PL217921B1 - Przeciwciało przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne - Google Patents

Przeciwciało przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne

Info

Publication number
PL217921B1
PL217921B1 PL366340A PL36634001A PL217921B1 PL 217921 B1 PL217921 B1 PL 217921B1 PL 366340 A PL366340 A PL 366340A PL 36634001 A PL36634001 A PL 36634001A PL 217921 B1 PL217921 B1 PL 217921B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
igf
amino acid
acid sequence
nucleic acid
Prior art date
Application number
PL366340A
Other languages
English (en)
Other versions
PL366340A1 (pl
Inventor
Bruce D. Cohen
Jean Beebe
Penelope E. Miller
James D. Moyer
Jose R. Corvalan
Michael Gallo
Original Assignee
Amgen Fremont Inc
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL217921(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Fremont Inc, Pfizer filed Critical Amgen Fremont Inc
Publication of PL366340A1 publication Critical patent/PL366340A1/pl
Publication of PL217921B1 publication Critical patent/PL217921B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells

Abstract

Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał i ich wiążących antygeny części, które specyficznie wiążą się z receptorem podobnego do insuliny czynnika wzrostu I (IGF-IR), który korzystnie jest ludzkim IGF-IR. Wynalazek dotyczy także ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR, wraz z przeciwciałami chimerowymi, dwuswoistymi, derywatyzowanymi, składającymi się z pojedynczego łańcucha albo fragmentów białek fuzyjnych. Wynalazek dotyczy ponadto wyizolowanych cząsteczek łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny otrzymanej z przeciwciał anty-IGF-IR oraz cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących takie cząsteczki. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobów wytwarzania przeciwciał anty-IGF-IR, kompozycji farmaceutycznych obejmujących takie przeciwciała oraz sposobów zastosowania przeciwciał oraz ich kompozycji do diagnozowania i leczenia. Wynalazek dostarcza również sposobów terapii genowej przy zastosowaniu cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących ciężkie i/albo lekkie cząsteczki immunoglobulin obejmujących ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR. Wynalazek dotyczy również sposobów terapii genowej oraz zwierząt transgenicznych obejmujących cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne.
Insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF-I, ang. insulin-like growth factor) jest polipeptydem o masie 7,5 kD, który krąży w osoczu w wysokim stężeniu i jest wykrywalny w większości tkanek. IGF-I stymuluje różnicowanie komórek i proliferację komórek i jest wymagany przez większość typów komórek ssaków do stałej proliferacji. Te typy komórek obejmują między innymi ludzkie diploidalne fibroblasty, komórki nabłonkowe, komórki mięśni gładkich, limfocyty T, komórki nerwowe, komórki szpiku, chondrocyty, osteoblasty i komórki macierzyste szpiku kostnego. Dla dokonania przeglądu szerokiej gamy typów komórek, dla których IGF-I/receptor IGF-I pośredniczy w proliferacji komórek patrz Goldring i wsp., Eukar. GeneExpress., 1: 31-326 (1991).
Pierwszym etapem w szlaku przekazywania sygnału, prowadzącym do stymulowanej przez IGF-I proliferacji albo różnicowania komórkowego, jest wiązanie się IGF-I lub IGF-II (albo insuliny w ponadfizjologicznych stężeniach) do receptora IGF-I. Receptor IGF-I składa się z dwóch typów podjednostek: podjednostki alfa (białko o wielkości 130-135 kD, które jest całkowicie zewnątrzkomórkowe i działa przy wiązaniu liganda) i podjednostki beta (białko transbłonowe o wielkości 95 kD, z domenami transbłonową i cytoplazmatyczną). IGF-IR należy do rodziny receptorów czynników wzrostu o aktywności kinazy tyrozynowej (Ullrich i wsp., Cell 61: 203-212, 1990) i jest strukturalnie podobny do receptora insuliny (Ullrich i wsp., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). IGF-IR jest syntetyzowany wyjściowo jako jednołańcuchowy polipeptyd proreceptora, który ulega obróbce poprzez glikozylację, cięcie proteolityczne i tworzenie wiązań kowalencyjnych, łącząc się w dojrzały heterodimer o wielkości 460 kD zawierający dwie podjednostki alfa i dwie podjednostki beta. Podjednostka(i) beta posiada aktywowaną ligandem aktywność kinazy tyrozynowej. Postuluje się udział tej aktywności w szlakach przekazywania sygnału, w których pośredniczy działanie liganda, obejmujących autofosforylację podjednostki beta i fosforylację substratów IGF-IR.
In vivo, poziomy IGF-I w surowicy są zależne od obecności przysadkowego hormonu wzrostu (GH, ang. growth hormone). Jakkolwiek głównym miejscem zależnej od GH syntezy IGF-I jest wątroba, ostatnie prace wskazują, że większość prawidłowych tkanek również wytwarza IGF-I. Wiele tkanek nowotworowych może również wytwarzać IGF-I. A zatem IGF-I może działać jako regulator prawidłowej i nieprawidłowej proliferacji komórek poprzez mechanizmy autowydzielnicze lub parawydzielnicze, jak również wewnątrzwydzielnicze. IGF-I i IGF-II wiążą się z białkami wiążącymi IGF (IGFBP, ang. IGF binding protein) in vivo. Dostępność wolnego IGF do oddziaływania z IGF-IR jest modulowana przez IGFBP. Dla dokonania przeglądu IGFBP i IGF-I patrz Grimberg i wsp., J. Cell. Physiol. 183: 1-9, 2000.
Istnieje wiele danych wskazujących na rolę IGF-I i/lub IGF-IR w utrzymywaniu się komórek nowotworowych in vitro i in vivo. Poziomy IGF-IR są podniesione w nowotworach płuc (Kaiser i wsp., J. Cancer Res. CIin Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody i wsp., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley i wsp., Cancer Res., 50: 25112517, 1990), sutka (Pollak i wsp., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens i wsp., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen i wsp., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga i wsp., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423,1989), prostaty i okrężnicy (Remaole Bennet i wsp., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo i wsp., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Rozregulowana ekspresja IGF-I w nabłonku prostaty prowadzi do nowotworzenia u transgenicznych myszy (DiGiovanni i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Ponadto, IGF-I wydaje się być autowydzielnicznym stymulatorem ludzkich glejaków (Sandberg-Nordqvist i wsp., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), podczas gdy IGF-I stymulował wzrost włókniakomięsaków, u których miała miejsce nadekspresja IGF-IR (Butler i wsp., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Co więcej, osobniki z „wysokimi prawidłowymi” poziomami IGF-I mają zwiększone ryzyko powszechnych nowotworów w porównaniu z osobnikami z poziomami IGF-I w „niskim prawidłowym” zakresie (Rosen i wsp., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Wiele z tych typów komórek nowotworowych odpowiada na IGF-I sygnałem proliferacyjnym w hodowli (Nakanishi i wsp., J. Clin. Invest. 82: 354 359, 1988; Freed i wsp., J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989) i opublikowano autowydzielnicze lub parawydzielnicze pętle proliferacji in vivo (LeRoith i wsp., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995; Yee i wsp., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Dla dokonania przeglądu roli oddziaływania receptora IGF-I/IGF-I we wzroście rozmaitych ludzkich nowotworów, patrz Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
PL 217 921 B1
Podwyższone poziomy IGF-I koreluje się również z kilkoma patologicznymi stanami nienowotworowymi, włączając w to akromegalię i gigantyzm (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347349, 1998), podczas gdy nieprawidłową funkcję receptora IGF-I/IGF-I postuluje się w łuszczycy (Wraight i wsp., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), miażdżycy tętnic i nawrocie zawężenia przez mięśnie gładkie naczyń krwionośnych po plastyce naczynia (Bayes-Genis i wsp., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Zwiększone poziomy IGF-I mogą być również problemem w cukrzycy lub jej komplikacjach, takich jak proliferacja mikronaczyniowa (Smith i wsp., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Zmniejszone poziomy IGF-I, które występują między innymi w przypadkach, kiedy poziomy GH w surowicy są zmniejszone albo kiedy ma miejsce niewrażliwość albo odporność na GH, mają związek z chorobami, takimi jak niski wzrost (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropatia, zmniejszenie masy mięśni i osteoporoza (Rosen i wsp., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
Stosując antysensowne wektory ekspresyjne albo antysensowe oligonukleotydy wobec RNA IGF-IR pokazano, że przeszkadzanie w działaniu IGF-IR prowadzi do zahamowania wzrostu komórek, w którym pośredniczy IGF-I Iub IGF-II (patrz np. Wraight i wsp., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). Strategia antysensowna przyniosła również sukces w hamowaniu proliferacji komórek w kilku prawidłowych typach komórek i ludzkich liniach komórek nowotworowych. Wzrost można również hamować poprzez zastosowanie peptydowych analogów IGF-I (Pietrzkowski i wsp., Cell Growth & Diff. 3: 199205, 1992 oraz Pietrzkowski i wsp., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992) lub wektora do ekspresji antysensownego RNA wobec RNA IGF-I (Trojan i wsp., Science 259: 94-97, 1992). Ponadto, przeciwciała wobec IGF-IR (Arteaga i wsp., Breast Canc. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992 oraz Kalebic i wsp., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) i dominujące negatywne mutanty IGF-IR (Prager i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2181-2185, 1994; Li i wsp., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 oraz Jiang i wsp., Oncogene 18: 6071-77, 1999) mogą odwracać transformowany fenotyp, hamować nowotworzenie i indukować utratę fenotypu przerzutowania.
IGF-I jest również ważny przy regulacji apoptozy. Apoptoza, która jest programowaną śmiercią komórkową, uczestniczy w różnych procesach rozwojowych, włączając w to dojrzewanie układu immunologicznego i nerwowego. Poza jej rolą w rozwoju, uważa się apoptozę za ważną straż komórkową przeciw nowotworzeniu (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; Lane, Nature 362: 786787, 1993). Zahamowanie programu apoptotycznego przez rozmaite uszkodzenia genetyczne może przyczyniać się do rozwoju i postępów nowotworów.
IGF-I chroni przed apoptozą indukowaną przez brak cytokin w zależnych od IL-3 komórkach krwiotwórczych (Rodriguez-Tarduchy, G. i wsp., J. Immunol. 149: 535540, 1992) i przez brak surowicy w komórkach Rat-1/mycER (Harrington, E., i wsp., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). Funkcja przeciwapoptotyczna IGF-I jest ważnym podecyzyjnym stadium cyklu komórkowego, a także w komórkach z zablokowanym przez etopozyd lub tymidynę cyklem komórkowym. Wykazanie, że przeżywalność kierowanych przez c-myc fibroblastów jest zależna od IGF-I sugeruje, że IGF-IR odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu się komórek nowotworowych poprzez specyficzne zahamowanie apoptozy, rolę odrębną od efektów proliferacyjnych IGF-I lub IGF-IR. Byłaby to rola podobna do tej, którą, jak się uważa, odgrywają inne geny przeciwapoptotyczne, takie jak bcl-2, przy promowaniu przeżywania nowotworu (McDonnell i wsp., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry i wsp., Nature 348: 334-336, 1990).
Ochronne efekty IGF-I na apoptozę zależą od występowania na komórkach IGF-IR w celu oddziaływania z IGF-I (Resnicoff i wsp., Cancer Res. 55; 3739-3741, 1995). Poparcia dla przeciwapoptotycznej funkcji IGF-IR przy utrzymywaniu się komórek nowotworowych dostarczyły również badania z zastosowaniem antysensownych nukleotydów wobec IGF-IR, które zidentyfikowały związek ilościowy pomiędzy poziomami IGF-IR, stopniem apoptozy i potencjałem rakotwórczym szczurzych syngenicznych nowotworów (Rescinoff i wsp., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Stwierdzono, że nadekspresja IGF-IR chroni komórki nowotworowe in vitro przed indukowaną etopozydem apoptozą (Sell i wsp., Cancer Res. 55: 303-306, 1995), a nawet bardziej dramatycznie, że zmniejszenie poziomów IGF-IR poniżej poziomów typu dzikiego powoduje masową apoptozę komórek nowotworowych in vivo (Resnicoff i wsp., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Potencjalne strategie indukowania apoptozy albo hamowania proliferacji komórek związanej ze zwiększonym poziomem IGF-I, zwiększonym poziomem IGF-11 i/lub zwiększonym poziomem receptora IGF-IR obejmują obniżenie poziomów IGF-I lub IGF-II albo zapobieganie wiązaniu się IGF-I do IGF-IR. Przykładowo, analog somatostatyny o długotrwałym działaniu, oktreotydu, został zastosowany do zmniejszenia syntezy i/lub wydzielania IGF. Rozpuszczalny IGF-IR użyto do zaindukowania apoptozy w komórkach nowotworowych in vivo i zahamowania nowotworzenia w zwierzęcym układzie doświad4
PL 217 921 B1 czalnym (D'Ambrosio i wsp., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Ponadto, antysensowne oligonukleotydy IGF-IR, analogi peptydowe IGF-I oraz przeciwciała wobec IGF-IR zastosowano w celu zmniejszenia ekspresji IGF-I lub IGF-IR (patrz wyżej). Jednakże, żaden z tych związków nie jest odpowiedni do długotrwałego podawania pacjentom-ludziom. Ponadto, jakkolwiek był podawany pacjentom do leczenia niskiego wzrostu, osteoporozy, zmniejszonej masy mięśniowej, neuropatii lub cukrzycy, wiązanie się IGF-I do IGFBP czyniło często leczenie IGF-I trudnym albo nieskutecznym.
A zatem, w świetle roli, którą IGF-I i IGF-IR odgrywają w takich chorobach jak nowotwór i innych chorobach, w których ma miejsce proliferacja przy nadekspresji IGF-I i/lub IGF-IR oraz roli, którą ma zbyt mało IGF-I i IGF-IR w chorobach, takich jak niski wzrost i wątłość, przy niedostatecznej ekspresji IGF-I i/lub IGF-IR, byłoby pożądane wytworzenie przeciwciał wobec IGF-IR, które można by użyć aby hamować albo stymulować IGF-IR. Jakkolwiek istnieją doniesienia o znalezieniu przeciwciał anty-IGFIR u niektórych pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, żadne z tych przeciwciał nie zostało oczyszczone i dla żadnego nie pokazano przydatności do hamowania aktywności IGF-I dla procedur diagnostycznych albo klinicznych. Patrz, np. Thompson i wsp., Pediat. Res. 32; 455459, 1988; Tappy i wsp., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightman i wsp., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage i wsp., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994. A zatem byłoby pożądane otrzymanie ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR o wysokim powinowactwie, które można by użyć do leczenia chorób u ludzi.
Krótki opis rysunków
Fig. 1A-1C przedstawiają dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych łańcucha lekkiego z sześciu ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR wzajemnie do siebie i do sekwencji z linii płciowej. Fig. 1A pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych łańcucha lekkiego (VL) przeciwciał 2.12.1 (SEK NR ID: 1), 2.13.2 (SEK NR ID: 5), 2.14.3 (SEK NR ID: 9) i 4.9.2 (SEK NR ID: 13) wzajemnie do siebie i do sekwencji Vk z linii płciowej A30 (SEK NR ID: 39). Fig. 1B pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VL z przeciwciała 4.17.3 (SEK NR ID: 17) do sekwencji Vk z linii płciowej 012 (SEK NR ID: 41). Fig. 1C pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VL z przeciwciała 6.1.1 (SEK NR ID: 21) do sekwencji Vk z linii płciowej A27 (SEK NR ID: 37). Dopasowanie pokazuje również regiony CDR z VL każdego przeciwciała. Sekwencje najwyższej zgodności dla Fig. 1A-1C są pokazane w SEK NR ID: 53-55, odpowiednio.
Fig. 2A-2D przedstawiają dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych łańcucha ciężkiego z sześciu ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR wzajemnie do siebie i do sekwencji z linii płciowej. Fig. 2A pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VH przeciwciała 2.12.1 BRIEF DESCRIPTI (SEK NR ID: 3) do sekwencji VH z linii płciowej DP-35 (SEK NR ID: 29). Fig. 2B pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VH przeciwciała 2.14.3 (SEK NR ID: 11) do sekwencji z linii płciowej VIV-4/4.35 (SEK NR ID: 43). Fig. 2C-1 i 2C-2 pokazują dopasowanie sekwencji nukleotydowych VH przeciwciał 2.13.2 (SEK NR ID: 7), 4.9.2 (SEK NR ID: 15) i 6.1.1 (SEK NR ID: 23) wzajemnie do siebie i do sekwencji VH z linii płciowej DP-47 (SEK NR ID: 31). Fig. 2D pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VH przeciwciała 4.17.3 (SEK NR ID: 19) do sekwencji VH z linii płciowej DP-71 (SEK NR ID: 35). Dopasowanie pokazuje również regiony CDR przeciwciał. Sekwencje najwyższej zgodności dla Fig. 2A - 2D są pokazane w SEK NR ID: 56-59, odpowiednio.
Fig. 3 pokazuje, że przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2, 4.9.2 i 2.12.1 hamują wiązanie się IGF-I do komórek 3T3-IGF-IR.
Fig. 4 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 4.9.2 hamuje indukowaną przez IGF-I fosforylację tyrozyny receptora (górna część) i indukuje obniżenie poziomu IGF-IR na powierzchni komórek (dolna część).
Fig. 5 pokazuje, że przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i 4.9.2 zmniejszają sygnał z fosfotyrozynyIGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR.
Fig. 6 pokazuje, że przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i 4.9.2 zmniejszają poziom IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR.
Fig. 7 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost nowotworu 3T3-IGF-IR in vivo, samo (lewa część) albo w połączeniu z adriamycyną (prawa część).
Fig. 8 pokazuje związek pomiędzy poziomami surowicy przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i obniżeniem poziomu IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR.
Fig. 9 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu 3T3-IGF-IR in vivo, same albo w połączeniu z adriamycyną.
Fig. 10 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost dużego nowotworu in vivo w połączeniu z adriamycyną.
PL 217 921 B1
Fig. 11 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost nowotworu Colo 205 in vivo, samo albo w połączeniu z 5-deoksyurydyną (5-FU).
Fig. 12 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-lGF-lR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu Colo 205 in vivo, same albo w połączeniu z 5-FU.
Fig. 13 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-lGF-lR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu MCF-7 in vivo, same albo w połączeniu z taksolem.
Fig. 14 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost nowotworu MCF-7 in vivo, samo (lewa część) albo w połączeniu z adriamycyną (prawa część).
Fig. 15 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu MCF-7 in vivo, same albo w połączeniu z tamoksyfenem.
Fig. 16 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu A431 in vivo same albo w połączeniu z inhibitorem kinazy tyrozynowej receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF-R) CP-358,774.
Fig. 17 przedstawia ocenę farmakokinetyczną pojedynczego dożylnego wstrzyknięcia przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 makakom z gatunku Macaca fascicularis.
Fig. 18 pokazuje, że połączenie przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i adriamycyny zwiększa obniżenie poziomu IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR in vivo.
Fig. 19A przedstawia liczbę mutacji w różnych regionach łańcuchów lekkich i ciężkich 2.13.2 i 2.12.1 w porównaniu do sekwencji z linii płciowej.
Fig. 19A-D przedstawiają dopasowanie sekwencji aminokwasowych łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciał 2.13.2 i 2.12.1 do sekwencji z linii płciowej, z których pochodzą. Fig. 19B przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.13.2 (SEK NR ID: 45) z sekwencją linii płciowej DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEK NR ID: 46). Fig. 19C pokazuje dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (SEK NR ID: 47) do sekwencji z linii płciowej A30/Jk2 (SEK NR ID: 48). Fig. 19D przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.12.1 (SEK NR ID: 49) do sekwencji z Iinii DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEK NR ID: 50). Fig. 19E przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.12.1 (SEK NR ID: 51) do sekwencji z linii płciowej A30/Jk2 (SEK NR ID: 52). Na Fig. 19B-E, sekwencje sygnałowe są zapisane kursywą, CDR są podkreślone, domeny zmienne są wytłuszczone, mutacje w regionie zrębowym (FR) są zaznaczone znakiem plus („+”) powyżej reszty aminokwasowej, a mutacje w CDR są zaznaczone gwiazdką powyżej reszty aminokwasowej.
W pierwszym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne albo jego część wiążąca antygen, które swoiście wiąże się z receptorem insulinopodobnego czynnika wzrostu I (IGF-IR), przy czym przeciwciało zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki, a sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego są odpowiednio wybrane z grupy składającej się z:
a) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA2788);
b) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 8 oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 6;
d) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 16 oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 14.
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, której sekwencja obejmuje nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen Vk A30 o linii zarodkowej.
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera łańcuch lekki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 6 lub SEK NR ID: 14, albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej, a korzystniej łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 6 lub SEK NR ID: 14.
Korzystnie, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, której sekwencja zawiera nie więcej niż osiem zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen VH DP47 linii zarodkowej.
PL 217 921 B1
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8 lub NR ID: 16 albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej, a korzystniej łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8 lub NR ID: 16.
Korzystnie łańcuch ciężki i łańcuch lekki przeciwciała albo jego części wiążącej antygen według wynalazku obejmują odpowiednio:
a) sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788); lub
b) sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789).
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku jest:
a) cząsteczką immunoglobuliny G(IgG), IgM, IgE, IgA lub IgD albo jest z niej otrzymane; lub
b) fragmentem Fab, fragmentem F(ab')2, fragmentem Fv, przeciwciałem jednołańcuchowym lub przeciwciałem bispecyficznym.
W szczególnie korzystnej postaci wykonania przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem
2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789), lub przeciwciałem o takich samych sekwencjach aminokwasowych, jak wybrane przeciwciało.
Korzystnie sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała według wynalazku stanowią:
a) odpowiednio sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego z 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788); lub
b) odpowiednio sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 45 bez sekwencji sygnałowej i sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 47 bez sekwencji sygnałowej.
W korzystnej postaci wykonania przeciwciało monoklonalne według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEK NR ID: 8, przy czym przeciwciało obejmuje ponadto sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEK NR ID: 6.
Również w korzystnej postaci wykonania przeciwciało monoklonalne według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą SEK NR ID: 8 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 konserwatywnymi substytucjami aminokwasowymi, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 6 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 substytucjami aminokwasowymi. Korzystniej, sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego przeciwciała według wynalazku zawiera SEK NR ID: 8, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 6.
Korzystnie sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego przeciwciała według wynalazku zawiera SEK NR ID: 45 bez sekwencji sygnałowej, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego tego przeciwciała zawiera SEK NR ID: 47 bez sekwencji sygnałowej.
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku ma co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z:
a) współzawodniczy o wiązanie z IGF-IR z przeciwciałem 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
b) wiąże się z tym samym epitopem IGF-IR, co przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) wiąże się z tym samym antygenem, który jest wiązany przez przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
d) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą KD jak przeciwciało wybrane z grupy składającej się z 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789); oraz
e) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą szybkością dysocjacji jak przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789).
Korzystniej przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku wykazuje wszystkie właściwości wskazane powyżej.
Korzystnie przeciwciało według wynalazku albo jego część wiążąca antygen wykazuje co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) nie wiąże się z IGF-IR myszy, szczura, psa lub królika;
b) wiąże się z IGF-IR makaka z gatunku Macaca faseieularis albo rezusa, ale nie z IGF-IR marmozety;
c) hamuje wiązanie IGF-I albo IGF-11 z IGF-IR;
PL 217 921 B1
d) wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny;
e) hamuje wzrost nowotworu in vivo;
f) powoduje zniknięcie IGF-IR z powierzchni komórki, podczas inkubacji z komórką wyrażającą IGF-IR;
g) hamuje indukowaną przez IGF-IR fosforylację tyrozyny;
h) wiąże się z IGF-IR z KD wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej; oraz -4 -1
i) wykazuje Koff dla IGF-IR wynoszącą 10-4s -1 lub mniejszą.
Korzystniej przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku wykazuje wszystkie te właściwości.
Najkorzystniej przeciwciało albo jego część według wynalazku hamuje wiązanie IGF-I lub IGF-II do IGF-IR, szczególnie korzystnie z IC50 wynoszącym 100 nM lub mniej, wiąże się do IGF-IR z Kd wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej i wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało albo jego część według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W korzystnej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera ponadto czynnik przeciwnowotworowy, chemioterapeutyczny, antyangiogenny albo anty-nowotworowy.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania przeciwciała według wynalazku obejmującego etapy:
a) immunizowania ssaka innego niż człowiek immunogenem zawierającym IGF-IR, przy czym ssak ma zdolność wyrażania ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;
b) izolowania komórek B z ssaka;
c) przeszukiwania takich komórek B albo linii komórkowych od nich pochodzących w celu zidentyfikowania linii komórkowej, która wytwarza przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR;
d) hodowania linii komórkowej, która wyraża przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR; i
e) izolowania przeciwciał, które wiążą się z IGF-IR z linii komórkowej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowana linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało według wynalazku. Korzystnie linia komórkowa według wynalazku wytwarza przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789) albo przeciwciało o takiej samej sekwencji aminokwasowej jak wybrane przeciwciało.
Wynalazek dostarcza również zastosowania przeciwciała lub jego części według wynalazku do wytwarzania leku do diagnozowania obecności albo umiejscowienia nowotworu wyrażającego IGF-IR u osobnika potrzebującego takiej diagnostyki.
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała lub jego części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u człowieka.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia hipeproliferacyjnego u pacjenta.
Korzystnie leczenie obejmuje ponadto etap podawania środka przeciwnowotworowego, antyrakowego, antyangiogennego albo chemioterapeutycznego.
Zgodnie z wynalazkiem przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku jest stosowana jako lek.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki Iub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała według wynalazku.
Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego cząsteczki według wynalazku koduje łańcuch ciężki Iub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego Iub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8 Iub SEK NR ID: 16; oraz
PL 217 921 B1
d) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 7 lub SEK NR ID: 15;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 28.
Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego cząsteczki według wynalazku koduje łańcuch lekki Iub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 6 Iub SEK NR ID: 14; oraz
d) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 5 lub SEK NR ID: 13;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 26.
Wynalazek dostarcza również wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, przy czym wektor ten zawiera ewentualnie sekwencję kontrolującą ekspresję połączoną funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto komórka gospodarza zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania przeciwciała anty-IGF-IR albo jego części wiążącej antygen, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku albo linii komórkowej według wynalazku w odpowiednich warunkach i odzyskiwanie takiego przeciwciała Iub jego części wiążącej antygen.
Wynalazek dostarcza zwierzę transgeniczne inne niż człowiek, które zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała według wynalazku, przy czym zwierzę to wyraża ten kwas nukleinowy.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie jednej lub więcej izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia osobnika, przy czym cząsteczka lub cząsteczki izolowanego kwas nukleinowego są wybrane z grupy składającej się z:
a) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała według wynalazku;
b) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała według wynalazku; oraz
c) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen oraz łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała według wynalazku;
d) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego z obu (a) i (b).
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki Iub jego część wiążącą antygen i wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki Iub jego część wiążącą antygen, lub wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen jak i łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, przeciwciała Iub jego części jak określono wyżej, do zastosowania jako lek.
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje i ogólne techniki
O ile nie zdefiniowano tu inaczej, terminy naukowe i techniczne użyte w niniejszym zgłoszeniu będą miały znaczenia powszechnie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie. Ponadto, o ile nie wymaga tego kontekst, terminy użyte w liczbie pojedynczej będą obejmować liczbę mnogą, a użyte w liczbie mnogiej będą obejmować liczbę pojedynczą. Ogólnie, nazewnictwo zastosowane w powiązaniu z oraz opisane tu techniki hodowli komórek i tkanek, biologii molekularnej, immunologii, mikrobiologii, genetyki i chemii białek i kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacji są tymi, które są dobrze znane i powszechnie stosowane w tej dziedzinie. Sposoby i techniki według niniejszego wynalazku przeprowadza się generalnie zgodnie ze zwykłymi metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie i jak
PL 217 921 B1 opisano w wielu ogólnych i bardziej szczegółowych odniesieniach, cytowanych i dyskutowanych w niniejszym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej. Patrz np. Sambrook i wsp. Molecular cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) oraz Harlow i Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), które są tu włączone jako odniesienie. Reakcje enzymatyczne oraz techniki oczyszczania przeprowadzane są zgodnie z opisem producenta, jak to się zwykle czyni w tej dziedzinie albo jak tu opisano. Nazewnictwo zastosowane w powiązaniu z oraz opisane tu techniki i procedury laboratoryjne chemii analitycznej, chemii syntezy organicznej, chemii medycznej i farmaceutycznej są dobrze znane i powszechnie stosowane w tej dziedzinie. Standardowe techniki zastosowano do syntez chemicznych, analiz chemicznych, przygotowywania, wytwarzania i dostarczania farmaceutyków oraz leczenia pacjentów.
Następujące terminy, o ile nie zaznaczono inaczej, powinny być rozumiane w następujących znaczeniach:
Termin „polipeptyd” obejmuje białka natywne albo sztuczne, fragmenty białkowe albo analogi polipeptydowe sekwencji białkowej. Polipeptyd może być monomeryczny albo polimeryczny.
Termin „wyizolowane białko” albo „wyizolowany polipeptyd” to białko albo polipeptyd, który wskutek swego pochodzenia lub źródła, z którego pochodzi (1) nie jest związany ze związanymi z nim naturalnie składnikami, które towarzyszą mu w jego stanie natywnym, (2) jest wolny od innych białek z tego samego gatunku, (3) jest wyrażany przez komórkę innego gatunku lub (4) nie występuje w naturze. A zatem polipeptyd, który jest zsyntetyzowany chemicznie albo zsyntetyzowany w systemie komórkowym różnym od komórki, z której naturalnie pochodzi, będzie „wyizolowany” w odniesieniu do związanych z nim naturalnie składników. Białko można uczynić zasadniczo wolnym od związanych z nim naturalnie składników poprzez izolację, przy zastosowaniu technik oczyszczania białka dobrze znanych w tej dziedzinie.
Białko albo polipeptyd jest „zasadniczo czysty”, „zasadniczo homogenny” albo „zasadniczo oczyszczony” kiedy przynajmniej około 60 do 75% próbki stanowi pojedynczy rodzaj polipeptydu. Polipeptyd może być monomeryczny albo polimeryczny. Zasadniczo czysty polipeptyd albo białko będzie zawierało typowo około 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% wag./wag. próbki białkowej, zwykle około 95%, a korzystniej, będzie czysty w 99%. Czystość albo homogenność białka można wykazać wieloma sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie, takimi jak elektroforeza próbki białkowej w żelu poliakryloamidowym, a następnie wizualizacja pojedynczego prążka polipeptydowego po wybarwieniu żelu barwnikiem dobrze znanym w tej dziedzinie. Dla pewnych celów można dostarczyć lepszego rozdziału poprzez zastosowanie HPLC albo innych sposobów znanych w tej dziedzinie.
Stosowany tu termin „fragment polipeptydowy” odnosi się do polipeptydu, który ma delecję na końcu aminokwasowym i/lub karboksylowym, ale gdzie pozostała sekwencja aminokwasowa jest identyczna z odpowiednimi pozycjami w sekwencji występującej naturalnie. Fragmenty zwykle mają długość przynajmniej 5, 6, 8 lub 10 aminokwasów, korzystnie długość przynajmniej 14 aminokwasów, bardziej korzystnie długość przynajmniej 20 aminokwasów, zazwyczaj długość przynajmniej 50 aminokwasów, a jeszcze korzystniej długość przynajmniej 70, 80, 90, 100, 150 albo 200 aminokwasów.
Stosowany tu termin „analog peptydowy” dotyczy polipeptydu, który składa się z odcinka przynajmniej 25 aminokwasów, który wykazuje zasadniczą identyczność z częścią sekwencji aminokwasowej i który ma przynajmniej jedną z następujących właściwości: (1) specyficzne wiązanie do IGF-IR w odpowiednich warunkach wiązania, (2) zdolność do blokowania wiązania się IGF-I lub IGF-II z IGFIR lub (3) zdolność do zmniejszania ekspresji IGF-IR na powierzchni komórek albo fosforylacji tyrozyny in vitro lub in vivo. Zazwyczaj analogi polipeptydowe zawierają konserwatywne podstawienie aminokwasowe (albo addycję lub delecję) w odniesieniu do sekwencji występującej naturalnie. Analogi zazwyczaj mają długość przynajmniej 20 aminokwasów, korzystnie długość przynajmniej 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 lub 200 aminokwasów albo więcej i często mogą być tak długie jak polipeptyd występujący naturalnie.
Korzystne podstawienia aminokwasowe to takie, które: (1) zmniejszają podatność na proteolizę, (2) zmniejszają podatność na utlenianie, (3) zmieniają powinowactwo wiązania do tworzenia kompleksów białkowych, (4) zmieniają powinowactwa wiązania i (4) nadają albo modyfikują inne właściwości fizykochemiczne albo funkcjonalne takich analogów. Analogi mogą obejmować różne muteiny sekwencji inne niż występująca naturalnie sekwencja peptydowa. Przykładowo, można dokonać pojedynczych albo wielokrotnych podstawień aminokwasowych (korzystnie podstawień konserwowanych
PL 217 921 B1 aminokwasów) w naturalnie występującej sekwencji (korzystnie w części polipeptydu poza domeną(ami) tworzącą międzycząsteczkowe miejsca styku. Konserwatywne podstawienia nie powinny zasadniczo zmieniać właściwości strukturalnych sekwencji rodzicielskiej (np. zastępujący aminokwas nie powinien mieć tendencji do niszczenia helisy, która występuje w sekwencji rodzicielskiej albo niszczyć innych typów struktury drugorzędowej, która charakteryzuje sekwencję rodzicielską). Przykłady znanych w tej dziedzinie drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur polipeptydowych są opisane w Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, wyd., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, wyd. Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) oraz Thornton i wsp. Nature 354: 105 (1991), które są tu włączone jako odniesienie.
Analogi niepeptydowe są powszechnie używane w przemyśle farmaceutycznym jako leki o właściwościach analogicznych do właściwości peptydu będącego ich wzorem. Ten rodzaj niepeptydowych związków nazywa się „mimetykami peptydów” lub „peptydomimetykami”. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber i Freidinger TINS str. 392 (1985) oraz Evans i wsp. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), które są tu włączone jako odniesienie. Takie związki projektuje się często przy pomocy komputerowego modelowania cząsteczek. Mimetyki peptydów, które są strukturalnie podobne do przydatnych leczniczo peptydów, można zastosować w celu uzyskania ekwiwalentnego efektu profilaktycznego lub terapeutycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do wzorcowego peptydu (tj. polipeptydu, który ma pożądaną właściwość biochemiczną lub aktywność farmakologiczną), takiego jak ludzkie przeciwciało, ale mają jedno lub więcej wiązań peptydowych fakultatywnie zastąpionych wiązaniem wybranym z grupy składającej się z -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- oraz -CH2SO-, przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Do wytworzenia bardziej stabilnego peptydu można wykorzystać systematyczne podstawianie jednego lub więcej aminokwasu sekwencji najwyższej zgodności D-aminokwasem tego samego rodzaju (np. D-Iizyna w miejsce L-lizyny). Ponadto, można wytworzyć peptydy związane wewnętrznie zawierające sekwencję najwyższej zgodności albo zasadniczo identyczny wariant sekwencji najwyższej zgodności metodami znanymi w tej dziedzinie (Rizo i Gierasch Ann Rev. Biochem. 61: 387 (1997), włączony tu jako odniesienie); przykładowo, dodając wewnętrzne reszty cysteinowe, pozwalające na tworzenie mostków dwusiarczkowych, które cyklizują peptyd.
