MXPA06005540A - Anticuerpo del receptor anti-igf-i. - Google Patents

Abstract

Los anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos recubiertos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos derivatizados y conjugados de los mismos con agentes citotoxicos, que especificamente se enlazan a, e inhiben al receptor del factor I de crecimiento de tipo insulina, antagonizan los efectos de IGF-I, IGF-II y suero en le crecimiento y supervivencia de celulas de tumor, y que substancialmente carecen de actividad agonista. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos por consiguiente se pueden utilizar, opcionalmente en conjuncion con otros agente terapeuticos, en el tratamiento de tumores que expresan niveles elevados del receptor IGF-I, tales como cancer de pecho, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma sinovial, cancer de prostata, y cancer pancreatico, y los anticuerpos derivatizados se pueden utilizar en el diagnostico y formacion de imagenes de tumores que expresan niveles elevados del IGF-I.

Description

ANTICUERPO DEL RECEPTOR ANTI-1GF-I La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de origen número 10/170,390, presentada el 14 de junio del 2002, incorporada aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos que se enlazan al receptor del factor-l de crecimiento (receptor IGF-I) de tipo insulina humana. Más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos del receptor anti-IGF-l que inhibe las funciones celulares del receptor IGF-l receptor. Aún más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos del receptor anti-IGF-l que antagonizan los efectos de IGF-I, IGF-II y suero en el crecimiento y supervivencia de células de tumor que substancialmente tienen falta de actividad agonista. La invención también se refiere a fragmentos de dichos anticuerpos, versiones humanizadas y recubiertas de dichos anticuerpos, conjugados de dichos anticuerpos, derivados de anticuerpo, y los usos de los mismos en diagnóstico, investigación y aplicaciones terapéuticas. La invención además se refiere a anticuerpos mejorados o fragmentos de los mismos. En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica los anticuerpos o fragmentos de los mismos, y a vectores que comprenden los polinucleótidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor del factor-l de crecimiento de tipo insulina (receptor IGF-I) es una proteína heterotetramérica de transmembrana, que tiene dos cadenas alfa extracelulares y dos cadenas beta que abarcan la membrana en una configuración ß-a- -ß enlazada a disulfuro. El enlace d e l os l igandos, q ue son el factor-l d e crecimiento d e tipo i nsulina (IGF-1) y el factor-ll de crecimiento de tipo insulina (IGF- II), mediante el dominio extracelular del receptor IGF-I activa su dominio de cinasa de tirosina intracelular dando como resultado la autofosforiliación del receptor y la fosforilación del substrato. El receptor IGF-I es homólogo al receptor de insulina, tiene una alta similitud de secuencia de 84% en el dominio de cinasa de tirosina de cadena beta y una baja similitud de 48% en el dominio rico en cisteína extracelular de la cadena alfa (Ulrich, A. y otros, 1986, EMBO, 5,2503-2512; Fujita-Yamaguchi, Y. y otros, 1986, J. Biol. Chem., 261 , 16727-16731; LeRoith, D. y otros, 1995, Endocrine Reviews, 16,143-163). El receptor IGF-I y sus ligandos (IGF-l y IGF-II) juegan papeles importantes en numerosos procesos fisiológicos que incluyen el crecimiento y desarrollo durante la embriogénesis, metabolismo, proliferación celular y diferenciación de célula en adultos (LeRoith, D., 2000, Endocrinology, 141 ,1287-1288; LeRoith, D., 1997, New England J. Med., 336,633-640). IGF-I e ÍGF-II ambos funcionan como hormonas endocrinas en la sangre, en donde están predominantemente presentes en complejos con proteínas de enlace IGF y como factores de crecimiento paracrino y autocrino que se producen localmente (Humbel, R. E., 1990, Eur. J. Biochem., 190,445-462; Cohick, W. S. y Clemmons, D. R., 1993, Arans. Rev. Physiol. 55,131-153). El receptor IGF-I ha estado implicado en la promoción del crecimiento, transformación, y supervivencia de células de tumor (Baserga, R. y otros, 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332, F105-F126; Blakesley, V. A. y otros, 1997, Journal of Endocrinology, 152, 339-344; Kaleko, M., Rutter, W. J., y Miller, A. D. 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 464-473). De esta forma, se conocen varios tipos de tumores que expresan niveles más altos que los normales del receptor IGF-I, incluyendo cáncer de pecho, cáncer de colon, carcinoma ovárico, sarcoma sinovial, y cáncer pancreático (Khandwala, H. M. y otros, 2000, Endocrine Reviews, 21 ,215-244; Werner, H. y LeRoith, D., 1996, Adv. Cáncer Res., 68, 183-223; Happerfield, L. C. y otros, 1997, J. Pathol., 183,412-417; Frier, S. y otros, 1999, Gut, 44,704-708; van Dam, P. A. y otros, 1994, J. Clin. Patrol., 47,914-919; Xie, Y. y otros, 1999, Cáncer Res., 59, 3588-3591 ; Bergmann, U. y otros, 1995, Cáncer Res., 55,2007-2011). IGF-I e IGF-II in vitro, han mostrado que son mitógenos potentes para varias líneas de células de tumor humanas tales como cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de colón, osteosarcoma y cáncer cervical (Ankrapp, D. P. y Bevan, D . R . , 1 993, Cáncer Res., 53, 3399-3404; Cuiten, K. J., 1990, Cáncer Res., 50, 48-53; Hermanto, U. y otros , 2000, Cell Growth & Differentiation, 11, 655-664; Guo, Y. S. y otros, 1995, J. Am. Coll. Surg., 181 , 145-154; Kappel, C. C. y otros, 1994, CancerRes., 54,2803-2807; Steller, M. A. y otros, 1996, Cáncer Res., 56,1761-1765). Varios de estos tumores y líneas de célula también expresan altos niveles de IGF-I o IGF-II, que pueden estimular su crecimiento en una forma autocrina o paracrina (Quinn, K. A. y otros, 1996, J. Biol. Chem., 271 , 11477- 11483). Los estudios epidemiológicos ha demostrado una correlación del nivel de plasma elevado de IGF-I (y bajo nivel de la proteína-3 enlazada a IGF) con un riesgo disminuido para cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón y cáncer de pecho (Chan, J. M. y otros, 1998, Science, 279,563-566; Wolk, A. y otros, 1998, J. Nati. Cáncer Inst, 90,911-915; Ma, J. y otros, 1999, J. Nati. Cáncer Inst., 91 , 620-625; Yu, H. y otros, 1999, J. Nati. Cáncer Inst, 9 1 , 1 51-156; H ankinson, S . E . y otros, 1 998, Lancet, 351 , 1 393-1396). Se han sugerido estrategias para disminuir el nivel de IGF-I o para inhibir la función del receptor IGF-I para la prevención del cáncer (Wu, Y. y otros, 2002, Cáncer Res., 62,1030-1035; Grimberg, A y Cohén P., 2000, J. Cell. Physiol., 183, 1-9).

El receptor IGF-I protege a las células de tumor de la apoptosis causada por la falta del factor de crecimiento, la independencia del anclaje o el traíamienío del fármaco citotóxico (Navarro, M. y Baserga, R., 2001 , Endocrinology, 142, 1073-1081 ; Baserga, R. y otros, 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332, F105-F126). Los dominios del receptor ÍGF-I que son críticos para esta transformación mitogénica y actividades apoptóticas han sido identificados a través del análisis mutacional. Por ejemplo, el residuo de tirosina 1251 del receptor IGF-I ha sido identificado como crítico para actividades anti-apoptóticas y de transformación pero no para su actividad mitogénica (O'Connor, R. y otros, 1997, Mol. Cell. Biol., 17, 427-435; Miura, M. y otros, 1995, J. Biol. Chem., 270, 22639-22644). La trayectoria de señalización intracelular del receptor IGF-I activado por el ligando involucra la fosforilación de los residuos de tirosina de los substratos del receptor de insulina (1RS-1 e IRS-2), los cuales recluían fosfatidilinositol-3-cinasa (PI-3-cinasa) para la membrana. Los producios de fosfolípido enlazados a membrana de PI-3-cinasa activan una cinasa Akt de serina/treonina, cuyos substratos incluyen la proíeína BAD apropiada que se fosforila a un estado de inactivado (Datta, S. R., Brunet, A. y Greenberg, M. E., 1999, Genes & Development, 13, 2905-2927; Kulik, G., Klippel, A. y Weber, M.J., 1997, Mol. Cell. Biol. 17, 1595- 1606). La señalización mitogénica del receptor IGF-I en células de cáncer de pecho humanas MCF-7 requieren de la cinasa de proteína activada con miíógeno, mieníras que la señalización de supervivencia en células PC12 feocromocitoma de rata requieren tanto trayectorias d e cinasa PI-3 como trayectorias de cinasa de proteína activadas con mitógeno (Dufourny, B. y oíros, 1997, J. Biol. Chem., 272, 31163-31171; Parrizas, M., Salíiel, A. R. y LeRoiíh, D., 1997, J Biol Chem., 272, 154-161). La regulación descendeníe del nivel del recepíor IGF-I a íravés de esírategias antisentido han demostrado que reducen la tumorigenicidad de varias líneas de célula de íumor in vivo e in vitro, íales como melanoma, carcinoma de pulmón, cáncer ovárico, glioblasíoma, neuroblasíoma y rabdomiosarcoma (Resnicoff, M. y oíros, 1994, Cáncer Res., 54, 4848-4850; Lee, O T. y oíros, 1996, Cáncer Res., 56, 3038-3041 ; Muller, M. y oíros , 1998, Iní. J Cáncer, 77, 567-571 ; Trojan, J. y oíros, 1993, Science, 259, 94-97; Liu, X. y oíros, 1998, Cáncer Res., 58, 5432-5438; Shapiro, D. N. y oíros, 1994, J Clin. Invest., 94, 1235-1242). De igual forma, se ha reportado que un mutaníe negaíivo dominaníe del recepíor IGF-I reduce la íumorigenicidad in vivo y e l crecimienío in vitro d e células d e Raía-1 transformadas que sobre expresan el receptor IGF-I (Prager, D. y oíros, 1 994, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA, 91 , 2181-2185). Las células de íumor que expresan un aníiseníido para el ANRm del recepíor IGF-I que experimenía apoptosis masiva cuando se inyecía en animales y cámaras de biodifusión. Esía observación hace al recepíor IGF-I un objeíivo íerapéutico atracíivo, con base en la hipótesis de que las células de tumor son más susceptibles que las células normales a apoptosis a íravés de la inhibición del receptor IGF-I (Resnicoff, M. y oíros, 1995, Cáncer Res., 55, 2463-2469; Baserga, R., 1995, Cáncer Res., 55, 249-252). Oíra esíraíegia para inhibir la función del receptor IGF-I en células de tumor ha sido utilizar anticuerpos del receptor anti-IGF-l que se enlazan a los dominios exíracelulares del recepíor IGF-I e inhiben su acíivación. Se han reportado varios iníeníos para desarrollar aníicuerpos monoclonales de raíón coníra el recepíor IGF-I, de los cuales dos aníicuerpos inhibidores IR3 y 1 H7 esíán disponibles y su uso ha sido reportado en varios esíudios del recepíor IGF-I. El aníicuerpo IR3 se desarrolló uíilizando una preparación de placenía parcialmeníe purificada del recepíor de insulina para inmunizar raíones, los cuales produjeron un anficuerpo, IR1, que fue selectivo para el enlace con el receptor de insulina, y dos anticuerpos, IR2 e IR3, que mostraron una ¡nmunoprecipitación preferencial del recepíor IGF-I (receptor de somaíomedina-C) pero íambién debiliíaron la inmunoprecipiíación del recepíor de insulina (Kull, F. C. y oíros, 1983, J. Biol. Chem., 258, 6561-6566). El aníicuerpo 1 H7 se desarrolló inmunizando raíones con la preparación de placenía purificada del recepíor IGF-I, que produjo el aníicuerpo inhibidor 1 H7 además de íres aníicuerpos esíimuladores (Li, S.-L. y oíros, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, 92-98; Xiong, L. y oíros, 1992, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA, 89, 5356-5360). En otro reporte, se obtuvo un panel de anticuerpos monoclonales de raíón específicos p ara e l recepíor IGF-I humano a iravés de la inmunización de ratones con células 3T3 transfecíadas que expresan alíos niveles del recepíor IGF-I, que se caíegorizaron en sieíe grupos a íravés de esíudios de competencia de enlace y a través de su inhibición o estimulación del enlace IGF-I para transfectar células 3T3 (Soos, M. A. y oíros, 1992, J. Biol. Chem., 267, 12955-12963). De esía forma, aunque el aníicuerpo IR3 es el aníicuerpo inhibidor más comúnmenfe uíilizado para los esíudios in vitro del receptor IGF-I, sufre de la desveníaja que exhibe a cíividad a gonísíicas en células 3T3 y CHO íransfecíadas que expresan el receptor I GF-I h umano ( Kato, H . y oíros, 1993, J. Biol. Cam., 268, 2655-2661; Steele-Perkins, G. y Roth, R. A., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun., 171, 1244-1251). Similarmeníe, eníre el panel de aníicuerpos desarrollados por Soos y oíros, los aníicuerpos más inhibidores 24-57 y 24-60 íambién mosíraron acíividades agonísíicas en las células 3T3 transfectadas (Soos, M. A. y otros, 1992, J. Biol. Chem., 267, 12955-12963). Aunque el anticuerpo 1R3 se reporta para inhibir el enlace de IGF-I (pero no IGF-II) para expresar recepíores en células ¡níacías y después de la solubilización, se demosíró que inhibe la habilidad de ambos IGF-I y IGF-II para esíimular la síníesis de ADN en células in vitro (Síeele-Perkins, G. y Roíh, R. A., 1990, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 171 , 1244-1251). El epítopo de enlace del aníicuerpo IR3 ha sido deducido de consírucciones d el r eceptor I GF-I d e i nsuiina q uimérica p ara s er I a región 223-274 del receptor IGF-I (Gustafson, T. A. y Ruííer, W. J., 1990, J. Biol. Chem., 265, 18663-18667; Soos, M. A. y oíros, 1992, J. Biol. Chem., 267, 12955-12963). La línea de células de cáncer de pecho humanas MCF-7 íípicameníe se uíilizan como una línea de células modelo para demosírar la respuesía del crecimiento de IGF-I e IGF-II in vitro (Dufourny, B. y otros, 1997, J. B iol. Chem., 272, 31163-31171)>En las células MCF-7, el anticuerpo IR3 incompletamente bloquea el efecto esíimulador del IGF-I e IGF-II exógenameníe agregado en condiciones libres de suero a aproximadameníe 80%. También, el aníicuerpo IR3 no inhibe significativamente (menos de 25%) el crecimiento de células MCF-7 en suero al 10% (Cuiten, K. J. y oíros, 1990, Cáncer Res., 50,48-53). Esía inhibición débil del crecimiento esíimulado por suero de células MCF-7 a íravés del aníicuerpo IR3 in vitro se puede relacionar con los resulíados de un estudio in vivo en donde el traíamienío del aníicuerpo IR3 no inhibe significaíivameníe el crecimienío de un xenoinjerto MCF-7 en ratones desnudos (Arteaga, O L. y oíros, 1989, J. Clin.

Invesí., 84, 1418-1423). Debido a la acíividades agonísticas débiles del IR3 y otros anticuerpos reportados, y s u i nhabilidad para s ignificativamente inhibir el crecimiento de células de tumor íales como las células MCF-7 en la condición más fisiológica de la estimulación por suero (en lugar de e stimulación m edianíe I GF-I o I GF-II exógenameníe adicionado en condición libre de suero), exisíe una necesidad de nuevos aníicuerpos del recepíor aníi-IGF-l que significaíivameníe inhiben el crecimienío esíimulado por suero de células de tumor, pero no muestran una actividad agonísíica significaíiva por ellos mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, es un objeto de la invención proveer anticuerpos, fragmentos de aníicuerpo y derivados de aníicuerpo que específicamente se enlazan al receptor del factor-1 de crecimienío de íipo insulina e inhiben la acíividad celular del recepíor aníagonizando el receptor, y íambién subsíancialmeníe carecen de la acíividad aníagonisía de la acíividad hacia el recepíor. De esta forma, en una primera modalidad, se provee el anticuerpo de murino EM164, es esíá compleíameníe caracíerizado en la preseníe con respecto a las secuencias de aminoácido de ambas, sus regiones variables de cadena ligera y pesada, las secuencias de ADNc de los genes para las regiones de cadena ligera y pesada, la ideníificación de sus CDRs (regiones que determinan la complemenfariedad), la ideníificación de sus aminoácidos de superficie, y medios para su expresión en forma recombinan e. En una segunda modalidad, se proveen las versiones recubierta y humanizada del anticuerpo EM164 en donde los residuos expuestos en la superficie del anticuerpo o sus fragmentos se reemplazan en ambas, la cadena ligera y pesada para más estrechamente asemejarse a superficies de anticuerpo humano conocidas. Dichos anticuerpos humanizados pueden tener una uíilidad aumeníada, comparado con EM164 de murino, como ageníes íerapéuíicos o de diagnósíico. Las versiones humanizadas del aníicuerpo EM164 íambién esíán compleíameníe caracterizadas aquí con respecío a sus secuencias de aminoácido respectivas de ambas regiones variables de cadena ligera y pesada, las secuencias de ADN de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, la identificación de los CDRs, la identificación de sus aminoácidos de superficie, y la descripción de los medios para su expresión en una forma recombinaníe.

