EA009807B1 - Антитело против igf-i-рецептора - Google Patents

Abstract

Антитела, гуманизированные антитела, имеющие перестроенную поверхность антитела, фрагменты антител, дериватизованные антитела и их конъюгаты с цитотоксическими агентами, которые специфически связываются с рецептором инсулинподобного фактора роста I и ингибируют его, противодействуют действиям IGF-I, IGF-II и сыворотки на рост и выживание опухолевых клеток и которые, по существу, лишены агонистической активности. Эти антитела и их фрагменты могут быть использованы необязательно вместе с другими терапевтическими агентами в лечении опухолей, которые экспрессируют повышенные уровни IGF-I-рецептора, таких как рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак легкого, рак яичника, синовиальная саркома, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, и эти дериватизованные антитела могут быть использованы в диагностике и визиографии опухолей, которые экспрессируют повышенные уровни IGF-I-рецептора.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к антителам, которые связываются с рецептором инсулин-подобного фактора-1 (ЮЕП-рецептором). Более конкретно, данное изобретение относится к антителам против ЮЕ-Ιрецептора, которые ингибируют клеточные функции ЮБ-1-рецептора. Еще более конкретно, данное изобретение относится к антителам против ЮЕ-1-рецептора, которые являются антагонистами эффектов 1СБ-1, ЮЕ-ΙΙ и сыворотки на рост и выживание опухолевых клеток и которые, по существу, лишены агонистической активности.

Данное изобретение относится также к фрагментам указанных антител, гуманизированным и переделанным версиям указанных антител, конъюгатам указанных антител, производным антител и их применениям в диагностических, исследовательских и терапевтических приложениях. Далее, данное изобретение относится к улучшенным антителам или их фрагментам, которые получены из вышеописанных антител и их фрагментов. В другом аспекте, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему эти антитела или их фрагменты, и к векторам, содержащим эти полинуклеотиды.

Уровень техники

Рецептор инсулин-подобного фактора-Ι (Ι СЕ-1-рецептор) является трансмембранным гетеротетрамерным белком, который имеет две внеклеточные альфа-цепи и две простирающиеся через мембрану бета-цепи в дисульфид-связанной конфигурации β-α-α-β. Связывание лигандов, которыми являются инсулин-подобный фактор роста I (ЮЕ-Ι) и инсулин-подобный фактор роста II (ЮЕ-ΙΙ), внеклеточным доменом 1СЕ-1-рецептора активирует его внутриклеточный тирозинкиназный домен, приводя к автофосфорилированию этого рецептора и фосфорилированию субстрата. ЮЕП-рецептор является гомологичным рецептору инсулина, имеющим высокое сходство последовательности 84% в тирозинкиназном домене бета-цепи и низкое сходство последовательности 48% в богатом цистеинами внеклеточном домене (И1исй., А. е! а1., 1986, ЕМВО, 5, 2503-2512; Ещйа-УатэдцсЫ, Υ. е! а1., 1986, 1. ΒΙοΙ. Сйет., 261, 1672716731; ЬеКойй, Ό. е! а1., 1995, Епбосппе Реу1е\\ъ. 16, 143-163). ЮЕ-Ерецептор и его лиганды (ЮЕ-Ι и ЮЕ-ΙΙ) играют важные роли в многочисленных физиологических процессах, в том числе в росте и развитии во время эмбриогенеза, метаболизме, клеточной пролиферации и дифференцировке клеток во взрослых людях (ЬеКойй, Ό., 2000, Епбосгшо1оду, 141, 1287-1288; ЬеКойй, Ό., 1997, Ыете Епд1апб 1. Меб., 336, 633-640).

ЮЕ-Ι и IСЕ-II функционируют как в качестве эндокринных гормонов в крови, где они преимущественно присутствуют в комплексах с ЮЕ-связывающими белками, так и в качестве паракринных и аутокринных факторов роста, которые продуцируются локально (Нцтйе1, К.Е., 1990, Еиг. 1. Вюсйет., 190, 445-462; СоЫск, ν.8. апб С1еттопз, Ό.Κ. 1993, Аппи. Кеу. Рйузю1. 55, 131-153).

Предполагалось, что ЮЕ-Ьрецептор участвует в стимуляции роста, трансформации и выживания опухолевых клеток (Вазегда, К. е! а1., 1997, Вюсйет. Вюрйиз. Ас!а, 1332, Е105-Е126; В1акез1еу, У.А. е! а1., 1997, 1оита1 ок Епбосгто1оду, 152, 339-344; Ка1еко, М., Кийег, ν.1., апб МШег, А.Э. 1990, Мо1. Се11. Вю1., 10, 464-473). Так, известно, что несколько типов опухолей экспрессируют более высокие, чем нормальные, уровни ЮЕП-рецептора, в том числе рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак яичника, синовиальная саркома и рак поджелудочной железы (Кйапб^а1а, Н.М. е! а1, 2000, Епбосппе Кеу1е^8, 21, 215-244; \Vе^пе^. Н. апб ЬеКойй, Ό., 1995, Абу. Сапсег Кез., 68, 183-223; Наррегк1е1б, Ь.С. е! а1., 1997, 1. Ра!йо1., 183, 412-417; Епег, 8. е! а1, 1999, Си!, 44, 704-708; уап Пат, Р.А. е! а1., 1994, 1. Сйп. Ра!йо1., 47, 914-919; Х1е, Υ. е! а1., 1999, Сапсег Кез., 59, 3588-3591; Вегдтапп, и. е! а1., 1995, Сапсег Кез., 55, 20072011). Ιπ νίϋΌ было обнаружено, что ЮЕ-Ι и IСЕ-II являются сильными митогенами для нескольких клеточных линий человека, таких как линии клеток рака легкого, рака молочной железы, рака ободочной кишки, остеосаркомы и рака шейки матки (Апкгарр, П.Р. апб Βеνаπ, Ό.Κ, 1993, Сапсег Кез., 53, 33993404; Си11еп, К.1., 1990, Сапсег Кез., 50, 48-53; Негтап!о, и., 2000, Се11 Сго\\1й & П1ккегеп!1а1юп, 11, 655664; Сио, Υ.8. е! а1., 1995, 1. Ат. Со11. 8игд., 181, 145-154; Карре1, С.С. е! а1., 1994, Сапсег Кез., 54, 28032807; 8!е11ег, М.А. е! а1, 1996, Сапсег Кез., 56, 1761-1765). Несколько из этих опухолей и линий опухолевых клеток также экспрессируют ЮЕ-Ι или ЮЕ-ΙΙ, которые могут стимулировать их рост аутокринным или паракринным образом Юшпп, К.А. е! а1., 1996, 1. Вю1. Сйет., 271, 11477-11483).

Эпидемиологические исследования показали корреляцию повышенного уровня в плазме ЮЕ-Ι (и более низкого уровня ЮЕ-связывающего белка-3) с увеличенным риском рака предстательной железы, рака ободочной кишки, рака легкого и рака молочной железы (Сйап, 1.М. е! а1., 1998, 8с1епсе, 279, 563566; №о1к, А. е! а1, 1998, 1. Ыаб. Сапсег Шз!., 90, 911-915; Ма, 1. е! а1, 1999, 1. Ыа!1. Сапсег ]пз!, 91, 620-625; Υϋ, Н. е! а1., 1999, 1. Ыаб. Сапсег йз!., 91, 151-156; Напкшзоп, 8.Е. е! а1., 1998, Ьапсе!, 351, 1393-1396). Стратегии понижения уровня ЮЕ-Ι в плазме или ингибирования функции ЮЕП-рецептора были предложены для предотвращения рака (νυ, Υ. е! а1., 2002, Сапсег Кез., 62, 1030-1035; Сптйегд, А апб Сойеп Р., 2000, 1. Се11. Рйузю1., 183, 1-9).

ЮЕП-рецептор защищает опухолевые клетки от апоптоза, вызываемого депривацией фактора роста, независимостью сцепления или обработкой цитотоксическими лекарственными средствами (ΝηνηπΌ, М. апб Вазегда, К., 2001, Епбосгшо1оду, 142, 1073-1081; Вазегда, К. е! а1., 1997, Вюсйет. Вюрйуз. Ас!а, 1332, Е105-Е126). Были идентифицированы мутационным анализом домены ЮЕб-рецептора, которые являются решающими для его митогенной, трансформирующей и антиапоптотической активностей.

- 1 009807

Например, остаток тирозина 1251 ЮЕ-1-рецептора был идентифицирован как критический для антиапоптотической и трансформирующей активностей, но не для его митогенной активности (О'Соппог, В. е! а1., 1997, Мо1. Се11. ΒίοΙ., 17, 427-435; Мшта, М. е! а1, 1995, 1. ΒίοΙ. СЕет. 270, 22639-22644). Внутриклеточный путь передачи сигнала активируемого лигандом ЮЕ-1-рецептора включает в себя фосфорилирование остатков тирозина субстратов рецептора инсулина (1В8-1 и 1В8-2), которые рекрутируют фосфатилинозитол-3-киназу (ΡΙ-3-киназу) к мембране. Мембраносвязанные фосфолипидные продукты ΡΙ-3киназы активирует серин/треонинкиназу Ак!, субстраты которой включают в себя про-апоптотический белок ΒΑΌ, который фосфорилируется до неактивного состояния (ЭаНа. З.В., Вгипе!, А. апб СгеепЬегд, М.Е., 1999, Сепек & Оеуе1ортеп!, 13, 2905-2927; Ки11к, 6., К11рре1, А. апб АеЬет, М.1., 1997, Мо1. Се11. Βίο1. 17, 1595-1606). Митогенная передача сигнала 1СЕ-1-рецептора в клетках МСЕ-7 рака молочной железы человека требует ΡΙ-3-киназы и является независимой от митоген-активируемой протеинкиназы, тогда как передача сигнала выживания в дифференцированных клетках РС12 крысиной феохромоцитомы требует как ΡΙ-3-киназы, так и путей передачи сигнала митоген-активируемой протеинкиназы (ΌιιГоигпу, В. е! а1., 1997, 1. Βώ! СЕет., 272, 31163-31171; Ρа^^^ζак, М., 3аШе1, А.В. апб ЬеВойЕ, Ό., 1997, 1. ΒΦΕ СЕет., 272, 154-161).

Было показано, что понижающая регуляция уровня 1СЕ-1-рецептора антисмысловыми стратегиями уменьшает онкогенность нескольких линий опухолевых клеток ш у1уо и ш уйто, таких как меланома, рак легкого, рак яичника, глиобластома, нейробластома и рабдомиосаркома (ВекшсоГГ, М. е! а1., 1994, Сапсег Век., 54, 4848-4850; Бее, С.-Т. е! а1, 1996, Сапсег Век., 56, 3038-3041; Ми11ег, М. е! а1., 1998, 1п!. 1. Сапсег, 77, 567-571; Тто_)ап, 1. е! а1., 1993, Зс1епсе, 259, 94-97; Ыи, X. е! а1., 1998, Сапсег Век., 58, 5432-5438; 3Еар1то, Ό.Ν. е! а1, 1994, 1. С1ш. 1пуек!., 94, 1235-1242). Подобным образом, было сообщено, что доминантный негативный мутант 1СЕ-1-рецептора уменьшает онкогенность ш у1уо и рост ш уйто трансформированных клеток Ва!-1, сверхэкспрессирующих 1СЕ-1-рецептор ^тадет, Ό. е! а1, 1994 Бгос. Νη11. Асаб. Зск ИЗА, 91, 2181-2185).

Опухолевые клетки, экспрессирующие антисмысловую в отношении 1СЕ-1-рецептора мРНК, подвергаются обширному апоптозу при инъецировании в животных в биодиффузионных камерах. Это наблюдение делает 1СЕ-1-рецептор привлекательной терапевтической мишенью на основе гипотезы, что опухолевые клетки являются более чувствительными, чем нормальные клетки, к апоптозу, вызываемому ингибированием 1СЕ-1-рецептора (ВекшсоГГ, М. е! а1., 1995, Сапсег Век., 55, 2463-2469; Βα^ι^α, В., 1995, Сапсег Век., 55, 249-252).

Другой стратегией ингибирования функции 1СЕ-1-рецептора в опухолевых клетках было использование антител против 1СЕ-1-рецептора, которые связываются с внеклеточным доменом 1СЕ-1-рецептора и ингибируют его активацию. Сообщалось о нескольких попытках разработки мышиных моноклональных антител против 1СЕ-1-рецептора, из которых два ингибиторных антитела, 1В3 и ΙΗ7, являются доступными и об их применении сообщалось в нескольких исследованиях по ЮЕП-рецептору.

Антитело ΙΒ3 было разработано с использованием частично очищенного плацентарного препарата рецептора инсулина для иммунизации мышей, которые образовывали антитело, ГВ1, которое было селективным в отношении связывания рецептора инсулина, и были получены два антитела, ΙΒ2 и ГВ3, которые показали преимущественную иммунопреципитацию ЮЕП-рецептора (рецептора соматометина-С), но только слабую иммунопреципитацию рецептора инсулина (Ки11, Е.С. е! а1., 1983, 1. ΒώΕ СЕет., 258, 6561-6566).

Антитело 1Н7 было получено иммунизацией мышей очищенным плацентарным препаратом Ι6Ε-Ιрецептора, которая давала ингибиторное антитело 1Н7, наряду с тремя стимуляторными антителами (Ь1, δ.-Ь. е! а1., 1993, Β^ΐκιιι. Β^οрЕук. Век. Соттип., 196, 92-98; Хюпд, Ь. е! а1., 1992 ΡΐΌα Να11. Асаб. 8ск ИЗА, 89, 5356-5360).

В другом сообщении панель мышиных моноклональных антител, специфических в отношении Ι6ΕΙ-рецептора человека, получали иммунизацией мышей трансфицированными клетками 3Т3, экспрессирующими высокие уровни ЮЕб-рецептора, которые были классифицированы на семь групп с использованием исследований конкурентного связывания и по их ингибированию или стимуляции связывания Ι6Ε-Ι с трансфицированными клетками 3Т3 (8оок, М.А. е! а1., 1992, 1. ΒώΕ СЕет., 267, 12955-12963).

Таким образом, хотя антитело ΙΒ3 является наиболее часто используемым ингибиторным антителом для исследований ЮЕП-рецептора ш уйто, оно имеет недостаток, заключающийся в том, что оно проявляет агонистическую активность в трансфицированных клетках 3Т3 и СНО, экспрессирующих Ι6ΕΙ-рецептор человека (Ка!о, Η. е! а1., 1993, 1. ΒώΕ СЕет., 268, 2655-2661; З^ек-БеАтк, С. апб Во!Е, В.А., 1990, Β^ΐκιη. Β^οрЕук. Век. Соттип., 171, 1244-1251). Подобным образом, среди этой панели антител, разработанной Зоок е! а1., большинство ингибиторных антител 24-57 и 24-60 также показали агонистические активности в трансфицированных клеток 3Т3 (Зоок, М.А. е! а1., 1992, 1. ΒώΕ СЕет., 267, 1295512963). Хотя сообщается, что антитело ΙΒ3 ингибирует связывание Ι6Ε-Ι (но не Ι6Ε-ΙΙ) с экспрессируемыми рецепторами в интактных клетках и после солюбилизации, было показано, что оно ингибирует способность Ι6Ε-Ι и Ι6Ε-ΙΙ стимулировать синтез ДНК в клетках ш уйто С. апб Во!Е, В.А.,

1990, Β^ΐκιιι. Β^οрЕук. Век. Соттип., 171, 1244-1251). Был сделан вывод на основании химерных конструкций инсулин-ЮЕП-рецептора, что связывающим эпитопом антитела !В3 является район 223-274

- 2 009807

ЮЕ-1-рецептора (СийаРкоп, Т.А. апб Ки!!ег, XV.!. 1990, 1. ΒίοΙ. Сбет., 265, 18663-18667; 8оок, М.А. е! а1., 1992, 1. Βίο1. Сбет., 267, 12955-12963).

Линию клеток рака молочной железы человека МСР-7 обычно используют в качестве модельной клеточной линии для демонстрации реакции роста ЮР-1 и ЮР-11 ίη νίίτο (ОиРоиту, В. е! а1., 1997, 1. Βίο1. Сбет., 272, 31163-31171). В клетках МСР-7 антитело 1К3 полностью блокирует стимулирующее действие экзогенно добавленного ЮР-1 и ЮР-ΙΙ в бессывороточных условиях на приблизительно 80%. Антитело ΙΚ3 также незначительно ингибирует (менее, чем на 25%) рост клеток МСР-7 в 10% сыворотке (Си11еп, К.1. е! а1., 1990, Сапсег Кек., 50, 48-53). Это слабое ингибирование стимулируемого сывороткой роста клеток МСР-7 антителом ΙΚ3 ш \'йго может быть связано с результатами исследования ш νίνΌ, в которых обработка антителом ΙΚ3 не ингибировала значимо рост ксенотрансплантата МСР-7 в голых мышах (Айеада, С.Ь. е! а1., 1989, 1. С1ш. 1^ек!., 84, 1418-1423).

Вследствие слабых агонистических активностей ΙΚ3 и других описанных антител и их неспособности значимо ингибировать рост опухолевых клеток, таких как клетки МСР-7, в более физиологических условиях стимуляции сывороткой (вместо стимуляции экзогенно добавленными ЮР-Ι или ЮР-ΙΙ в бессывороточных условиях) существует потребность в новых антителах против ЮРЛ-рецепторов, которые значимо ингибируют стимулируемый сывороткой рост опухолевых клеток, но которые сами по себе не обнаруживают значимой агонистической активности.

Сущность изобретения

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение антител, фрагментов антител и производных антител, которые специфически связываются с инсулин-подобным фактором роста Ι и ингибируют клеточную активность этого рецептора антагонистическим действием на этот рецептор, а также, по существу, лишены агонистической активности в отношении этого рецептора.

Таким образом, в первом варианте осуществления обеспечено мышиное антитело ЕМ164, которое полностью охарактеризовано здесь в отношении аминокислотных последовательностей вариабельных областей как его легкой цепи, так и его тяжелой цепи, кДНК-последовательностей генов для вариабельных областей легкой и тяжелой цепи, идентификации его СЭК (определяющих комплементарность районов), идентификации его поверхностных аминокислот и способов для его экспрессии в рекомбинантной форме.

Во втором варианте осуществления обеспечены имеющие перестроенную поверхность или гуманизированные версии антитела ЕМ164, где экспонированные на поверхности остатки этого антитела или его фрагментов заменены как в легкой, так и в тяжелой цепях для более близкого сходства с известными поверхностями антитела человека. Такие гуманизированные антитела могут иметь увеличенную полезность в сравнении с мышиным ЕМ164, в качестве терапевтических или диагностических агентов. Гуманизированные версии антитела ЕМ164 также полностью охарактеризованы здесь в отношении их соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей как легкой, так и тяжелой цепи, последовательностей генов для вариабельных областей легкой и тяжелой цепи, идентификации СЭК, идентификации их поверхностных аминокислот и раскрытия способов для их экспрессии в рекомбинантной форме.

В третьем варианте осуществления обеспечено антитело, которое способно ингибировать рост раковых клеток на более, чем приблизительно 80%, в присутствии стимулятора роста, такого как, например, сыворотка, инсулин-подобный фактор роста Ι и инсулин-подобный фактор роста ΙΙ.

В четвертом варианте осуществления обеспечено антитело или фрагмент антитела, имеющие тяжелую цепь, включающую в себя СЭК, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО N0:1-3, соответственно:

8ΥΑ.ΜΗ (8Ε9ΙΟΝΟ:1),

ΕΙΝΡ8ΝΟΚΤΝΥΝΕΚΡΚΚ (8Е0 ГО N0:2),

ΟΚΡΏΥΥΟδδΚλνΥΕΰν (8Еф ГО N0:3);

и имеющие легкую цепь, которая содержит СЭК, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО N0:4-6:

Κ8808ΐνΗ8ΝνΝΤΥΕΕ (8Е() ГО N0:4);

ΚνΞΝΚΕδ (8ЕрГОЖ):5);

ГРСЗНУРРТ (8Еф ГО N0:6).

В пятом варианте осуществления обеспечены антитела, имеющие тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:7:

ΟνφΕφΟδΟΑΕΕνΚΡΟΑδνΚΕδΟΚΑβΟΥΤΕΤΞΥΑ'ΜΗΑΎΚφΚΡΟφΩΕΕλΊΟΕΙ ΝΡ8ΝσΚΤΝΥΗΕΚΓΚΚΚΑΤΕΤνθΚ888ΤΑΥΜ()Ε88ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΥΓΑΚ<3ΚΡΟΥ Υ688ΚΨΥΕΈ)νΐνθΑΟΤΤντν88 (8Еф ГО N0:7)

Сходным образом, обеспечены антитела, имеющие легкую цепь, которая имеет аминокислотную

- 3 009807 последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕО ГО N0:8:

ОУЬМТ0ТРЬ8ЕРУ8ЕСО0А818СК88081УН81Ф/НТ¥ЬЕ^УЕ0КРО08РКШУ КУ8ККР8ОУРОКР8С8ОЗОТСРТЕК18Е.УЕАЕОЕС1УУСР0О8НУРРТРОООТК ЕЕ1КК(8Еф ГО N0:8).