„Immunoglobulina” to cząsteczka tetrameryczna. W naturalnie występującej immunoglobulinie każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, gdzie każda para ma jeden łańcuch „lekki” (około 25 kDa) i jeden łańcuch „ciężki” (około 50-70 kDa). Część aminokońcowa każdego łańcucha zawiera region zmienny złożony ze 100 do 110 lub więcej aminokwasów odpowiedzialnych przede wszystkim za rozpoznanie antygenu. Część karboksy-końcowa każdego łańcucha definiuje region stały odpowiedzialny głównie za funkcję efektorową. Ludzkie łańcuchy lekkie są sklasyfikowane jako łańcuchy κ i λ. Łańcuchy ciężkie są sklasyfikowane jako μ, Δ, γ, α lub ε i definiują izotyp przeciwciała jako odpowiednio, IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. W obrębie łańcuchów lekkiego i ciężkiego, regiony zmienne i stałe są połączone przez region „J” składający się z około 12 lub więcej aminokwasów, z łańcuchem ciężkim obejmującym również region „D” składający się z około 10 lub więcej aminokwasów. Patrz ogólnie, Fundamental Immunology Roz. 7 (Paul, W., Wyd., wyd. 2. Raven Press, N. Y. (1989)) (włączone tu w całości jako odniesienie dla wszelkich celów). Regiony zmienne każdej pary łańcuchów lekkiego/ciężkiego tworzą miejsce wiązania przeciwciała, a zatem nienaruszona immunoglobulina ma dwa miejsca wiązania.
Łańcuchy immunoglobulin mają taką samą ogólną strukturę stosunkowo konserwatywnych regionów zrębowych (FR) połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, zwanymi również regionami determinującymi dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów z każdej pary są odpowiednio umiejscowione dzięki regionom zrębowym, co umożliwia wiązanie swoistego epitopu. Od końca N do końca C, obydwa łańcuchy, lekki i ciężki zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Aminokwasy przypisuje się do odpowiedniej domeny zgodnie z definicją z Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) albo Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia i wsp. Nature 342: 878-883 (1989).
„Przeciwciało” odnosi się do nienaruszonej immunoglobuliny lub jej części wiążącej antygen, która współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem w swoistym wiązaniu. Fragmenty wiążące antygen można wytworzyć technikami rekombinowania DNA lub przez chemiczne albo enzymatyczne cięcie nienaruszonych przeciwciał. Fragmenty wiążące antygen obejmują między innymi Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb oraz fragmenty regionów determinujących dopasowanie (CDR), przeciwciała jednoPL 217 921 B1 łańcuchowe (scFv), przeciwciała chimerowe, diciała i polipeptydy, które zawierają co najmniej część immunoglobuliny, która jest wystarczająca dla nadania polipeptydowi specyficzności wiązania antygenu.
W tym zgłoszeniu przeciwciało, które jest określane jako np. 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1, to przeciwciało, które pochodzi z hybrydomy o tej samej nazwie. Przykładowo, przeciwciało
2.12.1 pochodzi z hybrydomy 2.12.1.
Fragment Fab to monowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH I; fragment F(ab')2 to dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkami dwusiarczkowymi w regionie zawiasowym; fragment Fd składa się z domen VH i CH1 fragment Fv składa się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, a fragment dAb (Ward i wsp., Nature 341: 544-546, 1989) składa się z domeny VH.
Przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) to przeciwciało, w którym regiony VL i VH są sparowane tworząc cząsteczkę monowartościową za pośrednictwem syntetycznego łącznika, który umożliwia wytworzenie go w postaci pojedynczego łańcucha białkowego (Bird i wsp., Science 242: 423-426, 1988 oraz Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Diciała to dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała, w których regiony VL i VH są wyrażane jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, ale przy użyciu łącznika, który jest za krótki aby umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, forsując w ten sposób parowanie komplementarnych domen z innego łańcucha i tworząc dwa miejsca wiązania antygenu (patrz np., Holliger, P., i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993 oraz Poljak, R. J., i wsp., Structure 2: 1121 - 1123, 1994). Do cząsteczki może być wstawiony kowalencyjnie albo niekowalencyjnie jeden albo więcej CDR, co czyni je immunoadhezyną. Immunoadhezyna może zawierać CDR(y) jako część większego łańcucha polipeptydowego, może wiązać kowalencyjnie CDR(y) z innym łańcuchem polipeptydowym albo może mieć wstawiony CDR(y) niekowalencyjnie. CDR umożliwiają immunoadhezynie swoiste wiązanie z konkretnym antygenem będącym przedmiotem zainteresowania.
Przeciwciało może mieć jedno albo więcej miejsc wiążących. Jeżeli występuje więcej niż jedno miejsce wiążące, miejsca wiążące mogą być identyczne względem siebie albo mogą być równoważne. Przykładowo, naturalnie występująca immunoglobulina ma dwa identyczne miejsca wiążące, przeciwciało jednołańcuchowe albo fragment Fab ma jedno miejsce wiążące, podczas gdy przeciwciało „bispecyficzne” lub „bifunkcyjne” ma dwa miejsca wiążące.
„Przeciwciało wyizolowane” to przeciwciało, które (1) nie jest związane ze składnikami związanymi z nim naturalnie, które towarzyszą mu w jego stanie natywnym, (2) jest wolne od innych białek z tego samego gatunku, (3) jest wyrażane przez komórkę innego gatunku lub (4) nie występuje w naturze. Przykłady wyizolowanych przeciwciał obejmują przeciwciało anty-IGF-IR, które zostało oczyszczone przez powinowactwo z użyciem IGF-IR, przeciwciało anty-IGF-IR, które zostało zsyntetyzowane przez hybrydomę albo inną linię komórkową in vitro oraz ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR pochodzące z myszy transgenicznej.
Termin „przeciwciało ludzkie” obejmuje wszystkie przeciwciała, które mają jeden albo więcej regionów zmiennych i stałych pochodzących z sekwencji ludzkich immunoglobulin. W korzystnym wykonaniu wszystkie domeny zmienne i stałe pochodzą z sekwencji ludzkich immunoglobulin (całkowicie ludzkie przeciwciało). Przeciwciała te można wytworzyć wieloma sposobami, jak opisano poniżej.
Przeciwciało humanizowane to przeciwciało, które pochodzi z gatunków innych niż człowiek, w których pewne aminokwasy w domenach zrębowych i stałych zostały zmutowane, tak aby uniknąć albo znieść odpowiedź immunologiczną u ludzi. Alternatywnie, przeciwciało humanizowane można wytworzyć poprzez połączenie domen stałych i przeciwciała ludzkiego z domenami zmiennymi gatunków innych niż człowiek. Przykłady, w jaki sposób wytwarzać humanizowane przeciwciała można znaleźć w patentach USA nr 6054297, 5886152 i 5877293.
Termin „przeciwciało chimerowe” dotyczy przeciwciała, które zawiera jeden albo więcej regionów z jednego przeciwciała i jeden albo więcej regionów z innych przeciwciał. W korzystnym wykonaniu jeden albo więcej CDR pochodzi z ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu, wszystkie CDR pochodzą z ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR. W innym korzystnym wykonaniu, CDR z więcej niż jednego ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR są pomieszane i dopasowane w chimerowym przeciwciele. Przykładowo, chimerowe przeciwciało może zawierać CDR1 z łańcucha lekkiego pierwszego ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR, który może być połączony z CDR2 i CDR3 z łańcucha lekkiego drugiego ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR, a CDR łańcucha ciężkiego mogą pochodzić z trzeciego przeciwciała anty-IGF-IR. Ponadto, regiony zrębowe mogą pochodzić z jednego
PL 217 921 B1 z tych samych przeciwciał anty-IGF-IR, z jednego albo większej liczby innych przeciwciał, takich jak przeciwciało ludzkie albo z przeciwciała humanizowanego.
„Przeciwciało neutralizujące” albo „przeciwciało hamujące” to przeciwciało, które hamuje wiązanie IGF-IR z IGF-I, kiedy nadmiar przeciwciała anty-IGF-IR zmniejsza ilość IGF-I związanego z IGF-IR o co najmniej 20%. W korzystnym wykonaniu przeciwciało zmniejsza ilość IGF-I związanego z IGF-IR o co najmniej 40%, korzystniej 60%, jeszcze korzystniej 80%, a nawet bardziej korzystnie 85%.
Zmniejszenie wiązania można mierzyć dowolnymi sposobami znanymi specjaliście w tej dziedzinie, na przykład mierzyć jako test współzawodnictwa o wiązanie in vitro. Przykład pomiaru zmniejszania wiązania się IGF-I z IGF-IR jest przedstawiony poniżej w Przykładzie IV.
„Przeciwciało aktywujące” to przeciwciało, które aktywuje IGF-IR o co najmniej 20% po dodaniu do komórki, tkanki albo organizmu wyrażającego IGF-IR. W korzystnym wykonaniu przeciwciało aktywuje aktywność IGF-IR o co najmniej 40%, korzystniej 60%, jeszcze korzystniej 80%, a nawet bardziej korzystnie 85%. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu aktywujące przeciwciało dodaje się w obecności IGF-I lub IGF-II. W innym korzystnym wykonaniu a ktywność przeciwciała aktywującego mierzy się poprzez ustalenie ilości autofosforyIacji tyrozyny IGF-IR.
Fragmenty lub analogi przeciwciał mogą zostać łatwo wytworzone przez specjalistę w tej dziedzinie na podstawie wskazówek z tego opisu. Korzystne końce aminowe i karboksylowe fragmentów lub analogów występują blisko granic domen funkcjonalnych. Domeny strukturalne i funkcjonalne można zidentyfikować porównując dane o sekwencji nukleotydowej i/lub aminokwasowej z publiczn ymi lub prywatnymi bazami danych sekwencji. Korzystne jest wykorzystanie komputerowych metod porównawczych do identyfikacji motywów sekwencji lub przewidywanych domen konformacyjnych białka występujących w innych białkach o znanej strukturze i/lub funkcji. Znane są metody identyfikacji sekwencji białkowych, które fałdują się w znane struktury trójwymiarowe. Bowie i wsp., Science 253: 164 (1991).
Stosowany tu termin „powierzchniowy rezonas plazmonowy” dotyczy zjawiska optycznego, które umożliwia analizę oddziaływań biospecyficznych w czasie rzeczywistym poprzez wykrywanie zmian w stężeniach białek w obrębie matrycy biosensora, na przykład przy użyciu systemu BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden oraz Piscataway, N.J.). Dla dalszych szczegółów, patrz, Jonsson, 11: i wsp., (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., i wsp., (1991) Biotechniques 11: 620627; Johnsson, B., i wsp. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 oraz Johnson, B., i wsp. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Termin „Koff” dotyczy stałej odłączania się przy dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen.
Termin „Kd” dotyczy stałej dysocjacji dla konkretnego oddziaływania przeciwciało-antygen.
Termin „epitop” obejmuje dowolne białko zdolne do specyficznego wiązania z immunoglobuliną lub receptorem komórki T. Determinanty epitopów zwykle składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych zgrupowań cząsteczek, takich jak aminokwasy Iub boczne łańcuchy cukrowe i zazwyczaj posiadają specyficzną trójwymiarową charakterystykę, jak również specyficzny ładunek. Uważa się, że przeciwciało wiąże swoiście antygen, jeśli stała dysocjacji wynosi <1 μΜ, korzystnie <100 nM, najkorzystniej <10 nM.
Stosowane tu nazwy dwudziestu zwykłych aminokwasów i ich skróty są zgodne z konwencjonalnym użyciem. Patrz Immunology - A Synthesis (drugie wydanie, E.S. Golub D.R. Green, Wyd., Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)), które jest tu włączone jako odniesienie. Odpowiednimi składnikami polipeptydów według niniejszego wynalazku mogą również być stereoizomery (np. D-aminokwasy) dwudziestu zwykłych aminokwasów, aminokwasy nie występujące w naturze, takie jak jak α,α-dipodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy i inne niekonwencjonalne aminokwasy. Przykłady niekonwencjonalnych aminokwasów obejmują: 4-hydroksyprolinę, γ-karboksyglutaminian, ε-Ν,Ν,Ν-trimetylolizynę, ε-Ν-acetylolizynę, O-fosfoserynę, N-acetyloserynę, N-formylometioninę, 3-metylohistydynę, 5-hydroksylizynę, σ-Ν-metyloargininę i inne podobne aminokwasy oraz iminokwasy (np. 4-hydroksyprolinę). W stosowanym tu zapisie polipeptydu lewa strona odpowiada końcowi aminowemu, a prawa strona końcowi karboksylowemu, zgodnie ze standardowym zapisem i zwyczajem.
Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „polinukleotyd” oznacza polimeryczną formę nukleotydów o długości co najmniej 10 zasad, bądź to rybonukleotydów, bądź deoksyrybonukleotydów, bądź zmodyfikowanej postaci któregokolwiek typu nukleotydu. Termin obejmuje jednoniciowe i dwuniciowe formy DNA.
PL 217 921 B1
Użyty w niniejszym zgłoszeniu termin „wyizolowany polinukleotyd” ma oznaczać polinukleotyd pochodzenia genomowego, cDNA, bądź syntetycznego lub też pewnych ich kombinacji, który wskutek swego pochodzenia (1) nie jest połączony z całym lub fragmentem polinukleotydu, w którym „wyizolowany polinukleotyd” znajduje się w naturze, (2) jest połączony funkcjonalnie z polinukleotydem, z którym nie jest połączony w naturze albo (3) nie występuje naturalnie jako część większej sekwencji.
Stosowany tu termin „oligonukleotyd” obejmuje występujące naturalnie oraz modyfikowane nukleotydy połączone razem występującymi naturalnie oraz nie występującymi naturalnie wiązaniami oligonukleotydowymi. Oligonukleotydy są podzbiorem polinukleotydów o długości 200 zasad lub mniej. Korzystnie oligonukleotydy mają długość 10 do 60 zasad, a najkorzystniej długość 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 do 40 zasad. Oligonukleotydy zwykle są jednoniciowe, np. jako sondy, choć oligonukleotydy mogą również być dwuniciowe, np. stosowane do konstrukcji zmutowanego genu. Oligonukleotydy według wynalazku mogą być zarówno sensowne, jak i antysensowne.
Używany tu termin „nukleotydy występujące naturalnie” obejmuje deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy. Stosowany tu termin „nukleotydy zmodyfikowane” obejmuje nukleotydy z modyfikowaną lub podstawioną grupą cukrową i tym podobne. Używany tu termin „wiązania oligonukleotydowe” obejmuje takie wiązania oligonukleotydowe jak fosforotionianowe, fosforoditionianowe, fosforoselenianowe, fosforodwuselenianowe, fosforoanilotionianowe, fosforoanilidowe, fosforoamidowe i tym podobne. Patrz np. LaPlanclie i wsp., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec i wsp., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein i wsp., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon i wsp. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon i wsp. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, wyd. Oxford Uniwersity Press, Oxford England (1991)); Stec i wsp. Patent USA nr 5 151 510; Uhlmann i Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), ujawnienia których są tu włączone jako odniesienia. Oligonukleotyd może zawierać znacznik do wykrywania, jeśli to pożądane.
Sekwencje „połączone funkcjonalnie” obejmują zarówno sekwencje kontrolne dla ekspresji, które są ciągłe z genem będącym przedmiotem zainteresowania, jak i sekwencje kontrolne dla ekspresji, które działają w układzie trans albo w pewnej odległości kontrolując gen będący przedmiotem zainteresowania. Stosowany tu termin „sekwencje kontrolne dla ekspresji” dotyczą sekwencji polinukleotydowych, które są niezbędne dla uzyskania ekspresji i obróbki sekwencji kodujących, z którymi są połączone poprzez ligację. Sekwencje kontrolne dla ekspresji obejmują odpowiednie sekwencje dla inicjacji transkrypcji, terminacji, sekwencje promotora i wzmacniacza; wydajne sygnały obróbki RNA, takie jak sygnały składania mRNA i poliadenylacji; sekwencje, które stabilizują cytoplazmatyczny mRNA; sekwencje, które wzmacniają wydajność translacji (tj. sekwencję najwyższej zgodności Kozak); sekwencje, które zwiększają stabilność białek oraz, jeśli to pożądane, sekwencje, które zwiększają wydzielanie białek. Natura takich sekwencji kontrolnych jest różna w zależności od organizmu gospodarza; u organizmów prokariotycznych takie sekwencje kontrolne obejmują generalnie promotor, miejsce wiązania rybosomów, sekwencję terminacji dla transkrypcji; u organizmów eukariotycznych takie sekwencje kontrolne obejmują promotory, miejsce wiązania rybosomów i sekwencję terminacji dla transkrypcji. Termin „sekwencje kontrolne” ma obejmować co najmniej wszystkie składniki, których obecność jest niezbędna dla ekspresji i obróbki, a także może obejmować dodatkowe składniki, których obecność jest korzystna, na przykład sekwencje Iiderowe i sekwencje partnera fuzji.
Stosowany tu termin „wektor” ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, do którego został dołączony. Jednym z typów wektora jest „plazmid”, który oznacza kolistą dwuniciową pętlę, do której można dołączać poprzez ligację dodatkowe odcinki DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, gdzie dodatkowe odcinki DNA można włączyć poprzez ligację do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne mające bakteryjny początek replikacji i episomowe wektory ssacze). Inne wektory (np. nie-episomowe wektory ssacze) mogą zostać włączone do genomu komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i dzięki temu ulegają replikacji razem z genomem gospodarza. Ponadto, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi zostały połączone funkcjonalnie. Takie wektory określa się tu jako „zrekombinowane wektory ekspresyjne (albo po prostu „wektory ekspresyjne”). Generalnie, wektory ekspresyjne mające zastosowanie w technikach rekombinowania DNA mają często postać plazmidu. W niniejszym zgłoszeniu „plazmid” i „wektor” mogą być używane wymiennie jako że plazmid jest najpowszechniej używaną postacią wektora. Jednakże wynalazek ma obejmować te inne postaci wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np. retrowirusy
PL 217 921 B1 defektywne pod względem replikacji, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami), które spełniają ekwiwalentne funkcje.
Stosowany tu termin „zrekombinowana komórka gospodarza” (albo po prostu „komórka gospodarza”) ma odnosić się do komórki, do której został wprowadzony zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być zrozumiałe, że takie terminy mają dotyczyć nie tylko konkretnej komórki osobnika, ale potomstwa takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach mogą nastąpić pewne modyfikacje, bądź na skutek mutacji, bądź wpływów środowiska, takie potomstwo może nie być w rzeczywistości identyczne z komórką rodzicielską, ale jest nadal objęte zakresem stosowanego tu terminu „komórka gospodarza”.
Stosowany tu termin „wybiórczo hybrydyzuje” odnosi się do wykrywalnego i specyficznego wiązania. Polinukleotydy, oligonukleotydy i ich fragmenty według niniejszego wynalazku wybiórczo hybrydyzują z łańcuchami kwasów nukleinowych w warunkach hybrydyzacji i płukania, które minimalizują znaczne ilości wykrywalnego wiązania do niespecyficznych kwasów nukleinowych. Przykładem warunków „o wysokiej ostrości” albo „wysoce ostrych” jest metoda inkubowania polinukleotydu z innym polinukleotydem, gdzie jeden polinukleotyd może być przytwierdzony do stałej powierzchni, takiej jak membrana, w buforze do hybrydyzacji zawierającym 6X SSPE lub SSC, 50% formamid, 5X odczynnik Denhardta, 0,5% SDS, 100 μg/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia w temperaturze hybrydyzacji 42°C przez 12-16 godzin, po czym następuje dwukrotne płukanie w 55°C przy użyciu buforu do płukania zawierającego 1X SSC, 0,5% SDS. Patrz również Sambrook i wsp., jak wyżej, str. 9.50-9.55.
Termin „procent identyczności sekwencji” w kontekście sekwencji kwasów nukleinowych dotyczy reszt w dwóch sekwencjach, które są takie same po dopasowaniu tak, aby maksymalnie sobie odpowiadały. Porównywanie identyczności sekwencji można przeprowadzić na odcinku o długości co najmniej około dziewięciu nukleotydów, zwykle co najmniej około 18 nukleotydów, częściej co najmniej około 18 nukleotydów, typowo co najmniej około 28 nukleotydów, jeszcze bardziej typowo co najmniej około 32 nukleotydów, a korzystnie co najmniej około 36, 48 lub więcej nukleotydów. Istnieje kilka różnych algorytmów znanych w tej dziedzinie, które można zastosować do mierzenia identyczności sekwencji nukleotydowych. Przykładowo, sekwencje polinukleotydowe można porównywać stosując FASTA, Gap lub Bestfit, które są programami w pakiecie Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, który obejmuje np. programy FASTA2 i FASTA3, dopasowuje sekwencje i określa procent identyczności sekwencji dla regionów, które najlepiej pasują do siebie w sekwencjach stanowiących zapytanie i przeszukiwanych (Pearson, Methods
Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); włączone tu jako odniesienie). O ile nie zaznaczono inaczej dla konkretnego programu albo algorytmu stosuje się parametry domyślne. Przykładowo, procent identyczności sekwencji pomiędzy sekwencjami kwasu nukleinowego można określić stosując FASTA z jego parametrami domyślnymi (wielkość słowa 6 i czynnik NOPAM dla tablicy porównania) albo stosując Gap z parametrami dostarczonymi w GCG Wersja 6.1, włączone tu jako odniesienie.
Odniesienie się do sekwencji kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję do niego komplementarną, o ile nie zaznaczono inaczej. A zatem powinno być zrozumiałe, że odniesienie się do cząsteczki kwasu nukleinowego mającej określoną sekwencję obejmuje jej nić komplementarną o sekwencji do niej komplementarnej.
W dziedzinie biologii molekularnej badacze stosują termin „procent identyczności sekwencji”, „procent podobieństwa sekwencji”, „procent homologii sekwencji” wymiennie. W tym zgłoszeniu terminy te będą miały takie samo znaczenie jedynie w odniesieniu do sekwencji kwasów nukleinowych.
Termin „zasadnicze podobieństwo” albo „zasadnicze podobieństwo sekwencji” w odniesieniu do kwasu nukleinowego albo jego fragmentu wskazuje, że po optymalnym dopasowaniu, z uwzględnieniem odpowiednich insercji albo delecji nukleotydowych, z innym kwasem nukleinowym (albo jego nicią komplementarną) ma miejsce identyczność sekwencji nukleotydowej dla co najmniej 85%, korzystnie co najmniej około 90%, a korzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% zasad nukleotydowych mierzonej przy zastosowaniu dowolnego dobrze znanego algorytmu identyczności sekwencji takiego jak FASTA, BLAST lub Gap, jak dyskutowano powyżej.
Stosowany w odniesieniu do polipeptydów termin „zasadnicza identyczność” oznacza, że dwie sekwencje peptydowe, po optymalnym dopasowaniu, np. przy pomocy programów GAP czy BESTFIT z typowymi wagami dla przerw, wykazują co najmniej 75% lub 80% identyczności sekwencji, korzystPL 217 921 B1 niej co najmniej 90% Iub 95% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie co najmniej 98% lub 99% identyczności sekwencji. Korzystnie, jeżeli pozycje reszt, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi. „Konserwatywne podstawienie aminokwasowe” to takie, w którym reszta aminokwasowa jest zastąpiona przez inną resztę aminokwasową mającą łańcuch boczny (grupę R) o podobnych właściwościach chemicznych (np. ładunku albo hydrofobowości). Ogólnie, konserwatywne podstawienie aminokwasowe nie będzie zasadniczo zmieniać właściwości funkcjonalnych białka. W przypadku, gdy dwie Iub więcej sekwencje aminokwasowe różnią się od siebie konserwatywnymi podstawieniami, procent identyczności sekwencji albo stopień można zwiększyć dokonując korekty z uwzględnieniem konserwatywnej natury podstawienia. Sposoby dokonywania takiej korekty są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Patrz np., Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 (1994), włączone tu jako odniesienie. Przykłady grupy aminokwasów, które mają łańcuchy boczne o podobnych właściwościach chemicznych obejmują 1) alifatyczne łańcuchy boczne: glicyna, alanina, walina, Iecucyna i izoleucyna; 2) alifatyczno-hydroksylowe łańcuchy boczne: seryna i treonina; 3) łańcuchy boczne zawierające grupę amidową: asparagina i glutamina; 4) aromatyczne łańcuchy boczne: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; 5) zasadowe łańcuchy boczne: lizyna, arginina i histydyna; 6) łańcuchy boczne zawierające siarkę: cysteina i metionina. Korzystnymi konserwatywnymi grupami podstawień aminokwasowych są: walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, asparaginian-glutaminian i asparagina-glutamina.
Alternatywnie, konserwatywne podstawienie jest dowolną zmianą mającą wartość dodatnią w macierzy log wiarygodności PAM250 ujawnionej w Gonnet i wsp., Science 256: 1443-45 (1992), włączone tu jako odniesienie. „Średnio konserwatywne podstawienie” to dowolna zmiana mająca wartość macierzy log wiarygodności PAM250.
Podobieństwo sekwencji dla polipeptydów, które określa się również jako identyczność sekwencji mierzy się zazwyczaj przy zastosowaniu analizy komputerowej. Oprogramowanie do analizy białek dopasowuje podobne sekwencje stosując miary podobieństwa przypisane różnym podstawieniom, delecjom i innym modyfikacjom, włączając w to konserwatywne podstawienia aminokwasowe. Przykładowo, GCG zawiera programy, takie jak „Gap” i „Bestfit”, które można użyć z parametrami domyślnymi w celu ustalenia homologii sekwencji albo identyczności sekwencji pomiędzy ściśle spokrewnionymi polipeptydami, takimi jak homologiczne polipeptydy z różnych gatunków organizmów albo pomiędzy białkiem typu dzikiego a jego muteiną. Np., GCG Version 6.1. Sekwencje polipeptydowe można również porównywać przy użyciu FASTA z zastosowaniem parametrów domyślnych albo zalecanych, program w GCG Version 6.1. FASTA (np. FASTA2 i FASTA3) daje dopasowanie i procent identyczności sekwencji najlepiej pasujących regionów sekwencji wyjściowej i przeszukiwanych (Pearson (1990); Pearson (2000). Innym korzystnym algorytmem przy porównywaniu sekwencji według wynalazku z bazą danych zawierającą dużą liczbę sekwencji z różnych organizmów jest program komputerowy BLAST, a w szczególności blastp lub tblastn, z zastosowaniem parametrów domyślnych. Patrz, np. Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); włączone tu jako odniesienie.
Długość sekwencji polipeptydowych porównywanych pod kątem homologii będzie wynosiła generalnie co najmniej 16 reszt aminokwasowych, zwykle co najmniej 20 reszt, jeszcze częściej co najmniej 24 reszty, typowo co najmniej 28 reszt, a korzystnie ponad 35 reszt. Kiedy przeszukuje się bazę danych zawierającą sekwencje z dużej liczby różnych organizmów, korzystne jest porównywanie sekwencji aminokwasowych.
Stosowane tu terminy „znacznik” albo „wyznakowany” dotyczy włączania innej cząsteczki do przeciwciała. W jednym z wykonań znacznikiem jest wykrywalny marker, np. włączenie wyznakowanego radioaktywnie aminokwasu lub dołączenie do polipeptydu cząsteczek biotynylowych, które można wykryć znakowaną awidyną (np. streptawidyną zawierającą znacznik fluorescencyjny lub o aktywności enzymatycznej, który można wykryć metodami optycznymi bądź enzymatycznymi). W innym wykonaniu znacznik Iub marker mogą również być lecznicze, np. połączenie z lekiem albo toksyną. Można zastosować rozmaite metody znakowania polipeptydów i glikoprotein znane w tej dziedzinie. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują między innymi następujące: radioizotopy lub radionuklidy (np. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99TC 111In, 125I, 131I), znaczniki fluorescencyjne (np. FITC, rodamina, lantanidofosfory), znaczniki enzymatyczne (np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, alkaliczna fosfataza), znaczniki chemiluminescencyjne, grupy biotynylowe, określone uprzednio epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędowy wskaźnik (sekwencje suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiązania metali, znaczniki epitopowe)
PL 217 921 B1 czynniki magnetycze, takie jak chelaty gadoliny, toksyny, takie jak toksyna krztuśca, taksol, cytochalasyna B, gramicydyna D, bromek etydyny, emetyna, mitomycyna, etopozyd, tenopozyd, winkrystyna, winblastyna, kolchicyna, doksorubicyna, daunorubicyna, dihydroksyantracynodion, mitoksantron, mitramycyna, aktynomycyna D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokaina, tetrakaina, lidokaina, propranolol oraz puromycyna i jej analogi lub homologi. W niektórych wykonaniach, znaczniki są przyłączone poprzez ramiona łącznikowe o różnej długości, aby zmniejszyć potencjalną zawadę steryczną.
Termin „czynnik” jest tu stosowany w odniesieniu do związku chemicznego, mieszaniny związków chemicznych, makrocząsteczki biologicznej lub wyciągu sporządzonego z materiału biologicznego.
Stosowany tu termin „środek farmaceutyczny lub lek” dotyczy związku chemicznego lub kompozycji zdolnej do wywołania pożądanego skutku leczniczego przy podaniu w odpowiedni sposób pacjentowi. Inne terminy chemiczne tu używane są zgodnie z konwencjonalnym użyciem w tej dziedzinie, jak na przykład w The MacGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker S., wyd. McGraw-Hill, San Francisco (1985) włączone tu jako odnośnik).
Stosowany tu termin „czynnik przeciwnowotworowy” odnosi się do czynników, które mają funkcjonalną właściwość hamowania rozwoju lub postępów nowotworu u człowieka, w szczególności złośliwych zmian nowotworowych (rakowych), takich jak rak, mięsak, chłoniak lub białaczka. Hamowanie przerzutowania jest częstą właściwością czynników przeciwnowotworowych.
Termin pacjent obejmuje ludzi i podmioty weterynaryjne.
Ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR i ich charakteryzacja
Ludzkie przeciwciała pozwalają uniknąć pewnych problemów związanych z przeciwciałami, które posiadają mysie lub szczurze regiony zmienne i/lub stałe. Obecność takich sekwencji pochodzących od myszy lub szczurów może prowadzić do szybkiego znikania przeciwciał albo może prowadzić do wytwarzania odpowiedzi immunologicznej wobec przeciwciała u pacjenta. A zatem, niniejszym opisano dostarczanie humanizowanych przeciwciał anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu wynalazek dostarcza całkowicie ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR poprzez wprowadzenie ludzkich genów immunoglobulinowych do gryzonia, tak, że gryzoń wytwarza całkowicie ludzkie przeciwciała. Bardziej korzystne są całkowicie ludzkie przeciwciała anty-ludzki IGF-IR. Spodziewane jest, że całkowicie ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR będą minimalizować immunogenne i alergiczne odpowiedzi charakterystyczne dla mysich albo derywatyzowanych mysich przeciwciał monoklonalnych (Mab), a zatem zwiększać skuteczność i bezpieczeństwo podawanych przeciwciał. Można się spodziewać, że zastosowanie całkowicie ludzkich przeciwciał dostarczy znacznych korzyści przy leczeniu przewlekłych i nawracających ludzkich chorób, takich jak zapalenie albo nowotwór, które mogą wymagać powtarzanego podawanie przeciwciała. W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które nie wiąże dopełniacza.
W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem anty-IGF-IR jest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 albo 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR zawiera łańcuch lekki o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22 albo jeden lub więcej CDR z tych sekwencji aminokwasowych. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGFIR zawiera łańcuch ciężki o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24 albo jeden lub więcej CDR z tych sekwencji aminokwasowych.
Klasy i subklasy przeciwciał anty-IGF-IR
Przeciwciałem może być cząsteczka IgG, IgM, IgE, IgA lub IgD. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem jest IgG i podtyp IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciałem anty-IGF-IR jest podklasa IgG2. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciałem anty-IGFIR jest taka sama klasa Iub podklasa co przeciwciało 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub
6.1.1, którą jest IgG2.
Klasę lub podklasę przeciwciał anty-IGF-IR można określić przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie. Generalnie klasę lub podklasę przeciwciał anty-IGF-IR można określić przy użyciu przeciwciał, które są swoiste dla konkretnej klasy i podklasy przeciwciała. Takie przeciwciała są dostępne handlowo. Klasę lub podklasę można określić przy zastosowaniu ELISA, techniki Western jak również innych technik. Alternatywnie, klasę lub podklasę można ustalić poprzez sekwencjonowanie całej albo części domen zmiennych łańcuchów ciężkiego i/Iub lekkiego przeciwciał, porównując ich sekwencje aminokwasowe ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi z różnych klas i podklas immunoglobulin i określając klasę lub podklasę przeciwciał.
PL 217 921 B1
Selektywność gatunkowa i cząsteczkowa
W innym aspekcie wynalazku przeciwciało anty-IGF-IR wykazuje zarówno selektywność gatunkową, jak i cząsteczkową. W jednym z wykonań przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z IGF-IR ludzkim, makaka z gatunku Macaca fascicularis albo rezusa. W korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGFIR nie wiąże się z IGF-IR z myszy szczura, świnki morskiej, psa lub królika. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR nie wiąże się z gatunkami małp z Nowego Świata, takich jak marmozeta. Na podstawie nauk płynących z tego opisu można ustalić selektywność gatunkową dla przeciwciał anty-IGF-IR przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, można ustalić selektywność gatunkową przy zastosowaniu techniki Western, FACS, lub RIA. Możliwe jest ustalenie selektywności gatunkowej przy zastosowaniu techniki Western.
W innym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż wobec receptora insuliny. W korzystnym wykonaniu, selektywność przeciwciała anty-IGF-IR jest ponad 100 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR nie wykazuje widocznego swoistego wiązania z żadnym białkiem innym niż IGF-IR. Można ustalić selektywność przeciwciał anty-IGF-IR wobec IGR-IR przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie kierując się naukami płynącymi z tego opisu. Przykładowo, można ustalić selektywność przy zastosowaniu techniki Western, FACS, ELISA lub RIA. W korzystnym wykonaniu można ustalić selektywność cząsteczkową przy zastosowaniu techniki Western.
Powinowactwo wiązania się anty-IGF-IR z IGF-IR
Przeciwciała anty-IGF-IR wiążą się z IGF-IR z wysokim powinowactwem. W jednym z wykonań przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z IQ wynoszącą 1 x 10-9 M lub mniej. W jeszcze ko-1 rzystniejszym wykonaniu przeciwciało wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 5 x 10-1 M lub mniej. W in-1 nym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 1 x 10-1 M lub mniej. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd co przeciwciało wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą co przeciwciało, które zawiera jeden lub więcej CDR z przeciwciała wybranego spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub
6.1.1. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd co przeciwciało o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd co przeciwciało, które zawiera jeden lub więcej CDR z przeciwciała o jednej z sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24.
W innym aspekcie wynalazku, przeciwciało anty-IGF-IR ma niską szybkość dysocjacji. W jed4 -1 nym z wykonań, przeciwciało anty-IGF-IR ma Koff wynoszącą 1 x 104s-1 Iub mniejszą. W korzystnym -5 -1 wykonaniu, Koff wynosi 5 x 10-5s-1 lub mniej. W innym korzystnym wykonaniu, Koff jest zasadniczo taka sama co przeciwciała wybranego spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taka samą Koff co przeciwciało, które zawiera jeden lub więcej CDR z przeciwciała wybranego spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taka samą Koff co przeciwciało o jednej z sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR IDS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taka samą Koff co przeciwciało, które zawiera jeden lub więcej CDR z przeciwciała o jednej z sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22.
Powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji przeciwciała anty-IGF-IR wobec IGF-IR można określić przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie. W jednym z wykonań, powinowactwo wiązania można zmierzyć przy zastosowaniu ELISA, RIA albo powierzchniowego rezonansu plazmonowego takiego jak, BIAcore. Szybkość dysocjacji można zmierzyć przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego. W bardziej korzystnym wykonaniu, powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się przy zastosowaniu BIAcore. Przykład określania powinowactwa wiązania i szybkości dysocjacji jest opisany poniżej w Przykładzie II.
PL 217 921 B1
Okres półtrwania przeciwciał anty-IGF-IR
Według innego przedmiotu wynalazku, przeciwciało anty-IGF-IR ma okres półtrwania co najmniej jeden dzień in vitro lub in vivo. W korzystnym wykonaniu przeciwciało albo jego część ma okres półtrwania co najmniej trzy dni. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało albo jego część ma okres półtrwania co najmniej cztery dni albo dłuższy. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część ma okres półtrwania co najmniej osiem dni albo dłuższy. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen jest poddana derywatyzacji lub zmodyfikowana w taki sposób, że ma dłuższy okres półtrwania, jak dyskutowano poniżej. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało może zawierać mutacje punktowe dla zwiększenia okresu półtrwania w surowicy, jak opisano w WO 00/09560, opublikowanym 24 lutego, 2000.