En una tercera modalidad, se provee un aníicuerpo que es capaz de inhibir el crecimienío de una célula de cáncer mayor del alrededor del 80% en la presencia de una esíimulaníe del crecimienío íal como, por ejemplo, suero, el facíor-l de crecimienío de íipo insulina y facíor-l I de crecimiento de íipo insulina. En una cuarta modalidad, se provee un anticuerpo o fragmenío de aníicuerpo que íiene una cadena pesada que incluye CDRs que íienen secuencias de aminoácido represeníadas por SEC ID NOS: 1-3, respecíivameníe: SYWMH (SEC ID NO: 1), EINPSNGRTNYNEKFKR (SEC ID NO: 2), GRPDYYGSSKWYFDV (SEC ID NO: 3); y que íiene una cadena ligera que comprende CDRs que fienen secuencias de aminoácido represeníadas por SEC ID NOS: 4-6: RSSQSIVHSNVNTYLE (SEC ID NO: 4); KVSNRFS (SEC ID NO: 5); FQGSHVPPT (SEC ID NO: 6). En una quinfa modalidad, se proveen aníicuerpos que íienen una cadena pesada que fiene una secuencia de aminoácido que comparte por lo menos 90% de idenfidad de secuencia con una secuencia de aminoácido represeníadas por SEC ID NO: 7: GEINPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSKWYFDVWGAGTTVTVSS (SEC ID NO: 7). Similarmeníe, se proveen anticuerpos que tiene una cadena ligera que íienen una secuencia de aminoácido que comparten por lo menos 90% de identidad con una secuencia de aminoácido representada por SEC ID NO: 8: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTK LEIKR (SEC ID NO: 8). En una sexta modalidad, se proveen anticuerpos que tienen una región variable de cadena ligera humanizada o recubierta que una secuencia de aminoácido correspondiente a una de SEC ID NOS: -9-12: DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO: 9); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO:- 10); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO: 11); o DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEC ID NO: 12). Similarmente, se proveen anticuerpos que íienen una región variable de cadena ligera humanizada o recubierta que tiene una secuencia de aminoácido correspondiente a SEC ID NO: 13: QVQLVQSGAEWKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINP SNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYF DVWGQGTTVTVSS (SEC ID NO: 13). En una sépíima modalidad, se proveen a anticuerpos o fragmentos de anficuerpo de la presente invención que tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, los aníicuerpos o fragmentos de anticuerpo que tienen afinidad mejorada para el receptor IGF-I se preparan a través de la maduración de la afinidad de un anticuerpo o fragmento de la presente invención. La presente invención además provee conjugados de dichos anticuerpos, en donde un agente citotóxico está covalentemente e nlazado, d ¡rectamente o a través de enlazador divisible o no divisible, a un anticuerpo o fragmento de enlace de epítopo de un aníicuerpo de la preseníe invención. En modalidades preferidas, el ageníe citotóxico es un taxol, un maitansinoide, CC-1065 o un análogo de CC-1065. La p resente i nvención además provee anticuerpos o fragmentos de los mismos que además están identificados para uso en aplicaciones de invesíigación o de diagnóstico. En modalidades preferidas, la etiquefa es un radio identificador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente formador de imágenes, o un ion de metal. También se proporciona un método para el diagnóstico en donde dichos anticuerpos o fragmentos identificados se administran a un sujeto que se sospecha que tiene cáncer, y la distribución del identificador dentro del cuerpo del sujeto se mide o se monitorea. En una ocfava modalidad, la invención proporciona métodos para el traíamiento de un sujeto que tiene cáncer a través de la administración de un anticuerpo, fragmento de aníicuerpo, o conjugado de aníicuerpo de la presente invención, ya sea solo o en combinación con otros agentes citoíóxicos o íerapéuíicos. El cáncer puede ser uno o más de, p or ejemplo, cáncer d e p echo, cáncer d e colon, carcinoma ovárico, osíeosarcoma, cáncer cervical, cáncer de prósíaía, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreáíico, u oíro cáncer que se va deíerminar en donde los niveles del recepíor IGF-I esíán elevados. En una novena modalidad, la invención proporciona métodos para el íraíamienío de un sujeío que íiene un cáncer a íravés de la adminisíración de un aníicuerpo, fragmenío de aníicuerpo o conjugado de aníicuerpo de la preseníe invención, ya sea solo o en combinación con oíros ageníes ciíoíóxicos o ferapéuíicos. En paríicular, los agenfes ciíotóxicos y terapéuticos preferidos incluyen, docetaxel, paclitaxel, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, trasíuzumab (Herceptina), capeciíabina, tamoxifen, toremifen, leírozol, anasírozol, fulvesíraní, exemestan, goserelina, oxaliplatina, carboplaíina, cisplaíina, dexameíasona, antida, bevacizumab (Avastina), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinofecan, eíoposida, íopoíecan, gemciíabina, vinorelbina, esíramusíina, miíoxanírona, abarelix, zoledrona e, estreptozocina, riiuximab (Riíuxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, ¡maíinib, citarabina, ibriíumomab (Zevalina), ositumomab (Bexxar), interferón alfa-2b, melfalam, bortezomib (Velcade), altreíamína, asparaginasa, gefiíinib (Iressa), erlonitib (Tarceva), el anticuerpo del receptor anti-EGF (Ceíuximab, Abx-EGF), y una epoíilona. Más preferiblemeníe, el ageníe terapéutico es un agente de plaíino (fal como carboplaíino, oxaliplaíino, cisplatino), un taxano (tal como paclitaxel, docetaxel), gemcitabina, o camptotecina. El cáncer puede ser uno o más de, por ejemplo, cáncer de pecho, cáncer de colon, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstaía, cáncer de pulmón, carcinoma s inovial, cáncer p ancreáfico, melanoma, m ieloma m úlíiple, n euroblasíoma, y rabdomiosarcoma, u oíro cáncer que aún se va a deíerminar en donde los niveles del recepíor IGF-I esíán elevados. En u na d écima modalidad, la invención provee equipos que comprenden uno o más de los elementos descritos aquí, e instrucciones para el uso de estos elementos. En una modalidad preferida, un equipo de la preseníe invención incluye un aníicuerpo, un fragmenío de aníicuerpo, o conjugado de aníicuerpo de la invención, y un ageníe íerapéuíico. Las insírucciones para esía modalidad preferida incluyen insírucciones para inhibir el crecimienío de una célula de cáncer uíilizando el aníicuerpo, fragmento de aníicuerpo o conjugado de la invención, y el ageníe íerapéuíico, y/o insírucciones para un méíodo para írafar un pacieníe que íiene un cáncer uíilizando el aníicuerpo, fragmenío de aníicuerpo o c conjugado de la invención, y el ageníe íerapéuíico BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muesíra el análisis de clasificación de la célula acíivado con fluorescencia (FACS) del enlace específico del aníicuerpo EM164 purificado a células que sobre expresan el recepíor IGF-I Y1251 F humano o recepíor de insulina humano. La Figura 2 muesíra una curva de titulación de enlace para el enlace del anticuerpo EM164 a el recepíor IGF-I humano bioíeñido. La Figura 3 muesíra la inhibición del enlace de IGF-I bioíeñido a las células MCF-7 de cáncer de pecho humanas a íravés del aníicuerpo EM164. La Figura 4 muesíra la inhibición de la autofosforilación esíimulada por IGF-I del receptor IGF-I en células MCF-7 a íravés del aníicuerpo EM164. La Figura 5 muesíra la inhibición de la fosforilación de IRS-1 esíimulada por IGF-I en células MCF-7 a fravés del anticuerpo EM164. La figura 6 muestra la inhibición de la transducción de señal estimulada por IGF-I en células SaOS-2 a través del anticuerpo EM164. La figura 7 muestra el efecto del en el crecimiento y supervivencia de células MCF- 7 bajo difereníes condiciones de crecimiento, como se examina a íravés del ensayo MTT. La figura 8 muesira el efecío del aníicuerpo en el crecimiento y supervivencia de células MCF-7 en presencia de varias conceníraciones de suero. La figura 9 muesíra la inhibición de IGF-I y crecimienío y supervivencia estimulada por suero de células NCI-H838 a través del aníicuerpo EM164.

La figura 10 muestra el efecío del íraíamiento con el anticuerpo EM164, taxol, o una combinación del anticuerpo E 164 y taxol, en el crecimiento de un xenoinjerto de cáncer de pulmón Calu-6 cáncer en raíones. La figura 11 muesíra la competencia eníre el enlace del aníicuerpo EM164 humanizado (v. 1.0) y el aníicuerpo EM164 de murino La figura 12 muesíra el ADNc (SEC ID NO: 49) y las secuencias de aminoácido (SEC ID NO: 50) de la región líder y variable de cadena ligera del aníicuerpo EM164 del recepíor aníi-IGF-l de murino. La flecha marca el inicio de la esírucíura 1. Las secuencias 3 CDR de acuerdo con Kabaí esíán subrayadas. La figura 13 ADNc (SEC ID NO: 51) y las secuencias de aminoácido (SEC ID NO: 52) de la región líder y variable de la cadena pesada para el aníicuerpo EM164 del recepíor aníi-IGF-l de murino. La flecha marca el inicio de la esírucíura 1. Las secuencias 3 CDR de acuerdo con Kabaí esíán subrayadas. La figura 14 muesíra las secuencias de aminoácido CDR de cadena ligera y pesada del aníicuerpo EM164 como se determina de las definiciones de clase canónicas Choíhia. Las definiciones del software de modelación AbM para las CDRs de cadena pesada también se muestran. Cadena Ligera: CDR1 es SEC ID NO: 4, CDR2 es SEC ID NO: 5, y CDR3 es SEC ID NO: 6. Cadena Pesada: CDR1 es SEC ID NO: 1, CDR2 es SEC ID NO: 2, y CDR3 es SEC ID NO: 3. Cadena Pesada AbM: CDR1 es SEC ID NO: 53, CDR2 es SEC ID NO: 54, y CDR3 es SEC ID NO: 55. La figura 15 muestra las secuencias de aminoácido de cadena ligera y de cadena pesada para el aníicuerpo EM164 del recepíor aníi-IGF-l alineadas con las secuencias de la línea de germen para los genes Crl (SEC ID NO: 56) y J558.C (SEC ID NO: 57). Los guiones (-) indican la ideníidad de secuencia. La figura 16 muesíra los plásmidos uíilizados para construir y expresar anticuerpos EM164 quiméricos y humanizados. A) un plásmido de clonación de cadena ligera, B) un plásmido de clonación de cadena pesada, C) un plásmido de expresión del aníicuerpo de mamífero. La figura 17 muesíra las secuencias de aminoácido más homologas de las cadenas ligeras clasificadas de 1 27 a níicuerpos e n e I g rupo d e a rchivos d e e sírucíura utilizados para pronosticar los residuos de superficie de EM164. eml64 LC (SEC ID NO: 58), 2jel (SEC ID NO: 59), 2pcp (SEC ID NO: 60), Inqb (SEC ID NO: 61), Ikel (SEC ID NO: 62), Ihyx (SEC ID NO: 63), ligf (SEC ID NO: 64), Itet (SEC ID NO: 65), Iclz (SEC ID NO: 66), Ibln (SEC ID NO: 67), Icly (SEC ID NO: 68), Consensus (SEC ID NO: 69). La Figura 18 muestra las secuencias de aminoácido más homologas de las cadenas pesadas clasificadas de 127 anticuerpos en el grupo de archivos de estructura utilizados para pronosticar los residuos de superficie de EM164. eml64 HC (SEC ID NO: 70), Inqb (SEC ID NO: 71 ), Ingp (SEC ID NO: 72), Ifbi (SEC ID NO: 73), lafv (SEC ID NO: 74), lyuh (SEC ID NO: 75), Iplg (SEC ID NO: 76), Id5b (SEC ID NO: 77), Iae6 (SEC ID NO: 78), laxs (SEC ID NO: 79), 3hfl (SEC ID NO: 80), Consensus (SEC ID NO: 81). La Figura 19 muestra la accesibilidad promedio para cada uno de los residuos de la región variable de cadena (A) ligera, y (B) pesada de las 10 estructuras más homologas. Los números representan los números de la posición de secuencia de anticuerpo Kabaí. La Figura 20 muesíra las secuencias de aminoácido de la región variable de cadena ligera para ios aníicuerpos EM164 de murino (muEM164) y EM164 humanizado (huEM164). muEM164 (SEC ID NO: 82), huEM164 V1. 0 (SEC ID NO: 83), huEM164 VI. I (SEC ID NO: 84), huEM164 V1. 2 (SEC ID NO: 85), huEM164 V1. 3 (SEC ID NO: 86). La Figura 21 las secuencias de aminoácido de la región variable de cadena pesada para los aníicuerpos EM164 de murino (muEM164, SEC ID NO: 87) y humanizado (huEM164, SEC ID NO: 88). La Figura 22 muestra el ADN de la región variable huEM164 v1.0 y las secuencias de aminoácido para ambas, las cadenas ligera (ADN, SEC ID NO: 89, aminoácido SEC ID NO: 90) y pesada (ADN, SEC ID NO: 91, aminoácido SEC ID NO: 92). La Figura 23 muestra el ADN de la región variable de cadena ligera y las secuencias de aminoácido para EM164 v1.1 humanizado (ADN, SEC ID NO: 93; aminoácido SEC ID NO: 94), v1.2 (ADN, SEC ID NO: 95; aminoácido SEC ID NO: 96) y v1.3 (ADN, SEC ID NO: 97; aminoácido SEC ID NO: 98). La Figura 24 muestra la inhibición del crecimienío y supervivencia esíimulado por IGF-I de células MCF-7 a fravés del aníicuerpo EM164 v1.0 humanizado y el aníicuerpo EM164 de murino. La Figura 25 muesíra que EM164 elimina el ciclo esíimulado por IGF-I de células MCF-7. La Figura 26 muesíra que EM164 elimina el efecío anti-apoptótico de IGF-I y suero. El tratamiento con EM164 da como resultado la muerte de célula apoptótica como se demuestra a través de los niveles aumentados de proteína CK18 dividida. La Figura 27 muestra el efecto del tratamiento con el anticuerpo EM164, gemcitabina, o una combinación del anticuerpo EM164 y gemcitabina, en el crecimienío de xenoinjeríos pancreáticos de cáncer BxPC-3 humanos en ratones inmunodeficienf.es.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores de la preseníe han descubierto y mejorado anticuerpos novedosos que e specíficamente s e e nlazan a l receptor d el factor-l d e crecimiento d e tipo insulina humano (IGF-IR) en la superficie de célula. Los anticuerpos y fragmentos tienen la habilidad única de inhibir las funciones celulares del receptor sin la capacidad de activar a los receptores mismos. De esía forma, mienfras los anticuerpos previamente conocidos que específicamente se enlazan e i nhiben I GF-IR íambién a cíivan a l recepíor a ún e n ausencia de ligandos IGF-IR, los aníicuerpos o fragmeníos de la preseníe invención aníagonizan IGF-IR pero subsíancialmeníe carecen de la acíividad agonisía. Además, los aníicuerpos y fragmeníos de aníicuerpos de la presente invención inhiben el crecimiento de células de íumor humanas íales como las células MCF-7 en el grado de inhibición que se obíiene uíilizando aníicuerpos aníi-IGF-IR previamente conocidos. La preseníe invención confinua de un aníicuerpo anti-IGF-IR de murino, aquí EM164, que está compleíameníe caracterizado con respecío a las secuencias de aminoácido de ambas cadenas, ligera y pesada, la ideníificación de ios CDRs, la ideníificación d e l os a minoácidos d e s uperficie, y medios para su expresió?n en forma recombinanle. Las secuencias de la línea de germen se muesíran en la Figura 15 alineadas con la secuencia de EM164. La comparación ideníifica las muíaciones somáíicas probables en EM164, incluyendo cada uno en CDR1 en la cadena ligera y en CDR2 en la cadena pesada. Las secuencias de aminoácido y ADN principales de las cadenas ligera y pesada del aníicuerpo EM 164, y de las versiones humanizadas, se describen aquí. Sin embargo, el alcance de la presente invención no esíá limiíado a aníicuerpos y fragmeníos que comprenden esías secuencias. Más bien, iodos los aníicuerpos y fragmeníos que específicamente se enlazan a un receptor dei factor-l de crecimiento de íipo insulina y aníagonizan la acíividad biológica del recepíor, pero que subsíancialmeníe carecen de acíividad agonista, caen dentro del alcance de la presente invención. De esta forma, los anticuerpos y fragmeníos de aníicuerpo puede diferir del anticuerpo EM164 o de derivados humanizados en las secuencias de aminoácido de andamio, CDRs, cadena ligera y cadena pesada, y aún caen dentro del alcance de la preseníe invención Los CDRs del anficuerpo EM164 se ideníifican a íravés de la modelación y sus esíructuras moleculares han sido pronosticadas. Otra vez, ya que los CDRs son importantes para el reconocimiento del epííopo, no son esenciales para los aníicuerpos o fragmeníos de la invención. Por consiguiente, los aníicuerpos y fragmeníos se proveen teniendo propiedades mejoradas producidas por, por ejemplo, maduración de afinidad de un aníicuerpo de la preseníe invención. Los diversos aníicuerpos y fragmentos de aníicuerpos, así como imiíaciones de aníicuerpo pueden ser fácilmente producidos p9or muíación, eliminación y/o inserción deníro de las secuencias de ia región variable y constante que flanquean un grupo de CDRs particular. De esta forma, por ejemplo, son posibles difereníes clases de Ab para un grupo dado de CDRs a íravés de la subsíitución de las diferentes cadenas pesadas, mientras, por ejemplo, se pueden producir los tipos e isotipos de anticuerpo lgGI-4, IgM, lgAI-2, IgD, e IgE. Similarmente, los anticuerpos artificiales deníro del alcance de la ¡nvención se pueden producir embebiendo un grupo dato de CDRs dentro de una estrucíura siníéíica enteramente. El término "variable" se utiliza aquí para describir ciertas porciones de los dominios variables que difieren en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en el enlace y especificidad de cada anficuerpo particular para su aníígeno. Sin embargo, ia variabilidad no es usualmeníe uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Típicamente se concenfran en fres segmentos llamados regiones para deíerminar la complemeníariedad (CDRs) o regiones hipervariabies íanío en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada, en su mayor parte adopíando una configuración de hoja beía, coneciada a través de tres CDRs, que forman un bucle conectando, y en algunos casos formando parte de la esírucíura de la hoja beía. Las CDRs en cada cadena se maníienen junías en proximidad cercana por las regiones FR y, con las CDRs forman oíra cadena, coníribuyen a la formación del sitio de enlace del aníígeno de los aníicuerpos (E. A. Kabaí y oíros Sequences of Proíeins of Immunological Iníeresí, quinía edición, 1991 , NIH). Los dominios consíaníes no esíán involucrados direcíamente en el enlace de un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben varias funciones productoras, tales como la participación del anficuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados, o aníicuerpos adapíados para el no rechazo mediante otros mamíferos, se pueden producir uíilizando varias tecnologías íales como revesfimiento o injerto de CDR. En la tecnología de revestimiento, la modelación molecular, el análisis estadístico y la mutagénesis se combinan para ajustar las superficies no de CDR de las regiones variables para asemejarlas a superficies de anticuerpos conocidos del huésped objetivo. Las estrategias y métodos para revestir anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los aníicuerpos denfro de un huésped diferente, se describen en la Pateníe de E.U.A. No. 5,639,641 , la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En la tecnología de injerto CDR, las CDRs de cadena pesada y ligera de murino se injertan dentro de una secuencia de estructura completamente humanas. La invención también incluye equivalentes funcionales de los anticuerpos descritos en esía especificación. Los equivaleníes funcionales íienen caracíerísíicas de enlace que son comparables con aquellas de los aníicuerpos, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos quimerizados, humanizados y de cadena ligera así como fragmentos de los mismos. Los métodos para producir dichos equivalentes funcionales se describen en la Solicitud PCT WO 93/21319, la Solicitud de Paíeníe Europea No. 239,400; la Soliciíud PCT WO 89/09622; la Soliciíud de Patente Europea No. 338,745; y la Soliciíud de Paíeníe Europea EP 332,424, las cuales se incorporan aquí por referencia en su toíalidad. Los equivalentes funcionales incluyen polipépíidos con secuencias de aminoácido subsíancialmente las mismas que la secuencia de aminoácido de las regiones variables o hipervariable de los anticuerpos de la invención. "Substancialmeníe la misma" se aplica a una secuencia de aminoácido definida aquí como una secuencia con por lo menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con otra secuencia de aminoácido, como se determina a través del método de invesíigación FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988). Los aníicuerpos quimerizados preferiblemeníe íienen regiones consíaníes derivadas subsíancialmeníe o exclusivamente de regiones consíaníes del aníicuerpo humano y regiones variables derivadas subsíancialmeníe o exclusivamente de la secuencias de la región variable de un mamífero diferente de un ser humano. Las formas humanizadas de los aníicuerpos se hacen a íravés de la subsíiíución de las regiones para la determinación de la complemenfariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en un dominio de estrucíura de ser humano, por ejemplo, ver la Publicación de PCT No. W092/22653. Los aníicuerpos humanizados preferiblemeníe íienen regiones consfaníes y regiones variables diferentes de las regiones para la determinación de la complementariedad (CDRs) derivadas substancialmeníe o exclusivamente de las regiones del aníicuerpo humano correspondiente y CDRs derivados subsíancialmeníe o exclusivamente de un mamífero diferente de un ser humano. Los equivalentes funcionales íambién incluyen fragmeníos de aníicuerpo de cadena individual, íambién conocidos como aníicuerpos de cadena individual (scFvs). Estos fragmeníos coníienen por lo menos un fragmenío de una secuencia de aminoácido de cadena pesada variable del aníicuerpo (VH) aíada a por lo menos un fragmenío de una secuencia de cadena ligera variable del aníicuerpo (VL) con uno o más enlazadores de interconexión. Dicho enlazador puede ser un pépíido flexible, corto seleccionado para asegurar que ocurra el doblez tridimensional de los dominios (VL) y (VH) una vez que se enlazan para así mantener la especificidad de enlace de la molécula objetivo del anticuerpo completo a partir del cual se deriva el fragmento de aníicuerpo de cadena individual. Generalmeníe, el término carboxilo de la secuencia de (VL) o (VH) puede esíar covalenfemeníe enlazada a íravés de dicho pépíido al íérmino aminoácido de una secuencia (V ) y (VH) complemeníaria. El fragmenío de aníicuerpo de cadena individual se puede generar a íravés de clonación molecular, colección de despliegue de fago de aníicuerpo, o técnicas similares. Esías proteínas se pueden producir ya sea en las células eucarióíicas o células procarióticas, incluyendo la bacteria. Los fragmento de aníicuerpos de cadena individual coníienen secuencias de aminoácidos que íienen por lo menos una de las regiones para la determinación de la complementariedad o variable (CDRs) de los aníicuerpos completos descritos en esía especificación, pero carecen de algunos o todos los dominios consíaníes de esíos aníicuerpos. Esíos dominios consíaníes no son necesariameníe para el enlace del aníígeno, pero consíiíuyen una porción mayor de la esfrucíura de los aniicuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpos de cadena individual por consiguiente superan algunos de los problemas asociados con el uso de aníicuerpos que coníienen una parte o todos l os d ominios constaníes. P or ejemplo, l os fragmeníos d e a níicuerpos de cadena individual tienden a estar libres de interacciones no deseadas entre las moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada, u otra acíividad biológica no deseada. Adicionalmeníe, un fragmenío de aníicuerpo de cadena individual es considerablemente más pequeño que los aníicuerpos completos y puede por consiguiente íener una permeabilidad capilar mayor que los aníícuerpos completos, permitiendo que el fragmento de aníicuerpo de cadena individual localice y se enlace a los siíios de enlace del antígeno objetivo más eficientemente. También, los fragmeníos de aníicuerpo se pueden producir en una escala relaíivameníe grande en células procarióíicas, de esía forma faciliíando su producción. Además, el íamaño relaíivameníe pequeño del fragmenío de aníicuerpo de cadena individual lo convierte en menos probable para provocar una respuesta inmune en un receptor que los aníicuerpos completos. Los equivaleníes funcionales además incluyen fragmeníos de anticuerpos que tienen las mismas, o comparables caracterísíicas de enlace con aquellos del aníicuerpo complete. Dichos fragmeníos pueden coníener uno o ambos fragmeníos Fab o el fragmenío F (ab') 2. P referiblemente I os fragmeníos e a nf ¡cuerpo p ueden coníener las seis regiones p ara l a d eterminación de la complemeníariedad del aníicuerpo completo, aunque los fragmentos que contiene menos que iodos dichas regiones, íales como íres, cuaíro o cinco CDRs, íambién son funcionales. Además, los equivaleníes funcionales pueden ser o pueden combinar miembros de cualquiera de las siguieníes clases de inmunoglobulina: IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y subclases de las mismas. El conocimiento de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico para el anticuerpo EM164 del receptor aníi-IGF-l y sus variantes humanizadas, que se describen aquí, se puede utilizar para desarrollar oíros aníicuerpos que también se enlazan al receptor IGF-I humano e inhiben las funciones celulares del receptor IGF-I. Varios esíudios han esíudiado los efectos de iníroducir uno o más cambios en los aminoácidos en varias posiciones en la secuencia de un aníicuerpo, con base en el conocimiento de la secuencia del aníicuerpo primario, en sus propiedades íales como enlace y nivel de expresión (Yang, W. P. y oíros, 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403; Rader, C. y oíros, 1998, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. y oíros, 1998, Naíure Bioíechnology, 16,535-539).

