свързваща част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23.
  30. 30. Изолираната молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 29, където молекулата нуклеинова киселина включва секвенция от нуклеинова киселина, избрана от групата, съставена от:
    а) секвенция от нуклеинова киселина, кодираща тежката верига или нейна антигенсвързваща част, която включва трите тежковерижни CDR аминокиселинни секвенции на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    б) секвенция от нуклеинова киселина, кодираща аминокиселинната секвенция на тежката верига или на нейната антигенсвързваща част на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2,2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    в) секвенция от нуклеинова киселина, кодираща лека верига или нейна антигенсвързваща част, включваща трите лековерижни CDR аминокиселинни секвенции на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    г) секвенция от нуклеинова киселина, кодираща аминокиселинната секвенция на леката верига или на нейна антиген-свързваща част на антитяло, избрано от групата, съставена от 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
    д) секвенция от нуклеинова киселина, кодираща аминокиселинна секвенция, избрана от групата, съставена от SEQ ID NOS: 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20; и
    е) секвенция от нуклеинова киселина, избрана от групата, съставена от SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19;
    където споменатата молекула нуклеинова киселина включва по избор секвенция от нуклеинова киселина, кодираща аминокиселинната секвенция на SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 26.
  31. 31. Вектор, включващ молекулата нуклеинова киселина съгласно претенция 29 или 30, където векторът включва по избор секвенция, контролираща експресията, свързана по оперативен път с молекулата нуклеинова киселина.
  32. 32. Клетка-гостоприемник, включваща секвенция от нуклеинова киселина, която кодира тежката верига или нейна антиген-свързваща част, секвенция от нуклеинова киселина, която кодира леката верига или нейна антигенсвързваща част, или и двете на антитяло или на антиген-свързваща част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23.
  33. 33. Метод за приготвяне на анти-IGF-IR антитяло или на негова антиген-свързваща част, включващ култивиране на клетката-гостоприемник съгласно претенция 32 или на клетъчната линия съгласно претенция 27, при подходящи условия и възстановяване на споменатото антитяло или на антиген-свързващата част.
  34. 34. Трансгенно животно, различно от човек, включващо секвенция от нуклеинова
    66460 Bl киселина, която кодира тежката верига или нейна антиген-свързваща част, секвенция от нуклеинова киселина, която кодира леката верига или нейна антиген-свързваща, или и двете на антитяло или на антиген-свързваща част съгласно всяка една 5 от претенции от 1 до 23, където трансгенното животно, различно от човек експресира споменатата секвенция(и) от нуклеинова киселина.
  35. 35. Използване на антитялото или на 10 антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23, за производство на лекарствен препарат за диагностициране присъствието или локализацията на IGF-IR експресиращ тумор, в пациент нуждаещ се от 15 него.
  36. 36. Използване на антитялото или на антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от I до 23, за производство на лекарствен препарат за лечение на рак в човек. 20
  37. 37. Използване на антитялото или на антиген-свързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23, за производство на лекарствен препарат за лечение на пациент нуждаещ се от него.
  38. 38. Използването съгласно претенция 36 или 37, където споменатият лекарствен препарат освен това включва адриамицин, таксол, тамоксифен, СР-358,774 или 5-флуородезоксиуридин (5-FU).
  39. 39. Използване на изолирана молекула от нуклеинова киселина, кодираща тежката верига или нейна антиген-свързваща част, на изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща леката верига или нейна антиген-свързваща част или и на двете на антитялото или на антигенсвързващата част съгласно всяка една от претенции от 1 до 23, за производство на лекарствен препарат за лечение на пациент нуждаещ се от него.