В шестом варианте осуществления обеспечены антитела, имеющие гуманизированную или с перестроенную поверхностью вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую одной из 8Е0 ГО N0:9-12:

ΠΨΜΤ0ΤΡΕ8ΕΡν8ΕΟΟΡΑ8Ι80Κ8808ΐνΗ8ΝνΝΤΥΕΕΨΥΕ0ΚΡΟ98ΡΚΕΕΙΥ ΚνδΝΚΡδΟνΡϋΚΡδΟδΟΑΟΤΟΡΤΕΚΙδΚνΕΑΕΏΕΟΙΥΥΟΡΟαδΗνΡΡΤΡΟΟσΤ ΚΕΕΙΚΚ (8Еф ГО N0:9);

ОУЬМТ0ТРЬ8ЕРУ8ЬОПРА818СК88081УН8ПтаТУЕЕУАТ0КРСг(28РКШ¥ Κν8ΝΚΡ86νΡϋΚΡ8Ο8ΟΑΟΤΟΡΤΕΚΙ8ΚνΕΑΕϋΕΟΙΥΥΟΡ0Ο8ΗνΡΡΤΡ(3ΟΟΤ КЬЕГКК (8Еф ГО ΝΟ: 10);

θνΕΜΤ0ΤΡΕ8ΕΡν8ΕΟΟΡΑ8Ι8ΟΚ3808ΐνΗ8ΝνΝΤΥΕΕΨΥΕςΚΡθς8ΡΚΕΕΙΥ КУ8ПКР8ОУРОКР8ОЗСАОТОРТЕК18КУЕАЕОЕСг1УУСР0О8НУРРТРОООТ ΚΤ.ΕΙΚΚ (8Еф ГО N0: 11); или

Ο\νΜΤρΤΡΕ8ΕΡν8ΕΟΟΡΑ5Ι8ΟΒ.85ζ)8ΐνΗ8ΝνΝΤΥΕΕΑνΥΕ(2ΚΡΟ08ΡΚΕΕΙΥ КУ8МКР8СУРОКР8О8ОА0ТПРТЕК18КУЕАЕПЕО1УУСР0О8НУРРТР0О0Т ΚΕΕΙΚΒ. (8Εφ ΕΟ N0: 12).

Сходным образом, обеспечены антитела, имеющие гуманизированную или с перестроенной поверхностью вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0:13:

0νζ)Ενζ)8ΟΑΕννΚΡΟΆ8νΚΕ80ΚΑ8ϋΥΤΕΤ8Υν/ΜΗ\ννΚ0ΕΡ60ΟΕΕ\νΐΟΕΙ ΝΡ8ΝΟΚΤΝΥΝ0ΚΡ0ΟΚΑΤΕΊΎΟΚ833ΤΑΥΜ0Ε88ΕΤ8ΕΟ5ΑνΥΥΡΑΚ0ΚΡΟΥ ΥΟ38ΚλνΥΡϋνΨΟ0<}ΤΤντν88 (ЗЕф ГО N0:13).

В седьмом варианте осуществления обеспечены антитела или фрагменты антител данного изобретения, которые имеют улучшенные свойства. Например, антитела или фрагменты антител, имеющие улучшенную аффинность в отношении ЮЕ-1-рецептора, получают созреванием аффинности антитела или фрагмента данного изобретения.

Данное изобретение обеспечивает, далее, конъюгаты указанных антител, где цитотоксический агент ковалентно присоединен, непосредственно или через расщепляемый или нерасщепляемый линкер, к антителу или эпитопсвязывающему фрагменту антитела данного изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления этим цитотоксическим агентом является таксол, майтансиноид, СС-1065 или аналог СС-1065.

Далее данное изобретение обеспечивает антитела или их фрагменты, которые дополнительно помечены для использования в исследовательских или диагностических приложениях. В предпочтительных вариантах осуществления этой меткой является радиоактивная метка, флуорофор, хромофор, визиографический агент или ион металла.

Обеспечен также способ диагностики, в котором указанные меченые антитела или фрагменты вводят субъекту, в котором подозревают наличие рака, и измеряют или подвергают мониторингу распределение этой метки в теле этого субъекта.

В восьмом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способы лечения субъекта, имеющего рак, введением антитела, фрагмента антитела или конъюгата антитела данного изобретения, отдельно или в комбинации с другими цитотоксическими или терапевтическими агентами. Этот рак может быть, например, одним или несколькими из рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака яичника, остеосаркомы, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака легкого, синовиального рака, рака поджелудочной железы или другого рака, который еще должен быть определен, в котором уровни ЮЕ-1-рецептора являются повышенными.

В девятом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способы лечения субъекта, имеющего рак, введением антитела, фрагмента антитела или конъюгата антитела данного изобретения, отдельно или в комбинации с другими цитотоксическими или терапевтическими агентами. В частности, предпочтительные цитотоксические и терапевтические агенты включают в себя доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, эпирубицин, циклофосфамид, трастузумаб (Негеерйи), капецитабин, тамоксифен, торемифен, летрозол, анастрозол, фулвестрант, экземестан, госерелин, оксалиплатин, карбоплатин, циспла- 4 009807 тин, дексаметазон, антид, бевацизумаб (ΛνηδΙίη). 5-фторурацил, лейковарин, левамизол, иринотекан, этопозид, топотекан, гемцитабин, винорелбин, эстрамустин, митоксантрон, абареликс, золедронат, стрептозоцин, ритуксимаб (Кйихап), идарубицин, бусульфан, хлорамбуцил, флударабин, иматиниб, цитарабин, ибритумомаб (2еуа1т), тозитумомаб (Веххаг), интерферон альфа-2Ь, мелфолам, бортезомиб (Уе1сабе), алтретамин, аспарагиназу, гефитиниб (1ге§8а), эрлонитиб (Тагсеуа), анти-ЕСЕ-рецептор-антитело (Се1их1таЬ, АЬх-ЕСЕ) и эпотилон. Более предпочтительно, этим терапевтическим агентом является содержащий платину агент (такой как карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин), таксан (такой как паклитаксел, доцетаксел), гемцитабин или камптотецин.

Раком может быть, например, одно или более из раковых заболеваний, таких как рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак яичника, остеосаркома, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак легкого, синовиальный рак, рак поджелудочной железы, меланома, множественная миелома, нейробластома и рабдомиосаркома или другой рак, который еще должен быть определен, в котором уровни ЮЕ-1-рецептора являются повышенными.

В десятом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает наборы, содержащие один или несколько описанных здесь элементов и инструкции в отношении использования этих элементов. В предпочтительном варианте осуществления, набор данного изобретения включает в себя антитело, фрагмент или конъюгат антитела данного изобретения и терапевтический агент. Инструкции для этого предпочтительного варианта осуществления включают в себя инструкции в отношении ингибирования роста раковых клеток с использованием антитела, фрагмента или конъюгата антитела данного изобретения и терапевтического агента и/или инструкции в отношении способа лечения пациента, имеющего рак, с использованием антитела, фрагмента или конъюгата антитела данного изобретения и терапевтического агента.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает анализ с использованием клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) специфического связывания очищенного антитела ЕМ 164 с клетками, сверхэкспрессирующими ЮЕ-1-рецептор Υ1251Ε или рецептор инсулина человека;

Фиг. 2 - кривую титрования связывания для связывания антитела ЕМ164 с биотинилированным ЮЕ-1-рецептором человека.

Фиг. 3 - ингибирование связывания биотинилированного 1СЕ-1 -рецептора человека с клетками МСЕ-7 рака молочной железы человека антителом ЕМ 164.

Фиг. 4 - ингибирование ЮЕ-1-стимулированного автофосфорилирования ЮЕ-1-рецептора в клетках МСЕ-7 антителом ЕМ164.

Фиг. 5 - ингибирование ЮЕ-1-стимулированного ΙΚδ-1-фосфорилирования в клетках МСЕ-7 антителом ЕМ164.

Фиг. 6 - ингибирование ЮЕ-1-рецептор-стимулированной трансдукции сигнала в клетках 8а08-2 антителом ЕМ164.

Фиг. 7 - действие антитела ЕМ164 на рост и выживание клеток МСЕ-7 при различных условиях роста, оцененное при помощи МТТ-анализа.

Фиг. 8 - действие антитела ЕМ 164 на рост и выживание клеток МСЕ-7 в присутствии различных концентраций сыворотки.

Фиг. 9 - ингибирование стимулированного ЮЕ-1-и сывороткой роста и выживания клеток ИС1-Н838 антителом ЕМ164.

Фиг. 10 - действие обработки антителом ЕМ164, таксолом или комбинацией антитела ЕМ164 и таксола на рост ксенотрансплантата рака легкого Са1и-6 в мышах.

Фиг. 11 - конкуренцию между связыванием гуманизированного антитела ЕМ164 (ν.1.0) и мышиного антитела ЕМ164.

Фиг. 12 - кДНК- (8Еф ΙΌ N0:49) и аминокислотную (8Еф ΙΌ N0:50) последовательности лидерной области и вариабельной области легкой цепи мышиного антитела против ЮЕ-1-рецептора ЕМ 164. Стрелка показывает начало каркаса 1. Три СИК-последовательности в соответствии с КаЬа! подчеркнуты.

Фиг. 13 - кДНК- (8Еф ΙΌ N0:51) и аминокислотную (8Еф ΙΌ N0:52) последовательности лидерной области и вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела против ΙСЕ-1-рецептора ЕМ 164. Стрелка показывает начало каркаса 1. Три СИК-последовательности в соответствии с КаЬа! подчеркнуты.

Фиг. 14 показывает аминокислотные последовательности СИК легкой и тяжелой цепей антитела ЕМ164, определенные на основании определений канонического класса С1ю11иа. Показаны также определения программы АЬМ для СИК тяжелой цепи. Легкая цепь: СИК1 является 8Еф ГО N0:4, СИК2 является 8Еф ГО N0:5 и СИК 3 является 8Еф ГО N0:6. Тяжелая цепь: СИК1 является 8Еф ГО N0:1, СИК2 является 8Еф ГО N0:2 и СИК3 является 8Еф ГО N0:3. Тяжелая цепь АЬМ: СИК1 является 8Еф ГО N0:53, СИК2 является 8ЕС) ГО N0:54 и СИК3 является 8ЕС) ГО N0:55.

Фиг. 15 показывает аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи для антитела против ЮЕЛ-рецептора ЕМ164, выровненные с последовательностями зародышевой линии для генов Сг1

- 5 009807 (8ЕЦ ΙΌ N0:56) и 1558.С (8Ε0 ΙΌ N0:57). Пунктир (-) указывает идентичность последовательностей.

Фиг. 16 показывает плазмиды, используемые для конструирования и экспрессии рекомбинантных химерных и гуманизированных антител ЕМ 164. А) клонирующая плазмида для легкой цепи, В) клонирующая плазмида для тяжелой цепи, С) экспрессионная плазмида для антитела млекопитающего.

Фиг. 17 показывает 10 наиболее гомологичных аминокислотных последовательностей легких цепей, полученных скринингом из 127 антител в наборе файлов структур, используемых для предсказания поверхностных остатков ЕМ164. ет164 ЬС (8Е0 ΙΌ N0:58), 2_)е1 (8Е0 ΙΌ N0:59), 2рер (8Е0 ΙΌ N0:60), 1п§Ь (8Е0 ΙΌ N0:61), 1ке1 (8Е0 ΙΌ N0:62), 1Иух (8Е0 ΙΌ N0:63), 1ί§Τ (8Е0 ΙΌ N0:64), 1!е! е(8Е0 ΙΌ N0:65), 1ск (8Е0 ΙΌ N0:66), 1Ь1п (8Е0 ΙΌ N0:67, 1с1у (8Е0 ΙΌ N0:68), Консенсус (8Е0 ΙΌ N0:69).

Фиг. 18 показывает 10 наиболее гомологичных аминокислотных последовательностей легких цепей, полученных скринингом из 127 антител в наборе файлов структур, используемых для предсказания поверхностных остатков ЕМ164. ет164 НС (8Е0 ΙΌ N0:70), 1пдЬ (8Е0 ΙΌ N0:71), 1пдр (8Е0 ΙΌ N0:72), 11Ы (8Е0 ΙΌ N0:73), 1а1у (8Е0 ΙΌ N0:74), 1уиИ (8Е0 ΙΌ N0:75), 1р1д (8Е0 ΙΌ N0:76), 165Ь (8Е0 ΙΌ N0:77), 1ае6 (8Е0 ΙΌ N0:78), 1ах8 (8Е0 ΙΌ N0:79), ЗИЛ (8Е0 ΙΌ N0:80), Консенсус (8Е0 ΙΌ N0:81).

Фиг. 19 - среднюю доступность для каждого из остатков вариабельной области легкой (А) и тяжелой (В) цепей из 10 наиболее гомологичных структур. Числа представляют номера положений последовательности антитела по КаЬа!.

Фиг. 20 - аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи для мышиного ЕМ164 (тиЕМ164) и гуманизированного ЕМ164 (ИиЕМ164) антител. тиЕМ164 (8Е0 ΙΌ N0:82), ИиЕМ164 У1.0 (8Е0 ΙΌ N0:83), ИиЕМ164 νΙ.1 (8Е0 ΙΌ N0:84), ИиЕМ164 У1.2 (8Е0 ΙΌ N0:85), ИиЕМ164 У1.3 (8Е0 ΙΌ N0:86).

Фиг. 21 - аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи для мышиного ЕМ164 (тиЕМ164, 8Е0 ΙΌ N0:87) и гуманизированного ЕМ164 (ИиЕМ164, 8Е0 ΙΌ N0:88) антител.

Фиг. 22 - ДНК-последовательность и аминокислотную последовательность вариабельной области 111.1ЕМ164 ν1.0 как для легкой (ДНК, 8Е0 ΙΌ N0:89, аминокислотная 8Е0 ΙΌ N0:90), так и для тяжелой (ДНК, 8Е0 ΙΌ N0:91, аминокислотная 8Е0 ΙΌ N0:92).

Фиг. 23 - ДНК-последовательность и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи для гуманизированного ЕМ164 ν1.1 (ДНК, 8Е0 ΙΌ N0:93, аминокислотная 8Е0 ΙΌ N0:94), ν1.2 (ДНК, 8Е0 ΙΌ N0:95, аминокислотная 8Е0 ΙΌ N0:96) и ν1.3 (ДНК, 8Е0 ΙΌ N0:97, аминокислотная 8Е0 ΙΌ N0:98).

Фиг. 24 - ингибирование ΙΟΕ-Ι-стимулируемого роста и выживания клеток МСЕ-7 гуманизированным антителом ЕМ164 ν1.0 и мышиным антителом: ЕМ164.

Фиг. 25 показывает, что ЕМ164 подавляет ΙΟΕ-Ι-стимулированное прохождение клеточного цикла клеток МСЕ-7.

Фиг. 26 показывает, что ЕМ 164 подавляет антиапоптотическое действие ΙΟΕ-Ι и сыворотки. Обработка ЕМ164 приводит к апоптотической смерти клеток, как показано увеличенными уровнями расщепленного белка СК18.

Фиг. 27 показывает действие обработки антителом ЕМ164, гемцитабином или комбинацией антитела ЕМ164 и гемцитабина на рост ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы человека ВхРС-3 в иммунодефицитных мышах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Данное изобретение обнаружило и улучшило новые антитела, которые специфически связываются с рецептором инсулин-подобного фактора роста Ι (ΙΟΕ-ΙΒ) человека на поверхности клеток. Эти антитела и фрагменты имеют уникальную способность ингибировать клеточные функции этого рецептора без способности активации самого рецептора. Таким образом, в то время как известные ранее антитела, которые специфически связывают и ингибируют ΙΟΕ-ΙΒ, также активируют рецептор даже в отсутствие лигандов ΙΟΕ-ΙΒ, антитела или фрагменты данного изобретения являются антагонистами ΙΟΕ-ΙΒ, но, по существу, лишены агонистической активности. Кроме того, антитела и фрагменты антител данного изобретения ингибируют рост опухолевых клеток человека, таких как клетки МСЕ-7, в присутствии сыворотки более, чем на 80%, что является более высокой степенью ингибирования, чем степень ингибирования, получаемая с использованием ранее известных антител против ΙΟΕ-Ι-рецептора.

Данное изобретение начинается от мышиного антитела против ΙΟΕ-Ι-рецептора, здесь ЕМ164, которое полностью охарактеризовано в отношении аминокислотных последовательностей как легкой, так и тяжелой цепей, идентификации СЭВ, идентификации поверхностных аминокислот и способа для его экспрессии в рекомбинантной форме.

Последовательности зародышевой линии показаны на фиг. 15, выровненные с последовательностью ЕМ164. Это сравнение идентифицирует возможные соматические мутации в ЕМ164, в том числе одну из каждых мутаций в СЭВ 1 в легкой цепи и в СЭВ 2 в тяжелой цепи.

Здесь описаны первичные аминокислотная последовательность и ДНК-последовательность легкой и тяжелой цепей антитела ЕМ164 и гуманизированных версий. Однако объем данного изобретения не ограничивается антителами и фрагментами, содержащими эти последовательности. Вместо этого, все антитела и фрагменты, которые специфически связываются с рецептором инсулин-подобного фактора

- 6 009807 роста I и противодействуют биологической активности этого рецептора, но которые, по существу, лишены агонистической активности, попадают в объем данного изобретения. Таким образом, антитела и фрагменты антител могут отличаться от антитела ЕМ 164 или гуманизированных производных по аминокислотной последовательности их каркаса, СЭК легкой цепи и тяжелой цепи, но все еще попадать в объем данного изобретения.

СОЯ антитела ЕМ 164 идентифицированы моделированием и их молекулярные структуры были предсказаны. Опять, хотя эти СОЯ являются важными для узнавания эпитопов, они не являются незаменимыми для антител и фрагментов данного изобретения. Таким образом, обеспечены антитела и фрагменты, которые имеют улучшенные свойства, образованные, например, созреванием аффинности антитела данного изобретения.

Разнообразные антитела и фрагменты антител, а также миметики антител могут быть легко получены посредством мутации, делеции и/или инсерции в последовательностях вариабельной и константной областей, которые фланкируют конкретный набор СОЯ. Так, например, возможны различные классы ЛЬ для конкретного набора СОЯ, посредством замещения различных тяжелых цепей, посредством чего могут быть получены, например, типы и изотипы антител 1дО1-4, 1дМ, 1д А1 -2, 1дЭ. 1дЕ. Подобным образом, могут быть получены искусственные антитела в объеме данного изобретения посредством помещения конкретного набора СОЯ в полностью синтетический каркас. Термин «вариабельные» используется здесь для описания определенных частей вариабельных доменов, которые различаются по их последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его антигена. Однако эта вариабельность не распределяется обычно равномерно по всем вариабельным доменам этих антител. Обычно она сконцентрирована в трех сегментах, называемых определяющими комплементраность районами (СОЯ) или гипервариабельными районами в вариабельных доменах как легкой, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют каркасом (ЕЯ). Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, каждый, содержат четыре каркасных района, принимающих в значительной степени конфигурацию бета-складок, соединенных тремя СЭЯ, которые образуют петли, соединяющие бета-складчатую структуру и в некоторых случаях образующие часть бета-складчатой структуры. СОЯ в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством ЕЯ-районов и, с СОЯ из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (Е.А. КаЬа! с1 а1., Зесщепсек о! Рго1ешк о! 1ттипо1од1са1 1и1егек1, Дйй ебйюи, 1991, ΝΙΗ). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие этого антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

Гуманизированные антитела или антитела, адаптированные в отношении неотторжения другими млекопитающими, могут быть получены с использованием нескольких технологий, таких как перестройка поверхности антител и трансплантация СОЯ. В технологии перестройки поверхности, молекулярное моделирование, статистический анализ и мутагенез объединяют для доведения не-СЭЯ-поверхностей вариабельных областей до сходства с поверхностями известных антител хозяина-мишени. Стратегии и способы для переделывания поверхностей антител и другие способы для уменьшения иммуногенности антител в отличающемся хозяине описаны в Патенте США 5639641, который включен здесь в его полном виде в качестве ссылки. В технологии трансплантации СЭЯ, СЭЯ мышиных тяжелой и легкой цепей трансплантируют в полностью человеческую каркасную последовательность.

Данное изобретение включает в себя также функциональные эквиваленты антител, описанных в данном описании. Функциональные эквиваленты имеют характеристики связывания, которые сравнимы с характеристиками связывания этих антител, и включают в себя, например, химерные, гуманизированные и одноцепочечные антитела, а также их фрагменты. Способы получения таких функциональных эквивалентов описаны в Заявке РСТ АО 93/21319, Заявке на Европейский патент № 239400; Заявке РСТ АО 89/09622; Заявке на Европейский патент 338745 и Заявке на Европейский патент 332424, которые включены в их полном объеме путем отсылки.

Функциональные эквиваленты включают в себя полипептиды с аминокислотными последовательностями, по существу такими же, что и аминокислотная последовательность вариабельных или гипервариабельных районов антител данного изобретения. По существу такая же в применении к аминокислотной последовательности определяется здесь как последовательность по меньшей мере с приблизительно 90% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности относительно другой аминокислотной последовательности, определяемой при помощи способа поиска ЕАЗТА в соответствии с Реагкои апб Ыртаи, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. Зсг ИЗА 85, 2444-2448 (1988).

Химерные антитела предпочтительно имеют константные области, произведенные, по существу, или исключительно из константных областей антитела человека, а вариабельные области, произведенные по существу или исключительно из последовательности вариабельной области из млекопитающего, другого, чем человек. Гуманизированные формы этих антител получают замещением определяющих комплементарность районов, например, мышиного антитела, в каркасный домен человека, например, см. публикацию РСТ № АО92/22653. Гуманизированные антитела предпочтительно имеют константные области и вариабельные области, другие, чем определяющие комплементарность районы (СЭЯ), полу

- 7 009807 ченные, по существу, или исключительно из соответствующих районов антител человека, а СЭР. полученные, по существу, или исключительно из млекопитающего, другого, чем человек.

Функциональные эквиваленты включают в себя также одноцепочечные фрагменты антител, также известные как одноцепочечные антитела (ксЕу). Эти фрагменты содержат по меньшей мере один фрагмент вариабельной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела (У_н), присоединенный по меньшей мере к одному фрагменту вариабельной последовательности легкой цепи антитела (У_ь) с одним или несколькими соединяющими их линкерами. Такой линкер может быть коротким, гибким пептидом, выбранным для гарантии того, что образуется правильная трехмерная укладка доменов (У_ь) и (У_н) при их связывании, так чтобы сохранялась специфичность связывания молекулы-мишени целого антитела, из которого получен этот одноцепочечный фрагмент антитела. Обычно карбоксильный конец последовательности (У_ь) или (У_н) может быть ковалентно связан таким пептидным линкером с аминоконцом комплементарной последовательности (У_ь) и (У_н). Одноцепочечные фрагменты антител могут быть генерированы молекулярным клонированием с использованием библиотеки фагового дисплея антител или сходными способами. Эти белки могут быть продуцированы либо в эукариотических клетках, либо в прокариотических клетках, в том числе бактериях.

Одноцепочечные фрагменты антител содержат аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере один из вариабельных или определяющих комплементарность районов (СЭК) целых антител, описанных в этом описании, но лишены некоторых или всех константных областей этих антител. Эти константные области не являются обязательными для связывания антигена, но составляют основную часть структуры целых антител. Одноцепочечные фрагменты антител могут, следовательно, преодолевать некоторые из проблем, связанных с применением антител, содержащих часть константной области или всю константную область. Например, одноцепочечные фрагменты антител имеют тенденцию быть свободными от нежелательных взаимодействий между биологическими молекулами и константной областью тяжелой цепи или от другой нежелательной биологической активности. Кроме того, одноцепочечные фрагменты антител являются значительно меньшими, чем целые антитела и могут, следовательно, иметь более высокую капиллярную проникаемость, чем целые антитела, позволяющую одноцепочечным фрагментам более эффективно определять местонахождение антигенсвязывающих сайтов-мишеней и связываться с ними. Фрагменты антител могут в относительно большом масштабе продуцироваться в прокариотических клетках, что облегчает их получение. Кроме того, относительно малый размер одноцепочечных фрагментов приводит к тому, что они с меньшей вероятностью индуцируют иммунную реакцию в реципиенте, чем целые антитела.

Функциональные эквиваленты дополнительно включают в себя фрагменты антител, которые имеют такие же или сравнимые характеристики связывания, что и характеристики связывания целого антитела. Такие фрагменты могут содержать один или оба ЕаЬ-фрагмента или Е(аЬ')₂-фрагмент. Предпочтительно, эти фрагменты антител содержат все шесть определяющих комплементарность районов целого антитела, хотя фрагменты, содержащие меньше, чем все такие районы, например, три, четыре или пять СОР, также являются функциональными. Далее функциональные эквиваленты могут быть членами или могут быть объединены с членами следующих классов иммуноглобулинов: 1дО, 1дМ, 1дА, 1дО или 1дЕ и их подклассов.

Знание аминокислотных последовательностей и последовательностей нуклеиновых кислот для антител против ЮЕ-1-рецептора ЕМ 164 и его гуманизированных вариантов, которые описаны здесь, может быть использовано для развития других антител, которые также связываются с ЮЕ-1-рецептором человека и ингибируют клеточные функции этого ЮЕ-1-рецептора. Некоторые исследования изучали действие введения одной или нескольких аминокислотных замен в различных положениях в последовательности антитела, на основе знания первичной последовательности антитела, на такие его свойства, как связывание и уровень экспрессии (Уапд, А.Р. е! а1., 1995, 1. Мо1. ΒίοΙ., 254, 392-403; Кабег, С. е! а1., Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И8А, 95, 8910-8915; Уаидйап, Т.1. е! а1., 1998, Ыа1иге Вю!есйпо1оду, 16, 535-539).

В этих исследованиях варианты первичного антитела генерировали изменением последовательностей генов тяжелой и легкой цепей в районах СЭКЕ СОК2, СЭК3 или каркасных районах с использованием таких способов, как олигонуклеотид-опосредованный сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез, склонная к ошибкам ПЦР, перетасовка ДНК или мутаторные штаммы Е. сой (Уаидйаи, Т.1. е! а1., 1998, Ыа!иге Вю!есйпо1оду, 16, 535-539; Абеу, Ν.Β. е! а1., 1996, Сйар!ег 16, рр. 277-291, ίη Рйаде Όίκр1ау о£ Рерббек апб Рго!ешк, Ебк. Кау, В.К. е! а1., Асабетю Ргекк). Эти способы изменения последовательности первичного антитела привели к улучшенным аффинностям вторичных антител (Огат, Н. е! а1., 1992, Ргос. Асаб. 8οΐ. И8А, 89, 3576-3580; Вобег, Е.Т. е! а1., 2000, Ргос. N311. Асаб. δα. И8А, 97, 10701-10705; Пау1ек, 1. апб К1есйтапп, Ь., 1996, 1ттипо1оду, 2, 169-179; Тйотркоп, 1. е! а1., 1996, 1. Мо1. Вю1., 256, 77-88; 8Ьой, М.К. е! а1., 2002, 1. Вю1. Сйет., 277, 16365-16370; Еигцката, К. е! а1, 2001, 1. Вю1. Сйет., 276, 27622-27628).

С использованием подобной направленной стратегии изменения одного или нескольких аминокислотных остатков антитела, последовательности антител, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для развития антител против ЮЕ-1-рецептора с улучшенными функциями.

Конъюгаты данного изобретения содержат антитело, фрагменты и их аналоги, описанные здесь,

- 8 009807 связанные с цитотоксическим агентом. Предпочтительными цитотоксическими агентами являются майтансиноиды, таксаны и аналоги СС-1065. Эти конъюгаты могут быть получены способами ίη νίΐτο. Для связывания цитотоксического агента с антителом используют связывающую группу. Подходящие связывающие группы хорошо известны в данной области и включают в себя дисульфидные группы, простые тиоэфирные группы, неустойчивые к кислоте группы, фотолабильные группы, пептидаза-лабильные группы и эстераза-лабильные группы. Предпочтительными связывающими группами являются дисульфидные группы и тиоэфирные группы. Например, могут быть сконструированы конъюгаты с использованием реакции дисульфидного обмена или посредством образования простой тиоэфирной связи между антителом и цитотоксическим агентом.

Майтансиноиды и аналоги майтансиноидов находятся среди предпочтительных цитотоксических агентов. Примеры подходящих майтансиноидов включают в себя майтансинол и аналоги майтансинола. Подходящие майтансиноиды описаны в патентах США с номерами 4424219; 4256746; 4294767; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 6333410; 5475092; 5585499 и 5846545.

Таксаны также являются предпочтительными цитотоксическими агентами. Таксаны, подходящие для использования в данном изобретении, описаны в Патентах США с номерами 6372738 и 6340701.

СС-1065 и его аналоги являются также предпочтительными цитотоксическими лекарственными средствами для использования в данном изобретении. СС-1065 и его аналоги описаны в Патентах США с номерами 6372738; 6340701; 5846545 и 5585499.

Привлекательным кандидатом на получение таких цитотоксических конъюгатов является СС-1065, который является сильным противоопухолевым антибиотиком, выделенным из культурального бульона 81гер1отусек хс1сп515. СС-1065 является приблизительно в 1000 раз более сильным, чем обычно используемые антираковые лекарственные средства, такие как доксорубицин, метотрексат и винкристин (В.К. Вйиуап е! а1., Сапсег Век., 42, 3532-3537 (1982)).

Цитотоксические лекарственные средства, такие как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил и калихеамицин, также являются подходящими для приготовления конъюгатов данного изобретения, и эти молекулы лекарственных средств могут быть также связаны с молекулами антител через промежуточную молекулу-носитель, такую как сывороточный альбумин.

Для диагностических приложений антитела данного изобретения обычно метят детектируемой молекулой. Детектируемой молекулой может быть любая молекула, которая способна продуцировать, прямо или опосредованно, детектируемый сигнал. Например, детектируемой молекулой может быть радио3 14 32 35 131 изотоп, такой как Н, С, Р, 8 или I; флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как изотиоцианат флуоресцеина, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена.

Любой способ, известный в данной области, может быть использован для конъюгирования антитела с детектируемой молекулой, в том числе способы, описанные Нип1ег, е! а1., №1Шге 144:945 (1962); Όανίά, е! а1., В1осйет1к1гу 13:1014 (1974); Раш, е! а1, I. 1ттипо1. Ме111. 40:219 (1981) и Ыудгеп, I. НйЮсНет. апб СуйсЬет. 30:407 (1982).

Антитела данного изобретения могут быть использованы в любом известном способе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые или опосредованные сэндвич-анализы и иммунопреципитационные анализы (Ζο1η. Мопос1опа1 Апббоб1ек: А Мапиа1 о£ Тес1шк|иек. рр. 47-158 (СВС Ргекк, 1пс., 1987)).

Антитела данного изобретения применимы также для визиографии ш νίνΌ, где антитело, меченое детектируемой молекулой, такой как непрозрачный для излучения агент или радиоактивный изотоп, вводят субъекту, предпочтительно в кровоток, и анализируют присутствие или местонахождение этого меченого антитела в хозяине. Этот способ визиографии применим в определении стадии и лечении злокачественностей. Антитело может быть помечено любой молекулой, которая является детектируемой в хозяине, при помощи ядерного магнитного резонанса, радиологии или других средств детектирования, известных в данной области.

Антитела данного изобретения применимы также в качестве агентов аффинной очистки. В этом способе антитела иммобилизуют на подходящем носителе, таком как смола Сефадекс или фильтровальная бумага, с использованием способов, хорошо известных в данной области.

Антитела данного изобретения применимы также в качестве реагентов в биологических исследованиях, основанных на их ингибировании функции ΙΟΕ-Ι-рецептора в клетках.

Для терапевтических применений антитела и конъюгаты данного изобретения вводят субъекту в фармацевтически приемлемой дозированной форме. Они могут быть введены внутривенно в виде болюса или непрерывной инфузией на протяжении некоторого периода времени, внутримышечным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Антитело может также вводиться внутриопухолевым, околоопухолевым способами, способом введения в повреждение или около повреждения, для проявления локальных, а также системных терапевтических действий. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и

- 9 009807 эксципиенты хорошо известны и могут быть определены специалистами в данной области, как того может потребовать клиническая ситуация. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или эксципиентов включают в себя: (1) забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко, рН приблизительно 7,4, содержащий около 1 мг/мл - 25 мг/мл сывороточного альбумина человека, (2) 0,9% солевой раствор (0,9% мас./об. ЫаС1) и (3) 5% (мас./об.) декстроза. Способ данного изобретения может практиковаться ίη νίίτο, ίη νίνο или еx νίνο.

В других терапевтических обработках антитела, фрагменты или конъюгаты антител данного изобретения вводят совместно или вводят последовательно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. Подходящие терапевтические агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические или цитостатические агенты. Таксол является предпочтительным терапевтическим агентом, который является также цитотоксическим агентом.

Противораковыми терапевтическими агентами являются такие агенты, которые стремятся убить или ограничить рост раковых клеток, вызывая лишь минимальное повреждение хозяина. Таким образом, такие агенты могут использовать любое отличие в свойствах раковых клеток (например, метаболизм, васкуляризацию или презентацию антигенов клеточной поверхности) от свойств здоровых клеток хозяина. Различия в морфологии опухоли являются потенциальными сайтами для вмешательства: например, вторым терапевтическим веществом может быть такое антитело, как антитело против УЕСР, которое применимо в замедлении васкуляризации внутренней части солидной опухоли, которое замедляет скорость роста опухоли. Другие терапевтические агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, дополнительные средства, такие как гранистерон, НС1, ингибиторы андрогена, такие как ацетат лейпролида, антибиотики, такие как доксорубицин, антиэстрогены, такие как тамоксифен, антиметаболиты, такие как интерферон альфа-2а, цитотоксические агенты, такие как таксол, ингибиторы ферментов, такие как ингибитор фарнезилтрансферазы, иммуномодуляторы, такие как алдеслейкин и производные азотных аналогов горчичного газа (иприта), такие как мелфалан, НС1 и т.п.

Терапевтические агенты, которые могут быть комбинированы с ЕМ164 для улучшенной противораковой эффективности, включают в себя различные агенты, используемые в практике онкологии (Ссылка: Сапсег, Ргше1р1е8 & РгаеНее οί Опсо1оду, ОеУйа, У.Т., Не1тап, 8., ВокепЬегд, 8.А., 6^4Ь ебйюп, ЫррепсоИРауеп. РЫ1абе1рЫа, 2001), такие как доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, эпирубицин, циклофосфамид, трастузумаб (Негсерйп), капецитабин, тамоксифен, торемифен, летрозол, аиастрозол, фулвестрант, экземестан, госерелин, оксалиплатин, карбоплатин, цисплатин, дексаметазон, антид, бевацизумаб (Ανа8ί^η), 5-фторурацил, лейковарин, левамизол, иринотекан, этопозид, топотекан, гемцитабин, винорелбин, эстрамустин, митоксантрон, абареликс, золедронат, стрептозоцин, ритуксимаб (Кйихап), идарубицин, бусульфан, хлорамбуцил, флударабин, иматиниб, цитарабин, ибритумомаб (^етаНн), тозитумомаб (Веххаг), интерферон альфа-2Ь, мелфолам, бортезомиб (Уе1сабе), алтретамин, аспарагиназа, гефитиниб (1ге88а), эрлонитиб (Та^сеνа), анти-ЕСР-рецептор-антитело (СеШхгттаЬ, АЬх-ЕСР) и эпотилоны и конъюгаты цитотоксических лекарственных средств и антител против рецепторов клеточной поверхности. Предпочтительными терапевтическими агентами являются содержащие платину агенты (такие как карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин), таксаны (такие как паклитаксел, доцетаксел), гемцитабин или камптотецин.

Один или несколько дополнительных терапевтических агентов могут вводиться до, одновременно или после антитела, фрагмента или конъюгата антитела, данного изобретения. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что для каждого терапевтического агента могут быть преимущества в отношении конкретного порядка введения. Подобным образом, специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что для каждого терапевтического агента продолжительность интервалов, с которыми вводят каждый агент и антитело, фрагмент или конъюгат антитела данного изобретения, будет варьировать.

Хотя специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что доза каждого терапевтического агента будет зависеть от конкретного агента, предпочтительные дозы могут находиться в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 2000 мг/кв.м, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мг/кв. м. Для предпочтительных агентов, таких как содержащие платину агенты (карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин), предпочтительная доза равна приблизительно 10 - приблизительно 400 мг/кв. м, для таксанов (паклитаксела, доцетаксела) предпочтительно доза равна приблизительно 20 - приблизительно 150 мг/кв.м, для гемцитабина предпочтительная доза равна приблизительно 100 приблизительно 2000 мг/кв.м и для камптотецина предпочтительная доза равна приблизительно 60 мг/кв.м - приблизительно 350 мг/кв.м. Доза этих и других терапевтических агентов может зависеть от того, вводят ли антитело, фрагмент или конъюгат антитела данного изобретения одновременно или последовательно с терапевтическим агентом.

Введение антитела, фрагмента или конъюгата антитела данного изобретения и одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов, независимо от того вводят ли их совместно или вводят последовательно, может выполняться, как описано выше для терапевтических применений. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и эксципиенты для совместного введения будут известны специалисту с квалификацией в данной области и будут зависеть от идентичности конкретного

- 10 009807 терапевтического агента, который вводят совместно.

Когда антитело присутствует в водной дозированной форме, а не в лиофилизированной форме, это антитело готовят обычно в концентрации приблизительно 0,1-100 мг/мл, хотя допускается широкое варьирование за пределами этих диапазонов. Для лечения заболевания подходящая доза антитела или конъюгата будет зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, как определено выше, тяжести и протекания этого заболевания, от того, вводят ли эти антитела для профилактических или терапевтических целей, хода предыдущей терапии, клинической истории пациента и реакции на это антитело и от усмотрения лечащего врача. Предпочтительно, это антитело вводят пациенту один раз или на протяжении ряда введений.

В зависимости от типа и тяжести заболевания, предпочтительно начальной дозой для введения пациенту является доза от приблизительно 1 до приблизительно 2000 мг/кв.м антитела, более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мг/кв.м антитела, например, посредством одного или нескольких отдельных введений или непрерывной инфузией. Для повторяемых введений на протяжении нескольких дней или более продолжительно, в зависимости от состояния, введение повторяют, пока не наблюдается желаемая супрессия симптомов заболевания. Однако могут быть использованы и не исключены и другие схемы введения доз.

Данное изобретение включает в себя также наборы, содержащие один или несколько описанных здесь элементов и инструкции в отношении использования этих элементов. В предпочтительном варианте осуществления, набор данного изобретения включает в себя антитело, фрагмент или конъюгат антитела данного изобретения и терапевтический агент. Инструкции для этого предпочтительного варианта осуществления включают в себя инструкции в отношении ингибирования роста раковых клеток с использованием антитела, фрагмента или конъюгата антитела данного изобретения и терапевтического агента и/или инструкции в отношении способа лечения пациента, имеющего рак, с использованием антитела, фрагмента или конъюгата антитела данного изобретения, и терапевтического агента.

Предпочтительно антитело, используемое в этом наборе, имеет ту же самую аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело ЕМ164, продуцируемое мышиной гибридомой ЕМ164 (АТСС ассеззюи иитЬет РТА-4457), или это антитело является его эпитопсодержащим фрагментом, причем как антитело, так и этот фрагмент специфически связываются с рецептором инсулин-подобного фактора роста I. Антителом и фрагментом антитела, используемыми в этом наборе, могут быть также переделанная в отношении поверхности антитела версия антитела ЕМ164, имеющая по меньшей мере одну нуклеотидную мутацию, делецию или инсерцию. Антитела и фрагменты антител каждой из этих трех версий сохраняют ту же самую специфичность связывания, которую имеет антитело ЕМ164.

Предпочтительно, терапевтический агент, используемый в этом наборе, выбран из группы, состоящей из таких терапевтических агентов, как доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, эпирубицин, циклофосфамид, трастузумаб (Негсерйп), капецитабин, тамоксифен, торемифен, летрозол, анастрозол, фулвестрант, экземестан, госерелин, оксалиплатин, карбоплатин, цисплатин, дексаметазон, антид, бевацизумаб (Ауазйп), 5-фторурацил, лейковарин, левамизол, иринотекан, этопозид, топотекан, гемцитабин, винорелбин, эстрамустин, митоксантрон, абареликс, золедронат, стрептозоцин, ритуксимаб (Кйихап), идарубицин, бусульфан, хлорамбуцил, флударабин, иматиниб, цитарабин, ибритумомаб (2еуа1ш), тозитумомаб (Веххаг), интерферон альфа-2Ь, мелфолам, бортезомиб (Уе1еайе), алтретамин, аспарагиназа, гефитиниб (Еезза), эрлонитиб (Татееуа), анти-ЕОЕ-рецептор-антитело (Се1их1утаЬ, АЬх-ЕОЕ) и эпотилон. Более предпочтительно, этим терапевтическим агентом является содержащий платину агент (такой как карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин), таксан (такой как паклитаксел, доцетаксел), гемцитабин или камптотецин.

Элементы наборов данного изобретения находятся в подходящей для набора форме, например, в форме раствора или лиофилизированного порошка. Квалифицированному специалисту будет понятно, что концентрация или количество этих элементов наборов будут варьировать в зависимости от идентичности и предполагаемого использования каждого элемента этого набора.

Типы рака и клеток из этих типов рака, на которые делается ссылка в инструкциях наборов, включают в себя рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак яичника, остеосаркому, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак легкого, синовиальный рак, рак поджелудочной железы, меланому, множественную миелому, нейробластому и рабдомиосаркому.

Примеры

Теперь данное изобретение описывается со ссылкой на следующие примеры, которые являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения данного изобретения.

Пример 1. Мышиное антитело ЕМ164.

В этом первом примере описана полная первичная аминокислотная структура и кДНКпоследовательность мышиного антитела данного изобретения, вместе с его связывающими свойствами и способом его экспрессии в рекомбинантной форме. Таким образом, обеспечено полное и законченное описание антитела данного изобретения и его получение, так чтобы средний специалист в области иммунологии был способен получить указанное антитело без чрезмерного экспериментирования.

- 11 009807

А. Генерирование гибридомы моноклонального антитела против ЮГ-1-рецептора.

Клеточную линию, экспрессирующую ЮГ-1-рецептор человека с мутацией Υ1251Γ, использовали для иммунизации, так как она экспрессировала высокое количество ЮГ-1-рецепторов (~10⁷ на клетку). Мутация Υ1251Γ в цитоплазматическом домене ЮГ-1-рецептора приводила к потере трансформации (превращения клеток в опухолевые клетки) и антиапоптотической передачи сигнала, но не влияла на связывание ЮГ-1 и ЮГ-1-стимулируемую митогенную передачу сигнала (О'Соппог, К. с1 а1., 1997, Мо1. Се11. ΒίοΙ., 17, 427-435; Мшта, М. е1 а1, 1995, 1. Вю1. СНет., 270, 22639-22644). Эта мутация не влияла иным образом на генерирование антител, так как антитело этого примера связывалось с внеклеточным доменом ЮР-1-рецептора, который был идентичным как для мутанта Υ125ΙΡ, так и для рецептора дикого типа.

Клеточную линию, экспрессирующую ЮР-1-рецептор с мутацией Υ1251Ρ, генерировали из 3Т3подобных клеток дефицитной по ЮР-1-рецептору мыши трансфекцией геном ЮР-1-рецептора человека вместе с геном устойчивости к пуромицину и отбирали с использованием пуромицина (2,5 мкг/мл) и РАСЗ-сортингом на высокую экспрессию ЮР-1-рецептора (Мшта, М. е1 а1., 1995, ί. Βίο1. СНет., 270, 22639-22644). Клеточную линию, имеющую высокий уровень экспрессии ЮР-1-рецептора, дополнительно отбирали с использованием высокой концентрации пуромицина, например, 25 мкг/мл, которая была токсичной для большинства этих клеток. Выжившие колонии отбирали, и колонии, обнаруживающие высокий уровень экспрессии ЮР-1-рецептор, отбирали.

Самок мышей САР1/1, в возрасте 6 месяцев, иммунизировали внутрибрюшинно в день 0 клетками, сверхэкспрессирующими Υ1251Ρ-мутантный ЮР-1-рецептор человека (5х10⁶ клеток, суспендированных в 0,2 мл ЗФР). Животным повторно вводили 0,2 мл клеточной суспензии следующим образом: день 2, 5,2х10⁶ клеток; день 5, 2х10⁶ клеток; дни 7, 9, 12 и 23, 1х10⁷ клеток. В день 26 мышь умерщвляли и извлекали ее селезенку.

Селезенку измельчали между двумя матированными стеклянными предметными стеклами с получением суспензии отдельных клеток, которую промывали бессывороточной средой КРМ1, содержащей пенициллин и стрептомицин (8РМ). Осадок клеток селезенки ресуспендировали в 10 мл 0,83% (масса/объем) раствора хлорида аммония в воде в течение 10 мин на льду для лизиса эритроцитов и затем промывали бессывороточной средой (8РМ). Клетки селезенки (1,2х10⁸) объединяли с миеломными клетками (4х10⁷) из несекретирующей линии клеток мышиной миеломы Р3Х63Ад8.653 (АТСС, КоскуШе. МЭ; Са! # СКБ1580) в пробирке и промывали бессывороточной средой КРМ1 1640 (8РМ). Супернатант удаляли и осадок клеток ресуспендировали в остальной среде. Пробирку помещали в химический стакан с водой при 37°С и медленно добавляли при скорости капель 0,5 мл/мин 1,5 мл раствора полиэтиленгликоля (50% ПЭГ (мас./об.), средняя молекулярная масса 1500 в 75 мМ НЕРЕ8, рН 8) при осторожном встряхивании пробирки. После выдерживания в течение одной минуты добавляли 10 мл 8РМ следующим образом: 1 мл на протяжении первой минуты, 2 мл на протяжении второй минуты и 7 мл на протяжении третьей минуты. Затем другие 10 мл добавляли медленно на протяжении одной минуты. Клетки осаждали центрифугированием, промывали в 8РМ и ресуспендировали в среде для выращивания КРМ11640, дополненной 5% фетальной телячьей сывороткой (ФТС), гипоксантином/аминоптерином/тимидином (НАТ), пенициллином, стрептомицином и 10% клонирующей гибридому добавкой (НС8). Клетки высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты для культуры ткани при 2х10⁵ клеток селезенки в 200 мкл на лунку. Спустя 5-7 дней 100 мкл на лунку удаляли и заменяли средой для выращивания, дополненной гипоксантином/тимидином (НТ) и 5% ФТС. Общие условия, используемые для иммунизации и получения гибридомы, были такими как описанные ί. Ьапдопе апб Н. Уипак1к (Ебк., Мебюбк ίη Еп7уто1оду, Уо1. 121, 1ттипо1од1са1 Тесйшдиек, Рай I, 1986; Асабеиис Ргекк, Р1опба) и Е. Наг1о\у апб Ό. Ьапе (АпйЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 1988; Со1б Зрппд НатЬот ЬаЬогаФгу Ргекк, №\ν Уогк). Другие способы иммунизации и получения гибридом могут быть также использованы, как это хорошо известно специалистам с квалификацией в данной области.

Культуральные супернатанты из гибридомных клонов подвергали скринингу на связывание с очищенным ЮР-1-рецептором человека и на отсутствие специфического связывания с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор инсулина человека, при помощи ЕЬ18А и РАС8-скрининга, как описано ниже. Клоны, проявляющие более высокую аффинность связывания с клетками, сверхэкспрессирующими ЮРΙ-рецептор человека, чем с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор инсулина человека, размножали и субклонировали. Культуральные супернатанты этих субклонов дополнительно подвергали скринингу посредством вышеуказанных анализов связывания. При помощи этой процедуры, был отобран субклон 3Р1-С8-Э7 (ЕМ164), и гены тяжелой и легкой цепей клонировали и секвенировали, как описано ниже.

ЮР-1-рецептор человека выделяли для использования в скрининге супернатантов из гибридомных клонов на их связывание с ЮР-1-рецептором при помощи описанного ниже способа. Биотинилированный ЮР-Ι получали модификацией рекомбинантного ЮР-Ι с использованием реагентов биотинилирования, таких как сульфо-ННЗ-ЬС-биотин, сульфо-ЫН8-88-биотин или ПН8-РЕО₄-биотин. Биотинилированный ЮР-Ι абсорбировали на стрептавидин-агарозных гранулах и инкубировали с лизатом из клеток, которые сверхэкспрессировали ЮРК дикого типа человека или Υ1251Р-мутантный ЮРК. Эти гранулы

- 12 009807 промывали и элюировали буфером, содержащим 2-4 М мочевину и детергент, такой как Тритон Х-100 или октил-в-глюкозид. Элюированный ЮБ-1-рецептор диализовали против ЗФР и анализировали на чистоту электрофорезом в ДСН-ПААГ при восстанавливающих условиях, который показал полосы альфа- и бета-цепей ЮБ-1-рецептора с молекулярными массами приблизительно 135 кДа и 95 кДа, соответственно.

Для проверки на связывание супернатантов гибридом с очищенным ЮБ-1-рецептором планшет 1тти1оп-4НВ ЕЫ8А покрывали пробой очищенного ЮБ-1-рецептора человека (полученного диализом из элюции смесью мочевина/октил-в-глюкозид аффино очищенной пробы), разбавленного в 50 мМ СНЕ8-буфере при рН 9,5 (100 мкл; 4°С, в течение ночи). Лунки блокировали 200 мкл блокирующего буфера (10 мг/мл БСА в ТВ8-Т-буфере, содержащем 50 мМ Трис, 150 мМ ЫаС1, рН 7,5, и 0,1% Твин-20) и инкубировали с супернатантами из гибридомных клонов (100 мкл; разведенные в блокирующем буфере) в течение приблизительно 1-12 ч, промывали ТВ8-Т-буфером и инкубировали с конъюгатом козьи антитела против мышиного 1дС-Бс -пероксидаза хрена (НКР) (100 мкл; 0,8 мкг/мл в блокирующем буфере; Часккоп 1ттипоКе8еатсй ЕаЬотаФпек), с последующими промывками и детектированием с использованием субстрата АВТ8/Н₂О₂ при 405 нм (0,5 мг/мл АВТ8, 0,03% Н₂О₂ в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,2). Обычно, супернатант из гибридомного субклона 3Б1 давал сигнал приблизительно 1,2 единицы оптической плотности в пределах 3 мин проявления, в противоположность величинам 0,0, полученным для супернатантов из некоторых других гибридомных клонов. Общие условия для этого ЕБ18А были сходными со стандартными условиями ЕБ18А для связывания антител и детектирования, описанными Е. Нат1оте апб Ό. Ьапе (АпбЬоб1е8: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 1988; Со1б 8рппд НатЬот ЬаЬога1огу Ргекк, Ыете Уогк), которые также могут быть использованы.

Скрининг гибридомных супернатантов на специфическое связывание с ЮБ-1-рецептором человека, но не с рецептором инсулина человека выполняли с использованием ЕЬ18А на клеточных линиях, которые сверхэкспрессировали У1251Б-ЮБ-1-рецептор человека, и на клеточных линиях, которые сверхэкспрессировали рецептор инсулина человека. Обе клеточные линии получали из 3Т3-подобных клеток ЮБΙ-рецептор-недостаточных мышей. Сверхэкспрессирующие ЮБ-1-рецептор клетки и сверхэкспрессирующие рецептор инсулина клетки отдельно собирали из колб для культуры ткани быстрой обработкой трипсином/ЭДТА, суспендировали в среде для выращивания, содержащей 10% ФТС, осаждали центрифугированием и промывали ЗФР. Промытые клетки (100 мкл приблизительно 1-3 х 10⁶ клеток/мл) добавляли в лунки 1тти1оп-2НВ-планшета, покрытого фитогемагглютинином (100 мкл 20 мкг/мл РНА), центрифугировали и давали прикрепляться к РНА-покрытым лункам в течение 10 мин. Планшет с клетками переворачивали с постукиванием для удаления ЗФР и затем сушили в течение ночи при 37°С. Лунки блокировали 5 мг/мл-раствором БМА в ЗФР в течение 1 ч при 37°С и затем промывали осторожно ЗФР. Затем аликвоты супернатантов из гибридомных клонов (100 мкл; разбавленные в блокирующем буфере) добавляли в лунки, содержащие сверхэкспрессирующие ЮБ-1-рецептор клетки, и в лунки, содержащие сверхэкспрессирующие рецептор инсулина клетки, и инкубировали при температуре окружающей среды в течение 1 часа. Лунки промывали ЗФР, инкубировали с конъюгатом козьи антитела против мышиного 1дС-Бс - пероксидаза хрена (100 мкл; 0,8 мкг/мл в блокирующем буфере) в течение 1 ч с последующими промывками и затем связывание детектировали с использованием субстрата АВТ8/Н₂О₂. Типичный супериатант из гибридомного субклона 3Б1 после инкубирования с клетками, сверхэкспрессирующими ЮБ-1-рецептор, давал сигнал 0,88 единиц оптической плотности в пределах 12 минут проявления, в противоположность величине 0,22 единицы оптической плотности, полученной с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор инсулина человека.

Эту гибридому выращивали в колбах 1п(едга СЬ 350 (1п1едга Вюкаепсек, Магу1апб) в соответствии с описаниями изготовителя, для получения очищенного антитела ЕМ164. Выход приблизительно 0,5-1 мг/мл антитела получали в собранных супернатантах из колб 1п1едта, на основе количественного определения ЕЫ8А и на основе электрофореза в ДСН-ПААГ/окрашивания Кумасси синим с использованием стандартов антител. Это антитело очищали аффинной хроматографией на колонке с гранулами Белок Аагарозы при стандартных условиях очистки в отношении нанесения и промывания в 100 мМ Трисбуфере, рН 8,9, содержащем 3 М ЫаС1, с последующей элюцией в 100 мМ растворе уксусной кислоты, содержащем 150 мм ЫаС1. Элюированные фракции, содержащие антитело, нейтрализовали холодным 2 М раствором К₂НРО₄ и диализовали в ЗФР при 4°С. Концентрацию антитела определяли измерением оптической плотности при 280 нм (коэффициент экстинкции =1,4 мг^-1мл см^-1). Пробу очищенного антитела анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ при восстанавливающих условиях и окрашивании Кумасси синим, которое показало только полосы тяжелой и легкой цепей антитела при приблизительно 55 кДа и 25 кДа, соответственно. Изотип этого очищенного антитела был 1дС₄ с легкой цепью каппа.

В. Характеристика связывания антитела БМ164.

Специфическое связывание очищенного антитела ЕМ164 демонстрировали при помощи клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции (БАС8) с использованием клеток, сверхэкспрессирующих ЮБΙ-рецептор человека, и с использованием клеток, сверхэкспрессирующих рецептор инсулина человека (фиг. 1). Инкубирование антитела ЕМ164 (50-100 нМ) в 100 мкл холодного БАС8-буфера (1 мг/мл БСА в

- 13 009807 среде МЕМ в модификации Дульбекко) выполняли с использованием клеток, сверхэкспрессирующих ЮР-1-рецептор человека, и с использованием клеток, сверхэкспрессирующих рецептор инсулина человека (2 х 10⁵ клеток/мл) в круглодонном 96-луночном планшете в течение 1 ч. Клетки осаждали центрифугированием и промывали холодным РАС8-буфером осторожным стряхиванием с последующим инкубированием с конъюгатом козьи антитела против мышиного 1дС-Рс - пероксидаза хрена (100 мкл; 10 мкг/мл в РАС8-буфере) на льду в течение 1 ч. Клетки осаждали, промывали и ресуспендировали в 120 мкл 1% раствора формальдегида в ЗФР. Планшет анализировали с использованием РАС8Са11Ьиг-ридера (ВЛ ВюкОепсек).

Сильное смещение флуоресценции получали после инкубирования сверхэкспрессирующих ЮР-Ιрецептор клеток с антителом ЕМ164, в противоположность незначительному смещению после инкубирования сверхэкспрессирующих рецептор инсулина клеток с антителом ЕМ164 (фиг. 1), что показало, что антитело ЕМ 164 было селективным в его связывании с ЮР-1-рецептором и не связывалось с рецептором инсулина. Контрольные антитела, антитело против ЮР-1-рецептора 1Н7 (8ап!а Сгнх Вю1есйпо1оду) и анти-рецептор инсулина-антитело (ВЛ РРагтшодеп ЬаЬогаФпек), давали смещения флуоресценции после инкубации с клетками, сверхэкспрессирующими ЮР-1-рецептор и рецептор инсулина, соответственно (фиг. 1). Сильное смещение флуоресценции наблюдали также при помощи РАС8-анализа с использованием антитела ЕМ164 и клеток МСР-7 рака молочной железы человека, которые экспрессировали ЮР-1-рецептор (ЛиГоигпу, В. е! а1., 1997, Σ. Вю1. С1ет., 272, 31171), которое показало, что антитело ЕМ 164 связывалось с ЮР-1-рецептором человека на поверхности опухолевых клеток человека.

Константу диссоциации (К_с) для связывания антитела ЕМ164 с ЮР-1-рецептором человека определяли при помощи титрования ЕЫ8А связывания антитела при нескольких концентрациях либо с непосредственно сенсибилизацией ЮР-1-рецептором (аффинно очищенным с использованием биотинилированного ЮР-Ι, как описано выше), либо с опосредованно захваченным биотинилированным ЮР-Ιрецептором. Биотинилированный ЮРЛ-рецептор получали биотинилированием солюбилизированного детергентом лизата из сверхэкспрессирующих ЮРЛ-рецептор клеток с использованием реагента РЕОмалеимид-биотин (Р1егсе, Мо1еси1аг Вю8х1епсе8), который аффинно очищали с использованием антитела против бета-цепи ЮРЛ-рецептора, иммобилизованного на ХН8-агарозных гранулах, и элюировали 2-4 М мочевиной в буфере, содержащем детергент №-40, и диализовали в ЗФР.

Определение К_с для связывания антитела ЕМ164 с биотинилированным ЮРЛ-рецептором проводили сенсибилизацией ИштНоп-ЬНВ-планшета 100 мкл 1 мкг/мл стрептавидином в карбонатном буфере (150 мМ карбонат натрия, 350 мМ бикарбонат натрия) при 4°С в течение ночи. Сенсибилизированные стрептавидином лунки блокировали 200 мкл блокирующего буфера (10 мг/мл БСА в ТВ8-Т-буфере), промывали ТВ8-Т-буфером и инкубировали с биотинилированным ЮРЛ-рецептором (10-100 нг) в течение 4 часов при температуре окружающей среды. Затем лунки, содержащие захваченный биотинилированный ЮРЛ-рецептор, промывали и инкубировали с антителом ЕМ164 в блокирующем буфере при нескольких концентрациях (5,1 х 10^-13 М - 200 нМ) в течение 2 ч при температуре окружающей среды и затем инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки промывали ТВ8-Т-буфером и инкубировали с конъюгатом козьи антитела против мышиного Ι§6_η+ε - пероксидаза хрена (100 мкл; 0,5 мкг/мл в блокирующем буфере) с последующими промывками и детектированием с использованием субстрата АВТ8/Н₂О₂ при 405 нм. Величину К_с определяли нелинейной регрессией для односайтного связывания.

Подобное титрование связывания проводили с использованием РаЬ-фрагмента антитела ЕМ164, полученного расщеплением папаином этого антитела, как описано Е. Наг1оте апб Ό. Ьапе (Иктд АпйЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 1988; Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Ыете Уотк).

Кривая титрования связывания для связывания антитела ЕМ 164 с биотинилированным ЮРЛрецептором человека давала величину К_с 0,1 нМ (фиг. 2). РаЬ-фрагмент антитела ЕМ164 также связывал ЮРЛ-рецептор человека очень прочно с величиной К_с 0,3 нМ, что указывало на то, что мономерное связывание антитела Е164 с ЮРЛ-рецептором было также очень сильным.

Эта крайне низкая величина константы диссоциации для связывания ЮРЛ-рецептора антителом ЕМ 164 была отчасти обусловлена очень низкой скоростью к_оГГ, подтверждаемой сильными сигналами связывания, наблюдаемыми после пролонгированных промывок в течение 1-2 дней антитела, связанного с иммобилизованным ЮРЛ-рецептором.

Антитело ЕМ 164 может быть использовано для иммунопреципитации ЮРЛ-рецептора, как показано инкубированием солюбилизированного детергентом лизата клеток МСР-7 молочной железы человека с антителом ЕМ164, иммобилизованным на белок Ο-агарозных гранулах (Р1егсе Сйетка1 Сотрапу). Вестерн-блот иммунопреципитата антитела ЕМ164 детектировали с использованием кроличьего поликлонального антитела против бета-цепи (С-конца) ЮРЛ-рецептора (8ап!а Сгнх Вю1есйпо1оду) и конъюгата козьи антитела против мышиного ΙβΟ - пероксидаза хрена с последующими промывками и детектированием усиленной хемилюминесценции (ЕСЬ). Вестерн-блот иммунопреципитата ЕМ164 из клеток МСР-7 обнаруживал полосы, соответствующие бета-цепи ЮРЛ-рецептора при приблизительно 95 кДа и проЮРЛ-рецептор при приблизительно 220 кДа. Сходные иммунопреципитации проводили для других типов клеток для проверки видовой специфичности связывания антитела ЕМ164, которое также связыва- 14 009807 лось с ΙΟΕ-Ι-рецептором из клеток СО8-7 (африканская зеленая мартышка), но не связывалось с ΙΟΕ-Ιрецептором клеток 3Т3 (мышь), клеток СНО (китайский хомячок) или фибробластных клеток козы (коза). Антитело ЕМ164 не детектировало денатурированный ДСН ΙΟΕ-Ι-рецептор человека в Вестерн-блоте лизатов из клеток МСЕ-7, что указывало на то, что оно связывалось с конформационным эпитопом нативного, неденатурированного ΙΟΕ-Ι-рецептора человека.

Связывающий домен антитела ЕМ 163 дополнительно характеризовали с использованием укороченной конструкции альфа-цепи, которая содержала богатый цистеинами домен, фланкированный доменами Ь1 и Ь2 (остатки 1-468), слитый с 16-мерным участком С-конца (остатки 704-719) и которая заканчивалась С-концевой эпитопной меткой. Сообщалось, что этот ΙΟΕ-Ι-рецептор меньшего размера, который был лишен остатков 469-703, связывается с ΙΟΕ-Ι, хотя и менее прочно в сравнении с нативным полноразмерным ΙΟΕ-Ι-рецептором (Мо1ша, Ь. с1 а1., 2000, ЕЕВ8 Ьейегк, 467, 226-230; КпЧсшсп. С. с1 а1., 1999, I. В1о1. Сйеш., 274, 37251-37356). Таким образом, получали укороченную конструкцию альфа-цепи ΙΟΕ-Ιрецептора, содержащую остатки 1-468, слитые с С-концевым участком, который содержит остатки 704719 и фланкирован С-концевой эпитопной меткой тус. Конструировали стабильную клеточную линию, которая экспрессировала эту конструкцию и которая также экспрессирует эту конструкцию транзиторно в клетках 3Т3 эмбриональной почки человека. Наблюдали сильное связывание антитела ЕМ164 с этой конструкцией укороченной альфа-цепи ΙΟΕ-Ι-рецептора. Из двух испытанных антител, ΙΚ.3 (Са1Ыосйет) также связывалось с этой укороченной альфа-цепью, но антитело 1Н7 (8ап1а Стих Вю1ес11по1оду) не связывалось, что указывало на то, что эпитоп антитела ЕМ164 был явно отличающимся от эпитопа антитела 1Н7.

С. Ингибирование связывания ΙΟΕ-Ι с клетками МСЕ-7 антителом ЕМ164.

Связывание ΙΟΕ-Ι с клетками рака молочной железы человека ингибировали антителом ЕМ 164 (фиг. 3). Клетки МСЕ-7 инкубировали в присутствии или в отсутствие 5 мкг/мл антитела ЕМ 164 в течение 2 ч в бессывороточной среде с последующим инкубированием с 50 нг/мл биотинилированного ΙΟΕ-Ι в течение 20 мин при 37°С. Затем эти клетки промывали дважды бессывороточной средой для удаления несвязанного биотин-ΙΟΕ-Ι и затем лизировали в 50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, содержащем 1% ΝΡ-40 и ингибиторы протеаз. Ттти1оп-2НВ-планшет сенсибилизировали мышиным моноклональным антителом против бета-цепи ΙΟΕ-Ι-рецептора и использовали для захвата ΙΟΕ-Ι-рецептора и связанного биотин-ЮЕ-Ι из лизата. Связывание сенсибилизирующего антитела с цитоплазматическим С-концевым доменом бетацепи ΙΟΕ-Ι-рецептора не мешало связыванию биотин-ΙΟΕ-Ι с внеклеточным доменом ΙΟΕ-Ι-рецептора. Эти лунки промывали, инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена, опять промывали и затем детектировали с использованием субстрата АВТ8/Н₂О₂. Ингибирование ΙΟΕ-Ι-связывания с клетками МСЕ-7 антителом ЕМ 164 (5 мкг/мл) было по существу количественным и было почти эквивалентным связыванию фона ЕЫ8А, полученного с использованием контроля, не содержащего биотин-ΙΟΕ-Ι.

Кроме описанного выше анализа на ингибирование связывания ΙΟΕ-Ι с клетками МСР-7 антителом ЕМ164, следующий анализ показал, что антитело ЕМ164 было высокоэффективным в вытеснении связанного ΙΟΕ-Ι из клеток МСР-7, как это и желательно при физиологических условиях, чтобы антагонистическое антитело против ΙΟΕ-Ι-рецептора вытесняло связанный эндогенный физиологический лиганд (такой как ΙΟΕ-Ι или ΙΟΕ-ΙΙ). В этом анализе вытеснения ΙΟΕ-Ι клетки МСР-7, выращенные в 12луночном планшете, подвергали голоданию в бессывороточной среде и затем инкубировали с биотинилированным ΙΟΕ-Ι (20-50 нг/мл) в бессывороточной среде при 37°С (или при 4°С) в течение 1-2 ч. Затем эти клетки со связанным биотинилированным ΙΟΕ-Ι обрабатывали антителом ЕМ164 или контрольным антителом (10/100 мкг/мл) при 37°С (или при 0°С) в течение 30 мин - 1 ч. Затем клетки промывали ЗФР и лизировали в лизисном буфере, содержащем 1% ΝΡ-40, при 4°С. ЕМ8А проводили, как описано выше, для захвата ΙΟΕ-Ι-рецептора из лизата и затем детектирования биотинилированного ΙΟΕ-Ι, связанного с рецептором, с использованием конъюгата стрептавидин - пероксидаза хрена. Этот ЕЫ8А показал, что антитело ЕМ164 было способно вытеснять предварительно связанный биотинилированный ΙΟΕ-Ι из клеток почти полностью (90% в пределах 30 мин и ~ 100% в пределах 4 ч) при 37°С и приблизительно на 50% за 2 ч при 4°С. В другом эксперименте, клетки рака легкого ΝΟ-Η838 инкубировали с биотин-ΙΟΕ-Ι, затем промывали и инкубировали с антителом ЕМ164 при 4°С в течение 2 ч, что приводило к 80% уменьшению предварительно связанного биотин-ΙΟΕ-Ι. Таким образом, антитело ЕМ164 было высокоэффективным в вытеснении предварительно связанного биотин-ΙΟΕ-Ι из раковых клеток, что было бы важным терапевтически для антагонизма в отношении ΙΟΕ-Ι-рецептора вытеснением связанного эндогенного физиологического лиганда.

Инкубирование клеток МСΕ-7 с антителом ЕМ164 при 4°С в течение 2 ч (или при 37°С в течение 30 мин) не приводило к значимой понижающей регуляции ΙΟΕ-Ι-рецептора на основе Вестерн-блот-анализа с использованием антитела против бета-цепи ΙΟΕ-Ι-рецептора (8ап1а Сги/ Вю1ес11по1оду; §с-713), хотя более продолжительное инкубирование с антителом ЕМ164 при 37°С в течение 2 ч приводило к 25% понижающей регуляции ΙΟΕ-Ι-рецептора. Таким образом, ингибирование связывания ΙΟΕ-Ι и вытеснение связанного ΙΟΕ-Ι антителом ЕМ164 как при 4°С, так и при 37°С в этих экспериментах с коротким периодом времени не могут быть объяснены понижающей регуляцией рецептора вследствие связывания антитела ЕМ 164. Механизм сильного ингибирования связывания ΙΟΕ-Ι с ΙΟΕ-Ι-рецептором и вытеснения

- 15 009807 предварительно связанного ΙΟΡ-Ι антителом ЕМ164 является, по-видимому, конкуренцией за связывание, либо через наличие общего сайта связывания, либо через стерическую окклюзию, либо через аллостерические эффекты.

Ό. Ингибирование опосредованной ΙΟΕ-Ι-рецептором клеточной передачи сигнала антителом

ЕМ164.

Обработка клеток рака МСЕ-7 и клеток остеосаркомы 8аО8-2 антителом ЕМ164 почти полностью ингибировала внутриклеточную передачу сигнала ΙΟΡ-Ι-рецептора, как показано ингибированием автофосфорилирования ΙΟΡ-Ι-рецептора и ингибированием фосфорилирования его расположенных далее по ходу трансдукции сигнала эффекторов, таких как субстрат-1 рецептора инсулина (ΙΚ8-1), Ак1 и Егк1/2 (фиг. 4-6).

На фиг. 4, клетки МСЕ-7 выращивали в 12-луночном планшете в нормальной среде в течение 3 дней и затем их обрабатывали 20 мкг/мл антитела ЕМ164 (или контрольного анти-В4-антитела) в бессывороточной среде в течение 3 ч с последующей стимуляцией 50 нг/мл ΙΟΡ-Ι в течение 20 мин при 37°С. Затем эти клетки лизировали в охлажденном на льду лизисном буфере, содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз (50 мМ НЕРЕ8-буфер, рН 7,4, 1% ΝΡ-40, 1 мМ ортованадат натрия, 100 мМ фторид натрия, 10 мМ пирофосфат натрия, 2,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ лейпептин, 5 мкМ пепстатин, 1 мМ РМСЕ, 5 мМ бензамид и 5 мкг/мл апротинин). Планшет ЕЫ8А предварительно сенсибилизировали моноклональным антителом ТС123 против С-конца бета-цепи ингредиента и инкубировали с пробами лизата в течение 5 ч при температуре окружающей среды для захвата ΙΟΡ-Ι-рецептора. Затем лунки, содержащие захваченный ΙСЕ-1-рецептор, промывали и инкубировали с биотинилированным антифосфотирозин-антителом (ΡΥ20; 0,25 мкг/мл; ΒΌ Тгапкбисйоп БабогаЮпеД в течение 30 мин с последующими промывками и инкубированием с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (0,8 мкг/мл) в течение 30 мин. Лунки промывали и детектировали с использованием субстрата АВТ8/Н₂О₂. Использование контрольного анти-В4антитела не обнаруживало ингибирования ΙΟΡ-Ι-стимулируемого автофосфорилирования ΙΟΡ-Ιрецептора. В противоположность этому, полное ингибирование ΙΟΡ-Ι-стимулируемого автофосфорилирования ΙΟΡ-Ι-рецептора получали после обработки антителом ЕМ 164 (фиг. 4).

Для демонстрации ингибирования фосфорилирования субстрата-1 рецептора инсулина (ΙΚ8-1) использовали ЕЫ8А с применением иммобилизованного антитела против ΙΚ8-1 для захвата ΙΚ8-1 из лизатов с последующим измерением ассоциированной субъединицы р85 фосфатидилинозитол-3-киназы (ΡΙ3-киназы), которая связывается с фосфорилированным ΙΚ8-1 (Ьасккоп, Ю. с1 а1., 1998, 1. ΒίοΙ. Сйеш., 273, 9994-10003). На фиг. 5 клетки МСЕ-7 обрабатывали 5 мкг/мл антитела (ЕМ164 или ΙΚ3) в бессывороточной среде в течение 2 ч с последующей стимуляцией 50 нг/мл ΙΟΡ-Ι в течение 10 мин при 37°С. АнтиΙΚδ-1-антитело (кроличье поликлональное; ир51а1е Вю1ес11по1оду) непосредственно захватывалось посредством инкубирования нанесенным в виде покрытия козьим антителом против кроличьего ΙβΟ на ЕЫ8А-планшете, который затем использовали для захвата ΙΚ8-1 из проб клеточных лизатов инкубированием в течение ночи при 4°С. Затем эти лунки инкубировали с мышиным моноклональным антителом против р85-ΡI-3-киназы (Ир51а1е Вю1ес11по1оду) в течение 4 ч с последующей обработкой конъюгатом козьи антитела против мышиного ΙβΟ - НКР в течение 30 мин. Затем лунки промывали и детектировали с использованием субстрата АВТ8/Н₂О₂ (фиг. 5). Как показано на фиг. 5, антитело ЕМ164 было более эффективным в ингибировании ΙΟΡ-Ι-стимулируемого фосфорилирования ΙΚ8-1 при инкубировании с клетками в отсутствие ΙΟΡ-Ι.

Активация других эффекторов, находящихся ниже по ходу передачи сигнала, таких как Ак1 и Егк1/2, также ингибировалась зависимым от дозы образом антителом ЕМ164 в клетках 8аО8-2 (фиг. 6) и в клетках МСЕ-7, как было показано Вестерн-блотами лизатов и специфическими в отношении фосфорилирования антителами (кроличьими поликлональными антителами против фосфо-8ет⁴⁷³ Ак1 и поликлональными антителами против фосфо-ЕКК1/2; Се11 8щпа1тд Тесйпо1оду). Антитело против тотального ЕКК показало одинаковые нагрузки белка во всех дорожках (фиг. 6). Обработка клеток 8аО8-2 антителом ЕМ164 не ингибировала ЕОЕ-стимулируемое фосфорилирование Егк1/2 демонстрируя специфичность ингибирования пути передачи сигнала ΙΟΡ-Ι-рецептора антителом ЕМ 164.

Е. Ингибирование стимулируемого ΙΟΡ-Ι, ΙΟΡ-ΙΙ и сывороткой роста и выживания опухолевых клеток человека антителом ЕМ164.

Несколько линий опухолевых клеток человека испытывали в бессывороточных условиях на их реакцию роста и выживания на ΙΟΡ-Ι. Эти клеточные линии обрабатывали антителом ЕМ164 в присутствии ΙΟΡ-Ι, ΙΟΡ-ΙΙ или сыворотки и их реакции роста и выживания измеряли с использованием МТТ-анализа спустя 2-4 дня. Приблизительно 1500 клеток высевали в 96-луночном планшете в нормальной среде с сывороткой, которую заменяли бессывороточной средой на следующий день (либо бессывороточной средой КРМЕ дополненной трансферрином и БСА, либо не содержащей фенолового красного средой, описанной ИцЕоиту, В. е1 а1., 1997, I. Вю1. Сйеш., 272, 31163-31171). После одного для роста в бессывороточной среде эти клетки инкубировали с приблизительно 75 мкл 10 мкг/мл антитела в течение 30 мин 3 ч с последующим добавлением 25 мкл раствора ΙΟΡ-Ι (или ΙΟΡ-ΙΙ или сыворотки) с получением конечной концентрации 10 нг/мл ΙΟΡ-Ι или 20 нг/мл ΙΟΡ-ΙΙ или 0,04-10% сыворотки. В некоторых экспериментах эти клетки стимулировали сначала ΙΟΡ-Ι в течение 15 мин перед добавлением антитела ЕМ164, или

- 16 009807 добавляли вместе как ЮЕ-Ι, так и антитело ЕМ164. Затем клеткам давали расти в течение следующих 2-3 дней. Затем добавляли раствор МТТ (бромида 3-(4,5)-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия; 25 мкл 5 мг/мл раствора в ЗФР) и эти клетки возвращали в термостат на 2-3 ч. Затем среду удаляли и заменяли 100 мкл ДМСО, смешивали и измеряли оптическую плотность этого планшета при 545 нм. Несколько линий опухолевых клеток человека обнаружили реакцию роста и выживания после добавления ЮЕ-Ι или ЮЕ-ΙΙ или сыворотки, которая значимо ингибировалась антителом ЕМ164, независимо от того, добавляли антитело до ЮЕ-Ι или ЮЕ-Ι добавляли до антитела или как ЮЕ-Ι, так и антитело добавляли вместе (табл. 1).

Таблица 1. Ингибирование ЮЕ-Ьстимулируемого роста и выживания опухолевых клеток антителом ЕМ164

Тип опухолевых клеток	Реакция роста на ЮР-1 (МТТ-анализ: отношение ЮР-1обработанных клеток к необработанным клеткам в бессывороточной среде (в указанное число раз)а	% ингибирования антителом ЕМ 164 ЮР-1стимулируемого роста в бессывороточной среде	Ингибирование антителом ЕМ 164 роста/выживания клеток в 1,25-10 % сыворотке5
МСР-7 (молочная железа)	1.7-2.8	100%	85%
НТ-3 (шейка матки	2	70-90%	ΝΌ
Со1о 205 (ободочная кишка))	2.3	50%	да
НТ-29	1.5	60%	да
ИС1-Н838 (легкое)	3	100%	85-90 %
Са1и-6	1.6-1.8	85%	да
зк-ьи-1	1.4	100%	нет
N0144596	1.4	100%	Аеак1у
А 549	1.2	80%	N1)
А 375 (меланома)	Е6	90%	нет
8К-Ме1-37	1.4	85%	Νϋ

КО (рабдомиосаркома)	1.7	85-100 %	да
8аО8-2 (остеосаркома)	2.5	100%	да
А 431 (эпидермоид)	2.2	85%	да
8Κ-Ν-8Η (нейробластома)	2	85%	30-50 %

^а МТТ-анализ 3-4-дневного роста/выживания клеток в реакции на 10 нг/мл ЮЕ-Ι в бессывороточной среде, содержащей 5-10 мкг/мл антитела ЕМ 164 ^Ь Ингибирование роста клеток в 1,25-10% сыворотке в присутствии 5-10 мкг/мл антитела ЕМ164 в соответствии с МТТ-анализом или анализом образования колоний на основании сравнения с контролем (с сывороткой, но без антитела); степень ингибирования количественно измеряли для клеток МСЕ-7, ΝΟΙ-Η838 и 8Κ-Ν-8Η в расчете на контроли (без сыворотки, но с антителом и с сывороткой, но без антитела) для объяснения аутокринной/паракринной ЮЕ-стимуляции клетками. ΝΏ указывает отсутствие данных или плохие данные вследствие трудностей окрашивания.

Антитело ЕМ 164 сильно ингибировало стимулируемые ЮЕ-Ι или сывороткой рост и выживание клеток МСЕ-7 рака молочной железы (фиг. 7 и 8). В отдельном эксперименте антитело ЕМ 164 сильно ингибировало стимулируемые ЮЕ-ΙΙ рост и выживание клеток МСЕ-7. Предыдущие сообщения с использованием коммерчески доступных антител, таких как антитело ΙΚ.3, показали только слабое ингибирование стимулируемых сывороткой роста и выживания клеток МСЕ-7, как подтверждено на фиг. 7 для антител ΙΕ3 и 1Н7 (Си11еи, К.1. е! а1., 1990, Саисег Яек., 50, 48-53). В противоположность этому, антитело ЕМ 164 было сильным ингибитором стимулируемого сывороткой и ЮЕ-Ι роста клеток МСЕ-7. Как показано на фиг. 8, антитело ЕМ164 было одинаково эффективным в ингибировании роста и выживания клеток МСЕ-7 в широком диапазоне концентраций сыворотки (0,04-10% сыворотка).

Ингибирование роста клеток МСЕ-7 антителом ЕМ164 измеряли подсчетом клеток. Так, в 12

- 17 009807 луночном планшете приблизительно 7500 клеток высевали в среде КΡМI с 10% ФТС, в присутствии и в отсутствие 10 мкг/мл антитела ЕМ164. После 5 дней роста количество клеток для необработанной контрольной пробы было равно 20,5 х 10⁴ клеток, в противоположность количеству клеток только 1,7 х 10⁴ клеток для обработанной антителом ЕМ 164 пробы. Обработка антителом ЕМ 164 ингибировала рост клеток МСЕ-7 приблизительно в 12 раз за 5 дней. Это ингибирование антителом ЕМ164 было значимо большим, чем сообщенное ингибирование в 2,5 раза с использованием антитела ΙΕ3 в 6-дневном анализе для клеток МСЕ-7 (КоЫ1к, ф.Т. е! а1., 1987, ВюсНет. Вюрйук. Кек. Соттип., 149, 276-281).

Стимулируемые ЮЕ-Ι и сывороткой рост и выживание линии клеток немелкоклеточного рака легкого N0-4838 также сильно ингибировались антителом ЕМ164 в сравнении с контрольным антителом В4 (фиг. 9). Обработка антителом ЕМ164 в бессывороточной среде давала меньший сигнал, чем необработанная проба как для клеток НО-Н838, так и для клеток МСЕ-7, предположительно вследствие того, что антитело ЕМ 164 ингибировало также аутокринную и паракринную стимуляцию ЮЕ-Ι и ЮЕ-ΙΙ этих клеток (фиг. 7 и 9). Размер колоний клеток рака ободочной кишки НТ29 был также значительно уменьшен после обработки антителом ЕМ164.

Таким образом, в антитело ЕМ164 является уникальным среди всех известных антител против ЮЕΙ-рецептора по его эффективности в ингибировании стимулируемого сывороткой роста опухолевых клеток, таких как клетки МСЕ-7 и N0-4838, на более, чем 80%.

Антитело ЕМ 164 вызывало задержку роста в фазе С0/С1 клеточного цикла и устраняло митогенное действие ЮЕ-Ι. Для анализа клеточного цикла клетки МСЕ-7 обрабатывали ЮЕ-Ι (20 нг/мл) в присутствии или в отсутствие ЕМ164 (20 мкг/мл) в течение 1 дня и затем анализировали окрашивание иодидом пропидия и проточной цитометрией. Как показано на фиг. 25, прохождение клеточного цикла клетками в ответ на стимуляцию ЮЕ-Ι в отсутствие ЕМ164 (с 41% этих клеток в 8-фазе и 77% этих клеток с С0/С1фазе) подавлялось в ЕМ164-обработанных клетках (с только 9% в 8-фазе и 77% этих клеток в 00/01 фазе).

Кроме ингибирования пролиферации клеток обработка антителом ЕМ164 приводила к апоптозу клеток. Для измерения апоптоза расщепление белка цитокератина СК18 каспазой измеряли в клетках рака легкого N0-4^838, инкубированных с: ЮЕ-Ι или сывороткой в присутствии или в отсутствие ЕМ164, для дня 1 (фиг. 26). В отсутствие ЕМ164 добавление ЮЕ-Ι или сыворотки приводило к более низкому сигналу расщепленного каспазой СК 18 в сравнении с контролем без ЮЕ-Ι, что указывало на то, что ЮЕ-Ι и сыворотка предотвращают активацию каспазы. Обработка антителом ЕМ 164 подавляла антиапоптотические действия ЮЕ-Ι и сыворотки, как показано более высокими уровнями расщепленного СК18, полученными в присутствии ЕМ164, чем в отсутствие ЕМ164 (фиг. 26).

Е. Синергическое ингибирование антителом ЕМ164 роста и выживания опухолевых клеток человека в комбинациях с другими цитотоксическими и цитостатическими агентами.

Комбинированное введение антитела ЕМ164 с таксолом было значимо более ингибиторным в отношении роста и выживания клеток немелкоклеточного рака легкого Са1и6, чем один таксол. Подобным образом, комбинация антитела ЕМ164 с камптотецином была значительно более ингибирующей, чем один камптотекцин, в отношении роста и выживания клеток рака ободочной кишки НТ29. Поскольку не ожидалось, что одно антитело ЕМ164 является таким же токсичным в отношении клеток, как органические хемотоксичные лекарственные средства, синергизм между преимущественно цитостатическим действием антитела ЕМ164 и цитотоксическим действием хемотоксичного лекарственного средства мог быть высокоэффективным в комбинации раковых терапевтических веществ в клинических условиях.

Комбинированное действие антитела ЕМ164 с антителом против ЮЕ-Ьрецептора (К877) было значимо более ингибиторным, чем одного антитела ЕМ164 или одного антитела К877, на рост и выживание нескольких линий опухолевых клеток, таких как клетки НТ-3, клетки КИ, клетки МСЕ-7 и клетки А431. Таким образом, синергическое действие комбинирования нейтрализующих антител для двух рецепторов фактора роста, таких как ЮЕ-Ьрецептор и ЕСЕ-рецептор, может быть также применимым в клиническом лечении рака.

На основе эффективности антитела ЕМ164 в виде единственного агента в ингибировании пролиферации и выживания различных линий раковых клеток человека, показанной в табл. 1, проводили дополнительные исследования эффективности с использованием комбинаций антитела ЕМ164 с другими противораковыми терапевтическими агентами. В этих исследованиях на различных линиях раковых клеток комбинированная обработка антителом ЕМ164 и другими противораковыми терапевтическими агентами приводила к даже более высокой противораковой эффективности, чем с использованием либо ЕМ164, либо другого терапевтического агента по отдельности. Таким образом, комбинации ЕМ164 с другими терапевтическими агентами являются высокоэффективными в ингибировании пролиферации и выживания раковых клеток. Терапевтическими агентами, которые могут комбинироваться с ЕМ164 для улучшенной противораковой эффективности, включают в себя разнообразные агенты, используемые в онкологической практике (Ссылка: Сапсег, Рг1пс1р1ез & Ргасйсе о£ 0псо1оду, ИеУйа, У.Т., Не1тап, 8., КокепЬегд, 8.А., 6'¹' ебйюп, ^^рреηсой-Каνеη, РЫ1абе1рЫа, 2001), такие как доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, эпирубицин, циклофосфамид, трастузумаб (Негсерйп), капецитабин, тамоксифен, торемифен, летрозол, анастрозол, фулвестрант, экземестан, госерелин, оксалиплатин, карбоплатин, цисплатин, дек

- 18 009807 саметазон, антид, бевацизумаб (Ауазйп), 5-фторурацил, лейковарин, левамизол, иринотекан, этопозид, топотекан, гемцитабин, винорелбин, эстрамустин, митоксантрон, абареликс, золедронат, стрептозоцин, ритуксимаб (Кйихап), идарубицин, бусульфан, хлорамбуцил, флударабин, иматиниб, цитарабин, ибритумомаб (2еуа11п), тозитумомаб (Веххаг), интерферон альфа-2Ь, мелфолам, бортезомиб (Уе1сайе), алтретамин, аспарагиназа, гефитиниб (1гез5а), эрлонитиб (Тагсеуа), антитело против ЕОЕ-рецептора (СеФхйтаЬ, АЬх-ЕОЕ), эпотилоны и конъюгаты цитотоксических лекарственных средств и антител против рецепторов клеточной поверхности.

Для этих комбинированных способов терапии ЕМ164 комбинируют с одним или несколькими противораковыми агентами различных механизмов действия, такими как алкилирующие агенты, содержащие платину агенты, гормональные терапевтические агенты, антиметаболиты, ингибиторы топоизомеразы, антимикробные агенты, агенты дифференцировки, антиангиогенные агенты или агенты, действующие против васкуляризации, лучевая терапия, агонисты и антагонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ЪНКН) или гонадотропин-рилизинг-гормона (ОпКН) и другие химиотерапевтические агенты (Ссылка: Сапсег, Ргшс1р1ез & Ргасйсе о£ Опсо1оду, ОеУйа, У.Т., Не1тап, 8., КозепЬегд, 8.А., 6^4Ь еййюп, Ыррепсой-Кауеп, РЫ1айе1рЫа, 2001). В одном варианте осуществления, комбинация антагониста ЬНКН антида (0,1-10 микромолярного) и антитела ЕМ164 (0,1-10 наномолярного) ингибировала пролиферацию раковых клеток молочной железы МСЕ-7 значительно в большей степени, чем в случае либо одного ЕМ164, либо одного антида. В примере комбинированной терапии с содержащим платину агентом, эта комбинированная обработка антителом ЕМ164 (10 мкг/мл) и цисплатином (0,1-60 мкг/мл) приводила к большему ингибированию пролиферации и выживания раковых клеток молочной железы МСЕ7 в сравнении с ингибированием либо одним антителом ЕМ164, либо одним цисплатином.

Эти комбинации антитела ЕМ164 с другими терапевтическими агентами являются эффективными против нескольких типов раков, в том числе рака молочной железы, легкого, ободочной кишки, поджелудочной железы, шейки матки, яичника, меланомы, множественной миеломы, нейробластомы, рабдомиосаркомы и остеосаркомы. Антитело ЕМ164 и этот терапевтический агент могут вводиться для раковой терапии либо одновременно, либо последовательно.

Конъюгаты антитела ЕМ164 с цитотоксическими лекарственными средствами также являются ценными в нацеленной доставке цитотоксических лекарственных средств к опухолям, сверхэкспрессирующим ЮЕ-1-рецептор. Конъюгаты антитела ЕМ164 с радиоактивными метками могут быть использованы в лечении и визиографии опухолей, которые сверхэкспрессируют ЮЕ-1-рецептор.

О. Действие обработки ЕМ164, в качестве единственного агента или в комбинации с противораковыми агентами, в раковых ксенотрансплантатах человека в иммунодефицитных мышах.

Ксенотрансплантаты немелкоклеточного рака человека Са1и-6 прививали в иммуно дефицитным мышам подкожными инъекциями 1х10⁷ клеток Са1и-6. Как показано на фигуре 10, мышей, содержащих привитые ксенотрансплантаты Са1и-6 100 мм³, обрабатывали одним антителом ЕМ 164 (6 инъекций 0,8 мг/мышь, ί.ν., два раза в неделю) или одним таксолом (пять инъекций таксола, 1.р., каждые два дня; 15 мг/кг) или комбинацией обработок таксолом и антителом ЕМ 164 или одним ЗФР (200 мкг/мышь, 6 инъекций, два раза в неделю, ί.ν.) с использованием пяти мышей на группу обработки. Рост опухолей значимо замедлялся обработкой антителом ЕМ 164 на основании измерений массы этих мышей. Хотя обработка одним таксолом была эффективной до дня 14, затем эта опухоль снова начинала расти. Однако рост опухоли значимо задерживался в группе, которую обрабатывали комбинацией таксола и антитела ЕМ164, в сравнении с группой, которую обрабатывали одним таксолом.

Ксенотрансплантаты поджелудочной железы человека прививали 5-недельным самкам мышей 8СГО/1СК (Та1сошс) подкожными инъекциями 10⁷ клеток ВхРС-3 в ЗФР (день 0). Затем мышей, несущих привитые опухоли 80 мм³, обрабатывали одним ЕМ164 (13 инъекций 0,8 мг/мышь, ί.ν., в латеральную хвостовую вену, в дни 12, 16, 19, 23, 26, 29, 36, 43, 50, 54, 58, 61 и 64), одним гемцитабином (две инъекции 150 мг/кг/мышь, 1.р. в дни 12 и 19), комбинацией гемцитабина и ЕМ164 в соответствии с вышеуказанными схемами введения, одним ЗФР и одним контрольным антителом (в соответствии со схемами, приведенными для ЕМ164) с использованием пяти мышей в каждой из пяти групп обработки. Как показано на фиг. 27, обработка одним ЕМ164 или в комбинации с гемцитабином приводила к общему регрессу опухолевых ксенотрансплантатов в 4 из 5 животных в группе обработки ЕМ164 и во всех 5 животных в группе обработки комбинацией. Измеримое возобновление роста опухоли наблюдали только в более, чем одном животном, в день 43 в группе ЕМ164 и в день 68 в группе обработки комбинацией, приводящее к значимо меньшим средним объемам опухолей в день 74 в сравнении с контрольными обработками (Р = 0,029 и 0,002, соответственно; двухсторонний Т-критерий; фиг. 27). В другом исследовании, обработка антителом ЕМ164 (одним или в комбинации с антитело против ЮЕ-1-рецепторам; внутрибрюшинные инъекции) ингибировала рост привитых ксенотрансплантатов ВхРС-3 в мышах.

Мышиные ЕМ164 и гуманизированные антитела ЕМ164 показали эквивалентное ингибирование роста привитых ксенотрансплантатов ВхРС-3 в мышах, демонстрируя, следовательно, что эффективность гуманизированного ЕМ 164 является эквивалентной эффективности мышиного ЕМ164 ίπ νί\Ό. В сравнении с различными способами введения антитела ЕМ164, как внутрибрюшинное, так и внутривенное введения антитела ЕМ164 показали эквивалентное ингибирование роста привитых ксенотрансплан- 19 009807 татов ВхРС-3 в мышах. В другом исследовании с ксенотрансплантатами обработка антителом ЕМ164 обнаруживала значимую задержку роста привитых ксенотрансплантатов рабдомиосаркомы человека А673/саркомы Эвинга в мышах.

Н. Клонирование и секвенирование легкой и тяжелой цепей антитела ЕМ164.

Тотальную РНК очищали из гибридомных клеток ЕМ164. Реакции обратной транскриптазы выполняли с использованием 4-5 мкг тотальной РНК и либо олиго-бТ, либо случайных гексамерных праймеров.

ПЦР-реакции выполняли с использованием способа КАСЕ (быстрой амплификации концов кДНК), описанного в Со е! а1. (1. Iттиηο1., 148, 1149-1154 (1992)), и с использованием вырожденных праймеров, описанных в Аапд е! а1. (1. Тттипо1. Ме!йобк, 233, 167-177 (2000). Способ ПЦР КАСЕ требовал промежуточной стадии добавления поли С-хвоста на 3'-концах кДНК первых цепей. ОТ-реакционные смеси очищали с использованием колонок О1апеаку (О1адеп) и элюировали в 50 мкл 1Х№В-буфера 4. Реакция присоединения бС-хвоста выполняли на элюате с использованием 0,25 мМ СоС1₂, 2 мМ бСТР и 5 единиц терминальной трансферазы (ΝΉΒ) в 1 X ΝΉΒ-буфере 4. Эту смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин и затем 1/5 этой реакционной смеси (10 мкл) добавляли непосредственно в ПЦР-реакцию, где она служила в качестве ДНК-матрицы.

КАСЕ- и вырожденные ПЦР-реакции были идентичными, за исключением различий в праймерах и матрицах. Реакцию терминальной трансферазы использовали непосредственно для матрицы КАСЕ-РСК, тогда как реакционную смесь ОТ-реакции использовали непосредственно для вырожденных ПЦРреакций.

Как в КАСЕ-, так и в вырожденных ПЦР-реакциях использовали один и тот же 3'-праймер легкой цепи:

НтбКЬ - !а!ададс!саадс!!дда!дд!дддаада!дда!асад!!дд!дс (8Е0 ΙΌ N0:14) и 3'-праймер тяжелой цепи: Β§12Ι^1 - ддаада!с!аХадасада!ддддд!д!сдаЛддс (8Е0 ΙΌ N0:15).

В КАСЕ-ПЦР один поли С-5'-праймер использовали как для тяжелой, так и для легкой цепи:

ЕсоРо1уС - ТАТАТСТАСААТТССССССССССССССССС (ЛЮ ΙΌ N0:16), тогда как вырожденными 5'-концевыми праймерами были:

8ас1МК - СССАССТССАУАТТСТСМТ8АСМСАКАСТМСА (ЛЮ ΙΌ N0:17) для легкой цепи и равная смесь из:

ЕсоКГМН1 - СТТССССААТТС8АКСтаМАССТС8АС8АСТС (ЛЕО ΙΌ N0:18) и

ЕсоКГМН2 - СТТСС66ЛЛТТС8ЛК6ТХМЛ6СТ68Л68Л6ТСА66 (ЛЮ ΙΌ N0:19) для тяжелой цепи.

В приведенных выше последовательностях праймеров смешанные основания определены следующим образом: Н=А+Т+С, 8=С+С, У=С+Т, К=С+Т, М=А+С, К=А+С, А=А+Т, У=А+С+С.

ПЦР-реакции вьшолняли с использованием следующей программы: 1) 94°С 3 мин, 2) 94°С 15 с, 3) 45°С 1 мин, 4) 72°С 2 мин, 5) цикл опять до стадии №2 29 раз, 6) окончание с конечной стадией удлинения при 72°С в течение 10 мин.

ПЦР-продукты клонировали в ρΒ1ικΝπρΙ ΙΙ 8К+ (ЛпИадепе) с использованием рестрикционных ферментов (рестриктаз), созданных этими ПЦР-праймерами.

Несколько отдельных клонов легкой и тяжелой цепи секвенировали общепринятыми способами для идентификации и с целью избежать возможных ошибок генерированной полимеразой последовательности (фиг. 12 и 13). С использованием определений канонической классификации Сбо!Ыа были идентифицированы СОК трех легких цепей и тяжелых цепей (фиг. 12-14).

Поиск с использованием базы данных NСΒI ΙβΒΕικΙ показал, что вариабельная область легкой цепи антитела против ЮРЛ-рецептора, возможно, происходила из гена мышиной зародышевой линии Ι^νΕ Сг1, тогда как вариабельная область тяжелой цепи, возможно, происходила из гена зародышевой линии Ι§ν6 1558.с (фиг. 15).

Секвенирование белка мышиного антитела ЕМ164 выполняли для подтверждения последовательностей, показанных на фиг. 12 и 13. Полосы белков тяжелой и легкой цепей очищенного антитела ЕМ164 переносили на мембрану ΡνΩΕ из геля (ДСН-ПААГ, восстанавливающие условия), вырезали из мембраны ΡνΩΕ и анализировали путем секвенирования белковой последовательности. Было определено секвенированием по Эдману, что Л-концевая последовательность легкой цепи представляет собой: ПУБМТ0ТРЬ8 (8Е0 ΙΌ N0:20), которая соответствует ^концевой последовательности клонированного гена легкой цепи из гибридомы ЕМ164.

Было обнаружено, что №конец тяжелой цепи является блокированным для секвенирования белка по Эдману. Пептидный фрагмент расщепления трипсином тяжелой цепи с массой 1129,5 (М+Н+, моноизотопный) фрагментировали при помощи рок!-коигсе бесау (Ρ8Ό), и было определено, что его последовательность представляет собой СКРЭУУСЗЛХ (8Е0 ΙΌ N0:21). Другой пептидный фрагмент триптического расщепления тяжелой цепи с массой 2664,2 (М+Н+, моноизотопный) был также фрагментирован при помощи рок!-коигсе бесау (Р8О), и было определено, что его последовательность представляет собой 888ТАΥМ^^88^Т8Е^8АVΥΥΕΆΚ (8Е0 ΙΌ N0:22. Обе эти последовательности точно соответствуют последовательностям С0К3 и каркаса 3 (РК3) клонированного гена тяжелой цепи, полученного из гиб- 20 009807 ридомы ЕМ164.

I. Рекомбинантная экспрессия антитела ЕМ164.

Парные последовательности легкой и тяжелой цепей клонировали в единый экспрессионный вектор млекопитающего (фиг. 16). ПЦР-праймеры для вариабельных последовательностей человека создавали сайты рестрикции, которые позволяли присоединяться сигнальной последовательности человека в клонирующем векторе рВ1ие8спрШ, и эти вариабельные последовательности клонировали в экспрессионную плазмиду млекопитающего с использованием сайтов Ε^ΒΙ и ΒδίΧνί или НтбШ и Ара1 для легкой цепи или тяжелой цепи, соответственно (фиг. 16). Вариабельные последовательности легкой цепи клонировали в рамке считывания в константную область 1дК человека, а вариабельные последовательности тяжелой цепи клонировали в последовательность константной области 1ду1 человека. В конечных экспрессионных плазмидах, промоторы СМУ человека запускали экспрессию кДНК-последовательностей как легкой, так и тяжелой цепей. Экспрессию и очистку рекомбинантного мышиного антитела ЕМ 164 выполняли в соответствии со способами, которые хорошо известны в данной области.

Пример 2. Гуманизированные версии антитела ЕМ 164.

Перестраивание поверхности антитела ЕМ164 для обеспечения гуманизированных версий в качестве терапевтических или диагностических агентов обычно выполняли в соответствии с принципами и способами, описанными в Патенте США 5639641, следующим образом.

А. Предсказание поверхности.

Доступность для растворителя остатков вариабельной области для ряда антител с расшифрованными структурами использовали для предсказания поверхностных остатков для вариабельной области мышиного антитела против 1СР-1-рецептора (ЕМ164). Доступность аминокислот для растворителя для набора из 127 файлов уникальных структур антител (табл. 2) рассчитывали с использованием пакета программ МС (Ребегзеп е1 а1., 1994, Г Βίο1. Сйет., 235, 959-973). Десять наиболее сходных аминокислотных последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи из этого набора из 127 структур определяли при помощи выравнивания последовательностей. Среднюю доступность для растворителя для каждого остатка вариабельной области рассчитывали и считали, что положения с большей, чем 30% средней доступностью, являются поверхностными остатками. Положения со средними доступностями между 25 и 35% дополнительно исследовали расчетом доступности индивидуального остатка только для структур с двумя идентичными фланкирующими остатками.

Таблица 2. 127 структур антител из базы данных Β^οοкЬаνеη, используемые для предсказания поверхности антитела против 1СР-1-рецептора (ЕМ 164)

Файлы структур Вгоокйауеп, использованные для предсказаний последовательности

2ГСЗ	ЗЫ1	ЗЬйп	1аИ	1аЗг		43с9	4£аЬ	6£аЬ	7£аЬ
2дй>	2Ыр	2ЬЙ	1а61	1ах1	1ЬО£	2кгр	2]е1	2тср	2рср
1уи11	26£ν	2с§г	8£аЪ	1ае6	ΙΒνΙ	26Ы	2П9	2£Ь4	2£Ь]
15тЗ	Ие1	1ν&	е1Ь2	1а4]	1с1у	1«§е	1уес	1уеб	1уее
1П5П	1ор§	1О5р	1а]7	1ау1	1С12	1р1е	1рзк	1гт£	1зЬз
1псб	1п£б	1П£Р	1асу	1а£у	1сЪу	1п1б	1пта	1птЬ	ΙηςΒ
1тср	1т1Ъ	1тпп	15с8	1а5£	1ахз	1т1Ь	1тра	Ιιών	1псЬ
ЦгЬ	1кЪ5	1ке1	1ар2	1Β2\ν	1абд	Шр	Шг	11νε	1тат
	Н§т	ΐί§ι	1абО	1Ьа£	Ιοίν		Ик£	Це1	ЦЫ
1дро	Ш1	1Ьух	1аОц	Пут	1с1о	Наг	НЬд	11£С	1ίβ£
Ιίρί	1£гд	Ιίνο	1ацк	1Ып	165Ь	1да£	Ιββί	1еьг
1£а1	1йм	1Г61	1аб9	1ЬЬб	1£58	1ί§ν		1Йг	1£ог
	16Ы	1б£Ь	1а31	1Ъ£о	кар	НзГ	16νί

B. Молекулярное моделирование.

Молекулярную модель мышиного ЕМ 164 генерировали с использованием пакета программ ΟχΓογ6 ΜοΕαιΓίΓ κοΓΐ раскаде АЬМ. Каркас антитела строили из файлов структур для антител с наиболее сходными аминокислотными последовательностями, которыми были 2_)е1 для легкой цепи и 1пс|Ь для тяжелой цепи. Неканонические СЭВ встраивали с использованием поиска в базе данных С-а-структур, содержащей неизбыточные расшифрованные структуры. Определяли остатки, которые лежат в 5А от СЭВ.

C. Отбор АЬ человека.

Поверхностные положения мышиного ЕМ164 сравнивали с соответствующими положениями последовательностей антител человека в базе данных КаЬа1 (ΙοΠΗδοό, С. апб ^и, Т.Т. (2001) Ыис1е1с Аабз

- 21 009807

Векеагсй, 29: 205-206). Программу 8В управления базой данных антител (8еаг1е 1998) использовали для извлечения и сопоставления поверхностных остатков антител из природных пар тяжелых и легких цепей антител человека. Поверхность антитела человека с наиболее идентичными поверхностными остатками с особым обращением внимания на положения, которые находятся в пределах 5А от СОВ, были выбраны для замены поверхностных остатков мышиного антитела против ΙΟΕ-Ι-рецептора.

Ό. ПЦР-мутагенез.

ПЦР-мутагенез выполняли на кДНК-клоне мышиного ЕМ164 (см. выше) для построения переделанного на поверхности антитела ЕМ 164 человека (здесь ИиЕМ164). Наборы праймеров конструировали для получения 8 аминокислотных замен, требуемых для всех испытанных версий ИиЕМ164, и конструировали дополнительные праймеры для альтернативного создания двух замен остатков в пределах 5А (табл. 3). ПЦР-реакции выполняли с использованием следующей программы: 1) 94°С 1 мин, 2) 94°С 15 сек, 3) 55°С 1 мин, 4) 72°С 1 мин, 5) цикл опять до стадии №229 раз, 6) окончание с конечной стадией удлинения при 72°С в течение 4 мин. ПЦР-продукты расщепляли их соответствующими рестриктазами и клонировали в клонирующие векторы рВ1ие8спр1. как описано выше. Клоны секвенировали для подтверждения желаемых аминокислотных замен.

Таблица 3. ПЦР-праймеры, используемые для конструирования 4 гуманизированных антител ЕМ164

Праймер	Последовательность	8Ер ГО ΝΟ:
Ειη1641ιονν	САСОТСТАСАСТСССАООТССААСТООТОСАОТСТОООО СТОААОТООТОААОССТО	23
Вт 16411044^011	СААТСАОААОТТССАОСбОААССССАСАС	24
Еш] 641ΐ€ςς§ο12	СбТССССТООААСгТСТОАТТОТАСТТАОТАСО	25
Ет1641стЗ	САОСТбТАСАСТССОАТбТТСТСАТОАСССАААСгСС	26
ЕШ1641С13	САООТСТАСАСТССОАТбТпТСАТОАСССАААСТСС	27
Еш1641ср18	САСгАСАТСТОСААОАОАТОСАСССгСОАТСТССААВАС	28
Ет1641сЬ§12	ТТОСАОАТСТАОТСАОАОСАТАСТАСАТАОТААТО	29
Ет164т45	бААТООТАССгОСАСАААССАССССАОТСТССААСССгС СТСАТСТАС	30
Ет164а67о11	СТОССАОТООАОСА6ООАСАОАТТТСАС	31
Ет164а67о12	САААТСТ6ТСССТССТССАСТ6ССАСТС	32

Е. Остатки поверхности вариабельной области.

Способы перестройки поверхности антител, описанные Ребегкеп е! а1. (1. Вю1. СИет., 235, 959-973, 1994) и Водикка е! а1. (Рго1ет Епд., 9, 895-904, 1996), начинаются предсказанием остатков поверхности вариабельных последовательностей мышиного антитела. Остатком поверхности считают аминокислоту, которая имеет по меньшей мере 30% ее общей площади поверхности, доступной для молекулы воды.

Были идентифицированы 10 наиболее гомологичных антител в наборе из 127 файлов структур антител (фиг. 17 и 18). Доступность для растворителя каждого положения КаЬа! усредняли для этих выровненных последовательностей, и распределение относительных доступностей для каждого остатка было таким, какое показано на фиг. 19. Как легкая, так и тяжелая цепи имеют 26 остатков со средними относительными доступностями по меньшей мере 30% (фиг. 19); таким образом, эти остатки являются предсказанными остатками поверхности для ЕМ164. Несколько остатков имели средние доступности между 25 и 35%, и их дополнительно исследовали усреднением только антител с двумя идентичными остатками, фланкирующими каждую сторону данного остатка (табл. 4 и 5). После этого дополнительного анализа исходный набор поверхностных остатков, который был идентифицирован выше, оставался неизменным.

- 22 009807

Таблица 4. Поверхностные остатки и средняя доступность (ср. дост.) для вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепей антитела ЕМ 164

Остатки поверхности ЕМ 164
Легкая цепь	Тяжелая цепь
ЕМ164	№ КаЬа1	Ср. дост.	ЕМ 164	№ КаЬа!	Ср. дост.
ϋ	1	45.89	Ω	1	58.19
Ь	3	41.53	Ω	3	34.08
Т	7	31.40	Ω	5	34.36
Ь	9	50.08	А	9	38.01
Ь	15	35.45	Ь	11	47.72
0	18	39.79	К	13	46.51
К	24	34.36	Р	14	31.49
8	26	32.63	О	15	31.42
Ω	27	34.35	к	19	34.41
N	28	36.38	к	23	31.23
Р	40	43.05	т	28	36.24
О	41	46.56	Р	41	44.01
0	42	34.92	О	42	42.62
к	45	30.58	Ω	43	46.85
8	52	30.40	Е	61	46.68
8	56	41.46	К	62	44.87
О	57	42.41	К	64	38.92
О	60	45.96	К	65	40.06
8	67	38.20	К	73	35.92
К	77	42.61	8	74	48.91
Е	81	38.46	8	82В	32.72
V	95Е	34.83	8	84	35.21
К	103	31.10	Е	85	39.62
К	107	36.94	ϋ	98	36.00
К.	108	60.13	А	106	37.65
А	109	53.65	8	113	43.42

Таблица 5

Остатки границы поверхности
Легкая цепь	Тяжелая цепь
ЕМ164	№ КаЬа!	Ср. дост.	ЕМ164	№ КаЬа!	Ср. дост.
т	5	28.68	Ω	3	31.62
т	7	30.24	Ω	5	36.07
Р	12	26.59	Р	14	29.88
о	16	25.20	О	15	30.87
о	17	25.73	8	17	25.64
8	20	25.37	К	19	35.06
К	24	36.73	К	23	31.48
8	26	31.00	О	26	30.53
<2	27	32.29	8	31	27.12
8	27А	29.78	К	56	ΝΑ
V	27С	29.05	т	68	27.71
V	29	ΝΑ	т	70	24.65
Ω	42	34.92	8	75	18.80
к	45	32.24	8	82В	32.87
8	52	30.02	Р	97	ΝΑ
К.	54	29.50	Υ	99	ΝΑ
ϋ	70	26.03	V	103	ΝΑ
К.	74	ΝΑ	т	111	25.95
Е	79	26.64
А	80	29.61
V	95Е	42.12
О	100	29.82
К	103	31.10
Е	205	25.78

Остатки, которые имеют средние доступности между 25% и 35%, дополнительно анализировали усреднением субпопуляции антител, которые имеют два идентичных остатка, фланкирующих каждую сторону рассматриваемого остатка. NА обозначает остатки, не имеющие идентичных фланкирующих

- 23 009807 остатков в 10 наиболее сходных антителах.

Е. Молекулярное моделирование для определения, какие остатки попадают в пределы 5А от СОК.

Описанную выше молекулярную модель, генерированную с использованием пакета программ АЬМ, анализировали для определения, какие остатки поверхности ЕМ164 были в пределах 5А от СОК. Для переделывания поверхности мышиного антитела ЕМ164 все остатки поверхности, находящиеся вне СОК, должны быть заменены копиями человека, но остатки в пределах 5А от СОК обрабатывали с особой осторожностью, так как они могут также вносить вклад в антигенную специфичность. Таким образом, эти последние остатки должны быть идентифицированы, и к ним следует осторожно относиться в ходе всего процесса гуманизации. Определения СОК, используемые для переделывания поверхности, объединяют АЬМ-определение для СОК 2 тяжелой цепи и определения КаЬа! для остальных 5 СОК (фиг. 14). Табл. 6 показывает остатки, которые находятся в пределах 5 А от любого остатка СОК в последовательности либо легкой, либо тяжелой цепи модели ЕМ164.

Таблица 6. Остатки поверхности каркаса антитела ЕМ164 в пределах 5А от СОК

Легкая цепь	Тяжелая цепь
Ш	Т28
13	К73
Т7	574
Р40
6)42
К45
057
060
Е81

С. Идентификация наиболее гомологичных поверхностей антител человека.

Кандидатные поверхности антител человека для перестройки поверхности ЕМ164 идентифицировали в пределах базы данных антител КаЬа!, с использованием программного обеспечения 8К, которое обеспечило поиск только указанных положений остатков против этой базы данных. Для сохранения природных пар, сравнивали вместе поверхностные остатки как легкой, так и тяжелой цепей. Наиболее гомологичные человеческие остатки из базы данных КаЬа! сопоставляли в ранжированном порядке идентичности последовательности. Верхние 5 поверхностей приведены в табл. 7. Затем эти последовательности сравнивали для идентификации, какие из них, могли бы требовать наименьших замен в 5 А от СЭК. Антитело против лейкозных В-клеток, СЬЬ 1.69, требовало наименьшего количества замен поверхностных остатков (всего 10), и только два из этих остатков находились в пределах 5 А от СЭК.

Полноразмерную последовательность вариабельной области для ЕМ164 также сопоставляли против базы данных КаЬа!, и СЬЬ 1.69 опять идентифицировали как наиболее сходную последовательность вариабельной области человека. Вместе, эти сравнения последовательностей идентифицировали антитело лейкозных В-клеток СЬЬ 1.69 как предпочтительный выбор в качестве человеческой поверхности для ЕМ164.

Таблица 7. Верхние 5 человеческих последовательностей, извлеченных из базы данных КаЬа!

5 наиболее гомологичных поверхностей антитела человека
Антитело	Легкая цепь	8Еф ГО N0:
МиЕМ164	0ЬТЬЬб}Р0<)К<Э08К.ЕККЙ.А	33
СЬЬЬ69	ϋУТЬЬР ΡΟςΚΟϋΑΚΕΚΚΚ-	34
М8Ь5	ϋ ф8 Ь I Р Р69К0О8В.ОККВ.А	35
СОР571	ОМ88УКРО9КО888ОККВ.-	36
ЬСЗаРВ	ЕУЗОРКРОфйООЗКЕККВ-	37
88ЪРВ	Е У8 0РИР0()К0О8КЕККк-	38
Антитело	Тяжелая цепь	8Ε(}Ι0Ν0:
МиЕМ164	0 ИфАЬКРОККТ РОфЕКККК888ЕА8	39
СЬИ .69	0 фУАУКРОККТРОфОКфОК888Ер8	40
М8Ь5	П ффР ЬКРОККТ РΟΚΟϋΚΟΤ8ΝΝΕ08	41
СОР571	0 0νΑνΚΡΟΚΚΤΡΟ00ΚΚΟΚ888Ε08	42
ЬСЗаРВ	- фУАУКРОККТРОффКООКЗ88Еф8	43
88ЬРВ	- С) V А V К Р О К КТ Р 0 ζ) ф К ¢) О Е 8 8Еф8	44

Сопоставления были получены с использованием 8К (Ребегзеп 1993). Остатки поверхности ЕМ164, которые находятся в пределах 5 А СЭК, подчеркнуты.

Н. Конструирование гуманизированных генов ЕМ164.

Десять замен поверхностных остатков для ЕМ164 (табл. 7) производили с использованием способов ПЦР-мутагенеза, как описано выше. Поскольку восемь из поверхностных остатков для СЬЬ 1.69 не находились в пределах 5 А от СЭК, эти остатки заменяли с мышиных на человеческие во всех версиях гуманизированного ЕМ164 (табл. 8 и 9). Два остатка поверхности легкой цепи, которые находились в пределах 5 А от СЭК, (положения КаЬа! 3 и 45), были либо заменены на человеческие, либо оставлены как мышиные. Вместе эти опции генерируют четыре гуманизированные версии ЕМ164, которые были скон- 24 009807 струированы (фиг. 22 и 23).

Из этих четырех гуманизированных версий, версия 1.0 имеет все 10 человеческих поверхностных остатков. Наиболее консервативной версией в отношении замен вблизи от СИВ является версия 1.1, которая сохранила оба из мышиных поверхностных остатков, которые находились в пределах 5 А от СИВ.

Все четыре гуманизированных антитела ЕМ 164 клонировали в экспрессирующую антитело плазмиду (фиг. 16) для использования в транзиторной и стабильной трансфекциях.

Таблица 8. Замены остатков для версий 1.0-1.3 гуманизированного антитела ЕМ164 __________________| Изменения во всех версиях

Легкая цепь: тиЦ! 8 в йиР 18; ти867 в йиА67

Тяжелая цепь ти(25 в йиУ5; тиЫ1 в НиVI1; тиЕ611о йиЦ61; тиК641о НиС)64;

тиВ65 в ИиС65; тиАЮб в ИиО106

Изменения ЬиЕМ164

	Аминокислота 45 легкой цепи		Аминокислота 3 легкой цени		Всего
Ми	Ни	ши	йи	Мышиные остатки
νΐ.0		V			К		0
νΐ.1	Ь			К			2
νΐ.2	Ь				В		1
νΐ.3		V		К			1

Ι. Сравнение аффинностей гуманизированных версий антитела ЕМ164 с аффинностями мышиного антитела ЕМ 164 в отношении связывания с полноразмерным ЮЕ-Ерецептором и укороченной альфацепью ЮЕ-Ерецептора.

Афинности гуманизированных версий 1.0-1.3 антитела ЕМ164 сравнивали с аффинностями мышиного антитела ЕМ164 при помощи конкурентных анализов связывания с использованием биотинилированного полноразмерного ЮЕ-Ерецептора человека или меченой тус-эпитопной меткой укороченной альфа-цепи ЮЕ-Ерецептора, описанной выше. Пробы гуманизированных антител ЕМ164 получали транзиторной трансфекцией подходящих экспрессирующих векторов в клетках 293Т эмбриональной почки человека, и концентрации антител определяли при помощи ЕЫЗА с использованием стандартов очищенного гуманизированного антитела. Для измерений конкурентного связывания при помощи ЕЫЗА смеси проб гуманизированных антитела и различных концентраций мышиного антитела ЕМ164 инкубировали с захваченными опосредованным способом битинилированного полноразмерного Ι6Ε-Ιрецептора или меченой тус-эпитопной меткой укороченной альфа-цепи ЮЕ-Ерецептора. После уравновешивания связанное гуманизированное антитело детектировали с использованием конъюгата козье антитело против ЕаЬ'₂ человека-пероксидаза хрена. Графики ([связанное мышиное АЬ]/[связанное гуманизированное АЬ]) против ([мышиное АЬ]/[гуманизированное АЬ]), которые дают теоретически прямую линию с наклоном = (К_с гуманизированного аь/Кв мышиного аь), использовали для определения относительных аффинностей гуманизированных и мышиных антител.

Пример конкурентного анализа показан на фиг. 11. Iтши1οη-2НВ -планшет ЕЫЗА покрывали 100 мкл 5 мкг/мл стрептавидина на лунку в карбонатном буфере при температуре окружающей среды в течение 7 ч. Покрытые стрептавидином лунки блокировали 200 мкл блокирующего буфера (10 мг/мл БСА в ТВЗ-Тбуфере) в течение 1 ч, промывали ТВЗ-Т-буфером и инкубировали с биотинилированным Ι6Ε-Ιрецептором (5 нг на лунку) в течение ночи при 4°С. Затем лунки, содержащие опосредованно захваченный биотинилированный ЮЕ-Ерецептор, промывали и инкубировали со смесями гуманизированного антитела ЕМ164 (15,5 нг) и мышиного антитела (0 нг или 16,35 нг или 32,7 нг или 65,4 нг или 163,5 нг) в 100 мкл блокирующего буфера в течение 2 ч при температуре окружающей среды и затем инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки промывали ТΒ3-Т-буфером и инкубировали с конъюгатом козье антитело против ЕаЬ'₂ человека-пероксидаза хрена в течение 1 ч (100 мкл; 1 мкг/мл в блокирующем буфере) с последующими промывками и детектированием с использованием субстрата ΑΒТ3/Η₂О₂ при 405 нм.

График ([связанное мышиное АЬ]/[связанное гуманизированное АЬ]) против ([мышиное АЬ]/[гуманизированное АЬ]) давал прямую линию (г² = 0,996) с наклоном (=К_С гуманизированного аь/К .. .. _АЬ) 0,52. Таким образом, версия 1.0 гуманизированного антитела связывалась с Ι6Ε-Ι-рецептором более прочно, чем мышиное антитело ЕМ164. Сходные величины для градиента в диапазоне от приблизительно 0,5 до 0,8 получали для конкуренций версий 1.0, 1.1, 1.2 и 1.3 гуманизированных антител ЕМ164 с мышиным антителом ЕМ 164 за связывание с полноразмерным Ι6Ε-Ι-рецептором или с укороченной альфа-цепью ЮЕ-Ерецептора, что указывало на то, что все из этих гуманизированных версий антитела ЕМ164 имели сходные аффинности, которые все были лучшими, чем аффинность исходного мышиного антитела ЕМ164. Химерная версия антитела ЕМ164 с мутацией 92Е^С в тяжелой цепи показала наклон приблизительно 3 в подобной конкуренции связывания с мышиным антителом ЕМ164, что указывало на

- 25 009807 то, что мутант 92Е^С ЕМ164 имел в 3 раза более низкую аффинность, чем мышиное антитело ЕМ164 в отношении связывания ЮЕ-1-рецептора. Гуманизированное антитело ЕМ164 ν1.0 показало сходное ингибирование ЮЕ-1-стимулируемого роста и выживания клеток МСЕ-7 в сравнении с мышиным антителом ЕМ 164 (фиг. 24). Ингибирование стимулируемого сывороткой роста и выживания клеток МСЕ-7 гуманизированным антителом ЕМ164 ν1.0 было сходным с ингибированием мышиным антителом ЕМ164.

Таблица 9

Сегмент	Легкая цепь	Тяжелая цепь
РК1	1 -23 (со случайным остатком при 0 и делецией при 10 в цепях νλ)	1-30 (со случайным остатком при 0)
СОК!	24-34 (с возможными инсерцияями, пронумерованными как 27А, В, С, ϋ, Е, Г)	31-35 (с возможными инсерциями, пронумерованными как 35А, В)
РК2	35-49	36-49
СОК2	50-56	50-65 (с возможными инсерциями, пронумерованными как 52А, В, С)
гкз	57-88	66-94 (с возможными инсерциями, пронумерованными как 82А, В, С)
спкз	89-97 (с возможными инсерциями, пронумерованными как 95А, В, С, ϋ, Е, Г)	95-102 (с возможными инсерциями, пронумерованными как 100А, В, С, ϋ, Е, Г, О, Η, I, ί, К)
РК4	98-107 (с возможной инсерцией,	103-113

пронумерованной как 106А)

Использовали систему нумерации КаЬа! для полипептидов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей различных версий ЕМ 164 АЬ. Аминокислотные остатки сгруппированы в каркасные (ЕК) и определяющие комплементарность районы (СИК) в соответствии с положением в полипептидной цепи.

Взято из КаЬа! е! а1., 8ес.|иепсе5 оГ Рго!ет8 оГ 1ттцпо1одюа1 1п1егек1. ΕίΓιΗ Εάίίίοη, 1991, ΝΙΗ РиЬйсаΐΐοη №. 91-3242.

1. Способ обеспечения улучшенных антител против ЮЕ-1-рецептора на основе последовательностей мышиного и гуманизированных антител, описанных здесь.

Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот антитела против ЮЕ-1-рецептора ЕМ 164 и его гуманизированных версий использовали для развития других антител, которые имели улучшенные свойства и которые также находятся в объеме данного изобретения. Такие улучшенные свойства включают в себя увеличенную аффинность в отношении ЮЕ-1-рецептора. Несколько исследований изучили действия введения одной или нескольких аминокислотных замен в различных положениях в последовательности антитела, на основании знания последовательности первичного антитела, на их свойства, такие как связывание и уровень экспрессии (Уапд, ^.Р. е! а1., 1995, 1. Мо1. Вю1, 254, 392-403; Кайег, С е! а1., 1998, Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А, 95, 8910-8915; УаидЬап, Т.1. е! а1., 1998, №11иге Вю!есЬпо1оду, 16, 535-539).

В этих исследованиях варианты первичного антитела получали изменением последовательностей генов тяжелой и легкой цепей в районах СИКТ, СИК2, СЭЕ3 или каркасных районах с использованием таких способов, как опосредованный олигонуклеотидом сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез, склонная к ошибкам ПЦР, перетасовка ДНК или мутаторные штаммы Е. сой (УаидЬап, Т.1. е! а1., 1998, №11иге Вю!есЬпо1оду, 16, 535-539; Айеу, Ν.Β. е! а1., 1996, СЬар!ег 16, рр. 277-291, ш РЬаде Э18р1ау оГ Рерййез апй Рго!ет8, Ейз. Кау, В.К. е! а1., Асайетю Ргезз). Эти способы изменения последовательности первичного антитела привели, посредством применения стандартных способов скрининга, к улучшенным аффинностям таких вторичных антител (Сгат, Н. е! а1, 1992, Ргос. №!1. Асай. 8сЕ И8А, 89, 35763580; Войег, Е.Т. е! а1., 2000, Ргос. №11. Асай. 8сЕ И8А, 97, 10701-10705; ^аν^е8, 1. апй КтесЬтапп, Ь., 1996, 1ттипо1оду, 2, 169-179; ТЬотрзоп, 1. е! а1., 1996, 1. Мо1. Вю1., 256, 77-88; 8Ьой, М.К. е! а1., 2002, 1. Вю1. СЬет., 277, 16365-16370; Еигика^а, К. е! а1., 2001, 1. Вю1. СЬет., 276, 27622-27628).

С использованием подобной направленной стратегии изменения одного или нескольких аминокислотных остатков антитела, последовательности антител, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для развития антител против ЮЕ-1-рецептора с улучшенными функциями, например, антител, имеющих подходящие группы, такие как свободные аминогруппы или тиолы, в удобных точках присоединения для ковалентной модификации, например, для использования в присоединении терапевтических агентов.

К. Альтернативная система экспрессии для мышиного, химерного и других антител против ЮЕ-Ιрецептора.

Мышиное антитело против ЮЕ-1-рецептора экспрессировали также при помощи экспрессирующих плазмид млекопитающих, сходных с плазмидами, используемыми для экспрессии гуманизированного антитела (см. выше). Известно, что экспрессирующие плазмиды имеют мышиные константные области, включающие в себя последовательности легкой цепи каппа и тяжелой цепи гамма-1 (МсЬеап е! а1., 2000,

- 26 009807

Мо1 ^типоЦ 37, 837-845). Эти плазмиды сконструированы для принятия любой вариабельной области антитела, например, мышиного антитела против ЮР-Ьрецептора, посредством простого расщепления рестриктазами и клонирования. Обычно требуется дополнительная ПЦР этого антитела против ЮР-Ιрецептора для создания рестрикции, совместимой с рестрикцией в этой экспрессирующей плазмиде.

Альтернативным подходом для экспрессии полностью мышиного антитела против ЮР-Ьрецептора была замена константных областей человека в плазмиде, экспрессирующей химерное антитело против ЮР-Ерецептора. Эту плазмиду химерной экспрессии (фиг. 16) конструировали с использованием кассет для вариабельных областей и для константных областей как легкой, так и тяжелой цепей. Как раз, когда вариабельные последовательности антитела клонировали в эту экспрессионную плазмиду посредством расщеплений рестриктазами, отдельные продукты расщепления рестриктазами использовали для клонирования в любых последовательностях константной области. Например, кДНК легкой цепи каппа и кДНК тяжелой цепи гамма-1 клонировали из РНК мышиной гибридомы, такой как РНК, описанная выше для клонирования вариабельных областей антитело против ЮР-Ьрецептора. Подобным образом, конструировали подходящие праймеры из последовательностей, доступных в базе данных КаЬа1 (см. табл. 10). Например, использовали ОТ-ПЦР для клонирования последовательностей константной области и для создания сайтов рестрикции, необходимых для клонирования этих фрагментов в плазмиду, экспрессирующую химерное антитело против ЮРЛ-рецептора. Затем эту плазмиду использовали для экспрессии полностью мышиного антитела против ЮР-Ьрецептора в стандартных экспрессионных системах млекопитающего, таких как клеточная линия СНО.

Таблица 10. Праймеры, сконструированные для клонирования мышиной константной области гамма-1 и мышиной константной области каппа, соответственно

Праймеры мышиной константной области
Название праймера	Последовательность праймера	8ΕΟΙΟΝΟ:
ΜιιΙβΟΙ СЗспбХ	ТТТТОАОСТСТТАТТТАССАСОАОАСТОССАОА ООСТСТГ	45
МиЦО1 С5епбН	ТТТТААОСТТСССААААССАСАСССССАТСТСТСТАТ	46
МиЦКар СЗепбВ	ТТТТООАТССТААСАСТСАТТССТОТТСААОС	47
Ми!§Кар С5еп<1Е	ТТТТ6ААТТСООССТ6АТ6СТССАССААСТО	48

Эти праймеры были сконструированы на основании последовательностей, доступных в базе данных КаЬа1 ЦоЬпкоп, 6. апб Аи, Т.Т. (2001) ЫисШс Ас1бк Кекеагсй, 29: 205-206).

Заявление о депонировании

Гибридома, продуцирующая мышиное антитело ЕМ164, была депонирована в Американской Коллекции Типовых Культур, РО Вох 1549, Мапаккак, УА 20108, 14 июня 2002 г. согласно Будапештскому Договору и получила номер доступа АТСС (АТСС ассеккюп питЬег) РТА-4457.

В данном описании делались ссылки на некоторые патенты и печатные публикации, содержание которых, в каждом случае, включены здесь путем отсылки в их соответствующем полном виде.

Хотя данное изобретение было описано подробно и со ссылкой на его конкретные варианты осуществления, специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что различные изменения и модификации могут быть произведены в нем без отклонения от его идеи и объема.

Claims (31)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция, содержащая:

   (a) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент и где указанное антитело или указанный фрагмент специфически связывается с рецептором инсулин-подобного фактора роста Ι, выбранный из группы, состоящей из:

   (ί) антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента, имеющих ту же самую аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело ЕМ164, продуцируемое мышиной гибридомой ЕМ164 (номер доступа АТСС РТА-4457), (ίί) антитела с перестроенной поверхностью или его эпитопсвязывающего фрагмента, имеющих ту же самую специфичность связывания, что и мышиное антитело ЕМ164, (ίίί) человеческого или гуманизированного антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента, имеющих ту же самую специфичность связывания, что и мышиное антитело ЕМ164, (ίν) функционального эквивалента антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента, имеющих ту же самую специфичность связывания, что и мышиное антитело ЕМ164, (ν) варианта мышиного антитела ЕМ164 или его эпитопсвязывающего фрагмента, имеющих по меньшей мере одну мутацию, делецию или инсерцию нуклеотида в сравнении с мышиным антителом ЕМ164 и имеющих ту же самую специфичность связывания, что и мышиное антитело ЕМ164, и (νί) мышиного антитела ЕМ164, продуцируемого мышиной гибридомой ЕМ164 (номер доступа АТСС РТА-4457), или его эпитопсвязывающего фрагмента, и (b) второй терапевтический агент.

   - 27 009807
2. 2. Композиция по п.1, где указанный второй терапевтический агент выбран из группы, состоящей из таких терапевтических агентов, как доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, эпирубицин, циклофосфамид, трастузумаб (Негсерйп), капецитабин, тамоксифен, торемифен, летрозол, анастрозол, фулвестрант, экземестан, госерелин, оксалиплатин, карбоплатин, цисплатин, дексаметазон, антид, бевацизумаб (Аνа8ΐ^η), 5-фторурацил, лейковарин, левамизол, иринотекан, этопозид, топотекан, гемцитабин, винорелбин, эстрамустин, митоксантрон, абареликс, золедронат, стрептозоцин, ритуксимаб (Кйихап), идарубицин, бусульфан, хлорамбуцил, флударабин, иматиниб, цитарабин, ибритумомаб (Ζеνа1^η), тозитумомаб (Веххаг), интерферон альфа-2Ь, мелфалам, бортезомиб (Уе1сабе), алтретамин, аспарагиназа, гефитиниб Цгекка), эрлонитиб (Та^сеνа), антитело к ЕСЕ-рецептору (СеШхктаЬ, АЬх-ЕСЕ) и эпотилон.
3. 3. Композиция по п.1, где указанный второй терапевтический агент выбран из группы, состоящей из карбоплатина, оксалиплатина, цисплатина, паклитаксела, доцетаксела, гемцитабина и камптотецина.
4. 4. Композиция по п.1, где указанный первый терапевтический агент вводят пациенту в дозе приблизительно 1 - приблизительно 2000 мг/кв.м и где указанный второй терапевтический агент вводят в дозе приблизительно 10 - приблизительно 2000 мг/кв. м.
5. 5. Композиция по п.1, где указанный первый терапевтический агент вводят пациенту в дозе приблизительно 10 - приблизительно 1000 мг/кв. м и где указанный второй терапевтический агент вводят в дозе приблизительно 50 - приблизительно 1000 мг/кв.м.
6. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
7. 7. Композиция, содержащая:

   (а) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или эпитопсвязывающий фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере один определяющий комплементарность район, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
8. 8ΥΨΜΗ

   ΕΙΝΡ8ΝΟΚΊΝΥΝΕΚΡΚΚ. ΟΚΡΌΥΥΟδδΚΧνΥΡϋν Κ88ζ)8ΓνΗ8ΝνΝΤΥΙ,Ε Κν8ΝΚΡ8

   ΡφΟδΗΥΡΡΤ (5ЕС2 ГО N0:1), (8Ер ГО N0:2), (8Ε0 ГО N0:3), (8ΕρΐϋΝΟ:4), (8ЕО ГО N0:5) и (8Ε9№ΝΟ:6)η (Ь) второй терапевтический агент, где, когда выбрана 8Еф ΙΌ N0:5, указанное антитело или фрагмент антитела специфически связывается с рецептором инсулин-подобного фактора роста Ι (ЮЕ-Щ).

   8. Композиция, содержащая:

   (а) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или эпитопсвязывающий фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит три последовательных определяющих комплементарность района, имеющего аминокислотные последовательности, представленные 8Еф ΙΌ N0:1-3, соответственно: 8ΥΑΥΜΗ (8ΕφΙΟΝΟ:1),

   ΕΙΝΡ8Ν0ΚΤΝ ΥΝΕΚΡΚΚ 18Е0 ГО N0:2),

   ΟΚΡΟΥΥΟ88Κ\νΥΡΏν (8Ер ГО N0:3), и где указанная вариабельная область легкой цепи содержит три последовательных определяющих комплементарность района, имеющего аминокислотные последовательности, представленные 8Еф ΙΌ N0:46, соответственно:

   ΚδδςδίνΗδΝνΝΤΥί,Ε (8Е0 ГО N0:4),

   ΚνδΝΚΡδ (8Е0 ГО N0:5),

   РЦОЗНУРРТ (8ΕΓ)ΙΟΝΟ:6)π (Ь) второй терапевтический агент.
9. 9. Композиция, содержащая:

   (a) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент антитела, причем указанное антитело или указанный фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности, представленной 8Еф ΙΌ N0:7:

   (.)У01.908СЛЕЕУКРОА8УКГ.8СКАКСУП-!8УЧ⁷МНШ^гК()КРСОСЬЕиТОЕ1

   ΝΡ8ΝαΚΤΝΥΗΕΚΡΚΚΚΑΤΕΤν0Κ888ΤΑΥΜ0Ε88ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΥΡΑΚ0ΚΡΟΥ ΥΟ88Κ5νΥΡθνΐνθΑΟΊΤντν88 (8ЕЦ ГО N0:7), и (b) второй терапевтический агент.
10. 10. Композиция по п.9, где указанная вариабельная область тяжелой цепи имеет по меньшей мере

    - 28 009807

    95% идентичность последовательности относительно указанной аминокислотной последовательности, представленной ЗЕ/ ΙΌ N0:7.
11. 11. Композиция по п.9, где указанная вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, которая представлена ЗЕ/ ΙΌ N0:7.
12. 12. Композиция, содержащая:

    (a) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или указанный фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности, представленной ЗЕ/ ΙΌ N0:8:

    ОУЬМТОТРЬ8ЬРУ8ЬООрА818СК88р81УН8ПУМТУЬЕ1¥УЬрКР098РКШ¥

    Κν8ΝΚΓ80νΡ0ΚΓ8Ο8080Τ0ΡΤΕΚ.Ι8Κ.νΕΑΕ0Ε<3ΙΥΥ0Ρρ08ΗνΡΡΤΡ€>Ο0ΤΚ

    ЬЕ1КВ.(8Е0 Ю N0:8), и (b) второй терапевтический агент.
13. 13. Композиция по п.12, где указанная вариабельная область легкой цепи имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности относительно указанной аминокислотной последовательности, представленной ЗЕ/ ΙΌ N0:8.
14. 14. Композиция по п.12, где указанная вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, которая представлена ЗЕ/ ΙΌ N0:8.
15. 15. Композиция, содержащая:

    (a) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или указанный фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

    θννΜΤ4ΤΡΕ8ΕΡν8ΕΟΏΡΑ8Ι80Κ8808ΐνΗ8ΝνΝΤΕΕΐνΥΕ0ΚΡ608ΡΡΕΕΙΥ Κν8ΝΚΓ8σνΡΟΚΡ8Ο8ΟΑΟΊΌΡΤΕΚΙ8ΚνΕΑΕΟΕΟΙΥΥ0Ρ0Ο8ΗνΡΡΊΤΟΟ0ΤΚΕΕΙΚ К. (8Εζ) ГО N0:9);

    θνΕΜΤ0ΤΡΕ8ΕΡν8ΕΟΏΡΛ8Ι8ΟΚ8808ΐνΗ8ΝνΝΤΥΈΕ\νΥΕ0ΚΡ608ΡΚΕΕΙΥ Κν8ΝΚΡ8ανΡΟΚΡ8Ο8ΟΑΟΤΟΡΤΕΚΙ8ΚνΕΑΕΠΕΰΙΥΥ0Ρ0Ο8ΗνΡΡΤΓαα6ΤΚΕΕΙΚ К (8Е0 ГО N0:10);

    θνΕΜΤ0ΤΡΕ8ΕΡν8ΕΟ«ΡΛ8Ι8ΟΚ8808ΐνΗ8ΝνΝΤΥΓ.ΕΨΥΕ0^;08ΡΚΕΕΙΥ Κν8ΝΚΡ8θνΡΟΚΡ8Ο8ΟΑΟΊΌΡΤΕΚΙ8ΚνΕΑΕΟΕΟΙΥΥ0Ρ0Ο8ΗνΡΡΤΡΟΟΟΤΚΕΕΙΚ К(8Е(Э ГО N0:11);

    ΠννΜΤ0ΊΤΕ8ΕΡν8ΤΌΠΡΛ8Ι8ΟΛ8808ΐνΗ8ΝνΝΤΥΕΕν7ΥΕΟΚΡΟ08ΡΚΕΕΙΥ Κν8ΝΚΡ8θνΡΓ^ΚΡ8Ο8ΓιΑΟΤΟΓΤΙΚΙ8Τ<νΕΑΕηΐ.0ΤΥΥ0Ε0Ο8ΠνΡΡΤΕΟΟΟΤΚΕΕ1Κ К(8Е0 ГО N0:12), и

    (b) второй терапевтический агент.
16. 16. Композиция, содержащая:

    (a) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или указанный фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную ЗЕ/ ΙΌ N0:13:

    0νρΕν08ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΕ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΨΜΗ\ννΚ0ΚΡΟ0ΟΕΕλνΐΟΕΙ ΝΡ8ΝΟΚΤΝΥΝ9ΚΡ9ΟΚΑΤΕΤνθΚ888ΤΑΥΜ0Ε88ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΥΡΑΚ0ΚΡΟΥ Υ088ΚννΥΗ0ν\ν090ΤΤντν88 (8Εζ) ГО N0:13), и (b) второй терапевтический агент.
17. 17. Композиция по любому из пп.7-16, где указанный второй терапевтический агент выбран из группы, состоящей из доцетаксела, паклитаксела, доксорубицина, эпирубицина, циклофосфамида, трастузумаба (НегсерИи), капецитабина, тамоксифена, торемифена, летрозола, анастрозола, фулвестранта, экземестана, госерелина, оксалиплатина, карбоплатина, цисплатина, дексаметазона, антида, бевацизумаба. (АуакИи), 5-фторурацила, лейковарина, левамизола, иринотекана, этопозида, топотекана, гемцитабина, винорелбина, эстрамустина, митоксантрона, абареликса, золедроната, стрептозоцина, ритуксимаба (ЯИихаи), идарубицина, бусульфана, хлорамбуцила, флударабина, иматиниба, цитарабина, ибритумомаба (2еуа1ш), тозитумомаба. (Веххаг), интерферона альфа-2Ь, мелфалама, бортезомиба (Уе1сабе), алтретамина, аспарагиназы, гефитиниба Цгекка), эрлонитиба (Тагсеуа), антитела против ЕСЕ-рецептора (Се!ихгутаЬ, АЬх-ЕСЕ) и эпотилона.
18. 18. Композиция по любому из пп.7-16, где указанный второй терапевтический агент выбран из группы, состоящей из карбоплатина, оксалиплатина, цисплатина, паклитаксела, доцетаксела, гемцитаби- 29 009807 на и камптотецина.
19. 19. Способ ингибирования роста раковой клетки, предусматривающий контактирование указанной клетки с композицией по п.1.
20. 20. Способ лечения пациента, имеющего рак, предусматривающий введение указанному пациенту эффективного количества композиции по п.1.
21. 21. Способ лечения пациента, имеющего рак, предусматривающий введение указанному пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.6.
22. 22. Способ лечения по любому из пп.19-21, где указанный рак является раком, выбранным из группы, состоящей из рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака яичника, остеосаркомы, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака легкого, синовиального рака, рака поджелудочной железы, меланомы, множественной миеломы, нейробластомы и рабдомиосаркомы.
23. 23. Набор, содержащий:

    (a) первый терапевтический агент, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело, имеющее ту же самую аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело ЕМ164, продуцируемое мышиной гибридомой ЕМ164 (номер доступа АТСС РТА-4457), или его эпитопсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или указанный фрагмент специфически связываются с рецептором инсулин-подобного фактора роста I, (b) второй терапевтический агент и (c) инструкции по применению.
24. 24. Способ ингибирования роста раковой клетки, предусматривающий контактирование указанной клетки с:

    (a) первым терапевтическим агентом, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело, имеющее ту же самую аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело ЕМ164, продуцируемое мышиной гибридомой ЕМ164 (номер доступа АТСС РТА-4457), или его эпитопсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или указанный фрагмент специфически связываются с рецептором инсулин-подобного фактора роста I, (b) вторым терапевтическим агентом.
25. 25. Способ лечения пациента, имеющего рак, предусматривающий введение указанному пациенту эффективного количества:

    (a) первого терапевтического агента, где указанным первым терапевтическим агентом является антитело, имеющее ту же самую аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело ЕМ164, продуцируемого мышиной гибридомой ЕМ164 (номер доступа АТСС РТА-4457), или его эпитопсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или указанный фрагмент специфически связываются с рецептором инсулин-подобного фактора роста I, (b) второго терапевтического агента.
26. 26. Способ по п.24, где указанную клетку контактируют с указанным первым терапевтическим агентом и указанным вторым терапевтическим агентом одновременно.
27. 27. Способ по п.24, где указанную клетку контактируют с указанным первым терапевтическим агентом и указанным вторым терапевтическим агентом последовательно и в любом порядке.
28. 28. Способ по п.25, где указанный первый терапевтический агент и указанный второй терапевтический агент вводят одновременно.
29. 29. Способ по п.25, где указанный первый терапевтический агент и указанный второй терапевтический агент вводят последовательно и в любом порядке.
30. 30. Способ по п.24 или 25, где указанный второй терапевтический агент выбран из группы состоя- щей из таких терапевтических агентов, как доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, эпирубицин, циклофосфамид, трастузумаб (Негсерйп), капецитабин, тамоксифен, торемифен, летрозол, анастрозол, фулвестрант, экземестан, госерелин, оксалиплатин, карбоплатин, цисплатин, дексаметазон, антид, бевацизумаб (Аνа5ΐ^π), 5-фторурацил, лейковарин, левамизол, иринотекан, этопозид, топотекан, гемцитабин, винорелбин, эстрамустин, митоксантрон, абареликс, золедронат, стрептозоцин, ритуксимаб (Кйихап), идарубицин, бусульфан, хлорамбуцил, флударабин, иматиниб, цитарабин, ибритумомаб тозитумомаб (Веххаг), интерферон альфа-2Ь, мелфолам, бортезомиб (Уе1сайе), алтретамин, аспарагиназа, гефитиниб ([гезза), эрлонитиб (Та^сеνа), анти-ЕОЕ-рецептор-антитело (СеШхйтаЬ, АЬх-ЕОЕ) и эпотилон.
31. 31. Способ по п.24 или 25, где указанный второй терапевтический агент выбран из группы, состоящей из карбоплатина, оксалиплатина, цисплатина, паклитаксела, доцетаксела, гемцитабина и камптотецина.