En esíos esíudios, las variantes del aníicuerpo primario han sido generadas cambiando las secuencias de los genes de la cadena ligera y pesada en CDR1 , CDR2, CDR3, o las regiones de esírucíura, ufilizando métodos íales como mufagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótido, mutagénesis de cásete, PCR propensa al error, organización de ADN, o cepas del mutador de E. coli (Vaughan, T. J. y oíros, 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. y otros, 1996, Capífulo 16, pp. 277-291 , in "Phage Dispiay of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. y otros, Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han dado como resultado el cambio en la secuencia han dado como resultado la mejora en la secuencia de anticuerpos secundarios (Gram, H. y otros, 1992, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA, 89, 3576- 3580; Boder, E. T. y oíros, 2000, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA, 97, 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L, 1996, Imniunofechiiolgy, 2, 169-179; Thompson, J. y otros, 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88; Short, M. K. y otros, 2002, J Biol. Chem., 277, 16365-16370; Furukawa, K. y otros, 2001 , J. Biol. Chem., 276, 27622-27628). A través de una estrategia similar dirigida de cambiar uno o más residuos de aminoácido del, las secuencias del anticuerpo descritas en esta invención se pueden utilizar para desarrollar anticuerpos del receptor anti-IGF-l con funciones mejoradas. Los conjugados de la presenfe invención comprenden el anticuerpo, fragmentos, y sus análogos como se describen aquí, enlazados a un agente cifotóxico. Los ageníes ciíofóxicos preferidos son maitansinoides, taxanos y análogos de CC-11065. Los conjugados se pueden preparar a través de métodos in vitro. Con e l f in d e e nlazar e l agente citotóxido al anticuerpo, se uíiliza un grupo enlazador. Los grupos enlazadores adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen grupos de disulfuro, grupos tioéíer, grupos inesíables de ácido, grupos fotoinesíables, grupos inesíables de pepíidasa, y grupos inesíables de esíearasa. Los grupos enlazadores preferidos son los grupos de disulfuro y grupos íioéíer. Por ejemplo, los conjugados se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o a íravés de la formación de un enlace de íioéíer eníre el aníicuerpo y el ageníe ciíoíóxico. Los mailansinoides y análogos maiíansinoides esíán entre los agente citoíóxicos preferidos. Ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maiíansinol y análogos de maifansinol. Los maiíansinoides adecuados se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371 ,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; y 5,846,545. Los láxanos íambién son a geníe citoíóxicos p referidos. Los íaxanos adecuados para uso en la preseníe ¡nvención se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,372,738 y 6,340,701 CC-1065 y sus análogos íambién son grupos cifoíóxicos preferidos para uso en la preseníe invención. CC-1065 y sus análogos se describen en las Pateníes de E.U.A. Nos. 6,372,738; 6,340,701 ; 5,846,545 y 5,585,499. Un candidato airactivo para la preparación d e d ichos conjugados citoíóxicos es CC-1065, el cual es un aníibióíico aníi-íumor potente aislado del caldo del culíivo de Streptomyces zelensis. CC-1065 es de alrededor de 1000 veces más potente in vitro que los fármacos aníi-cáncer comúnmeníe uíilizados, íales como doxorubicina, meíotrexato y vincristina (B. K. Bhuyan y otros, Cáncer Res., 42, 3532-3537 (1982)). Los fármacos citotóxicos tales como metoírexaío, daunorubicina, doxorubicina, vincrisíina, vinblasíina, melfalan, miíomicina C, clorambucil, y caliqueamicina íambién son adecuados para la preparación de conjugados de la preseníe invención, y las moléculas de fármaco íambién esíán enlazadas a las moléculas de aníicuerpo a íravés de una molécula portadora íal como albúmina de suero.

Para aplicaciones de diagnósfico, los aníicuerpos de la preseníe invención íípicameníe se marcarán con una porción deíecíable. La porción deíecíable puede se cualquiera que sea capaz de producir, ya sea direcfa o indirecíamenfe, una señal deíectable. Por ejemplo, la porción detecíable puede ser un radioisótopo, íal como 3H, 14C, 32P, 35S, o 131l; un compuesío fluorescente o quimioluminisceníe, íal como isoíiocianaío de fluoresceína, rodamina, o luciferina; o una enzima, íal como fosfaíasa alcalina, beía-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Cualquier méíodo conocido en la íécnica para conjugar el aníicuerpo para una porción deíecfable se puede emplear, incluyendo aquellos métodos descriíos por Huníer, y oíros, Naíure 144:945 (1962); David, y oíros , Biochemisíry 13:1014 (1974); Pain, y otros, J. Immunol. Meíh. 40:219(1981); y Nygren, J. Hisfochem. y Cyíochem. 30:407 (1982). Los anficuerpos de la preseníe invención se pueden emplear en cualquier méíodo de ensayo conocido, íal como el ensayo de enlace competitivo, ensayos de emparedado directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Aníibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)). Los anticuerpos de la invención también son útiles para una formación de imágenes in vivo, en donde el anticuerpo marcado con una porción detecíable íal como una ageníe radio-opaco o radioisótopo se adminisíra a un sujeío, preferiblemeníe denfro de la corriente sanguínea, y la presencia y ubicación del aníicuerpo marcado en el huésped de ensaya. Esía íécnica formadora de imágenes es úíil en represeníación y fraíamienío de malignidades. El aníicuerpo se puede marcar con cualquier porción que es detectable en un huésped, ya sea a través de resonancia magnética nuclear, radiología, u oíros medios de detección conocidos en la íécnica. Los aníicuerpos de la ¡nvención íambién son úíiles como agentes de purificación de afinidad. En esíe proceso, los aníicuerpos se inmovilizan en un soporte adecuado, íal como resina Sephadex o papel filíro, uíilizando métodos conocidos en la íécnica. Los aníicuerpos de la invención íambién son útiles como reactivos en una investigación biológica, con base en su inhibición de la función del recepíor IGF-I en células. Para aplicaciones lerapéuíicas, los aníicuerpos o conjugados de la invención se adminisíran a un sujeío, en una forma de dosificación farmaceúíicamenfe acepíable. Se pueden adminisírar íníravenosameníe como un bolo o a íravés de infusión confinua duraníe un período de íiempo, medianíe ruías iníramuscular, subcuíánea, iníra-articular, inírasinovial, inírahecal, oral, tópica, o inhalación. El aníicuerpo íambién se puede adminisírar a íravés de la ruía iníraíumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos íerapéuíicos locales así como sisiémicos. Los portadores, diluyeníes y excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica y se pueden deíerminar a iravés de aquellos con experiencia en la íécnica según las garaníías de la siíuación clínica. Ejemplos de portadores, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) salina regulada en su pH de fosfato de Dulbecco, pH de alrededor de 7.4, conteniendo alrededor de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero humano, (2) 0.9% de salina (0.9% p/v de NaCI), y (3) 5% de (p/v) dextrosa. El méíodo de la preseníe invención se puede pracíicar in vitro, in vivo, o ex vivo. En oíros í raíamieníos íerapéuíicos, l os a níicuerpos, fragmentos de aníicuerpo o conjugados de la invención se co-administran, o se administran secuencialmente, con uno o más agentes terapéuíicos. Los ageníes ierapéuiicos adecuados incluyen, pero no se limiían a, ageníes ciíolóxicos o ciíoesíáiicos. Taxol es un agente íerapéuíico preferido que íambién es un agente citoíóxico. Los ageníes terapéuíicos de cáncer son aquellos ageníes que buscan aniquilar o limiíar el crecimienío de células de cáncer mieníras hacen un daño mínimo al huésped. De esía forma, dichos ageníes pueden explorar cualquier diferencia en las propiedades de la célula de cáncer (por ejemplo, meíabolismo, vascularización o preseníación de aníígeno en la superficie de la célula) de células huésped sanas. Las diferencias en la morfología del íumor son sitios potenciales para la intervención: por ejemplo, el segundo terapéuíico puede ser un aníicuerpo tal como el anticuerpo anti-VEGF que es útil en el retraso de la vascularización del interior de un íumor sólido, mientras disminuye su tasa de crecimiento. Otros agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, complementos íales como HCl de g raniseíron, i nhibidores d e andrógeno íales como aceíaío de leuprolída, aníibióíicos tales como doxorubicina, antiesírógenos íales como íamoxifen, aníimeíaboliíos íales como iníerferón alfa-2a, ageníe citoíóxicos fales como íaxol, inhibidores de enzima tales como el inhibidor de transferasa de ras famesilo, immunomoduladores tales como aldesleucina, y derivados de mostaza de nitrógeno tales como HCl de melfalano, y similares. Los agentes íerapéuíicos que se pueden combinar con EM164 para mejorar la eficiencia aníi-cáncer incluyen diversos ageníes uíilizados en la prácíica oncológica (Referencia: Cáncer, Principies & Pracíice of Oncology, DeViía, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6a edición, Lippincoíf-Raven, Philadelphia, 2001), íales como doceíaxel, pacliíaxel, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, írasíuzumab (Hercepíina), capeciíabina, íamoxifen, íoremifene, leírozoi, anasfrozol, fulvesíraní, exemesíane, goserelina, oxaliplaíina, carboplaíina, cisplaíina, dexameíasona, antide, bevacizumab (Avastin), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinoíecan, eíoposida, íopoíecan, gemcifabina, vinorelbina, esíramusíina, miíoxanírona, abarelix, zoledronaíe, sírepíozocina, riíuximab (Rituxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, imatinib, ciíarabina, ibriíumomab (Zevalin), íosiíumomab (Bexxar), iníerferón alfa-2b, melfalam, bortezomib (Velcade), altreíamina, asparaginasa, gefiíinib (Iressa), erloniíib (Tarceva), aníicuerpo del recepíor aníi-EGF (Cetuximab, Abx-EGF), epoíilones, y conjugador de fármacos ciíoíóxicos y aníicuerpos coníra recepíores de superficie de células. Los ageníes íerapéuíicos preferidos son ageníes de plaíino (íales como carboplaíina, oxaliplaíina, cisplaíina), íaxanos (íales como pacliíaxel, docefaxel), gemciíabina, y campíoíecina. Los uno o más ageníes íerapéuíicos adicionales se pueden adminisírar aníes, concurrentemente, o después del aníicuerpo, fragmenío de aníicuerpo o conjugado de la invención. El experto en la íécnica eníenderá que para cada ageníe terapéuíico puede haber veníajas para un orden particular de adminisíración. Similarmente, el experto en la íécnica eníenderá que para cada ageníe íerapéuííco, la duración de íiempo eníre el cual el agente, y un aníicuerpo, fragmenío de anticuerpo o conjugado de la invención se administra, variará. Ya que el experto en la íécnica eníenderá que la dosificación de cada ageníe íerapéuíico d ependerá d é l a ideníidad del agente, las dosificaciones preferidas pueden estar en la escala de alrededor de 10 mg/m2 a ardedor de 200 mg/m2, más preferiblemente de acreedor de 50 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. Para los agentes preferidos fales como ageníes de plaíino (carboplaíina, oxaliplaíina, cisplaíina), las dosificaciones preferidas son de alrededor de 10 mg/m2 a aproximadameníe 400 mg/m2, para faxanos (paclitaxel, docetaxel) la dosificación preferida es de aproximadameníe 20 mg/m2 a aproximadamenfe 150 mg/m2, para gemcitabina la dosificación preferida es de aproximadamente 100 mg/m2 a aproximadamente 2000 mg. m2, y para campíoíecina la dosificación preferida es de aproximadamenfe 50 mg/m2 a aproximadameníe 350 mg/m2. La dosificación de este y otros agentes terapéuíicos puede depender de si el anficuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de la invención se administra concurrente o secuencialmenfe con un agente terapéuíico. La adminisíración de un aníicuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de la invención, y uno o más agentes terapéuticos adicionales, ya sea co-administrados o adminisírados secuencialmente, puede ocurrir como se describe anteriormeníe para aplicaciones terapéuíicas. Los portadores, diluyentes y excipientes farmacéuticamente adecuados para la co-administración se entenderán por un experto en la técnica que dependen de la identidad del agente terapéuíico particular que se está administrando. Cuando está presente en una forma de dosificación acuosa, en lugar de ser liofilizado, el anticuerpo típicamente se formulará a una concentración de alrededor de 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, aunque se permite una amplia variación fuera de esías escalas. Para el íralamienío de enfermedades, la dosificación apropiada del aníicuerpo o conjugado dependerá del íipo de enfermedad que se va a íratar, si los aníicuerpos se adminisíran para propósitos d e p revención o terapéuíicos, el curso dé la ferapia previa, el h istorial clínico del pacieníe, y la respuesía al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, preferiblemente de aproximadamente 1 mg/metro cuadrado a aproximadamente 2000 mg/meíro cuadrado del anticuerpo es un dosificación candidato inicial para adminisíración al pacieníe, más preferiblemeníe de aproximadamente 10 mg/mefro cuadrado a aproximadamente 1000 mg/meíro cuadrado del aníicuerpo ya sea, por ejemplo, a íravés de una o más adminisíraciones separadas, o a través de infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el íratamienío se repite hasta que ocurre la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, y no se excluyen. La presente invención también incluye equipos que comprenden uno o más de los elementos descritos aquí, e instrucciones para uso de esos elementos. En una modalidad preferida, un equipo de la presente ¡nvención incluye el anficuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de la ¡nvención, y un agente terapéutico. Las instrucciones para esta modalidad preferida incluyen ínsírucciones para inhibir el crecimiento de una célula de cáncer utilizando el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de la ¡nvención, y el agente terapéutico, y/o instrucciones para un método para tratar un paciente que tiene cáncer utilizando el aníicuerpo, fragmenío de aníicuerpo o conjugado de la invención, y el ageníe terapéutico. Preferiblemente, el anticuerpo utilizado en el equipo tiene la misma secuencia de aminoácido q ue e l a nticuerpo E M164 d e m urino producido por el hibridoma EM164 de raíón (ATCC número de regisíro PTA-4457), o el anticuerpo es un fragmento enlazado al epítopo del mismo, en donde ambos, el anticuerpo y e l fragmenío específicamente s e enlazan al recepíor del faclo-l de crecimiento de tipo insulina. El anticuerpo y el fragmento de anticuerpo utilizados en el equipo también pueden ser una versión revestida del anticuerpo EM164, una versión humanizada del anticuerpo EM164, o una versión alterada del aníicuerpo EM164 que tiene por lo menos una mutación, eliminación o inserción del nucleótido. Los a nticuerpos y los fragmeníos d e a nficuerpo d e cada una de estas tres versiones retienen la misma especificidad de enlace que el anticuerpo EM164. Preferiblemeníe, el ageníe ferapéuíico utilizado en el equipo se selecciona del grupo que consiste de doceíaxel, pacliíaxel, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, írastuzumab (Hercepfina), capeciíabina, íamoxifen, íoremifen, letrozol, anastrozol, fulvesíraní, exemesíano, goserelina, oxaliplatina, carboplafina, cisplaíina, dexameíasona, antida, bevacizumab (Avastin), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinotecan, etoposida, topotecan, gemcitabina, vinorelbina, estramusíina, mitoxanírona, abarelix, zoledronaío, esírepíozocina, rituximab (Rituxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, imatinib, citarabina, ibritumomab (Zevalin), íositumomab (Bexxar), iníerferón alfa-2b, melfalam, bortezomib (Velcade), altretamina, asparaginasa, gefitinib (Iressa), erlonitib (Tarceva), anticuerpo del receptor anti- EGF (Cetuximab, Abx-EGF), y una epotilona. Más preferiblemente, el agente terapéutico es un agente de platino (tales como carboplatina, oxaliplatina, cisplatina), un taxano (tales como paclitaxel, docetaxel), gemcitabina, o camptoíecina. Los elementos de los equipos de la presente invención están en forma adecuada para un equipo, tal como una solución o polvo liofilizado. La concentración o la cantidad de los elementos de los equipos se entenderán por aquellos con experiencia e n l a técnica q ue variarán d ependiendo d e la identidad y uso previsto para cada elemento del equipo. Los cánceres y células ahí referidas en las instrucciones de los equipos incluyen cáncer de pecho, cáncer de colon, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, melanoma, mieloma múlíiple, neuroblastoma, y rhabdomiosarcoma.

EJEMPLOS Ahora se describirá la invención mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que solamente son ilustraíivos, y no pretenden limiíar la presente invención.

EJEMPL0 1 anticuerpo EM164 de Murino En este primer ejemplo, se describe la estructura de aminoácido primaria completa y la secuencia de ADNc de un aníicuerpo de murino de la presenfe invención, junto con sus propiedades de enlace y medios para su expresión en forma recombinante. Por consiguiente, se provee una descripción completa y toíal de un aníicuerpo de la ¡nvención y su preparación, de tal forma que alguien con experiencia ordinaria en las técnicas ¡nmunológicas sería capaz de preparar dicho aníicuerpo sin experimentos indebidos.

A. Generación del Hibridoma del Anticuerpo Monoclonal del Receptor Anti- IGF-I Se utilizó una línea de célula que expresa el receptor IGF-I humano con una mutación Y1251 F para la inmunización según se expresa a un gran número de receptores IGF-I (aproximadamente 107 por célula). La mutación Y1251 F en el dominio citoplásmico del receptor IGF-I receptor dio como resultado la pérdida de transformación y señalización anti-apopíótica, pero no afectó el enlace de IGF-I y la señalización mitogénica esíimulada por I GF-I (O'Connor, R. y oíros , 1 997, Mol. Cell. B iol., 1 7,427-435; Miura, M. y otros, 1995, J Biol. Chem., 270, 22639-22644). La mutación por el conírario no afectó la generación del anticuerpo porque el anticuerpo de este ejemplo se enlazó al dominio extracelular del receptor IGF-I, el cual fue idéntico para ambos, el receptor de tipo muíante Y1251 F y de tipo silvestre. Se generó una línea de célula que expresa el receptor IGF-I humano con una mutación Y1251 F de células de íipo 3T3 de un raíón deficiente del receptor IGF-I a través de transfección con el gen del receptor IGF-I humano mutaníe Y1251 F junto con un gen resistente a puromicina, y se seleccionó utilizando puromicina (2.5 microgramo/ml) a través de FACS clasificando la alta expresión del receptor IGF-I (Miura, M. y otros, 1995, J. Biol. Chem., 270, 22639-22644). Una célula que tiene un alto nivel de expresión del recepíor IGF-I además se seleccionó uíilizando una alfa concentración de puromicina tal como 25 microgramos/ml, que fue tóxico para la mayor parte de las células. Las colonias sobrevivientes se seleccionaron y aquellas que desplegaron un alio nivel de la expresión del IGF-I se seleccionaron. Se inmunizaron ratones hembra CAF1/J, de 6 meses de edad intraperitonealmente en el día 0 con células que sobre expresan el receptor IGF-I humano del mutante Y1251 F (5 x 105 células, suspendidas en 0.2 ml de PBS). Los animales se fortalecieron con 0.2 ml de suspensión de célula como sigue: día 2, 1 x 106 células; día 5, 2 x 106 células; días 7, 9, 12, y 23, 1 x 107 células. En el día 26, un ratón se sacrificó y se removió su bazo. El bazo de trituró entre dos diapositivas de cristal congelado para obtener una sola suspensión de célula, la cual se lavó con medio RPMI libre de suero coníeniendo penicilina y esfreptomicina (SFM). El comprimido de células de bazo se volvió a suspender en 10 ml de 0.83% (p/v) solución de cloruro de amonio en agua duranfe 10 minutos sobre hielo para lisar los glóbulos rojos, y después se lavaron con medio libre de suero (SFM). Las células del bazo (1.2 x 108) se agruparon con células de mieloma (4 x 107) de la línea de células de mieloma de ratón no se secreción P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD; Cat. # CRL1580) en un tubo, y se lavaron con medio RPMI-1640 libre de suero SFM). El sobrenadante se removió y el comprimido de células se volvió a suspender en medio residual. El tubo se colocó en un vaso de laboratorio de agua a 37°C y se agregaron 1.5 ml de solución de polietilen glicol (50% de PEG (p/v), peso molecular promedio de 1500 en 75 mM de HEPES, pH 8) lentamente a una velocidad de goteo de 0.5 ml/minuto mientras el íubo se agiíó ligeramente. Después de una espera de un minuto, s e a gregaron 1 0 m l d e S FM como s igue: 1 m l d urante el p rimer m inuío, 2 m l durante el segundo minuto y 7 ml durante el tercer minuto. Después se agregaron otros 10 ml lentamente duraníe un minuío. Las células se comprimieron a íravés de cenírifugación, se lavaron en SFM y se volvieron a suspender en medio de crecimienío RPM1-1640 suplemeníado con 5% de suero de bovino fetal (FBS), hipoxantina/aminopíerina/timidina (HAT), penicilina, estreptomicina, y 10% de suplemento de clonación de hibridoma (HCS). Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 cavidades a 2 x 105 células de bazo en 200 µl por cavidad. Después de 5-7 días, se removieron 100 µl por cavidad y se volvieron a colocar con medio de crecimiento suplemeníado con hipoxantina/timidina (HT) y 5% de FBS. Las condiciones generales utilizadas para la inmunización y la producción del hibridoma fueron como se describe por J. Langone y H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121 , "Immunochemical Techniques, Parte I"; 1986; Academic Press, Florida) y E. Harlow y D. Lañe ("Antibodies: A Laboratory Manual"; 1988; Cold Spring Harbor Laboraíory Press, New York). También se pueden uíilizar oirás técnicas de inmunización y producción de hibridoma, según son bien conocidas por un experto en la íécnica. Los sobrenadaníes de culíivo de los clones de hibridoma se seleccionaron para el enlace con el recepíor IGF-I humano purificado a íravés de ELISA, para enlace específico a células que sobre expresan el recepíor IGF-I humano, y para una carencia de enlace a células que sobre expresan el recepíor de insulina humano a íravés de clasificación ELISA y FACS como se describe más adelaníe. Los clones que exhiben una afinidad de enlace más alia a células que sobre expresan al recepíor de insulina humano se expandieron y subclonaron. Los sobrenadaníes de cultivo de los subclones además se clasificaron a través de los ensayos de enlace anteriores. A través de esíe procedimienío, se seleccionó el subclon 3F1-C8-D7 (EM164), y los genes de cadena ligera y pesada se clonaron y se secuenciaron como se describe más adelaníe. Se aisló el recepíor IGF-I humano para uso en la clasificación de los sobrenadaníes de clones de hibridoma para su enlace al recepíor IGF-I a íravés del méíodo anterior. El IGF-I bioíeñido se preparó a íravés de la modificación del IGF-I recombinaníe uíilizando reacíivos de bioíeñido íales como sulfo-NHS-LC-bioíina, sulfo-NHS-SS-bioíina, o NHS-PEO4-bioíina. El IGF-I bioíeñido se absorbió en perlas de estreplavidina-agarosa y se incubó con lisato de células que sobre expresan el IGR de tipo silvesíre o del muíante Y1251 F. Las perlas se lavaron y se eluyeron con un regulador de pH conteniendo de 2 a 4 M de urea y detergentes íales como íriíon X-100 o octil-ß-glucosida. El receptor IGF-I eluido se dializó coníra PBS y se analizó para su pureza a íravés de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción, lo que demosíró las bandas de cadena alfa y beía del recepíor IGF-I de pesos moleculares de aproximadameníe 135 kDa y 95 kDa, respecfivameníe. Para verificar el enlace de los sobrenadantes de hibridoma al recepíor IGF-I purificado, se cubrió una placa ELISA lmmulon-4HB (Dynaíech) con una muesíra del recepíor IGF-I humano (preparado a íravés de diálisis de la elusión de urea/ocíil-ß-glucosida de la muestra purificada da afinidad) diluido en 50 mM de regulador de pH CHES a un pH de 9.5 (100 µl; 4°C, duraníe la noche). Las cavidades se bloquearon con 200 µl de regulador de pH de bloqueo (10 mg/ml de BSA en regulador de pH TBS-T conteniendo 50 mM de Tris, 150 mM de NaCI, pH 7.5, y 0.1 % de Tween-20) y se incubaron con sobrenadantes de clones de hibridoma (100 µl; diluido con regulador de pH de bloqueo) duraníe aproximadameníe 1 hora a 12 horas, se I lavó con regulador de pH TBS-T, y se incubó con conjugado de peroxidasa de rábano picante del aníicuerpo Fc de IgG d e anti-ratón de cabra (HRP) (100 pµl; 0.8 µg/ml en regulador de pH de bloqueo; Jackson ImmunoResearch Laboratories), seguido por lavados y deíección uíilizando el subsíraío ABTS/H202 a 405 nm (0.5 mg/ml de ABTS, 0.03% de H2O2 en 0. 1 M de regulador de pH de ciíraío, pH 4.2). Típicamente, un sobrenadaníe del sublcon de hibridoma 3F1 produjo una señal de alrededor de 1.2 absorbancia deníro de los 3 minuíos de desarrollo, en conírasío con los valores de 0.0 obtenidos de sobrenadaníes de algunos oíros clones del hibridoma. Las condiciones generales para esíe ELISA fueron similares a las condiciones de ELISA esíándares para el enlace y la deíección del aníicuerpo como se describe por E. Harlow y D. Lañe ("Using Aníibodies: A Laboraíory Manual"; 1999, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, New York), cuyas condiciones íambién se pueden ufilizar. La clasificación de los sobrenadaníes del hibridoma para el enlace específico al recepíor IGF-I humano y no al receptor de insulina humano se llevaron a cabo utilizando ELISA en líneas de célula que sobre expresan el receptor IGF-I Y1251 F humano y en líneas d e célula q ue s obre expresan e l receptor de insulina humano. Ambas líneas de célula se generaron de células de tipo 3T3 de ratones deficientes del receptor IGF-I. Las células que sobre expresan el recepíor IGF-I y las células que sobre expresan el recepíor de insulina se cosecharon de manera separada de maíraces de culíivo de tejido a íravés del íraiamienío de íripsina/EDTA rápido, se suspendieron en medio de crecimiento coníeniendo 10% de FBS, se comprimieron a íravés de cenírifugación, y se lavaron con PBS. Las células lavadas (100 µl de aproximadameníe 1-3 x 106 células/ml) se agregaron a cavidades de una placa !mmulon-2HB cubierta con fiíohemagluíinina (100 µl de 20 µg/ml de PHA), se cenírifugaron y se dejaron adherir a las placas cubiertas con PHA durante 10 minutos. La placa con células se golpeó ligerameníe para remover el PBS, y después se secó duraníe la noche a 37°C. Las cavidades se bloquearon con 5 mg/ml de solución de BSA en PBS duraníe 1 h a 37°C y después se lavaron ligerameníe con PBS.

Los alícuoías de los sobrenadaníes de los clones del hibridoma (100 µl; diluidos con regulador de pH de bloqueo) después se agregaron a las cavidades coníeniendo las células que sobre expresan el recepíor IGF-I y a las cavidades coníeniendo las células que sobre expresan el recepíor de insulina a íemperafura ambieníe duraníe 1 hora. Las cavidades se lavaron con PBS, se incubaron con conjugado de peroxidasa de rábano picante del aníicuerpo Fc de IgG de aníi-raíón de cabra (100 µl; 0.8 µg/ml en regulador de pH de bloque) duraníe 1 hora, seguido por lavados y después se detectó el enlace uíilizando un subsíraío ABTS/H202. Un sobrenadaníe íípico de un subclon del hibridoma 3F1 después de la incubación con células que sobre expresan el recepíor IGF-I produjo una señal de 0.88 unidades de absorbancia deníro de los 12 minuíos del desarrollo, en conírasíe con un valor de 0.22 unidades de absorbancia obtenidas después de la incubación con células que sobre expresan al recepíor de insulina humano. El hibridoma creció en frascos Integra CL 350 (Integra Biosciences, Maryland), de acuerdo con las especificaciones del fabricante, para proveer el aníicuerpo EM164 purificado. Se obíuvo un rendimienío de alrededor de 0.5-1 mg/ml de aníicuerpo en los sobrenadaníes cosechados de los frascos de Integra, con base en la cuaníificación a íravés de ELISA y a íravés de SDS-PAGE/íinción azul de Coomassie uíilizando esíándares de aníicuerpo. El aníicuerpo se purificó a íravés de cromaíografía de afinidad en una columna de perla de agarosa de Proíeína A bajo condiciones de purificación esíándares de carga y lavado en 100 mM de regulador de pH Tris, pH 8.9, conteniendo 3 M de NaCI, seguido por elusión en 100 mM de solución de ácido acéíico coníeniendo 150 mM de NaCl. Las fracciones eluidas coníeniendo el aníicuerpo se neuíralizaron con solución de 2 M K2HPO4 fría y se dializaron en PBS a 4°C. La conceníración del aníicuerpo se deíerminó midiendo la absorbancia a 280 nm (coeficiente de exíinción = 1.4 mg"1 ml cm"1). La muesíra de aníicuerpo purificado se analizó a íravés de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y íinción azul de Coomassie, lo cual indicó solameníe bandas de cadena pesada y ligera del anticuerpo a aproximadameníe 55 kDa y 25 kDa, respecíivameníe. El isoíipo del aníicuerpo purificado fue IgG-i con la cadena ligera kappa.

B. Caracterización del enlace del anticuerpo EM164 El enlace específico del aníicuerpo EM 164 purificado se demosíró a íravés de la clasificación de célula acíivada por fluorescencia (FACS) uíilizando células que sobre expresan el recepíor humano IGF-I y a íravés del uso de células que sobre expresan el recepíor de insulina humano (Figura 1). La incubación del aníicuerpo EM 164 (50-100 nM) en 100 1 I de regulador de pH FACS frío (1 mg/ml BSA en medio MEM de Dulbecco) se llevó a cabo uíilizando células que sobre expresan el recepíor IGF-I y uíilizando células que sobre expresan el recepíor de insulina (2x105 células/ml) en una placa de 96 cavidades de fondo redondo duraníe 1 hora. Las células se granularon a íravés de cenírifugación y se lavaron con regulador de pH FACS frío a íravés de cepillado ligero, seguido por incubación con conjugado de aníicuerpo FITC de IgG de aníi-raíón de cabra e (100 µl; 10 µg/ml en regulador de pH FACS) sobre hielo duraníe 1 hora. Las células se granularon, se lavaron y se volvieron a suspender en 120 µl de solución de formaldehído al 1% en PBS. La placa s e a nalizó uíilizando un lector FACSCalibur (BD Biosciences). Se obíuvo un desplazamiento de fluorescencia fuerte después de la incubación del recepíor IGF-I que sobre expresa células con el aníicuerpo EM 164, en conírasíe con una desplazamiento insignificante después de la incubación del recepíor de insulina que sobre expresa células con el aníicuerpo EM 164 (Figura 1), que demosíró que el aníicuerpo EM 164 fue selecíivo en su en enlace al r recepíor IGF-I y no se enlaza al receptor de insulina. Los anticuerpos de conírol, el aníicuerpo 1 H7 del aníi-recepíor de IGF-I (Sania Cruz Bioíechnology) y aníicuerpo del aníi-recepfor de insulina alfa (BD Pharmingen Laboratories), produjeron desplazamientos de fluorescencia después de las incubaciones con células que sobre expresan recepíor IGF-I y el recepíor de insulina, respecíivameníe (Figura 1 ). También se observó un desplazamiento de fluorescencia fueníe a íravés del ensayo FACS uíilizando el aníicuerpo EM 164 y células MCF-7 de cáncer de pecho humano, que expresan el recepíor IGF-I (Dufoumy, B. y oíros , 1997, J. Biol. Chem., 272, 31163-31171), que mostró que el anticuerpo EM164 se enlaza al receptor IGF-l humano en la superficie de las células de íumor. La consfaníe de disociación (Kd) para el enlace del aníicuerpo EM 164 con el recepíor IGF-I humano se deíerminó a íravés de íiíulación con ELISA del enlace del aníicuerpo a varias concenlraciones con ya sea el recepíor direcíameníe cubierto IGF-I (afinidad purificada uíiiizando IGF-I bioíeñido, como aníeriormeníe) o indirecíamenie capíurado a íravés de bioíinción de lisaío solubilizado de deíergeníe del recepíor IGF-I que sobre expresa células ufilizando el reacfivo PEO-maleimida-biotina (Pierce, Molecular Biosciences), el cual íiene afinidad purificada uíilizando un aníicuerpo de cadena beía IGF-I del aníi-recepíor inmovilizado con perlas de NHS-agarosa y se eluyó con 2-4 M de urea en regulador de pH coníeniendo deíergeníe NP-40 y se dializó en PBS. La determinación Kd para el enlace del aníicuerpo EM164 con el receptor IGF-I bioíeñido se llevó a cabo cubriendo placas de Immulon-2HB con 100 µl de 1 µg/ml de esírepíavidina en regulador de pH de carbonaío (150 mM de carbonaío de sodio, 350 mM de bicarbonaío de sodio) a 4°C duraníe la noche. Las cavidades cubiertas con esírepíavidina se bloquearon con 200 gl de regulador de pH de bloqueo ((10 mg/ml de BSA en regulador de pH TBS-T), se lavaron con regulador de pH TBS-T y se incubaron con el recepíor IGF-I bioíeñido (10 a 100 ng) duraníe 4 horas a íemperaíura ambieníe. Las cavidades coníeniendo el recepíor IGF-I bioíeñido ¡ndirecíamenie capíurado después se lavaron y se incubaron con el aníicuerpo EM164 en regulador de pH de bloqueo a varias conceníraciones (5.1x10'13 M a 200 nM) duraníe 2 horas temperaíura ambiente y después se incubaron duraníe la noche a 4°C. Las cavidades después se lavaron con regulador pH TBS-T y se incubaron con conjugado de peroxidasa de rábano picante del aníicuerpo L + aníí-raíón de cabra (100 I; 0.5 µg/ml en regulador de pH de bloque ), seguido por lavados y la detección uíilizando el susíraío ABTS/H202 a 405 nm. El valor de Kd se esíimó a íravés de regresión no lineal para un siíio de enlace.

Se realizó una titulación de enlace similar utilizando el fragmento Fab del aníicuerpo EM164, preparado a íravés de la digesíión de papaina del anticuerpo como se describió a través de E. Harlow y D. Lañe ("Using Aníibodies: A Laboraíory Manual"; 1999, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, New York). La curva de íiíulación de enlace para el enlace del aníicuerpo EM164 al recepíor IGF-I humano bioíeñido produjo un valor Kd de 0.1 nM (Figura 2). El fragmento Fab del aníicuerpo EM164 íambién se enlazó al recepíor IGF-I humano muy esírechameníe con un valor Kd de 0.3 nM, lo que indicó que el enlace monomérico del aníicuerpo EM164 al recepíor IGF-I íambién fue muy fuerte. Esíe valor exíremadameníe bajo de la consíaníe de disociación para el enlace del recepíor IGF-I a íravés del anticuerpo EM164 fue en parte debido a una velocidad koff muy lenta como se verificó a través de las fuertes señales de enlace observadas después de lavados prolongados de 1-2 días del enlace del aniicuerpo a recepíor IGF-I inmovilizado. El aníicuerpo EM164 se puede uíilizar para la inmunoprecipiíación del recepíor IGF-I, como se demosíró a íravés de la incubación del lisaío solubilizado de deíergeníe de células MCF-7 de cáncer de pecho humano con el aniicuerpo EM164 inmovilizado en perlas de G-agarosa de proíeína (Pierce Chemical Company). Se detectó una tinción Western del anticuerpo EM164 immunoprecipiíado ufilizando un aníicuerpo (Sania Cruz Biotechnology) de la cadena beta (C-término ) de IGF-I del aníi-receptor policlonal de conejo y un conjugado de peroxidasa de rábano picante del anticuerpo IgG de anti-ratón de cabra, seguido por lavados y detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL). La tinción Western del inmunoprecipitado EM164 de células MCF-7 exhibió bandas correspondientes a la cadena b eta d el receptor I GF-I a a Irededor d e 95 k Da y e I p ro-receptor IGF-I a alrededor de 220 kDa. Se realizó una inmunoprecipitación similar para los oíros íipos de célula para verificar la especificidad de las especies del enlace al aníicuerpo EM164, que iambién se enlazó al recepíor IGF-I de células cos-7 células (mono verde Africano), pero no se enlazó al recepíor IGF-I de células 3T3 (raíón), células CHO (hámster chino) o células de fibroblasto de cabra (cabra. El aníicuerpo EM164 no detectó al recepíor IGF-I humano desnaíuralizado SDS en las íinciones Western de lisaíos d e células MCF-7, que indicaron que se enlazó a un epííopo adapíable del recepíor IGF-I humano no desnaíuralizado. El dominio de enlace del aníicuerpo EM164 además se caracterizó utilizando una construcción de cadena alfa íruncada, que comprende el dominio rico en cisterna flanqueado por los dominios L1 y L2 (residuos 1-468) fusionados con la pieza del íérmino C 16-mer( residuos 704-719) y que se terminó a íravés de la eíiqueía del epítopo del íérmino C. Esíe recepíor IGF-I más pequeño, que íiene residuos ausentes 469-703, ha sido reportado que se enlaza a IGF-I, aunque esíá menos esírechameníe comparado con el recepíor IGF-lde longiíud compleía naíivo (Molina, L. y oíros, 2000, FEBS Letters, 467,226-230; Krisíensen, C . y oíros, 1 999, J B iol. C hem., 274, 37251-37356). D e esía forma, una consírucción de cadena alfa del recepíor IGF-I íruncado se preparó comprendiendo los residuos 1-468 fusionados a la pieza del término C que es los residuos 704-719 y flanqueados a íravés de la eíiqueía del epííopo myc del íérmino O Se consíruyó una línea de células esíable que expresó esía consírucción, y que íambién expresa la consírucción temporalmente en células 293T de riñon embriónico humanas. Un fuerte enlace del aníicuerpo EM164 a esía consírucción de cadena alfa del recepíor IGF-I íruncado se observó. De los dos anficuerpos observados, IR3 (Calbiochem) también se enlazó a la cadena alfa íruncada, pero el aníicuerpo 1H7 (Sania Cruz Biotechnology) no se enlazó, lo que indica que el epítopo del aníicuerpo EM164 fue claramente distinto de aquel del anticuerpo 1 H7.

C. Inhibición del enlace de IGF-I a células MCF-7 a través del anticuerpo EM164 El enlace de IGF-I a células MCF-7 de cáncer de pecho se inhibió a través del anticuerpo EM164 (Figura 3). Las células MCF-7 se incubaron con o sin 5 µl/ml del anticuerpo EM164 durante 2 horas en medio libre de suero, seguido por incubación con 50 ng/ml de IGF-I bioteñido durante 20 minutos a 37°C. Las células después se lavaron dos veces con medio libre de suero para remover la biotina-IGF-l no enlazada, y después se lisaron en 50 mM de HEPES, pH de 7.4, coníeniendo 1 % de NP-40 e inhibidores de proteasa. Una placa ELISA de lmmulon-2HB se cubrió con un aníicuerpo de la cadena beía del aníi-recepíor IGF-I y se uíilizó para capíurar el recepíor IGF-I y el enlace de bioíina-IGF-1 del lisaío. El enlace del aníicuerpo cubierto al dominio C-íermina citoplásmico de la cadena beta del recepíor IGF-I no interfiere con el enlace de bioíina-IGF-I para el dominio exíracelular del recepíor IGF-I. La cavidades se lavaron, se incubaron con conjugado de esírepfavidina-peroxidasa de rábano picante, se volvieron a lavar y después se deíecíaron uíilizando el susíraío ABTS/H202. La inhibición del enlace IGF-I a células MCF-7 a íravés de 5 µg/ml del aníicuerpo EM164 fue esencialmente cuaníiíaíivo, y fue casi equivalente con aquel del antecedente de E LISA obtenido uíilizando conírol carente de bioíina-IGF-I. Además del ensayo descriío anteriormeníe para la inhibición del enlace de IGF-I a células MCF-7 a íravés del aníicuerpo EM164, el siguiente ensayo demosíró que el aníicuerpo EM164 fue alíameníe efecíivo en el desplazamiento del enlace IGF-I de células MCF-7, según deseado bajo condiciones fisiológicas para un aníicuerpo IGF-I del aníi-recepíor aníagonísíico para desplazar el ligando fisiológico endógeno del enlace (íales como IGF-I o IGF-II). En esíe ensayo de desplazamiento IGF-I, las células MCF-7 que crecieron en una placa de 12 cavidades se privaron de suero y después se incubaron con IGF-I bioteñido (20-50 ng/ml) en medio libre de suero a 37°C (o a 4°C) durante 1 a 2 horas. Las células con el IGF-I bioteñido enlazado después se traíaron con el aníicuerpo EM164 o un aníicuerpo de conírol (10-100 µg/ml) a 37°C (o a 4°C) duranfe 30 minuto a 4 horas. Las células después se lavaron con PBS y se lisaron en regulador de pH de lisis conteniendo 1 % de NP-40 a 4°C. ELISA se llevó a cabo como se describió anteriormeníe para capturar el receptor IGF-I del lisaío y después deíecíar el enlace IGF-I bioíeñido para el recepíor uíilizando el conjugado de esírepíavidina-peroxidasa de rábano picante. Esíe ELISA demosíró que el aníicuerpo EM164 fue capaz de desplazar IGF-I bioíeñido pre-enlazados de desplazamiento de células casi compleías (90% en 30 minuíos y 100% en 4 horas) a 37°C y a alrededor de 50% en 2 horas a 4°C. En oíro experimento, las células de cáncer de pulmón NCI-H838 se incubaron con biotina-IGF-l, después se lavaron y se incubaron con el anticuerpo EM164 a 4°C durante 2 horas, que dio como resultado un 80% de disminución en el enlace bioíina-IGF-l. Por consiguiente, el aníicuerpo EM164 fue alíamente efecíivo en el desplazamiento de IGF-I pre-enlazado de células de cáncer, que podría ser importante íerapéuíicameníe para el aníagonismo del recepíor IGF-I a íravés del desplazamiento del ligando fisiológico endógeno de enlace. La incubación de células MCF-7 con el aníicuerpo EM164 a 4°C duraníe 2 horas (o a 37°C duraníe 30 minuíos) no dio como resulíado una regulación descendiente significaíiva del receptor IGF-I con base en el a nálisis d e tinción Western uíilizando e l aníicuerpo de cadena b eía I GF-I d el a níi-recepfor ( Sania C ruz B ioíechnology; p p-713), aunque una incubación más larga con el anticuerpo EM164 a 37°C durante 2 horas dio como resulíado una regulación hacia debajo de 25% del recepíor IGF-I. Por consiguiente, la inhibición de enlace de IGF-I y el desplazamiento del enlace IGF-I a íravés del anficuerpo EM164 a ambas 4°C y 37°C en esíos experimentos a corto tiempo puede no explicarse a través de la regulación descendiente del receptor debido al en lace del anticuerpo EM164. El mecanismo para la potenfe inhibición del enlace de IGF-l al receptor IGF-I y para el desplazamiento del IGF-I de pre-enlace a través del anticuerpo EM164 probablemente será la competencia para el enlace, ya sea a través de la compartición del sitio de enlace o a través de oclusión estérica o través de efectos alsotéricos.

D. I nhibición d é l a s eñalización d e c élula m ediada p or e I r eceptor IGF-I a través del anticuerpo EM164 El tratamiento de células MCF-7 de cáncer de pecho y células SaOS-2 de osteosarcoma con el anticuerpo EM164 casi completamente inhiben la señalización del receptor IGF-I intracelular, como se muestra a íravés de la inhibición de la auíofosforilación del recepíor IGF-I y a íravés de la inhibición de la fosforilación de sus efectos corriente abajo íales como e I s usiraio-1-del recepíor d e i nsulina ( IRS-1), Akí y Erkl/2 (Figuras 4-6). En la Figura 4, las células MCF-7 se hicieron crecer en una placa de 12 cavidades en un medio regular duraníe 3 días, y después se íraíaron con 20 µg/ml del aníicuerpo EM164 (o aníicuerpo de conírol aníi-B4) en medio libre de suero durante 3 horas, seguido por la estimulación con 50 ng/ml ÍGF-I durante 20 minutos a 37°C. Las células después se l isaron e n regulador d e p H d e l isis h elado conteniendo inhibidores de proteasa y fosfaíasa (50 mM se regulador de pH de HEPESr, pH 7.4, 1 % de NP-40, 1 mM de ortovanadaío de sodio, 100 mM de fluoruro de sodio, 10 mM de pirofosfaío de sodio, 2.5 mM de EDTA, 10 µM de leupepíina, 5 µM de pepsíaíina, 1 mM de PMSF, 5 mM de benzamidina, y 5 µg/ml de aproíinina). Una placa de ELISA se pre-cubrió con el aníicuerpo TC123 monoclonal del íérmino C de la cadena beía del aníi-receptor IGF-I y se incubó con muestras de lisato durante 5 horas a temperaíura ambieníe para capíurar el recepíor IGF-I. Las cavidades conteniendo el recepíor IGF-I capíurado después se lavaron e incubaron con el aníicuerpo aníi-fosfoíirosina bioíeñido (PY20; 0.25 µg/ml; BD Transducíion Laboratories) duraníe 30 minuíos, seguido por lavados e incubación con conjugado de esírepíavidina-peroxidasa de rábano picante, (0. 8 µg/ml) duraníe 30 minuíos. Las cavidades se lavaron y se deíecfaron con susíraío ABTS/H202. el uso de un aníicuerpo aníi-B4 de conírol no mosíró inhibición de la auíofosforilación esíimulada por IGF-I del receptor IGF-I. En conirasíe, se obíuvo una compleía inhibición de la auíofosforilación esíimulada de IGF-K del recepíor IGF-I sobre el íraíamiento con el aníicuerpo EM164 (Figura 4). Para demosírar la inhibición de la fosforilación del susíraío-1 del recepíor de insulina subsíraío-1 (IRS-1), se uíilizó un ELISA uíilizando el aníicuerpo aníi-IRS-1 inmovilizado para capíurar IRS-1 de lisaíos, seguido por la medición de la subunidad p85 asociada de fosfaíidilinosiíol-3-cinasa (PI-3-cinasa) que se enlaza al IRS-1 fosforilado (Jackson, J. G. y oíros, 1998, J. Biol. Chem., 273, 9994-10003). En la Figura 5, las células MCF-7 se traíaron con 5 µg/ml del aníicuerpo (EM164 o IR3) en el medio libre de suero duraníe 2 horas, seguido por esíimulación con 50 ng/ml de IGF-I duraníe 10 minuíos a 37°C. El aníicuerpo aníi-IRS-1 (policlonal de conejo; Upsíaíe Bioíechnology) se capíuró indirecíameníe a íravés de incubación con anficuerpo IgG de aníi-conejo de cabra cubierto en una placa ELISA, el cual después se uíilizó para capíurar IRS-1 de las muesíras de lisaío de célula a fravés de incubación durante la noche a 4°C. Las cavidades después se incubaron con anticuerpo PI-3-cinasa anti-p85 monoclonal de raíón (Upsíate Bioíechnology) durante 4 horas, seguido por el tratamiento con conjugado del anticuerpo HRP de IgG de anti-ratón de cabra durante 30 minuíos. Las cavidades después se lavaron y se detecíaron uíilizando el susíraío ABTS/H202 (Figura 5). Como se mosíró en la figura .5, ei aníicuerpo EM164 fue más efecíivo en la inhibición de la fosforilación de IRS-1 esíimulado por IGF-I que el anficuerpo IR3, y el aníicuerpo EM164 no mostró ninguna acíividad agonística en la fosforilación IRS-1 cuando se incubó con células en la ausencia de IGF-I. La activación de otros producíores de corriente hacia abajo, tales como Akt y Erkl/2, íambién se inhibió en una forma dependieníe de dosis a íravés del aníicuerpo EM164 en células SaOS-2 (Figura 6) y en células MCF-7, como9 se muesíra uíilizando unciones Western de lisatos y los aníicuerpos específicos de fosforilación (el aníicuerpo policlonal Akí anfi-fosfo-Ser473 de conejo y aníicuerpos aníi-fosfo-ERK1/2; Tecnología de Señalización de Daíos). Un aníicuerpo pan-ERK demosíró cargas de proíeína iguales en iodos los carriles (Figura 6). El íratamienío de células SaOS-2 con el aníicuerpo EM164 no inhibió la fosforilación esíimulada por EGF de Erkl/2, de esíá forma demosírando la especificidad de la inhibición de la írayecíoria de señalización del recepíor IGF-I a íravés del aníicuerpo EM164.

E. Inhibición de IGF-I, IGF-II y crecimiento estimulado por suero y supervivencia de células de tumor humanas a través del anticuerpo EM164 Varias líneas de células de íumor humanas se probaron en condiciones libres de suero para su crecimienío y respuesía de supervivencia a IGF-I. Esías líneas de célula se íraíaron con el aníicuerpo EM164 en la presencia de IGF-I, IGF-II, o suero y su crecimienío y respuesías de supervivencia se midieron uíilizando un ensayo MTT después de 2-4 días. Aproximadameníe 1500 células se colocaron en placas en una placa de 96 cavidades en medio regular con suero, el cual se reemplazó con medio libre de suero al día siguiente (ya sea medio RPMI libre de suero suplemeníado con íransferina y BSA, o medio libre de fenol rojo como se especifica por Dufourny, B. y oíros, 1997, J. Biol. Chem., 272, 31163-31171 ). Después de un día de crecimienío en medio libre de suero, las células se incubaron con a proximadameníe 75 µl d e 1 0 µl/ m l d e a nticuerpo durante 30 minuíos. Tres horas después de la adición de 23 I solución de IGF-I (o IGF-II o suero) para obíener una conceníración final de 10 ug/ml de IGF-I, o 20 ug/ml de IGF-II, o 0.04-10% de suero. En algunos experimentos, las células se estimularon primero con IGF-I durante 15 minutos antes de la adición del anticuerpo EM164, o ambos el IGF-I y el anticuerpo EM164 se agregaron juntos. Las células después se dejaron crecer duraníe oíros 2-3 días. Después se agregó una solución de MTT bromuro de (3-(4,5)-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilíeírazolio; 25 µl de una solución de 5 mg/ml en PBS) y las células se regresaron al incubador duraníe 2-3 horas. El medio después se removió y se reemplazó medianíe 100 µl de DMSO, se mezcló y la absorbancia de la placa se midió a 545 nm. Varias líneas de células de íumor humanas mosíraron un crecimiento y una respuesía de supervivencia una vez la adición de IGF-I o IGF-11 o suero que significativamente se inhibió a través del anticuerpo EM164, independientemente de que el aníicuerpo se agregó aníes del IGF-I, o si IGF-I se agregó aníes del aníicuerpo, o su ambos IGF-I y el anficuerpo se agregaron juntos (Cuadro 1).

CUADRO 1 Inhibición del crecimiento estimulado por IGF-I y supervivencia de células de tumor a través del anticuerpo EM164 3 Ensayo MTT de 3-4 días de crecimiento/supervivencia de células en respuesfa a 10 ng/ml de IGF-I en medio libre de suero conteniendo 5-10 µg/ml de anticuerpo EM164. b Inhibición del crecimienío de células en 1.25-10% de suero en la presencia de 5-10 µg/ml del aníicuerpo EM164 a íravés del ensayo MTT o formación de colonia con base en la comparación con el conírol (con suero pero sin aníicuerpo); la extensión de la inhibición fue cuantiíativameníe medida para células MCF-7, NCI-H838, SK-N-SH con base en coníroles (sin suero pero con aníicuerpo, y con suero pero sin aníicuerpo) para coníar la esíimulación IGF auíocrina/paracrina a íravés de las células. ND indica no daíos o grupos de daíos debido a las dificulíades de la íinción. El aníicuerpo EM164 fuertemente inhibió el crecimienío y supervivencia esíimulados por IGF-I o suero de células MCF-7 de cáncer de pecho (Figuras 7 y 8). En un experimento separado, el aníicuerpo EM164 fuertemente inhibió fuertemente inhibió el crecimienío y supervivencia de células MCF-7. Los reportes previos uíilizando aníicuerpos comercialmeníe disponibles íales como el anficuerpo IR3 mosíraron una inhibición débil del crecimienío y supervivencia esíimulados por suero de células MCF-7 células, según confirmado en la Figura 7 para los anticuerpos IR3 y 1 H7 (Cuiten, K. J. y otros , 1990, Cáncer Res., 50,48-53). En coníraste, el aníicuerpo EM164 fue un inhibidor potente de crecimiento estimulado por suero o IGF de células MCF-7. Como se muesíra en la Figura 8, el aníicuerpo EM164 fue igualmente efecfivo en la inhibición del crecimiento y supervivencia de células MCF-7 sobre un amplio rango de conceníraciones de suero (0.04-10% suero). La inhibición del crecimienío de células MCF-7 a íravés del aníicuerpo EM164 se midió coníando las células. De esía forma, en una placa de 12 cavidades, alrededor de 7500 células se colocaron en placas en medio RPMI con 10% FBS, en la presencia o ausencia de 10 µg/ml de anticuerpo EM164. Después de cinco días de crecimiento, el coníeo de células para la muesíra de conírol n o íraíada fue d e 20.5 x 1 04 células, e n conírasíe con el coníeo de células de solamente 1.7 x 104 células para la muesíra íraíada con el aníicuerpo EM164. El íraíamienío con el aníicuerpo EM164 inhibió el crecimienío de células MCF-7 a fravés de alrededor 12 veces en 5 días. Esfa inhibición a íravés del aníicuerpo EM164 fue significaíivamente mayor que el que se reportó con una inhibición de 2.5 veces u tilizando e I a níicuerpo I R3 e n u n e nsayo d e 6 d ías para células MCF-7 (Rohlik, Q. T. y oíros , 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun., 149,276-281). El crecimienío y supervivencia esíimulados por IGF-I y suero de una línea de células no pequeñas de cáncer de pulmón NCI-H838 íambién fueron fuertemente inhibidos a íravés del anficuerpo EM164, comparado con un anticuerpo anti-B4 de control (Figura 9). El trafamiento con el anticuerpo EM164 en medio libre de suero produjo una señal más pequeña que la muestra no íratada para ambos NCI-H838 y células MCF-7, presumiblemente debido a que el anticuerpo EM 164 también inhibió la estimulación IGF-I e IGF-II autocrina y paracrina de esías células (Figuras 7 y 9). En íamaño de la colonia de células de cáncer de colon HT29 fambién fue enormemente reducida después del traíamiento con el anticuerpo EM164. El anticuerpo EM164 por consiguiente es único entre todos los anticuerpos del anti-recepíor IGF-I conocidos que son efectivos para inhibir el crecimiento estimulado por suero de células de íumor tales como células MCF-7 y células NCI-H838 a través de más de 80%. El anticuerpo E M164 causó e l a rresto d el crecimiento d e las células e n la fase GO/G1 del siglo de la célula y derogó el efecto mitogénico de IGF-I. Para el análisis del siglo de la célula, las células MCF-7 se traíaron con IGF-I (20 ng/ml) en la presencia o ausencia de EM164 (20 µg/ml) durante 1 día y después se analizaron a través de la íinción de yoduro de propidio y ciíometría de flujo. Como se muestra en la Figura 25, el ciclo de las células en respuesta al estimulación IGF-I en la ausencia de EM164 (con 41% de células en la fase S y 50% en la fase GO/G1) se suprimió con células trafadas con EM164 (con solameníe 9% en la fase S y 77% de las células en la fase GO/G1). Además de su inhibición de proliferación de célula, el fraíamienío del anticuerpo EM164 dio como resultado la apoptosis de las células. Para la medición de apoptosis, la división de la proteína CK18 de citoqueraíina a través de caspasa se midió en células de cáncer de pulmón NC1-H838 incubadas con IGF-I o suero en la presencia o ausencia de EM164 durante 1 día (Figura 26). En la ausencia de EM164, la adición de IGF-I o suero dio como resultado una señal CK18 dividida de caspasa comparada con el control no de IGF-I, indicando que IGF-I y el suero previenen la activación de caspasa. El traíamiento con EM164 suprimió los efectos anti-apoptóíicos de IGF-I y suero, como se indica a través de los niveles de CK18 más grandes separados obtenidos en la presencia de EM164 que en la ausencia de EM164 (Figura 26).

F. Inhibición sinergística a través del anticuerpo EM164 de crecimiento y supervivencia de células de tumor humanas en combinaciones con otros agentes citotóxicos o citostáticos. La administración combinada del anticuerpo EM164 con íaxol fue significativamente más inhibidor que el crecimiento y supervivencia de células no pequeñas de cáncer de pulmón, células Calu6 que con el taxol solo. Similarmente, la combinación del anticuerpo EM164 con camptotecina fue significativamente más inhibidor que la camptotecina sola hacia el crecimiento y supervivencia de células HT29 de cáncer de colon. Debido a que anticuerpo EM164 solo no se espera que sea un tóxico para las células como fármacos quimioíóxicos orgánicos, el sinergismo entre el efecto predominantemente c itostático d el a nticuerpo E M 64 y e l efecto c itotóxico d el fármaco quimioíóxico puede ser altamente eficaz en combinación con terapias de cáncer en configuraciones clínicas. El efecto combinado del anticuerpo EM164 con un anticuerpo del receptor anti-EGF (KS77) fue significaíivameníe más inhibidor que cualquier aníicuerpo EM164 o aníicuerpo KS77 s olo e n e l crecimienío y s upervivencia d e varías l íneas d e células de íumor íales como células HT-3, células RD, células MCF-7, y células A431. Por consiguiente, el efecío sinergísíico de combinar aníicuerpos neuíralizaníes para dos recepíores del facíor de crecimienío íales como recepíor IGF-I y recepíor EGF íambién puede ser útil en el tratamienío de cáncer clínico. Con b ase e n l a eficacia d el a níicuerpo EM164 como un ageníe individual en la inhibición de la proliferación y supervivencia de líneas de célula de cáncer humano diversas como se muesíra en el Cuadro 1 , los esíudios de eficacia adicionales se llevaron a cabo uíilizando combinaciones el a níicuerpo E M164 con oíros agentes íerapéuíicos anti-cáncer. En estos esíudios sobre líneas de células de cáncer diversas, el frafamienío combinado del aníicuerpo EM164 y oíros agenfes terapéuticos anti-cáncer dieron como resultado una eficacia más pareja aníi-cáncer que con ya sea EM164 o el oíro ageníe terapéutico solo. Estas combinaciones de EM164 con otros agentes terapéuíicos por consiguiente son alíameníe efecíivos en la inhibición de la proliferación y supervivencia de células de cáncer. Los ageníes íerapéuíicos que se pueden combinar con EM164 para la eficacia aníi-cáncer mejorada incluyen diversos ageníes uíilizados en la prácíica oncológica (Referencia: Cáncer, Principies & Pracíice of Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S. , Rosenberg, S. A., 6a edición, Lippincotí-Raven, Philadelphia, 2001), íales como doceíaxel, paclitaxel, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, trasíuzumab (Hercepíina), capeciíabina, íamoxifen, íoremifen, leírozol, anasírozol, fulvesíraní, exemesíano, goserelina, oxaliplaíina, carboplaíina, cisplaíina, dexameíasona, anfida, bevacizumab (Avasfina), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinotecan, etoposida, topoíecan, gemciíabina, vinorelbina, esíramusíina, mifoxanírona, abarelix, zoledronaía, esírepíozocina, rifuximab (Riíuxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, imatinib, citarabina, ibritumomab (Zevalin), íosiíumomab (Bexxar), iníerferón alfa-2b, melfalam, bortezomib (Velcade), alírefamina, asparaginasa, gefiíinib (Iressa), erloniíib (Tarceva), aníicuerpo del receptor aníi-EGF (Ceíuximab, Abx-EGF), epoíilonas, y conjugados de fármacos ciíoíóxicos y aníicuerpos coníra los receptores de la superficie de célula. Para esas terapias de combinación, EM164 se combinó con uno o más ageníes aníi-cáncer de diversos mecanismos de acción tales como agentes de alquilación, ageníes de plaíino, terapias hormonales, aníimeíaboliíos, inhibidores de topoisomerasa, agentes antimicrofúbulo, agentes de diferenciación, antiangiogénicos o terapias antivascularización, terapia de radiación, agonistas y antagonistas de la hormona de liberación de hormona leutinizante (LHRH) o hormona de liberación de gonadotropina (GnRH), anticuerpos inhibidores o inhibidores de molécula pequeña contra receptores de superficie de célula, y otros quimioageníes íerapéuíicos (Referencia: Cáncer, Principies & Pracfice of Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6a edición, Lippincotí- Raven, Philadelphia, 2001). En un ejemplo, la combinación de una antida del antagonista LHRH (0.1 a 10 micromolares) y el anticuerpo EM164 (0.1 a 10 nanomolares) inhibieron la proliferación de células de cáncer de pecho MCF-7 significativamente más de aquellas con ya sea EM164 o antida sola. En un ejemplo de una terapia de combinación con un agente de platino, el traíamienío combinado con el aníicuerpo EM164 (10 microgramos/ml) y cisplatina (0.1-60 microgramos/ml) dio como resultado una inhibición mayor de la proliferación y supervivencia de células d e cáncer d e p echo M CF-7 e n l a comparación con la inhibición a través de ya sea el anticuerpo EM164 o cisplatina sola. Estas combinaciones de anticuerpo EM164 con oíros agentes terapéuticos son efectivas contra varios tipos de cánceres incluyendo pecho, pulmón, colon, próstata, pancreático, cervical, ovárico, melanoma, mieloma múltiple, neuroblastoma, rhabdomiosarcoma y osteosarcoma. El anticuerpo EM164 y el agente terapéuíico se pueden adminisírar para íerapia de cáncer ya sea simulfáneamenfe o en secuencia. Los conjugados del anticuerpo EM164 con fármacos citotóxicos también son valiosos en la distribución activada de fármacos citotóxicos para los tumores que sobre expresan el receptor IGF-I. Los conjugados del anticuerpo EM164 con radiomarcadores u otros marcadores se pueden utilizar en el íraíamienío y formación de imágenes de íumores que sobre expresan el recepíor IGF-I.

G. Efecto del tratamiento EM164, como un solo agente o en combinación con agentes anti-cáncer, en xenoinjertos de cáncer humano en ratones inmunodeficientes. Los xenoinjeríos de células de cáncer no pequeñas de pulmón se esíablecieron en ratones inmunodeficienies a través de inyecciones subcutáneas de células Calu-6 de 1 x 107. Como se muesíra en la Figura 10, esíos raíones coníeniendo 100 mm3 de xenoinjertos Calu-6 esíablecidos se íraíaron con el aníicuerpo EM 164 solo (6 inyecciones de 0.8 mg/raíón, i. v., dos por semana) o con íaxol solo (cinco inyecciones de íaxol, i.p. cada dos días; 15 mg/kg), o una combinación de íraíamieníos de íaxol y aníicuerpo EM164, o PBS solo (200, ul/raíón, 6 inyecciones, dos veces por semana, i. v.) uíilizando cinco raíones por grupo de íraíamienío. El crecimienío de los íumores significaíivameníe se desacelero a íravés del íraíamienío con el aníicuerpo EM164 comparado con el conírol de PBS. No se observó toxicidad del aníicuerpo EM164, con base en las mediciones de los pesos de los raíones. Aunque el íraíamienío con íaxol solo fue efecíivo hasía el día 14, el íumor entonces inicio a crecer ofra vez. Sin embargo, el crecimienío del íumor se reírasó significaíivameníe en el grupo que se íraíó con una combinación de íaxol y aníicuerpo EM164, comparado con el grupo que se írató con taxol solo. Los xenoinjertos pancreáíicos de cáncer humano se esíablecieron en ratones SCID/ICR de 5 semanas de edad (Taconic) a íravés de inyecciones subcuíáneas de 107 B x PC-3 células en PBS (día 0). Los raíones que llevan íumores esíablecidos de 80 mm3 se íraíaron con EM164 sólo (13 inyecciones de 0.8 mg/rafón, i.v., de la vena de la cola lateral, en los días 12, 16, 19, 23, 26, 29, 36, 43, 50, 54, 58, 61 y 64), con gemciíabina sola (dos inyecciones de 150 mg/kg/raíón, i.p., en los días 12 y 19), con una combinación de gemciíabina y EM164 siguiendo los horarios aníeriores, PBS solo, y un aníicuerpo de conírol solo (siguiendo el mismo horario que EM164) uíilizando cinco raíones macho en cada uno de los cinco grupos de írafamiento. Como se muesíra en la figura 27, el íraíamienío con EM164 solo, o en combinación con gemciíabina, dio como resulíado ¡nicialmente una regresión íoíal de xenoinjertos de fumor en 4 de los 5 animales en el grupo d e í raíamienfo E M164 y e n todos los 5 a nimales e n e l g rupo d e traíamienío de combinación. El recrecimiento del íumor medible solamente se vio en más de un animal en el día 43 en el grupo EM164 y en el día 68 en el grupo de traíamiento de combinación, dando como resulíado volúmenes de íumor promedio significafivameníe menores en el día 74 en comparación con los íraíamieníos de conírol (P = 0.029 y 0.002, respectivamente; dos prueba T con cola; (Figura 27). En oíro esíudio, el íraíamienío del aníicuerpo EM164 (solo o en combinación con un aníicuerpo del recepíor aníi-EGF; inyecciones iníraperiíoneales) inhibió el crecimienío de xenoinjertos BxPC-3 esíablecidos en rafones. Los anticuerpos EM164 de murino y EM164 humanizados mostraron una inhibición equivalente del crecimiento de xenoinjertos BxPC-3 establecidos en ratones, de esía manera demosírando que la potencia de EM164 humanizado es equivalente a aquella de EM164 de murino in vivo. En una comparación de los difereníes modos de adminisíración del aníicuerpo EM164, ambas adminisíraciones iníraperiíoneal e iníravenosa del aníicuerpo EM164 mosíraron una inhibición equivalente del crecimienío de xenoinjertos BxPC-3 esíablecidos en raíones. En oíro esíudio de xenoinjerío, el íraíamienío con el aníicuerpo EM164 mosíró un reíraso en el crecimiento significaíivo de xenoinjertos de rhabdomiosacroma humano A-673/sarcoma de Ewing en raíones.

H. Clonación y secuenciación de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo EM164 El ARN íoíal se purificó de células de hibridoma EM164. Las reacciones de íranscripíaza se llevaron a cabo uíilizando 4-5 µg de ARN íoíal y ya sea oligo dT o iniciadores de hexámero aleatorios. Las reacciones PCR se llevaron a cabo uíilizando un méíodo RACE descrito en Co y oíros (J. lmmunol., 148, 1149-1154 (1992)) y ufilizando iniciadores degenerados como se describe en Wang y oíros, (J. Immunol. Meíhods, 233,167-177 (2000)). El méíodo PCR RACE requirió de un paso intermedio para agregar una cola poli G en los extremos 3' de los ADNcs de la primera cepa. Las reacciones RT se purificaron con columnas Qianeasy (Qiagen) y se eluyeron en 50 µl 1 X regulador de pH NEB 4. Se realizó una reacción de cola dG en el eluato con 0.25 mM de CoCI2, 1 mM de dGTP, y 5 unidades de íransferasa íerminal (NEB), en 1 x regulador de pH NEB 4. La mezcla se incubó a 37°C duraníe 30 minuíos y después se agregó 1/5 de la reacción (10 µl) direcíamente a una reacción PCR para servir como el ADN de plantilla. Las reacciones RACE y PCR degenerado fueron idénticas excepío por las diferencias en los iniciadores y la plantilla. La reacción de íransferasa terminal se utilizó directamente de la plantilla de PCR RACE, mientras la mezcla de reacción RT se utilizó directamente para reacciones PCR degeneradas. En ambas reacciones RACE y PCR degenerada se utilizaron los mismos iniciadores de cadena ligera 3': HindKL-tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagítggtgc (SEC ID NO: 14) y el iniciador de cadena pesada 3': Bgl2lgG1-ggaagatcíatagacagaígggggtgtcgítítggc (SEC ID NO: 15) were used. En la PCR RACE, se uíilizó un iniciador poli 5' para ambas cadenas, ligera y pesada: EcoPolyC-TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC (SEC ID NO: 16), mieníras los iniciadores PCR del exíremo 5' degenerados fueron: SacIMK-GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEC ID NO: 17) para la cadena ligera, y una mezcla igual de: EcoR1 MH1-CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEC ID NO: 18) y EcoR1 MH2-CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEC ID NO: 19) para la cadena pesada. En las secuencias del iniciador anteriores, las bases mezcladas se definieron como sigue: H=A+T+C, S=g+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+g, W=A+T, V = A+C+G.

Las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando el siguiente programa: 1) 94°C 3 minuíos, 2) 94°C 15 segundos, 3) 45°C 1 minuío, 4) 72°C 2 minuíos, 5) ciclo de regreso al paso #2 29 veces, 6) terminar con un paso de extensión final a 72°C por 10 minuíos. Los producios PCR se clonaron en pBluescripí II SK+ (Síraíagene) utilizando enzimas de restricción creadas por los iniciadores PCR. Se secuenciaron varios clones de cadena ligera y cadena pesada individuales a través de medios convencionales para identificar y evitar los errores de secuencia generados por polimerasa posibles (Figuras 12 y 13). Al utilizar las definiciones de clasificación canónica, los íres CDRs de cadena pesada y de cadena ligera se identificaron (Figuras 12-14). Una investigación de la base de daíos lgBlasí de NCBl indicó que la región variable de cadena ligera del aníicuerpo del aníi-receptor IGF-I probablemente se derivó del gen de la línea de germen IgVk Crl de ratón mientras que la región variable de cadena pesada probablemente se derivó del gen de la línea de germen IgVh J558 (Figura 15). La secuenciación de la proíeína del aníicuerpo EM164 de murino se realizó para confirmar l as s ecuencias m osíradas e n l as F iguras 1 2 y 13. Las bandas de la cadena ligera y pesada del aníicuerpo EM164 purificado se íransfirieron a una membrana PVDF de un gel (SDS-PAGE, condiciones de reducción), removido de la membrana PVDF y analizado a íravés de secuenciación de proíeína. La secuencia N-terminal de la cadena ligera se deíerminó a íravés de secuenciación Edman para ser: DVLMTQTPLS (SEC ID NO: 20), la cual coincide con la secuencia N-íerminal del gen de cadena ligera clonado obtenido del hibridoma EM164. El N-íérmino de cadena pesada se enconfró como estando bloqueado por la secuenciación del N-término Edman. Un fragmenío de péptido de digestión tríptico de la cadena pesada de masa 1129.5 (M+H+, monoisotópico) se fragmentó a íravés del debiliíamienío posí-fueníe (PSD) y su secuencia se deíerminó como siendo GRPDYYGSSK (SEC ID NO: 21). Oíro fragmenío de péptido de digestión írípíico de la cadena pesada de masa 2664. 2 (M+H+, monoisoíópico) íambién se fragmentó a íravés del debiliíamienío posí-fueníe (PSD) y su secuencia se identificó como: SSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFAR (SEC ID NO: 22). Ambas de estas secuencias coinciden perfectamente con aquella de CDR3 y la estrucíura 3 (FR3) del gen de cadena pesada clonado obtenido del hibridoma EM164.

I. Expresión recombinante del anticuerpo EM164 Las secuencias emparejadas de cadena ligera y pesada se clonaron en un vecíor de expresión de mamífero individual (Figura 16). Los iniciadores de PCR de las secuencias variables humanas crearon los sitios de resíricción que permitieron que la secuencia de señal humana se enlazara mieníras en el vector de clonación pBluescriptli, y las secuencias variables se clonaron en un plásmido de expresión de mamífero utilizando los sitios EcoRI y BsiWI o Hindlll y Apal para la cadena ligera o cadena pesada, respectivamente (Figura 16). Las secuencias variables de cadena ligera se clonaron en marco sobre la región constaníe IgK humana y las secuencias variables de cadena ligera se clonaron en la secuencia de la región consíaníe Iggammal humana. En los plásmidos de expresión final, los promotores CMV humanos conducen la expresión de ambas secuencias de ADNc de cadena ligera y pesada. La expresión y purificación del aníicuerpo EM164 de raíón recombinaníe procedió de acuerdo con los métodos que son bien conocidos en la íécnica.

EJEMPLO 2 Versiones humanizadas del anticuerpo EM164 El recubrimiento del aníicuerpo EM164 para proveer la versión humanizada adecuada como agente terapéuíico o de diagnóstico adecuada generalmeníe continúa de acuerdo con los principios y métodos descriíos en la Paíeníe de los Esfados Unidos de Norteamérica No. 5,639,641 , y como sigue.

A. Predicción de la superficie La accesibilidad del solveníe de los residuos de la región variable para un grupo de aníicuerpos con esírucíuras resuelías se utilizó para pronosticar para la región variable de los residuos de superficie para el aníicuerpo IGF-I del aníi-recepíor de murino (EM164).

La accesibilidad del solvente del aminoácido para un grupo de 127 archivos de estrucíura del aníicuerpo único (Cuadro 2) se calcularon con el paqueíe de sofíware MC (Pedersen y otros, 1994, J. Mol. Biol., 235, 959-973). Las diez secuencias de cadena ligera y de cadena pesada más similares de aminoácidos de este grupo de 127 esírucíuras se determinaron a través de la alineación de secuencia. La accesibilidad del solvente promedio para cada residuo de la región variable se calculó y las posiciones con más de 30% de accesibilidad promedio se consideraron como residuos de superficie. Las posiciones con accesibilidades promedio de entre 25% y 35% además se examinaron a través del cálculo de la accesibilidad del residuo individual para solameníe aquellas esírucíuras con dos residuos de flanqueo idénticos.

CUADRO 2 127 Estructuras de anticuerpo de la base de datos Brookhaven utilizadas para pronosticar la superficie del anticuerpo del receptor antí-IGF-l (EM 64) 127 arch vos de estructura Brookhaven utilizados para predicciones de superficie 2rcs 3hfl 3hfm 1aif 1a3r 1bbj 43c9 4fab 6fab 7fab 2gfb 2h1 p 2hfl 1a6t 1axt 1bog 2hrp 2jel 2mcp 2pcp 1yuh 2bvf 2cgr dfab 1ae6 1 vl 2dbl 2f19 2fb4 2fbj 1sm3 1tet 1 fa glb2 1a4j 1cly 1vge 1yec 1yed 1yee 1ncd 1 nfd 1ngp 1acy 1afv 1cbv 1nid 1nma 1nmb 1nqb 1 mcp 1mfb 1 mim 15c8 1a5f 1axs 1 mlb 1mpa 1nbv 1ncb 1jrh 1kb5 1kel 1ap2 1b2w 1adq 1kip 1k¡r 1jel Imam ligi 1 hil 1 yx 1a0q 1bjm 1clo 1iai 1¡bg 1igc 1igf 1gpo 1 hil 1 hyx 1a0q 1 bjm 1clo 1ia¡ 1ibg 1igc 1 ¡.qf 1fpt 1frg 1fvc 1aqk 1b¡n 1d5b 1gaf igg¡ 1ghf ig¡g 1fal 1fb¡ 1fdl 1ad9 1bbd 1f58 ifgv if¡g 1fir 1for 1dbl 1dfb 1a3l 1bfo 1eap 1dsf 1dvf B. Modelado Molecular: Un modelo molecular de EM164 de murino se generó uíilizando el paqueíe de sofíware Oxford Molecular Abm. La esíructura del anticuerpo se construyó a partir de los archivos de estrucíura para los aníicuerpos con la secuencia de aminoácidos más similar, que fueron 2jel para la cadena ligera y Inqb para la cadena pesada. Los CDRs no canónicos se consfruyeron a través de la investigación de una base de daíos de esírucíura C-a coníeniendo esírucíuras resuelías no redundantes. Se determinaron los residuos que se siíúan en 5 de una CDR.

C. Selección de Ab Humano Las posiciones de la superficie de EM164 de murino se compararon con las posiciones correspondientes en secuencias de aníicuerpo humanas en la base de daíos Kabaí (Johnson, G. y Wu, T. T. (2001) Nucleic Acids Research, 29: 205-206). El sofíware SER para la adminisíración de la base de daíos del aníicuerpo (Searle 1998) se utilizó para exíraer y alinear los residuos de superficie del aníicuerpo de pares de anficuerpo humanos de cadena ligera y pesada nafurales. La superficie del anticuerpo humano con los residuos de superficie más idénticos, dando una consideración especial a las posiciones que caen deníro de 5 de una CDR, se seleccionaron para reemplazar los residuos de superficie del aníicuerpo IGF-I del anti-receptor de murino.

D. Mutagénesis PCR La mutagénesis PCR se llevó a cabo sobre el clon de ADNc EM164 de murino (anterior) para consíruir el EM164 de murino recubierto (aquí huEM164). Los grupos de iniciadores se diseñaron para hacer los cambios de 8 aminoácidos requeridos para todas las versiones probadas de huEM164, y los iniciadores adicionales se diseñaron para alternativamente hacer los dos cambios de 5 aminoácidos (Cuadro 3). Las reacciones PCR se realizaron con el siguiente programa: 1) 94°C 1 minuto, 2) 94°C 15 segundos, 3) 55°C 1 minuío, 4) 72°C 1 minuío, 5) ciclo de regreso al paso #2, 29 veces, 6) terminar con un paso de extensión final a 72°C por 4 minuíos. Los producios de PCR se digirieron con sus enzimas de resíricción correspondientes y se clonaron en los vectores de clonación pBluescripí como se describió anteriormeníe. Los clones se secuenciaron para confirmar los cambios de aminoácido deseados.

CUADRO 3 Iniciadores PCR para construir 4 anticuerpos EM164 humanizados E. Residuos de superficie de región variable Las técnicas de recubrimiento del aníicuerpo descrifas por Pedersen y oíros (J. Mol. Biol., 235, 959-973, 1994) y Roguska y oíros (Proíein Eng., 9, 895-904, 1996) empezaron pronosticando los residuos de superficie de las secuencias variables del aníicuerpo de murino. Un residuo de superficie se definió como un aminoácidos que íiene al menos 30% de su área de superficie íoíal accesible a una molécula de agua. Los 10 aníicuerpos más homólogos en el grupo de 127 archivos de esírucíura de anticuerpo se identificaron (Figuras 17 y 18). La accesibilidad del solvente para cada posición Kabat se promedió par esías secuencias alineadas y la disfribución de las accesibilidades relativas para cada residuo fueron como se muesíra en la Figura 19.

Tanto la cadena ligera como pesada íienen 26 residuos con accesibilidades relativas promedio de al menos 30% (Figura 19): esíos residuos por consiguiente fueron residuos de superficie pronosíicados para EM164. Varios residuos íuvieron accesibilidades promedio de eníre 25% y 35%, y además se examinaron promediando solamente los aníicuerpos con dos residuos idénticos que flanquean cualquier lado del residuo (Cuadros 4 y 5). Después de este análisis adicional, el grupo original de residuos de superficie que se identificó anteriormente permaneció invariable. CUADRO 4 Residuos de superficie y accesibilidad promedio (acc. prom.) para las secuencias variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo EM164 Los residuos que tuvieron una accesibilidad promedio eníre 25% y 35% además se analizaron promediando un subgrupo de aníicuerpos que tuvieron dos residuos idénticos flanqueando cualquier lado del residuo en cuestión. Se dan esías posiciones de superficie de margen y su nueva accesibilidad promedio. Los Ñas se refieren a residuos sin residuos de flanqueo idénticos en los 10 aníicuerpos más similares.

F. Modelado Molecular para determinar que residuos caen dentro 5 de un CDR El modelo molecular aníerior, generado con el paqueíe de software AbM, se analizó para determinar que residuos de superficie EM164 estuvieron dentro de 5' de una CDR. Con el fin de recubrir el anticuerpo EM164 de murino, todos los residuos de superficie fuera de una CDR deberán cambiarse a la coníraparte humana, pero los residuos denf.ro de 5' de una CDR se íratan con especial cuidado debido a que íambién coníribuyen con l a especificidad d el a níígeno. P or consiguiente, esíos ú ltimos residuos deben identificarse y cuidadosameníe considerarse a lo largo del proceso de humanización. Las definiciones de CDR uíilizadas para recubrir de forma combinada la definición de AbM (Figura 14). El Cuadro 6 muesíra los residuos que esíán deníro de 5 de cualquier residuo CDR en y a s ea I a s ecuencia d e c adena i igera o p esada d el m odelo EM164.

CUADRO 6 Residuos de superficie de la estructura del anticuerpo EM164 en 5' de una CDR Residuos de Superficie EM164 en 5Á de una CDR G. Identificación de las superficies humanas más homologas Las superficies de aníicuerpo humanas candidato para recubrir EM164 se identificaron en la base de datos Kabat de secuencia del anticuerpo utilizando software SR, que proveyó la investigación de solamente las posiciones del residuo especificadas coníra la base de daíos del anticuerpo. Para conservar los emparejamientos naturales, los residuos de superficie de ambas cadenas ligera y pesada se compararon juntos. Las superficies humanas más homologas de la base de datos Kabaí se alinearon en un orden de rangos de identidad de secuencia. Las 5 superficies superiores se dan el Cuadro 7. Esías superficies después se compararon para identificar cuál de ellas requiere al menos cambios en 5' de una CDR. El aníicuerpo de la célula B leucémico, CLL 1.69, requirió el menor número de cambios de residuo de superficie (10 en loíal) y solameníe dos de estos residuos esíuvo en 5' de una CDR. La secuencia de región variable de longifud complete para CUADRO 7 Las 5 secuencias humanas principales de la base de datos Kabat Las alineaciones se generaron a íravés de SR (Pedersen 1993). Los residuos de superficie EM164 que llegan a 5' de una CDR esfán subrayados.

H. Construcción de genes EM164 humanizados. Los diez cambios de residuos de superficie para EM164 (Cuadro 7) se hicieron uíilizando técnicas de muíagénesis PCR como se describió aníeriormeníe. Debido a que los ocho residuos de superficie para CLL 1.69 no esíuvieron en 5' de una CDR, estos residuos se cambiaron de murino a humano en todas las versiones de EM164 humanizado (Cuadros 8 y 9). Los dos residuos de superficie de cadena ligera que esíuvieron en 5' de una CDR (posiciones 3 y 45 en Kabaí) fueron ya sea cambiados a humanos o se reíuvieron como de murino. Junías, esías opciones general las cuaíro versiones humanizadas de EM164 que fueron consíruidas (Figuras 22 y 23). De las cuafro versiones humanizadas, la versión 1.0 íiene todas los 10 residuos de superficie humanos. La versión más conservadora con respecío a los cambios en la proximidad de la CDR es la versión 1.1 , que reíuvo ambos residuos de superficie de murino que esíuvieron en 5' de una CDR. Los cuaíro genes EM164 del anticuerpo humano se clonaron en un plásmido de expresión del anticuerpo (Figura 16) para uso en transfecciones temporales y esíables.

CUADRO 8 Cambios en los residuos para las versiones 1.0-1.3 del anticuerpo EM164 humanizado I. Comparación de las afinidades de las versiones del anticuerpo EM164 con el anticuerpo EM164 de murino para el enlace de la cadena del receptor IGF-I de longitud completa y de la cadena alfa del receptor IGF-I truncado Las afinidades de las versiones 1.0-1.3 del anticuerpo EM164 humanizado se compararon con aquellas del anticuerpo EM164 humanizado a íravés de los ensayos de competencia de enlace uíilizando el recepíor IGF-I humano de longiíud compleía bioíeñido y la cadena alfa del receptor IGF-I íruncado marcado como epííopo myc, como se describió aníeriormeníe. Las muesíras del aníicuerpo EM164 humanizado se obíuvieron a íravés de la íransfección temporal de los vecíores de expresión apropiados en las células 293T de riñon embriónico humano, y las conceníraciones el aníicuerpo se determinaron a íravés d e E LISA utilizando esfándares del aníicuerpo humanizado purificado. Para las mediciones de competencia de enlace ELISA, las mezclas de las muesíras del aníicuerpo y varias conceníraciones del anficuerpo EM164 de murino se incubaron con la cadena alfa del recepíor IGF-I de longiíud compleía bioíeñido indirecíameníe capíurado o del receptor IGF-I del receptor truncado marcado como epítopo myc. Después del equilibrio, el anticuerpo humanizado enlazado se detectó uíilizando un conjugado de peroxidasa d e rábano picante, del aníicuerpo Fab'2 anti-humano de cabra. Las gráficas de ([Ab de murino enlazado]/ [Ab humanizado enlazado]) coníra ([Ab de murino]/[Ab humanizado]), que teóricamente produjeron una línea recia con un declive = (Kd Ab umanizado K Ab m-pno). se utilizaron para determinar las afinidades relativas de los anticuerpos humanizados y de murino. Un ensayo de competencia ilusíraíivo se muesíra en la Figura 11. Se cubrió una placa ELISA lmmulon-2HB con 100 µl de 5 µg/ml de esírepíavidina por cavidad en regulador de pH de carbonato a temperatura ambiente duraníe 7 horas. La cavidades cubiertas con estrepíavidina se bloquearon con 200 µl de regulador de pH de bloqueo (10 mg/ml de BSA en regulador de TBS-T) duraníe 1 horas, se lavó con regulador de pH TBS-T y se incubó con el recepíor IGF-I bioíeñido (5 ng por cavidad) duraníe la noche a 4°C. Las cavidades conteniendo el recepíor IGF-I bioíeñido indirecíameníe capturado después se lavaron e incubaron con mezclas de anticuerpo humanizado EM164 (15.5 ng) y aníicuerpo de murino (0 ng, o 16.35 ng, o 32.7 ng, o 65.4 ng, o 163.5 ng) en 100 µl de regulador de pH de bloque durante 2 horas a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 4°C. Las cavidades después se lavaron con regulador de pH TBS-T y se incubaron con conjugado de peroxidasa de rábano picante del anticuerpo Fab'2 anti-humano de cabra duraníe 1 hora (100 µl; 1 µg/ml en regulador de pH de bloqueo), seguido por lavados y detección uíilizando el susíraío ABTS/H202 a 405 nm. La gráfica de ([Ab de murino enlazado]/ [Ab humanizado enlazado]) coníra ([Ab de murino]/[Ab h umanizado]) produjo una línea recia (r2 = 0.996) con un declive = (K Ab humanizado Kd Ab urino) de 0.52. La versión 1.0 el aníicuerpo humanizado por consiguiente se enlazó al receptor IGF-I más fuertemente que el anticuerpo EM164 de murino. Se obtuvieron valores similares para el gradiente, en la escala de alrededor de 0.5 a 0.8, para las competiciones de las versiones 1.0, 1.1 , 1.2 y 1.3 de los anticuerpos EM164 humanizados con la cadena alfa el anticuerpo EM164 de murino para el enlace con el receptor IGF-I de longitud completa o el receptor IGF-I truncado, lo que indica que todas las versiones humanizadas del anticuerpo EM164 íienen afinidades similares, las cuales todas fueron mejores que las del aníicuerpo EM164 de murino padre. Una versión quimérica del aníicuerpo EM164 con la muíación 92F?C en la cadena pesada mosíró un declive de alrededor de 3 en una competencia de enlace similar con el aníicuerpo EM164 de murino, lo que indica que el muíante 92F?C de EM164 íuvo una afinidad menor en íres veces que el aníicuerpo EM164 de murino para el enlace con el recepíor IGF-I. El aníicuerpo EM164 humanizado v1.9 mosíró una inhibición similar de crecimienío y supervivencia of células MCF-7 estimuladas por IGF-I como lo hizo el aníicuerpo EM164 (Figura 24). La inhibición del crecimienío y supervivencia of células MCF-7 estimuladas con suero fue similar a la inhibición del aníicuerpo EM164 humanizado.

CUADRO 9 El sistema de numeración Kabaí se uíilizó para los polipéptidos de la región variable de cadena ligera y pesada de las difereníes versiones del EM164 Ab. Los residuos de aminoácido se agruparon en la Esíruclura (FR) y Las Regiones de Determinación de Complemeníariedad (CDR) de acuerdo con la posición en la cadena del polipépíido. Tomado de Kabaí y oíros Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinía Edición, 1991 , NIH Publicaíion No. 91-3242 J. Proceso para proveer anticuerpos del receptor anti-IGF-l mejorador partiendo de las secuencias del anticuerpo de murino y humanizado descritas aquí: Las secuencias de aminoácido y ácido nucleico del anticuerpo EM164 del a nti- receptor IGF-I y sus variantes humanizadas se utilizaron para desarrollar oíros aníicuerpos que íienen propiedades mejoradas y que íambién esíán deníro del alcance de la preseníe invención. Dichas propiedades mejoradas incluyen una afinidad incremeníada para el receptor IGF-I. Varios estudios han examinado los efecíos de la iníroducción de uno o más cambios en el aminoácido en varias posiciones en la secuencia de un anticuerpo, con base en el conocimiento de la secuencia del anticuerpo primaria, en sus propiedades tales como enlace y nivel de expresión (Yang, W. P. y oíros, 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403; Rader, C. y oíros, 1998, Proc. Nati. Acad. Scí. USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. y oíros, 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539). En estos esíudios, las variantes del anficuerpo primario han sido generados a íravés de los cambios de secuencias de los genes de cadena pesada y ligera en CDR1 , CDR2, CDR3, o regiones de esíructura, utilizando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleófido, mutagénesis de cásete, PCR propenso a I error, organización de ADN, o cepas de E. coli del mutador (Vaughan, T. J. y oíros, 1998, Naíure Bioíechnology, 16,535-539; Adey, N. B. y oíros , 1996, Capííulo 16, pp. 277-291, en "Phage Display of Peptides y Proteins", Eds. Kay, B. K. y otros, Academic Press).

Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han resultado, a través del uso de técnicas de clasificación estándares, en afinidades mejoradas de dichos anticuerpos secundarios (Gram, H. y otros, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. y otros, 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97, 10701-10705; Davies,. J. y Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. y otros, 1996, J. Mol.

Biol., 256,77-88; Short, M. K. y otros, 2002, J. Biol. Chem., 277, 16365-16370; Furukawa, K. y otros, 2001 , J. Biol. Chem., 276, 27622-27628). A través de una esírategia dirigida similar de cambiar uno o más residuos de aminoácido del aníicuerpo, las secuencias del anticuerpo descritas en esta invención se pueden utilizar para desarrollar anticuerpos del recepíor aníi-IGF-l con funciones mejoradas, tales como anticuerpos que tienen grupos adecuados tales como grupos libres de amino o tioles en los puntos de enlace convenientes para la modificación covalente para uso, por ejemplo, en el enlace de los agentes terapéuticos.

K. Sistema de expresión alternativo para anticuerpos de murino, quiméricos y otros anticuerpos del anti-receptor IGF-I. El anticuerpo IGF-I del anti-receptor de murino también se expresó a partir de plásmidos de expresión de mamíferos similares a aquellos utilizados para expresar el anticuerpo humanizado (anterior). Los plásmidos de expresión se sabe que íienen regiones consfaníes de murino que incluyen las secuencias de la cadena ligera kappa y la cadena pesada gama-1 (McLean y oíros, 2000, Mol Immunol., 37, 837-845). Estos plásmidos se diseñaron para aceptar cualquier región variable de aníicuerpo, íales como por ejemplo el aníicuerpo IGF-I del aníi-recepíor de murino, a íravés de digesíión y clonación de resfricción simple. El PCR adicional del anticuerpo del receptor anti-IGF-l usualmente fue requerido para crear la resíricción con aquellos en el plásmido de expresión. Un méíodo alíernaíivo para expresar el aníicuerpo IGF-I del aníi-recepíor de murino compleío fue reemplazar las regiones consíaníes humanas en el plásmido de expresión del anticuerpo IGF-I del anti-recepíor quimérico. El plásmido de expresión quimérico (Figura 1 6) se consíruyó uíilizando casetos d e las regiones variables y para ambas regiones consíaníes de cadena ligera y pesada. Justo cuando las secuencias variables del aníicuerpo fueron clonadas en este plásmido de expresión a íravés de las digesíiones de resíricción, las digesíiones de resíricción separadas se utilizaron para clonarse en cualquier secuencia de la región consíaníe. Los ADNsc de cadena ligera kappa y pesada gama-1 se clonaron, por ejemplo, a partir del ARN del hibridoma de murino, íales como los ARN descrifos aquí para la clonación de las regiones variables del aníicuerpo aníi-IGF-l. Similarmente, los iniciadores adecuados se diseñaron a partir de las secuencias disponibles en la base de daíos Rabaí (ver Cuadro 10). Por ejemplo, se uíilizó RT-PCR para clonar las secuencias de la región consíaníe y para crear los sitios de resíricción necesarios para clonar estos fragmeníos en el plásmido de expresión del anticuerpo IGF-I del anti-receptor quimérico. Este plásmido entonces se utilizó para expresar el anticuerpo IGF-I del anti-receptor de murino completo en sistemas de expresión de mamífero estándares tales como la línea de células CHO.

CUADRO 10 Iniciadores diseñados para clonar la región constante qama-1 de murino y la región constante kappa respectivamente Los iniciadores se diseñaron a partir de las secuencias disponibles en la base de daíos Rabaí ((Johnson, G y Wu, T. T. (2001) Nucleic Acids Research, 29: 205-206).

CONSTANCIA DE DEPOSITO El hibridoma que forma el anticuerpo EM164 de murino se depositó con la Colección del Cultivo de Tipo Americano, Apartado Posíal 1549, Manassas, VA 20108, el 14 de junio del 2002, bajo los Términos del Traíado de Budapesí y asignado con el número de regisíro ATCC PTA-4457. Ciertas patentes y publicaciones impresas han sido referidas en la presente descripción, las enseñanzas de las cuales se incorporan aquí en su toíalidad respectiva por referencia. En íanío que se ha descriío en deíalle la invención con referencia a modalidades específicas, será evidente para alguien con experiencia en la técnica que se pueden hacer varios cambios y modificaciones en ésta sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims (31)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende: (a) un primer agente terapéutico, en donde dicho primer agente terapéutico es un anticuerpo o un fragmento que se enlaza al epítopo del mismo, y en donde dicho anticuerpo o dicho anticuerpo específicamente se enlaza al recepíor del facíor I de crecimienío de íipo insulina, seleccionado del grupo que consiste de: (i) un anticuerpo, o fragmento de enlace de epítopo del mismo, que íiene la misma secuencia de aminoácido que el aníicuerpo EM164 de murino producido a íravés del hibridoma de raíón EM164 (número de regisíro ATCC PTA-4457), (ii) un anticuerpo recubierto, o fragmento d e e nlace d e p éptido d el m ismo, q ue tiene la misma especificidad de enlace que el anticuerpo EM164 de murino, (¡ii) un anticuerpo humano o humanizado, o fragmento de enlace de epítopo del mismo, que tiene la misma especificidad de enlace que el anticuerpo EM164 de murino, (iv) un equivalente funcional de un anticuerpo, o fragmento de enlace de epííopo del mismo, que fiene la misma especificidad de enlace que el anticuerpo EM164 de murino, (v) una variante del anticuerpo EM164 de murino, o fragmento de enlace de epítopo del mismo, que tiene por lo menos una mutación, eliminación o inserción del nucleótido comparado con el aníicuerpo EM164 de murino, y que tiene la misma especificidad de enlace que el anticuerpo EM164 de murino, y (vi) el anticuerpo EM164 de murino producido por el hibridoma EM164 de ratón (número de regisíro ATCC PTA-4457), o fragmenío de enlace de epítopo del mismo, y (b) un segundo agente terapéutico.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho segundo ageníe terapéuíico se selecciona del grupo que consiste de docetaxel, paclitaxel, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, trastuzumab (Herceptina), capecitabina, tamoxifen, toremifen, letrozol, anastrozol, fulvesíraní, exemesían, goserelina, oxaliplaíina, carboplaíina, cisplatina, dexameíasona, aníida, bevacizumab (Avasíina), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinofecan, eíoposida, íopoíecan, gemciíabina, vinorelbina, esíramusíina, mitoxantrona, abarelix, zoledronate, estrepíozocina, riíuximab (Riíuxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, imaíinib, ciíarabina, ibriíumomab (Zevalina), tosiiumomab (Bexxar), iníerferón alfa-2b, melfalam, boríezomib (Velcade), alíretamina, asparaginasa, gefiíinib (Iressa), erloniíib (Tarceva), el aníicuerpo del recepíor aníi-EGF (Ceíuximab, Abx-EGF), y una epoíílona.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho segundo ageníe íerapéuíico se selecciona del grupo que consiste de carboplaíina, oxaliplaíina, cisplaíina, pacliíaxel, doceíaxel, gemciíabina, y campíoíecina.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizada porque dicho primer agente terapéuíico se adminisíra al paciente a una dosis de aproximadameníe 1 mg/meíro cuadrado a aproximadameníe 2000 mg/meíro cuadrado, y en donde dicho segundo ageníe íerapéuíico se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/metro cuadrado a aproximadameníe 2000 mg/meíro cuadrado.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizada porque dicho primer ageníe íerapéuíico se adminisfra al pacieníe a una dosis de aproximadameníe 10 mg/meíro cuadrado a aproximadameníe 1000 mg/meíro cuadrado, y en donde dicho segundo agente terapéutico se adminisíra a una dosis de aproximadameníe 50 mg/mefro cuadrado a aproximadameníe 1000 mg/meíro cuadrado.

6. Una composición farmacéutica que comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1 , y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición que comprende: (a) un primer agente terapéutico, en donde dicho primer agente íerapéuíico es un aníicuerpo o fragmenío de aníicuerpo que comprende al menos una región para la determinación de la complemenfariedad que íiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consisíe de: SYWMH (SEC ID NO: 1), EINPSNGRTNYNEKFKR (SEC ID NO: 2), GRPDYYGSSKWYFDV (SEC ID NO: 3), RSSQSIVHSNVNTYLE (SEC ID NO: 4), KVSNRFS (SEC ID NO: 5), y FQGSHVPPT (SEC ID NO: 6), y (b) un segundo ageníe íerapéuíico.

8. Una composición que comprende: (a) un primer ageníe íerapéuíico, en donde dicho primer agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde dicha región variable de cadena pesada comprende tres regiones para la determinación de la complemeníariedad que tienen una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NOS: 1-3, respectivamente: SYWMH (SEC ID NO: 1), EINPSNGRTNYNEKFKR (SEC ID NO: 2), GRPDYYGSSKWYFDV (SEC ID NO: 3); y en donde dicha en donde dicha región variable de cadena ligera comprende tres regiones para la determinación de la complementariedad secuencial que íienen la secuencia de aminoácidos represente por SEC ID NOS: 4-6, respectivamente: RSSQSIVHSNVNTYLE (SEC ID NO: 4), KVSNRFS (SEC ID NO: 5), FQGSHVPPT (SEC ID NO: 6), y (b) un segundo ageníe íerapéuíico.

9. Una composición que comprende: (a) un primer ageníe terapéutico, en donde dicho primer ageníe íerapéuíico es un aníicuerpo o fragmenío del mismo en donde dicho aníicuerpo comprende a región variable de cadena pesada que íiene al menos 90% de ideníidad de secuencia a una secuencia de aminoácido represeníada por SEC ID NO : 7: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINP SNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSS KWYFDVWGAGTTVTVSS (SEC ID NO : 7), y (b) un segundo ageníe íerapéuíico.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracíerizada porque dicha región variable de cadena pesada fiene por lo menos 95% con dicha ideníidad de secuencia de aminoácido represenfada por SEC ID NO: 7.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque dicha región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido que está representada por SEC ID NO: 7.

12. Una composición que comprende: (a) un primer agente terapéutico, en donde dicho primer agente íerapéuíico es un aníicuerpo o fragmenfo del mismo en donde dicho aníicuerpo comprende una región variable de cadena ligera que fiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido representada por SEC ID NO: 8: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO: 8), y (b) un segundo agente terapéuíico.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracíerizada porque dicha región variable de cadena ligera íiene por lo menos 95% ideníidad de secuencia con dicha secuencia de aminoácido represeníada por SEC ID NO: 8.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque dicha región variable de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido que esfá representada por SEC ID NO: 8.

15. Una composición que comprende: (a) un primer agente terapéutico, en donde dicho primer agente terapéuíico es un aníicuerpo o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO: 9); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK R (SEC ID NO: 10); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO: 11 ); DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEC ID NO: 12), y b) un segundo agente terapéuíico.

16. Una composición que comprende: (a) un primer agente terapéuíico, en donde dicho primer ageníe ferapéuíico es un anticuerpo o fragmenío del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que íiene una secuencia represeníada por SEC ID NO: 13: QVQLVQSGAEWKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINP SNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYF DVWGQGTTVTVSS (SEC ID NO: 13), y (b) un segundo agente terapéuíico.

17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-16, caracíerizada porque dicho segundo agente terapéuíico se selecciona del grupo que consisíe de d ocetaxel, p aclitaxel, d oxorubicina, e pirubicina, ciclofosfamida, f rastuzumab (Hercepíina), capecitabina, tamoxifen, toremifen, letrozol, anastrozol, fulvestrant, exemestan, goserelina, oxaliplatina, carboplatina, cisplatina, dexametasona, antida, bevacizumab (Avastina), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinotecan, eíoposida, topoíecan, gemcitabina, vinorelbina, estramusfina, mitoxanírona, abarelix, zoledronate, esíreptozocina, riíuximab (Riíuxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, imaíinib, citarabina, ibritumomab (Zevalina), íositumomab (Bexxar), interferón alfa-2b, melfalam, bortezomib (Velcade), alfretamina, asparaginasa, gefitinib (Iressa), erlonitib (Tarceva), el aníicuerpo del recepíor anti-EGF (Ceíuximab, Abx-EGF), y una epoíilona.

18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-16, caracterizada porque dicho segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de carboplatina, oxaliplatina, cisplatina, paclitaxel, docetaxel, gemcitabina, y camptoíecina.

19. Un método para inhibir el crecimiento de una célula de cáncer que comprende poner en coníacto dicha célula Con la composición de conformidad con la reivindicación 1.

20. Un méíodo para íratar a un paciente que tiene un cáncer que comprende adminisírar a dicho paciente una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1.

21. Un método para íratar a un paciente que íiene un cáncer que comprende adminisírar a dicho pacieníe una caníidad efecíiva de la composición farmacéuíica de conformidad con la reivindicación 6.

22. El método de traíamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21 , caracterizado porque dicho cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de pecho, cáncer de colon, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstaía, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, melanoma, mieloma múltiple, neuroblastoma, y rhabdomiosarcoma.

23. Un equipo que comprende: (a) un primer agente terapéutico, en donde dicho primer agente terapéutico es un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácido que el anticuerpo EM164 de murino producido por el híbridoma de ratón EM164 (número de registro ATCC PTA-4457), o un fragmenío de enlace de epííopo del mismo, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento específicamente se enlaza al receptor del factor I de crecimiento de íipo insulina, (b) un segundo agente terapéutico, y (c) instrucciones para su uso

24. Un método para inhibir el crecimiento de una célula de cáncer que comprende poner en coníacto dicha célula con: (a) un primer agente íerapéuíico, en donde dicho primer ageníe terapéutico es un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácido que el aníicuerpo EM164 de murino producido por hibridoma de ratón EM164 (Número de regisíro ATCC PTA-4457), o un fragmenío de enlace de epííopo del mismo, en donde dicho aníicuerpo o dicho fragmenío específicamente se enlaza al recepíor del facto I de crecimiento de tipo insulina, y (b) un segundo agente terapéutico.

25. Un méíodo para íraíar a un pacieníe que íiene un cáncer que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efecíiva de: (a) un primer ageníe íerapéuíico, en donde dicho primer agenle terapéuíico es un aníicuerpo que íiene la misma secuencia de aminoácido que el aníicuerpo EM164 de murino producido por hibridoma de ratón EM164 (número de regisíro ATCC PTA-4457), o un fragmenío de enlace de epííopo del mismo, en donde dicha aníicuerpo o dicho fragmento específicamente se enlaza al receptor del factor I de crecimiento de tipo insulina, y (b) un segundo agente terapéutico.

26. El méíodo de conformidad con la reivindicación 24, caracíerizado porque dicha célula se pone en coníacío con dicho primer agente íerapéuíico y dicho segundo ageníe íerapéuíico concurrentemente.

27. El méíodo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque dicha célula se pone en coníacto con dicho primer agente terapéutico y dicho segundo agente terapéutico secuencialmeníe y en cualquier orden.

28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracíerizada porque dicho primer agente íerapéuíico y dicho segundo ageníe terapéutico se adminisíran concurrentemente.

29. El méíodo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque dicho primer ageníe terapéuíico y dicho segundo agente íerapéuíico se adminisíran secuenciaimeníe y en cualquier orden.

30. El método de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracíerizada porque dicho segundo ageníe íerapéuíico se selecciona del grupo que consisíe de doceíaxel, pacliíaxel, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, írasíuzumab (Hercepíina), capeciíabina, íamoxifen, íoremifen, leírozol, anasírozol, fulvesíraní, exemesfan, goserelina, oxaliplatina, carboplatina, cisplatina, dexameíasona, aníida, bevacizumab (Avastina), 5-fluorouracilo, leucovorin, levamisol, irinoíecan, eíoposida, íopoíecan, gemciíabina, vinorelbina, esíramusfina, miíoxanírona, abarelix, zoledronate, estrepíozocina, riíuximab (Riíuxan), idarubicina, busulfan, clorambucil, fludarabina, imaíinib, ciíarabina, ibriíumomab (Zevalina), íosiíumomab (Bexxar), iníerferón alfa-2b, melfalam, bortezomib (Velcade), alírefamina, asparaginasa, gefitinib (Iressa), erloniíib (Tarceva), el anticuerpo del receptor anti-EGF (Cetuximab, Abx-EGF), y una epotilona.

31. El méíodo de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracíerizada porque dicho segundo ageníe íerapéuíico se selecciona del grupo que consisíe de carboplatina, oxaliplatina, cisplatina, paclitaxel, docetaxel, gemcitabina, y camptotecina.