BG108037A 2001-01-05 2003-07-28 Антитела срещу рецептора за инсулинподобния растежен фактор i BG66460B1 (bg)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG10111652A BG111652A (bg) 2001-01-05 2013-12-13 Антитела срещу рецептора на инсулин - подобния растежен фактор i

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
PCT/US2001/051113 WO2002053596A2 (en) 2001-01-05 2001-12-20 Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG108037A BG108037A (bg) 2005-04-30
BG66460B1 true BG66460B1 (bg) 2014-10-31

Family

ID=22987016

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG108037A BG66460B1 (bg) 2001-01-05 2003-07-28 Антитела срещу рецептора за инсулинподобния растежен фактор i
BG10111652A BG111652A (bg) 2001-01-05 2013-12-13 Антитела срещу рецептора на инсулин - подобния растежен фактор i
BG112197A BG112197A (bg) 2001-01-05 2016-01-13 Антитела срещу рецептора за инсулин-подобния растежен фактор i

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG10111652A BG111652A (bg) 2001-01-05 2013-12-13 Антитела срещу рецептора на инсулин - подобния растежен фактор i
BG112197A BG112197A (bg) 2001-01-05 2016-01-13 Антитела срещу рецептора за инсулин-подобния растежен фактор i

Country Status (51)

Country Link
US (7) US7037498B2 (bg)
EP (4) EP1399483B1 (bg)
JP (4) JP2004531217A (bg)
KR (1) KR100830082B1 (bg)
CN (2) CN1330668C (bg)
AP (1) AP2072A (bg)
AR (1) AR032028A1 (bg)
AT (1) ATE464322T1 (bg)
AU (1) AU2002231368C1 (bg)
BG (3) BG66460B1 (bg)
BR (2) BR0116728A (bg)
CA (1) CA2433800C (bg)
CR (4) CR7045A (bg)
CU (1) CU23447B7 (bg)
CZ (1) CZ301712B6 (bg)
DE (1) DE60141855D1 (bg)
DK (1) DK1399483T3 (bg)
DZ (1) DZ3494A1 (bg)
EA (1) EA012079B3 (bg)
EC (1) ECSP034711A (bg)
EE (2) EE05715B1 (bg)
ES (1) ES2344592T3 (bg)
GE (1) GEP20084484B (bg)
GT (1) GT200100257A (bg)
HK (3) HK1072059A1 (bg)
HN (1) HN2001000283A (bg)
HR (2) HRP20030627A2 (bg)
HU (1) HUP0302525A2 (bg)
IL (2) IL156661A0 (bg)
IS (1) IS2790B (bg)
MA (1) MA26040A1 (bg)
ME (1) ME00502B (bg)
MX (2) MX349009B (bg)
MY (1) MY143465A (bg)
NO (1) NO339789B1 (bg)
NZ (2) NZ569856A (bg)
OA (1) OA12589A (bg)
PA (1) PA8535501A1 (bg)
PE (1) PE20020801A1 (bg)
PL (3) PL224873B1 (bg)
PT (1) PT1399483E (bg)
RS (1) RS51373B (bg)
SG (1) SG138469A1 (bg)
SK (1) SK287954B6 (bg)
SV (1) SV2007000775A (bg)
TN (1) TNSN01177A1 (bg)
TW (1) TWI324609B (bg)
UA (1) UA87804C2 (bg)
UY (2) UY27087A1 (bg)
WO (1) WO2002053596A2 (bg)
ZA (1) ZA200305995B (bg)

Families Citing this family (294)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ569856A (en) 2001-01-05 2010-03-26 Pfizer Antibodies to insulin-like growth factor 1 receptor
SG173211A1 (en) * 2001-06-26 2011-08-29 Amgen Inc Antibodies to opgl
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
CN100410275C (zh) * 2002-01-18 2008-08-13 皮埃尔法布雷医药公司 新的抗igf-ir抗体及其应用
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
WO2003097805A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
EP1506286B1 (en) 2002-05-24 2014-03-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Neutralizing human anti-igfr antibody
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2003105782A2 (en) 2002-06-17 2003-12-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
WO2004031347A2 (en) * 2002-09-24 2004-04-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
PL378812A1 (pl) * 2003-02-13 2006-05-29 Pfizer Products Inc. Zastosowania przeciwciał przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostowego I
JP2007528201A (ja) * 2003-03-14 2007-10-11 ファルマシア・コーポレーション 癌治療のためのｉｇｆ−ｉ受容体に対する抗体
ATE549359T1 (de) * 2003-04-02 2012-03-15 Hoffmann La Roche Antikörper gegen den insulinähnlichen wachstumsfaktor i-rezeptor und deren verwendungen
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
ATE458006T1 (de) * 2003-05-14 2010-03-15 Kenta Biotech Ag Humaner monoklonaler antikörper spezifisch für lipopolysacchariden (lps) des serotyps iats o6 von pseudomonas aeruginosa
US7579157B2 (en) 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
UA85058C2 (ru) * 2003-08-13 2008-12-25 Пфайзер Продактс Инк. Модифицированное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с рецептором подобного к инсулину фактора роста i человека (igf-ir)
US7498415B2 (en) * 2003-09-24 2009-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody against human insulin-like growth factor
US20050187175A1 (en) * 2003-09-30 2005-08-25 Elly Nedivi Methods and compositions for CPG15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
PE20050928A1 (es) 2003-11-21 2005-11-08 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti-igfr1
MXPA06005540A (es) * 2003-12-08 2006-08-17 Immunogen Inc Anticuerpo del receptor anti-igf-i.