Okres półtrwania przeciwciała można zmierzyć przy zastosowaniu dowolnej metody znanej specjaliście w tej dziedzinie. Przykładowo okres półtrwania przeciwciała można zmierzyć przy zastosowaniu techniki Western, ELISA lub RIA na przestrzeni odpowiedniego okresu czasu. Okres półtrwania przeciwciała można zmierzyć w dowolnym odpowiednim zwierzęciu, np. małpie, takiej jak makak z gatunku Macaca fascieularis, naczelnym albo człowieku.
Identyfikacja epitopów IGF-IR rozpoznawanych przez przeciwciało anty-IGF-IR
Wynalazek dostarcza również przeciwciała anty-IGF-IR, które wiąże się z tym samym antygenem albo epitopem co ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR. Ponadto, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które współzawodniczy z ludzkim przeciwciałem anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, ludzkim przeciwciałem anty-IGF-IR jest 2.13.2 i 4.9.2. W innym korzystnym wykonaniu, ludzkie antyIGF-IR zawiera jeden lub więcej CDR z przeciwciała wybranego spośród 2.13.2 i 4.9.2. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, ludzkie anty-IGF-IR ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24. W innym korzystnym wykonaniu, ludzkie antyIGF-IR zawiera jeden lub więcej CDR z przeciwciała o jednej z sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24. W wysoce korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR jest innym ludzkim przeciwciałem.
Można ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z tym samym antygenem stosując rozmaite metody znane w tej dziedzinie. Przykładowo, można ustalić czy testowane przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z tym samym antygenem przy zastosowaniu przeciwciała anty-IGF-IR do wyłapania antygenu, o którym wiadomo że wiąże się z przeciwciałem anty-IGF-IR, takim jak IGF-IR, odmycie antygenu od przeciwciała, a następnie ustalenie, czy testowane przeciwciało wiąże się z wymytym antygenem. Można ustalić, czy przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem co przeciwciało anty-IGF-IR poprzez wiązanie przeciwciała anty-IGF-IR do IGF-IR w warunkach wysycenia, a następnie mierzenie zdolności testowanego przeciwciała do wiązania się z IGF-IR. Jeżeli testowane przeciwciało jest zdolne do wiązania się z IGF-IR w tym samym czasie co przeciwciało anty-IGF-IR, wówczas testowane przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z tym innym epitopem niż przeciwciało anty-IGF-IR. Jednakże, jeżeli testowane przeciwciało nie jest zdolne do wiązania się z IGF-IR w tym samym czasie, wówczas testowane przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem co ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR. Doświadczenie to można przeprowadzić stosując ELISA, RIA lub powierzchniowy rezonans plazmonowy. W korzystnym wykonaniu, doświadczenie przeprowadza się stosując powierzchniowy rezonans plazmonowy. W bardziej korzystnym wykonaniu, stosuje się BIAcore. Można również ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR współzawodniczy z przeciwciałem anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, one można ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR współzawodniczy z innym poprzez zastosowanie tej samej metody co przy badaniu czy przeciwciało anty-IGF-IR jest zdolne do wiązania się z tym samym epitopem co inne przeciwciało anty-IGF-IR.
Użycie łańcucha lekkiego i ciężkiego
Wynalazek dostarcza również przeciwciała anty-IGF-IR, które zawiera sekwencje zmienne kodowane przez ludzki gen k. W korzystnym wykonaniu, sekwencje zmienne są kodowane przez ludzką rodzinę genów Vk A27, A30 albo 012. W korzystnym wykonaniu, sekwencje zmienne są kodowane przez rodzinę ludzkich genów Vk A30. W bardziej korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki zawiera nie więcej niż dziesięć podstawień aminokwasowych w stosunku do Vk A27, A30 lub 012 linii płciowej, korzystnie nie więcej niż sześć podstawień aminokwasowych, a korzystniej nie więcej niż trzy podstawienia aminokwasowe. W korzystnym wykonaniu, podstawienia aminokwasowe są podstawieniami konserwatywnymi. SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 i 22 dostarczają sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych sześciu łańcuchów lekkich k anty-IGF-IR. SEK NR ID: 38, 40 i 42 dostarczają sekwencje aminokwasowe trzech łańcuchów lekkich k linii płciowej, z których pochodzi sześć łańcuchów lekkich k
PL 217 921 B1 anty-IGF-IR. Fig. 1A-1C pokazują dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych sześciu łańcuchów lekkich sześciu przeciwciał anty-IGF-IR wzajemnie do siebie i do sekwencji linii płciowej, z których pochodzą. Na podstawie nauk płynących z tego opisu specjalista w tej dziedzinie będzie mógł określić zakodowaną sekwencję amino kwasową sześciu łańcuchów lekkich k i łańcuchów lekkich k linii płciowej i ustalić różnice pomiędzy sekwencjami linii płciowej i sekwencjami przeciwciała.
W korzystnym wykonaniu VL z przeciwciała anty-IGF-IR zawiera te same podstawienia aminokwasowe w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii płciowej, co dowolny jeden lub więcej VL z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. Przykładowo, VL z przeciwciała anty-IGF-IR może zawierać jedno lub więcej one podstawień aminokwasowych, które są takie same jak te obecne w przeciwciele 2.13.2, i inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 2.14.3 oraz inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 4.9.2. w ten sposób można mieszać i dopasowywać różne właściwości wiązania przeciwciała w celu zmiany, np. powinowactwa przeciwciała wobec IGF-IR albo jego szybkości oddysocjowywania od antygenu. W innym wykonaniu, dokonuje się podstawień aminokwasowych w tej samej pozycji co znajdywane w jednym lub więcej VL z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1, ale dokonuje się raczej konserwatywnych podstawień aminokwasowych niż stosuje ten sam aminokwas. Przykładowo, jeżeli podstawieniem aminokwasowym w porównaniu do linii płciowej w jednym z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1 jest glutaminian, można go zastąpić konserwatywnie asparaginianem. Podobnie, jeżeli podstawieniem aminokwasowym jest seryna, można ją zastąpić konserwatywnie treoniną.
W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak sekwencja aminokwasowa VL z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym wysoce korzystnym wykonaniu łańcuch lekki zawiera taką samą sekwencję aminokwasową, co regiony CDR łańcucha lekkiego z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową co najmniej jednego regionu CDR łańcucha lekkiego z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki zawiera sekwencje aminokwasowe CDR z różnych łańcuchów lekkich. W korzystniejszym wykonaniu, CDR z różnych łańcuchów lekkich są otrzymane z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22. W innym wykonaniu, łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasową zakodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego wybraną spośród.
SEK NR ID: 1, 5, 9, 13, 17 lub 21 albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową mającą w stosunku do niej 1-10 insercji, delecji albo podstawień aminokwasowych. Korzystnie, jeżeli podstawienia aminokwasowe są podstawieniami konserwatywnymi. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część zawiera łańcuch lekki lambda.
Niniejszy wynalazek dostarcza również przeciwciała anty-IGF-IR albo jego część, która zawiera ludzki łańcuch ciężki albo sekwencję pochodzącą z ludzkiego łańcucha ciężkiego. W jednym z wykonań, sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego pochodzi z rodziny ludzkich genów VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 lub VIV-4/4.35. W korzystnym wykonaniu, sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego pochodzi z rodziny ludzkiego genu VH DP47. W bardziej korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki zawiera nie więcej niż osiem podstawień aminokwasowych w stosunku do genów VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 lub VIV-4/4 linii płciowej, korzystniej nie więcej niż sześć podstawień aminokwasowych, a nawet bardziej korzystnie nie więcej niż trzy podstawienia aminokwasowe.
SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 i 24 dostarczają sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych sześciu łańcuchów ciężkich anty-IGF-IR. SEK NR ID: 30, 32, 34, 36 i 44 dostarczają sekwencje aminokwasowe, a SEK NR ID: 29, 31, 33, 35 i 43 dostarczają sekwencje nukleotydowe trzech łańcuchów ciężkich linii płciowych, odpowiednio, DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 i VIV-4. Fig. 2A-2D pokazują dopasowanie sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych sześciu przeciwciał anty-IGF-IR do odpowiadających im sekwencji linii płciowej. Na podstawie nauk płynących z tego opisu specjalista w tej dziedzinie będzie mógł określić zakodowaną sekwencję aminokwasową sześciu łańcuchów ciężkich anty-IGF-lR i łańcuchów ciężkich linii płciowej i ustalić różnice pomiędzy sekwencjami linii płciowej i sekwencjami przeciwciała.
W korzystnym wykonaniu VH z przeciwciała anty-IGF-IR zawiera te same podstawienia aminokwasowe w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii płciowej, co dowolny jeden lub więcej VH z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. Podobnie, jak dyskutowano powyżej, VH z przeciwciała anty-IGF-IR może zawierać jedno lub więcej podstawień amino kwasowych, które
PL 217 921 B1 są takie same, jak te obecne w przeciwciele 2.13.2, inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 2.14.3 oraz inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 4.9.2. W ten sposób można mieszać i dopasowywać różne właściwości wiązania przeciwciała w celu zmiany, np. powinowactwa przeciwciała wobec IGF-IR albo jego szybkości oddysocjowywania od antygenu. W innym wykonaniu, dokonuje się podstawień aminokwasowych w tej samej pozycji co znajdywane w jednym lub więcej VH z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1, ale dokonuje się raczej konserwatywnych podstawień aminokwasowych niż stosuje ten sam aminokwas.
W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak sekwencja aminokwasowa VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym wysoce korzystnym wykonaniu łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową, która jest taka sama co regiony CDR łańcucha ciężkiego z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową co najmniej jednego regionu CDR łańcucha ciężkiego z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 Iub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki zawiera sekwencje aminokwasowe CDR z różnych łańcuchów ciężkich. W korzystniejszym wykonaniu, CDR z różnych łańcuchów ciężkich są otrzymane z 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24. W innym wykonaniu, łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasową zakodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego wybraną spośród SEK NR ID: 3, 7, 11, 15, 19 lub 23 albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową mającą w stosunku do niej 1-10 insercji, delecji albo podstawień aminokwasowych. W innym wykonaniu, podstawienia aminokwasowe są podstawieniami konserwatywnymi.
Hamowanie aktywności IGF-IR przez przeciwciało anty-IGF-IR
Hamowanie wiązania się IGF-I do IGF-IR
W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które hamuje wiązanie się IGF-I do IGF-IR albo wiązanie IGF-II do IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, IGF-IR jest ludzki. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR jest przeciwciałem ludzkim. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część hamuje wiązanie między IGF-IR a IGF-I z IC50 nie większą niż 100 nM. W korzystnym wykonaniu, IC50 jest nie większa niż 10 nM. W bardziej korzystnym wykonaniu, IC50 jest nie większa niż 5 nM. IC50 można zmierzyć dowolną metodą znaną w tej dziedzinie. Typowo, IC50 można mierzyć poprzez ELISA lub RIA. W korzystnym wykonaniu, IC50 mierzy się poprzez RIA.
W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które zapobiega aktywacji IGF-IR w obecności IGF-I. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR hamuje indukowaną przez IGF-IR fosforylację tyrozyny, która następuje po zajęciu receptora. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR hamuje zajście kolejnych zdarzeń komórkowych. Przykładowo, antyIGF-IR może hamować fosforylację tyrozyny Shc i substratu dla receptora insuliny (IRS)1 i 2, z których każdy jest normalnie fosforylowany, kiedy komórki traktuje się IGF-1 (Kim i wsp., J. Biol. Chem. 273: 34543-34550, 1998). Można ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR może zapobiegać aktywacji IGF-IR w obecności IGF-1 poprzez ustalenie poziomów autofosforylacji dla IGF-IR, Shc, IRS-1 Iub IRS-2 poprzez zastosowanie techniki Western albo immunoprecypitacji. W korzystnym wykonaniu, można określić poziomy autofosforylacji IGF-IR poprzez zastosowanie techniki Western. Patrz np. Przykład VII.
W innym aspekcie wynalazku, przeciwciało powoduje obniżenie poziomu IGF-IR na komórkach traktowanych przeciwciałem. W jednym z wykonań, IGF-IR jest internalizowany do cytoplazmy komórki. Po związaniu się przeciwciała anty-IGF-IR z IGF-IR, przeciwciało jest internalizowane, co zostało pokazane przy zastosowaniu mikroskopii konfokalnej. Bez zamiaru przywiązywania się do jakiejkolwiek teorii, uważa się, że kompleks przeciwciało-IGF-IR jest internalizowany do lizosomu i degradowany. Można zmierzyć obniżenie poziomu IGF-IR przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, włączając w to immunoprecypitację, mikroskopię konfokalną lub technikę Western. Patrz np. Przykład VII. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1, albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego region wiążący antygen.
Aktywacja IGF-IR przez przeciwciało anty-IGF-IR
Inny aspekt niniejszego wynalazku obejmuje aktywujące przeciwciała anty-IGF-IR. Przeciwciało aktywujące różni się od przeciwciała hamującego ponieważ zwiększa albo zastępuje efekty IGF-1 wobec IGF-IR. W jednym z wykonań, przeciwciało aktywujące ma zdolność do wiązania się z IGF-IR i powoduje jego aktywację w nieobecności IGF-L. Ten typ przeciwciała aktywującego jest zasadniczo imitatorem IGF-1. W innym wykonaniu, przeciwciało aktywujące zwiększa efekt IGF-I na IGF-IR. Ten
PL 217 921 B1 typ przeciwciała sam nie aktywuje IGF-IR, ale zwiększa raczej aktywację IGF-IR w obecności IGF-1. Naśladujące przeciwciało anty-IGF-IR można łatwo odróżnić od przeciwciała anty-IGF-IR zwiększającego efekt poprzez traktowanie komórek in vitro przeciwciałem w obecności albo nieobecności niskich poziomów IGF-1. Jeżeli przeciwciało ma zdolność powodowania aktywacji IGF-IR w nieobecności IGF-I, np. zwiększa fosforylację tyrozyny IGF-IR, wówczas przeciwciało jest przeciwciałem naśladującym. Jeżeli przeciwciało nie może powodować aktywacji IGF-IR w obecności IGF-I, ale ma zdolność do zwiększenia stopnia aktywacji IGF-IR wówczas przeciwciało jest przeciwciałem zwiększającym efekt. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem aktywującym jest 4.17.3. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało zawiera jeden albo więcej CDR z 4.17.3. W innym korzystnym wykonaniu przeciwciało pochodzi z jednej albo obydwu sekwencji linii płciowej O12 (łańcuch lekki) i/lub D71 (łańcuch ciężki).
Hamowanie fosforylacji tyrozyny IGF-IR, poziomów IGF-IR i wzrostu komórek nowotworowych in vivo przez przeciwciała anty-IGF-IR
Inne wykonanie wynalazku dostarcza przeciwciała anty-IGF-IR, które hamuje fosforylację tyrozyny IGF-IR i poziomy receptora in vivo. W jednym z wykonań, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR zwierzętom powoduje zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego IGF-IR w nowotworach wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR powoduje zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego o co najmniej 20%. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR powoduje zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego o co najmniej 60%, korzystniej 50%. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało powoduje co najmniej 40% zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego, korzystniej 30%, a jeszcze korzystniej 20%. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało podaje się około 24 godziny przed pomiarem poziomów fosforylacji tyrozyny. Poziomy fosforylacji tyrozyny można zmierzyć dowolną metodą znaną w tej dziedzinie, jak te opisane tutaj. Patrz np. Przykład III i Fig. 5. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9. lub 6.1.1 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
W innym wykonaniu, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR zwierzętom powoduje zmniejszenie poziomów IGF-IR w nowotworach wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało antyIGF-IR powoduje zmniejszenie poziomów receptora o co najmniej 20% w porównaniu do zwierząt nie traktowanych. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR powoduje zmniejszenie poziomów receptora do co najmniej 60%, korzystniej 50% poziomu receptora u zwierząt nie traktowanych. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało powoduje zmniejszenie poziomów receptora do najmniej 40%, korzystniej 30%. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało podaje się około 24 godziny przed pomiarem poziomów IGF-IR. Poziomy IGF-IR można zmierzyć dowolną metodą znaną w tej dziedzinie, jak te opisane tutaj. Patrz np. Przykład VIII i Fig. 6. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
W innym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR hamuje wzrost komórek nowotworowych in vivo. Komórki nowotworowe mogą pochodzić z dowolnego typu komórek, włączając w to, bez ograniczania, komórki naskórkowe, nabłonkowe, śródbłonkowe, białaczkowe, mięsaka, szpiczaka mnogiego i mezodermalne. Przykłady komórek nowotworowych obejmują komórki A549 (rak płuc nie z małych komórek), komórki MCF-7, komórki Colo 205, komórki 3T3/IGF-IR i komórki A431. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych w porównaniu ze wzrostem nowotworu u zwierząt nie traktowanych. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych o 50%. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych o 60%, 65%, 70% lub 75%. W jednym z wykonań, hamowanie wzrostu komórek nowotworowych mierzy się co najmniej 7 dni po rozpoczęciu traktowania zwierzęcia przeciwciałem. W bardziej korzystnym wykonaniu, hamowanie wzrostu komórek nowotworowych mierzy się co najmniej 14 dni po rozpoczęciu traktowania zwierzęcia przeciwciałem. W innym korzystnym wykonaniu zwierzęciu podaje się inny czynnik przeciwnowotworowy razem z przeciwciałem anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, czynnik przeciwnowotworowy ma zdolność dalszego hamowania wzrostu komórek nowotworowych. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, czynnikiem przeciwnowotworowym jest adriamycyna, taksol, tamoksifen, 5-fluorodeoksyurydyna (5-FU) albo CP-358,774. W korzystnym wykonaniu, jednoczesne podawanie czynnika przeciwnowotworowego i przeciwciała anty-IGF-IR hamuje wzrost komórek nowotworowych o co najmniej 50%, korzystniej 60%, 65%, 70% lub 75%, jeszcze korzystniej 80%, 85% lub 90% po okresie 22-24 dni. Patrz np. Fig. 7 i Przykład IX. W korzystnym
PL 217 921 B1 wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
Indukcja apoptozy przez przeciwciała anty-IGF-IR
Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza przeciwciała anty-IGF-IR, które indukuje śmierć komórki. W jednym z wykonań, przeciwciało powoduje apoptozę. Przeciwciało może indukować apoptozę in vivo albo in vitro. Generalnie, komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na apoptozę niż komórki prawidłowe, a zatem podawanie przeciwciała anty-IGF-IR powoduje apoptozę komórek nowotworowych preferencyjnie wobec komórek prawidłowych. W innym wykonaniu, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR zmniejsza poziomy enzymu akt, który uczestniczy w szlaku kinazy fosfatydyloinozytolowej (PI). Szlak kinazy PI z kolei uczestniczy w proliferacji komórek i zapobiega apoptozie. A zatem hamowanie akt może powodować apoptozę. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało podaje się in vivo w celu spowodowania apoptozy komórek wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
Sposoby wytwarzania przeciwciał i linii komórkowych wytwarzających przeciwciała
Immunizacja
W jednym z wykonań niniejszego wynalazku ludzkie przeciwciała wytwarza się poprzez immunizację zwierzęcia oprócz człowieka zawierającego część albo cały locus immunoglobulinowy antygenem IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, zwierzęciem oprócz człowieka jest XENOMOUSE™, czyli poddany zabiegom inżynierii genetycznej szczep myszy, który zawiera duże fragmenty ludzkich Ioci immunoglobulin i jest defektywny pod względem wytwarzania mysiego przeciwciała. Patrz np. Green i wsp. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) oraz patenty USA 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 oraz 6130364. Patrz również WO 91/10741, opublikowany 25 lipca, 1991, WO 94/02602, opublikowany 3 lutego, 1994, WO 96/34096 i WO 96/33735, obydwa opublikowane 31 października, 1996, WO 98/16654, opublikowany 23 kwietnia, 1998, WO 98/24893, opublikowany 11 czerwca, 1998, WO 98/50433, opublikowany 12 listopada, 1998, WO 99/45031, opublikowany 10 września, 1999, WO 99/53049, opublikowany 21 października, 1999, WO 00/09560, opublikowany 24 lutego, 2000 i WO 00/037504, opublikowany 29 czerwca, 2000. XENOMOUSE™ wytwarza ludzki repertuar w pełni ludzkich przeciwciał typu dojrzałego i wytwarza swoiste wobec antygenu ludzkie Mab. Draga generacja XENOMOUSETM zawiera około 80% repertuaru ludzkich przeciwciał poprzez wprowadzenie fragmentów YAC o wielkości megazasad w konfiguracji linii płciowej ludzkich Ioci łańcuchów ciężkich i Ioci łańcuchów lekkich k. Patrz Mendez i wsp. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green i Jakobovits J. Exp. Med. 188; 483-495 (1998), ujawnienia których są tu włączone jako odniesienie.
Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania przeciwciał anty-IGF-IR ze zwierząt innych niż człowiek i innych niż mysz poprzez immunizację zwierząt transgenicznych innych niż człowiek, które zawierają ludzkie Ioci immunoglobulin. Można wytworzyć takie zwierzęta przy zastosowaniu metod opisanych bezpośrednio powyżej. Metody ujawnione w tych patentach mogą być zmodyfikowane, jak opisano w patencie USA 5994619. W korzystnym wykonaniu zwierzętami innymi niż człowiek mogą być szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie.
W innym wykonaniu zwierzętami innymi niż człowiek zawierającymi ludzkie Ioci immunoglobulin są zwierzęta, które mają „minilocus” ludzkich immunoglobulin. W strategii minilocus, egzogenny locus Ig jest naśladowany poprzez włączenie poszczególnych genów pochodzących z locus Ig. A zatem do konstraktu do wstawienia do zwierzęcia wprowadza się jeden lub więcej genów VH, jeden lub więcej genów DH jeden lub więcej genów JH, region stały i drugi region stały (korzystnie region stały gamma). Podejście to jest opisane między innymi w patencie USA nr 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 oraz 5643763, włączone tu jako odniesienie.
Zaletą podejścia minilocus jest tempo, w jakim można wytworzyć i wprowadzić do zwierząt konstrukty zawierające części locus Ig. Jednakże z drugiej strony znaczącą wadą podejścia minilocus jest to, że można uzyskać niedostateczne zróżnicowanie immunoglobulin dla podtrzymania pełnego rozwoju komórek B, a zatem może mieć miejsce wytwarzanie niższego poziomu przeciwciał.
W celu wytworzenia ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR zwierzę inne niż człowiek zawierająceczęść albo cały locus immunoglobulinowy immunizuje się antygenem IGF-IR i izoluje się ze zwierzęcia przeciwciało albo komórkę wytwarzającą przeciwciało. Antygenem IGF-IR może być wyizolowany i/lub oczyszczony IGF-IR, a korzystnie jeśli jest IGF-IR ludzki. W innym wykonaniu antygenem IGF-IR jest
PL 217 921 B1 fragment IGF IR, korzystnie domena zewnątrzkomórkowa IGF-IR. W innym wykonaniu antygenem IGF-IR jest fragment, który zawiera co najmniej część epitopu IGF-IR. W innym wykonaniu antygenem IGF-IR jest komórka, która wyraża IGF-IR na swojej powierzchni, korzystnie komórka z nadekspresją IGF-IR na swojej powierzchni.
Immunizację zwierząt można przeprowadzić dowolną metodą znaną w tej dziedzinie. Patrz np. Harlow i Lane, Przeciwciała: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Sposoby immunizowania zwierząt innych niż człowiek, takich jak szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Harlow i Lane oraz patent USA 5994619. W korzystnym wykonaniu, antygen IGF-IR podaje się z adiuwantem w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Takie adiuwanty obejmują kompletny albo niekompletny adiuwant Freunda, RIBI (muramylodipeptydy) albo ISCOM (kompleksy immunostymulujące). Takie adiuwanty mogą chronić polipeptyd przed szybkim rozproszeniem poprzez odseparowanie go w postaci miejscowego depozytu albo mogą one zawierać substancje, które stymulują gospodarza do wydzielania czynników, które są chemotaktyczne dla makrofagów i innych składników systemu immunologicznego. Korzystne jest przy podawaniu polipeptydu, jeżeli harmonogram immunizacji będzie obejmował dwa albo więcej podawań polipeptydu na przestrzeni kilku tygodni.
Przykład I dostarcza protokołu immunizacji XENOMOUSETM ludzkim IGF-IR pełnej długości w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
Wytwarzanie przeciwciał i linii komórkowych wytwarzających przeciwciała
Po immunizacji zwierzęcia antygenem IGF-IR, ze zwierzęcia można otrzymać przeciwciała i/lub komórki wytwarzające przeciwciała. Surowicę zawierającą przeciwciało anty-IGF-IR otrzymuje się ze zwierzęcia poprzez skrwawienie albo uśmiercenie zwierzęcia. Surowicę można użyć taką jak jest otrzymana ze zwierzęcia, z surowicy można otrzymać frakcję immunoglobulin albo z surowicy można oczyścić przeciwciała anty-IGF-IR. Surowica albo immunoglobuliny otrzymane w ten sposób są poliklonalne, co jest niekorzystne, ponieważ ilość przeciwciał, które można w ten sposób otrzymać jest ograniczona, a przeciwciała poliklonalne mają heterogenny zestaw właściwości.
W innym wykonaniu, z immunizowanego zwierzęcia można otrzymać wytwarzające przeciwciała unieśmiertelnione hybrydomy. Po immunizacji zwierzę uśmierca się i komórki B ze śledziony łączy się z unieśmiertelnionymi komórkami szpiczaka, co jest dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Harlow i Lane, jak wyżej. W korzystnym wykonaniu, komórki szpiczaka nie wydzielają peptydów immunoglobulinowych (nie wydzielająca linia komórkowa). Po fuzji i selekcji na antybiotyk hybrydomy przeszukuje się przy użyciu IGF-IR, jego części albo komórek wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, wyjściowe przeszukiwanie przeprowadza się przy zastosowaniu enzymatycznego testu immunologicznego (ELISA) albo (RIA), korzystnie ELISA. Przykład przeszukiwania ELISA jest dostarczony w WO 00/37504, włączone tu jako odniesienie.
W innym wykonaniu, komórki wytwarzające przeciwciała można otrzymać od osoby, która ma chorobę autoimmunologiczną i która wyraża przeciwciała anty-IGF-IR. Komórki wyrażające przeciwciała anty-IGF-IR można wyizolować poprzez izolację białych komórek krwi i poddanie ich aktywowanemu fluorescencją sortowaniu komórek (FASC) albo przeszukiwaniu na płytkach opłaszczonych IGF-IR albo jego częścią. Te komórki można łączyć z ludzkim nie wydzielającym szpiczakiem w celu wytworzenia ludzkich hybrydom wyrażających ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR. Generalnie, jest to mniej korzystne wykonanie, ponieważ jest prawdopodobne, że przeciwciała anty-IGF-IR będą miały niskie powinowactwo wobec IGF-IR.
Hybrydomy wytwarzające przeciwciało anty-IGF-IR wybiera się, klonuje i dalej przeszukuje pod kątem pożądanych właściwości, włączając w to obfity wzrost hybrydomy, wysoki poziom wytwarzania przeciwciał i pożądaną charakterystykę przeciwciał, jak dyskutowano dalej poniżej. Hybrydomy można hodować i namnażać in vivo w syngenicznych zwierzętach, w zwierzętach, którym brak układu immunologicznego np. u nagich myszy albo w hodowli komórek in vitro. Sposoby selekcji, klonowania i namnażania hybrydom są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Korzystne jest, jeżeli immunizowanym zwierzęciem jest zwierzę inne niż człowiek, które wyraża geny immunoglobulinowe, a komórki B śledziony łączy się ze szpiczakiem pochodzącym z tego samego gatunku co zwierzę inne niż człowiek. Bardziej korzystnie, jeżeli immunizowanym zwierzęciem jest XENOMOUSE™, a linią komórkową szpiczaka jest nie wydzielający mysi szpiczak, taki jak linia komórkowa szpiczaka NSO-bcl2. Patrz np. Przykład I.
W jednym z aspektów wynalazek dostarcza hybrydom, które wytwarzają ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu hybrydomami są hybrydomy mysie, jak opisano powyżej
PL 217 921 B1 w innym korzystnym wykonaniu, hybrydomy są wytwarzane w gatunkach innych niż człowiek i mysz, takich jak szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie. W innym wykonaniu, hybrydomami są hybrydomy ludzkie, w których nie wydzielający ludzki szpiczak jest połączony z ludzką komórką wyrażającą przeciwciało anty-IGF-IR.
Kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarza oraz sposoby wytwarzania przeciwciał poprzez rekombinowanie DNA
Dostarczone są cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku. W jednym z wykonań cząsteczka kwasu nukleinowego koduje łańcuch ciężki i/lub lekki immunoglobuliny anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu pojedyncza cząsteczka kwasu nukleinowego koduje łańcuch ciężki immunoglobuliny anty-IGF-IR, a inna cząsteczka kwasu nukleinowego koduje łańcuch lekki immunoglobuliny anty-IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu zakodowaną immunoglobuliną jest immunoglobulina ludzka, korzystnie ludzka IgG. Zakodowanym łańcuchem lekkim może być łańcuch λ albo łańcuch k, korzystnie łańcuch k.
Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region zmienny łańcucha lekkiego może pochodzić z genu Vk A30, A27 lub O12. W korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki pochodzi z genu Vk A30. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca łańcuch lekki zawiera region łączący pochodzący z Jk1, Jk2 albo Jk4. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca łańcuch lekki zawiera nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do genu Vk z linii płciowej A30, korzystnie nie więcej niż sześć zmian aminokwasowych, a jeszcze korzystniej nie więcej niż trzy zmiany aminokwasowe.
Wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający co najmniej trzy zmiany aminokwasowe w porównaniu do sekwencji linii płciowej, gdzie zmiany aminokwasowe są identyczne do zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji linii płciowej w VL jednego z przeciwciał 2.12.1, 2.13 .2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową jednego lub większej liczby CDR dowolnego z łańcuchów lekkich z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową z jednej spośród SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z jednej spośród SEK NR ID: 1, 5, 9, 13, 17 lub 21. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową jednego lub większej liczby CDR z dowolnej z SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego jednego lub większej liczby CDR z dowolnej z SEK NR ID: 1, 5, 9, 13, 17 lub 21. W bardziej korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR z dowolnej z SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wszystkich CDR z dowolnej z SEK NR ID: 1, 5, 9, 13, 17 lub 21.
Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową VL o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z opisanym powyżej VL, a w szczególności VL o sekwencji aminokwasowej z jednej z SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z sekwencją kwasu nukleinowego jednej z SEK NR ID: 1, 5, 9, 13, 17 lub 21. W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą VL jak opisano powyżej, a w szczególności cząsteczką kwasu nukleinowego, która zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego o sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 1, 5, 9, 13, 17 lub 21.
Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego (VH) pochodzący z genu VH DP-35, DP-47, DP-71 lub Vit-4/4.35, korzystnie genu VH DP-35. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera region łączący pochodzący z JH6 lub JH5, korzystniej JH6. W innym korzystnym wykonaniu, segment D
PL 217 921 B1 pochodzi z 3-3, 6-19 lub 4-17. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do genu z linii płciowej DP-47, korzystnie nie więcej niż sześć zmian aminokwasowych, a jeszcze korzystniej nie więcej niż trzy zmiany aminokwasowe. W wysoce korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera co najmniej jedną zmianę aminokwasową w porównaniu do sekwencji z linii płciowej, gdzie zmiana aminokwasowa jest identyczna co zmiana aminokwasowa w stosunku do sekwencji z linii płciowej z łańcucha ciężkiego jednego z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera co najmniej trzy zmiany aminokwasowe w porównaniu do sekwencji z linii płciowej, gdzie zmiany aminokwasowe są identyczne co zmiany aminokwasowe w stosunku do sekwencji z linii płciowej z VH jednego z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1.
W jednym z wykonań cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową jednego lub większej liczby CDR łańcucha ciężkiego z 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR łańcucha ciężkiego z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową z jednej z SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24 albo taką, która zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z jednej z SEK NR ID: 3, 7, 11, 15, 19 lub 23. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową jednego lub większej liczby CDR z dowolnej z SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego jednego lub większej liczby CDR z dowolnej z SEK NR ID: 3, 7, 11, 15, 19 lub 23. W korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR z dowolnej z SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wszystkich CDR z dowolnej z SEK NR ID: 3, 7, 11, 15, 19 lub 23.
W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje sekwencję aminokwasową VH, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z jedną z sekwencji aminokwasowych kodujących VH jak opisano bezpośrednio powyżej, a w szczególności VH o sekwencji aminokwasowej z jednej z SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z sekwencją kwasu nukleinowego jednej z SEK NR ID: 3, 7, 11, 15, 19 lub 23. W innym wykonaniu, cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą VL, jest taka, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą VH jak opisano powyżej, a w szczególności VH, która zawiera sekwencję aminokwasową z jednej SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24. Wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego o sekwencji kwasu nukleinowego z jednej z SEK NR ID: 3, 7, 11, 15, 19 lub 23.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą jeden z albo obydwa całe łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała anty-IGF-IR albo ich regiony zmienne można otrzymać z dowolnego źródła, które wytwarza przeciwciało anty-IGF-IR. Sposoby izolowania mRNA kodującego przeciwciało są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i wsp. mRNA można użyć do wytworzenia cDNA do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) albo klonowania cDNA genów dla przeciwciała. W jednym z wykonań wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego można otrzymać z hybrydomy, która wyraża przeciwciało anty-IGF-IR, jak opisano powyżej, korzystnie hybrydomy, która ma jako jednego z partnerów fuzji komórkę transgenicznego zwierzęcia, które wyraża ludzkie geny immunoglobulinowe, takiego jak XENOMOUSETM, zwierzęcia transgenicznego innego niż człowiek będącego myszą, zwierzęcia transgenicznego innego niż mysz. W innym wykonaniu hybrydoma pochodzi ze zwierzęcia nietransgenicznego innego niż człowiek, które można użyć np. do przeciwciał humanizowanych.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą cały łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR można skonstruować poprzez połączenie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej domenę zmienną łańcucha ciężkiego albo jego domenę wiążącą antygen z domeną stałą łańcucha ciężkiego. Podobnie, cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch lekki przeciwciała anty-IGF-IR można skonstruować poprzez połączenie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej domenę zmienną łańcucha lekkiego
PL 217 921 B1 albo jego domenę wiążącą antygen z domeną stałą łańcucha lekkiego. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch VH i VL można przekształcić w geny dla przeciwciał pełnej długości poprzez wstawienie ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących, odpowiednio, regiony stałe łańcucha ciężkiego i regiony stałe łańcucha lekkiego, tak że segment VH jest połączony funkcjonalnie z segmentem(ami) regionu stałego łańcucha ciężkiego (CH) w obrębie wektora, a segment VL jest połączony funkcjonalnie z segmentem(ami) regionu stałego łańcucha lekkiego (CL) w obrębie wektora. Alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy VH lub VL przekształca się w geny dla przeciwciał pełnej długości poprzez łączenie np. poprzez ligację cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch VH z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą łańcuch CH przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej. To samo można osiągnąć stosując cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy VL i CL. Sekwencje ludzkich genów dla regionów stałych łańcucha ciężkiego i lekkiego są znane w tej dziedzinie. Patrz, np. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wyd. 5. Publikacja NIH nr 91-3242, 1991. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy ciężkie i/lub lekkie pełnej długości można następnie wyrazić z komórki, do której zostały one wprowadzone i wyizolować przeciwciało anty-IGF-IR.
W korzystnym wykonaniu, kwas nukleinowy kodujący region zmienny łańcucha ciężkiego koduje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region zmienny łańcucha lekkiego koduje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22. SEK NR ID: 28 przedstawia sekwencję aminokwasową, a SEK NR ID: 28 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego region stały łańcucha ciężkiego przeciwciał anty-IGF-IR 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1. A zatem, w korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha ciężkiego koduje SEK NR ID: 28, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha lekkiego koduje SEK NR ID: 26. W bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha ciężkiego ma sekwencję kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 27, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha lekkiego ma sekwencję kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 25.
W innym wykonaniu cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą bądź łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR, bądź jego domenę wiążącą antygen albo łańcuch lekki przeciwciała anty-IGF-IR, bądź jego domenę wiążącą antygen można wyizolować ze zwierzęcia innego niż człowiek i innego niż mysz, które wyraża ludzkie geny immunoglobulinowe i zostało poddane immunizacji antygenem IGF-IR. W innym wykonaniu cząsteczkę kwasu nukleinowego można wyizolować z komórki wytwarzającej przeciwciało anty-IGF-IR pochodzącej ze zwierzęcia nietransgenicznego albo od człowieka - pacjenta, który wytwarza przeciwciała anty-IGF-IR. mRNA z komórek wytwarzających przeciwciała anty-IGF-IR można izolować przy zastosowaniu standardowych technik, klonować i/lub powielać stosując techniki PCR i konstrukcje bibliotek i przeszukiwać stosując standardowe protokoły do otrzymywania cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała anty-IGF-IR.
Cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do wyrażenia poprzez rekombinowanie DNA dużych ilości przeciwciał anty-IGF-IR, jak opisano powyżej. Cząsteczki kwasu nukleinowego można również użyć do wytworzenia przeciwciał chimerowych, przeciwciał jednołańcuchowych, immunoadhezyn, diciał, przeciwciał zmutowanych i pochodnych przeciwciał, jak opisano dalej poniżej. Jeżeli cząsteczka kwasu nukleinowego pochodzi ze zwierzęcia innego niż człowiek, innego niż zwierzę transgeniczne, cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do humanizacji przeciwciała, jak opisano poniżej.
W innym wykonaniu cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku można użyć jako sondy albo startera do PCR dla specyficznych sekwencji przeciwciała. Przykładowo, cząsteczkę kwasu nukleinowego - sondę można zastosować w metodach diagnostycznych albo cząsteczkę kwasu nukleinowego startera do PCR można zastosować do powielania regionów DNA, które można użyć między innymi do izolowania sekwencji kwasów nukleinowych do wytwarzania domen zmiennych przeciwciał anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu cząsteczkami kwasu nukleinowego są oligonukleotydy. W bardziej korzystnym wykonaniu oligonukleotydy pochodzą z regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, oligonukleotydy kodują cały albo część jednego albo większej liczby CDR.
Wektory
Wynalazek dostarcza wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, które kodują łańcuch ciężki albo jego część wiążącą antygen. Wynalazek dostarcza wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, które kodują łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen. Wynalazek dostarcza wektorów zawierających cząsteczki kwasu nuklePL 217 921 B1 inowego według wynalazku, kodujących fuzje białkowe, przeciwciała zmodyfikowane, fragmenty przeciwciał i sondy z nich pochodzące.
W celu wyrażenia przeciwciał albo części przeciwciał według wynalazku, DNA kodujący łańcuchy lekkie i ciężkie pełnej długości otrzymane jak opisano powyżej wstawia się do wektorów ekspresyjnych, tak, że geny są połączone funkcjonalnie z transkrypcyjnymi i translacyjnymi sekwencjami kontrolnymi. Wektory ekspresyjne obejmują plazmidy, retrowirusy, kosmidy, YAC, episomy pochodzące od EBV i temu podobne. Gen dla przeciwciała wstawia się poprzez ligację do wektora, tak aby transkrypcyjne i translacyjne sekwencje kontrolne w obrębie wektora spełniały swoją zamierzoną funkcję regulowania transkrypcji i translacji genu dla przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące transkrypcję wybiera się tak, aby pasowały do zastosowanych komórek gospodarza do ekspresji. Gen dla łańcucha lekkiego przeciwciała i gen dla łańcucha ciężkiego przeciwciała można wstawić do odrębnych wektorów. W korzystnym wykonaniu obydwa geny są wstawione do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny dla przeciwciała wstawia się do wektora ekspresyjnego przy zastosowaniu standardowych metod (np. Iigacji komplementarnych miejsc restrykcyjnych we fragmencie genu dla przeciwciała i wektorze albo ligację tępych końców jeżeli miejsca restrykcyjne są nieobecne).
Dogodny wektor jest takim, który koduje funkcjonalnie kompletną ludzką sekwencję CH lub CL immunoglobuliny, z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi utworzonymi w taki sposób, aby można było wstawić i wyrazić dowolną sekwencję VH lub VL, jak opisano powyżej. W takich wektorach, składanie mRNA zwykle następuje pomiędzy donorowym miejscem składania we wstawionym regionie J i akceptorowym miejscem składania, poprzedzającym ludzki region C, a także regionach składania, które występują w obrębie ludzkich eksonów CH. PoIiadenylacja i terminacja transkrypcji następują w natywnych miejscach chromosomowych za regionami kodującymi. Zrekombinowany wektor ekspresyjny może również kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia wydzielenie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen dla łańcucha przeciwciała można sklonować w wektorze w taki sposób, że peptyd sygnałowy jest połączony w ramce z końcem aminowym genu dla łańcucha przeciwciała. Peptydem sygnałowym może być peptyd sygnałowy immunoglobuliny albo heterologiczny peptyd sygnałowy (tj. peptyd sygnałowy z białka innego niż immunoglobulina).
Poza genami dla łańcucha przeciwciała zrekombinowane wektory ekspresyjne przenoszą sekwencje regulacyjne, które kontrolują ekspresję genów dla łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Będzie wiadome dla specjalisty w tej dziedzinie, że zaprojektowanie wektora ekspresyjnego, włączając w to wybór sekwencji regulacyjnych może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza, która ma być transformowana, pożądany poziom ekspresji białka, itd. Korzystne sekwencje regulacyjne dla ekspresji w komórkach ssaków obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokimi poziomami ekspresji białka w komórkach ssaków, takie jak promotory i wzmacniacze pochodzące z retrowirusowych LTR, cytomegalowirusa (CMV) (takie jak promotor/wzmacniacz CMV), Simian Virus 40 (SV40) (takie jak promotor/wzmacniacz SV40), adenowirusa (np. główny późny promotor adenowirusa (AdMLP)), polioma oraz mocne promotory ssacze, takie jak natywne promotory immunoglobulinowe i aktynowe. Dla dalszego opisu wirusowych elementów regulacyjnych i ich sekwencji patrz np. patent USA nr 5168062 dla Stinski, patent USA nr 4510245 dla Bell i wsp. oraz patent USA nr 4968615 dla Schaffner i wsp.
Poza genami dla łańcucha przeciwciała i sekwencjami regulacyjnymi zrekombinowane wektory ekspresyjne mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórkach gospodarza (np. początki replikacji) i geny dla markerów selekcyjnych. Geny dla markerów selekcyjnych ułatwiają selekcję w komórkach gospodarza, do którego wektor został wprowadzony (patrz np. patenty USA nr 4399216, 4634665 i 5179017, wszystkie dla Axel i wsp.). Przykładowo, na ogół gen markera selekcyjnego nadaje oporność na leki, takie jak G418, higromycyna albo metotreksan, komórce gospodarza, do której wektor został wprowadzony. Korzystne geny markera selekcyjnego obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do zastosowania z komórkami gospodarza dhfr- z selekcją/amplifikacją na metotreksanie) oraz gen neo (do selekcji na G418).
Komórki gospodarza innego niż hybrydoma i sposoby wytwarzania białka poprzez rekombinowanie DNA
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące bądź łańcuch ciężki, bądź jego domenę wiążącą antygen albo łańcuch lekki, bądź jego domenę wiążącą antygen przeciwciała anty-IGF-IR oraz wektory zawierające te cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do transformacji odpowiedniej ssaczej komórki gospodarza. Transformację można przeprowadzić przy zastosowaniu dowolnej metody wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza. Sposoby wprowadzania polinukleotydów do
PL 217 921 B1 komórki gospodarza są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują transfekcję za pośrednictwem dekstranu, precypitację fosforanem wapniowym, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, bombardowanie cząstkami, zamykanie polinukleotydów w liposomach, koniugaty peptydowe, dendrymery i bezpośrednie wstrzykiwanie DNA do jąder. Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego można wprowadzać do komórek ssaków przy zastosowaniu wektorów wirusowych. Sposoby transformowania komórek są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. patenty USA 4399216, 4912040, 4740461 i 4959455 (które to patenty są tu włączone w całości jako odniesienie).
Ssacze linie komórkowe dostępne jako gospodarze dla ekspresji są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych dostępnych z American Type Culture Collection (ATCC), włączając w to między innymi komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), NSO, komórki SP2, komórki HeLa, komórki nerki młodego chomika (BHK, komórki małpiej nerki (COS), ludzkie komórki raka wątroby (np., Hep G2), komórki A549, komórki 3T3 i wiele innych linii komórkowych. Ssacze komórki gospodarza obejmują komórki człowieka, myszy, szczura, owcy, świni, kozy, bydła, konia lub chomika. Szczególnie korzystne linie komórkowe wybiera się poprzez ustalenie, które linie komórkowe mają wysokie poziomy ekspresji. Innymi liniami komórkowymi, które można zastosować są linie komórek owadzich, takie jak komórki Sf9, komórki płazów, komórki bakteryjne, komórki roślinne i komórki grzybów. Po wprowadzeniu do ssaczych komórek gospodarza zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych kodujących łańcuch ciężki albo jego domenę wiążącą antygen, łańcuch lekki albo jego domenę wiążącą antygen, przeciwciała wytwarza się poprzez hodowanie komórek gospodarza przez okres czasu wystarczający dla umożliwienia ekspresji przeciwciała w komórkach gospodarza, albo korzystniej, wydzielenia przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której komórki gospodarza są hodowane. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej przy zastosowaniu standardowych metod oczyszczania białka.
Ponadto, ekspresję przeciwciał według wynalazku (lub innych pochodzących z nich cząsteczek) z wytwarzających je linii komórkowych można wzmocnić poprzez zastosowanie wielu znanych technik. Przykładowo, system ekspresji genu syntetazy glutaminowej jest powszechnie stosowanym podejściem do wzmacniania ekspresji w pewnych warunkach. System GS jest dyskutowany w całości albo częściowo w powiązaniu z europejskimi patentami nr 0216846, 0256055 i 0323997 oraz europejskim zgłoszeniem patentowym nr 89303964.4.
Jest prawdopodobne, że przeciwciała wyrażane w różnych liniach komórkowych albo zwierzętach transgenicznych będą miały odmienny wzór glikozylacji. Jednakże wszystkie przeciwciała kodowane przez dostarczone tu cząsteczki kwasu nukleinowego albo zawierające dostarczone tu sekwencje kwasu nukleinowego są częścią niniejszego wynalazku, niezależnie od glikozylacji przeciwciał.
Zwierzęta transgeniczne
Wynalazek dostarcza zwierząt transgenicznych innych niż człowiek zawierających jedną albo więcej cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku. Przeciwciała można wytwarzać i odzyskiwać z tkanki albo płynów ciała, takich jak mleko, krew albo mocz kóz, krów, koni, świń, szczurów, myszy, królików, chomików i innych ssaków. Patrz np. patenty USA nr 5827690, 5756687, 5750172 i 5741957. Jak opisano powyżej, zwierzęta transgenicznie inne niż człowiek, które zawierają ludzkie Ioci immunglobulin można wytwarzać poprzez immunizację IGF-IR albo jego częścią.
W innym wykonaniu zwierzęta transgeniczne inne niż człowiek wytwarza się poprzez wprowadzenie jednej albo więcej cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku do zwierzęcia przy zastosowaniu standardowych technik. Patrz Hogan, jak wyżej. Komórkami transgenicznymi używanymi do wytworzenia zwierzęcia transgenicznego mogą być embrionalne komórki macierzyste albo komórki somatyczne. Organizmami transgenicznymi innymi niż człowiek mogą być chimerowe, niechimerowe heterozygoty i niechimerowe homozygoty. Patrz np. Hogan i wsp., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual wyd. 2., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson i wsp., Mose Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000) oraz Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). W innym wykonaniu organizmy transgeniczne inne niż człowiek mogą mieć ukierunkowane przerwanie i wymianę na fragment, który koduje łańcuch ciężki i/lub łańcuch lekki będący przedmiotem zainteresowania. W korzystnym wykonaniu zwierzęta transgeniczne zawierają i wyrażają cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy ciężkie i lekkie, które wiążą się swoiście z IGF-IR, korzystnie ludzkim IGF-IR. W innym wykonaniu zwierzęta transgeniczne zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowane przeciwciało, takie jak przeciwciało jednołańcuchowe, przeciwciało chimerowe albo przeciwciało humanizowane. Przeciwciała anty-IGF-IR można wytworzyć w dowolnym zwierzęciu transgenicznym. W koPL 217 921 B1 rzystnym wykonaniu zwierzętami transgenicznymi innymi niż człowiek są myszy, szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie. Zwierzęta transgeniczne inne niż człowiek wyrażają takie zakodowane polipeptydy we krwi, mleku, moczu, ślinie, łzach, śluzie i innych płynach ciała.
Biblioteki w oparciu o prezentację na fagach
Wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała anty-IGF-IR albo jego części wiążącej antygen obejmującego etapy syntetyzowania biblioteki ludzkich przeciwciał na fagach, przeszukiwanie biblioteki IGF-IR Iub jego częścią, izolowanie faga, który wiąże się z IGF-IR i otrzymanie przeciwciała z faga. Jedna z metod wytwarzania Iudzkich przeciwciał obejmuje etap immunizowania zwierzęciagospodarza innego niż człowiek zawierającego Iocus ludzkiej immunoglobuliny stosując IGF-IR lub jego immunogenną część w celu uzyskania odpowiedzi immunologicznej, wydzielenia ze zwierzęcia komórek, które są odpowiedzialne za wytwarzanie przeciwciał, izolowania RNA z wydzielonych komórek, przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji na RNA w celu wytworzenia cDNA, powielenia cDNA z zastosowaniem startera i wstawienia cDNA do wektora do prezentacji na fagu, tak że przeciwciała są wyrażane na fagu. Można w ten sposób otrzymać zrekombinowane przeciwciała anty-IGF-IR.
Poza ujawnionymi tu przeciwciałami anty-IGF-IR zrekombinowane ludzkie przeciwciała antyIGF-IR według wynalazku można wyizolować poprzez przeszukiwanie zrekombinowanej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał, korzystnie biblioteki scFv w oparciu o prezentację na fagach, wytworzonej przy użyciu ludzkich cDNA VL i VH wytworzonych z mRNA pochodzącego z ludzkich limfocytów. Sposoby wytwarzania i przeszukiwania takich bibliotek są dobrze znane w tej dziedzinie. Istnieją dostępne handlowo zestawy do wytwarzania bibliotek w oparciu o prezentację na fagach (np. Pharmacia
Recombinant Phage Antybody System, nr katalogowy 27-9400-01 oraz zestaw do Stratagene SurQAP phage display kit, nr katalogowy 240612). Są również inne metody i odczynniki, które można zastosować do wytwarzania i przeszukiwania bibliotek w oparciu o prezentację na fagach (patrz np., Ladner i wsp. patent USA nr 5223409; Kang i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/18619; Dower i wsp. Publikacja PCT nr WO 91/17271; Winter i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/20791; Markłand i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/15679; Breitling i wsp. Publikacja PCT nr WO 93/01288; McCafferty i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/01047; Garrard i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/09690; Fuchs i wsp. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay i wsp. (1992) Hum. Antybod. Hybridomas 3: 81-85; Huse i wsp. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths i wsp. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins i wsp. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson i wsp. (1991) Nature 352: 624-628; Gram i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad i wsp. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom i wsp. (1991) Nucl Acid Res 19: 4133-4137 oraz Barbas i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
W korzystnym wykonaniu w celu wyizolowania ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR o porządanych cechach, ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR jak tu opisano stosuje się najpierw do selekcji ludzkich sekwencji łańcucha lekkiego i ciężkiego mających podobną aktywność wiązania wobec IGF-IR przy użyciu metod piętnowania epitopowego opisanych w Hoogenboom i wsp. Publikacja PCT nr WO 93/06213. Korzystne jest, jeżeli bibliotekami przeciwciał zastosowanymi w tej metodzie są biblioteki scFv wytworzone i przeszukiwane jak opisano w McCafferty i wsp., publikacja PCT nr WO 92/01047, McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: 552-554 oraz Griffiths i wsp., (1993) EMBO J 12: 725-734. Korzystne jest przeszukiwane bibliotek przeciwciała przy zastosowaniu jako antygen ludzkiego IGF-IR.
Po wstępnej selekcji ludzkich segmentów VL i VH, przeprowadza się doświadczenia „mieszania i dopasowywania”, w których różne pary wyselekcjonowanych wstępnie segmentów VL i VH przeszukuje się pod kątem wiązania IGF-IR w celu wybrania korzystnej kombinacji pary VL/VH. Dodatkowo, w celu dalszego polepszenia jakości przeciwciała, segmenty VL i VH z korzystnej pary (par) VL/VH można poddać losowej mutagenezie, korzystnie w obrębie regionu CDR3 VH i/lub VL, w procesie analogicznym do procesu powstawania mutacji somatycznych in vivo odpowiedzialnym za dojrzewanie powinowactwa przeciwciał w czasie naturalnej odpowiedzi immunologicznej. Takie dojrzewanie powinowactwa in vitro można uzyskać poprzez powielenie regionów VH i VL stosując startery do PCR komplementarne odpowiednio do VH CDR3 lub VL CDR3 przy użyciu starterów, które zostały „naszpikowane” w pewnych pozycjach losową mieszaniną czterech zasad nukleotydowych, tak że otrzymane w rezultacie fragmenty PCR kodują segmenty VH i VL, do których w regionach CDR3 VH i/lub VL zostały wprowadzone losowe mutacje. Te losowo zmutowane segmenty VH i VL można przeszukiwać ponownie pod kątem wiązania się z IGF-IR.
Po przeszukiwaniu i izolacji przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku z biblioteki zrekombinowanych przeciwciał w oparciu o prezentację, z układu do prezentacji (np. genomu faga) można
PL 217 921 B1 odzyskać kwas nukleinowy kodujący wybrane przeciwciało i subklonować w innych wektorach ekspresyjnych przy zastosowaniu standardowych technik rekombinowania DNA. Jeśli to pożądane, kwas nukleinowy można poddać dalszym manipulacjom w celu utworzenia innych postaci przeciwciała według wynalazku, jak opisano poniżej. W celu wyrażenia zrekombinowanego ludzkiego przeciwciała wyizolowanego poprzez przeszukiwanie biblioteki kombinatorycznej, DNA kodujący przeciwciało klonuje się do zrekombinowanego wektora ekspresyjnego i wprowadza do ssaczych komórek gospodarza, jak opisano powyżej.
Zamiana klas
Innym aspektem niniejszego wynalazku jest dostarczenie mechanizmu, poprzez który jedna klasa przeciwciała anty-IGF-IR może zmienić się na inną. W jednym z aspektów wynalazku kwas nukleinowy kodujący VL albo VH izoluje się przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie, tak że nie zawierają żadnych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących CL Iub CH. Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL lub VH łączy się następnie funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą CL lub CH z innej klasy cząsteczek immunoglobulin. Można tego dokonać stosując wektor albo cząsteczkę kwasu nukleinowego, która zawiera łańcuch CL lub CH, jak opisano powyżej. Przykładowo, klasę przeciwciała anty-IGF-IR, które wyjściowo było IgM można zmienić na IgG. Ponadto, zmianę klas można zastosować do przekształcenia jednej podklasy IgG w inną, np. z IgGI na IgG2. Korzystny sposób wytwarzania przeciwciała według wynalazku o pożądanym izotypie obejmuje etapy izolowania kwasu nukleinowego kodującego łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR i kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała anty-IGF-IR, otrzymanie regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, połączenie poprzez ligację regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z domeną stałą łańcucha ciężkiego o pożądanym izotypie, wyrażenie łańcucha lekkiego i poddanego ligacji łańcucha ciężkiego w komórce i zebranie przeciwciała anty-IGF-IR o pożądanym fenotypie.
Pochodne przeciwciał
Można użyć opisane powyżej cząsteczki kwasu nukleinowego do wytworzenia pochodnych przeciwciał stosując techniki i metody dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie.
Przeciwciała humanizowane
Jak dyskutowano powyżej w związku z wytwarzaniem ludzkiego przeciwciała, istnieją zalety wytwarzania przeciwciał z obniżoną immunogennością. Do pewnego stopnia można to uzyskać w powiązaniu z technikami humanizacji i technikami prezentacji stosując odpowiednie biblioteki. Będzie można dostrzec, że mysie przeciwciała albo przeciwciała z innych gatunków można humanizować albo upodobnić do naczelnych stosując techniki znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład, Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) oraz Wright i wsp. Crit. Reviews in Immunol 12125-168 (1992).
Przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania można skonstruować poprzez techniki rekombinowania DNA w celu zastąpienia CH1, CH2, CH3, domen zawiasowych i/Iub domeny zrębowej odpowiednimi sekwencjami ludzkimi (patrz WO 92/02190 i patenty USA nr 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 i 5777085). W korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być humanizowane poprzez zastąpienie CH1, CH2, CH3, domen zawiasowych i/lub domeny zrębowej odpowiednimi sekwencjami ludzkimi, zachowując CDR łańcucha ciężkiego, łańcucha lekkiego albo obydwu, łańcucha ciężkiego i lekkiego.
Przeciwciała zmutowane
W innym wykonaniu cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza można użyć do wytworzenia zmodyfikowanych przeciwciał anty-IGF-IR. Przeciwciała mogą być zmutowane w domenach zmiennych łańcuchów ciężkich i/Iub lekkich w celu zmiany właściwości wiązania przeciwciała. Przykładowo, mutacji można dokonać w jednym z regionów CDR w celu zwiększenia lub zmniejszenia Kd przeciwciała wobec IGF-IR, zwiększenia lub zmniejszenia Koff albo zmiany swoistości wiązania przeciwciała. Techniki ukierunkowanej mutagenezy są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i wsp. oraz AusubeI i wsp., jak wyżej. W korzystnym wykonaniu, mutacji dokonuje się w miejscu reszty aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu do linii płciowej w regionie zmiennym przeciwciała anty-IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu jedną albo większą liczbę mutacji dokonuje się w miejscu reszty aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu do linii płciowej w regionie zmiennym albo regionie CDR jednego z przeciwciał antyIGF-IR 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym wykonaniu jedną albo większą liczbę mutacji dokonuje się w miejscu reszty aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu do linii płciowej w regionie zmiennym albo regionie CDR, których sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona w SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24, albo których sePL 217 921 B1 kwencja kwasu nukleinowego jest przedstawiona w SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 lub 23. W innym wykonaniu cząsteczki kwasu nukleinowego są zmutowane w jednym albo większej liczbie regionów zrębowych. Mutacji można dokonać w regionie zrębowym albo domenie stałej w celu zwiększenia okresu półtrwania przeciwciała anty-IGF-IR. Patrz np. WO 00/09560, opublikowane 24 lutego, 2000, włączone tu jako odniesienie. W jednym z wykonań może mieć miejsce jedna, trzy albo pięć mutacji punktowych i nie więcej niż dziesięć mutacji punktowych. Mutacji w regionie zrębowym albo domenie stałej można również dokonać w celu zmiany immunogenności przeciwciała, w celu dostarczenia miejsca dla kowalencyjnego albo niekowalencyjnego wiązania z inną cząsteczką albo zmiany takich właściwości, jak wiązanie dopełniacza. Mutacje mogą być dokonane w każdym z regionów zrębowych, każdej z domen stałej i każdym z regionów zmiennych w pojedynczym zmutowanym przeciwciele. Alternatywnie, mutacje mogą być dokonane tylko w jednym z regionów zrębowych, domen stałych i regionów zmiennych w pojedynczym zmutowanym przeciwciele.
W jednym z wykonań, ma miejsce nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w każdym z regionów VH lub VL zmutowanego przeciwciała anty-IGF-IR w porównaniu do przeciwciała antyIGF-IR przed mutacją. W bardziej korzystnym wykonaniu ma miejsce nie więcej niż pięć zmian aminokwasowych w każdym z regionów VH Iub VL zmutowanego przeciwciała anty-IGF-IR, korzystniej nie więcej niż trzy zmiany aminokwasowe. W innym wykonaniu, ma miejsce nie więcej niż piętnaście zmian aminokwasowych w domenach stałych, korzystniej nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych, a jeszcze korzystniej nie więcej niż pięć zmian aminokwasowych.
Przeciwciała zmodyfikowane
W innym wykonaniu można wytworzyć fuzję przeciwciałową albo immunoadhezynę, która zawiera całe ałbo część przeciwciała anty-IGF-IR połączone z innym polipeptydem. W korzystnym wykonaniu, jedynie regiony zmienne przeciwciała anty-IGF-IR są połączone z innym polipeptydem. W innym korzystnym wykonaniu domena VH przeciwciała anty-IGF-IR jest połączona z pierwszym polipeptydem, podczas gdy domena VL przeciwciała anty-IGF-IR jest połączona z drugim polipeptydem, który jest połączony z pierwszym polipeptydem w taki sposób, że domeny VH i VL mogą oddziaływać ze sobą z wytworzeniem miejsca wiązania przeciwciała. W innym korzystnym wykonaniu domena VH jest oddzielona od domeny VL przez łącznik w taki sposób, że domeny VH i VL mogą ze sobą oddziaływać (patrz poniżej pod „Przeciwciała jednołańcuchowe”). Przeciwciało VH-łącznik-VL łączy się następnie z polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania. Fuzja przeciwciałowa jest przydatna do kierowania polipeptydu do komórki albo tkanki wyrażającej IGF-IR. Polipeptyd może być czynnikiem terapeutycznym, takim jak toksyna, czynnik wzrostu albo inne białko regulacyjne albo może być czynnikiem diagnostycznym, takim jak enzym, który można łatwo uwidocznić, takim jak peroksydaza chrzanowa. Ponadto, można wytworzyć fuzję przeciwciałową, w której dwa (albo większa liczba) przeciwciał jednołańcuchowych jest połączonych ze sobą. Jest to przydatne, kiedy chce się wytworzyć przeciwciało dwuwartościowe albo wielowartościowe z jednego łańcucha polipeptydowego albo kiedy chce się wytworzyć przeciwciało bispecyficzne.
W celu wytworzenia przeciwciała jednołańcuchowego, (scFv), fragmenty DNA kodujące VH i VL łączy się funkcjonalnie z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodującym sekwencję aminokwasową (Gly4-Ser)3 (SEK NR ID: 60), tak że sekwencje VH i VL mogą być wyrażane jako ciągły pojedynczy łańcuch białkowy z regionami VL i VH połączonymi przez elastyczny łącznik (patrz np. Bird i wsp. (1988) Science 242: 423-426; Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 58795883; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: 552-554). Przeciwciało jednołańcuchowe może być jedno wartościowe, jeżeli użyje się jednego VH i VL, dwuwartościowe jeżeli użyje się dwóch VH i VL albo wielowartościowe jeżeli użyje się więcej niż dwóch VH i VL.
W innym wykonaniu można wytworzyć przeciwciała zmodyfikowane wykorzystując cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała anty-IGF-IR. Na przykład, można wytworzyć „Kappaciała” (Ill i wsp., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), „Miniciała” (Martin i wsp., EMBO J 13: 53039 (1994)), „Diciała” (Holliger i wsp., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)) albo „Janusiny” (Traunecker i wsp., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) oraz Traunecker i wsp. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents” Int J Cancer Suppl 7: 51-52 (1992)) stosując standardowe techniki biologii molekularnej według nauk z tego opisu.
W innym aspekcie można wytworzyć przeciwciała chimerowe i bispecyficzne. Można wytworzyć przeciwciała chimerowe, które zawierają CDR i regiony zrębowe z różnych przeciwciał. W korzystnym wykonaniu CDR przeciwciała chimerowego obejmują wszystkie CDR regionów zmiennych łańcucha ciężkiego albo łańcucha lekkiego przeciwciała anty-IGF-IR, podczas gdy regiony zrębowe pochodzą
PL 217 921 B1 z jednego lub większej liczby odmiennych przeciwciał. W bardziej korzystnym wykonaniu CDR przeciwciała chimerowego obejmują wszystkie CDR regionów zmiennych łańcucha lekkiego i łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR. Regiony zrębowe mogą być z innych gatunków i mogą być, w korzystnym wykonaniu, humanizowane. Alternatywnie, regiony zrębowe mogą być z innego przeciwciała ludzkiego.
Można wytworzyć przeciwciało bispecyficzne, które wiąże się swoiście z IGF-IR poprzez jedną domenę wiążącą i z drugą cząsteczką poprzez drugą domenę wiążącą. Przeciwciało bispecyficzne można wytworzyć przy zastosowaniu technik biologii molekularnej albo może być połączone razem fizycznie. Ponadto, można wytworzyć przeciwciała jednołańcuchowe zawierające więcej niż jeden VH i VL które wiążą się swoiście z IGF-IR i z inną cząsteczką. Takie przeciwciała bispecyficzne można wytworzyć przy zastosowaniu technik dobrze znanych w tej dziedzinie, na przykład według (i) i (ii) patrz np. Fanger i wsp. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) oraz Wright i Harris, jak wyżej oraz według (iii) patrz np. Traunecker i wsp. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). W innym korzystnym wykonaniu przeciwciała bispecyficzne wiążą się z IGF-IR i z inną cząsteczką wyrażaną na wysokim poziomie na komórkach rakowych albo nowotworowych. W bardziej korzystnym wykonaniu inną cząsteczką jest receptor erbB2, VEGF, CD20 lub EGF-R.
W jednym wykonaniu opisane są zmodyfikowane przeciwciała wytworzone przy użyciu jednego albo większej liczby regionów CDR z jednego z przeciwciał wybranych spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W innym wykonaniu zmodyfikowane przeciwciała są wytworzone przy użyciu jednego albo większej liczby regionów zmiennych albo jednego albo większej liczby regionów CDR, których sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona w SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24, albo których sekwencja kwasu nukleinowego jest przedstawiona w SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 lub 23.
Przeciwciała derywatyzowane i wyznakowane
Przeciwciało albo część przeciwciała według wynalazku można poddać derywatyzacji albo połączyć z inną cząsteczką (np. innym peptydem albo białkiem). Generalnie, przeciwciała albo ich część poddaje się derywatyzacji w taki sposób, że derywatyzacja albo znakowanie nie zmienia w niekorzystny sposób wiązania IGF-IR. A zatem przeciwciała albo ich część według wynalazku mają obejmować zarówno nienaruszone, jak i zmodyfikowane postaci opisanych tu ludzkich przeciwciał antyIGF-IR. Przykładowo, przeciwciała albo ich część według wynalazku mogą być połączone funkcjonalnie (poprzez połączenie chemiczne, fuzję genetyczną, połączenie niekowalencyjne albo w inny sposób) z jedną albo więcej reszt molekularnych, takich jak inne przeciwciało (np. przeciwciało bispecyficzne albo diciało), czynnik do wykrywania, czynnik cytotoksyczny, czynnik farmaceutyczny i/lub białko albo peptyd, który może pośredniczyć w wiązaniu się przeciwciała albo części przeciwciała z inną cząsteczką (taką jak rdzeń streptawidyny albo znacznik polihistydynowy).
Jeden z typów przeciwciała derywatyzowanego wytwarza się poprzez łączenie krzyżowe dwóch albo większej liczby przeciwciał (tego samo typu albo innego typu, np. w celu wytworzenia przeciwciał bispecyficznych). Odpowiednie łączniki krzyżowe obejmują łączniki heterobifunkcjonalne, mające dwie grupy o odrębnej reaktywności oddzielone przez odpowiedni łącznik (np. ester m-maleimidobenzoiloN-hydroksysukcynimidowy) lub homobifunkcjonalne (np. suberan disukcynimidylowy). Takie łączniki są dostępne z Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Innym typem przeciwciała derywatyzowanego jest przeciwciało wyznakowane. Przydatne odczynniki do wykrywania, z którymi przeciwciało albo część przeciwciała według wynalazku mogą być połączone obejmują związki fluorescencyjne, włączając w to fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetyloamino-1-naftalenosulfonylowy, fikoerytrynę, Iantanidofosfory i temu podobne. Przeciwciało może być również wyznakowane enzymami, które są przydatne do wykrywania, takimi jak peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, alkaliczna fosfataza, oksydaza glukozowa i temu podobne. Kiedy przeciwciało jest wyznakowane wykrywalnym enzymem, wykrywa się go poprzez dodanie dodatkowych czynników, które wykorzystuje enzym dla wytworzenia produktu reakcji, który można wyróżnić. Przykładowo, kiedy obecnym czynnikiem jest peroksydaza chrzanowa dodatek nadltenku wodoru i diaminobenzydyny prowadzi do barwnego produktu reakcji, który można wykryć. Przeciwciało może być również wyznakowane biotyną i wykrywane poprzez pośredni pomiar wiązania awidyny albo streptawidyny. Przeciwciało może być również wyznakowane czynnikiem magnetycznym, takim jak gadolin. Przeciwciało może być również wyznakowane określonymi uprzednio epitopami polipeptydowymi rozpoznawanymi przez drugorzędowy wskaźnik (np. para sekwencji suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiązania metali,
PL 217 921 B1 znaczniki epitopowe). W niektórych wykonaniach, znaczniki są przyłączone poprzez ramiona łącznikowe o różnej długości, aby zmniejszyć potencjalną zawadę steryczną.
Przeciwciało anty-IGF-IR może być również wyznakowane radioaktywnym aminokwasem. Znacznik radioaktywny można zastosować zarówno dla celów diagnostycznych jak i terapeutycznych. Przykładowo, znacznik radioaktywny można zastosować w celu wykrycia nowotworów wyrażających IGF-IR poprzez zastosowanie promieni X albo innych technik diagnostycznych. Ponadto, znacznik radioaktywny można zastosować leczniczo jako toksynę dla komórek nowotworowych albo nowotworów. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują między innymi następujące: radioizotopy lub radionuklidy 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
Przeciwciało anty-IGF-IR może być również derywatyzowane przy użyciu grupy chemicznej, takiej jak glikol polietylenowy (PEG), grupy metylowej lub grupy etylowej albo grupy węglowodanowej. Grupy te mogą być przydatne do polepszenia właściwości biochemicznych przeciwciała, np. dla zwiększenia okresu półtrwania w surowicy albo zwiększenia wiązania w tkance.
Kompozycje i zestawy farmaceutyczne
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzenia związanego z hiperoliferacją u ssaka, która zawiera skuteczną terapeutycznie ilość związku według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. W jednym z wykonań, taka kompozycja farmaceutyczna służy do leczenia raka, takiego jak rak mózgu, płuca, płaskokomórkowy, pęcherza, żołądka, trzustki, sutka, głowy, szyi, nerki, jajnika, prostaty, jelita grubego, przełyku, ginekologicznego lub tarczycy. W innym wykonaniu, taka kompozycja farmaceutyczna dotyczy nierakowych zaburzeń związanych z hiperproliferacją, takich jak, bez ograniczania, restenoza po zabiegu angioplastyki i łuszczyca. W innym wykonaniu, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do leczenia ssaka, który wymaga aktywacji IGF-IR, gdzie kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała aktywującego według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciała aktywujące, mogą zostać użyte do leczenia zwierząt, którym brak dostatecznego poziomu IGF I lub IGF-11, albo mogą zostać użyte do leczenia osteoporozy, łamliwości lub zaburzeń, w których zwierzę wydziela za mało aktywnego hormonu wzrostu lub jest niezdolne do odpowiedzi na hormon wzrostu.
Przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku mogą zostać włączone do kompozycji farmaceutycznych, odpowiednich do podawania pacjentom. W sytuacji typowej, kompozycja farmaceutyczna zawiera przeciwciało według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Stosowane tu określenie „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik” obejmuje każdy i wszystkie rozpuszczalniki, nośniki postaci rozproszonych, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję i podobne, które są zgodne fizjologicznie. Przykłady dopuszczalnych farmaceutycznie nośników obejmują jeden lub więcej spośród wody, roztworu soli fizjologicznej, roztworu soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem, dekstrozy, glicerolu, etanolu i podobnych oraz ich kombinacji. W wielu przypadkach korzystne będzie włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorku sodu. Akceptowalne farmaceutycznie substancje, takie jak zwilżające lub małe ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki konserwujące lub bufory, które poprawiają okres przechowywania lub skuteczność przeciwciała lub części przeciwciała.
Kompozycje według tego wynalazku mogą mieć różne formy. Obejmują one, na przykład, formy dawkowania płynne, półstałe i stałe, takie jak roztwory płynne (np. do zastrzyków i wlewów), postacie rozproszone lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna forma zależy od zamierzonego trybu dawkowania i zastosowania terapeutycznego. Typowe korzystne kompozycje mają formę roztworów do zastrzyków lub wlewów, takich jak kompozycje podobne do tych, których używa się do uodpornienia biernego ludzi za pomocą innych przeciwciał. Korzystnym sposobem podawania jest podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). W wykonaniu korzystnym przeciwciało podaje się za pomocą wlewu lub zastrzyku dożylnego. W innym korzystnym wykonaniu przeciwciało podaje się za pomocą zastrzyku domięśniowego lub podskórnego.
Kompozycje terapeutyczne muszą zazwyczaj zachowywać jałowość i trwałość w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycja może zostać sporządzona w postaci roztworu, mikroemulsji, postaci rozproszonej, liposomu lub innej struktury uporządkowanej, dostosowanej do dużego stężenia leku. Jałowe roztwory do zastrzyków można sporządzić wprowadzając przeciwciało anty-IGF-IR w odpowiedniej ilości do właściwego rozpuszczalnika wraz z jednym lub kombinacją składników, wyli34
PL 217 921 B1 czonych powyżej, wedle potrzeby, a następnie sterylizując przez filtrowanie. Ogólnie, postacie rozproszone sporządza się przez wprowadzenie związku aktywnego do jałowego nośnika, który zawiera zasadniczy nośnik postaci rozproszonej i inne wymagane składniki spośród tych, które wyliczono powyżej. W przypadku jałowych proszków dla przygotowywania jałowych roztworów do zastrzyków, sposobami korzystnymi do sporządzania są suszenie pod próżnią i liofilizacja, za pomocą których otrzymuje się proszek składnika aktywnego, wraz z dodatkowymi pożądanymi składnikami, z ich roztworu, wysterylizowanego uprzednio poprzez filtrowanie. Odpowiednią płynność roztworu można uzyskać przez zastosowanie powłoki, na przykład z lecytyny, przez zachowanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku postaci rozproszonej i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. Przedłużona absorpcja kompozycji do zastrzyków może zostać uzyskana przez zawarcie w kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, na przykład soli monostearynianów i żelatyny.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać za pomocą różnych sposobów znanych w tej dziedzinie, choć dla wielu zastosowań terapeutycznych korzystną drogą/sposobem jest podawanie dootrzewnowe, podskórne, domięśniowe, dożylne lub wlew. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że droga i/lub sposób podawania będzie zmienny, w zależności od pożądanych wyników. W jednym z wykonań, przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać jako pojedynczą dawkę albo można podawać jako dawki wielokrotne.
W pewnych wykonaniach związek aktywny można przygotować wraz z nośnikiem, który zabezpieczy go przed szybkim uwolnieniem, takim jak kompozycja dla kontrolowanego uwalniania, w tym implanty, plastry przezskórne i układy podawania w postaci mikrokapsułek. Można użyć polimerów biodegradowalnych i zgodnych biologicznie, takich jak octan winylowo-etylenowy, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów wyk o n yw ania takich kompozycji zostało opatentowanych lub jest ogólnie znanych specjalistom w tej dziedzinie. Patrz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, wyd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
W pewnych wykonaniach przeciwciało anty-IGF-IR według wynalazku może być podawane doustnie, na przykład z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym jadalnym nośnikiem. Związek (i inne składniki, jeśli to pożądane) można również zawrzeć w kapsułce żelatynowej o twardej lub miękkiej powłoce, sprasować w tabletki lub wprowadzić bezpośrednio do diety pacjenta. Dla podawania terapeutycznego doustnego, związek można połączyć z zaróbkami i zastosować w postaci tabletek do spożycia, tabletek podjęzykowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, wafli i tym podobnych. Dla podawania związku według wynalazku sposobem innym niż pozajelitowy może być konieczne pokrycie lub współpodawanie związku z materiałem zapobiegającym jego inaktywacji.
Do kompozycji można również włączyć dodatkowe związki aktywne. W pewnych wykonaniach anty-IGF-IR według wynalazku może być zmieszane i/lub podawane wspólnie z jednym lub większą liczbą czynników terapeutycznych, takich jak czynnik chemioterapeutyczny, czynnik przeciwnowotworowy lub czynnik antyrakowy. Przykładowo, przeciwciało anty-IGF-IR według wynalazku może być mieszane i/lub podawane wspólnie z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników terapeutycznych. Do tych czynników należą, między innymi, przeciwciała, które wiążą inne cząsteczki (np. przeciwciała, które wiążą jeden lub większą liczbę czynników wzrostu lub cytokin, ich receptorów na powierzchni komórki lub IGF-I), białka wiążące IGF, czynniki przeciwnowotworowe, czynniki chemioterapeutyczne, czynniki antyrakowe,oligonukleotydy antysensowne przeciw IGF-IR lub IGF-I, analogi peptydowe które, blokują aktywację IGF-IR, rozpuszczalny IGF-IR i/lub jeden lub więcej czynników chemicznych, które hamują wytwarzanie lub aktywność IGF-I, które są znane w dziedzinie, np. oktreotyd. W kompozycji farmaceutycznej, zawierającej przeciwciało aktywujące, przeciwciało anty-IGF-IR może zostać zmieszane z czynnikiem, który wzmaga proliferację komórek lub zapobiega apoptozie. Do takich czynników należą czynniki wzrostu, takie jak IGF-I i/Iub analogi IGF-I, które aktywują IGF-IR. Takie terapie łączone mogą wymagać niższego dawkowania przeciwciała anty-IGF-IR, a także czynników podawanych jednocześnie, co umożliwia uniknięcie możliwej toksyczności lub komplikacji, związanych z różnymi monoterapiami. W jednym z wykonań przeciwciało i jeden lub większa liczba dodatkowych czynników terapeutycznych.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać „ilość skuteczną terapeutycznie” lub „ilość skuteczną profilaktycznie” przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku. „Ilość skuteczna terapeutycznie” odnosi się do ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu leczniczego w koniecznych dawkach i okresach czasu. Ilość skuteczna terapeutycznie przeciwciała lub części przeciwciała może się zmieniać w związku z takimi czynnikami, jak stan choroby, wiek, płeć i waga
PL 217 921 B1 danego osobnika oraz zdolność przeciwciała lub części przeciwciała do wywołania pożądanej odpowiedzi u danego osobnika. Ilość skuteczna terapeutycznie to również taka, przy której efekty dobroczynne leczniczo przeważają nad wszelkimi efektami toksycznymi lub szkodliwymi przeciwciała lub części przeciwciała. „Ilość skuteczna profilaktycznie” przeciwciała lub części przeciwciała odnosi się do ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu profilaktycznego w koniecznych dawkach i okresach czasu. W sytuacji typowej, jako że dawka profilaktyczna jest stosowana u pacjentów przed pojawieniem się choroby lub w jej wczesnym stadium, ilość skuteczna profilaktycznie będzie mniejsza od ilości skutecznej terapeutycznie.
Tryby dawkowania można dostosować tak, by dostarczyć optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną Iub profilaktyczną). Na przykład, można podać pojedynczą dużą dawkę, można podać w pewnym okresie kilka dawek podzielonych albo dawka może zostać proporcjonalnie obniżona lub podwyższona wedle wskazań sytuacji terapeutycznej. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą przeciwciało lub zawierającą terapię łączoną, obejmującą przeciwciało i jeden lub większą liczbę dodatkowych czynników terapeutycznych można wytworzyć dla dawek pojedynczych lub wielokrotnych. Szczególnie korzystne jest wytworzenie kompozycji pozajelitowej w formie jednostek dawkowania, dla ułatwienia podawania i jednolitości dawkowania. Forma jednostki dawkowania, w znaczeniu tu użytym, odnosi się do odrębnych fizycznie jednostek, dostosowanych do roli dawek jednostkowych dla osobników - ssaków, które mają być poddane leczeniu; każda jednostka zawiera ustaloną z góry ilość związku aktywnego, wyliczoną tak, by wywołała pożądany efekt terapeutyczny w powiązaniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacje dla form jednostek dawkowania według wynalazku są podyktowane przez i bezpośrednio zależne od (a) swoistych cech związku aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego, który ma zostać uzyskany i (b) ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takich związków aktywnych dla leczenia wrażliwości u danych osobników. Szczególnie przydatną kompozycję stanowi 5 mg/ml przeciwciała anty-IGF-IR w buforze 20 mM cytrynian sodu, pH 5,5, 140 mM NaCl i 0,2 mg/ml polisorban 80.
Przykładowym, nie ograniczającym zakresem ilości przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku skutecznych terapeutycznie lub profilaktycznie jest 0,1-100 mg/kg, bardziej korzystnie 0,550 mg/kg, bardziej korzystnie 1-20 mg/kg, a jeszcze bardziej korzystnie 1-10 mg/kg. Należy zaznaczyć, że wartości dawkowania mogą zmieniać się wraz z rodzajem i nasileniem stanu, który ma być leczony. Jest ponadto zrozumiałe, że dla każdego konkretnego pacjenta winno się w trakcie leczenia dobrać właściwy tryb dawkowania, zgodny z indywidualnymi potrzebami i profesjonalną oceną osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, a zakresy dawkowania podane tutaj są jedynie przykładowe i nie mają na celu ograniczania zakresu lub praktyki stosowania zastrzeganej kompozycji. W jednym z zastosowań ilość przeciwciała lub jego części wiążącej antygen skuteczna terapeutycznie lub profilaktycznie jest podawana wraz z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników terapeutycznych.
W innym aspekcie ten wynalazek dotyczy podawania przeciwciała anty-IGF-IR przy leczeniu raka w dawce niższej niż 300 mg miesięcznie.
Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza zestawów, zawierających przeciwciała anty-IGF-IR i kompozycji farmaceutycznych, zawierających te przeciwciała. Zestaw może zawierać, w dodatku do przeciwciała lub kompozycji farmaceutycznej, czynniki diagnostyczne lub terapeutyczne. Zestaw może również zawierać instrukcje dla zastosowania w sposobie diagnostycznym lub terapeutycznym. W korzystnym wykonaniu zestaw zawiera przeciwciało lub jego kompozycję farmaceutyczną i czynnik diagnostyczny, który można zastosować w sposobie opisanym poniżej. W innym korzystnym wykonaniu zestaw zawiera przeciwciało Iub jego kompozycję farmaceutyczną i jeden lub większą liczbę czynników terapeutycznych, takich jak dodatkowy czynnik przeciwnowotworowy, czynnik antyrakowy lub czynnik chemioterapeutyczny, które można zastosować w sposobie opisanym poniżej.
Wynalazek ten dotyczy również kompozycji farmaceutycznych do hamowania nienormalnego wzrostu komórek u ssaka, które zawierają pewną ilość związku według wynalazku, w połączeniu z pewną ilością czynnika chemioterapeutycznego, gdzie ilości związku, soli, substancji rozpuszczanej lub proleku oraz czynnika chemioterapeutycznego są razem skuteczne w hamowaniu nienormalnego wzrostu komórek. Obecnie w dziedzinie znanych jest wiele czynników chemioterapeutycznych. W jednym z wykonań czynniki chemioterapeutyczne wybiera się z grupy, składającej się z inhibitorów mitozy, czynników alkilujących, antymetabolitów, antybiotyków interkalujących, inhibitorów czynników wzrostu, inhibitorów cyklu komórkowego, enzymów, inhibitorów topoizomerazy, czynników przeciw36
PL 217 921 B1 przeżyciowych, modyfikatorów odpowiedzi biologicznej, anty-hormonów, np. anty-androgenów i czynników przeciw angionenezie.
Czynniki przeciw angiogenezie, takie jak inhibitory MMP-2 (metaloproteinaza substancji międzykomórkowej 2), inhibitory MMP-9 (metaloproteinaza substancji międzykomórkowej 9) i inhibitory COX-II (cyklooksygenazy II) mogą zostać zastosowane w połączeniu ze związkiem według wynalazku. Przykłady użytecznych inhibitorów COX-II obejmują CELEBREXTM (alecoksib), waldecoksib, oraz rofecoksib. Przykłady użytecznych inhibitorów metaloproteinazy substancji międzykomórkowej są opisane w WO 96/33172 (opublikowanym 24 października 1996), WO 96/27583 (opublikowanym 7 marca 1996), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 97304971.1 (złożonym 8 lipca 1997), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99308617.2 (złożonym 29 października 1999), WO 98/07697 (opublikowanym 26 lutego 1998), WO 98/03516 (opublikowanym 29 stycznia 1998), WO 98/34918 (opublikowanym 13 sierpnia 1998), WO 98/34915 (opublikowanym 13 sierpnia 1998), WO 98/33768 (opublikowanym 6 sierpnia 1998), WO 98/30566 (opublikowanym 16 lipca 1998), europejskiej publikacji patentowej 606046 (opublikowanej 13 lipca 1994), europejskiej publikacji patentowej 931788 (opublikowanej 28 lipca 1999), WO 90/05719 (opublikowanym 31 maja 1990), WO 99/52910 (opublikowanym 21 października 1999), WO 99/52889 (opublikowanym 21 października 1999), WO 99/29667 (opublikowanym 17 lipca 1999), międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr PCT/IB98/01113 (złożonym 21 lipca
1998) , europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99302232.1 (złożonym 25 marca 1999), zgłoszeniu patentowym Wielkiej Brytanii numer 9912961.1 (złożonym 3 czerwca 1999), zgłoszeniu tymczasowym USA nr 60/148,464 (złożonym 12 sierpnia 1999), patencie USA 5863949 (wydanym 26 stycznia
1999) , patencie USA 5861510 (wydanym 19 stycznia 1999), oraz europejskiej publikacji patentowej 780386 (opublikowanej 25 czerwca 1997), wszystkie te patenty zostają tu włączone jako odniesienie. Korzystnymi inchibitorami MMP są te, które nie wywołują bólów stawów. Bardziej korzystne są te, które wybiórczo hamują MMP-2 i/lub MMP-9 w stosunku do innych metaloproteinaz substancji międzykomórkowej (to jest MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 oraz MMP-13).
Konkretnymi przykładami inhibitorów MMP, przydatnych dla niniejszego wynalazku są AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 i związki wymienione na następującej liście: kwas 3-[[4-(4-fluoro-fenoksy)benzenosufonylo]-(1-hydroksykarbamoilocyklopentylo)amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo3-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylamino]-8-oksa-bicyklo [3.2.1] oktano-3-karboksylowego-; hydroksyamid kwasu (2R, 3R) 1-[4-(2-chloro-4-fluorobenzyloksy)-benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylo-piperydyno-2-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzene sulfonylamino]tetrahydropirano-4-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylo] (1-hydroksykarbamoilo-cyklobutylo)-amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-chloro-fenoksy)-benzenosulfonylamino]-tetrahydropirano-4-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (R) 3-[4(4-chloro-fenoksy)-benzenosulfonylamino]-tetrahydropirano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R, 3 R) 1-[4-(4-fluoro-2-metylo-benzyloksy)-benzenosulfonyIo]-3-hydroksy-3-metylo-piperydyno-2-karboksylowego; kwas 3-[[4'(4-fluorofenoksy)-benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilo-1-metyloetylo)-amino]-propionowy; kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)-benzenosulfonylo]-(4-hydroksykarbamoilo-tetrahydropiran-4-ilo)-amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo-3-[4-(4-chlorofenoksy)-benzenosulfonylamino]-8-oksa-bicyklo [3.2.1]oktano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 3-endo-3-[4-(4-fluorofenoksy)-benzeno sulfonylamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego i hydroksyamid kwasu (R) 3-[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonylamino]-tetrahydrofurano-3-karboksylowego oraz akceptowalne farmaceutycznie sole i solwaty tych związków.
Związek według wynalazku może również być używany wraz z inhibitorami przekazywania sygnału, takimi jak czynniki, które mogą hamować odpowiedź EGF-R (receptora naskórkowego czynnika wzrostu), takimi jak przeciwciała EGF-R, przeciwciała EGF i cząsteczki, które są inhibitorami EGF-R; inhibitory VEGF (naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu), takimi jak receptory VEGF i cząsteczki, które mogą hamować VEGF oraz inhibitorami receptora erbB2, takimi jak cząsteczki organiczne lub przeciwciała, które wiążą się do receptora erbB2, na przykład HERCEPTINTM (Genentech, Inc.). Inhibitory EGF-R opisano na przykład w WO 95/19970 (opublikowanym 27 lipca 1995), WO 98/14451 (opublikowanym 9 kwietnia 1998), WO 98/02434 (opublikowanym 22 stycznia 1998) i patencie USA 5747498 (wydanym 5 maja 1998) i takie substancje mogą zostać użyte w niniejszym wynalazku, tak jak tu opisano. Czynniki hamujące EGRF obejmują, między innymi przeciwciała monoklonalne, C225 i anty-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. i Merck KgaA)
PL 217 921 B1 i związki ZD1834, ZD-1838 i ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), Ieflunomid (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) i EGF-R Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Te i inne czynniki hamujące EGF można zastosować w niniejszym wynalazku.
Ze związkiem według niniejszego wynalazku można również połączyć inhibitory VEGF, na przykład SU-5416 i SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Sobering) i NX-1838 (NeXstar). Inhibitory VEGF opisano na przykład w WO 99/24440 (opublikowanym 20 maja 1999), zgłoszeniu międzynarodowym PCT PCT/IB99/00797 (złożonym 3 maja 1999), w WO 95/21613 (opublikowanym 17 sierpnia 1995), WO 99/61422 (opublikowanym 2 grudnia 1999), patencie USA 5834504 (wydanym 10 listopada 1998), WO 98/50356 (opublikowanym 12 listopada 1998), patencie USA 5883113 (wydanym 16 marca 1999), patencie USA 5886020 (wydanym 23 marca 1999), patencie USA 5792783 (wydanym 11 sierpnia 1998), WO 99/10349 (opublikowanym 4 marca 1999), WO 97/32856 (opublikowanym 12 września 1997), WO 97/22596 (opublikowanym 26 czerwca 1997), WO 98/54093 (opublikowanym grudnia 1998), WO 98/02438 (opublikowanym 22 stycznia 1998), WO 99/16755 (opublikowanym 8 kwietnia 1999) i WO 98/02437 (opublikowanym 22 stycznia 1998), wszystkie spośród których zostają tu włączone w całości przez odniesienie. Inne przykłady niektórych swoistych inhibitorów VEGF, użytecznych dla niniejszego wynalazku, to IM862 (Cytran Inc.); przeciwciało monoklonalne anty-VEGF firmy Genentech, Inc. oraz angiozyme, rybozym syntetyczny z firm Ribozyme i Chiron. Te i inne inhibitory VEGF można zastosować w niniejszym wynalazku tak, jak to tu opisano.
Inhibitory receptora erbB2, takie jak GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) i przeciwciała monoklonalne AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) i 2B-1 (Chiron), mogą być ponadto połączone ze związkiem według wynalazku, na przykład te, które wskazano w WO 98/02434 (opublikowanym 22 stycznia 1998), WO 99/35146 (opublikowanym 15 lipca 1999), WO 99/35132 (opublikowanym 15 lipca 1999), WO 98/02437 (opublikowanym 22 stycznia 1998), WO 97/13760 (opublikowanym 17 kwietnia 1997), WO 95/19970 (opublikowanym 27 lipca 1995), patencie USA 5587458 (wydanym 24 grudnia 1996) i patencie USA 5877305 (wydanym 2 marca 1999), wszystkie zostają tu włączone w całości jako odniesienie. Inhibitory receptora erbB2, użyteczne w niniejszym wynalazku, opisano również w zgłoszeniu tymczasowym USA nr 60/117341, złożonym 27 stycznia 1999 i w zgłoszeniu tymczasowym USA nr 60/117346, złożonym 27 stycznia 1999, obydwa włączone tu w całości jako odniesienie. Związki hamujące receptor erbB2 i substancje opisane we wspomnianych uprzednio zgłoszeniach PCT, patentach USA i zgłoszeniach tymczasowych USA, a także inne związki lub substancje, które hamują receptor erbB2, mogą zostać użyte wraz ze związkiem według niniejszego wynalazku, zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
Do związków przeciw-przeżyciowych należą przeciwciała anty-IGF-IR i czynniki antyintegrynowe, takie jak przeciwciała antyintegrynowe.
Diagnostyczne sposoby stosowania
Przeciwciała anty-IGF-IR można użyć do wykrywania IGF-IR w próbce biologicznej in vitro lub in vivo. Przeciwciała anty-IGF-IR można użyć w konwencjonalnym teście immunologicznym, włączając w to między innymi, ELISA, RIA, FACS, immunohistochemię tkankową, technikę Western Iub immunoprecypitację. Przeciwciała anty-IGF-IR można użyć do wykrywania IGF-IR z człowieka. W innym wykonaniu przeciwciała anty-IGF-IR można użyć do wykrywania IGF-IR z naczelnych ze Starego Świata, takich jak makaki z gatunku Macaca fascicularis, rezusy, szympansy i małpy człekokształtne. Wynalazek dostarcza sposobu wykrywania anty-IGF-IR w próbce biologicznej, obejmującego doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej z przeciwciałem anty-IGF-IR według wynalazku i wykrycie związanego przeciwciała, związanego z anty-IGF-IR, by uzyskać wykrycie IGF-IR w próbce biologicznej. W jednym z wykonań przeciwciało anty-IGF-IR jest znakowane bezpośrednio za pomocą wykrywalnego znacznika. W innym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR (pierwsze przeciwciało) jest nieznakowane, a drugie przeciwciało lub inna cząsteczka, która może wiązać przeciwciało anty-IGF-IR, jest znakowane. Jak dobrze wiadomo specjaliście w tej dziedzinie, dobiera się drugie przeciwciało, które jest zdolne do swoistego wiązania swoistego gatunku i klasy pierwszego przeciwciała. Na przykład,
PL 217 921 B1 jeśli przeciwciałem anty-IGF-IR jest IgG człowieka, to drugim przeciwciałem może być anty-IgG człowieka. Do innych cząsteczek, które mogą wiązać się do przeciwciał, należą, bez ograniczania się, Białko A i Białko G, obydwa dostępne handlowo, np. z Pierce Chemical Co.
Znaczniki odpowiednie dla przeciwciała lub drugorzędowe ujawniono powyżej i obejmują one różne enzymy, grupy prostetyczne, substancje fluorescencyjne, substancje luminescencyjne, czynniki magnetyczne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę z chrzanu, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich substancji fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykładem odpowiedniej substancji luminescencyjnej jest luminol; przykładem odpowiedniego czynnika magnetycznego jest gadoΊ ή Ο ή oc Ό lin, a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują lub125I 131I 35S lub 3H.
W wykonaniu alternatywnym IGF-IR można oznaczać w próbce biologicznej w kompetycyjnym teście immunologicznym, wykorzystującym standardy IGF-IR, znakowane substancjami wykrywalnymi i nieznakowane przeciwciało anty-IGF-IR. W tym teście próbkę biologiczną, znakowane standardy IGF-IR i przeciwciało anty-IGF-IR łączy się razem i ustala się ilość znakowanego standardu IGF-IR, związanego do niewyznakowanego przeciwciała. Ilość IGF-IR w próbce biologicznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości znakowanego standardu IGF-IR, związanego do przeciwciała anty-IGF-IR.
Testy immunologiczne, ujawnione powyżej, można stosować do wielu celów. W jednym z wykonań przeciwciała anty-IGF-IR można zastosować do wykrywania IGF-IR w komórkach i hodowlach komórkowych. W wykonaniu korzystnym przeciwciała anty-IGF-IR można zastosować do określania stopnia fosforylacji tyrozyny, autofosforyIacji tyrozyny IGF-IR l/lub ilości IGF-IR na powierzchni komórki po poddaniu komórek działaniu różnych związków. Ten sposób można zastosować do testowania związków, które można użyć do aktywowania lub hamowania IGF-IR. W tym sposobie, jedna próbka komórek jest poddawana działaniu związku testowanego przez dany okres czasu, a druga próbka pozostawiona jest osobno. Jeśli celem jest pomiar autofosforylacji tyrozyny, to komórki poddaje się lizie, a fosforylację tyrozyny IGF-IR mierzy się za pomocą testu immunologicznego, opisanego powyżej lub według opisu w Przykładzie III, Ictóry stosuje test ELISA. Jeśli celem jest pomiar całkowitego poziomu IGF-IR, to komórki poddaje się lizie, a całkowity poziom IGF-IR mierzy się za pomocą jednego z testów immunologicznych, opisanych powyżej.
Korzystnym testem immunologicznym dla wyznaczania fosforylacji tyrozyny IGF-IR lub dla pomiaru całkowitego poziomu IGF-IR jest ELISA lub technika Western. Jeśli zmierzony ma być tylko poziom IGF-IR na powierzchni komórki, to komórek nie poddaje się lizie, a poziom IGF-IR na powierzchni komórki mierzy się za pomocą jednego z testów immunologicznych, opisanych powyżej. Korzystny test immunologiczny dla wyznaczania poziomu IGF-IR na powierzchni komórki zawiera etapy znakowania białek na powierzchni komórki za pomocą wykrywalnego znacznika, takiego jak
125 biotyna lub 125I, immunoprecypitacji IGF-IR za pomocą przeciwciała anty-IGF-IR, a potem wykrywania znakowanego IGF-IR. Inny korzystny test immunologiczny dla wyznaczania lokalizacji IGF-IR, np. poziomu na powierzchni komórki, jest oparty na zastosowaniu immunohistochemii. Techniki takie jak ELISA, RIA, Western , immunohistochemia, znakowanie integralnych białek błonowych na powierzchni komórki i immunoprecypitacja są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej. W dodatku można zwiększyć skalę testu immunologicznego dla badań przesiewowych o dużej przepustowości, dla celu przebadania dużej liczby związków pod kątem aktywacji albo hamowania IGF-IR.
Przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku można również zastosować do wyznaczania poziomu IGF-IR w tkance lub w komórkach otrzymanych z tkanki. W korzystnym wykonaniu tkanką jest tkanka zaatakowana chorobą. W bardziej korzystnym wykonaniu tkanką jest nowotwór lub jego biopsja. W korzystnym wykonaniu sposobu tkanka lub jej biopsja pochodzi od pacjenta. Tkankę lub biopsję używa się następnie w teście immunologicznym by wyznaczyć np. poziom IGF-IR, poziom IGF-IR na powierzchni komórki, poziom fosforylacji tyrozyny IGF-IR lub lokalizację IGF-IR za pomocą dyskutowanych powyżej sposobów. Ten sposób można zastosować do ustalenia, czy nowotwór wykazuje ekspresję IGF-IR na wysokim poziomie.
Opisany powyżej sposób diagnostyczny można zastosować do ustalenia, czy nowotwór wykazuje ekspresję IGF-IR na wysokim poziomie, co może być wskazaniem, czy nowotwór wykaże dobrą odpowiedź na leczenie za pomocą przeciwciała anty-IGF-IR. Sposób diagnostyczny można również zastosować do ustalenia, czy nowotwór jest potencjalnie złośliwy, jeśli wykazuje ekspresję IGF-IR na wysokim poziomie, lub łagodny, jeśli wykazuje ekspresję IGF-IR na niskim poziomie. Ponadto, ten
PL 217 921 B1 sposób diagnostyczny można również zastosować do ustalenia, czy leczenie za pomocą przeciwciała anty-IGF-IR (zobacz poniżej) sprawia, że nowotwór wykazuje ekspresję IGF-IR na niższym poziomie i/lub wykazuje niższy poziom autofosforylacji tyrozyny, a zatem można zastosować do ustalenia, czy leczenie jest skuteczne. Ogólnie, sposób ustalenia, czy przeciwciało anty-IGF-IR obniża fosforylację tyrozyny, obejmuje etapy pomiaru poziomu fosforylacji tyrozyny w komórce lub tkance będącej przedmiotem zainteresowania, inkubacji komórki lub tkanki z przeciwciałem anty-IGF-IR lub jego częścią wiążącą antygen, następnie ponownego pomiaru poziomu fosforylacji tyrozyny w komórce lub tkance. Można mierzyć fosforylację IGF-IR lub innego białka(ek). Ten sposób diagnostyczny można również zastosować do ustalenia, czy tkanka lub komórka nie wykazuje ekspresji IGF-IR na dostatecznie wysokim poziomie, co może mieć miejsce u osób dotkniętych karłowatością, osteoporozą lub cukrzycą. Diagnoza, że poziom IGF-IR lub aktywnego IGF-IR są zbyt niskie, mogłaby zostać użyta w leczeniu za pomocą aktywujących przeciwciał anty-IGF-IR, IGF-I lub innych czynników leczniczych, służących zwiększeniu poziomu lub aktywności IGF-IR.
Przeciwciał według niniejszego wynalazku można również użyć in vivo do lokalizacji tkanek i narządów, które wykazują ekspresję IGF-IR. W korzystnym wykonaniu przeciwciała anty-IGF-IR można zastosować do zlokalizowania nowotworów wykazujących ekspresję IGF-IR. Zaletą przeciwciał antyIGF-IR według niniejszego wynalazku jest to, że przy podaniu nie wywołują odpowiedzi immunologicznej. Ten sposób obejmuje etapy podawania przeciwciała anty-IGF-IR lub jego kompozycji farmaceutycznej pacjentowi, który wykazuje potrzebę takiego testu diagnostycznego i poddawania pacjenta badaniu obrazowemu, określającemu położenie tkanek wykazujących ekspresję IGF-IR. Badania obrazowe są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, bez ograniczania, badania rentgenowskie, obrazowanie przy zastosowaniu rezonansu magnetycznego (MRI) lub tomografię komputerową (CE). W innym wykonaniu tego sposobu, od pacjenta pozyskuje się biopsję, by ustalić, czy tkanka będąca przedmiotem zainteresowania wykazuje ekspresję IGF-IR, zamiast poddawania pacjenta badaniu obrazowemu. W korzystnym wykonaniu przeciwciała anty-IGF-IR można znakować za pomocą wykrywalnego czynnika, który można zobrazować u pacjenta. Na przykład przeciwciało można znakować czynnikiem kontrastowym, takim jak bar, który można zastosować w badaniu rentgenowskim lub magnetycznym czynnikiem kontrastowym, takim jak gadolin, który można zastosować w badaniu MRI lub CE. Do innych czynników znakujących należą, bez ograniczania, radioizotopy, takie jak 99Tc. W innym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR pozostanie nie wyznakowane i zostanie zobrazowane przez podanie drugiego przeciwciała lub innej cząsteczki, która jest wykrywalna i która może wiązać przeciwciało anty-IGF-IR.
Terapeutyczne sposoby stosowania
W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu hamowania aktywności IGF-IR przez podawanie przeciwciała anty-IGF-IR pacjentowi tego potrzebującemu. Każdy z opisanych tutaj typów przeciwciał można zastosować terapeutycznie. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR jest przeciwciałem ludzkim, chimerowym lub humanizowanym. W innym korzystnym wykonaniu, IGF-IR jest ludzki, a pacjentem jest człowiek. Alternatywnie pacjentem może być ssak, który wykazuje ekspresję takiego IGF-IR, z którym przeciwciało anty-IGF-IR reaguje krzyżowo. Przeciwciało może być podawane ssakowi, innemu niż człowiek, który wykazuje ekspresję IGF-IR, z którym przeciwciało anty-IGF-IR reaguje krzyżowo (tj. małpie naczelnej, makakowi z gatunku Macaca fascicularis lub rezusowi), dla celów weterynaryjnych lub w zwierzęcym modelu ludzkiej choroby. Takie modele zwierzęce mogą być przydatne dla oceny skuteczności terapeutycznej przeciwciał według tego wynalazku.
Stosowany tu termin „zaburzenie, w którym aktywność IGF-IR jest szkodliwa” ma obejmować choroby i inne zaburzenia, w których wykazano lub podejrzewa się, że obecność wysokich poziomu IGF-IR u pacjenta, cierpiącego na dane schorzenie, jest odpowiedzialna za patofizjologię zaburzenia albo jest czynnikiem przyczyniającym się do zaostrzenia zaburzenia. A zatem, zaburzenie, w którym aktywność IGF-IR jest szkodliwa, jest zaburzeniem, dla którego można oczekiwać, że hamowanie aktywności IGF-IR złagodzi objawy i/lub postęp zaburzenia. Takie zaburzenia mogą się objawiać, na przykład, podwyższeniem poziomu IGF-IR na powierzchni komórki lub podwyższoną autofosforylacją tyrozyny IGF-IR w zaatakowanych komórkach lub tkankach pacjenta cierpiącego na dane zaburzenie. Podwyższenie poziomu IGF-IR można wykryć, na przykład, stosując przeciwciało anty-IGF-IR jak opisano powyżej.
W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który ma nowotwór wykazujący ekspresję IGF-IR. Nowotwór może być guzem litym lub guzem nie litym, takim jak chłoniak. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjen40
PL 217 921 B1 towi, który ma nowotwór wykazujący ekspresję IGF-IR, który jest złośliwy. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który ma nowotwór płuc, sutka, prostaty lub okrężnicy. W wysoce korzystnym wykonaniu sposób sprawia, że nowotwór nie zwiększa wagi lub objętości lub zmniejsza wagę bądź objętość. W innym wykonaniu, ten sposób sprawia, że IGF-IR na powierzchni nowotworu ulega internalizacji. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1, lub zawiera ono łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub jego region wiążący antygen.
W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który wykazuje ekspresję niewłaściwie wysokiego poziomu IGF-I. Wiadomo w tej dziedzinie, że wysoki poziom ekspresji IGF-I może prowadzić do rozmaitych powszechnie spotykanych nowotworów. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi z rakiem prostaty, glejakiem lub włókniakomięsakiem. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu sposób sprawia, że rak zaprzestaje anormalnej proliferacji, albo nie zwiększa wagi lub objętości lub zmniejsza wagę bądź objętość. W jednym z wykonań, ten sposób odnosi się do leczenia raka, takiego jak rak mózgu, płaskokomórkowy, pęcherza, żołądka, trzustki, sutka, głowy, szyi, przełyku, prostaty, jelita grubego, płuca, nerki, jajnika, ginekologicznego lub tarczycy. Do pacjentów, których można leczyć za pomocą związków według wynalazku, zgodnie ze sposobami według tego wynalazku, zalicza się na przykład pacjentów, których zdiagnozowano jako mających raka płuca, raka kości, raka trzustki, raka skóry, raka głowy i szyi, czerniaka skóry lub wewnątrzgałkowego, raka macicy, raka jajnika, raka odbytu, raka odbytu, raka okolic odbytu, raka żołądka, raka okrężnicy, raka sutka, guzów ginekologicznych (np. mięsaki macicy, rak jajowodów, rak trzonu macicy, rak szyjki, rak pochwy lub rak sromu), chorobę Hodgkina, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka układu wydzielania wewnętrznego (np. rak tarczycy, przytarczyc lub nadnerczy), mięsaki tkanek miękkich, raka cewki moczowej, raka penisa, raka prostaty, białaczkę przewlekłą lub ostrą, guzy lite dziecięce, chłoniaki limfocytyczne, raka pęcherza, raka nerki lub moczowodu (np. rak komórek nerkowych, rak miedniczki nerkowej) lub nowotwór centralnego układu nerwowego (np. chłoniak pierwotny OUN, guzy kręgosłupa, glejaki pnia mózgu lub gruczolaki przysadki).
Przeciwciało może zostać podane raz, ale bardziej korzystne jest podawanie go wiele razy. Przeciwciało można podawać od trzech razy dziennie do jednej dawki co sześć miesięcy. Podawanie może być w trybie takim jak trzy razy dziennie, dwa razy dziennie, raz dziennie, raz na dwa dni, raz na trzy dni, raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na miesiąc, raz na dwa miesiące, raz na trzy miesiące i raz na sześć miesięcy. Przeciwciało można podawać drogą doustną, przez błonę śluzową, podjęzykową, donosową, wziewną, dożylną, podskórną, domięśniową, pozajelitową, do wnętrza guza lub domiejscowo. Przeciwciało można podawać w miejscu odległym od lokalizacji nowotworu. Przeciwciało można również podawać w sposób ciągły za pomocą minipompy. Przeciwciało można podawać raz, przynajmniej dwa razy lub przynajmniej co dany okres czasu, aż choroba zostanie zaleczona, złagodzona lub wyleczona. Ogólnie, przeciwciało będzie podawane tak długo, jak długo obecny jest nowotwór, o ile przeciwciało sprawia, że guz lub rak przestaje rosnąć lub zmniejsza wagę lub objętość. Ogólnie, przeciwciało będzie podawane jako część kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej. Dawkowanie przeciwciała będzie ogólnie zawarte w zakresie 0,1-100 mg/kg, bardziej korzystnie 0,5-50 mg/kg, bardziej korzystnie 1-20 mg/kg, a jeszcze bardziej korzystnie 1-10 mg/kg. Stężenie przeciwciała w osoczu można zmierzyć za pomocą sposobu znanego w dziedzinie. Zobacz, np. Przykład XVII poniżej. Przeciwciało można również podawać profilaktycznie w celu zapobieżenia wystąpieniu raka lub nowotworu. Może to być szczególnie użyteczne u pacjentów, którzy mają „wysoki normalny” poziom IGF-I, gdyż wykazano, że ci pacjenci mają wyższe ryzyko zapadnięcia na typowe nowotwory. Patrz Rosen i wsp., jak wyżej.
W innym aspekcie przeciwciało anty-IGF-IR można podawać pacjentowi, który ma zaburzenie rozrostowe, takie jak rak lub nowotwór, jednocześnie z innymi czynnikami terapeutycznymi, takimi jak leki lub cząsteczki przeciwnowotworowe. W jednym z aspektów wynalazek odnosi się do sposobu leczenia zaburzenia związanego z hiperproliferacją u ssaka, obejmującego podawanie temu ssakowi skutecznej terapeutycznie ilości związku według wynalazku, w połączeniu z czynnikiem przeciwrakowym, wybranym z grupy składającej się między innymi z inhibitorów mitozy, czynników alkilujących, antymetabolitów, czynników interkalujących, inhibitorów czynników wzrostu, inhibitorów cyklu komórkowego, enzymów, inhibitorów topoizomerazy, modyfikatorów odpowiedzi biologicznej, anty-hormonów, inhibitorów kinaz, inhibitorów metaloproteinazy substancji międzykomórkowej, czynników terapii genowych i antyandrogenów. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało można podawać
PL 217 921 B1 razem z czynnikiem przeciwnowotworowym, takim jak adriamycyna lub taksol. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało lub terapia łączona są podawane równolegle z radioterapią, chemioterapią, terapią fotodynamiczną, interwencją chirurgiczną lub inną immunoterapią. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu przeciwciało będzie podawane wraz z innym przeciwciałem. Na przykład, przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane wraz z przeciwciałem lub innym czynnikiem, o którym wiadomo, że hamuje nowotwór lub proliferację komórek rakowych, np. przeciwciałem lub czynnikiem, który hamuje receptor erbB2, EGF-R, CD20 lub VEGF.
Jednoczesne podawanie przeciwciała z dodatkowym czynnikiem terapeutycznym (terapia łączona) obejmuje podawanie kompozycji farmaceutycznej, zawierającej przeciwciało anty-IGF-IR i dodatkowy czynnik terapeutyczny oraz podawanie dwóch lub większej liczby odrębnych kompozycji farmaceutycznych, jednej zawierającej przeciwciało anty-IGF-IR i innej (innych), zawierającej dodatkowy czynnik(i) terapeutyczny. Ponadto, choć jednoczesne podawanie lub terapia łączona oznacza ogólnie, że przeciwciało i dodatkowe czynniki terapeutyczne są podawane jednocześnie, to uwzględnia się również przypadki, w których przeciwciało i dodatkowe czynniki terapeutyczne są podawane w różnym czasie. Na przykład przeciwciało może być podawane raz na trzy dni, gdy dodatkowy czynnik terapeutyczny jest podawany raz dziennie. Alternatywnie, przeciwciało może być podawane przed lub po leczeniu zaburzenia za pomocą dodatkowego czynnika terapeutycznego. Podobnie, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR może być stosowane przed lub po innym leczeniu, takim jak radioterapia, chemioterapia, terapia fotodynamiczna, interwencja chirurgiczna lub inna immunoterapia.
Przeciwciało i jeden lub większą liczbę dodatkowych czynników terapeutycznych (terapia łączona) można podawać raz, przynajmniej dwa razy lub przynajmniej co dany okres czasu, aż choroba zostanie zaleczona, złagodzona lub wyleczona. Korzystne jest, gdy terapię łączoną podaje się wiele razy. Terapię łączoną można podawać od trzech razy dziennie do jednej dawki co sześć miesięcy. Podawanie może być w trybie takim jak trzy razy dziennie, dwa razy dziennie, raz dziennie, raz na dwa dni, raz na trzy dni, raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na miesiąc, raz na dwa miesiące, raz na trzy miesiące i raz na sześć miesięcy lub w sposób ciągły za pomocą minipompy. Terapię łączoną można podawać drogą doustną, przez błonę śluzową, podjęzykową, donosową, wziewną, dożylną, podskórną, domięśniową, pozajelitową, do wnętrza guza lub miejscowo. Terapię łączoną można podawać w miejscu odległym od lokalizacji nowotworu. Ogólnie, terapia łączona będzie podawana tak długo, jak długo obecny jest nowotwór, o ile terapia łączona sprawia, że nowotwór lub rak przestaje rosnąć lub zmniejsza wagę lub objętość.
W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR jest znakowane radioizotopowo, za pomocą immunotoksyny lub toksyny lub jest fuzją białkową, zawierającą peptyd toksyczny. Przeciwciało anty-IGF-IR lub fuzja białkowa przeciwciała anty-IGF-IR kieruje radioizotop, immunotoksynę, toksynę lub peptyd toksyczny do komórki nowotworowej lub rakowej, wykazującej ekspresję IGF-IR. W korzystnym wykonaniu radioizotop, immunotoksyna, toksyna lub peptyd toksyczny ulega internalizacji po związaniu przeciwciała anty-IGF-IR z IGF-IR na powierzchni komórki nowotworowej lub rakowej.
W innym aspekcie przeciwciało anty-IGF-IR można użyć terapeutycznie do wywołania apoptozy w odpowiednich komórkach u pacjenta tego potrzebującego. W wielu przypadkach komórki, w których ma zajść apoptoza, są komórkami rakowymi lub nowotworowymi. Zatem, w korzystnym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu wywoływania apoptozy przez podawanie skutecznej terapeutycznie ilości przeciwciała anty-IGF-IR pacjentowi tego potrzebującemu. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14,3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki Iub jego region wiążący antygen.
W innym aspekcie przeciwciało a nty-IGF-IR można użyć do leczenia stanów nienowotworowych, w których wysokie poziomy IGF-I i/lub IGF-IR są związane ze stanem lub chorobą nienowotworową. W jednym z wykonań sposób obejmuje etap podawania przeciwciała anty-IGF-IR pacjentowi, który ma nienowotworowy stan patologiczny, wywołany lub zaostrzony przez wysoki poziom lub aktywność IGF-I i/lub IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, nienowotworowym stanem patologicznym jest akromegalia, gigantyzm, łuszczyca, miażdżyca tętnic, restoenoza mięśni gładkich naczyń krwionośnych lub nieodpowiednia proliferacja naczyń włosowatych, taka jak wykrywana jako powikłanie cukrzycy, szczególnie w oku. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało a nty-IGF-IR spowalnia postęp nienowotworowego stanu patologicznego. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało a nty-IGF-IR zatrzymuje lub odwraca, przynajmniej częściowo, nienowotworowy stan patologiczny.
PL 217 921 B1
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu podawania przeciwciała aktywującego antyIGF-IR pacjentowi tego potrzebującemu. W jednym z wykonań przeciwciało aktywujące albo kompozycję farmaceutyczną podaje się pacjentowi tego potrzebującemu w ilości skutecznej dla podniesienia aktywności IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało aktywujące jest zdolne do przywrócenia normalnej aktywności IGF-IR. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało aktywujące może być podawane pacjentowi, który ma niski wzrost, neuropatię, obniżenie masy mięśniowej lub osteoporozę. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało aktywujące może być podawane razem z jednym lub większą liczbą innych czynników, które podnoszą proliferację komórek, zapobiegają apoptozie lub podnoszą aktywność IGF-IR. Do takich czynników należą czynniki wzrostu, takie jak IGF-I i/lub analogi IGF-I, które aktywują IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 4.17.3 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen.
Terapia genowa
Cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku można podawać pacjentowi tego potrzebującemu za pośrednictwem terapii genowej. Terapia może być albo typu in vivo albo ex vivo. W korzystnym wykonaniu, cząsteczki kwasu nukleinowego, kodujące zarówno łańcuch ciężki, jak i łańcuch lekki są podawane pacjentowi. W bardziej korzystnym wykonaniu podawane są takie cząsteczki kwasu nukleinowego, które ulegają trwałej integracji do dichromosomu komórek B, ponieważ te komórki są wyspecjalizowane w produkcji przeciwciał. W korzystnym wykonaniu, prekursorowe komórki B poddaje się transfekcji lub infekcji ex vivo i przeszczepia spowrotem pacjentowi tego potrzebującemu. W innym wykonaniu, prekursorowe komórki B lub inne komórki są poddawane infekcji in vivo z użyciem wirusa, o którym wiadomo, że zakaża typ komórek będący przedmiotem zainteresowania. Do typowych wektorów używanych w terapii genowej należą liposomy, plazmidy lub wektory wirusowe, takie jak retrowirusy, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom. Po infekcji in vivo albo ex vivo, poziom ekspresji przeciwciał można monitorować pobierając próbkę od leczonego pacjenta i stosując test immunologiczny znany w tej dziedzinie i dyskutowany tutaj.
W korzystnym wykonaniu, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania skutecznej ilości wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego , kodującej łańcuch ciężki lub łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. W innym wykonaniu, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania skutecznej ilości wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części oraz ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. W bardziej korzystnym sposobie, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania skutecznej ilości wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części oraz ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego oraz skutecznej ilości izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części oraz ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego. Sposób terapii genowej może również obejmować etap podawania innego czynnika antyrakowego, takiego jak taksol, tamoksifen, 5-FU, adriamycyna lub CP-358,774.
Aby wynalazek ten mógł zostać lepiej zrozumiany, podaje się następujące przykłady. Te przykłady służą jedynie celom ilustracji i nie można ich traktować jako ograniczających w jakikolwiek sposób zakres wynalazku.
P r z y k ł a d I: Otrzymywanie hybrydom wytwarzających przeciwciała anty-IGF-IR
Przeciwciała będące przedmiotem wynalazku otrzymano, wyselekcjonowano i testowano jak następuje:
Immunizacja i otrzymywanie hybrydom
Immunizowano myszy XENOMICE™ w wieku ośmiu do dziesięciu tygodni przez dootrzewnowe podanie lub do poduszek tylnych łap zarówno zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego IGF-IR (10 μg/dawka/mysz) lub komórek 3T3-IGF-IR lub 300.19-IGF-IR, które to są dwiema liniami transfekowanych komórek z ekspresją ludzkiego IGF-IR na powierzchni błony komórkowej (10 x 106) komórek/dawka/mysz). Dawka taka była ponownie podawana pięć do siedmiu razy przez trzy do ośmiu tygodni. Cztery dni przed fuzją myszy otrzymywały ostateczny zastrzyk z preparatu zewnątrzko mórkowej domeny ludzkiego IGF-IR w PBS. Węzłowe limfocyty ze śledziony i limfy immunizowanych myszy poddawano fuzji z nie wydzielającą linią komórkową szpiczaka P3X63-Ag9.653 i poddano selekcji typu HAT tak jak zostało to wcześniej opisane (Galfre i Milstein, Methods Enzymol. 73:3 - 46, 1981). Uzyskano szereg hybrydom, wszystkie wydzielały ludzkie przeciwciała IgG2k specyficzne dla
PL 217 921 B1
IGF-IR. Siedem hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne swoiste wobec IGF-IR wybrano do dalszych badań i oznaczono 2.12.1, 2.13.2, 2.14.2, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1.
Hybrydomy 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 i 4.17.3 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassa, VA 20110-2209, 12 grudnia 2000 r. pod następującymi numerami depozytów:
Hybrydoma Nr depozytu
2.12.1 PTA-2792
2.13.2 PTA-2788
2.14.3 PTA-2790
3.1.1 PTA-2791
4.9.2 PTA-2789
4.17.3 PTA-2793
P r z y k ł a d II: Wyznaczenie stałych powinowactwa (Ka) dla całkowicie ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-IGF-IR przy zastosowaniu BIAcore
Wykonano pomiary powinowactwa oczyszczonych przeciwciał przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (ang. surface plasmon resonance) z wykorzystaniem urządzenia BIAcore 3000, zgodnie z zaleceniami producenta.
Protokół 1
Aby przeprowadzić analizy kinetyczne, umieruchamiano białko A na powierzchni mikromacierzy urządzenia BIAcore. Mikromacierz użyto następnie do wyłapywania przeciwciał anty-IGF-IR będących przedmiotem obecnego wynalazku. Na mikromacierz nałożono w różnych stężeniach preparaty zewnątrzkomórkowej domeny IGF-IR i analizowano kinetykę wiązania i dysocjacji dla oddziaływań pomiędzy przeciwciałami anty-IGF-IR a zewnątrzkomórkową domeną IGF-IR. Wyniki otrzymano po analizie danych metodą globalnego dopasowania Langmuir 1:1 z wykorzystaniem modeli dryfu wykresu bazowego dostępnych w oprogramowaniu BIAevaluation dostarczonego z BIAcore.
Protokół 2
Pomiary urządzeniem BIAcore wykonano dokładnie jak opisano przez Fagerstam i wsp., „Detection of antigen-antibody interaction by surface plasmon resonnance. Applications to epitope mapping.” J. Mol. Recog. 3: 208-214. (1990).
Tabela I przedstawia pomiary powinowactwa dla reprezentatywnych przeciwciał anty-IGF-IR według niniejszego wynalazku.
T a b e l a I
Przeciwciało monoklonalne Kd (M) Protokół 1 Kd (M) Protokół 2
2.12.1 7,37 x 109
2.13.2 3,5 x 10'9 1,53 x 109
2.14.3 6,41 x 10'10
3.1.1 1,15 x 10-9
4.9.2 6,84 x 10 4,27 x 10'10
4.17.3 1,3 x 10 8
6.1.1 5,65 x 10
Analizy kinetyczne wskazują, że przeciwciała otrzymane zgodnie z wynalazkiem posiadają wysokie powinowactwa i duże stałe wiązania do zewnątrzkomórkowej domeny IGF-IR.
P r z y k ł a d III: Hamowanie za pośrednictwem przeciwciał fosforylacji IGF-IR indukowanej przez IGF-I
PL 217 921 B1
Wykonano doświadczenia z testami ELISA w celu określenia, czy przeciwciała według wynalazku są zdolne blokować aktywację IGF-IR wywoływaną przez IGF-I, Aktywacja IGF-IR wywoływana przez IGF-I była wykrywana przez zwiększenie związanej z receptorem fosforylacji tyrozyny.
Przygotowanie płytek ELISA
Przygotowano wiążące płytki ELISA przez dodanie 100 μl buforu blokującego (3% albumina surowicy wołowej [BSA] w soli fizjologicznej buforowanej Tris [TBS]) do każdej studzienki 96-studzienkowych płytek ReactBind pokrytych białkiem G (Pierce) i inkubację płytek z wytrząsaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczono królicze, wielospecyficzne przeciwciała anty-IGF-IR (Santa Cruz) w buforze blokującym w stężeniu 5 μq/ml i do każdej studzienki dodano 100 μl rozcieńczonych przeciwciał. Inkubowano płytki z wytrząsaniem przez 60-90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukano płytki pięciokrotnie buforem do płukania (TBS + 0,1% Tween 20) i delikatnie odciśnięto pozostały bufor na papierowych ręcznikach. Przed dodaniem lizatu nie pozwolono płytkom wyschnąć.
Przygotowanie lizatów z komórek z ekspresją IGF-I
Komórki NIH-3T3 umieszczono w 100 μl (5x104/ml) pożywki hodowlanej na 96-studzienkowej płytce o „U” kształtnym dnie (pożywka DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełniona L-glutaminą (0,29 mg/ml), 10% FBS inaktywowaną termicznie oraz genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 μg/ml). Płytki inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc, tak aby komórki mogły się przyczepić. Zlano pożywkę z płytek i wymieniono ją na świeżą pożywkę po 100 μl na studzienkę. Do testowania rozcieńczono potencjalne przeciwciała anty-IGF-IR w pożywce, pięciokrotnie w stosunku do pożądanego, końcowego stężenia i dodano po 25 μl do studzienek. Wszystkie próby były powtarzane trzykrotnie. Następnie inkubowano płytki w 37°C przez 1 h. Komórki stymulowano IGF-1 w stężeniu 600 ng/ml (przygotowanym w pożywce hodowlanej) dodając po 25 μl na studzienkę i inkubowano płytki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie zlano pożywkę przez odwrócenie płytek i delikatnie odciśnięto na ręcznikach papierowych i lizowano przyczepione komórki przez dodanie 50 μl buforu lizującego (50 mM HEPES pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCls 1/6 mM NaV04, 1% Triton X-100, 1% glicerol, uzupełnionego tuż przed użyciem tabletką/50 ml proteazy wolnej od EDTA [Roche Molecular Sciences]) i wytrząsano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodano po 200 μl buforu do rozcieńczania (50 mM HEPES pH 7,4, 1,6 mM NaVO4) do każdej ze studzienek, zmieszano przez delikatne pipetowanie. Przeniesiono 100 μl lizatów z każdej ze studzienek do studzienek płytek ELISA przygotowanych tak jak opisano powyżej i inkubowano przy delikatnym wytrząsaniu w temperaturze pokojowej.
Test ELISA z przeciwciałami anty-tyrozynofosforan (pTYR)
Usunięto lizaty komórkowe przez odwrócenie płytek, płukano płytki pięciokrotnie buforem do płukania i odciśnięto na ręcznikach papierowych. Dodano po 100 μl na studzienkę przeciwciał swoistych wobec pTYR (HRP-PY54) rozcieńczonych w buforze do blokowania w stężeniu 0,2 pg/ml i inkubowano płytki z wytrząsaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płukano płytki pięciokrotnie buforem do płukania i odciśnięto na ręcznikach papierowych.
Wiązanie się przeciwciał HRP-PY54 wykrywano przez dodanie roztworu TBM substratu peroksydazy (Kirkegaard & Perry) po 100 μl na studzienkę i inkubowano do wytworzenia się koloru (w przybliżeniu 2-10 minut). Reakcję barwną zatrzymano przez dodanie 100 μl na studzienkę roztworu zatrzymującego reakcję TBM (Kirkegaard & Perry). Następnie wytrząsano płytki przez 10 sekund w temperaturze pokojowej tak, aby wymieszać roztwór i dokonano pomiarów przy OD450nm.
Tab. II i Fig 4. pokazują wyniki tego eksperymentu wykonanego dla kilku przeciwciał według wynalazku. Wyniki tego eksperymentu wykazują zdolność przeciwciał według tego wynalazku do blokowania aktywacji IGF-IR wywoływanej przez IGF-IR, wykrywanej przez zwiększenie związanej z receptorem fosforylacji tyrozyny. Następnie wyniki te mogą być wykorzystane do obliczania potencjalnej wartości przeciwciał według tego wynalazku.
T a b e l a II
Przeciwciało IC50
monoklonalne (μ/ml)
2.12.1 0,172
2.13.2 0,0812
2.14.3 0,325
4.9.2 0,0324
PL 217 921 B1
P r z y k ł a d IV: Blokowanie przeciwciałami wiązania IGF-I/IGF-IR
Wykonano eksperymenty ELISA, aby określić ilościowo zdolność przeciwciał według wynalazku do hamowania wiązania IGF-I do IGF-IR w testach komórkowych. Komórki NIH-3T3 transfekowane IGF-IR umieszczono w 100 μl (5 x 104/ml) pożywki hodowlanej na 96-studzienkowej płytce o „U kształtnym dnie (pożywka DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełniona L-glutaminą (0,29 mg/ml), 10% FBS inaktywowaną termicznie oraz genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 pg/ml). Płytki inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc tak aby komórki mogły się przyczepić. Zlano pożywkę z płytek i wymieniono ją na świeżą pożywkę po 100 μl na studzienkę. Do testowania rozcieńczono przeciwciała w pożywce do testów (pożywka DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełniona L-glutaminą, 10% FBS inaktywowaną termicznie, 200 μg/ml BSA i genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 μg/ml) do pożądanego, końcowego stężenia i dodano po 50 μl do studzienek. Wszystkie próby były powtarzane trzykrotnie. Następnie inkubowano płytki
125 w 37°C przez 10 minut. Rozcieńczono [ I]-IGF-I do stężenia 1 μC/ml w pożywce do testów i dodano po 50 μl do studzienek. Jako kontrolę radioaktywności tła dodano zimnego IGF-I w stężeniu końcowym 100 ng/ml. Inkubowano płytki w 37°C przez 10 minut, zlano pożywkę przez delikatne odciśnięcie na ręcznikach papierowych i płukano dwukrotnie pożywką do testów. Lizowano komórki przez dodanie 50 μl buforu 0,1 M NaOH, 0,1% SDS i wytrząsano płytki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przeniesiono próbki na płytkę scyntylacyjną, dodano 150 μl OptiPhase Supermix i odczytano sygnał przy pomocy licznika Wallac Micro-Beta.
Tab. III i Fig. 3 przedstawiają wyniki tego eksperymentu wykonanego dla trzech reprezentatywnych przeciwciał według wynalazku. Eksperyment wykazał, że przeciwciała według wynalazku specyficznie hamują wiązanie się [125I]-IGF-I do komórek z ekspresją IGF-IR
T a b e l a III
Przeciwciało monoklonalne IC50
2.12.1 0,45 μg/ml
2.13.2 0,18 pg/ml
4.9.2 0,1 pg/ml
P r z y k ł a d V: Badania mapowania epitopu
Wiedząc już, że przeciwciała według wynalazku rozpoznają IGF-IR wykonano badania mapowania epitopu dla kilku przeciwciał według wynalazku. Skupiono się w tych eksperymentach na przeciwciałach 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2.
Wykonano badania współzawodnictwa z wykorzystaniem BIAcore, aby wyznaczyć czy przeciwciała według tego wynalazku wiążą się do tego samego lub do różnych miejsc na cząsteczce IGF-IR. Związano zewnątrzkomórkową domenę (ECD) z IGF-IR na mikromacierzy BIAcore, tak jak opisano w Przykładzie II. Związano pierwsze przeciwciało wynalazku ze związanym na mikromacierzy IGF-IR w warunkach saturacji. Zmierzono zdolność następnych drugorzędowych przeciwciał według wynalazku do konkurowania z pierwszorzędnym przeciwciałem o wiązanie do IGF-IR. Technika ta pozwala przypisać przeciwciała według wynalazku do różnych grup wiązania.
Wykonano ten eksperyment z przeciwciałami 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2. Zauważono, że przeciwciała 2.13.2 i 4.9.2 konkurują o to samo miejsce na zewnątrzkomórkowej domenie IGF-IR. Pozostałe przeciwciała, 3.12.1 i 2.14.3 wiążą się do różnych miejsc na IGF-IR, innych niż miejsce wiązania 2.13.2 i 4.9.2.
P r z y k ł a d VI: Reaktywność międzygatunkowa przeciwciał według wynalazku
Wykonano kilka doświadczeń w celu wyznaczenia reaktywności międzygatunkowej przeciwciał według wynalazku, w tym immunoprecypitację, blokowanie przeciwciałami fosforylacji IGF-IR indukowanej IGF-I i analizę FACS.
W celu wykonania doświadczeń z immunoprecypitacją hodowano komórki na szalkach z pożywką DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełnioną L-glutaminą (0,29 mg/ml), 10% FBS inaktywowanym cieplnie i genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 μg/ml, w butelkach T25 do czasu osiągnięcia 50% konfluencji. Następnie dodawano 100 μl przeciwciał według wynalazku w buforowanym roztworze Hank'a soli fizjologicznej (HBSS; Gibco BRL) w stężeniu 1 μg/ml. Inkubowano płytki przez 30 minut w 37°C w inkubatorze i stymulowano komórki przy pomocy
PL 217 921 B1
IGF-I w stężeniu 100 ng/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki lizowano w buforze
RIPA (Harlow i Lane, jak wyżej) i immunoprecypitowano IGF-IR przy pomocy 2 μg wielospecyficznych przeciwciał anty-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz) z dodatkiem kulek agarozy z białkiem A przez 1 godzinę w 4°C. Kulki rozłożono na płytkach i płukano trzykrotnie PBS/T (PBS + 0,1% Tween-20) i zagotowano kulki w 40 μΐ buforu Laemmliego zawierającego 5% βΜΕ.
Próbki przygotowane tak, jak opisano powyżej były następnie poddane analizie typu Western. Naniesiono po 12 μΐ próbek do studzienek 4-10% gradientowych żeli Novex™, elektroforeza była prowadzona w buforze 1X MES (Novex™). Żele rozwijano przy 150 V przez 1 godzinę lub przy 200 V przez około 30 minut. Materiał z rozwiniętych żeli przeniesiono na membranę w buforze do transferu Novex™ z 10% metanolem przez noc przy 100 mA lub przez 1-1,5 godziny przy 250 mA. Po kompletnym wyschnięciu membrany i zablokowaniu w temperaturze pokojowej przez TBS (sól fizjologiczna buforowana Tris pH 8,0) zawierającym Superblock (Pierce Chemical Co.). Dodano następnie przeciwciał dla IGF-IR, SC713 (Santa Cruz), żeby wykryć wytrącony immunologicznie IGF-IR.
Doświadczenie to wykonano dla przeciwciał według wynalazku, konkretnie dla 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 i 4.9.2, na komórkach z różnych zwierząt. Okazało się, że przeciwciała 2.12.1, 2.13.2 i 4.9.2 były zdolne do wiązania ludzkiego IGFI-R, ale nie zdolne do wiązania psich, świnki morskiej i króliczych IGF-IR. Następnie, przeciwciała te były zdolne do wiązania IGF-IR z komórek COS7 i rezusa, pochodzących od małp Starego Świata, ale nie IGF-IR marmozety będącej małpą z Nowego Świata. Eksperymenty te wykazują że, przeciwciała są wysoko specyficzne.
Blokowanie przeciwciałami wiązania IGF-I/IGF-IR u naczelnych innych niż człowiek
Po stwierdzeniu, że przeciwciała według wynalazku rozpoznają IGF-IR małp Starego Świata testowano także ich zdolność blokowania wiązania IGF-I/IGF-IR dla komórek pochodzących od tych małp Starego Świata. Komórki hodowano na szalkach z pożywką DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełnioną L-glutaminą, 10% FBS inaktywowaną termicznie i genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 μg/ml, w butelkach T25 do czasu osiągnięcia 50% konfIuencji. Następnie dodawano 100 μl przeciwciał według wynalazku lub pożywki bez przeciwciał jako kontrolę i stymulowano komórki przy pomocy IGF-I w stężeniu 100 ng/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po stymulacji komórki lizowano i immunoprecypitowano IGF-IR przy pomocy wielospecyficznych przeciwciał SC-713 anty-IGF-IR, tak jak opisano to powyżej. Następnie wykonano analizy typu Western tak jak opisano to powyżej, z wykorzystaniem przeciwciał HRP-PY54 tak, aby wykryć fosforylowaną tyrozynę w aktywowanym IGF-IR.
Zaobserwowano, że przeciwciała według wynalazku, w szczególności 2.13.2 i 4.9.2 mogą blokować indukowaną IGF-I fosforylację IGF-IR zarówno w komórkach COS7 jak i rezusa. Dla obserwowanego hamowania IC50 wynosiło 0,02 μg/ml i 0,005 μg/ml odpowiednio dla IGF-IR z komórek COS7 i rezusa. Wyznaczenie między-gatunkowego powinowactwa przeciwciał według wynalazku
Wykonano analizę FACS, aby wyznaczyć powinowactwo przeciwciał według wynalazku do
IGF-IR z innych zwierząt,w szczególności z małp Starego Świata opisanych powyżej. Inkubowano 5 równe ilości ludzkich i małpich komórek (5 x 105) przez 1 godzinę na lodzie przy rosnących stężeniach biotynylowanych przeciwciał anty-hemocjanina skałoczepa (KLH, Abgenix), użytych jako kontrola negatywna. Następnie inkubowano próbki przez 30 minut na lodzie z przeciwciałami RPE (fikoerytryna) połączonymi ze streptawidyną. Wiązanie mierzono przy pomocy cytometrii przepływowej i analizowano histogramy intensywności fIuorescencji (F12-H) względem ilości komórek (Counts) z wykorzystaniem oprogramowania CellQuest. Wyliczono wiązanie (Kd) dla każdego z przeciwciał z wykresów wartości intensywności fIuorescencji względem stężenia przeciwciał. W większości eksperymentów mierzono wiązanie dla hodowanych komórek ludzkich MCF-7 i komórek hodowli tkankowych rezeusa lub makaka z gatunku Macaca fascicularis. Kontrolowano obniżenie poziomu przeciwciał pomiarami wiązania przy różnych stężeniach komórek.
Wykonano wspomniane analizy FACS, aby sprawdzić zdolność przeciwciał według wynalazku, w szczególności 2.13.2 i 4.9.2 do wiązania komórek ludzkich, rezusa lub makaka z gatunku Macaca fascicularis. Zaobserwowano, że połowa maksymalnego wiązania (Kd) jest przy 0,1 μg/ml dla wszystkich badanych linii komórkowych.
P r z y k ł a d VII: Zmniejszenie działania receptora IGF-I
Wykonano eksperymenty z blokowaniem, tak jak dokładnie opisano powyżej w Przykładzie IV
125 do momentu dodania znakowanego [ I] IGF-I. W tym punkcie zagotowano komórki w 40 μl buforu Laemmliego zawierającego 50% me. Następnie analizowano próbki przez analizę typu Western, tak jak opisano powyżej w Przykładzie VI i filtry poddano działaniu zarówno wielospecyficznych przeciwPL 217 921 B1 ciał dla IGF-IR, SC713, aby wyznaczyć poziomy IGF-IR, jak i przeciwciał HRP-PY54 aby skontrolować poziomy fosforylowanych tyrozyn w aktywowanych IGF-IR.
Tak jak zaobserwowano poprzednio (Przykład III), zaobserwowano blokowanie indukowanej przez IGF-I fosforylacji IGF-IR zgodnie z traktowaniem komórek przeciwciałami wynalazku (Fig. 4). Następnie zaobserwowano, że po blokowaniu fosforylacji indukowanej IGF-I następuje zmniejszenie działania IGF-IR w tych komórkach. Patrz np. Fig. 4. Poziomy IGF-IR były maksymalnie obniżone po 16 godz. po stymulacji przez IGF-I w obecności przeciwciał według wynalazku.
P r z y k ł a d VIII: Wpływ przeciwciał według wynalazku na IGF-IR in vivo
Określono, czy wpływ przeciwciał według wynalazku na IGF-IR opisany w poprzednich przykładach będzie też miał miejsce in vivo. Indukowano powstawanie guzów u myszy pozbawionych grasicy według opublikowanych metod (V.A Pollack i wsp., „Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP358,774; Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice.” J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748 (1999). Pokrótce, wstrzyknięto komórki NIH-3T3 (5 x 106) transfekowane IGF-IR podskórnie 4 tygodniowym, pozbawionym grasicy (nu/nu) myszom z 0,2 ml prepa3 ratu Martigel. Następnie, gdy uformowały się guzy (m.in. około 400 mm3), nastrzyknięto myszy dootrzewnowo przeciwciałami według wynalazku.
Po 24 godzinach wycięto guzy, homogenizowano je i oznaczono poziom IGF-IR. Aby wyznaczyć poziomy IGF-IR rozcieńczono przeciwciała SC-713 w buforze do blokowania w końcowym stężeniu μg/ml i dodano po 100 μΐ do każdej studzienki płytki (Pierce) pokrytej kozim przeciw-króliczym Reacti-Bind (GAR). Inkubowano płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem, a następnie płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania. Następnie zważono próbki guzów przygotowane tak jak opisano powyżej i homogenizowano je w buforze do Iizy (1 ml/100 mg). Rozcieńczono 12,5 μΐ ekstraktu guzów buforem do Iizy do końcowej objętości 100 μl i dodano do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 1-2 godziny a następnie płukano pięciokrotnie buforem do płukania. Następnie do każdej ze studzienek dodano 100 μΐ przeciwciał HRP-PY54 lub biotynylowanych anty-IGF-IR w buforze blokującym i inkubowano w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 30 minut. Następnie płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania i wywoływano. Płytki znakowane HRP-PY54 wywoływano przez dodanie 100 μl substratu mikrostudzienek TBM na studzienkę i zatrzymywano reakcję barwną przez dodanie 100 μl 0,9 M H2SO4. Następnie zliczono sygnał przy OD450nm po wytrząsaniu przez 10 sekund. Sygnał był normalizowany w stosunku do całości białka. Płytki znakowane przeciwciałem antyIGF-IR wywoływano przez dodanie do każdej ze studzienek 100 μl przeciwciał streptoawidyna-HRP rozcieńczonych w buforze do blokowania i inkubację w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 30 minut, a następnie postępowano tak jak opisano dla HRP-PY54.
Zaobserwowano, że dootrzewnowy zastrzyk przeciwciał według tego wynalazku, w szczególności 2.13.2 i 4.9.2, wywoływał inhibicję aktywności IGF-IR, mierzoną jako spadek [zarówno fosfotyrozyny IGF-IR (ufosforylowany IGF-IR) jak i całości białka IGF-IR (Fig. 5), W dodatku, zaobserwowano także spadek fosfotyrozyny IGF-IR (ufosforyIowanego IGF-IR) (Fig. 6). Bez ograniczania się do żadnej innej teorii, obniżenie poziomów fosfotyrozyny IGF-IR może być wywołane obniżeniem poziomów białka IGF-IR in vivo po kuracji przeciwciałem lub może być wywoływane połączeniem obniżenia poziomów białka IGF-IR z obniżeniem fosforylacji tyrozyny na IGF-IR, co powodowane jest przez blokowanie aktywacji ligandem (np. IGF-I lub IGF-II). Następnie, inhibicja ta była zależna od dawki podawanych przeciwciał (Fig. 6). Dane te pokazują, że przeciwciała według wynalazku są zdolne do działania na IGF-IR in vivo w sposób analogiczny do tego co obserwowano in vitro.
P r z y k ł a d IX: Hamowanie wzrostu (TGI) komórek guza 3T3/IGF-IR
Sprawdzono, czy przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku będą działać hamująco na wzrost guza. Indukowano guzy w sposób opisany powyżej (Przykład VIII) i gdy rozwinęły się ufor3 mowane, widoczne guzy (m.in. 250 mm3, w ciągu 6-9 dni) myszy poddano kuracji pojedynczym zastrzykiem dootrzewnowym przeciwciał w dawce 0,20 ml. Rozmiar guza mierzono przyrządem Verniera, mierząc przez dwie średnice, co trzeci dzień i obliczano objętość z wykorzystaniem wzoru (długość x [szerokość] 2/2 wg metod ustalonych przez Geran i wsp., „Protocols for screening chemical agents and natural/products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3: 1-104.
Gdy wykonano tą analizę dla przeciwciał według wynalazku, okazało się, że pojedyncza kuracja przeciwciałem 2.13.2 sama hamuje wzrost guzów indukowanych komórkami NIH-3T3 transfekowany48
PL 217 921 B1 mi IGF-IR (Fig. 7, część lewa). Następnie, w badaniach terapii łączonych, gdzie podawano pojedynczą dawkę adriamycyny, zaobserwowano że podanie pojedynczej dawki 2.13.2 wzmacnia efektywność adriamycyny, znanego inhibitora wzrostu nowotworów. Połączenie adriamycyny z przeciwciałem według wynalazku 2.13.2 wykazuje opóźnienie wzrostu o 7 dni w stosunku do leczenia samym przeciwciałem lub samą adriamycyną (Fig. 7, część prawa).
P r z y k ł a d X: Powiązanie pomiędzy poziomami przeciwciał a obniżeniem IGF-IR
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie VIII. Myszy były następnie traktowane 125 μg 2.13.2 podawanym przez wlew dootrzewnowy, tak jak opisano w Przykładzie VIII. Guzy wycinano i mierzono poziomy IGF-IR w teście ELISA, tak jak opisano w Przykładzie VIII. Fig. 8 pokazuje poziomy przeciwciał 2.13.2 w surowicy i poziomy receptora IGF-IR w czasie. Doświadczenie wykazało, że przeciwciało obniża poziom IGF-IR i że stopień inhibicji IGF-IR jest proporcjonalny w stosunku do dawki, mierzonej jako stężenia przeciwciał w surowicy.
P r z y k ł a d XI: Hamowanie wzrostu guzów 3T3/IGF-IR różnymi dawkami przeciwciał w połączeniu z adriamycyną
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie IX. Myszom, u których wytwo3 rzyły się podskórne guzy o wielkości około 250 mm3 podawano w dniach 1, 8, 15 i 22 różne ilości przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub 7,5 mg/kg adriamycyny (i.v.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie IX. Fig. 9 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co siedem dni hamuje wzrost komórek guza i rozszerza hamowanie wzrostu komórek w połączeniu z adriamycyną, znanym inhibitorem guzów.
P r z y k ł a d XII: Hamowanie wzrostu dużych guzów
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie IX. Myszom, u których wytwo3 rzyły się duże podskórne guzy o wielkości około 2000 mm3 podawano w dniach 1 i 8 różne ilości przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub 7,5 mg/kg adriamycyny (i.v.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie IX. Fig. 10 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Dla grup kontrolnych, gdzie podawano samo przeciwciało lub samą adriamycynę, doświadczenie kończono 5 dnia, 3 gdy guzy przekraczały wielkość 2000 mm3. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem antyIGF-IR podawanym w połączeniu z adriamycyną jest wysoce skuteczne w leczeniu dużych guzów, przy podawaniu różnych dawek.
P r z y k ł a d XIII: Hamowanie wzrostu komórek gruczolakoraka okrężnicy i odbytu
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie IX, z wyjątkiem tego, że użyto komórek Colo 205 (ATCC CCL 222). Komórki Colo 205 są ludzkimi komórkami gruczolakoraka okrężnicy i odbytu. Myszom, u których wytworzyły się podskórne guzy o wielkości około 250 podawano różne ilości przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub 100 mg/kg 5-fIuorodeoksyurydyny (5-FU, i.v.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie IX. Fig. 11 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podanym jednokrotnie hamuje wzrost ludzkich komórek gruczolakoraka okrężnicy i odbytu i wzmacnia efektywność 5-FU, znanego inhibitora guzów.
Myszom, u których wytworzyły się guzy Colo 205 podawano w dniach 1, 8, 15 i 22 po 500 μg przeciwciała 2.13.2 (i.p.), 100 mg/kg adriamycyny (i.v.) lub ich kombinacje. Fig. 12 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co siedem dni hamuje wzrost ludzkich komórek raka okrężnicy i odbytu oraz wzmacnia efektywność 5-FU.
P r z y k ł a d XIV: Hamowanie wzrostu guzów pochodzących od komórek raka piersi
Nagim myszom, tak jak opisano w Przykładzie VIII, implantowano biodegradowalną pastylkę estrogenu (0,72 mg 17-β-estradiolu/pastylkę, dawka uwalniana przez 60 dni; Innovative Research of America). Po 48 godzinach indukowano guzy u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie IX, poza tym, że wykorzystano komórki MCF-7 (ATCC HTB-22). Myszom, u których wytworzyły się podskórne 3 guzy o wielkości około 250 mm podawano po 50 μg przeciwciała 2.13.2 (i.p.) w dniach 1,4, 10, 13, 16, 19 i 22 (q3dx7) lub 6,25 mg/kg taksolu (i.v.) w dniach 1, 2, 3, 4, 5 (qldx5), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie IX. Fig. 13 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co trzeci dzień, hamuje wzrost ludzkich komórek raka sutka, a także, gdy stosowane w połączeniu, rozszerza efektywność taksolu, znanego inhibitora raka piersi.
PL 217 921 B1
Myszom, u których wytworzyły się guzy MCF-7, tak jak to opisano tuż powyżej, podawano w dniu 1 różne ilości samego przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub z 3,75 mg/kg adriamycyny (i.v.), tak jak opisano w Przykładzie IX. Fig. 14 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym pojedynczo, samo hamuje wzrost ludzkich komórek raka sutka i gdy stosowane w połączeniu, rozszerza efektywność adriamycyny, znanego inhibitora nowotworów.
Myszom, u których wytworzyły się guzy MCF-7, tak jak to opisano tuż powyżej podawano w dniach 1, 8, 15 i 23 po 250 pg samego przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub biodegradowalną pastylkę tamoksifenu (25 mg/pastylkę, wolna zasada, dawka uwalniana przez 60 dni; Innovative Research of America), osobno lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie IX. Fig. 15 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co siedem dni hamuje wzrost ludzkich komórek raka sutka, a także, gdy stosowane w połączeniu, rozszerza efektywność tamoksifenu, znanego inhibitora nowotworów.
P r z y k ł a d XVI: Hamowanie wzrostu komórek guzów nowotworu skóry
Guzy indukowano u nagich myszy, tak jak opisano w Przykładzie IX, z wyjątkiem tego, że użyto komórek A431 (ATCC CRL 1555). Komórki A431 są ludzkimi komórkami nowotworu skóry z nadeks3 presją EGFR. Myszom, u których wytworzyły się podskórne guzy o wielkości około 250 mm3 podawano w dniach 1, 8, 15, 22 i 29 po 500 pg przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub podawano raz dziennie przez 27 dni 10 mg/kg CP-358,774 doustnie (p.o.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie IX. CP-358,774 jest opisane w patencie USA nr 5747498 i w Moyer i wsp., Cancer Research 57:4838-4848 (1997), W całości tutaj dołączonych jako odniesienie. Fig. 16 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR wzmacnia efektywność CP-358,774, znanego inhibitora kinazy tyrozynowej EGF-R, w hamowaniu wzrostu ludzkiego nowotworu skóry.
P r z y k ł a d XVII: Farmakokinetyka przeciwciał anty-IGF-IR in vivo
W celu oceny farmakokinetyki przeciwciał anty-IGF-IR podano dożylnie makakom z gatunku Macaca fascicularis 3, 30 lub 100 mg/kg przeciwciała 2.13.2 w buforze octanowym. Pobierano surowicę od małp w różnych punktach czasowych i oznaczono stężenie przeciwciał anty-IGF-IR w surowicy małp w okresie 10 tygodni. W celu określenia poziomów czynnego przeciwciała w surowicy, zewnątrzkomórkowa domena ludzkiego IGF-IR (IGF-I-sR, R&D Systems, nr katalogowy 391GR) została związana na powierzchni 96-studzienkowych płytek. Dodano surowice małp (rozcieńczone pomiędzy 1:100 a 1:15000) do płytek tak, aby każda z próbek była w liniowym zakresie krzywej standardowej i inkubowano w warunkach, w których każde z przeciwciał anty-IGF-IR związało się z IGF-I-sR. Po przepłukaniu płytek dodano znakowane przeciwciało przeciw ludzkiemu IgG i inkubowano płytki w warunkach, w których przeciwciało przeciw ludzkiej IgG mogło związać się z przeciwciałem antyIGF-IR. Płytki następnie płukano i rozwijano, a kontrolne krzywe standardowe i dopasowania regresji liniowej zostały użyte do obliczenia ilości przeciwciał anty-IGF-IR. Fig. 17 pokazuje stężenie 2.13.2 w surowicy w czasie. Doświadczenie pokazało, że czas półtrwania przeciwciała anty-IGF-IR wynosi od 4,6 do 7,7 dni, a dystrybucja względem objętości wynosi 44-105 ml/kg. Następnie, doświadczenie wykazało, że otrzymane wartości są u małp proporcjonalne do dawki, co wskazuje, że przeciwciało anty- IGF-IR wysyciło każde dostępne miejsce wiązania na IGF-IR w ciele nawet przy niższej dawce 3 mg/kg.
P r z y k ł a d XVIII: Terapia łączona przeciwciałem anty-IGF-IR i adriamycyną obniża działanie IGF-IR in vivo
Guzy indukowano u nagich myszy, tak jak opisano w Przykładzie IX. Myszom, u których wy3 tworzyły się podskórne guzy o wielkości około 400 mm3 podawano w pojedynczym zastrzyku 250 pg przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub podawano 7,5 mg/kg adriamycyny (i.v.), tak jak opisano w Przykładzie IX. Po 72 godz. od podania czynników, guzy były wycinane, tak jak opisano w przykładzie VIII i równe ilości ekstraktów guzowych poddano elektroforezie w żelach poliakryloamidowych w obecności SDS (SDS-PAGE) i analizie typu Western z wykorzystaniem przeciwciała antyIGF-IR SC-713 (Santa Cruz). Fig. 18 pokazuje ilość IGF-IR w komórkach guzów ze zwierząt kontrolnych (pierwsze trzy studzienki każdej części), u zwierząt leczonych samą adriamycyną (część środkowa) i u zwierząt leczonych przeciwciałem i adriamycyną (część niższa). Każda studzienka przedstawia równe ilości białka z pojedynczych guzów z pojedynczych myszy. Doświadczenie wykazało, że leczenie samą adriamycyną ma mały wpływ na poziomy IGF-IR, a leczenie samym przeciwciałem daje pewne obniżenie poziomów IGF-IR. Co zaskakujące, leczenie adriamycyną
PL 217 921 B1 i przeciwciałem razem pokazuje dramatyczne obniżenie poziomów IGF-IR, co pokazuje że adriamycyna i przeciwciało bardzo obniżają poziomy IGF-IR.
Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe zacytowane w tym opisie są tu włączone jako odniesienie, tak jak gdyby każda pojedyncza publikacja albo zgłoszenie patentowe było konkretnie i indywidualnie wskazane, aby być włączone jako odniesienie. Mimo, że niniejszy wynalazek został opisany szczegółowo jako ilustracja i przykład dla celów jasności i zrozumienia, będzie łatwo dostrzeżone przez specjalistę w tej dziedzinie w świetle nauk z tego wynalazku, że można dokonać pewnych zmian i modyfikacji nie odbiegając od ducha i zakresu dołączonych zastrzeżeń.
PL 217 921 B1
Lista sekwencji
Lista sekwencji <110» ABGENIX, INC.
PFIZER, INC.
«120» Przeciwciała przeciw receptorowi podobnego do insuliny czynnika wzrostu «130» ΑΒΧ-ΡΡ2 <140» «141» <150» 60/259,927 «151» 2001-01-05 <160» 60 <170» Patentln wer. 2.1 «210» 1 «211» 291 «212» DNA «213» Homo sapiens «400» 1 tgcatctgta tttaggctgg ccgtttacaa tctcacaatc taafcfcatcct ggagacagag tatcagcaga agtggggtce agcagcctgc cggacgttcg fecaccttcac aaccagggaa catcaaggtt agcctgaaga gccaagggac ttgccgggca agctcctaag cagcggcagfc ttttgcaact cgaggtggaa agtcaggaca cgcctgatct ggatctggga tattactgtc atcatacgaa ttagacgtga atgctgcatc cagaattcac tacagcataa c
120
180
240
291 «210» 2 «211» 136 «212» PRT «213» Homo sapiens <400> 2
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp
1 5 10 15
Ile Arg Arg Asp 20 Leu Gly Trp Tyr Gin 25 Gin lys Pro Giy Lys 30 Ala Pro
Łys Arg Leu 35 Ile Tyr Ala Ala Ser 40 Arg Leu Gin Ser Gly 45 Val Pro Ser
Arg Phe 50 Ser Gly Ser Gly Ser 55 Gly Thr Glu Phe Thr 60 Leu Thr Ile Ser
65 Leu Gin Pro Glu Asp 70 Phe Ala Thr Tyr Tyr 75 Cys Leu Gin His Asn 30
Asn Tyr Pro Arg Thr 85 Phe Gly Gin Gly Thr 90 Glu Val Glu Ile Ile 95 Arg
Thr Val Ala 1 «L 100 Pro Ser Val Phe Ile 105 Phe Pro Pro Ser Asp 110 Glu Gin
PL 217 921 B1
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 <210> 3 <211> 352 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gggaggcttg gtcaagcctg gaggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattoact S0 ttcagtgact actatatgag etggatccgc caggctccag ggaaggggct ggaatgggtt 120 teatacatta gtagtagtgg tagtaccaga gactacgcag actctgtgaa gggccgattc 180 aocatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 240 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga gatggagtgg aaactacttt ttaotactac 300 taotacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggfcca ccgtctcctc ag 352 <21O> 4 <211> 174 <212> PRT <213> Komo sapiens <400> 4
Gly 1 Arg Leu Gly Gin 5 Ala Trp Arg Ser Leu 10 Arg Leu Ser Cys Ala 15 Ala
Ser Gly Phe Thr 20 Phe Ser Asp Tyr Tyr 25 Met Ser Trp Ile Arg 30 Gin Ala
Pro Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp Val 40 Ser Tyr Ile Ser Ser 45 Ser Gly Ser
Thr Arg 50 Asp Tyr Ala Asp Ser 55 Val Lys Gly Arg Phe 60 Thr Ile Ser Arg
Asp 65 Asn Ala Lys Asn Ser 70 Leu ITyz* Leu Gin Met 75 Asn Ser Leu Ala 80
GlU Asp Thr Ala Vai 85 Tyr Tyr Cys Vał Arg 90 Asp Gly Val Glu Thr 95 Thr
Phe Tyr Tyr Tyr 100 Tyr Tyr Gly Met Asp 105 Val Trp Gly Gin Gly 110 Thr Thr
Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro Ser Vał 125 Phe Pro Leu
Ala Pro 130 Cys Ser Arg Ser Thr 135 Ser Glu Ser Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys
Leu 145 Val Lys Asp Tyr Phe 150 Pro Glu Pro Val Thr 155 Val Ser Trp Asn Ser 160
Gly Ala Leu Thr Ser 165 Gly Vał His Thr Phe 170 Pro Ser cys Ala
PL 217 921 B1 <210» 5 <211» 322 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 5 gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagcec ctaagcgcct gatctatgct gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtttacaa cataatagtt acccgtgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa ac 322 <210» 6 <211» 107 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 6
Asp Ile Gin Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Jyj- Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Cys
85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210» 7 <211» 375 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 7 aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct 60 cctgtacagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgccaggctc 120 cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg ISO cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg 300 gctggtccga ctcttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg 360 tcaccgtctc ctcag 375 <210» 8 <211» 124 <212» PRT
PL 217 921 B1 <213> Homo sapiens <400> 8
Val 1 Gin Leu Leu Glu 5 Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gin Pro Gly Gly 15 Ser
Leu Arg Leu Ser CyB Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala
Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
0
115 <210> 9 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <400=· 9 tcctccctgt attagacgtg tatgctgcat acagaattca ctacagcata ac ctgcatctgt atttaggctg cccgtttaca ctctcacaat ataattatcc aggagacaga gtatcagcag aagtggggtc cagcagcctg tcggacgttc gtcaccttca aaaccaggga ccatcaaggt cagcctgaag ggccaaggga cttgccgggc aagctcctaa tcagcggcag attttgcaac ccgaggtgga aagtcaggac 60 gcgcctgatc 120 tggatctggg 180 ttattactgt 240 aatcatacga 300
302 <210> 10 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400=· 10
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg
1 5 10 15
Ala Ser Gin Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
20 25 30
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser
35 40 45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
PL 217 921 B1
Leu Gin His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val 85 90 95
Glu Ile Ile Arg 100 <210> 11 <211> 338 <212 > DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac ctccatcagt aattactact ggagctggat gattgggcgt atctatacca gtgggagccc cacoatgtca gtagacacgfc ccaagaacca cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ectgtccctc acctgcactg tctctggtgg 60 ccggcagccc gccgggaagg gactggagtg 120 caactacaac ccctccctca agagtcgagt 180 gttctccctg aagctgaact ctgtgaccgc 240 aacgattttt ggagtggtta ttatctttga 300 ctectcag 338 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
1 5 10 ' 15
Val Ser Gly Gly 20 Ser Ile Ser Asn Tyr 25 Tyr Trp Ser Trp Ile 30 Arg Gin
Pro Ala Gly 35 Lys Gly Leu Glu Trp 40 Ile Gly Arg Ile Tyr 45 Thr Ser Gly
Ser Pro 50 Asn Tyr Asn Pro Ser 55 Leu Lys Ser Arg Vał 60 Thr Het Ser Val
Asp 65 Thr Ser Lys Asn Gin 70 Phe Ser Leu Lys Leu 75 Asn Ser Val Thr Ala 80
Ala Asp Thr Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Ala Val 90 Thr Ile Phe Gly Val 95 Val
Ile Ile Phe Asp 100 Tyr Trp Gly Gin Gly 105 Thr Leu Val Thr Val 110 Ser Ser
<210> 13 <211? 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gacatecaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcafc ctgtaggaga cagagtcaoc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga agtgattfcag gctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccaaat tacaccgtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagccg ectgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cafcaatagtt accctctcac tttcggcgga 300
PL 217 921 B1 gggaccaagg tggagatcaa ac
322 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Ser Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
105 <210> 15 <211> 376 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 15 gaggtgcagc tcctgtgcag ceagggaagg gcagactccg ctgcaaatga ggctacggtg gtcaccgtct tgttggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag acttttacta cctcag tgggggaggc cacctttagc ggtctcagct gttcaccatc agccgaggac otactactac ttggtacagc agctatgcca attagtggta tccagagaca acggccgtat ggtatggacg ctggggggtc tgagctgggt gtggtggtat attccaagaa attactgtgc fcctggggcca cctgagactc 60 ccgccaggct 120 cacatactac 180 cacgctgtat 240 gaaagatctg 300 agggaccacg 360
376 <210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
PL 217 921 B1
Ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly 55 Gly Ile Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Łeu Tyr 80
Łeu Gin Met Asn Ser 85 Łeu Arg Ala Olu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys Asp Leu 100 Gly Tyr Gly Asp Phe 105 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 110 Gly Met
Asp Val Trp 115 Gly Gin Gly Thr Thr 120 Val Thr val Ser Ser 125
<210» 17 <211» 279 <212» DNA <213» Homo sapiens <400> 17 caggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagtacc tttttaaatt 60 ggtatoagca gaaaccaggg aaagccccta aactcctgat ccatgttgca tccagtttac 120 aaggtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca 180 tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tacaatgccc 240 cactcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaac 279 <21Q> 18 <211» 92 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 18
Gly 1 Asp Arg Val Thr 5 Ile Thr Cys Arg Ala 10 Ser Gin Ser Ile Ser 15 Thr
Phe Łeu Asn Trp 20 Tyr Gin Gin Łys Pro 25 Gly Lys Ala Pro Lys 30 Łeu Łeu
Ile His Val 35 Ala Ser Ser Len Gin 40 Gly Gly Val Pro Ser 45 Arg Phe Ser
Gly Ser 50 Gly Ser Gly Thr Asp 55 Phe Thr Łeu Thr Ile 60 Ser Ser Leu Gin
Pro 65 Glu Asp Phe Ala Thr 70 Tyr Tyr cys Gin Gin 75 Ser Tyr Asn Ala Pro 80
Łeu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
90 <21Q> 19 <211» 341 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 19 cccaggactg gtgaagcctfc cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc 60
PL 217 921 B1 catcagtagt tactactgga gttggatccg gcagccccca gggaagggac tggagtggat 120 tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga gtcgagtcac 180 catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag ctgagttctg tgaccgctgc 240 ggacacggcc gtgtattact gtgccaggac gtatagcagt tcgttctact actacggtat 300 ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca g 341 <210> 20 <211» 113 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 20
Pro Gly Leu. Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vał
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser 20 Ile Ser Ser Tyr Tyr 25 Trp Ser Trp Ile Arg 30 Gin Pro
Pro Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp Ile 40 Gly Tyr Ile Tyr Tyr 45 Ser Gly Ser
Thr Aen 50 Tyr Asn Pro Ser Leu 55 Lys Ser Arg Val Thr 60 Ile Ser val Asp
Thr 65 Ser Lys Asn Gin Phe 70 Ser Leu Lys Leu Ser 75 Ser Val Thr Ala Ala 80
Asp Thr Ala val Tyr 85 Tyr Cys Ala Arg Thr 90 Tyr Ser Ser Ser Phe 95 Tyr
Tyr Tyr Gly Met 100 Asp Val Trp Gly Gin 105 Giy Thr Thr Val Thr 110 Val Ser
Ser <210» 21 <211» 274 <212» DRA <213» Homo sapiens <220» <221» modyfikowana_zasada <222» (240) “ <223» a, c, t, g, inna lub nieznana <400» 21 agagccaccc tctcctgtag ggccagtcag agtgttcgcg gcaggtactt agcctggtac 60 cągcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact 120 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc ISO agactggagc ctgaagattt tgcagtgttt tactgtcagc agtatggtag ttcacctcgn 240 acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaac 274
PL 217 921 B1
Arg 1 Ala Thr Leu Ser 5 Cys Arg Ala Ser Gin 10 Ser Val Arg Gly Arg 15 Tyr
Leu Trp Tyr 20 Gin Gin Lys Pro Gly 25 Gin Ala Pro Arg Leu 30 Leu Ile
Tyr Gly Ala 35 Ser Ser Arg Ala Thr 40 Gly Ile Pro Asp Arg 45 Phe Ser Gly
Ser Gly 50 Ser Gly Thr Asp Phe 55 Thr Leu Thr Ile Ser 60 Arg Leu Glu Pro
Glu 65 Asp Phe Ala Val Phe 70 Tyr Cys Gin Gin Tyr 75 Gly Ser Ser Pro Arg 80
Thr Phe Gly Gin Gly 85 Thr Lys Val Glu Ile 9Q Lys
<210> 23 <211» 367 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacage ctggggggtc cetgagactc 60 tcetgtgcag cctetggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcca 300 gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcag · <210» 24 <211» 122 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 24
Glu 1 val Gin Leu Leu 5 Olu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vał
Ser Gly 50 Ile Thr Gly Ser Gly Gly 55 Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 cys
Ala Lys Asp Pro 100 Gly Thr Thr Val Ile 105 Met Ser Trp Phe Asp 110 Pro Trp
PL 217 921 B1
Gly Gin. Gly Thr Leu Val Thr Vał Ser Ser lis 120 <210> 25 <211> 320 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 25 gaactgtggc tgcaecatct gtcttcatet tcccgccafcc tgatgagcag ttgaaatctg 50 gaactgcctc tgttgtgtge ctgctgaata acttcfcatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gaetacgaga 240 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggccfc gagctcgccc gtcacaaaga 300 gcttcaacag gggagagtgt 320 <21O> 26 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro pro Ser Asp Glu Gin
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly 20 Thr Ala Ser Val Val 25 Cys Leu Leu Asn Asn 30 Phe Tyr
Pro Arg Glu 35 Ala Lys Val Gin Trp 40 Lys Val Asp Asn Ala 45 Leu Gin Ser
Gly Asn 50 Ser Gin Glu Ser Val 55 Thr Glu Gin, Asp Ser 60 Lys Asp Ser Thr
Tyr 65 Ser Leu Ser Ser Thr 70 Leu Thr Leu Ser Lys 75 Ala Asp Tyr Glu Lys 80
HiS Lys Val Tyr Ala 85 Cys Glu Val Thr His 90 Gin Gly Leu Ser Ser 95 Pro
Val Thr Lys Ser 100 Phe Asn Arg Gly Glu 105 Cys
<210> 27 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgcccfc gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacfcfccc ccgaaccggt gacggtgtog 120 tggaacteag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctacfc ccctcagoag cgtggtgacc gtgccctcca geaactfccgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta egtggacggc 480 StSgagghgo ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
PL 217 921 B1 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtetcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978 <210> 28 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg
Ser Thr Ser Glu 20 Ser Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu Val Lys 30 Asp Tyr
Phe Pro Glu 35 Pro Val Thr Val Ser 40 Trp A3n Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser
Gly Val 50 His Thr Phe Pro Ala 55 Val Leu Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser
Leu 65 Ser Ser Val Val Thr 70 Val Pro Ser Ser Asn 75 Phe Gly Thr Gin Thr 80
Tyr Thr Cys Asn Val 85 Asp His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys Val Asp 95 Lys
Thr Val Glu Arg 100 Lys Cys Cys Val Glu 105 Cys Pro Pro Cys Pro 110 Ala Pro
Pro Val Ala 115 Gly Pro Ser Val Phe 120 Leu Phe Pro Pro Lys 125 Pro Lys Asp
Thr Leu 130 Met Ile Ser Arg Thr 135 Pro Glu Val Thr Cys 14 0 Val val Val Asp
Val 145 Ser His Glu Asp Pro 150 Glu Val Gin Phe Asn 155 Trp Tyr Val Asp Gly 160
Val Glu Val His Asn 165 Ala Lys Thr Lys Pro 170 Arg Glu Glu Gin Phe 175 Asn
Ser Thr Phe Arg 180 Val Val Ser Val Leu 185 Thr Val Val His Gin 190 Asp Trp
Leu Asn Gly 195 Lys Glu Tyr Lys Cys 200 Lys Val ser Asn Lys 205 Gly Leu Pro
Ala Pro 210 Ile Glu Lys Thr Ile 215 Ser Lys Thr Lys Gly 220 Gin Pro Arg Glu
Pro 225 Gin Val Tyr Thr Leu 230 Pro Pro Ser Arg Glu 235 Glu Met Thr Lys Asn 240
PL 217 921 B1
Gin Val Ser Leu Thr 245 Cys Leu Val Lys Gly 250 Phe Tyr Pro Ser Asp 255 Ile
Ala Val Glu Trp 260 Glu Ser Asn Gly Gin 265 Pro Glu Asn Asn Tyr 270 Lys Thr
Thr Pro Pro 275 Met Leu Asp Ser Asp 280 Gly Ser Phe Phe Leu 285 Tyr Ser Lys
Leu Thr 290 Val Asp Lys Ser Arg 295 Trp Gin Gin Gly Asn 300 Val Phe Ser Cys
Ser 305 Val Met His Glu Ala 310 Leu His Asn His Tyr 315 Thr Gin Lys Ser Leu 320
Ser Leu Ser Pro Gly 325 Lys
<210» 29 <211» 296 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 29 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcotgtgcag cctctggatt caocttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 etgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgć gagaga 296 <210» 30 <211» 98 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 30
Gin. 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asp Tyr
Tyr Met Ser 35 Trp Ile Arg Gin Ala 40 Pro ciy Lys dy Leu 45 Glu Trp Val
Ser Tyr 50 11 e Ser Ser Ser Gly 55 Ser Thr Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg <210» 31 <211» 296
PL 217 921 B1 <212» DNA <213> Homo sapiens <400» 31 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtaoagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 geagactceg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaga 296 <210» 32 <211» 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400» 32
Glu 1 Val Gin Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly 55 Gly Ser Thr Ty32 Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn. Thr Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 cys
Ala Lys <210» 33 <211» 296 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 33 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga etggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccateagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac ISO aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata teagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210» 34 <211» 93 <212» PRT <213» Homo sapiens <400> 34
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 S io 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
PL 217 921 B1
20 25 30
Asn Trp Trp 35 Ser Trp Val Arg Gin 40 Pro Pro Gly hys Gly 45 Leu Glu Trp
Ile Gly 50 Glu Ile Tyr His Ser 55 Gly Ser Thr Asn Tyr 60 Asn Pro Ser Leu
Lys 65 Ser Arg Val Thr Ile 70 Ser Val Asp Lys Ser 75 Lys Asn Gin Phe Ser 80
Łeu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Arg <210» 35 <211» 293 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 35 .
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ceggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcao caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccafcatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagcfcgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293 <210» 36 <211» 97 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 36
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Tyr
Tyr Trp Ser 35 Trp Ile Arg Gin Pro 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Tyr 50 Ile Tyr Tyr Ser Gly 55 Ser Thr Asn. Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys
Ser 65 Arg val Thr Ile Ser 70 Val Asp Thr Ser Lys 75 Asn Gin Phe Ser Leu 80
Lys Leu Ser Ser Vh1 85 Thr Ala Ala Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala
Arg <210» 37 <211» 290 <212» DNA <213» Homo sapiens
PL 217 921 B1 <400» 37 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 190 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag eagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc 290 <210» 38 <211> 96 <212> PRT <213» Homo sapiens <400» 38
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ser Ser
Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu
Ile Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly Ile Pro 60 Asp Arg Phe Ser
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Ala 85 Val Tyr Tyr Cys Gin 90 Gin Tyr Gly Ser Ser 95 Pro
<210» 39 <211» 288 <212» DNA <213» Homo sapiens <220>
<22i> modyfikowana_zasada <222» (288) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <40Q> 39 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagcec ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctccn 288 <210» 40 <211» 96 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 40
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 χ5
PL 217 921 B1
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Arg 30 Asn Asp
Leu Gly Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu Ile
Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
GlU Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyir Pro Pro
90 95 <210» 41 <211» 288 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 41 gacatccaga tgacccagte tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagteacc 60 ateacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcoagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tteactetca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caactfcacta ctgtcaacag agttacagta cccctcch 288 <210» 42 <211» 96 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 42
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Ile Ser 30 Ser Tyr
Leu Asn Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile
Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Giy Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Ser Tyr Ser Thr Pro 95 Pro
<210» 43 <211» 293 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 43 caggtgeagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc ettcggagac cctgtccctc 60
PL 217 921 B1 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293 <210> 44 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44
Gin 1 val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Tyr
Tyr Trp Ser 35 Trp Ile Arg Gin Pro 40 Ala Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Arg 50 Ile Tyr Thr Ser Gly 55 Ser Thr Asn Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys
Ser 65 Arg Val Thr Met Ser 70 Val Asp Thr Ser Lys 75 Asn Gin Phe Ser Leu 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
90 95
Arg <210> 45 <211> 470 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr
PL 217 921 B1
Tyr Gly 130
Ala Ser 145
Ser Thr
Phe Pro
Gly Val
Leu Ser 210
Tyr Thr 225
Thr Val
Pro Val
Thr Leu
Val Ser 290
115
Met Asp
Thr Lys
Ser Glu
Glu Pro 180
His Thr 195
Ser Val
Cys Asn
Glu Arg
Ala Gly 260
Met Ile 275
His Glu
Val Trp
Gly Pro 150
Ser Thr 165
Val Thr
Phe Pro
Val Thr
Val Asp 230
Lys Cys 245
Pro Ser
Ser Arg
Asp Pro
120
Gly Gin 135
Ser val
Ala Ala
Val Ser
Ala Val 200
Val Pro 215
His Lys
Cys Val
Val Phe
Thr Pro 280
Glu Val 295
Gly Thr
Phe Pro
Leu Gly 170
Trp Asn 185
Leu Gin
Ser Ser
Pro Ser
Glu Cys 250
Leu Phe 265
Glu val
Gin Phe
Thr Val 140
Leu Ala 155
Cys Leu
Ser Gly
Ser Ser
Asn Phe 220
Asn Thr 235
Pro Pro
Pro Pro
Thr Cys
Asn Trp 300
125
Thr Val
Pro Cys
Val Lys
Ala Leu 190
Gly Leu 205
Gly Thr
Lys Val
Cys Pro
Lys Pro 270
Val Val 285
Tyr Val
Ser Ser
Ser Arg 160
Asp Tyr 175
Thr Ser
Tyr Ser
Gin Thr
Asp Lys 240
Ala Pro 255
Lys Asp
Val Asp
Asp Gly
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val 325 Val Ser Val Leu Thr 330 Val Val His Gin Asp 335 Trp
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
Ala Pro
Pro Gin 370
Gin Val 385
340
Ile Glu 355
Val Tyr
Ser Leu
Lys Thr
Thr Leu
Thr Cys 390
Ile Ser 360
Pro Pro 375
Leu Val
345
Lys Thr
Ser Arg
Lys Gly
Lys Gly
Glu Glu 380
Phe Tyr 395
350
Gin Pro 365
Met Thr
Pro Ser
Arg Glu
Lys Asn
Asp Ile 400
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro 410 Glu Asn Asn Tyr Lys 415 Thr
Thr Pro Pro Met 420 Leu Asp Ser Asp Giy 425 Ser Phe Phe Leu Tyr 430 Ser Lys
Leu Thr Val 435 Asp Lys Ser Arg Trp 440 Gin Gin Gly Asn Val 445 Phe Ser Cys
PL 217 921 B1
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
Ser 465 450 Pro Gly Lys 470 455 460
Leu Ser
<210> 46 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Met 1 Glu Phe Gły Leu Ser 5 Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin 20 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 25 30
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 40 45
Ser Ser 50 Tyr Ala Met Ser Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60
Glu 65 Trp Val Ser Ala Ile 70 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met 100 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 105 110
Tyr Tyi? Cys 115 Ala Lys Gły Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 120 125
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 140
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr 165 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr 180 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 185 190
Gły Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 200 205
Leu Sar 210 Ser Val Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 220
Tyr 225 Thr cys Asn Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys 245 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 250 255
PL 217 921 B1
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
Ser 465 450 Pro Gly Lys 470 455 460
Leu Ser
<210 <211 <212 <213 <40C l> 46 .> 470 :> PRT i> Homo sapiens i> 46
Met 1 Glu Phe Gły Leu Ser 5 Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin 20 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 25 30
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 40 45
Ser Ser 50 Tyr Ala Met Ser Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60
Glu 65 Trp Val Ser Ala Ile 70 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met 100 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 105 110
Tyr Tyi? Cys 115 Ala Lys Gły Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 120 125
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 140
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr 165 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr 180 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 185 190
Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 200 205
Leu Sar 210 Ser Val Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 220
Tyr 225 Thr cys Asn Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 235 240
Thr val Glu Arg Lys Cys 245 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 250 255
PL 217 921 B1
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Vąi Asp Gly
290 295 300
Val GlU Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Ty 3? Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
335 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 47 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Met 1 Asp Met Arg Val Ej Pro Ala Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Ile Gin 25 Met Thr Gin Phe Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Ile Thr cys 45 Arg Ala Ser
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
55 60
PL 217 921 B1
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gin pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Ser Tyir Pro Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val vai Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210> 48 <211> 236 <212» PRT
<213» Homo sapiens
<400> 48
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly £sp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro aiy Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
PL 217 921 B1
His Asn Ser 115 Tyr Pro Tyr Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Lys 125 Leu Glu ile
Lys Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser Val Phe Ile Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 14S Gin Leu Lya Ser Gly 150 Thr Ala Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser Val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210» 49 <211> 470 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 49
Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Val Phe Leu 10 Val Ala Ile Ile Lys 15 Gly
Val Gin Cys Gin 20 Ala Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val Lys
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe
Ser Asp 50 Tyr Tyr Met Ser Trp 55 ile Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu
Glu 65 Trp Val Ser Tyr Ile 70 Ser Ser Ser Gly Ser 75 Thr Arg Asp Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn
Ser Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Val Arg Asp Gly Val 120 Glu Thr Thr Phe Tyr 125 Tyr Tyr Tyr
Tyr Gly 13 0 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val 140 Thr Val Ser Ser
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu 155 Ala Pro Cys Ser Arg 160
PL 217 921 B1
Ser Thr Ser Glu Ser 165 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 170 Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr
210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys
225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lya Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys siy Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ser Lys
420 425 430
Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 470
PL 217 921 B1 <210» 50 <211> 473 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 50
Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Val Phe Leu 10 Val Ala Ile Ile Lys 15 Gly
Val Gin cys Gin 20 Val Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val Lys
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe
Ser Asp 50 Tyr Tyr Met Ser Trp 55 Ile Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu
Glu 65 Trp Val Ser Tyr Ile 70 Ser Ser Ser Gly Ser 75 Thr Ile Tyr Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn
Ser Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Val Leu Arg 120 Phe Leu Glu Trp Leu 125 Leu Tyr Tyr
Tyr Tyr 130 Tyr Tyr Gly Met Asp 135 Val Trp Gly Gin Gly 140 Thr Thr Val Thr
Val 145 Ser Ser Ala Ser Thr 150 Lys dy Pro Ser Val 155 Phe Pro Leu Ala Pro 160
Cys Ser Arg Ser Thr 165 Ser Glu Ser Thr Ala 170 Ala Leu Gly Cys Leu 175 Val
Lys Asp Tyr Phe ISO Pro Glu Pro Val Thr 185 Val Ser Trp Asn Ser 190 Gly Ala
Leu Thr Ser 195 Gly Val His Thr Phe 200 Pro Ala Val Leu Gin 205 Ser Ser Gly
Leu Tyr 210 Ser Leu Ser Ser Val 215 Val Thr Val Pro Ser 220 Ser Asn Phe Gly
Thr 225 Gin Thr Tyr Thr Cys 230 Asn Val Asp His Lys 235 Pro Ser Asn Thr Lys 240
Val Asp Lys Thr Val 245 Glu Arg Lys Cys Cys 250 Val Glu Cys Pro Pro 255 Cys
Pro Ala Pro Pro 260 Val Ala Gly Pro Ser 265 Val Phe Leu Phe Pro 270 Pro Lys
Pro Lys Asp 275 Thr Leu Met Ile Ser 280 Arg Thr Pro Glu Val 285 Thr Cys Val
PL 217 921 B1
Val Val 290 Asp Val Ser His Glu 295 Asp Pro Glu Val Gin 300 Phe Asn Trp Tyr
Val 305 Asp Gly Val Glu Val 310 Bis Asn Ala Lys Thr 315 Lys Pro Arg Glu Glu 320
Gin Phe Asn Ser Thr 325 Phe Arg Vał Val Ser 330 Val Leu Thr Val Val 335 His
Gin Asp Trp Leu 340 Asn Gly Lys Glu ’Γγχ 345 Lys Cys Lys Val Ser 350 Asn Lys
Gly Leu Pro 355 Ala Pro Ile Glu Lys 360 Thr Ile Ser Lys Thr 365 Lys Gly Gin
Pro Arg 370 Glu Pro Gin Val Tyr 375 Thr Leu Pro Pro Ser 380 Arg Glu Glu Met
Thr 385 Lys Asn Gin Val Ser 390 Leu Thr cys Leu Val 395 Lys Gly Phe Tyr Pro 400
Ser Asp Ile Ala Val ,405 Glu Trp Glu Ser Asn 410 Gly Gin Pro Glu Asn 415 Asn
Tyr Lys Thr Thr 420 Pro Pro Met Leu Asp 425 Ser Asp Gly Ser Phe 430 Phe Leu
Tyr Ser Lys 435 Leu Thr Val Asp Lys 440 Ser Arg Trp Gin Gin 445 Gly Asn Val
Phe Ser. 450 Cys Ser Val Met His 455 Glu Ala Leu His Asn 460 His Tyr Thr Gin
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 51 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Ala Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Ile Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Phe Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Asp 50 Ile Arg Arg Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu Ile 70 Tyr Ala Ala Ser Arg 75 Leu Gin Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
90 95
PL 217 921 B1
ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Asn 115 Tyr Pro Arg Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Glu 12 5 Val Glu ile
Ile Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser Val Phe Ile Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 145 Gin Leu Lys Ser Gly 150 Thr hi ϊχ Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser Val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser Pro Vał Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210» 52 <211» 236 <212» PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys ASp Ile Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Ile Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Gly 50 Ile Arg Asn Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu Ile 70 Tyr Ala Ala ser Ser 75 Leu Gin Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
Ile Ser Ser Leu 100 Gin Pro Glu Asp Phe 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys 110 Leu Gin
His Asn Ser 115 Tyr Pro Trp Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Lys 125 Val Glu Ile
Lys Arg Thr Val Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
PL 217 921 B1
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
ISO 185 190
Ser Thr 7yX* Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210» 53 <211> 326 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <220» <221» modyfikowana_zasada <222» (289) <223» a, c, t, g, inna lub nieznana <400» 53 gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120 gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct geatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 130 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybsns kttyggcsrr 300 gggaccrags tggaratcaw acgaac 326 <210» 54 <211» 322 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400» 54 gacatccaga atcacttgcc gggaaagcec aggttcagtg gaagattttg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaarctcct gcagtggatc caacttacta tggagatcaa tccatcctcc ctgtctgcat gageattagy asctwtttaa gatcyatgyt gcatccagtt tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag agttacartr ac ctgyaggaga attggtatca trcaargtgg ccatcagcag ccccayychc cagagtcacc gcagaaacca ggtcccatca tctgcaacct ttteggegga
120
130
240
300
322 <210» 55 <211> 325 <212» DNA
PL 217 921 B1 <213 » Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <220» <221» modyfikowana_zasada <222» (291) <223» a, c, t, g, inna lub nieznana <400» 55 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgya gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325 <210» 56 <211» 376 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400» 56 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 180 gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300 gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag 376 <210» 57 <211» 358 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <220» <221» modyfikaowana_zasada <222» {337) “ <223» a, c, t, g, inna lub nieznana <400» 57 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ceggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt 300 ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag 358 <210» 58 <211» 418
PL 217 921 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400> 58 caggtgeagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacage ctggggggtc cetgagactc 60 tcctgtrcag cctetggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct 12Q ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagst attastggka gtggtggtab yacatwctac 180 gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk 300 ggctrsksyg actyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg 360 gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 418 <210> 59 <211> 364 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400> 59 caggtgeagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc ettcggagac cctgtccctc 60 scctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtegact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc 300 agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: łącznik Gly-Ser <400> 60
Gly Gły Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (40)

1. Ludzkie przeciwciało monoklonalne albo jego część wiążąca antygen, które swoiście wiąże się z receptorem insulinopodobnego czynnika wzrostu I (IGF-IR), przy czym przeciwciało zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki, a sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego są odpowiednio wybrane z grupy składającej się z:
a) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788);
b) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 8 oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 6;
d) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 16 oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 14.
2. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, której sekwencja obejmuje nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen Vk A30 linii zarodkowej.
3. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 6 lub SEK NR ID: 14, albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej.
4. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch Ieklci zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 6 lub SEK NR ID: 14.
5. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, której sekwencja zawiera nie więcej niż osiem zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen VH DP47 linii zarodkowej.
6. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8 lub NR ID: 16 albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej.
7. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8 lub NR ID: 16.
8. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki i łańcuch lekki obejmują odpowiednio:
a) sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788); lub
b) sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789).
9. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienne tym, że jest:
a) cząsteczką immunoglobuliny G (IgG), IgM, IgE, IgA lub IgD albo jest z niej otrzymane; lub
b) fragmentem Fab, fragmentem F(ab')2, fragmentem Fv, przeciwciałem jednołańcuchowym lub przeciwciałem bispecyficznym.
10. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789), lub przeciwciałem o takich samych sekwencjach aminokwasowych, jak wybrane przeciwciało.
11. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego stanowią:
a) odpowiednio sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego z 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788); lub
b) odpowiednio sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 45 bez sekwencji sygnałowej i sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 47 bez sekwencji sygnałowej.
12. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEK NR ID: 8, przy czym przeciwciało obejmuje ponadto sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEK NR ID: 6.
PL 217 921 B1
13. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 12, znamienne tym, że sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego zawiera SEK NR ID: 8 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 konserwatywnymi substytucjami amino kwasowymi, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 6 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 substytucjami aminokwasowymi.
14. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 13, znamienne tym, że sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego zawiera SEK NR ID: 8, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 6.
15. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego tego przeciwciała zawiera SEK NR ID: 45 bez sekwencji sygnałowej, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego tego przeciwciała zawiera SEK NR ID: 47 bez sekwencji sygnałowej.
16. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1-15, znamienne tym, że ma co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z:
a) współzawodniczy o wiązanie z IGF-IR z przeciwciałem 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
b) wiąże się z tym samym epitopem IGF-IR, co przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) wiąże się z tym samym antygenem, który jest wiązany przez przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
d) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą KD jak przeciwciało wybrane z grupy składającej się z 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789); oraz
e) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą szybkością dysocjacji jak przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789).
17. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 16, znamienne tym, że wykazuje wszystkie te właściwości.
18. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1 do 17, znamienne tym, że wykazuje co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) nie wiąże się z IGF-IR myszy, szczura, psa lub królika;
b) wiąże się z IGF-IR makaka z gatunku Macaca fascicularis albo rezusa, ale nie z IGF-IR marmozety;
c) hamuje wiązanie IGF-I albo IGF-II z IGF-IR;
d) wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny;
e) hamuje wzrost nowotworu in vivo,
f) powoduje zniknięcie IGF-IR z powierzchni komórki, podczas inkubacji z komórką wyrażającą IGF-IR;
g) hamuje indukowaną przez IGF-IR fosforylację tyrozyny;
h) wiąże się z IGF-IR z KD wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej; oraz -4 -1
i) wykazuje Koff dla IGF-IR wynoszącą 10-4s-1 lub mniejszą.
19. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 18, znamienne tym, że wykazuje wszystkie te właściwości.
20. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 18, znamienne tym, że przeciwciało albo jego część hamuje wiązanie IGF-I lub IGF-II do IGF-IR, wiąże się do
IGF-IR z Kd wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej i wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny.
21. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1 do 20, znamienne tym, że hamuje wiązanie pomiędzy IGF-IR a IGF-I lub IGF-II z IC50 wynoszącym 100 nM lub mniej.
22. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało albo jego część określone w jednym z zastrz. 1 do 21 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
23. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 22, znamienna tym, że zawiera ponadto czynnik przeciwnowotworowy, chemioterapeutyczny, antyangiogenny albo antynowotworowy.
24. Sposób wytwarzania przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21, znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) immunizowania ssaka innego niż człowiek immunogenem zawierającym IGF-IR, przy czym ssak ma zdolność wyrażania ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;
b) izolowania komórek B z ssaka;
PL 217 921 B1
c) przeszukiwania takich komórek B albo linii komórkowych od nich pochodzących w celu zidentyfikowania linii komórkowej, która wytwarza przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR;
d) hodowania linii komórkowej, która wyraża przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR; i
e) izolowania przeciwciał, które wiążą się z IGF-IR z linii komórkowej.
25. Wyizolowana linia komórkowa, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało określone w jednym z zastrz. 1 do 21.
26. Linia komórkowa według zastrz. 25, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789) albo przeciwciało o takiej samej sekwencji aminokwasowej jak wybrane przeciwciało.
27. Zastosowanie przeciwciała Iubjego części określonych w jednym z zastrz. 1 do 21 do wytwarzania leku do diagnozowania obecności albo umiejscowienia nowotworu wyrażającego IGF-IR u osobnika potrzebującego takiej diagnostyki.
28. Zastosowanie przeciwciała Iubjego części wiążącej antygen określonych w jednym z zastrz. 1 do 21 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u człowieka.
29. Zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen określonych w jednym z zastrz. 1 do 21 do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia hiperproliferacyjnego u pacjenta.
30. Zastosowanie według zastrz. 28 albo 29, znamienne tym, że leczenie obejmuje ponadto etap podawania środka przeciwnowotworowego, anty-rakowego, antyangiogennego albo chemioterapeutycznego.
31. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21.
32. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 31, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA- 2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8 Iub SEK NR ID: 16; oraz
d) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 1 Iub SEK NR ID: 15;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 28.
33. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 31, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego koduje łańcuch lekki Iub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA-2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego Iubjego części wiążącej antygen przeciwciała 2.13.2 (nr dostępu ATCC PTA- 2788) lub 4.9.2 (nr dostępu ATCC PTA-2789);
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 6 IubSEKNR ID: 14; oraz
d) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 5 lub SEK NR ID: 13;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 26.
34. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 31 do 33, przy czym zawiera ewentualnie sekwencję kontrolującą ekspresję połączoną funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego.
35. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która
PL 217 921 B1 koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21.
36. Sposób wytwarzania przeciwciała anty-IGF-IR albo jego części wiążącej antygen, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 35 albo linii komórkowej określonej w zastrz. 25 w odpowiednich warunkach i odzyskiwanie takiego przeciwciała Iubjego części wiążącej antygen.
37. Zwierzę transgeniczne inne niż człowiek, znamienne tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki Iubjego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21, przy czym zwierzę to wyraża ten kwas nukleinowy.
38. Zastosowanie jednej lub więcej izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia osobnika, przy czym cząsteczka lub cząsteczki izolowanego kwas nukleinowego są wybrane z grupy składającej się z;
a) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21;
b) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21; oraz
c) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen oraz łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 21;
d) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego z obu (a) i (b).
39. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1-21 do zastosowania jako lek.
40. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, lub wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen jak i łańcuch lekki Iubjego część wiążącą antygen, przeciwciała Iubjego części jak określono w jednym z zastrz. 1-21, do zastosowania jako lek.
PL366340A 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne PL217921B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
PCT/US2001/051113 WO2002053596A2 (en) 2001-01-05 2001-12-20 Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL366340A1 PL366340A1 (pl) 2005-01-24
PL217921B1 true PL217921B1 (pl) 2014-09-30

Family

ID=22987016

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL407889A PL224873B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne
PL413188A PL228041B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne.
PL366340A PL217921B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL407889A PL224873B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne
PL413188A PL228041B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne.

Country Status (51)

Country Link
US (7) US7037498B2 (pl)
EP (4) EP1399483B1 (pl)
JP (4) JP2004531217A (pl)
KR (1) KR100830082B1 (pl)
CN (2) CN1330668C (pl)
AP (1) AP2072A (pl)
AR (1) AR032028A1 (pl)
AT (1) ATE464322T1 (pl)
AU (1) AU2002231368C1 (pl)
BG (3) BG66460B1 (pl)
BR (2) BR0116728A (pl)
CA (1) CA2433800C (pl)
CR (4) CR7045A (pl)
CU (1) CU23447B7 (pl)
CZ (1) CZ301712B6 (pl)
DE (1) DE60141855D1 (pl)
DK (1) DK1399483T3 (pl)
DZ (1) DZ3494A1 (pl)
EA (1) EA012079B3 (pl)
EC (1) ECSP034711A (pl)
EE (2) EE05715B1 (pl)
ES (1) ES2344592T3 (pl)
GE (1) GEP20084484B (pl)
GT (1) GT200100257A (pl)
HK (3) HK1072059A1 (pl)
HN (1) HN2001000283A (pl)
HR (2) HRP20030627A2 (pl)
HU (1) HUP0302525A2 (pl)
IL (2) IL156661A0 (pl)
IS (1) IS2790B (pl)
MA (1) MA26040A1 (pl)
ME (1) ME00502B (pl)
MX (2) MX349009B (pl)
MY (1) MY143465A (pl)
NO (1) NO339789B1 (pl)
NZ (2) NZ569856A (pl)
OA (1) OA12589A (pl)
PA (1) PA8535501A1 (pl)
PE (1) PE20020801A1 (pl)
PL (3) PL224873B1 (pl)
PT (1) PT1399483E (pl)
RS (1) RS51373B (pl)
SG (1) SG138469A1 (pl)
SK (1) SK287954B6 (pl)
SV (1) SV2007000775A (pl)
TN (1) TNSN01177A1 (pl)
TW (1) TWI324609B (pl)
UA (1) UA87804C2 (pl)
UY (2) UY27087A1 (pl)
WO (1) WO2002053596A2 (pl)
ZA (1) ZA200305995B (pl)

Families Citing this family (294)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ569856A (en) 2001-01-05 2010-03-26 Pfizer Antibodies to insulin-like growth factor 1 receptor
SG173211A1 (en) * 2001-06-26 2011-08-29 Amgen Inc Antibodies to opgl
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
CN100410275C (zh) * 2002-01-18 2008-08-13 皮埃尔法布雷医药公司 新的抗igf-ir抗体及其应用
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
WO2003097805A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
EP1506286B1 (en) 2002-05-24 2014-03-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Neutralizing human anti-igfr antibody
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2003105782A2 (en) 2002-06-17 2003-12-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
WO2004031347A2 (en) * 2002-09-24 2004-04-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
PL378812A1 (pl) * 2003-02-13 2006-05-29 Pfizer Products Inc. Zastosowania przeciwciał przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostowego I
JP2007528201A (ja) * 2003-03-14 2007-10-11 ファルマシア・コーポレーション 癌治療のためのｉｇｆ−ｉ受容体に対する抗体
ATE549359T1 (de) * 2003-04-02 2012-03-15 Hoffmann La Roche Antikörper gegen den insulinähnlichen wachstumsfaktor i-rezeptor und deren verwendungen
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
ATE458006T1 (de) * 2003-05-14 2010-03-15 Kenta Biotech Ag Humaner monoklonaler antikörper spezifisch für lipopolysacchariden (lps) des serotyps iats o6 von pseudomonas aeruginosa
US7579157B2 (en) 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
UA85058C2 (ru) * 2003-08-13 2008-12-25 Пфайзер Продактс Инк. Модифицированное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с рецептором подобного к инсулину фактора роста i человека (igf-ir)
US7498415B2 (en) * 2003-09-24 2009-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody against human insulin-like growth factor
US20050187175A1 (en) * 2003-09-30 2005-08-25 Elly Nedivi Methods and compositions for CPG15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
PE20050928A1 (es) 2003-11-21 2005-11-08 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti-igfr1
MXPA06005540A (es) * 2003-12-08 2006-08-17 Immunogen Inc Anticuerpo del receptor anti-igf-i.
CN1997382A (zh) * 2004-05-05 2007-07-11 梅里麦克制药股份有限公司 调节生物活性的双特异性结合剂
CN101014365B (zh) * 2004-07-16 2011-04-13 辉瑞产品公司 使用抗-igf-1r抗体联合治疗非血液的恶性肿瘤
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
DE602005025685D1 (de) 2004-12-03 2011-02-10 Schering Corp Biologische marker zur vorauswahl von patienten für die anti-igf1r-therapie
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
BRPI0609655A2 (pt) 2005-03-31 2010-03-16 Agensys Inc anticorpos e moléculas relacionadas que ligam-se às proteìnas 161p2f10b
CN101222926B (zh) * 2005-04-15 2013-07-17 默沙东公司 用于治疗或预防癌症的方法和组合物
AU2006238930B2 (en) 2005-04-26 2010-12-23 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
WO2006138181A2 (en) * 2005-06-14 2006-12-28 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
MX2007016306A (es) * 2005-06-15 2008-03-07 Schering Corp Formulaciones de anticuerpo anti-igf1r.
PL2100618T3 (pl) * 2005-06-17 2014-07-31 Imclone Llc Przeciwciało anty-PDGFR alfa do zastosowania w leczeniu przerzutowego raka kości
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
ES2546069T3 (es) 2005-09-07 2015-09-18 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos monoclonales humanos para quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1)
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
JP2009516513A (ja) 2005-11-21 2009-04-23 ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム ハイブリッド抗原結合分子の組成物及び製造方法並びにその使用
CA2633956C (en) 2005-12-13 2016-12-06 Olivia Raeber Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP2671954B1 (en) 2006-01-20 2018-05-16 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ROS kinase in human non-small cell lung carcinoma
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
AP2008004569A0 (en) 2006-02-03 2008-08-31 Imclone Systems Inc IGR-IR antagonists as adjuvants for treatment of prostrate cancer
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
KR20080104160A (ko) * 2006-03-28 2008-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｉｇｆ-１ｒ 인간 단일클론 항체 제형
WO2007126876A2 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-ir antibodies and uses thereof
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
SI2450437T1 (sl) 2006-04-14 2017-12-29 Cell Signaling Technology Inc. Okvarjenost genov in mutantna ALK kinaza v človeških solidnih tumorjih
EP2021338A1 (en) 2006-05-09 2009-02-11 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
WO2008005469A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Schering Corporation Igfbp2 biomarker
CN102123712B (zh) 2006-12-13 2014-03-19 默沙东公司 使用igf1r抑制剂治疗癌症的方法
TW200833711A (en) * 2006-12-22 2008-08-16 Genentech Inc Antibodies to insulin-like growth factor receptor
PE20090107A1 (es) * 2007-02-14 2009-03-20 Glaxo Group Ltd Anticuerpos de union al antigeno igf-1r
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
CN101617228A (zh) * 2007-02-27 2009-12-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于评估针对胰岛素样生长因子ⅰ受体的抗体的抑制活性的方法
MX2009009379A (es) * 2007-03-02 2009-09-14 Amgen Inc Metodos y composiciones para tratar enfermedades tumorales.
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
WO2008127710A2 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute Methods for treating cancer resistant to erbb therapeutics
WO2008144345A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
WO2009032145A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
KR20100052545A (ko) * 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
DK2203558T3 (en) 2007-10-18 2016-06-27 Cell Signaling Technology Inc TRANSLOCATION AND mutant ROS kinase IN HUMAN NON-small cell lung carcinoma
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
BRPI0820875B1 (pt) 2007-12-14 2021-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
CN101903401B (zh) 2007-12-21 2013-06-05 罗切格利卡特公司 抗体的稳定性试验
JP2011515478A (ja) * 2008-03-25 2011-05-19 シェーリング コーポレイション 結腸直腸がんを処置または予防するための方法
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BRPI0913366A8 (pt) 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
TW201008580A (en) 2008-06-03 2010-03-01 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8822645B2 (en) 2008-07-08 2014-09-02 Abbvie Inc. Prostaglandin E2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP5576370B2 (ja) 2008-08-06 2014-08-20 ファイザー・インク Ｃｈｋ−１阻害剤としての６置換２−ヘテロシクリルアミノピラジン化合物
TWI471139B (zh) 2008-12-12 2015-02-01 Boehringer Ingelheim Int 抗－ｉｇｆ抗體
PL2881402T3 (pl) 2009-02-12 2017-10-31 Cell Signaling Technology Inc Ekspresja zmutowanej ROS w ludzkim raku wątroby
EP3903829B1 (en) 2009-02-13 2023-05-03 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
EP2419136A4 (en) 2009-04-16 2013-01-02 Merck Sharp & Dohme COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN104725512A (zh) * 2009-04-27 2015-06-24 诺华股份有限公司 增加肌肉生长的组合物和方法
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3028565T3 (da) 2009-07-08 2017-11-13 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
CN102666875A (zh) 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
KR101860175B1 (ko) 2009-10-26 2018-05-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
CA2782194C (en) 2009-12-02 2018-01-16 Immunomedics, Inc. Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
US9238080B2 (en) 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
DK2575935T4 (da) 2010-06-07 2023-11-27 Amgen Inc Anordning til indgivelse af lægemiddel
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
CA2804185C (en) 2010-07-12 2017-03-21 Covx Technologies Ireland Limited Multifunctional antibody conjugates
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2012019132A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
US9046513B2 (en) 2010-08-26 2015-06-02 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG10201506906VA (en) 2010-09-09 2015-10-29 Pfizer 4-1bb binding molecules
WO2012050921A2 (en) * 2010-09-28 2012-04-19 Nono, Inc. Nd2 peptides and methods of treating neurological disease
WO2012066058A1 (en) * 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
WO2012071557A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Litron Laboratories, Ltd Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
AU2012212075A1 (en) 2011-02-02 2013-07-18 Amgen Inc. Methods and compositons relating to inhibition of IGF-1R
US20120258073A1 (en) 2011-02-10 2012-10-11 Christian Gerdes Immunotherapy
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
MY171008A (en) 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
CA2831467C (en) 2011-03-29 2020-03-24 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
KR20140138353A (ko) * 2011-04-19 2014-12-03 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
DK2699598T3 (en) 2011-04-19 2019-04-23 Pfizer COMBINATIONS OF ANTI-4-1BB ANTIBODIES AND ADCC-INducing ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CA2831572C (en) 2011-05-02 2019-11-26 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
ES2872081T3 (es) 2011-08-05 2021-11-02 Regeneron Pharma Ratones con cadena ligera universal humanizada
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
EP4091442A1 (en) * 2011-09-19 2022-11-23 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US20140309229A1 (en) 2011-10-13 2014-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
US9987428B2 (en) 2011-10-14 2018-06-05 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
JP6268097B2 (ja) 2011-11-11 2018-01-24 デューク・ユニヴァーシティ 固形腫瘍治療のための併用薬物療法
US20140341922A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 SUN R & D Foundation Method for Overcoming Tolerance to Targeted Anti-Cancer Agent
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
JP2015508994A (ja) 2011-12-30 2015-03-26 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｉｌ−１３および／またはｉｌ−１７に対する二重可変ドメイン免疫グロブリン
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
PL2838998T3 (pl) 2012-04-18 2018-04-30 Cell Signaling Technology, Inc. EGFR i ROS1 w nowotworze
CN104284674A (zh) 2012-05-04 2015-01-14 辉瑞公司 前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法
WO2013191982A2 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind igf1r
EP3539563A1 (en) 2012-07-19 2019-09-18 Redwood Bioscience, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
EP3434695B1 (en) 2012-08-07 2020-12-02 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
CA2886993A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
RU2636043C2 (ru) 2012-11-01 2017-11-17 Эббви Инк. Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US20150290390A1 (en) 2012-11-21 2015-10-15 Amgen Inc. Drug delivery device
RU2649004C2 (ru) 2012-11-29 2018-03-29 Кемосентрикс, Инк. Антагонисты cxcr7
WO2017004144A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
HUE057977T2 (hu) 2012-12-13 2022-06-28 Immunomedics Inc Ellenanyagok és SN-38 immunkonjugátumainak dózisai javított hatásossággal és csökkentett toxicitással
US9458245B2 (en) 2013-03-06 2016-10-04 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. ANTI-C-MET tandem Fc bispecific antibodies
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
AU2014227732A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
CN110526971B (zh) 2013-04-29 2023-06-30 泰华制药澳大利亚公司 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US20160129089A1 (en) * 2013-06-13 2016-05-12 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
SG11201602236SA (en) 2013-10-01 2016-04-28 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3789064A1 (en) 2013-10-24 2021-03-10 Amgen, Inc Injector and method of assembly
CA2936675C (en) 2014-01-12 2023-06-27 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN106132436B (zh) 2014-02-21 2021-06-15 Ibc药品公司 通过诱导对trop-2表达细胞的免疫应答的疾病疗法
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
JP6636498B2 (ja) 2014-03-21 2020-01-29 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 単一ドメイン結合タンパク質を作る非ヒト動物
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
SG10201811702TA (en) 2014-05-07 2019-01-30 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
CA2948003C (en) 2014-06-03 2023-06-27 Amgen Inc. Drug delivery system and method of use
US9580495B2 (en) 2014-06-24 2017-02-28 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
AU2015328370B2 (en) 2014-10-07 2021-08-05 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US10544199B2 (en) 2014-10-29 2020-01-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha 2B variants
CA2966932A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Immunogen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3258988B1 (en) 2015-02-17 2019-08-28 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
CN107921104A (zh) * 2015-02-22 2018-04-17 索伦托治疗有限公司 结合cd137的抗体疗法
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
JP2018508224A (ja) 2015-03-19 2018-03-29 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗原を結合する軽鎖可変領域を選択する非ヒト動物
JP6746845B2 (ja) 2015-04-22 2020-08-26 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． 循環ｔｒｏｐ−２陽性癌細胞の単離、検出、診断及び／または特徴付け
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CN114796501A (zh) 2015-06-25 2022-07-29 免疫医疗公司 抗体与治疗剂的组合治疗癌症的方法
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3355907B1 (en) 2015-10-02 2021-01-20 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
JP2019510741A (ja) 2016-02-05 2019-04-18 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための効率的なプロセス
KR20230152153A (ko) 2016-03-10 2023-11-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3528787A4 (en) 2016-10-21 2020-05-06 Amgen Inc. PHARMACEUTICAL FORMULATIONS AND PROCESSES FOR THEIR PREPARATION
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
MX2019010544A (es) 2017-03-06 2019-10-21 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con caracteristica de prevencion de la activacion.
CA3052482A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
SG11201908062QA (en) 2017-03-09 2019-09-27 Amgen Inc Insertion mechanism for drug delivery device
US20200131518A1 (en) 2017-03-14 2020-04-30 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN110446512B (zh) 2017-03-28 2022-03-18 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件系统以及方法
WO2018217669A1 (en) 2017-05-21 2018-11-29 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
US11904143B2 (en) 2017-06-08 2024-02-20 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CA3063920A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019046600A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Amgen Inc. INSULIN-RELATED GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR BINDING PROTEINS (IGF-1R) AND METHODS OF USE
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
US11813426B2 (en) 2017-10-06 2023-11-14 Amgen Inc. Drug delivery device including seal member for needle of syringe
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
JP2021501198A (ja) * 2017-10-27 2021-01-14 トランスフュージョン ヘルス，リミティド ライアビリティ カンパニー フルオレンの誘導体を用いて造血幹細胞を増殖する組成物および方法
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
JP2021501616A (ja) 2017-11-06 2021-01-21 アムジエン・インコーポレーテツド 配置及び流量検出を備える薬物送達デバイス
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
MX2020004996A (es) 2017-11-16 2020-08-27 Amgen Inc Un mecanismo de pestillo de puerta para un dispositivo de administracion de farmacos.
AU2018368338A1 (en) 2017-11-16 2020-04-09 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
EP3775251A1 (en) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000748A (es) 2018-07-24 2021-03-26 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210228797A1 (en) 2018-07-31 2021-07-29 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710A1 (en) 2018-09-24 2021-02-04 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN112805048B (zh) 2018-10-02 2023-09-22 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
MA53818A (fr) 2018-10-05 2022-01-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament ayant un indicateur de dose
CN117138169A (zh) 2018-10-15 2023-12-01 安进公司 药物递送装置
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
JP7246409B2 (ja) * 2018-12-03 2023-03-27 帝人ファーマ株式会社 抗ｉｇｆ－ｉ受容体ヒト化抗体
KR20210102338A (ko) 2018-12-12 2021-08-19 케모센트릭스, 인크. 암의 치료를 위한 cxcr7 억제제
US11702482B2 (en) 2018-12-17 2023-07-18 Revitope Limited Twin immune cell engager
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
JP2022549329A (ja) 2019-09-26 2022-11-24 アムジェン インコーポレイテッド 抗体組成物を製造する方法
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
CN116745324A (zh) 2021-01-27 2023-09-12 信达生物制药(苏州)有限公司 针对cd16a的单域抗体及其用途
EP4305069A1 (en) * 2021-03-08 2024-01-17 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to cd66e polypeptides
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
JPWO2022239720A1 (pl) 2021-05-10 2022-11-17
CN117320964A (zh) 2021-05-21 2023-12-29 美国安进公司 优化药物容器的灌装方案的方法
TW202317614A (zh) 2021-06-07 2023-05-01 美商安進公司 使用岩藻糖苷酶控制糖基化蛋白的去岩藻糖基化水平
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023143484A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE352612T1 (de) 1990-08-29 2007-02-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0580752A4 (en) 1991-04-19 1994-08-24 Mannheim Gmbh Boehringer Human bone derived insulin like growth factor binding protein
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
JP3801196B2 (ja) 1993-03-09 2006-07-26 ジェンザイム・コーポレイション 乳からの対象化合物の単離
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5861510A (en) 1995-04-20 1999-01-19 Pfizer Inc Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as MMP and TNF inhibitors
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
JP2000500654A (ja) * 1995-11-14 2000-01-25 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ 可溶性ｉｇｆ−１受容体による腫瘍成長に対する誘導耐性
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
WO1997032856A1 (en) 1996-03-05 1997-09-12 Zeneca Limited 4-anilinoquinazoline derivatives
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
PT912559E (pt) 1996-07-13 2003-03-31 Glaxo Group Ltd Compostos heterociclicos fundidos como inibidores de proteina tirosina quinase
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
ID19430A (id) 1996-07-13 1998-07-09 Glaxo Group Ltd Senyawa senyawa heterosiklik
TR199900066T2 (xx) 1996-07-18 1999-04-21 Pfizer Inc. Matriks metalloproteazlar�n fosfinat bazl� inhibit�rleri
CA2264284A1 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Ralph P. Robinson Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
PT950059E (pt) 1997-01-06 2004-10-29 Pfizer Derivados de sulfona ciclicos
PT977733E (pt) 1997-02-03 2003-12-31 Pfizer Prod Inc Derivados de acido arilsulfonilamino-hidroxamico
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
AU722784B2 (en) 1997-02-11 2000-08-10 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0984930B1 (en) 1997-05-07 2005-04-06 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
CA2291709A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
IL134300A (en) 1997-08-08 2004-07-25 Pfizer Prod Inc Derivatives of aryloxyacrylylsulfonaminoaminoxamic acid derivatives, pharmaceutical preparations containing them and their use in the preparation of drugs for the treatment of arthritis, cancer and other diseases characterized by the activity of metalloproteinase-13 of matrix
JP4959049B2 (ja) 1997-08-22 2012-06-20 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド 血管新生阻害剤としてのオキシインドリルキナゾリン誘導体
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
CZ20001709A3 (cs) 1997-11-11 2001-12-12 Pfizer Products Inc. Deriváty thienopyrimidu a thienopyridinu, farmaceutické kompozice a způsoby léčení na jejich bázi
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
CA2314156C (en) 1998-05-29 2010-05-25 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
WO2000009560A2 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
PT1004578E (pt) 1998-11-05 2004-06-30 Pfizer Prod Inc Derivados hidroxamida do acido 5-oxo-pirrolidino-2-carboxilico
JP3793693B2 (ja) 1998-12-23 2006-07-05 ファイザー インコーポレーテッド Ｃｔｌａ−４に対するヒトモノクローナル抗体
WO2000050067A1 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Saltech I Göteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic production of insulin-like growth factor-1
CN101066997B (zh) 1999-03-25 2013-03-27 艾博特股份有限两合公司 结合人il-12的人抗体及其生产方法
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
NZ569856A (en) 2001-01-05 2010-03-26 Pfizer Antibodies to insulin-like growth factor 1 receptor
SG173211A1 (en) 2001-06-26 2011-08-29 Amgen Inc Antibodies to opgl
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
UA85058C2 (ru) * 2003-08-13 2008-12-25 Пфайзер Продактс Инк. Модифицированное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с рецептором подобного к инсулину фактора роста i человека (igf-ir)
CA2552523C (en) * 2004-01-09 2019-11-26 Pfizer Inc. Monoclonal antibodies to mucosal addressin cell adhesion molecule(madcam)
US10181126B2 (en) 2012-03-13 2019-01-15 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
SV2007000775A (es) 2007-03-15
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
AR032028A1 (es) 2003-10-22
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
CR7045A (es) 2005-09-02
CR10786A (es) 2009-06-04
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
CR10134A (es) 2010-09-14
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
NO20033074L (no) 2003-07-04
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
TWI324609B (en) 2010-05-11
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
US8642037B2 (en) 2014-02-04
US7700742B2 (en) 2010-04-20
AP2072A (en) 2009-12-10
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
OA12589A (en) 2006-06-08
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
MY143465A (en) 2011-05-13
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
US7982024B2 (en) 2011-07-19
US9234041B2 (en) 2016-01-12
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
PT1399483E (pt) 2010-07-20
GEP20084484B (en) 2008-09-25
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
ECSP034711A (es) 2003-10-28
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
EE05724B1 (et) 2014-10-15
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
MX337162B (es) 2016-02-15
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
GT200100257A (es) 2002-09-02
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
EE200300318A (et) 2003-10-15
IL156661A (en) 2008-11-26
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
PL366340A1 (pl) 2005-01-24
CR20140001A (es) 2014-02-05
MX349009B (es) 2017-07-06
NZ569856A (en) 2010-03-26
US7037498B2 (en) 2006-05-02
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
CN1564829A (zh) 2005-01-12
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
ME00502B (me) 2011-10-10
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
EE201300037A (et) 2014-04-15
CN1330668C (zh) 2007-08-08
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
CN1854157A (zh) 2006-11-01
NZ527302A (en) 2006-10-27
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
IS6866A (is) 2003-07-04
BG112197A (bg) 2016-05-31
CU23447B7 (es) 2009-10-16
RS51373B (sr) 2011-02-28
EE05715B1 (et) 2014-06-16
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
IL156661A0 (en) 2004-01-04
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
ZA200305995B (en) 2004-08-04
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
UY27087A1 (es) 2002-06-20
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
YU54203A (en) 2006-03-03
SG138469A1 (en) 2008-01-28
US7815907B2 (en) 2010-10-19
NO339789B1 (no) 2017-01-30
BG108037A (bg) 2005-04-30
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
BR0116728A (pt) 2005-04-12
CN1854157B (zh) 2013-01-02
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
DE60141855D1 (de) 2010-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002231368C1 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
AU2002231368A1 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor