KR20040083918A

KR20040083918A - 인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 모노클로날 폴리펩티드및 이를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR20040083918A
Application number: KR1020030018621A
Authority: KR
Inventors: 권병세; 이언화; 김지영; 권명희
Original assignee: 이뮤노믹스 주식회사; 권병세
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2003-03-25
Publication date: 2004-10-06
Also published as: KR100500283B1

Abstract

본 발명은 인간 4-1BB 분자에 대한 마우스 모노클로날 항체를 인간화함으로써 제조된, 인간 4-1BB 분자에 특이성을 갖는 인간화 모노클로날 폴리펩티드, 이에 불변영역이 연결된 항체 및 이들을 포함하는 자가면역질환 치료용 또는 면역억제용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 및 이에 불변영역이 연결된 항체는 인간 4-1BB에 대한 결합친화도가 높으면서 인간의 항체와 유사한 서열을 가지므로 자가면역질환의 치료제 또는 면역억제제로서 부작용 없이 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 모노클로날 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물{Humanized Monoclonal Polypeptide Specific for Human 4-1BB Molecule and Pharmaceutical Composition Comprising Same}

본 발명은 새로운 자가면역 질환(autoimmune disease) 치료용 또는 면역 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 자가면역질환 중 대표적인 류마티스성 관절염 및 루퍼스성 홍진(lupus erythematosus) 등을 치료하는 인간 4-1BB에 특이적인 새로운 인간화 모노클로날 폴리펩티드 및 이를 포함하는 자가면역 질환 치료용 또는 면역억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

인간 면역반응의 시작은 T 세포에 의한 단백질 항원의 인식에 의존한다. 그러나, T 세포는 항원을 단독으로는 인식할 수 없고, B 세포, 마크로파지 (macrophage) 등과 같은 항원표출세포(antigen presenting cell) 표면의 조직적합성복합체(major histocompatibility complex; 이하 "MHC"라 함)와 항원이 복합체를 이루고 있는 경우에만 면역반응을 촉발할 수 있다.

MHC 클래스 I 분자는 킬러 T 세포반응을 촉발하여 항원을 가진 세포를 파괴하고, MHC 클래스 Ⅱ분자는 헬퍼 T 세포반응을 촉발하여 선택된 B 세포의 성장과 마크로파지의 활성화를 조절한다. 이런 면역계의 중요한 기능 중 하나는 자기항원과 외부에서 들어온 항원을 감별하고 인지하는 능력이다. 이 구별은 면역계가 침입한 외부 병원체에 반응하는 반면에 자기 단백질에 대해서는 내성을 유지하여 정상조직에 해를 가하지 않게 하는 데 필요하다.

자가면역 질환은 자기내성(self-tolerance)이 파괴되어 면역계가 류마티스 관절염의 관절과 같은 자기 조직에 대해 반응하는 질환이고, 또 다른 예로 루퍼스성 홍진(lupus erythematosus)이 있다. 내성의 유지에 따른 자가면역질환의 방지는 MHC 분자의 기능에 절대적으로 의존한다.

여러 자가면역질환이 특정 MHC 대립형질(alleles)의 유전과 관련이 있다는 결과는 자가면역질환에 MHC가 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. 예를 들어,인슐린 의존 당뇨병은 HLA-DR3 및/또는 HLA-DR4와 관련이 있고, 하시모토 갑상선염(thyroiditis)은 HLA-DR5와 관련이 있으며, 만성 염증성 관절염은 HLA-DR4w14 및/또는 HLA-DR1과 관련이 있다.

자가면역질환에 관여하는 MHC 분자는 특정 자가 항원에 결합하여 그들을 T 세포에 표출시켜 자가면역반응에 관여하는 것으로 생각된다.

자가면역질환에 관여하는 MHC 분자에 결합할 수 있거나, 결합하는 것을 방해하거나 또는 이미 결합된 자가 항원을 제거하거나, T 세포 활성화를 저해하거나 방어적 T 세포(Th 2세포)의 활성을 증가시킬 수 있는 펩타이드가 상기 MHC 분자를 통해 중재되는 자가면역반응을 저해할 수 있을 것이다.

이러한 종류의 약제들은 자가면역질환에 대한 치료를 제공하는 반면에 정상적인 면역계의 억제를 방해하는 부작용을 가지므로 그 사용이 제한된다. 또한 MHC와 이에 반응하는 자가항원의 수가 많고, 종류가 다양하므로 이에 대한 특이 펩타이드도 종류가 너무 많아 치료제로는 적합하지 않다.

MHC 분자에 결합하여 T 세포 활성을 억제하는 펩타이드들이 국제특허출원 공개번호 WO 92/02543, WO 93/05011 및 WO 95/07707에 기재되어 있다. 비록 HLA-DR 분자들에 붙어서 T 세포 활성화를 저해하는 많은 분자들이 발견되었지만, 그런 분자들에 결합하는 다른 화합물들이나 다른 메카니즘으로 자가면역반응을 억제하거나 변형시키는 대체 화합물들에 대한 필요성은 계속되고 있다.

4-1BB는 활성화된 T 세포의 표면에 발현하는 공동자극분자(costimulatory molecule)로써, CD8 T 세포에 생존시그날(survival signal)을 전달하고, CD8 T 세포 증식 및 세포독성(cytotoxic) T 세포 반응 유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 장기이식 또는 자가면역질환에서 자기(self)를 인지하는 자기 항원에 의해서 활성화된 세포독성 T 세포를 억제하기 위해서 본 발명에서는 인간의 항체와 유사한 서열을 갖는 인간화 모노클로날 폴리펩티드인 항-h4-1BB ScFv형태의 Hu4785-2 및 불변영역이 연결된 H2L2형태의 Hu4785-2H/Hu4785-2K를 제조하여, 자가면역질환의 치료 또는 면역 억제에 가능성이 있는지 연구하였다.

연구 결과, 본 발명에 따른 인간화 모노클로날 폴리펩티드인 Hu4785-2 및 Hu4785-2H/Hu4785-2K 가 인간 4-1BB 분자에 특이성이 있고, 결합 친화도가 높음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간 4-1BB(h4-1BB) 분자에 대해 특이성이 있고 결합 친화도가 높으며 항-h4-1BB ScFv 형태인 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 인간화 모노클로날 폴리펩티드에 불변영역이 연결된 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간화된 모노클로날 폴리펩티드를 포함하는, 자가면역 질환 치료용 또는 면역억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

도 1 및 2 는 각각 4785 VH 및 VL의 인간화 뉴클레오타이드 서열과 인간 주형의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,

도 3 및 4 는 각각 인간화 4785 VH 및 VL의 영역을 제조하기 위한 PCR 순서를 나타낸 것이고,

도 5 는 인간화된 항-h4-1BB ScFv를 항-E 태그 세파로즈를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 것이고,

도 6 은 경쟁적 ELISA를 통한 인간화 항-h4-1BB ScFv의 억제율을 나타낸 것이고,

도 7 은 인간화된 항-h4-1BB ScFv의 인간 4-1BB 분자와의 결합친화도를 나타낸 것이고,

도 8a 는 인간화된 ScFv의 VH에 리더서열 및 인간 IgG1의 불변영역이 연결된 상태의 중쇄 뉴클레오티드 서열이고,

도 8b 는 상기 도 8a의 중쇄 뉴클레오티드 서열에 해당하는 중쇄 아미노산서열이며,

도 8c 는 인간화된 ScFv의 VL에 리더서열 및 인간 카파사슬서열이 연결된 상태의 경쇄 뉴클레오티드 서열이고,

도 8d 는 상기 도 8c의 경쇄 뉴클레오티드 서열에 해당하는 경쇄 아미노산서열이고,

도 9 는 실시예 20의 Hu4785-2H/Hu4785-2K 유전자 발현을 관찰한 웨스턴블롯결과사진이고,

도 10 은 순수분리된 인간화된 항체의 SDS-PAGE 사진이고,

도 11a 는 마우스4785의 농도별 처리시 PBMC의 증식억제를 나타낸 도이고,

도 11b 는 인간화된 Hu4785-2 ScFv 처리시 PBMC의 증식억제를 나타낸 도이고,

도 11c 는 인간화된 Hu4785-2 H2L2 처리시 PBMC의 증식억제를 나타낸 도이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호:5의 아미노산서열을 포함하는, 인간 4-1BB 분자에 대해 특이성이 있는 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 서열번호:40 및 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 4-1BB 분자에 대해 특이성이 있는 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료용 약학조성물 및 면역억제용 약학조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH), 링커 및 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)에 해당하는 서열번호: 5 의 아미노산서열을 포함하고, 인간 4-1BB 분자에 대해 특이성이 있으며, 항-h4-1BB ScFv(single-chain fragment variable)형태인 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 제공한다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드는 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 1 및 2의 아미노산 서열을 갖는 4-1BB에 대한 마우스 4785 모노클로날 항체를 인간화함으로써 제조할 수 있으며, 구체적으로 가변영역의 항원결합부위인 CDRs (complementarity determining regions) 서열 및 정준 잔기(canonical residue)는 마우스 단일클론항체의 서열과 일치하고, 프레임워크 영역(framework region, FR)의 서열 중 중쇄와 경쇄 사이에 존재하는 서열은 마우스 항체의 것과 일치하고, 특이적 서열은 인간 항체의 것과 일치하고, 용매 표출 잔기(solvent-exposed residue)는 마우스 항체의 것과 일치하도록 고안된 것이다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드들 중에서 인간의 4-1BB와 친화도가 가장 높은 것으로 나타난 Hu4785-2는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 이 아미노산 서열은 서열번호: 6의 염기서열에 의해 암호화될 수 있고, 본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 생산하는 세포주 TG1/Hu4785-2는 2002년 11월 12일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 10365BP 호로서 기탁하였다.

또한, 본 발명은 상기 Hu4785-2 모노클로날 폴리펩티드를 암호화 하는 DNA 염기서열을 제공하며, 바람직하게는 서열번호: 6의 염기서열을 제공한다.

그리고, 본 발명은 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 암호화하는 플라스미드 Hu4785-2/pCANTAB 5E(기탁번호: KCTC 10365BP)를 제공한다.

본 발명의 ScFv 형태인 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2는 4-1BB 분자와의 친화도가 마우스 4785보다 약 1000배정도 높으며, 인간화된 ScFv는 경쟁적 ELISA 실험에서 원래의 모노클로날 항체와 같은 생물학적 효과를 나타냄으로써, 이를 유효성분으로 하는 조성물은 4-1BB와 4-1BB 리간드의 상호작용을 막을 수 있어, 장기이식 또는 자가면역질환에서 자기를 인지하는 자기항원에 의해 활성화된 세포독성 T 세포를 억제하는데 적용할 수 있다.

ScFv 형태의 인간화 모노클로날 폴리펩티드는 VH, 링커(linker), VL이 연결되어 있는 형태이고, ScFv는 뉴트랄 링커(neutral linker)로 인위적으로 연결되어있어서 한 가닥의 폴리펩티드로 발현되고, 대부분의 VH-Linker-VL ScFv 단백질은 15개의 아미노산링커인 (Gly₄Ser)₃를 가지고 있다. 이러한 유연 펩티드링커 (flexible peptide linker)는 VH 사슬의 카르복시말단(carboxy-terminus)과 VL 사슬의 아미노말단(amino terminus) 사이에 3.5nm 거리의 브릿지(bridge)를 형성하도록 특별히 고안된 것이다. 이러한 구조는 사슬간 페어링(chain pairing)을 촉진시키고 두 개의 사슬이 각각 발현되었을 때 발생하는 응집(aggregation)이나 리폴딩(refolding)을 최소화시킬 수 있다. (Gly₄Ser)₃잔기를 가지고 있는 ScFv는 친화도(affinity)와 안정성(stability)의 면에서 원래의 항체와 같다.

이에 항체의 불변영역(Constant region)을 연결하여 중쇄사슬 2개 및 경쇄사슬 2개가 연결된 H2L2 형태의 완전한 항체 형태를 제조함으로써, 그 효과를 극대화 시킬 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호: 40 및 서열번호: 42의 아미노산서열을 포함하고, 인간 4-1BB 분자에 대해 특이성이 있으며, 항-h4-1BB H2L2 형태를 갖는 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2H/Hu4785-2K를 제공한다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2의 VH에 리더서열과 인간 IgG1의 불변영역을 연결시켜 진핵세포 발현벡터 내로 서브클로닝하여 제작한 Hu4785-2H/pcDNA는, 진핵세포주에서 발현시 Hu4785-2H를 생산하고, 이 폴리펩티드는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 가지고 서열번호: 41의 염기서열에 의해 암호화된다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2H를 생산하는 플라스미드 Hu4785-2H/pcDNA를 갖는 세포주 XL-1 Blue/Hu4785-2H는 2003년 3월 6일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 10440BP 호로서 기탁하였다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2의 VL 리더서열과 인간 카파사슬서열을 연결시켜 진핵세포 발현벡터 내로 서브클로닝하여 제작한 Hu4785-2K/pcDNA는, 진핵세포주에서 발현시 Hu4785-2K를 생산하고, 이 폴리펩티드는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 가지고, 서열번호: 43의 염기서열에 의해 암호화된다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2K를 생산하는 플라스미드 Hu4785-2K/pcDNA를 갖는 세포주 XL-1 Blue/Hu4785-2K는 2003년 3월 6일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 10441BP 호로서 기탁하였다.

또한, 본 발명은 Hu4785-2H/Hu4785-2K 모노클로날 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 염기서열을 제공하며, 바람직하게는 서열번호: 41 및 서열번호: 43의 염기서열을 제공한다.

그리고, 본 발명은 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 포함하고 항체 중쇄 불변영역을 발현하기 위한 플라스미드 Hu4785-2H/pcDNA (기탁번호: KCTC 10440BP) 및 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 포함하고 항체 경쇄 불변영역을 발현하기 위한 플라스미드 Hu4785-2K/pcDNA (기탁번호: KCTC 10441BP)를 제공한다.

상기 H2L2 형태의 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2H/Hu4785-2K를 유효성분으로 함유하는 조성물은 장기이식 또는 자가면역질환에서 자기를 인지하는 자기항원에 의해 활성화된 세포독성 T 세포를 억제하는데 적용할 수 있다.

ScFv는 결합부위가 한개 이지만, H2L2 형태는 결합부위가 2개라서 더 효과적인 결합이 일어나며, ScFv 형태는 인간의 생체에 존재하지 않는 형태이므로, 생체에 존재하는 H2L2 형태가 항원성이 더 낮다. 그리고 인간화된 Hu4785-H2L2의 불변부위(constant region)의 이형(isotype)인 IgG1은 세포에 결합되고 나서 보체(complement)를 고정시키므로 Hu4785-H2L2 항체가 결합한 세포독성 T 세포를 죽이는 반응이 일어난다. 이것은 장기이식 또는 자가면역질환에서 자기를 인지하는 자기 항원에 의해서 활성화된 세포독성 T 세포를 특이적으로 사멸시킴으로서 장기이식 거부반응과 자가면역반응의 원인이 되는 자기반응세포독성 T 세포(self reactive cytotoxic T cell)를 완전히 제거할 수 있다. 그러므로 H2L2 형태로의 전환이 바람직하다.

그러므로, 본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드들은 인간 4-1BB에 대한 결합 친화도가 높으면서 인간의 항체와 유사한 서열을 가지므로 자가면역 질환의 치료제 또는 장기이식 거부반응 등에 대한 면역억제제로서 부작용 없이 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2 또는 Hu4785-2H/Hu4785-2K를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2 또는 Hu4785-2H/Hu4785-2K를 유효성분으로 포함하는 장기 이식시 거부반응 방지 및 치료를 위한면역억제용 약학조성물을 제공한다.

상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 만성염증성관절염, 루퍼스성 홍진(lupus erythematosus), 쇼그랜증후군, 자가면역으로 인한 갑상선염 (thyroiditis)과 같은 갑상선질환, 자가면역 당뇨병 등을 포함한다.

이러한 목적으로, 본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함하여 자가면역질환의 치료용 또는면역억제용 약학조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 통상적으로 사용되는 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 경구 투여용 제제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 인간화 모노클로날 폴리펩티드의 사용량은 사용목적, 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.01 내지 5mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정 항체, 투여경로, 투여시간,배 설율, 건강상태, 질환의 중증도, 성별, 체중, 나이, 식이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 4-1BB의 제조

(단계 1) 하이브리도마 세포주 제조

사람의 4-1BB 분자를 코딩하는 cDNA(울산대 면역제어연구소, 권병세교수)와 글루타치온 S 트랜스퍼라제(GST) 중 글루타치온이 결합하는 부위를 코딩하는 DNA(Pharmacia LKB Biotechnology사)를 결합시켜서 pGEX3 발현벡터(Pharmacia LKB Biotechnology사)를 제작하였다. human 4-1 BB의 세포외 부위와 GST를 결합시켜서 pGEX3에 넣었다. 이 벡터로 대장균(Top1, Stratagene사)을 형질 전환시킨 후 형질전환된 대장균의 단일 콜로니(colony)를 1X LB에 접종한 다음 37℃에서 12시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 1× LB 100분의 1 부피로 접종하고 37℃에서 3시간 동안 진탕배양하였다. 여기에 0.1mM의 IPTG를 처리하고, 25℃에서 5시간동안 진탕배양하여 4-1BB-GST 융합단백질의 발현을 유도한 다음 배양액을 글루타치온 세파로즈-4B 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology사)에 넣고 용출완충액인 0.5M 글리신-HCl으로 용출시킴으로써 4-1BB-GST 융합단백질을 정제하였다.

(단계 2) 면역

20㎍의 4-1BB-GST 융합단백질을 0.1㎖의 완전 프로인트 보조제(Freund complete adjuvant)와 섞어서 생후 4 내지 8주된 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하여 최소면역을 시켰다. 이 후 20㎍의 4-1BB-GST 융합단백질을 0.1㎖의 불완전 프로인트 보조제(Freund incomplete adjuvant)와 섞어서 3주 간격으로 2차례 복강내에 주사하여 면역화시켰다. 면역화시킨 최종일로부터 3일 후에 꼬리로부터 소량의 피를 채혈하여 효소면역 검정법에 의해 원하는 항체의 역가를 측정하였다, 면역가가 일정수준 이상이 되면 마우스로부터 비장을 적출하여 비장세포를 얻어 융합에 사용하였다.

(단계 3) 세포융합

면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포를 SP2/0-Ag14 골수종 세포(ATCC CRL 1581)와 1:2로 혼합하고, 50% 폴리에틸렌글리콜 4000(Gibco BRL사)을 사용하여 융합시켰다(Mishell and SHiigi,Seledted Methods in Cellular Immunology,W. H.Freeman Company, 1980).

하이브리도마 세포주를 선별하기 위해, 융합시킨 세포 혼합물을 HAT 배지(15% 송아지 태아 혈청, 0.1mM 하이포크산틴, 0.4μM 아미노프테린, 16μM 티미딘이 보강된 RPMI 1640 배지)내에 재현탁시킨 다음 3 ×10⁷세포/㎖의 농도로 96웰 마이크로 배양 트레이에 투입하여 5% CO₂를 함유하는 37℃의 세포 배양기에서 배양하였다. 골수종세포 및 융합되지 않은 비장세포는 HAT 배지에서 잘 성장할 수 없으므로, 상기 배지에서 성장하는 세포는 융합이 이루어진 세포로 생각할 수 있다. 6, 7, 8일 후에 세포배양액의 1/2를 새로운 세포배양액으로 대체시켰다. 세포 증식 여부를 역상현미경을 이용하여 관찰하여 세포가 충분히 자랐을 때 96웰 마이크로 배양트레이로부터 항체를 포함하고 있는 상층액을 취하여 ELISA법을 수행하였다.

(단계 4) 하이브리도마 세포주 선별

4-1BB-GST 융합단백질을 인산염 완충액(PBS, pH 7.2)에 희석하여 200ng/0.1㎖의 농도로 ELISA 플레이트에 코팅시켰다. 코팅이 완료된 플레이트를 인산염 완충액으로 여러 번 씻고 난 후, 1% 소혈청 알부민이 포함된 인산염 완충액을 플레이트에 가하여 1시간 동안 방치하고 인산염 완충액으로 여러번 씻은 다음, 상기에서 얻은 세포 상층액을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 인산염 완충액으로 다시 여러 번 씻고 알카라인 포스파타제가 결합된 염소 항-마우스면역 글로불린(Southern Biotech사)을 1000배 희석하여 0.1㎖의 양으로 첨가하였다. 2시간 방치 후 인산염 완충액으로 여러 번 씻고, 기질(p-니트로페닐 인산 이나트륨염을 탄산염 완충액에 녹여서 1㎎/㎖로 만든 용액, pH 9.6) 0.1㎖을 첨가하여 실온에서 10분간 보존하였다. 이후 자동 마이크로 플레이트 기록계로 반응을 측정하고, 4-1BB 분자에 특이하게 작용하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 4785(기탁번호:KCTC 0952BP)로 명명하였다.

(단계 5) 하이브리도마 세포주를 이용한 항체의 제조

상기 단계 4에서 제조된 4785 세포주 1 ×10⁷개를 배양액에서 증식시킨 후 프리스테인(pristane : 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸, Sigma사) 0.5㎖로 미리 처리한 Balb/c 마우스의 복막에 주입하고 10일 후에 복수액을 수집하였다. 이 복수액을 프로테인-A 세파로즈 컬럼(Pharmacia사)을 이용하여 친화 크로마토그래피를 수행하여 모노클로날 항체를 분리하였다. 이 때 항체 생성율은 1㎖ 복수액 당 l㎎이었다.

항체 분석키트를 사용하여 측정한 결과 제조된 모노클로날 항체는 IgG1인 것으로 나타났으며 카파 경사슬(kappa light chain)의 이형(isotype)을 갖고 있음을 확인하였다.

실시예 2 : 생쥐의 모노클로날 항체 유전자의 클로닝

(단계 1) 4785 세포주의 mRNA 추출

2 ×10⁸개의 4785 세포에서 총 RNA를 다음과 같은 방법으로 추출하였다. 먼저, 세포 펠렛(pellet)에 트리퓨어 분리시약(TriPure Isolation Reagent, Sigma사)을 처리하고 페놀/클로로포름으로 1회 추출하였다. 상층액에 이소프로판올을 처리하여 RNA를 침전시키고 75% 에탄올로 2회 세척한 후에 DEPC(Sigma사)를 처리한 증류수에 녹여 총 RNA를 수득하였다. 수득한 총 RNA에서의 mRNA 추출은 다이날비드(Dynalbeads) mRNA 정제 키트(DYNAL사)를 사용하여 mRNA를 분리, 정제하였다.

(단계 2) 4785 세포주의 cDNA 라이브러리 제작

4785세포주의 cDNA 라이브러리 제작을 위해서 ZAP-cDNA 합성 키트(STRATAGENE사) 및 ZAP-cDNA 기가팩 III 골드 클로닝 키트(Gigapack III Gold Cloning Kit, STRATAGENE사)를 사용하였다.

상기 단계 1에서 수득된 mRNA 5㎍, XhoI 인지서열을 갖는 서열번호: 19의 링커 프라이머 2.8㎍, RNase H^-역전사효소(40U, Stratagene사), 메틸 뉴클레오타이드 혼합물(1.25mM) 및 RNase 억제제(40U, Stratagene사)를 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 첫 번째 가닥을 합성하였다. 이어서, RNase H(3U)와 DNA 중합효소 I(99U, Stratagene사)를 이용하여 16℃에서 2시간 30분 동안 반응시켜 두 번째 가닥을 합성하였다. 반응 후 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올을 이용하여 농축시킨 다음, 70% 에탄올로 세척한 후 침전물을 물에 녹이고 울트라프리-프로바인드 필터(Ultrafree-Probind filter, SIGMA사)를 사용하여 단백질을 제거하고 클레나우 단편(Klenow fragment)과 dNTP를 이용하여 3' 및 5' 말단을 평활말단으로 만들고 울트라프리-프로바인드 필터를 이용하여 단백질을 제거하였다. 이어서, rATP 2mM, T4 DNA 리가제(2U)를 첨가하고 4℃에서 12 시간 동안 반응시킨 다음, 70℃에서 30분 동안 가열하여EcoRI 효소를 불활성화시켰다. 다시 rATP 2mM, T4 폴리뉴클레오타이드 키네이즈(10U)를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 70℃에서 30분 동안 불활성화시켜EcoRI 말단을 키네이즈화시켰다. 이어서,XhoI을 이용하여 절단한 다음, 울트라프리-프로바인드 필터를 이용하여 단백질을 제거하여 cDNA를 수득하였다. 에티디움 브로마이드 플레이트 분석을 이용하여 cDNA의 양을 결정하였다. cDNA 100ng에 Uni-ZAP XR 벡터(Stratagene사) 125㎍, rATP(1mM) 및 T4 DNA 리가제(2U)를 혼합하여 12℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 80℃에 보관하던 패키징 추출물(packaging extract, Stratagene사)을 꺼내어 녹기 시작하면 상기 연결된 DNA 2㎕를 넣고 거품이 생기지 않게 조심하면서 피펫을 이용하여 혼합한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 여기에 SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgSO₄. 7H₂O, 50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01% gelatin) 500㎕, 클로로포름 20㎕을 넣고 혼합한 다음, 원심분리하여 상층액을 새 튜브에 옮겼다.

숙주 세포로는 대장균 XL-1 블루 MRF'(Stratagene사)를 이용하고, LB/테트라사이클린(50㎍/㎖) 플레이트에 도말하여 얻은 단일 콜로니를 10mM 황산마그네슘과 0.2% 말토즈를 포함하는 LB 배지에 접종하였다. 이를 37℃에서 OD₆₀₀이 1.0이 넘지않게 200rpm으로 진탕하면서 키웠다. 이 배양액을 500×g에서 10분 동안 원심분리하면서 배지를 제거하고 세포 펠렛에 10mM 황산마그네슘을 가하여 OD₆₀₀에서 0.5가 될 때까지 희석하였다. 이렇게 준비된 숙주세포는 4℃에 저장하면 48시간 동안 사용 가능하다.

숙주세포 200㎕에 1/10으로 희석한 패키징 반응산물(pakaged reaction)을 1㎕ 넣고, 37℃에서 15분 동안 부착시켰다. 여기에 48℃로 식힌 상층 아가(top agar)를 3㎖ 넣고 볼텍싱(vortexing)한 후에 예열한 LB 아가 플레이트에 즉시 부은 다음 37℃에서 10시간 동안 키운 후 플라크 수를 세어 ㎖당 pfu로 계산하였다. 그 결과 1.9 ×10⁵pfu를 얻었다.

(단계 3) 중쇄 유전자와 카파 사슬 유전자의 스크리닝

(단계 2)에서 얻은 형질전환 세포주를 100mm 플레이트에 각각 약 200-300개의 플라크가 형성되도록 플레이팅하고 나일론 막으로 옮겨 UV 교차연결(crosslinking)하였다. 이 막을 이용하여 하이브리다이제이션을 실시하였다. 이 때 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain) 카파(kappa) 사슬의 스크리닝을 위한 프로브로는 PCR로 클로닝한 각각의 불변영역의 단편을 사용하였다. 자세하게는, 중쇄 프로브를 얻기 위한 PCR 프라이머는 마우스 IgG1의 cDNA의 CH1 영역을얻기 위해서 서열번호 8의 G-1U: 5'-gaactctggatccctgtcca-3' 서열번호 9의 G-1D: 5'-tgcaaggcttacaaccacaa-3'를 사용했으며, 이를 이용하여 200bp의 PCR 산물을 얻어서 프로브로 사용하였다. 경쇄 프로브는 마우스 카파 사슬 cDNA의 CH1 영역을 얻기 위해서 서열번호 10의 K-1U: 5'- atcttcccaccatccagtga -3' 및 서열번호 11의 K-1D: 5'- cgtccttggtcaacgtgag -3'를 사용했으며, 이를 이용하여 200bp의 PCR 산물을 얻어서 프로브로 사용하였다. ECL 다이렉트 핵산 라벨링 및 검색 키트(direct nucleic acid labelling and detection kit)를 사용하여 하이브리다이제이션을 수행하였고, 이를 통해 수득된 클론들을 Exassit/SOLR 시스템을 사용하는 생체내 절제(in vivo excision)를 통하여 플라스미드로 전환시키고 서열을 확인하였다. 중쇄 유전자 및 카파 사슬의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 38 및 39에 나타내었다.

실시예 3: 4785 클론의 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)의 인간화

인간 항체 유전자 중에서 마우스의 단백질을 코딩하는 4785 클론의 가변 영역의 염기서열과 가장 유사한 것을 데이터 베이스 검색을 통하여 선별하고 이 염기서열을 4785의 염기서열과 비교하여 조합 항체 라이브러리의 제작에 필요한 PCR 주형 겸 프라이머를 제작하는데 사용하였다.

4785 클론의 중쇄 및 경쇄의 CDR과 FR 영역의 위치를 결정하고 인간의 아미노산 잔기로 바꿀 것인지 마우스의 잔기를 그대로 사용할 것인지는 하기 표 1에 따라 결정하였다.

마우스 잔기	설 명	결 정
CDR	Ig blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)	마우스
정준잔기(canonical residues)	초티아 정준 지정 (Chothia canonical assignment)(http://www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/)	마우스
사슬간 패킹 잔기(Interchain packing residue)		마우스
N-글리코실래이션 부위(N-glycosylation sites)		인간
특이적 프레임워크 잔기(Unusual framework residues)	CDR 잔기의 5-6 ?? 내에 있는 모든 잔기	마우스
특이적 프레임워크 잔기(Unusual framework residues)	모든 다른 잔기들	인간
용매-노출 잔기(Solvent-exposed residues)	CDR, 정준, 사슬간 잔기들	마우스
용매-노출 잔기(Solvent-exposed residues)	모든 다른 잔기들(http://imgt.cines.fr:8104/textes/IMGTrepertoire.html)	인간

중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열 중에서 항원과 직접 결합하는 부분인 CDR 영역은 마우스의 서열로 그대로 두고, 정준 잔기(canonical residue)는 마우스의 서열, FR 영역에 존재하는 서열이라도 중쇄와 경쇄의 사이에 존재하는 서열은 마우스, 특이서열은 인간의 서열, 용매 표출 잔기는 마우스의 잔기로 하였다.

이를 근거로 하여 4785 클론의 인간화 뉴클레오타이드 서열을 결정하였으며 이러한 법칙에 따라 얻어진 아미노산 서열과 인간 주형의 아미노산 서열을 비교하여 도 1 및 2에 나타내었다.

실시예 4: 인간화된 4785 VH 및 VL 서열 결정

조합 항체 라이브러리를 만들기 위한 삽입체를 준비하기 위하여 4785 클론의 중쇄와 경쇄의 염기서열과 인간 주형의 염기서열을 비교해서 얻은 아미노산 서열을근거로 하여 서열번호: 11 내지 23의 서열을 갖는 4785 VH 조합 프라이머 및 서열번호: 24 내지 34의 서열을 갖는 4785 VL 조합 프라이머를 제작하였다.

이렇게 제작된 프라이머를 주형 겸 프라이머로 사용하여 도 3 및 4에 제시된 바와 같은 순서로 VH 영역 및 VL 영역의 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 전-변성 94℃, 5분; 94℃, 1분; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 후-신장 72℃, 7분으로 35회 실시하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 정제 분리(퀴아젠 젤 추출 키트, Qaigen사)로 분리하여 인간화 VH 및 VL의 PCR 산물을 얻었으며, 이의 각 서열은 서열번호 3 및 4에 나타내었다.

실시예 5: 조합 VH와 조합 VL의 연결 및 제한효소 부위의 첨가

PCR로 얻은 VH와 VL을 링커 DNA를 이용해서 단일가닥으로 연결시키고 5'- 및 3'- 에 효소 부위를 첨가하기 위해 중쇄 산물 50ng, 경쇄 산물 50ng, 서열번호: 35의 4785 VH-Sfi-U(5μM) 1㎕, 서열번호: 36의 4785 VL-NotI-D(5μM) 1㎕, 서열번호: 37의 링커 프라이머 2㎕, 10 ×PCR 완충액 5㎕, dNTP 혼합물 2.5㎕, 25mM MgCl₂5㎕ 및 ExTag(5U, Takara사) 1㎕을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 증류수로 총량을 50㎕으로 조절하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 전-변성 94℃, 5분; 94℃, 1분; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 후-신장 72℃, 7분으로 35회 실시하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물(4785 ScFv DNA)을 퀴아젠 젤 추출 키트(QIAGEN사)로 분리하였다.

실시예 6: ScFv DNA 삽입체의 제한효소 처리 및 정제

(단계 1)SfiI 절단반응

정제된 ScFv DNA(상기 실시예 5 에서 얻어진 ScFv DNA) 1㎍, 10 ×Sfi 반응 완충액(Roche사) 8.5㎕, 제한효소SfiI(10U/㎕, Roche사) 2㎕ 및 3차 증류수를 총량이 85㎕가 되도록 하는 양으로 혼합하고 85㎕의 미네랄 오일을 첨가하여 50℃에서 4 시간 동안 반응시켰다.

(단계 2)NotI 절단반응

단계1에서 준비된SfiI으로 절단된 ScFv에 3M 염화나트륨 3.6㎕, 10 ×완충액(NotI 반응 완충액 : 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgCl_2,1mM dithioerythritol, pH7.5, Roche사) 1.5㎕, 제한효소NotI(10U/㎕, Roche사) 4㎕ 및 3차 증류수를 총량이 15㎕가 되도록 하는 양으로 혼합하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 페놀/클로로포름으로 추출하고, 스펀-칼럼(Pharmacia Biotech사) 정제로 분리시켰다.

실시예 7: ScFv의 정량과 클로닝

0.75cm 두께의 1%의 아가로즈 젤에 12.5ng과 25ng의 ScFv 마커를 분리정제된 ScFv DNA와 같이 전기영동하여 비교함으로써 ScFv DNA를 정량한 후, 4785 ScFv DNA 150ng, 10 ×OPA 완충액 5㎕, pCANTAB 5E(50ng/㎕, Pharmacia Biotech사) 5㎕, 10mM ATP 5㎕, T4 DNA 리가제(4U/㎕) 2㎕ 및 3차 증류수를 총량이 50㎕가 되도록하는 양으로 혼합하여 16℃에서 1 시간 동안 반응시키고, 70℃에서 10분 동안 리가제를 열 불활성화시킨 다음, 얼음에서 5분 동안 식혔다.

실시예 8: 수용성 세포(Competent cell)의 준비

TG1 대장균(Pharmacia Biotech사)의 글리세롤 원료(glycerol stock)를 최소 배지 플레이트에 도말(streaking)하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 최소 배양배지 플레이트의 단일 콜로니를 5㎖ 2 ×YT 배지(Bacto-tryptone 17g, Bacto-yeast extract 10g, NaCl 5g in dH₂O 1 liter)에 접종하고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 수득된 배양액 1㎖을 100㎖의 2 ×YT 배지에 접종하고 250rpm으로 교반하면서 OD₆₀₀이 0.4 내지 0.5에 이를 때까지 배양하였다. 이어서, 4℃, 2500 ×g에서 15분 동안 원심분리하고, 세포 침전물을 10㎖의 차가운 TSS(1g Bacto-tryptone, 0.5g Bacto-yeast extract, 0.5g NaCl, 10g PEG(M.W. 3350), 5㎖ dimethylsulfoxide, 5㎖ 1M MgCl₂in 100㎖ 증류수(pH 6.5), 0.22㎛ 필터로 여과 후멸균)에서 재현탁시키고 얼음에서 보관하였다.

실시예 9: 형질전환과 라이브러리 제조.

상기에서 준비된 수용능력이 있는(competent) TG1 세포 1㎖에 연결 반응액을 첨가하고, 얼음에서 45분 동안 방치하였다. 이 혼합물을 42℃에서 2분 동안 배양한 다음, 얼음에서 식혔다. 이 중 100㎕에 900㎕의 LBG(Bacto-tryptone 1g, Bacto-yeast extract 0.5g, NaCl 0.5g / dH₂O 100㎖, 2M glucose 1㎖ 첨가)를 첨가하여, 250rpm으로 교반하면서 배양하였다. 이렇게 형질전환된 세포를 여러 비율로 희석하여 SOBAG 플레이트(Bacto-tryptone 20g, Bacto-yeast extract 5g, NaCl 0.5g / dH₂O 1 리터, 1M MgCl₂10㎖, 2M glucose 55.6㎖, 20㎎/㎖ 암피실린 5㎖, Bacto agar 15g)에 플레이팅하여 cfu를 확인한 결과 6 ×10⁶cfu의 라이브러리를 수득하였다.

실시예 10: 4785 재조합 파지 항체 라이브러리로의 전환

상기에서 수득한 박테리아 라이브러리 900㎕에 9.1㎖의 2 ×YT-G 배지를 첨가하고, 250rpm으로 교반하면서 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 침전시키기 위해서 1000×g에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다.

침전물에 10㎖의 2 ×YT-AK 배지(2×YT 배지, 100㎍/㎖ 암피실린, 50㎍/㎖ 카나마이신)를 첨가하고, 250rpm으로 교반하면서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 침전시키기 위해 1000×g에서 20분 동안 원심분리시키고 상층액을 50㎖의 원추형 멸균 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.45㎛ 여과막을 통과시킨 후 4℃에서 보관하였다.

실시예 11: 재조합 파지의 PEG 침전

4785 재조합 파지 항체 라이브러리에 2㎖의 PEG/NaCl(PEG 8000 200g, NaCl146.1g 1 리터의 물에 녹이고 멸균한다.)를 가하고 잘 혼합한 다음 얼음에서 60분 동안 배양하였다. 이어서 4℃, 10000×g에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 침전물에 16㎖의 2 ×YT 배지를 첨가하여 혼합한 다음, 0.45㎛의 여과막을 통과시킨 후 패닝(panning)을 실시하였다.

실시예 12: 항원-양성 재조합 파지 항체의 선택을 위한 패닝(panning)

0.05M 카보네이트 완충액(pH 9.6)에 4-1 BB단백질을 10㎍/㎖이 되게 희석시킨 후 상온에서 1-2 시간 동안 T25(Corning사) 플라스크에 코팅하였다. 이어서, PBS로 플라스크를 3회 세척한 다음, 블로킹 완충액(blocking buffer, 10% non fat milk in 1×PBS)으로 플라스크를 가득 채우고 상온에서 1 시간 동안 두었다. 이어서, PBS로 3회 세척한 다음, 0.01% 소디움 아지드를 포함하는 블로킹 완충액 14㎖에 PEG 침전된 재조합 파지 16㎖을 희석하고 상온에서 15분간 반응시켰다. 이 희석액 중 재조합 파지 20㎖를 플라스크에 넣고 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이어서, 50㎖의 PBS로 플라스크를 20번 세척한 다음, 50㎖의 0.1% PBS-T로 20번 세척하였다. 대수기(log-phase)에 있는 TG1 세포(Pharmacia Biotech사) 10㎖를 플라스크에 넣고, 37℃에서 1 시간 동안 배양한 다음, 배양액 중 100㎕를 2×YT 배지로 1:10, 1:100 및 1:1000으로 희석하여, SOBAG 플레이트에 100㎕씩 플레이팅하고 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

상기 플레이트의 cfu를 계산하여 라이브러리 크기를 추정한 결과 9 ×10⁴cfu를 수득하였다.

실시예 13: 스크리닝을 위한 단일 클론 제조

패닝 후에 얻어진 800개의 콜로니를 각각 200㎕의 2×YT-AG 배지(Bacto-tryptone 17g, Bacto-yeast extract 10g, NaCl 5g / dH₂O 1 리터, 100㎍/㎖ 암피실린, 2% 글루코스 포함)가 함유된 96-웰 플레이트에 접종하여 250rpm으로 교반하면서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

M13KO7 헬퍼 파지(Pharmacia Biotech사) 2.5 ×10¹⁰pfu가 포함된 2×YT-AG 배지 50㎖를 96 웰 플레이트에 200㎕씩 각각 분주하였다. 이 플레이트에 상기 하룻밤 동안 배양한 배양액을 40㎕ 씩 접종하였다. 접종한 플레이트를 150rpm으로 교반하면서 37℃에서 2 시간 동안 배양한 다음, 1500 ×g에서 상온에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 200㎕의 2×YT-AK(2×YT medium, 100㎍/㎖ 암피실린 및 50㎍/㎖ 카나마이신 포함) 배지를 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 250rpm으로 교반하면서 37℃에서 배양한 다음, 1500×g에서 상온에서 20분 동안 원심분리하고 상층액으로 ELISA를 실시하여 스크리닝하였다.

0.05M 카보네이트 완충액(pH 9.6)에 4-1 BB 단백질을 10㎍/㎖이 되게 희석한 후 상온에서 1-2시간동안 ELISA 플레이트에 200㎕ 씩 코팅하였다. 이어서, PBS로 플레이트를 3회 세척한 다음, 블로킹 완충액(10% non fat milk in 1×PBS) 200㎕씩 각 웰에 넣고 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서, 0.01% PBS-T로 플레이트를 3회 세척한 다음, 미리 블로킹된 미량 역가 플레이트 위에서 얻어진 상기 재조합 파지 항체 상층액 100㎕를 첨가하고, 여기에 블로킹 완충액을 동량 섞어서 상온에서 30 분 동안 반응시켰다.

희석된 재조합 파지 항체 상층액 200㎕를 항원 코팅된 웰에 넣고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 0.01% PBS-T로 플레이트를 5회 세척한 다음, 블로킹 완충액에 HRP/항-M13 모노클로날 콘주게이트(Pharmacia Biotech사)를 1:5000으로 희석하여 각 웰에 200㎕씩 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 0.01% PBS-T로 플레이트를 6회 세척한 다음, 각 96웰 플레이트 당 36㎕의 30% H₂O₂를 첨가한 21㎖ 1×ABTS 원료액(Sigma사)을 각 웰당 200㎕ 씩 첨가하고, 20분간 상온에서 반응시킨 다음, 410nm에서 흡광도를 측정하여 0.2 이상의 흡광도를 가지는 19개의 클론을 수득하여 이를 양성 클론으로 정하였다. 하기 표 2는 ELISA를 통해서 얻어진 각 클론의 흡광도를 나타낸 것이다.

클론번호	1	2	7	10	11	13	14	15	16	17
A405-1。	0.807	0.543	0.747	1.636	0.901	1.698	0.393	0.549	0.137	0.663
A405-2。	0.625	0.802	0.736	1.103	0.520	0.215	0.464	0.185	0.670	2.122
클론번호	18	19	20	21	22	23	24	25	26
A405-1。	0.358	0.375	0.476	0.722	0.802	0.804	0.193	0.785	2.284
A405-2。	1.093	0.481	0.209	1.125	0.809	0.852	0.489	0.329	0.362

상기 19개의 클론의 전체 서열을 확인하고 비교하여 중복된 것을 제외시켜 8가지의 군으로 나누어 하기 표 3에 나타내었다.

그룹 1	Hu4785-1, Hu4785-7, Hu4785-10, Hu4785-13,Hu4785-15, Hu4785-16, Hu4785-22, Hu4785-23
그룹 2	Hu4785-11, Hu4785-18, Hu4785-26
그룹 3	Hu4785-14
그룹 4	Hu4785-24
그룹 5	Hu4785-19
그룹 6	Hu4785-2
그룹 7	Hu4785-17
그룹 8	Hu4785-21

상기의 Hu4785-2클론의 염기서열을 포함하는 pCANTAB/Hu4785-2 플라스미드로 형질전환된 TG1세포를 생명공학연구소 유전자은행에 KCTC 10365BP로 기탁하였다.

실시예 14: 단백질 발현과 정제

항원에 결합하는 것으로 밝혀진 8가지 군의 M13 파지를 수용성 ScFv 상태로 전환시키기 위해 대장균 HB2151(Pharmacia Biotech사)에 감염시켜 대장균을 형질전환시켰다. 각 세균성 클론들을 80㎖의 2×YT-AG에 접종하고 37℃에서 250rpm으로 교반하면서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 다시 800㎖의 2×YT-AG에 접종하고 37℃에서 250rpm으로 교반하면서 1시간 동안 배양한 다음, 5000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 수득된 펠렛을 800㎖의 2×YT-AI 배지(Bacto-tryptone 17g, Bacto-yeast extract 10g, NaCl 5g/dH₂O 1 리터)에 가하여 37℃에서 250rpm으로 교반하면서 4시간동안 배양한 후, 6000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 수득된 펠렛에 차가운 1 ×TES(0.2M Tris-HCl(pH 8.0), 0.5mM EDTA, 0.5M 수크로즈) 8㎖을 넣어서 완전히 섞고 1/5 ×TES 12㎖을 첨가하여 잘 혼합한 후, 얼음 상에서 30분 동안 배양한 다음, 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 새 튜브로 옮기고 RPAS 정제 모듈(Pharmacia Biotech사, Cat.# 17-1362-01)을 사용하여 정제하여 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5는 인간화된 항-h4-1BB ScFv를 항-E 태그 세파로스를 이용하여 인간화된 ScFv의 순수 분리한 결과를 나타낸 도이다.

실시예 15 : 각 ScFv의 친화력(affinity) 측정

ScFv의 친화력을 측정하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance)를 이용하여 생분자간 상호작용(biomolecular interaction)을 분석하는 장비인 BIAcore2000(BIAcore사)로 ScFv를 갖는 Hu4785 클론(항-h4-1BB ScFv)들과 4-1BB-GST 융합 단백질 사이의 분자간 상호작용을 분석하였다.

결과는 아래의 표 4와 같다. 결과에서 KD(equilibrium dissociate rate constant) 값을 비교해 보면, 4785는 2.94 ×10⁹이며, Hu4785-2은 3.04 ×10¹²이며, Hu4785-10은 8.23 ×10⁹인 것을 볼 수 있다. 이것은 친화도가 Hu4785-2은 마우스 4785보다 약 1000배 친화도가 높은 것을 나타내는 것이다.

	ka	kd	KD(M)	Chi2
마우스4785	1.04E+03	3.06E-06	2.94E-09	3.06
Hu4785-2	3.21E+04	9.76E-08	3.04E-12	0.30
Hu4785-10	5.20E+02	4.28E-06	8.23E-09	2.83
Hu4785-14	6.14E+02	8.21E-06	1.34E-08	1.61
Hu4785-17	4.95E+02	5.99E-06	1.21E-08	1.25
Hu4785-18	2.00E+02	4.85E-06	2.43E--08	204.00
Hu4785-24	9.72E+01	2.03E-06	2.09E-08	5.53

실시예 16: 경쟁적(Competitive) ELISA

4-1 BB-GST를 코팅 완충액에 5㎍/㎖로 희석하여 ELISA 플레이트에 코팅한 다음, PBS로 3회 세척하고 1% BSA-PBS로 실온에서 1 시간 동안 차단한 후 PBS로 3회 세척하였다. 동일한 농도의 8가지 ScFv와 바이오틴 표지된 항-4-1 BB mAb 4785를 50㎕에 4785를 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8㎍/㎖ 첨가하고 총 부피를 1% BSA-PBS를 사용하여 100㎕로 조절한 후 15분 동안 반응시킨 후에 ELISA 플레이트에 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, PBS-0.05% 트윈으로 5회 세척하였다. 이에 대한 대조군 Ab로는 항-TR2 mAb인 108(Immunomics사/본사제조)을 사용하였다. 1:10000으로 희석한 HRP-콘쥬게이트된 항-E 태그 Ab(Pharmacia Biotech사) 100㎕를 처리하여 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이어서, PBS-0.05% 트윈으로 5회 세척한 다음, ABTS 기질 100㎕를 처리하고 405nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 1에 따라 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.

억제율(%)= 100 ×(경쟁적 항체가 없는 경우의 OD₄₀₅-경쟁적 항체가 있는 경우의 OD₄₀₅)/경쟁적 항체가 없는 경우의 OD₄₀₅

경쟁적 ELISA는 각 클론이 원래의 마우스 4785와 같은 에피토프(epitope)를 가지는가를 확인하기 위한 실험이다. 경쟁적 ELISA는 Ag에 인간화(humanization)하기 전의 마우스 단일클론항체(mouse mAb)의 농도가 증가됨에 따라 인간화된 ScFv의 결합이 얼마나 감소되는지를 % 억제율(% inhibition) 값으로 얻을 수 있다. 도 6의 결과에서 마우스 mAb의 농도가 증가함에 따라 % 억제율이 증가하는 것으로 보아 인간화된 ScFv가 원래의 mAb와 같은 에피토프을 가지고 경쟁하는 것을 증명할 수 있었으며, 이것은 인간화된 ScFv가 원래의 mAb와 같은 생물학적 효과(biological effect)를 가질 것이라는 것을 강력히 암시하는 것이다.

실시예 17: FACS를 이용한 결합 친화도의 측정

인간 Jurkat 8-1 세포주는 인간 4-1BB를 안정적으로 발현하도록 감염된 세포주로서, 형광활성세포분류기(fluorescent activated cell sorter, FACS) 분석에 사용되었다. 5x10⁵개의 Jurkat 8-1 세포에 50㎕의 FACS 완충액(1XPBS, 0.1% sodium azide, 1% FBS)을 넣고 각각의 1차 항체를 처리하였다. 1차 항체로 마우스 4785(A)와 Hu4785-2 단백질(B)을 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 마우스 IgG1은 비특이적인 반응을 알아보기 위한 이형대조군(isotype control)으로 사용하였다. 세포를FACS 완충액으로 세척한 다음, (A)은 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 토끼 항마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.)를 4℃에서 30분 동안 처리하였으며, (B)는 항-E-태그 항체(anti-E-Tag antibody)와 항-마우스 IgG-FITC (anti-mouse IgG-FITC)를 차례로 처리하여 FACS 완충액으로 3회 세척한 후에 FACS 분석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 A와 B에서 가는 선은 이형 대조군이고 굵은 선은 각각 마우스 4785항체(A)와 Hu4785-2(b)를 처리하였다. 결과에서 굵은 선은 이형 대조군의 가는 선에 비해서 더 높은 FITC 수준을 보이고 있다. 이 결과로 마우스 4785와 Hu4785-2가 Jurkat 8-1에서 발현되는 인간 4-1 BB에 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 18: 인간화된 ScFv의 불변영역(constant region) 연결

4-1BB는 활성화된 T 세포의 표면에 발현하는 공동자극분자(costimulatory molecule)로써, CD8 T 세포에 생존시그날(survival signal)을 전달하고, CD8 T 세포 증식 및 세포독성(cytotoxic) T 세포 반응 유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 장기이식 또는 자가면역질환에서 자기(self)를 인지하는 자기 항원에 의해서 활성화된 세포독성 T 세포를 억제하기 위해서 인간화된 Hu4785 항체를 사용하려고 한다. 이러한 경우에 있어서 ScFv 형태만으로도 4-1BB와 4-1BB 리간드(ligand)의 상호작용을 막을 수 있어서 적용가능하지만, H2L2(heavy chain 2, light chain 2) 형태로 전환시키면, 그 효과를 극대화 시킬 수 있다. ScFv는 결합부위가 한개 이지만, H2L2 형태는 결합부위가 2개라서 더 효과적인 결합이 일어난다. ScFv 형태는 인간의 생체에 존재하지 않는 형태이므로, 생체에 존재하는 H2L2 형태가 항원성이 더 낮다. 그리고 인간화된 Hu4785-H2L2의 불변부위(constant region)의 이형(isotype)인 IgG1은 세포에 결합되고 나서 보체(complement)를 고정시키므로 Hu4785-H2L2 항체가 결합한 세포독성 T 세포를 죽이는 반응이 일어난다. 이것은 장기이식 또는 자가면역질환에서 자기를 인지하는 자기 항원에 의해서 활성화된 세포독성 T 세포를 특이적으로 사멸시킴으로서 장기이식 거부반응과 자가면역반응의 원인이 되는 자기반응세포독성 T 세포(self reactive cytotoxic T cell)를 완전히 제거할 수 있다. 그러므로 H2L2 형태로의 전환은 필수적이다.

각 Ab의 인간화 ScFv는 VH, 링커(linker), VL이 연결되어 있는 형태이다. 이것을 원래 항체의 형태인 H2L2형태로 만들기 위해서, VH에는 리더서열(leader sequence)과 인간 IgG1의 불변영역이 연결되고, VL에는 리더서열과 인간 카파사슬서열이 연결되었다. 각 절편의 연결은 PCR을 통해서 수행하였다. 연결된 후의 서열은 서열번호 40 내지 43에 기재하였으며, 도 8a 내지 도 8d와 같다.

실시예 19: H2L2를 이용한 ELISA

ScFv 형태에서 H2L2로 전환한 후에 ScFv의 결합 능력과 생물학적 효과가 그대로 남아 있는지 알아보기 위해서 실시예 19, 20, 21을 실시하였다.

불변영역까지 완전히 인간화된 유전자, 즉 상기 실시예 18의 Hu4785-2 중쇄 유전자(서열번호: 41)와 Hu4785-2의 경쇄 유전자(서열번호: 43)를 진핵세포발현벡터(eukaryotic expression vector)인 pcDNA에 서브클로닝하여 Hu4785-2H/pcDNA(기탁번호 KCTC 10440BP) 및 Hu4785-2K/pcDNA(기탁번호 KCTC 10441BP)를 수득하였으며, 이 두개의 플라스미드를 293EBNA 세포(ATCC)에 감염시키고(transfection), 감염된 세포(transfectant)의 배양상층액으로 ELISA를 수행하였다.

먼저 ELISA를 수행하였다. 항원으로는 4-1BB-GST를 사용하였으며, 각 50개의 감염세포의 배양상층액을 사용하였다. 50개 중에서 가장 높은 발현률을 보인 것은 B4 클론이며, 하기 표 5의 ELISA 결과에서 살펴보면 음성대조군보다 약 15배 높은 값을 보이고 있다.

시료	흡광도
Hu4785-2H/pcDNA, Hu4785-2K/pcDNA 감염된 293 EBNA 배양상층액(B4)	1.935
293 EBNA 배양상층액	0.126

실시예 20: H2L2를 이용한 웨스턴 블롯 분석

상기 실시예 18의 불변영역까지 완전히 인간화된 유전자를 진핵세포발현벡터인 pcDNA 또는 pD18에 서브클로닝하여 수득한 플라스미드를, Hu4785-2H/pcDNA + Hu4785-2K/pcDNA 또는 Hu4785-2H/pD18 + Hu4785-2K/pD18 과 같은 조합으로 293EBNA 세포(ATCC)에 감염시키고, 감염된 세포의 배양 상층액을 가지고 항체생성을 웨스턴블롯을 통해 확인하였다. 웨스턴 블롯 과정에 사용된 항원은 4-1BB-GST 이었다.

도 9는 H2L2를 이용한 웨스턴 블롯 결과사진으로, 레인 1은 Hu4785-2H/pcDNA + Hu4785-2K/pcDNA 감염세포(B4 클론)이고, 레인 2는 Hu4785-2H/pD18 + Hu4785-2K/pD18 감염세포이며, 레인 3은 293EBNA세포-음성대조군이다. 인간화가 완료된 항체가 인간 4-1BB에 잘 결합하는 것을 확인하였다.

실시예 21: H2L2의 순수분리

B4 클론의 배양배지 상층액에서 단백질 G 컬럼(protein G column)을 사용하여 완전히 인간화된 항체를 순수분리하여 SDS-PAGE하였다(도 10 참조).

실시예 22: 세포증식시험(Cell proliferation assay)

인간화된 ScFv와 H2L2의 생물학적 기능을 알아보기 위해서 세포증식시험법 (cell proliferation assay)을 실시하였다.

많은 경우에 있어서는 인간화 후의 항체가 인간화 전의 마우스 항체가 가지고 있던 생물학적 효과를 잃어버리는 경우가 있다. 그러므로 항체의 인간화를 완료한 후에 마우스 항체가 가지고 있던 생물학적 효과를 그대로 가지고 있는지를 증명하는 것이 필수적이다.

사람의 전혈에서 말초혈액단핵구세포(PBMC)를 분리하고, 각 Ab(마우스4785, Hu4785-2 및 Hu4785 H2L2)를 농도별(0, 1.25, 2.5 및 5㎍/㎖)로 처리하고, [³H] 인코포레이션 결과를 베타 카운터(beta counter)로 측정하였다. 마우스 4785는 인간 4-1BB에 결합하는 항체이다.

도 10a는 마우스4785를 농도별로 처리한 것으로서, PBMC의 증식을 용량 의존적으로 억제하는 것을 보이고 있다. 도 10b는 인간화된 Hu4785-2 ScFv를 처리한 것으로서 마우스4785와 같은 경향성을 보이고 있다. 도 10c는 인간화된 Hu4785-2 H2L2를 처리한 것으로서 마우스4785와 같은 경향성을 보이고 있다. 이것은 인간화 후의 항체가 원래 마우스 항체가 가지고 있는 생물학적 효과를 가지는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 ScFv형태인 인간화 Hu4785-2 및 H2L2형태인 Hu4785-2H/Hu4785-2K은 인체 4-1BB에 대한 결합 친화도가 높으면서 인간의 항체와 유사한 서열을 가지므로, 자가면역질환의 치료제 또는 면역억제제로서 부작용없이 효과적으로 사용될 수 있다.

<110> IMMUNOMICS CO., LTD. <120> Humanized Monoclonal Polypeptide Specific for Human 4-1BB Molecule and Pharmaceutical Composition comprising Same <130> DIF-2002-0019 <160> 43 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse 4785-heavy chain amino acid sequence <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Val Tyr Met Gln Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Asn Gly Val Glu Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Ala 115 120 125 Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln 145 150 155 160 Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser 195 200 205 Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys 210 215 220 Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val 225 230 235 240 Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val 245 250 255 Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile 260 265 270 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His 290 295 300 Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320 Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Ser Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp 385 390 395 400 Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile 405 410 415 Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln 420 425 430 Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His 435 440 445 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse 4785-light chain amino acid sequence <400> 2 Met Arg Phe Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ala Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Leu Ser Asn His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 170 175 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 3 <211> 1526 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse 4785-Heavy chain nucleotide sequence <400> 3 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtct 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggataa actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat cggaaatatt tatccttctg atagttatac taactacaat 240 caaaagttca aggacaaggc cacattgact gtagacaagt cctccaacac agtttacatg 300 cagctcaaca gcccgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag aaacggggtg 360 gagggttacc ctcattacta tgctatggaa tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 480 actaactcca tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 540 gtgacctgga actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600 tctgacctct acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag 660 accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 720 cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 780 atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 840 gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 900 gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc cgggaggagc agttcaacag cactttccgc 960 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gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtggctc tggaacagat tattctctca ccattaggaa cctggagcaa 300 gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc ttccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttagagaca aaggtcctga 720 gacgccacca ccagctcccc agctccatcc tatcttccct tctaaggtct tggaggcttc 780 cccacaagcg acctaccact gttgcggtgc tccaaacctc ctccccacct ccttctcctc 840 ctcctccctt tccttggctt ttatcatgct aatatttgca gaaaatattc aataaagtga 900 gtctttgcac ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 932 <210> 5 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785-2 clone amino acid sequence <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asn Gly Val Glu Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Pro 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Leu Ser Asn His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Glu Ile Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 180 185 190 His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 210 215 220 Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Lys <210> 6 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785-2 clone nucleotide sequence <400> 6 caggtccaac tggtgcagtc tggggctgag gtgaaaaaac ctggggcttc agtgaagctg 60 tcttgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaggcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggtcacaatg actgtagaca catccacatc aacagtttac 240 atggagctca gcagcctgag atctgaggac actgcggtct attactgtac aagaaacggg 300 gtggagggtt accctcatta ctatgctatg gaatactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcctcag gcggcggcgg cccaggcggc ggcggctcag gcggcggcgg ctcagatatc 420 cagatgacac agtctccatc ctccctgtct gcctctgttg gagacagagt caccatcact 480 tgcagggcaa gtcaggacct tagcaatcat ttatactggt atcagcagaa accaggtgaa 540 attgttaaac tcctgatcta ctacacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 600 agtggcagtg gctctggaac agattttacg ctcaccattt cctccctgca gccagaagat 660 ttcgccactt acttttgcca acagggttat acgcttccgt acacgttcgg agggaccaag 720 ctggaaataa aa 732 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker primer containing XhoI recognition site <400> 7 ctcgagtttt tttttttt 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-1U : sense primer of mouse Ig G1 <400> 8 gaactctgga tccctgtcca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-1D : antisense primer of mouse Ig G1 <400> 9 tgcaaggctt acaaccacaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K-1U : sense primer of mouse kappa CH1 domain <400> 10 atcttcccac catccagtga 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K-1D : antisense primer of mouse kappa CH1 domain <400> 11 cgtccttggt caacgtgag 19 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-2U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 12 caggtccaac tgswgcagyc tggggctgag gtgaaaaaac ctggggcttc agtgaagstg 60 tcttgcaagg 70 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-3U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 13 agtgaagstg tcttgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt 60 gargcagrsg 70 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-4U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 14 taaactgggt gargcagrsg cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt 60 ctgatagtta 70 <210> 15 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-5U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 15 atttatcctt ctgatagtta tactaactac aatcaaaagt tcaaggacar ggycacaatg 60 actgtagaca 70 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-6U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 16 ggycacaatg actgtagaca catccacatc aacagtttac atggagctca gcagcctgag 60 atctgaggac 70 <210> 17 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-7U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 17 gcagcctgag atctgaggac wctgcggtct attactgtac aagaaacggg gtggagggtt 60 accctcatta 70 <210> 18 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-8U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 18 gtggagggtt accctcatta ctatgctatg gaatactggg gtcaaggaac ctyagtcacc 60 gtctcctca 69 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-6D : antisense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 19 tgaggagacg gtgactragg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-1U: sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 20 caggtccaac tgswgcagyc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-1D : antisense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 21 csyctgcytc acccagttta 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-3D : antisense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 22 tgtctacagt cattgtgrcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785H-9U : sense primer for humanized 4785 heavy chain variable region <400> 23 ggycacaatg actgtagaca 20 <210> 24 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-2U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 24 gatatccaga tgacacagwc tmcatcctcc ctgtctgcct ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgca 70 <210> 25 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-3U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 25 cagagtcacc atcacttgca gggcaagtca ggaccttagc aatcatttat actggtatca 60 gcagaaacca 70 <210> 26 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-4U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 26 actggtatca gcagaaacca grtrrarctg ttaaactcct gatctactac acatcaagat 60 tacactcagg 70 <210> 27 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-5U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 27 acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtggctc tggaacagat 60 tttacgctca 70 <210> 28 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-6U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 28 tggaacagat tttacgctca ccatttcctc cctgcagcca gaagatttcg ccacttactt 60 ttgccaacag 70 <210> 29 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-6U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 29 ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc ttccgtacac gttcggasrg gggaccaagc 60 tggaaataaa a 71 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-1U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 30 gatatccaga tgacacagwc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-1D : antisense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 31 tggtttctgc tgataccagt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-3D : antisense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 32 tgagcgtaaa atctgttcca 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-8U : sense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 33 ctggaacaga ttttacgctc a 21 <210> 34 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785L-6D : antisense primer for humanized 4785 light chain variable region <400> 34 ttttatttcc agcttggtcc cctccgaacg tgtacggaag cgtataaccc tgttggcaaa 60 agtaagtgg 69 <210> 35 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4785 VH SfiI-U : sense primer of 4785 heavy chain variable region contaning SfiI recognition site <400> 35 actgcggccc agccggccat ggcccaggtc caactgswgc agyctgg 47 <210> 36 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4785 VL NotI-D : antisense primer of 4785 light chain variable region containing NotI recogniton site <400> 36 gagtcattct cgacttgcgg ccgcttttat ttccagcttg gtcccctc 48 <210> 37 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4785VH-Linker-VL : linker sequence to bridge between 4785 heavy chain variable region and light chain variable region <400> 37 cctyagtcac cgtctcctca ggcggcggcg gctcaggcgg cggcggctca ggcggcggcg 60 gctcagatat ccagatgaca cagw 84 <210> 38 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain amino acid sequence <400> 38 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Val Tyr Met Gln Leu Asn Ser Pro Thr Ser 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Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Leu Ser Asn His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 170 175 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 40 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785-2H:heavy chain amino acid sequence of humanized monoclonal antibody <400> 40 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Asn Gly Val Glu Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Ala 115 120 125 Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 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tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caaaagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caaaaaaagt 720 ttgagtccca aatcttgtga caaaactcat acttgcccgc cgtgcccggc tccggaactc 780 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacattg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 1422 <210> 42 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu4785-K: light chain amino acid sequence of humanized monoclonal antibody <400> 42 Met Arg Phe Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Leu Ser Asn His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ile Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Val 115 120 125 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 130 135 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accaagctgg aaataaaaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480 gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540 gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600 aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagt 660 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttag 699

Claims

서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 4-1BB 분자에 대해 특이성이 있는 인간화 모노클로날 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 세포주 Hu4785-2(기탁번호:KCTC 10365BP)에 의해 생산된 것임을 특징으로 하는 인간화 모노클로날 폴리펩티드.
서열번호: 40 및 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 4-1BB 분자에 대해 특이성이 있는 인간화 모노클로날 폴리펩티드.
제 3항에 있어서, 세포주 Hu4785-2H(기탁번호:KCTC 10440BP) 및 세포주 Hu4785-2K(기탁번호:KCTC 10441BP)에 의해 생산된 것임을 특징으로 하는 인간화 모노클로날 폴리펩티드.
제 1항의 모노클로날 폴리펩티드를 암호화하는 DNA.
제 5항에 있어서, 서열번호: 6의 염기서열을 갖는 DNA.
제 3항의 모노클로날 폴리펩티드를 암호화하는 DNA.
제 7항에 있어서, 서열번호: 41 또는 서열번호: 43의 염기서열을 갖는 DNA.
인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 포함하고 항체 중쇄 불변영역을 발현하기 위한 플라스미드 Hu4785-2H/pCANTAB (기탁번호: KCTC 10365BP).
인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 포함하고 항체 중쇄 불변영역을 발현하기 위한 플라스미드 Hu4785-2H/pcDNA (기탁번호: KCTC 10440BP).
인간화 모노클로날 폴리펩티드 Hu4785-2를 포함하고 항체 경쇄 불변영역을 발현하기 위한 플라스미드 Hu4785-2K/pcDNA (기탁번호: KCTC 10441BP).
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환 치료용 약학조성물.
제 12항에 있어서, 자가면역질환은 류마티스 관절염, 만성염증성관절염, 루퍼스성 홍진, 쇼그랜증후군, 자가면역으로 인한 갑상선염, 자가면역 당뇨병인 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 인간화 모노클로날 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 장기이식시 거부반응방지 및 치료를 위한 면역억제용 약학조성물.
제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 제형은 비경구 투여용인 조성물.
제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 투여량은 0.1 내지 0.5 mg/㎏인 조성물.