CN1997382A (zh) * 2004-05-05 2007-07-11 梅里麦克制药股份有限公司 调节生物活性的双特异性结合剂
CN101014365B (zh) * 2004-07-16 2011-04-13 辉瑞产品公司 使用抗-igf-1r抗体联合治疗非血液的恶性肿瘤
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
DE602005025685D1 (de) 2004-12-03 2011-02-10 Schering Corp Biologische marker zur vorauswahl von patienten für die anti-igf1r-therapie
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
BRPI0609655A2 (pt) 2005-03-31 2010-03-16 Agensys Inc anticorpos e moléculas relacionadas que ligam-se às proteìnas 161p2f10b
CN101222926B (zh) * 2005-04-15 2013-07-17 默沙东公司 用于治疗或预防癌症的方法和组合物
AU2006238930B2 (en) 2005-04-26 2010-12-23 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
WO2006138181A2 (en) * 2005-06-14 2006-12-28 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
MX2007016306A (es) * 2005-06-15 2008-03-07 Schering Corp Formulaciones de anticuerpo anti-igf1r.
PL2100618T3 (pl) * 2005-06-17 2014-07-31 Imclone Llc Przeciwciało anty-PDGFR alfa do zastosowania w leczeniu przerzutowego raka kości
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
ES2546069T3 (es) 2005-09-07 2015-09-18 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos monoclonales humanos para quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1)
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
JP2009516513A (ja) 2005-11-21 2009-04-23 ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム ハイブリッド抗原結合分子の組成物及び製造方法並びにその使用
CA2633956C (en) 2005-12-13 2016-12-06 Olivia Raeber Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP2671954B1 (en) 2006-01-20 2018-05-16 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ROS kinase in human non-small cell lung carcinoma
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
AP2008004569A0 (en) 2006-02-03 2008-08-31 Imclone Systems Inc IGR-IR antagonists as adjuvants for treatment of prostrate cancer
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
KR20080104160A (ko) * 2006-03-28 2008-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｉｇｆ-１ｒ 인간 단일클론 항체 제형
WO2007126876A2 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-ir antibodies and uses thereof
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
SI2450437T1 (sl) 2006-04-14 2017-12-29 Cell Signaling Technology Inc. Okvarjenost genov in mutantna ALK kinaza v človeških solidnih tumorjih
EP2021338A1 (en) 2006-05-09 2009-02-11 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
WO2008005469A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Schering Corporation Igfbp2 biomarker
CN102123712B (zh) 2006-12-13 2014-03-19 默沙东公司 使用igf1r抑制剂治疗癌症的方法
TW200833711A (en) * 2006-12-22 2008-08-16 Genentech Inc Antibodies to insulin-like growth factor receptor
PE20090107A1 (es) * 2007-02-14 2009-03-20 Glaxo Group Ltd Anticuerpos de union al antigeno igf-1r
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
CN101617228A (zh) * 2007-02-27 2009-12-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于评估针对胰岛素样生长因子ⅰ受体的抗体的抑制活性的方法
MX2009009379A (es) * 2007-03-02 2009-09-14 Amgen Inc Metodos y composiciones para tratar enfermedades tumorales.
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
WO2008127710A2 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute Methods for treating cancer resistant to erbb therapeutics
WO2008144345A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
WO2009032145A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
KR20100052545A (ko) * 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
DK2203558T3 (en) 2007-10-18 2016-06-27 Cell Signaling Technology Inc TRANSLOCATION AND mutant ROS kinase IN HUMAN NON-small cell lung carcinoma
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
BRPI0820875B1 (pt) 2007-12-14 2021-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
CN101903401B (zh) 2007-12-21 2013-06-05 罗切格利卡特公司 抗体的稳定性试验
JP2011515478A (ja) * 2008-03-25 2011-05-19 シェーリング コーポレイション 結腸直腸がんを処置または予防するための方法
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BRPI0913366A8 (pt) 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
TW201008580A (en) 2008-06-03 2010-03-01 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8822645B2 (en) 2008-07-08 2014-09-02 Abbvie Inc. Prostaglandin E2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP5576370B2 (ja) 2008-08-06 2014-08-20 ファイザー・インク Ｃｈｋ−１阻害剤としての６置換２−ヘテロシクリルアミノピラジン化合物
TWI471139B (zh) 2008-12-12 2015-02-01 Boehringer Ingelheim Int 抗－ｉｇｆ抗體
PL2881402T3 (pl) 2009-02-12 2017-10-31 Cell Signaling Technology Inc Ekspresja zmutowanej ROS w ludzkim raku wątroby
EP3903829B1 (en) 2009-02-13 2023-05-03 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
EP2419136A4 (en) 2009-04-16 2013-01-02 Merck Sharp & Dohme COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN104725512A (zh) * 2009-04-27 2015-06-24 诺华股份有限公司 增加肌肉生长的组合物和方法
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3028565T3 (da) 2009-07-08 2017-11-13 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
CN102666875A (zh) 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
KR101860175B1 (ko) 2009-10-26 2018-05-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
CA2782194C (en) 2009-12-02 2018-01-16 Immunomedics, Inc. Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
US9238080B2 (en) 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
DK2575935T4 (da) 2010-06-07 2023-11-27 Amgen Inc Anordning til indgivelse af lægemiddel
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
CA2804185C (en) 2010-07-12 2017-03-21 Covx Technologies Ireland Limited Multifunctional antibody conjugates
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2012019132A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
US9046513B2 (en) 2010-08-26 2015-06-02 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG10201506906VA (en) 2010-09-09 2015-10-29 Pfizer 4-1bb binding molecules
WO2012050921A2 (en) * 2010-09-28 2012-04-19 Nono, Inc. Nd2 peptides and methods of treating neurological disease
WO2012066058A1 (en) * 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
WO2012071557A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Litron Laboratories, Ltd Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
AU2012212075A1 (en) 2011-02-02 2013-07-18 Amgen Inc. Methods and compositons relating to inhibition of IGF-1R
US20120258073A1 (en) 2011-02-10 2012-10-11 Christian Gerdes Immunotherapy
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
MY171008A (en) 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
CA2831467C (en) 2011-03-29 2020-03-24 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
KR20140138353A (ko) * 2011-04-19 2014-12-03 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
DK2699598T3 (en) 2011-04-19 2019-04-23 Pfizer COMBINATIONS OF ANTI-4-1BB ANTIBODIES AND ADCC-INducing ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CA2831572C (en) 2011-05-02 2019-11-26 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
ES2872081T3 (es) 2011-08-05 2021-11-02 Regeneron Pharma Ratones con cadena ligera universal humanizada
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
EP4091442A1 (en) * 2011-09-19 2022-11-23 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US20140309229A1 (en) 2011-10-13 2014-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
US9987428B2 (en) 2011-10-14 2018-06-05 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
JP6268097B2 (ja) 2011-11-11 2018-01-24 デューク・ユニヴァーシティ 固形腫瘍治療のための併用薬物療法
US20140341922A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 SUN R & D Foundation Method for Overcoming Tolerance to Targeted Anti-Cancer Agent
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
JP2015508994A (ja) 2011-12-30 2015-03-26 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｉｌ−１３および／またはｉｌ−１７に対する二重可変ドメイン免疫グロブリン
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
PL2838998T3 (pl) 2012-04-18 2018-04-30 Cell Signaling Technology, Inc. EGFR i ROS1 w nowotworze
CN104284674A (zh) 2012-05-04 2015-01-14 辉瑞公司 前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法
WO2013191982A2 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind igf1r
EP3539563A1 (en) 2012-07-19 2019-09-18 Redwood Bioscience, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
EP3434695B1 (en) 2012-08-07 2020-12-02 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
CA2886993A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
RU2636043C2 (ru) 2012-11-01 2017-11-17 Эббви Инк. Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US20150290390A1 (en) 2012-11-21 2015-10-15 Amgen Inc. Drug delivery device
RU2649004C2 (ru) 2012-11-29 2018-03-29 Кемосентрикс, Инк. Антагонисты cxcr7
WO2017004144A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
HUE057977T2 (hu) 2012-12-13 2022-06-28 Immunomedics Inc Ellenanyagok és SN-38 immunkonjugátumainak dózisai javított hatásossággal és csökkentett toxicitással
US9458245B2 (en) 2013-03-06 2016-10-04 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. ANTI-C-MET tandem Fc bispecific antibodies
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
AU2014227732A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
CN110526971B (zh) 2013-04-29 2023-06-30 泰华制药澳大利亚公司 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US20160129089A1 (en) * 2013-06-13 2016-05-12 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
SG11201602236SA (en) 2013-10-01 2016-04-28 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3789064A1 (en) 2013-10-24 2021-03-10 Amgen, Inc Injector and method of assembly
CA2936675C (en) 2014-01-12 2023-06-27 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN106132436B (zh) 2014-02-21 2021-06-15 Ibc药品公司 通过诱导对trop-2表达细胞的免疫应答的疾病疗法
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
JP6636498B2 (ja) 2014-03-21 2020-01-29 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 単一ドメイン結合タンパク質を作る非ヒト動物
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
SG10201811702TA (en) 2014-05-07 2019-01-30 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
CA2948003C (en) 2014-06-03 2023-06-27 Amgen Inc. Drug delivery system and method of use
US9580495B2 (en) 2014-06-24 2017-02-28 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
AU2015328370B2 (en) 2014-10-07 2021-08-05 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US10544199B2 (en) 2014-10-29 2020-01-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha 2B variants
CA2966932A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Immunogen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3258988B1 (en) 2015-02-17 2019-08-28 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
CN107921104A (zh) * 2015-02-22 2018-04-17 索伦托治疗有限公司 结合cd137的抗体疗法
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
JP2018508224A (ja) 2015-03-19 2018-03-29 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗原を結合する軽鎖可変領域を選択する非ヒト動物
JP6746845B2 (ja) 2015-04-22 2020-08-26 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． 循環ｔｒｏｐ−２陽性癌細胞の単離、検出、診断及び／または特徴付け
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CN114796501A (zh) 2015-06-25 2022-07-29 免疫医疗公司 抗体与治疗剂的组合治疗癌症的方法
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3355907B1 (en) 2015-10-02 2021-01-20 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
JP2019510741A (ja) 2016-02-05 2019-04-18 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための効率的なプロセス
KR20230152153A (ko) 2016-03-10 2023-11-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3528787A4 (en) 2016-10-21 2020-05-06 Amgen Inc. PHARMACEUTICAL FORMULATIONS AND PROCESSES FOR THEIR PREPARATION
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
MX2019010544A (es) 2017-03-06 2019-10-21 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con caracteristica de prevencion de la activacion.
CA3052482A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
SG11201908062QA (en) 2017-03-09 2019-09-27 Amgen Inc Insertion mechanism for drug delivery device
US20200131518A1 (en) 2017-03-14 2020-04-30 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN110446512B (zh) 2017-03-28 2022-03-18 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件系统以及方法
WO2018217669A1 (en) 2017-05-21 2018-11-29 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
US11904143B2 (en) 2017-06-08 2024-02-20 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CA3063920A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019046600A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Amgen Inc. INSULIN-RELATED GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR BINDING PROTEINS (IGF-1R) AND METHODS OF USE
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
US11813426B2 (en) 2017-10-06 2023-11-14 Amgen Inc. Drug delivery device including seal member for needle of syringe
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
JP2021501198A (ja) * 2017-10-27 2021-01-14 トランスフュージョン ヘルス，リミティド ライアビリティ カンパニー フルオレンの誘導体を用いて造血幹細胞を増殖する組成物および方法
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
JP2021501616A (ja) 2017-11-06 2021-01-21 アムジエン・インコーポレーテツド 配置及び流量検出を備える薬物送達デバイス
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
MX2020004996A (es) 2017-11-16 2020-08-27 Amgen Inc Un mecanismo de pestillo de puerta para un dispositivo de administracion de farmacos.
AU2018368338A1 (en) 2017-11-16 2020-04-09 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
EP3775251A1 (en) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000748A (es) 2018-07-24 2021-03-26 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210228797A1 (en) 2018-07-31 2021-07-29 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710A1 (en) 2018-09-24 2021-02-04 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN112805048B (zh) 2018-10-02 2023-09-22 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
MA53818A (fr) 2018-10-05 2022-01-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament ayant un indicateur de dose
CN117138169A (zh) 2018-10-15 2023-12-01 安进公司 药物递送装置
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
JP7246409B2 (ja) * 2018-12-03 2023-03-27 帝人ファーマ株式会社 抗ｉｇｆ－ｉ受容体ヒト化抗体
KR20210102338A (ko) 2018-12-12 2021-08-19 케모센트릭스, 인크. 암의 치료를 위한 cxcr7 억제제
US11702482B2 (en) 2018-12-17 2023-07-18 Revitope Limited Twin immune cell engager
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
JP2022549329A (ja) 2019-09-26 2022-11-24 アムジェン インコーポレイテッド 抗体組成物を製造する方法
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
CN116745324A (zh) 2021-01-27 2023-09-12 信达生物制药(苏州)有限公司 针对cd16a的单域抗体及其用途
EP4305069A1 (en) * 2021-03-08 2024-01-17 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to cd66e polypeptides
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
JPWO2022239720A1 (bg) 2021-05-10 2022-11-17
CN117320964A (zh) 2021-05-21 2023-12-29 美国安进公司 优化药物容器的灌装方案的方法
TW202317614A (zh) 2021-06-07 2023-05-01 美商安進公司 使用岩藻糖苷酶控制糖基化蛋白的去岩藻糖基化水平
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023143484A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE352612T1 (de) 1990-08-29 2007-02-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0580752A4 (en) 1991-04-19 1994-08-24 Mannheim Gmbh Boehringer Human bone derived insulin like growth factor binding protein
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
JP3801196B2 (ja) 1993-03-09 2006-07-26 ジェンザイム・コーポレイション 乳からの対象化合物の単離
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5861510A (en) 1995-04-20 1999-01-19 Pfizer Inc Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as MMP and TNF inhibitors
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
JP2000500654A (ja) * 1995-11-14 2000-01-25 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ 可溶性ｉｇｆ−１受容体による腫瘍成長に対する誘導耐性
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
WO1997032856A1 (en) 1996-03-05 1997-09-12 Zeneca Limited 4-anilinoquinazoline derivatives
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
PT912559E (pt) 1996-07-13 2003-03-31 Glaxo Group Ltd Compostos heterociclicos fundidos como inibidores de proteina tirosina quinase
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
ID19430A (id) 1996-07-13 1998-07-09 Glaxo Group Ltd Senyawa senyawa heterosiklik
TR199900066T2 (xx) 1996-07-18 1999-04-21 Pfizer Inc. Matriks metalloproteazlar�n fosfinat bazl� inhibit�rleri
CA2264284A1 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Ralph P. Robinson Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
PT950059E (pt) 1997-01-06 2004-10-29 Pfizer Derivados de sulfona ciclicos
PT977733E (pt) 1997-02-03 2003-12-31 Pfizer Prod Inc Derivados de acido arilsulfonilamino-hidroxamico
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
AU722784B2 (en) 1997-02-11 2000-08-10 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0984930B1 (en) 1997-05-07 2005-04-06 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
CA2291709A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
IL134300A (en) 1997-08-08 2004-07-25 Pfizer Prod Inc Derivatives of aryloxyacrylylsulfonaminoaminoxamic acid derivatives, pharmaceutical preparations containing them and their use in the preparation of drugs for the treatment of arthritis, cancer and other diseases characterized by the activity of metalloproteinase-13 of matrix
JP4959049B2 (ja) 1997-08-22 2012-06-20 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド 血管新生阻害剤としてのオキシインドリルキナゾリン誘導体
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
CZ20001709A3 (cs) 1997-11-11 2001-12-12 Pfizer Products Inc. Deriváty thienopyrimidu a thienopyridinu, farmaceutické kompozice a způsoby léčení na jejich bázi
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
CA2314156C (en) 1998-05-29 2010-05-25 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
WO2000009560A2 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
PT1004578E (pt) 1998-11-05 2004-06-30 Pfizer Prod Inc Derivados hidroxamida do acido 5-oxo-pirrolidino-2-carboxilico
JP3793693B2 (ja) 1998-12-23 2006-07-05 ファイザー インコーポレーテッド Ｃｔｌａ−４に対するヒトモノクローナル抗体
WO2000050067A1 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Saltech I Göteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic production of insulin-like growth factor-1
CN101066997B (zh) 1999-03-25 2013-03-27 艾博特股份有限两合公司 结合人il-12的人抗体及其生产方法
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
NZ569856A (en) 2001-01-05 2010-03-26 Pfizer Antibodies to insulin-like growth factor 1 receptor
SG173211A1 (en) 2001-06-26 2011-08-29 Amgen Inc Antibodies to opgl
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
UA85058C2 (ru) * 2003-08-13 2008-12-25 Пфайзер Продактс Инк. Модифицированное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с рецептором подобного к инсулину фактора роста i человека (igf-ir)
CA2552523C (en) * 2004-01-09 2019-11-26 Pfizer Inc. Monoclonal antibodies to mucosal addressin cell adhesion molecule(madcam)
US10181126B2 (en) 2012-03-13 2019-01-15 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
SV2007000775A (es) 2007-03-15
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
AR032028A1 (es) 2003-10-22
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
CR7045A (es) 2005-09-02
CR10786A (es) 2009-06-04
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
CR10134A (es) 2010-09-14
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
NO20033074L (no) 2003-07-04
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
TWI324609B (en) 2010-05-11
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
US8642037B2 (en) 2014-02-04
US7700742B2 (en) 2010-04-20
AP2072A (en) 2009-12-10
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
OA12589A (en) 2006-06-08
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
MY143465A (en) 2011-05-13
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
US7982024B2 (en) 2011-07-19
US9234041B2 (en) 2016-01-12
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
PT1399483E (pt) 2010-07-20
GEP20084484B (en) 2008-09-25
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
ECSP034711A (es) 2003-10-28
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
EE05724B1 (et) 2014-10-15
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
MX337162B (es) 2016-02-15
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
GT200100257A (es) 2002-09-02
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
EE200300318A (et) 2003-10-15
IL156661A (en) 2008-11-26
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
PL366340A1 (en) 2005-01-24
CR20140001A (es) 2014-02-05
MX349009B (es) 2017-07-06
NZ569856A (en) 2010-03-26
US7037498B2 (en) 2006-05-02
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
CN1564829A (zh) 2005-01-12
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
ME00502B (me) 2011-10-10
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
EE201300037A (et) 2014-04-15
CN1330668C (zh) 2007-08-08
BG111652A (bg) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
CN1854157A (zh) 2006-11-01
NZ527302A (en) 2006-10-27
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
IS6866A (is) 2003-07-04
BG112197A (bg) 2016-05-31
CU23447B7 (es) 2009-10-16
RS51373B (sr) 2011-02-28
EE05715B1 (et) 2014-06-16
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
IL156661A0 (en) 2004-01-04
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
ZA200305995B (en) 2004-08-04
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
UY27087A1 (es) 2002-06-20
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
YU54203A (en) 2006-03-03
SG138469A1 (en) 2008-01-28
US7815907B2 (en) 2010-10-19
NO339789B1 (no) 2017-01-30
BG108037A (bg) 2005-04-30
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
BR0116728A (pt) 2005-04-12
CN1854157B (zh) 2013-01-02
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
DE60141855D1 (de) 2010-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9234041B2 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
US7371378B2 (en) Modified human IGF-IR antibodies
AU2002231368A1 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor